Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение трансгенных растений картофеля и их молекулярно-генетический анализ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение трансгенных растений картофеля и их молекулярно-генетический анализ"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

УДК 631.62;636.21

' КУРОЧКИНА СВЕТЛАНА ДМИТРИЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ И ИХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕГШЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1995

Рабсга выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института генетики и цитологии АН Беларуси

Научный руководитель:

Член-коор. AHB, доктор биологических наук, профессор Картель H.A.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, Палилова А.Н. Доктор биологических наук, Левенко Б.А.

Оппонирующая организация - Институт клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины

Защита состоится " /3 " мая 1696 г. в /V—'' час. на васедании совета по ващите диссертаций на соискание ученой отепени доктора биологических наук Д.01.31.01. при Институте генетики и цитологии АН Беларуси по адресу: 820072 г.Минск, ул. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомится в Центральной научной библиотек© им. Я.Колоса Академии наук Беларуси

Автореферат рааослан " /8 " апрели 1995 г,

■ Ученый секретарь совета по ващите диссертаций

Д. 01.31.01 ^ л ......

кандидат "иологических наук /¿¿"/¿Р^-— Лобанок Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Успеиное развитие молекулярной биологии, разработка технологий получения регамбинантных молекул ДНК, создание целого арсенала методов генетической инженерии растений открыли широкие возможности как для прикладных, так и для фундаментальных исследований растительных геномов. Тотипо-тентность растительных клеток и способность их геномов интегрировать чужеродные гены привели к тому, что за последние 10 лет с целью направленного изменения примаков более чем к 60 видам ра гений были применены методы генетической инженерии. Уже сейчас в лабораторных условиях можно получать растения, . устойчивые к насекомым-вредителям, к вирусным, бактериальным и грибным инфекциям, к пестицидам и гербицидам путем их биодеградации. Получены растения, несущие трансгены запасных белков сои, гороха, фосоли, кукурузы, ячменя, пшеницы и др. Однако успешное применение трансгенных растений в прзкти"еской селекции невозможно без проведения фундаментальных исследований, позволяющих проследить стабильность интеграции чужеродной генетической информации, экспрессию перенесенных генов в новом для них генетическом окружении, характер наследования трансгенов. Для большинства сельскохозяйственных культур, включая картофель (Solanum tuberosum L.), процессы взаимодействия между растительным геномом и интегрируемыми чужеродными гена»« все еще недостаточно изучены, а имеющиеся в литературе данные о характере интеграции и экспрессии трансгенов противоречивы. Это и определило выбор наших исследований.

Цель и задачи исследования. Целью наши исследований явилось получение трансгенных растений у различных форм одной из наиболее важных в условиях Беларуси пищевой и кормовой культур" - картофеля Solanum tuberosum L. и изучение интеграции, огсспрес-crai и наследования чужеродных бактериальных генов при вегетативном и репродуктивном размножении олученных трансгенных форм.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. отработать условия эффективной регенерации растений из листовых дисков различных генотипов (сортов, гибридов, линий);

2. методом кокул^тивации листовых дисков с использованием различных векторных систем получить трансгенные растения картофеля;

3, изучи-', эффективность получения трансгенных растений в зависимости от генотипа растения, а тагам; от использованной агробактериальной векторной системы;

4, провести модекулярно-генетический анализ ¡га стабильность интеграции трансгенов при вегетативном и репродуктивном размножении полученных трансген"чх клонов;

5, проанализировать экспрессию трансгенов в F1 и F2 полученных трансгенных клонов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Отработаны условия агробактериальной трансформации картофеля Solanum tuberosum L., позволяющие получать трансгенные растения i ;я различных сортов, в том числе белорусской селекции.

Получены генетически маркированные трансгенные растения для восьми различных генотипов • картофеля. Полученные трансгенные клоны, интегрировавшие бактериальные гены tt. tg, npt II, gus в различных комбинациях, могут служить модельными объектами для дальнейших фундаментальных исследований взаимодействия 'растите,пьный геном - трансген".

Впервые на картофеле показана интеграция трансгенов в две гомологичные хромосомы, причем оба локуса являются функционально активными.

Показано, что различные трансгенные клоны картофеля как в пределах одного генотипа (сорта, линии), так и между разными генотипами (сортами, линиями) могут сильно отличаться по уровню экспрессии чужеродного гена; уровень экспрессии тр:.;югена в геноме картофеля не имеет прямой связи с количеством его копий.

Наряду со стабильной интеграцией показаны случаи нестабильной интеграции трансгенов в геном картофеля..

