Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение трансгенных растений картофеля (SOLANUM TUBEROSUM L. ), устойчивых к гербициду глифосат путем введения мутантного aroA гена Е. coli

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение трансгенных растений картофеля (SOLANUM TUBEROSUM L. ), устойчивых к гербициду глифосат путем введения мутантного aroA гена Е. coli"

' J О i/<*

2 2 С Ei! Яа правах рукописи

КАБРАЛЬ ЭСКАЛАНТЕ БЬЕНВЕНИДО

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ (SOLANUM TUBEROSUM L.), УСТОЙЧИВЫХ к ГЕРБИЦИДУ ГЛИФОСАТ ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ МУТАНТНОГО

агоА ГЕНА Е. coli

Специальность 03.00.23 — Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева и в отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель — доктор биологических наук, академик РАСХН В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты: дсктор биологических наук А. Н. Майсурян, кандидат биологических наук Н- В. Хадеева.

Ведущее учреждение—Институт общей генетики км. Н. И. Вавилова РАН.

Защита состоится ......... 1998 г.

в ...... час на заседании диссертационного совета

Д.20.40.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН. Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 42. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан . . . •.....1993 г.

Ученый секретарь диссертационного совета — кандидат биологических наук

С. А. Меликова

ОВДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальное« темы. Современное растениеводство обладает неисчерпаемыми возможностями. Достаточно сказать, что используемые а настоящее время сорта и гибриды основных сельскохозяйственных культур обладают очень высоким потенциалом продуктивности: зерновые -свыше 100 ц/га, кукуруза - 200, сахарная свекла и картофель - свыше 1000 ц/га (Шевелуха B.C..1992 ). Однако, реализовать такой и даже более низкий потенциал в условиях производства удается всего на 20-30 Z. Одной из важных причин данного положения, несомненно, яв-ля1.ся засоренность посевов. Все более широкое применение гербицидов, наблюдаемое эа последние 20 лет, вносит существенный вклад в решение данной проблемы. Вместе с тем, существенный недостаток многих высокоэффективных гербицидов - воздействие не только на сорняки, но и на культурные виды растений в целом. К числу таковых относится один из наиболее широко применяемых на сегодняшний день гербицидов - глифосат (N-фосфоно-метил-глицин), ингибирующий в бактериях и растениях 5-енол-пирувилшикимат-З-фосфат-синтетазу (EPSP-синтетаза), ключевой фермент в пути биосинтеза ароматических аминокислот. В бактериях EPSP-синтетаза кодируется локусом агоА плазмид-ной ДНК. Б растениях этот фермент, хотя и синтезируется в ядре, является хлоропластным энзимом (Shah D. et al., 1986).

Установлено, что молекулярной основой устойчивости к глифосату у мутанта Salmonella typhimurium является замена одной пары оснований в структурной части гена, приводящая к замещению серина на про-лин в положении 101 аминокислотной последовательности фермента дикого типа (Stalker D.M. et al., 1985). У Escherichia coll также получены мутации, сообщающие клеткам резистентность к глифосату. Так, осуществлено клонирование гена, кодирующего высокорезистентную к глифосату форму EPSP-синтетазы. Уже получены трансгенные растения табака, томатов и петуньи, экспрессирующие бактериальный ген устойчивости к гербициду глифосат (Cornai L. et al.. 1985, FUattl J. et al., 1987).

Применение гербицидоустойчивых растений станет существенным вкладом в развитие интенсивных технологий, позволит существенно видоизменить тактику борьбы с сорняками и достигнуть заметной экономии, прежде всего на уменьшении количеств применяемых гербицидов. Последнее имеет важное значение в решении проблемы применения химической прополки с учетом требований экологической безопасности. Особенно важной биотехнологической задачей является конструирование

глифосатрезистентных растений картофеля в связи с частым применением этого гербицида для борьбы с различной сорной растительностью в посадках этой ва .шишей продовольственной культуры.

Цель и задачи. Цель настоящей работы - введение в геном картофеля мутантного агоА гена Е. coll, кодирующего мутантную EPSP-син-тетазу для получения устойчивых линий к гербициду глифосат. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать оптимальные питательные среды для индукции побегообразования в реципиетных тканях картофеля,

2. Отработать экспериментальную систему регенерации растений.

3. Провести трансформацию картофеля агроОактериальной векторной конструкцией pGV3850::pPREP3 и изучить экспрессию бактерипьно-го мутантного агоА гена в трансгенных растениях.

4. Провести тестирование трансгенных растений на устойчивость к гербициду глифосат.

Научная ноакана н практическая значимость. В настоящей работе впервые получены трансгенные растения картофеля, в которых экспрес-сируется бактериальный мутантный ген устойчивости к гербициду глифосат с принципиально новой точечной мутацией в его структурной части, ваключающейся в замене G на С в нуклеотидной последовательности гена дикого типа, приводящей к замещению аланина на пролин в 104 положении аминокислотной последовательности кодируемой EPSP-синтетазы. Проведено детальное исследование интеграции в растительный геном мутантного агоА гена, его организации и экспрессии в трансгенных растениях картофеля. Показано, что индивидуальные клоны различаются как по количеству копий встроенного гена, так и уровню его экспрессии и\или толерантности к глифосату. -Выявлено, что уровень экспрессии гена в трансгенных растениях картофеля-может зависеть как от количества копий, так и от сайта его инсерции в хромосому .'