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что для практического использования траксгенных растений картофеля этап изучения модифицированного генома на стабильность интеграции желаемого трансгена и уровень его экспрессии является необходимым для каждого конкретного растения.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. При агробактериальной трансформации картофеля эффективность получения трансгень'" растений определяется как генотипом исходного растения, так и выбором векторной системы. Трансформанты картофеля отличаются между собой как п- количеству стабильно интегрированной чужеродной генетической информации, так и по уровню

экспрессии трансгенов. При интеграции трансгена в две гомологичные хромосомы может наблюдаться з. 1>ект усиления его фенотипичес-кого проявления.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена Курочкиной С.Д. 1юд руководством чл.-корр. АНБ, профессора Картеля H.A. и при методической помощи ст.н.с., к.б.н. Забеньковой К.И. Плаэмидные вектора pGV941tt и pGV941tg сконструированы и любезно предоставлены сотрудниками ВНИИ СХБ РАСХН (г.Иосква).

Связь работы с крупными научными прграммами. Работа выполнялась в рамках темы, входящей в Республиканскую комплексную программу фундаментальных исследований "Генетические и физиоло-го-биохимические проблемы продуктивности и иммунитета сельскохозяйственных растений".

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на I Всесоюзном и II Российском симпозиумах "Новые направления в биотехнологии , чтений", г. Пущино, 1991, 1993; на VI Съезде генетиков и селекционеров Беларуси, г.Горки, 1992; на конференции "Генетика соматических клеток в культуре", г.Черноголовка, 1993; на конференции "Стратегии и новые методы в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур" г.Жодино, 1994; на конференции "Генетическая инженерия и биотехнология", г.Минск,1994; на Международно« семинаре "Современные направления в молекулярной биологии растений", г.Гатерслебен, Германия, 1994; на Международной конференции "Биотехнология растений и генетическая инженерия", г. Киев, 1994; на заеданиях Ученого Совета ИГиЦ АНБ.

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 12 печатных работах, одна из которых за рубежом.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения и выводов, а также списка литературы. Работа содержит 22 ригунка, 8 таблиц. Список цитируемой литературы включает 234 наименования, в том числе 204 иностранных.

'МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Растительный материал и векторные системы. В экспериментах использовали сортовой, линейный и гибридный материал тетраплоид-

ного картофел.. Solanum tuberosum L. Copra Аксамит, Ласунок, При-гожий-2, линия Сеянец-76 были любезно предоставлены БелНИИ картофелеводства ; сорт Львовянка предоставлен Институтом клеточной биологии и генетической инженерии АНУ (г.Киев); гибриды 199 (384199) и £01 (384201) получены из Международного центра картофеля (CIP, Lima). Сеяг Ц-76Д является сомаклоном линии Сеянец- 76; "олучен нами in vitro; отличается повышенной морфогене-тической способностью и физиологической мощностью, стабильно сохраняющимися при клонировании; имеет нормальный тетраллоидный кариотип; изучается как самостоятельный гинотип.

В работе использовали бактериальные штаммы Agroba^terlum, содержащие бинарные векторные плаэмидн: A.tumefaciens 3850 (pGV941tg), A.rhlzogenes A4 (pGV941tt), A.tumefaciens 4404 (pBI 121). Векторные плазмиды pGV941tg и pGV941tt были сконструированы и любе&но предоставлены лабораторией генетической инженерии растений ВНИИ СХБ РАСХН (г.Москва). Бинарный вектор pBI 121 по-лучеь из лаборатории профессора Потрикуса (Institute Oi Plant Sciences, Швейцария).

Шазмда pGV941tt содержит ген tt, являющейся производным гена B.thurlngiensls subsp. kurstakl HD-1 (CrylA(a)) и кодирующий полипептид, соответствующий токсичному фрагменту бациллярного белка, а также ген npt II из транспозона Гл5 E.coll, обеспечивающий устойчивость к антибиотику канамицину. Ген.инсектоток-сина tt фланкирован .Í5S промотором и терминирующей областью гена 6 ВМЦК, npt II грч под nos-промотором и сигналом ¡.олиадекилиро-вания гена нопалинсинтааы Т1-плазмвды.

Ялазмода pGV94îtg содержит tg ген двухдоменного полипептида, N-концевая часть которого соответствует токсичному продукту гена tt, а С-концевая часть представляет продукт гена gus. кодирующего полноразмерную/-глюкуронидазу E.coli. Ген tg встроен под 35S проыоторм и терминирующей областью гена 6 ВМЦК. Плазмида pGV94ltg содержит также ген npt II под регуляторными последовательностями гена нопалинсинтаэы Tí-плазмиды.

Плазмида рВ! 121 содержит гены npt II и gus E.coli под регуляторными последовательностямми, соответственно, гена нопалин-синтазы Ti-r аэмиды и гена 6 ВМЦК, что обеспечивает неошцинфос-фотраясферазную и ß -глюкуронидазную активность в клетках трансформированных растений.

Культура картофел-" In vitro. Для проведения исследований

опытах (бев инокуляции АртоЬасЬеПшл, на среде без антибиотиков) представлена в таблице 1. и варьирует от 3,77. (Ласунок) до 96,8% (Сеянец-76Д) в зависимости от генотипа.

Таблица 1. Эффективность регенерации побегов из листовых дисков картофеля разных генотипов

Генотип | Количество | Количество | X эксплантов с картофеля | эксплантов, |эксплантов о побе-|побегообразова-| шт. | гообразоваиием, | нием

Львовянка 107 27* 25,2+2,4

Аксамит 64 12 18,8+4,9

Ласунок 54 2 3,7+2,6

Пригожий-2 80 21 26,3+2,8

Сеянец-76 72 18* 25,0+5,1

Сеянец-76Д 124 120* 96,8+1,6

189/384199 90 Б 5,6+2,4

201/384201 83 8 9,6+3,2

* множественное побегообразование на эксплантах.

Эффективность получения трансформированных растений у изучаемых генотипов оказалась различной (таблица 2), Очевидно существенное различие по проценту выхода канамицинустойчивых реге-непантов между изучаемыми формами картофеля. Яри этом наблюдается определенная связь меаду регенерационной способностью и частотой трансформации. Так, гибриды, проявляющие низкий морфогене-тический потенциал, показали та!еже самую иизкув частоту трансформации.

Вместе с тем оказалось, что на выход трансформантоэ больше влияние оказывает выбор агробактериальной векторной системы (табл.2). Особенно эффективным окааался высоковирулентный атамм А. гМгоеепез А4 с плазмидой рОУЭ'ИЪ, после обработки которым процент эксплантов с множественной регенерацией побегов в условиях селективного давления у ряда генотипов составил более 40%, превысив соответствующий показатель в контроле. Так, у Львовянки 40,5 и 25,2Х соответс ьвенно, у Пригожего 44,1 и 26,32 соответственно, у Аксамита 51,9 и 18,8Х. соответственно.

Следует заметить, что использование А.гМгогепеэ А4 в наиих

Таблица 2. Эффективность регенерации побегов ив инокулированных листовых дисков картофеля на селективной среде с канамицином (50 мг/л)

I Инокуляг 'я: | Кол-во | Эксплантов

Генотип | штамм АдгоЬасЬег1иш,|листовых| с побегообразованием

картофеля | плавмидный вектор |эксплан-|--

I |тов, шт | шт. I X

Львовянка А. 1. 4404 :: рВ1 121 93 3 ЗЛ+1,8

АЛ. 3850 : :р0У04Ий 84 8 9,5+3,2

А.гЬ. А4 : :рйУ94ИЛ 126 61* 40,5+4,4

Аксамит АЛ.3850 ::рЗУ941Ьд 26 1 3,8+3,7

А.г(1. А4 :;р(ЗУ941и 27 14* 51.0+9,6

Лаоунок А.г.3850 :¡рвУ941Ьг 31 1 3,2+3,2

А. 1*1. А4 ::рОУ94ИЛ 60 ,9 15,9+4,6

Пригожий-2 АЛ.3850 :: р6У94П,е 41 1 2,4+2,4

А.г1ч. А4 :: рОУ94ИЪ 34 15* 44,1+8,5

Сеянец-76 АЛ. 4404 :: рВ1 121 173 10 5,8+1,8

АЛ.3850 :;р6У9411й 54 0 0

А.гЪ. А4 ::р6У941и 133 22* 16,5+3,2

Сеянец-76Д АЛ. 4404 :: рВ1 121 96 5 5,2+2,3

АЛ.385и ::р(ЗУ94Пг 70 25* 35,7+5.7

А.гЬ. А4 : :рВУ941и 79 43* 54,4+5,6

199/384199 А.1.3850 : :раУ941Ьдг- 26 0 0

А.гЬ. А4 : :р6У941и 44 3 6,8+3,8

201/384201 АЛ.3850 ::р6У941Ьг 41 2 4,9+3,4

А.гЬ. А4 ::рбУ9411Л 32 0 0

* множественное побегообразование на эксплантах. условиях не вызывало появления "гоо1у"-фенотипа, т.к. присутствие большого количества цитокининов в среде (3,6-4 мг/л) давало селективное преимущество для морфогенеза клеток, не включивших Т-ДНК М-плазмиды. Наблюдаемый же в ряде случаев эффект увеличения процента эксплантов с усиленным морфогенезом после инокуляции штаммом А.гМгодепеэ А4 (рСТ941Ш вероятно связан с увеличением числа клеток эксплантов э;\х генотипов, компетентных для регенерации и трансформации. Одной из возможных причин наблюдае-

мого феномена может служить изменение локального гормонального окружения растительных клеток вследствие конститутивной продукции бактериями данного штамма ауксинов и/или цитокининов в определенном соотношении.