Установлено, что реализация морфогенных потенций у картофеля в значительной степени зависит от способа регенерации побегов. Отмечена явная зависимость эффективности агробактериальной трансформации от природы реципиетных растительных клеток. Отработана эффект тивная система трансформации и. таким образом, данная работа предоставляет определенный методический подход к переносу генов в растения при использовании агробактериальных векторов.

Полученные трансгенные линии картофеля могут быть использованы

для дальнейших исследований по повышению их уровня толерантности к глифосату с целью применения в качестве селекционного материала.

Апробация работы. Материалы диссертации отражены в отчетах кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА и являются частью программы исследований "Получение трансгенних растений картофеля, томатов, сои и люцерны путем введения бактериальных генов", докладывались на заседаниях кафедры (ежегодно), научных семинарах в отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики РАН, научной конференции МСХА, на 8 Международном конгрессе I UPАС по химии пестицидов (Вашингтон, США, 1994).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обвора литературы, экспериментальной части, включающей методический раздел, результаты и обсуждение, выводы. Содержит Ц таблиц и -IS рисунков. Библиография включает ¿50 источников отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ Н 1.ЕТ0ДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Растительный материал. Исходным материалом служили растения четырех генотипов картофеля (Solarium tuberosum L.): сортов Кенне-бек, Луг^вской, Резерв и Ресурс, предоставленные НИИ картофельного хозяйства (п. Коренево, Моск. обл.). Источником реципиентных клеток для трансформации являлись фрагменты ткани листа, стебля и пазушные почки из стерильных пробирочных растений, а так же кусочки ткани микроклубня.

Агробзктернал&нцй штамм и плазмида. Растительные ткани инфицировали штаммом A. tumefaciens pQV3850, в котором участки Т-ДНК в Т1-плазмиде, определяющие онкогенносгь, замещены на последовательности pBR322. Он несет коинтегрант "обезоруженной" Т1-плазмиды и промежуточного (интегративного) вектора pPR£P3, полученного в лаборатории доктора Пирузян Э.С. (отдел молекулярной генетики растений. Институт молекулярной генетики РАН). Данная векторная плазмида содержит мутантный ген aroA Е. coll, за исключением последовательностей, кодирующих две N-концевые аминокислоты и последовательность, кодирующую транзитный пептид малой субъединицы РВФК/о гороха (обеспечивающий транспорт мутантной EPSP-синтетазы в хлоропласта) под контролем 35S промотора РНК вируса цветной капусты (ВМЦК).

В исследования! применяли: Агарозу (Sigma), рестрикционные эн-

-У

донуклеазы (Fermentas), тритонХ-100 (Ferak), sarcosyl (Sigma), KIT PCR (Biopol); антибиотики - Канамицин (Km), карбенициллин (Cb), ри-фампицин (Rf), спектиномицин (Sp), стрептомицин (Sin) (отечественные), цефотаксим (Сх) (Roussel); фиторегуляторы - БАЛ (6-бензилами-нопурин), зеатин (6-С4-окси-3-метил транс-2-бутениламино]пурин), кинетин (6-фурфуриламинопурин), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), ИУК (В-индолил-З-уксусная кислота ), НУК (сс-нафтилуксус-ная кислота) (Serva); глифосат - стандартный препарат, технический препарат (Раундап, изопропиламиновая соль, 36 % д.в.) (Monsanto).

Индукцию каллусной ткани на листовых и стеблевых эксплантах проводили на среде с 6,0 мг/л 2,4-Д в сочетании с зеатином (0,05 мг/л) и кинетином (0,2 мг/л). Для субкультивирования каллусе концентрация 2,4-Д составила 3 мг/л. На клубневых эксплантах (микроклубня) каллус получали и субкультивировали соответственно на средах с 3 и 2 мг/л 2,4-Д, зеатином и кинетином в тех же концентрациях. За основу питательного субстрата взята среда MS (Murashige T., Skoog F., 1962) с модификацией по составу биологически активных веществ.

Регенерация растений. Исследовали три варианта регенерационных сред в каллусной ткани из листа и стебля, содержащие. 1. 2 мг/л б-ВАП, 0,1 мг/л ИУК, 0,1 мг/л НУК; 2. 0,5 мг/л кинетика, 1,0 мг/л зеатина, 0,2 мг/л ИУК; 3. 2,5 мг/л зеатина, 0,2 мг/л ИУК и три варианта в клубневом каллусе, содержащие: 4. 3,0 мг/л 6-БАП. 0,1 мг/л ИУК, 0,03 мг/л НУК; 5. 1,0 мг/л кинетина, 0,5 мг/л 6-ВАП, 0,1 мг/л ИУК; 6. 1,0 мг/л кинетина, 0,5 мг/л зеатина, 0,1 мг/л ИУК. Основой питательного субстрата служила среда MS, несколько измененная по составу био-\огически активных веществ. Стеблевой органогенез изучали в трех вариантах способов регенерации: посредством прямого органогенеза из экспланта, в первичной и в пассируемой (4 пассажа) каллусной ткани. Культивирование проводили в течение 12 недель с пересадкой тканей на свежую среду каждые 3 недели.