Значительно менее эффективными для Лольшинства изучаемых генотипов оказались агробактериальные векторные системы A.tumefaciens 4404 (pBI 121) и A.tumefaciens 38Б0 (pGV941tg) (табл.2). Процент эксплантов с морфогенезом, а также количество морфогенных зон на эксплант у большинства генотипов падает после инокуляции этими векторными штаммами.

Результаты, полученные на этом этапе исследования, показали возможность получения трансгенных растений картофеля у широкого спектра генотипов, однако эффективность трансгеноза в значительной мере определяется такими факторами, как компетентность клеток растительного объекта к регенерации и трансформации, выбором векторной системы, условиями вырадь. ,ания асептической культуры как донорных растений, так и эксплантов, взятых для трансформации. Очевидно, что индивидуальный подбор условий регенерации и трансформации для каждого генотипа в отдельности может в некоторой степени повысить выход трансгенных растений.

2. Анализ трансгенных растений при вегетативном размножении

В результате проведения первого этапа исследований, в который было вовлечено более 2000 эксплантов 8 различных генотипов картофеля, 430 эксплантов дали побегообразование. Получено около тысячи регенерантных побегов. 125 регенерантов-трансформантов было отобрано для дальнейшего анализа.

2.1. Анализ трансгенных клонов на устойчивость к канамицину при пассировании In vitro.

Все трансформированные клоны, отобранные для анализа, были получены в условиях жесткого селективного отбора на этапе регенерации из инокулированных дисков. Тем не менее, как видно из рисунка 1, различные клоны опичались по своей способности к укоренению в присутствии селективного агента даже в пределах одного и того же генотипа и одной и тойже векторной системы. Отмечено также, что трансформанты, полученные после обработки эксплантов векторной сис -емой A.tumefaciens 4404 (pBI 121) в наших экспериментах укоренялись медленно, равно как малоэффективно осуществлялась и регенерация из инокулированных этой системой

дисков.

I 1 г*¿»ль ЕШ хорош« ухореазБНз ! ' 1 плохо« уъоргвяшэ

Рис.1. Канамицинустойчивость трансформантов Р1 в 1 пассаже пробирочной культуры, а. АДш^ао1епз 3850::рЗУ941Ьг; б. А.гМгогепез А4: :р(ЗУ94т , Лв.-Львовянка; Пр.- Пригожий; С.-Сеянец 76; С-Д. - Сеянец-76Д

По степени устойчивости к канамицину трансформанты условно можно рааделить на три группы: 1.быстро и хорошо укореняющиеся растения с нормальными побегами, 2. трудно и плохо укореняющиесй растения с нормальными. иногда несколько осл<1бленк..ми побегами, 3. растения с предельно низкой устойчивостью, обычно гибнущие г 1- 2-ом пассаже после сревки с эксплаята и перенесения в пробирочную культуру.

Растения иа первой группы показывали повышенную устойчивость к канамицину» выдерживая его концентрацию в среде до 200 иг/л. При анализе №Т II активности в экстрактах тканей этих растений фиксировался сигнал значительно большей интенсивности, чем в экстрактах тканей растений из 2-й и тем более 3-ей группы (рис.2), т.е. уровень иеомицинфосфотрансферааной активности в тканях различных трансгенных клонов различен. Такая вариабельность отмечегч как между клонами разных генотипов, так и в пределах • одного генотипа. Более того, при пассировании клонов в группе плохо укореняющихся растегчй зафиксированы единичные случаи полной потери устойчивости, приводящие к гибели растений.

- 11 -

12 3 4

Рис.2. Анализ NPT II активности in situ у растений с различной степенью устойчивости к канамицину (50 мг/л): 1.трансформированное растение табака; 2. ¡¡«трансформированное растение картофеля; 3-5.растения картофеля, трансформированные Airhlsofenes А4 (pGV94ltt): 3 - из группы высокоустойчивых, 4 - из группы со средней устойчивостью, 5 - из группы слабоустойчивых.

Наиболее вероятными причинами могли быть либо элиминация трансгена npt II, либо изменения на уровне транскрипции-трансляции, а

также постгрансляционном уровне. «

2.2. Анализ трансгенных клонов на интеграцию и экспрессию трансгенов при пассировании in vitro

Для изучения причин различий в экспрессии трансгенов, в частности npt II, полученные в культуре in vitro результаты били сопоставлены с результатами анализа на иг ле грацию трансгенов методом блот-гибридизацин по Саузерну. Для молекулярного анализа мы отобрали по несколько морфологически нормальных трансгенных клонов: Сеяне"-76 - 5 клонов с генами tt/npt II; Сеянец-76Д - 5 ¡ионов с генами tt/npt II; 5 клонов с генами tg/npt II; б клонов с генами gus/npt 11; Львовянка - б клонов с генами tt/npt II; 5 клонов с генами tg/npt II.

Проведенный молекулярный анализ показал, что все растения, обладающие устойчивостью к селективному агенту (Km), содержат в своем геноме одну или несколько копий трансгенов (рис.3). Однако оказалось, что уровень активности белка (NPT II), проявляющийся в устойчивости растений к канамицину, а также выявляемый in situ, не всегда имеет прямую связь о количеством копий трансгена. Так, например, у растения 1 (клон С-76Д/1; tg/npt И) (рис.3) количество копий npt II трансгена на г^ним больше, чем у растения 2 (клон С-76Д/2; tg/npt II) (нанесено по 10 мкг ДНК на дорожку), однако растение 1 имееет более низкую NPT II актив-

ностьу в т1-знях ( рис.4; дор.б и 7 соответственно). Растения же 2 и 3 (клон С-76Д/3; 1г/пр1 П) (рис.3) демонстрируют другую связь, когда с увеличением числа копий трансгена на геном фиксируется более высокий уровень активности соответствующего белка (рис.4; дор. 4 и 6 соответственно). Это свидетельствует, о том, что увеличение числа копий трансгена на геном не всегда приводит к количественному увеличению сооветствующего активного белка в тканях растений.

123*5678 9

пл. '""Л ''' is.v„ ^ Г

> ' '' '

' ' О я«-,

.973 ^ ■ } I

$ - .

- I 200 ^ . ^ 11

* JOLHM

Рис.3. Радиоавтограф Слот-гибридизации п^ Саузерну ДНК .^астений картофеля F1 (6 пассах) на присутствие гена npt II; 1-7 -ДНК индивидуальных линий трансгенных растений F1, рестрицирован-ная Hind III; 8 - ДНК контрольных растений / Hind III; 9 - фрагмент ДНК из пдаамиды pABD', содержаний ген npt II, используемый в качестве вонда. ДНК pABDI рестрицироваиа EcoRV.

Полная потеря устойчивости к селективному агенту, выявляемая главным образом у регенерантов в 1-2 пассажах после срезки с инокулированных листовых эксплнтов (до 20% регенерантов) и в отдельных случаях при дальнейшем пассировании (до АХ), как правило обусловлена элиминацией трансгена, например, рис.3, дор.4 (клон С-76Д/4, tg/npt II). В то же время имели место 2 случая, когда снижение Km-устойчивости не могло быть объяснено физической потерей гена. Это дает основания констатировать факт изменения ' экспрессии npt 11 трансгена на уровне конечного продукта у единичных трансгенных клонов картофеля в ходе индивидуального развития.

На рисунке 6 представлены результаты анализа трансгенных клонов на присутствие, трансгена tt, который интегрировался в

растительный геном как при использовании плавмиды рвУ941и (дор, Г.е.Ь: клоны С-76/1, С-76/8 и С-76/3 о генами и/прЬ II), находясь в Т-ДНК вектора под самостоятельными регуляторньшГ" последовательностями, так и ллазмщы рвУб^Нд (дор, а.Ь,с,с],е: С-76Д/1, С-76Д/2, С-76Д/3, С-76Д/4 И С-75/б о генами Ь^/г^ И), находясь в Т-ДНК вектора в составе гена двухдоыеиного белка (Ь^). В обоих случаях ген давал положительный сигнал при блот-гибридизации по Саузерну. Растения, дававшие положительный сигнал на пр1 И, давали т-"кже положительный сигнал и на и. Случаев раздельной интеграции маркерного и репортерного генов нами не выявлено.