Получение бактериальной культуры. Агробактерии выращивали на твердой (агар 1,5 X) и жидкой LB-среде (Миллер Дж., 1977), в которую добавляли: MgS04.7H20 - 2.10"3 M, сахарозу - 0,2 % и антибиотики - СЬ - 100 мкг/мл, Rf - 50 мкг/мл, Sp - 50 мкг/мл, Sm - 100 мкг/мл. Для получения инокулята ночную агробактериальную культуру разводили Ь соотношении 1:50 соответствующей жидкой средой для культивирования растительных тканей.

Трансформация и селекция. Методика инокуляции тканей картофеля

-if-

A. tuT.efacions была несколько модифицирована. Фрагменты тканей кратковременно (2-3 ч) выдерживали в суспензии агробактерий при одновременном умеренном круговом вращении (110-120 об/мин; на термос-татируемой качалке при температуре 25±1°С, после чего зараженные ткани перемещали на соответствующую агаризованную среду и инкубировали при стандартных условиях в течение 12-36 ч. Селекцию трансформированных тканей и регенерантов вели на среде с 50 мкг/мл Km. Аг-робактерии удаляли добавлением в среду 500 мкг/мл Сх, который в норме нетоксичен для растительных клеток. Достигшие высоты около 1 см растеньица-регенеранты укореняли на безгормональной среде с минеральными элементами по MS. 20 г/л сахарозы и дополненной 500 мкг/мл Сх и 50 мкг/мл Km для дальнейшей селекции. Укоренившиеся побеги расчеренковывали на среде того же состава без антибиотиков.

Трансформация пазушных почек. В области пазушной почки, еще не пошедшей в рост, хорошо отточенным скальпелем проводили надсечку и в место поранения стерильной микробиологической петлей наносили каплю жидкой культуры агробактерий, помещали черенки с зараженными почками на безгормональную агаризованную среду и инкубировали при стандартных условиях в течение 12-36 ч. Наращивали проростки на среде того же состава с 500 мкг/мл Сх. Выросшие побеги расчеренковывали на среде, содержащей 50 мкг/мл канамицина.

Анализ на присутствие в геноме картофеля кутантиого агоА гена Е. coli и селективного маркерного гена npt-II, а так же проверку трансгениых растений на заражение А. tumefaciens осуществляли с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) по методике, описанной Эдуардсом с соавт. (Edwards К. et al., 1991). Температура денатурации равнялась 93°С, температура отжига npt-II и virB прай-меров с ДНК-матрицей равнялась 55°С , агоА праймера - 65°С , реакция полимеризации проходила при 70°С для npt II и virB праймеров и при 72°С для агоА праймера.

Выделение растительной ДНК и РНК проводили по методикам (Гло-вер Д., 1988).

Выделение плазмидной ДНК, обработку рестрикционными эндонукле-азами, блот-гибридизацию ДНК по Саузерну и дот-гибридизационный анализ растительной РНК проводили по соответствующим методикам (Ма-niatis Т. et al., 1982).

Устойчивость трансгенних растений картофеля к гербициду глифо-сат была исследована в трех типах экспериментов: 1. Тестирование

интенсивности каллусогенеза из листовых дисков на среде с различными концентрациями глифосата, 2. определение прироста биомассы при пролиферации каллуса на среде с различными концентрациями глифосата, 3. учет прироста высоты растений и их выживаемости после обработки различными концентрациями глифосата.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного комплекса статистической обработки экспериментальных данных ЗТЯАг отдела информационно-вычислительного обслуживания МСХА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование ыорфогенных потенций сортов-реципиентов.

Отработка системы эффективной регенерации побегов яв/чется первоочередной задачей при подходе к генетической трансформации любых видов растений с помощью агробактериальных векторов. На первом этапе исследований перед нами стояла задача подобрать оптимальный состав регенерационной питательной среды и определить оптимальное сочетание факториальных условий, которыми являются: генотип картофеля, природа экспланта, питательная среда и способ регенерации для того, чтобы в комбинации с условиями трансформации с наибольшей эффективностью провести генетическую модифицикацию картофеля.

1.1. Изучение влияния индуцирущей среда на стеблевой органогенез в каллусной ткани картофеля.

На основе результатов, приведенных в таблице 1, отобраны индуцирующие среды, которые с наибольшей эффективностью вызывали процесс регенерации побегов. Все использованные варианты регенерацион-ных сред пр.лвляли индуцирующее действие на ткани картофеля всех четырех сортов, но с большей эффективностью каллусная ткань как листа, так и стебля реагировала на среду, содержащую в-качестве индуцирующего фактора 2,5 мг/л зеатина и 0,2 мг/л ИУК в сочетании с 3,0 г'/л сахарозы и 36,0 г/л маннита, (вариант 3), а каллус из микроклубня проявил лучший морфогенный ответ на среде с 0,5 мг/л зеатина, 1,0 мг/л кинетина и 0,1 мг/л ИУК так же в комбинации с сахарозой и маннитом в указанных концентрациях (вариант 6). Эти варианты регенерационных сред были выбраны для проведения дальнейших исс--ледований.

1.2. Зависимость интенсивности стеблевого органогенеза у картофеля от генотипа, происхождения экспланта и способа регенерации.

Морфогенная активность исследуемых сортов картофеля достаточно

четко проявилась в приведенном выше эксперименте. Однако, длительное прохождение неорганизованного роста in vitro способствует повышению риска возникновения генетической изменчивости в популяциях клеток каллусных тканей (D'Amato F., 1985, Сидоров В.А., 1990), из

Таблица 1

Влияние питательной среды на стеблевой органогенез в каллусной ткани картофеля различного происхождения (посажено по 20 каллусов на вариант)

1 ■■ - 1 Генотип 1

!Чари- Ч^п п^ит 1

01\СШ1сШ I |

|ант ткани | Кеннебек Луговской Резерв Ресурс |

1 среды

i i )

А I i В А 1 в 1 А В А в 1 j

1 1 листа | 10 15 14 32 8 И 10 14 |

стебля | 13 35 11 18 16 34 12 19 |

1 2 листа | 12 21 15 54 12 20 12 25 |

стебля | 15 53 11 26 11 20 13 • 36 |

1 3 листа I 16 58 18 88 14 42 14 40 |

стебля | 18 65 15 62 17 51 15 "7 I

1 4 клубня | 12 27 10 17 12 22 10 13 |

1 5 -1 14 34 10 19 13 23 8 15 I

1 6 i i -и — | 1 17 СП 16 38 . i 16 40 14 33 | ......i

А - число регенерировавших каллусов. В - число растений-ре-

генерантов.

которых, в той или иной степени с отражением таковой, возникают вновь образовавшиеся растения. Поэтому поиск альтернативных способов регенерации, сводящих к минимуму нежелательное в нашей работе указанное явление, представлял особо важную задачу.

Из данных, представленных в таблице 2, отчетливо видно, что в трех вариантах способов регенерации морфогенный ответ у картофеля в исследуемых тканях -носил четко определенный характер, а именно: независимо от генотипа процесс стеблевого органогенеза проходил с интенсивностью, характеризуемой следующим возрастающим рядом: прямой органогенезепассируемый каллус<первичный каллус - для листовых и стеблевых тканей, и первичный каллус<пассируемый каллус<прямой ор-

-У-

ганогенез - при использовании кусочков ткани из микроклубня. Анализ ответа генотипа картофеля на природу экспланта, взятого для регенерации, показал, что реализация морфогенетических потенций изучаемых сортов в значительной степени зависит от последней. Так, при иден-

Таблица 2

Стеблевой органогенез у картофеля в зависимости от

генотипа, природы экспланта и способа регенерации (Средние из трех опытов по 25 эксплантов и каллусов на вариант)

I-1-1-1 |

Кол-во регенери- Кол-во регенеран-

| Генотип Способ регенерации ровавших эксплан- тов на один экс-

тов и каллусов, % плант и каллус

I II 111 I II III

прямой органогенез 32.0 44,0 80,0 0.80 1.32 3.08

|Кеннебек первичный каллус 80,0 92,0 72,0 4.68 7.44 1.12

пассируемый каллус 60,0 68,0 76.0 1.99 2,13 2,48

прямой органогенез 69,3 64,0 98.7 2.04 х,88 5.72

IЛуговской первичный каллус 100,0 100,0 56,0 12.40 10,48 0.96

пассируемый каллус 88,0 80,0 64,0 4,33 3,20 1.75

прямой органогенез 40,0 52,0 88,0 0,92 1,53 3,32

1 Резерв первичный каллус 88,0 96,0 60,3 5,36 7,60 • 1.04

пассируемый каллус 72,0 76.0 68,0 2,64 2,36 1,93

прямой органогенез 60,0 56,0. 93,3 • 1,96 1,76 4,72

I Ресурс первичный каллус 100,0 100,0 41,3 10,08 •8,12 0,84

пассируемый каллус ■ 86,7 84,0 52,0 2,85 2,49 1,68

Эксплант ткани: I - листа II - стебля III - микроклубня.

тичных условиях регенерационной среды в эксперименте с листовой и стеблевой тканями, первая обеспечила больший морфогенный эффект для сортов Луговской и Ресурс, а последняя для сортов Кеннебек и Резерв, причем это отмечалось по всем трем способам регенерации.

Сравнительный анализ регенерационного потенциала исследуемых сортов картофеля установил четко выраженную зависимость данного показателя от генотипа. При использовании в качестве исходного экс-

планте как листовых, так и стеблевых сегментов по его величине используемые в работе реципиенты можно расположить в следующей последовательности: Луговской>Ресурс>Резерв>Кеннебек, что наблюдается при всех трех изучаемых способах регенерации. В эксперименте с клубневыми дисками морфогенный эффект от генотипа картофеля в некоторой степени зависел от способа, при котором индуцировались побеги. При регенерации путем прямого органогенеза из кусочков ткани микроклубня более интенсивно по сравнению с сортами Кеннебек и Резерв регенерировали Луговской и Ресурс (в приведенном порядке).. Однако, когда регенерация проводилась в каллусной ткани( как первичной, так и прошедшей процесс пассирования), они отставали от двух первых. Морфогенный потенциал у сорта Кеннебек по сравнению с таковым у сорта Резерв здесь лучший в двух типах каллуса и отставал при способе регенерации прямо из экспланта.