I 2 з А 5 6 т

Ц*^ - 11

Рис.4. Анализ NPT II активности in situ у трансформированных растений картофеля с различной устойчивостью к канамицину: 1, экстракт из штамма E.coli, экспрессирующего ген npt II; 2. экстракт из ткани («трансформированного растения-, 3-7. экстракты из тканей растений картофеля, трансформированных векторной системой A.tumefaclens 3850 (pGV941tg): 3,4,6,7 - растения из группы с высокой и средней устойчивостью, 5 - растение иэ группы слабоустойчивых .

а Ъ о а * £_k 3

; . Рис.5. Радиоавтограф блот-1,8КЬ е» ' га ty f"'\ гибридизации no Сауверну ДНК

<4 растений картофеля fl на <~i присутствие генов tg и tt.

ДНК индивидуальных тран^генкых растений F1, интегрировавших: a,b,c,d,e - ген tg; f.g.h - ген tt; г - фрагмент ДНК иэ плаэмиды ptt4k, используемый в качестве зонда. 6 пасса*.

Анализ микроклубневого потомства канамицинустойчивых трансформантов показал стабильность не следования трансгенов.

К сол...внию, биотест на картофеле с tt геном малоэффективен, а иммуноаналиэ затруднителен из-за низкого содержания белка. Поэтому мы анализировали только интеграцию этого трансгена.

Был проведен также выборочный анализ соответствующих трансформированных растений на экспрессию gus гена. Растения, полученные от трансформации системой A.tumefaclens 4404 (pBI 121) (5 клонов Сеянца-76Д), оценивали гистохимическим способом. На сре-вах стеблей и черенков листьев для всех 5-и клонов получен положительный сигнал в Bir> вон голубоватой окраски разной интенсивности у разных клонов. Трансгенные клоны картофеля с конструкцией tg (б клонов Сеянца-76Д и 5 клонов Львовянки) оценивали совместно с ее создателями - сотрудниками лаборатории генетической инженерии растений ВНИИ СХБ РАСХН. Средний уровень глюкуронидаз-ной активности в растениях, экспрессирующих трансген tg (CiylA(a)-gus), нахс ;ится в пределах 6-16 пкмоль 4-ми/(мин * мг белка). Глюкуронидазной активностью в тканях этх растений обла-' дает 155-кДа интактный бифункциональный белок "CryIA(a)-GUS".

Таким образом, наш показана интеграция трансгенов в раз-личныее геноыы ка?- ° £феля и вариабельность в их экспрессии. Различия в экспрессии трансгенов могут объясняться разными при- (нами: хромосомная локализация тралсгена; количество копий на геном; правильность транскрипции и трансляции ; эффективность транспорта белка в цитоплазму; метилирование регулягорных последовательностей (Flavell R В. et al., 1994). Можно предположить, что полученные нами различные трансгенные клоны растений картофеля не идентичны в отношении названных характеристик.

3. Получение и анализ трансгенных растений картофеля репродуктивного потомства

В результате искусственного самоопыления собраны семена у 7 растений четырех независимо полученных трансгенных клонов. Из 16 вызревших ягод извлечено около 500 семян. Все четыре клона, давшие семенное потомство, были получены из листовых эксплантов, инокулированных системой A.rhlzogenes А4 :: pGV941tt и относились к генотипам: Сеяиец-76 (1 клон), Сеянец-76Д (2 клона) и Львовянка (1 клон).

После 6-месячного периода покоя полученные трансгенные семена были введены в культуру In vitro. Результаты феноткпкческо-

нескольких копий траксгена npt II в одну гомологичную хромосому. Характерно, что интенсивность развития побегов и корней у растений этих клонов эначительно слабее, чем у клона C-76F2, Аналиэ на интеграцию npt II и активность NPT II In situ у большинства растений этих клоноп выявил более слабые сигналы, чем у клона C-76F2.

Гибридизационннй анализ по Саузерну подтвердил наличие встроек npt II и tt трачогенов в геномах канамицинустойчивых растений F2 (рис.5; дор.6-9.). Характерно, что в F2, как и в F1, отмечены отдельные случаи, когда увеличение копий npt И гена на геном не приводило к увеличению фенотипического его проявления, т.е. к увеличению устойчивости растения к канамицину.

ВЫВОДЫ

1. Методом агробактериальной трансформации листовых дисков созданы трансгешше растения 8 генотипов картофеля; интеграция чужеродцах генов (npt II, gus, tt и tg) в геном картофеля подтверждена молекулярными меа-дали,

2. Эффективность регенерации побегов из .инокулированных листовых дисков картофеля на селективной среде с канамищшом (50 мг/л) колебалась от 0 до 54,4% н зависела как от генотипа. Tait и от использованной векторной системы.