Итак, в первой серии исследований'установлено, что оптимальным способом получения побегов-трансформантов картофеля с помощью агро-бактериального вектора может служить регенерация: в листовых и стеблевых тканях - через первичный каллус, в клубневых тканях -посредством прямого органогенеза. В соответствии с задачей наших исследований регенерацию побегов из инокулированных агробактериями тканей картофеля мы проводили и через пассируемый, отобранный по селективному фактору каллус.

2. Трансформация растений картофеля посредством А. 1итеГас1епз (р6У3850::рРЙЕРЗ).

Отработанная нами система трансформации и регенерации дала возможность получить на селективной среде серию растений-регенеран-тов у всех реципиентных генотипов картофеля (таблица 3). При этом по 9 и 8 укоренившихся на среде с Кш клонов, полученных из культуры инокулированных тканей, изолировано соответственно у сортов Луговской и Ресурс, что по отношению к общему числу побегов составляет соответственно 9,4713,00 и 10,0013,35 % выхода укоренившихся растений. Из 50 обработанных пазушных почек сорта Ресурс на среде без Кш индуцировано 36 побегов, из которых на среде с антибиотиком 1 (2,7812,74 %) образовал корневую систему. Укоренение на среде с Кш не наблюдалось у регенерантов сортов Кеннебек и Резерв, что в полной мере указывает на отсутствие трансформированных растений. Причем пассирование их каллусных тканей на среде с антибиотиком приводило к полной их гибели. По-видимому, эти сорта оказались менее или

_ N

к.

Вот HI

з—^—fW/t

т

>9

Tl «

Ii

n * • .1 r* M_ILi

»«PJ

Л I I I II

fCrmi

'M

I *

рПШ

Fite. i. а - Физическая карта плаз-мвды pFREP3. b - коинтегрант "обе-^ , 35 8»ршпр зоруженной" Ti-плазмиды pGV3850 и

gZZ3 1 2' манаш

..............г ' , , промежуточного вектора pPREP3.

тглш полиемнщироошия ико ?т-ДНН(ЗдГ)ии#а вклюпимсинпкташиСЗ'осе}

BSG пвемгМатеянюст, иеЗц/утцяя пратитниц пеятиЗ

не^ тсприимчивыми к штамму A. tumefaciens pGV3850.

Поскольку селекция на устойчивость к Km не дает полной гарантии получения трансгенных побегов (Van Montagu М. et al, '1984), трансформированный фенотип мы подтвердили при выявлении присутствия в растительном геноме последовательностей ДНК, гомологичных последовательностям исходной плазмиды pPREP3 и соответствующим анализом и тестированием на экспрессию введенных в растения картофеля генов.

2.1. Интеграция Т-ДНК в геном картофеля.

Из 9 проанализированных с помощью метода полимеразной цепной реакции (PCR) на присутствие мутантного агоА гена клонов сорта Лу-говской положительный сигнал давали 6 регенерантов; из 9 проанализированных клонов сорта Ресурс- 2 клона (рис. 2а), что полностью совпадает' с дачными PCR на присутствие гена устойчивости к антибиотику Km - npt-II (рис. 20). На контрольных дорожках (ДНК нетранс-генного растения и реакционная смесь без ДНК) сигналы отсутствуют. Обобщенные результаты осуществления генетической трансформации растений картофеля представлены в таблице 3. В целом листовуе диски в нашей работе являлись наиболее эффективной реципиентной системой; из 8 полученных трансформированных побегов 5 (или 62,50 X из трэнс-формантов) изолировано из листовых ткацей.

-/О-

Таблица 3

Результаты селекции трансформированных A. tumefaciens (pGV3850::pPREP3) растений картофеля

1 _ . . . _ Спо- Количество побегов V 1 1 1

(Исходный Реципиентная соб 1 . .. \Частота |

|генотип ткань реге- |укоренив- |транс- |тргнсфор-|

нера- общее шихся на 1 генных | мации I

ции |Km-среде t 1 1 1 1 | I

лист К1 6 -

|Кеннебек стебель К1 17 - - I

микроклубень кО 10 - - |

паз. почка - 39 - - 1

лист 37 3 3 в,11.10"2|

лист кг 19 4 1 5,26. Ю--2!

|Луговской стебель К1 25 1 1 4,00.10"2|

микроклубень кО 14 1 1 7,14.10~2|

паз. почка - 43 - - I

лист Kl 13 - - |

| Резерв стебель Kl 21 - - 1

микроклубень чО 8 ь - - 1

паз. почка - 45 - |

лист Kl 29 1 1 3,45.10"г|

лист к2 21 7 . - |

| Ресурс стебель Kl 13 - - |

м! ;роклубень кО 17 - - |

паз. почка > } 36 I 1 1 2,78.10"2| |

Обработано агробактериями по каждому варианту 150 сегментов листа и стебля. 100 сегментов микроклубня и 50 пазушных почек.

АгО - регенерация прямо из экспланта. к1 - первичный каллус. к2 - пассируемый каллус.

Р итоге по двум исходным сортам и различным системам регенерации мы получили трансгенные линии картофеля, которые были обозначе-

- //-

а

М 5 6 Т И 10 II

и!«} Ын I

и З 4 ! С 7 I 9 10

О я-ш

1ИГ1ПГ1

В

б

Рис. 2. Электрофоретическое разделение продуктов лолимеразноЯ цепной реакции: а - специфических для агоА гена (размер продукта реакции 700 п. ч); дорожки 1-9 - растения сорта Луговской: 2) К2.02, 3) К2.03. 4) К2.04. 5) К2.05. 6) К2.07. 7) К2.09; 10) Л ВЙГ1 X (650 п.н.); 11-19 - растения сорта Ресурс: 18) К49.01. 19) К49.10; 20) нетрансгенное растение; 21) реакционная смесь без ДНК: 22) плазмида рРЯЕРЗ. 6 - специфических для пр(:-11 гена (размер продукта реакции 700 п.н.); дорожки 1-6 - линии сортл Луговской: 1) К2.02. 2) К2.03, 3) К2.04. 4) К2.05. 5) К2.07, б) К2.09; 7) Л. Ве-11; 8-9 - линии сорта Ресурс: 8) К49.01. 9) К49.10: 10) нетрансгенное растение; 11) плазмида рР(?ЕРЗ. в - специфических для у1гВ гена (размер продукта реакции 660 п.н.): дорожки - 1) К49.01, 2) К49.10. 3) нетрансгенное растение. 4) 5) К2.03. 6) К2.04. 7) К2.05. 8) К2.07. 9) К2.09. 10) агробактериальная плазмида рБУЗабО.

ны: У сорта Луговской - линии К2.02, К2.03, К2.05 - из первичного листового каллуса, линия К2.04 - из первичного стеблевого каллуса, линия К2.07 - из пассируемого листового каллуса, линия К2.09 - через прямой органогенез на дисках микроклубней; у сорта Ресурс - ли-

ния К49.01 - ив пазушной почки, линия К49.10 - из первичного листового каллуса. Отсутствие агробактеризлыюго заражения в них было подтверждено ПЦР с праймером, комплементарным у1гВ-области ТЬплаз-миды А. 1шеГас1епз (рис. 2"). В отличие от контрольной плаэмиды

115 4 5 6 7» 9 1»«

Рис. 3. Блоттинг-гибридизация по Саузерну геномной ДНК трансгенных линий картофеля с использованием "Р-меченой ДНК ллазмиды, содержащая последовательность мутантного агоА гена. Дорожки: 1) 1,5x10 мкг плазмиды рРКЕРЭ (соответствует 5 копиям гена в пересчете на 10 мкг ДНК картофеля). 2) нетрансформированное растение. 3) К2.02. 4) К2.03, 5) К2.04. б) К2.05. 7) К2.07. 8) К2.09. 9) К49.01. 10) К49.10. Ш тотальная ДНК А. иш1еГас1епз (рЕУг'350': : рРЯЕРЗ) .

рвУ3850, в исследуемых трансгенных линиях мы не наблюдали продукта реакции нужного размера (660 п.н.). Следовательно, результаты ЩР на присутствие прЬ-И и мутантного агоА генов можно считать достоверным доказательством интеграции 'Г-ДНК в геном картофеля и трансформированной природы отобранных линий, что было подтверждено блот-.тинг-гибридизацией по Саузерну тотальной растительной ДНК, обработанной рестрикционной зндонуклеазой ЕсоИ1 с 32Р-меченой последовательностью агоА гена. ЕсоК1-рестриктаза была выбрана с целью идентификации изменения размера гибридизукяцегося с зондоь фрагмента при интеграции Т-ДНК из коинтегранта в геном растений. Есо!?1 сайт является уникальным в промежуточном векторе и ближайший ЕсоИ сайт в плазмиде рвУЗ 50 находится за пределами Т-ДНК. Как видно на рис. 3, только в ^НК трансгенных линий зафиксированы сигналы, а в ДНК контрольного растения сигнал отсутствует. Одновременно в эксперименте определялась копийность встроенного в геном картофеля гена. Исходя из сравнения интенсивности зон гибридизации растительной и исходной •ДНК можно определить, что трансформированные растения картофеля, вероятно, содержат от 1 до 12 копий мутантного агоА гена. Большое' количество полос в треках и различие в их интенсивности говорят . о неоднородном • и многократном встраивании гена в р?.зличных участках

-УЗ-

растительного генома, а так же о вероятности его тандемного встраивания.

4. Устойчивость трансгенных растений картофеля к гербициду глифосат.

Ранее были проведены эксперименты, выявившие высокую степень устойчивости полученных трансформантов картофеля к антибиотику ка-намицину, Ч' з подтверждает экспрессию в них сцепленной с агоА геном в генетической конструкции кодирующей области бактериального фермента неомицинфосфотрансферазы-II. Проведением соответствующих биотестов показано наличие в отобранных трансгенных линиях картофеля признак толерантности к гербициду глифосату, свидетельствующий об

jtr/iafeevu

осуществлении в их клеткгОгинтегрированного в геном проклонирован-ного из бактериальных клеток Е. coli м/тантного агоА гена.