3. Показано, что особенно эффективным для получения трансгенных растений картофеля является высоковируленгный штамм A.rhlzogenes A4 с плазмэдой pGV941tt. Для сортов Львовянка, Аксамит, Ласунок, Пригожий процент регенерировавших трансгенных растений в этом варианте трансформации эначительно выше, чем процент регенератов в контроле.

4. По степени устойчивости к селективному агенту - антибиотик канамицину сред» полученных грансформантов F1 выделены 3 группы растений: 1). хороио укореняющиеся и интенсивно развивающиеся; 2). плохо укореняющиеся с нормальными или слегка ослабленными побегами; 3). растения с очень нивкой устойчивостью, обычно гибнущие в 1-2 пассаже. Для первой группы трансгенных пастений установлен и более высокий уровень активности фермента неомицинфосфотрансферазы (NPT II). Показано, чт? в процессе вегетативного размножения (черенкование в 6-и пассажах и микроклубнями) трансформанты сохраняют устойчивость к канамицину, ха-

- 18 -

рактерную для выделенных 3 групп.

5. Показано, что до 80% полученных регенерантов-трансфор-мантов стабильно интегрируют .в свой геном чужеродные гены. Установлено, что количество копий трансгенов, а также уровень их экспрессии у независимо полученных трансгенных клонов отличается как в пределах одного растительного генотипа (сорта, линии и т.д.), так и между разными генотипами.

6. Получено семенное потомство от искусственного самоопыления трансгенных растрчий 4-х независимо полученных трансгенных клонов. Аначиз F2 поколения трансформантов на устойчивость к ка-намицину выявил растепление у 3-х клонов 3:1 (C-76£1F2, C-76fl2F2, JIbF2) и у одного клона 35:1 (C-76F2). что в первом случае соответствует интеграции гена npt 11 в одну хромосому (расщеплете симплексной гетероэиготы Аааа), а во втором - в две гомологичные хромосс и (расщепление дуплексной гетероэиготы АЛаа).

7. ГибридизационныЛ анализ по Саузерну F2 трансгенных растений подтвердил наличие в геномах канамивднустойчивых растении чужеродных генов npt II и tt. У растений, имеющих встройку трансгенов в 1 гомологичные хромосомы, выявлен более высокий уровень активности неомицинфосфотрансфераэы 11, что может быть связано с соответствующей дозой экспрессируюшихся копий npt II гена.

8. Созданный набор т: ансгенных клонов различных генотипов картофг -¡я может быть использован для дальнейшего изучения проблемы взаимодействия чужеродных генов с геномом тетрашгидно1 j картофеля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Курочкина С.Д., Забенькова К.И., Картель H.A. Трансформация картофеля агробактериальными векторами// Изучение и рациональное использование природных ресурсов. Тез. докл. Всесоюзн. конф. -Уфа, 1991. С.4-5.

2. Картель H.A., Курочкина С.Д., Забенькова К.И. Трансгенные растения картофеля, полученные кокультивацией листовых дисков с Agrobacterium tumefaclens и A.rhl20genes//. Новые методы биотехнологии растений. Теэ. докл.I Всесоюзн. симпоэ. - Пущино, 1991. С. 20.

3. Курочкина С.Д.. Забенькова К.И., Картель H.A., Кузьмин Е.В.,

Шемякин М.Ф. Перенос генов в растения картофеля// Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу. Тез. докл. Всесоюэн. конф. - Черновцы, 1991. С.26.

4. Курочкина С.Д. Введение чужеродных генов в растения картофеля// б Съезд генетк :ов и селекционеров Беларуси. Тез. докл.-Горки, 1992. С.14.

5. Курочкина С.Д., Забенькова К. И., Картель H.A. Изучение эффективности агробактсриальчэй трансформации различных генотипов картофеля// Управление генетической изменчивость» сельскохозяйственных растений. Tea. докл. Мехдунар. симпоз. - Ялта, 1992. С. 36-37.

6. Шаденков A.A., Дрвдзе И.Л., Гетачеу Т.Д., Курочкина С.Д. Уз-бековаС.В., Ыайсурян А.Н.. Шемякин М.Ф. Конструирование гена токсичного для жесткокрылых белка "CryIIIA-Cryl(a)-NPT II" и введение его а растения картофеля// Новые направления биотехнологии растений. Tee. док«. 2 Российск. симпоз. - Пувдию, 1993. С. 59.

7. Шаденков A.A., Курочкина С.Д., Узбекова С.Д. ДридзеИ.Л., Хадеева Н.В., Забенькова «.И., Шемякин М.Ф. Получение трансгенных растений картофеля, несущих производные гены инсектотоксияа CrylA(a) Bacillus thurlngíensls var. Kurstaki// Новые направления биотехнологии растений. Тез. докл. 2 Российск. симп. - Пу-щино, 1993. С.60.