4.1. Устойчивость на уровне каллусной ткани.

Результаты, представленные на рис. 5, получены на основе измерения индекса пролиферации из десяти навесок каллу:а (отношение абсолютного прироста биомассы к сырой массе каллуса в начале пассажа) иллюстрируют интенсивность роста трансгенного и контрольного каллусов на среде с различными концентрациями глифосата. Видно, что прирост каллусной биомассы контрольных растений за 4 недели практически прекращался на среде с О.оО мМ глифосата, в то время как трансгенные каллусы сохраняли пролиферативную активность на среде, содержащей гербицид вплоть до 5,00.мМ. Стабильный рост,не уступающий росту i.jjmyca на среде без глифосата, происходил до концентрации контроль к.шамицин глифосат 11

Рис. 4. Каллусообразование на листовых дисках ^трансформированного растения (а) и одной из трансгенных линий картофеля - К2.04 (б) на среде с канамицином (50 мкг/мл) и глифосатом (0.5 мМ).

' /У-

2,00 мМ гербицида для каллусной ткани линий К2.02, К2.05, К2.09, и 1,00 мМ для К2.03, К2.04, К2.07 и К49.10 (уровень значимости=5 %). Менее устойчивой к глифосату оказалась каллусная ткань, индуцированная из фрагментов листа л:;нии К2.01. Из диаграммы видно, что трансгенные каллусы сорта Луговской значительно более резистентны к Рис. 5. Интенсивность пролиферации каллуса из трансгенных агоА-несувдих линий и исходного растения картофеля на среде с различными концентрациями глиФОсата.

7, к контроле

250 --

200 150 100 50 О

О 0,25 0.50 0.75 1.00 2,00 3,00 5,00

концентрация гли^осата, мМ

СЗ Лугмсто» ШЗ кг.02 □ К7.03 О К2.04

ИЗ кг.» СИ кг.о7 ЕЕЗ кг.оо

% к контроле * НО --

120-----П----------П-------------------

100 80 60 40 20 О

, 0 0,25 0,50 0,75 .1,00 2,00 3,00 5,00 концентрация глифосага, мМ

СЭ Ресурс КЫ К49.С . СШЗ К49.10

-УУГ-

гербициду, чем трансгенные каллусы сорта Ресурс,несмотря на го, что индукция калл/сооСразования (как на среде с глифосатом, так и на среде без него) всегда происходила у последних более интенсивно. 4.2. Устойчивость на уровне интактного растения. Результаты пробит-анализа действия различных концентраций гер-Рис. 6. Ростовая активность трансгенных агоА-несущих линий и исходно! о растения картофеля при их обработке различными концентрациями глиФосата.

кониентр пция глифосата, мМ

• Луговспоя —<~ К2.02 кг.03 К2.0Л

-*- «2.05 К2.07 -*- кг.09

% к контро/ю

концентрация глифосата, мМ • Ресурс —К49.01 -*- К49.10

бицида на ростовую активность растений установили, что по уровню устойчивости к глифосату полученные нами агоА ген-несущие трансгенные линии картофеля можно расположить в следующей последовательности: К2.03Ж2.02Ж49.01Ж2.05 К2.07Ж2.04Ж49.10 Ж2.09 (таблица 4). Эти данные основаны на измерении 4-х недельного среднего прироста из 10 обработанных растений, выраженного в % к высоте растений в начале обработки (3-х недельные растения). Для опрыскивания растений мы использовали рабочие растворы, приготовлении? из технического препарата (Раундап, изопропиламиновая соль - 36Х д.в.), выпускаемого фирмой Мопэапи.

Особо важным показателем в э^ом эксперименте являлась выживаемость растений при их обработке гербицидом. Так, уже через двое суток после обработки глифосатом в концентрации 1 мМ наблюдалось увядание апекса исходных нетрансформированк .х растений,а в дальнейшем растения быстро желтели и погибали, причем отмечалось это уже при воздействии 0,1 мМ глифосата с тем лишь отличием, что процесс происходил медленнее, тогда как трансгенные растения выдерживали обработку глифосатом при концентрациях от 5,0 до 30,0 мМ. Как видно из рис. 6, растения трансгенных линий п2.02, К2.03, К2.05 и К49.01 выживали при опрыскивании "лифосатом в концентрации до 00,0 мМ, линии

Таблица 4

Характеристика трансгенных (р6У3850:: рР!?ЕРЗ; агоА, прЬ-И) линий картофеля по уровню устойчивости к антибиотику кана-мицину и гербициду гл"фосат *

г

|Транс-|генные I линии

| К2.02 1 К2.03 | К2.04 | К2.05 | К2.07 | К2.09 М9.01 1К49.10

устойчивость, ш50

174,2229 2.30,7811 191,9514 196,4632 219,6228 175,1734 110,2269 118,6175

0,9207 1,0602 2,8821 1,1170 1,1301 0,2689 0,4726 2,3345

9,4900 9,4900 9,4900 9,4900 9,4900 9,4900 9,4900 9,4У00

19.55СЗ 20,9618 8,1035 14,2084 10,8397 3,0734 14,7516 6,7272

5,0098 5,3501 0,8695 5,5337 0,7787 3,5777 6,8053 0,6897

7,81001 7,8100( 5,9900| 7,8100| 3,84П0| 3,8400| 7,8100) 3,8400|

К2.07 до 20,0 mW, линий К2.04 и К49.10 до 10,0 мМ, а К2.09 до мМ. Однако, g сравнении с контрольным вариантом (без гербицида) и растениями исходного типа без глифосата их рост был замедлен.