8. Курочкина С.Д., Картель H.A. Экспрессия маркерного гена npt.II во втором поколении трансгенных растений картофеля//Генетика соматических клеток в культуре. Тез.докл. конф.- Москва,1993.С.30.

9. Курочкина С.Д., Забенькова К.И.. Картель H.A. Молекулярно-ге-нетический анализ трансгешш растений картофеля// Генетическая инженерия и биотехнология. Тез. докл. конф. - Минск, 1994 С.36.

10. Картель H.A., Курочкина С,Д., Забенькова К.И. Эффективность агробактериальной трансформации различных генотипов картофеля Solanum tuberosum L.//4AH РВ. - 1994.- Т.33, N2. - С. 67-71.

11. Kurochkina S.D., Zabenkova К.I-, Kartei К.A. Vegetative and sex"al inheritance of transgenes in potato// VIII Int. Congr. ol Plant and Cell Culture, Proceed. - Florence. Italy, 1994. P.26. -»2. Kurochklna S.D., Zabenkova K.I., Kartei N. A. Molecular and genetic analysis of transgenic potato plant's by sexual ana vegetative propagation// Plant Biotechnology and genetic Engineering. Proceed, of Int. Conf. - Kiev, 1994. P.60.

РЭВШЕ

Курачк1на С. Bs.

АТРЫМАННЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСУ11Н БУЛЬБЫ I IX МАЛЕКУЛЯРНА-

■ГЕНЕТЫЧНЫ АНАЛ13

Ключавыя словы: трансгенныя расл!ны, трансфармацыя, транс-ген, бульба, Agrobacterlum.

Вывучаецца сгаб1льнасць' 1нтзграцы1, зкспрэсИ i наследа-вання трансгенау при аграбактэрыяльнай трансфармацы! бульбы (Solanum tuberosum L.) Атрыыаны трансгенныя клоны васьм! розных генатиггу бульбы, у тым л!ку сартоу беларускай селекцы!, як!я 1нтэгравал1 бактзрыялчш гены tt, tg, npt II 1 gus у розных камб1нациях. Паказаны адрознення у характары 1нтэграцы1, насле-давання, а таксама у узроуне экспрэсП трансгенау у незалежна атрчманых грансфармантау.. Выяулен уплыу генатыпу i выкарыстанай вектарнай сЮтэмы эфектыунасць атрымання трансгенных расл!н бульбы.

РВЗШЕ

Курочкина С. Д.

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ Ч ИХ МОЛЕКУЛЯ ..0-

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Ключевые слова: трансгешше растения, трансформация, тракс-ген, картофель, Agrobacterlum.

Изучается стабильное.ь интеграции, экспрессии и наследования трансгенов при а^робактериальной генетической трансформации картофеля (Solanum tuberosum L.). Получены трансгенные кло..л восьми различных генотипов картофеля, включая сорта белорусской селекции, интегрировавшие бактериальные гены tt. tg, npt II, gus в различных комбинациях. Показаны различия в характере интеграции, наследования, а также в уровне экспрессии трансгенов у независимо полученных трансформантов. Выявлено влияние генотипа и используемой векторной системы на эффективность получения трансгенных растений картофеля.

SUMMARY

Kurochklna S, D.

1 DEVELOPMENT OF POTATO TRANSGENIC PUNTS AND THEIR MOLECULAR AND GENETIC ANALYSIS. Key words: trr igenlo plants, transformation, transgene, potato, Agrobacterlum.

The genetic transformation of potato (Solanum tuberosum L.) mediated by Agrobj :terlu-n and the stability of integration, expression and inheritance of transgenes are Investigated. Transgenic clones of 8 different potato genotypes, including varieties of Belarusslan breeding, have been obtained. Bacterial genes tt, tg, npt II and erus in different combinations have been integrated into potato genomes. The differences in the character of transgene integration, the Inheritance and expression level are shown in independently obtained transformed plants. The influence of the genotype and the used vector system on the efficiency production of transgenic potato plants has ^een reveale^.

Подписано в печать 30.03.95. Бумага типографская № 2 Усл.печ.л. 1,5 Тирад 100. Зак. 30

3aK. 30

Формат 60x84,1/16 Печать офсетная1 Учет.изд.л. 1,39 Бесплатно.

Отпечатало па ротапринте ЦНБ ¿В РБ, 220601. Инков, ул. Сургаиава, 15,