5. Экспрессия в трансгенных растениях картофеля мутантного агоА гена Е. coli.

Для подтверждения экспрессии введенного мутантного агоА гена Е. coll в '.рансгенных линиях картофеля проведен анализ РНК методом Нозерн дот блот-гибридизации. Гранскрипт, соответствующий последовательности мутантного агоА гена и последовательности, кодирующей транзитный пептид MC РБФК/0 гороха, зарегистрирован у всех трансгенных линий картофеля как в интактных растениях (рис.. 8а), так и в каллусных клетках (рис. 86), что свидетельствует о том, что резистентность к глифосату происходит за счет накопления продукта трансляции - мутантной EPSP-синтетазн в хлоропластах. Это подтверждается большей выносливостью к гербициду у интактного активно фотосинтези-рующего растения в сравнении с каллусной тканью, что, как видно из сигналов РНК-гибридизации, связано с различной генной активностью, обусловленной физиологическими особенностями двух типов клеток.

Саузерн блот-гибридизационный анализ выявил вполне заметную

i Z 3 '! S S 7 в 9 (О

а ; -Л

4'' 4.V* tj? с ... &

i г 3 1 5 6 7в э 10 « * i & & * - ф

. « о * © о Ц

Рис. 7. Нозерн дот блоттинг-гибрндизация РНК трансгенных линий картофеля. На точку накосили 10 мкг РНК и соответствующее разведение в 3 раза, а - интактное растение: дорожки: 1) К2.02. 2) К2.03. 3) К2.04. 4) К2.05. 5) К2.07. б) K2.0G. 7) К49.01. 8) К49.10, Ч) нетрансгенное растение. 10) плазмида PFREF3. б - кал- 0 лусная ткань; дорожки: 1) К2.02. 2) К2.03. 3) К2.04. 4) К2.05. 5) К2.07. 6) нетрансгенный каллус. 7) К2.09. S) К4Р.01. 9) К49.10. 10) ДНК Е. coli без мутантного агоА гена. 11) плазмида pPREF3.

-a-

связь между копийностью встроенного в геном картофеля мутантного бактериального гена и уровнем его экспрессии в полученных трансгенных линиях: при большом и примерно среднем числе копий гена большинство трансгенных линий в сравниваемых условиях показали высокую степень его экспрессии. Однако, опираясь прежде всего на показатели экспрессии у линий К2.02, К2.05 и К49.01 можно предположить, что разница в уровнях экспрессии мутантного бактериального агоА гена у отобранных трансформантов в значительной степени может быть обусловлена сайтом инсерции гена в растительную хромосому. Тем не менее, как видно из таблчцы 4, самой высокой толерантностью к глифо-сату обладает линия К2.03, точно в соответствии с самым большим у нее числом копий встроенного мутантного агоА гена, что обеспечивает в ее клетках высокий уровень его экспрессии. Видимо, высокая копий-ностъ гена при "удачном" местоположении растительном геноме вносит большой вклад в уровень устойчивости к гербициду, даже без увеличения уровня его транскрипции, что наблюдается на примере К2.02..

Следует отметить отсутствие полного соответствия между уровнями транскрипции с мутантного агоА гена у трансгыных линий К2.02, К2.04, К2.04 и К2.09 и их резистен.ностью к глифосату, а также тот факт,что, несмотря на бспее высокий уровень агоА-мРНК в трансгенных каллусах линий сорта Ресурс по сравнению с каллусами сорта Луговс-кой. последние оказались более выносливыми к гербициду. Таким образом, наряду с уровнем генной экспрессии, существенное влияние на устойчивость к глифосату " трансгенных ¿астений, по-видимому, могут оказывать и другие регуляторные механизмы в клетках, в частности стабильность продукта транскрипции и/или транслируемой EPSP-синте-тазн, а так же правильная ее компартментализация, обусловливающая ее активность. Для того, чтобы точнее объяснить, различие в уровнях толерантности полученных трансгенных линий картофеля к гербициду глифосат необходимы дополнительные исследования, направленные прежде всего на определение кинетических параметров кодируемой агоА геном Е. coll мутантной EPSP-синтетазы. Несмотря на эти замечания, результаты наших исследований свидетельствуют о( интеграции в геном картофеля бактериального гена устойчивости к гербициду глифосат и ■его экспрессии с a5S промотора РНК ВМЦК в трансгенных растениях. Следует отметить, что стандартная норма расхода глифосата, применяемая в полевых условиях, составляет! кг/га д.в.. что в зависимости

от нормы расхода рабочего раствора находится в пределах 10 мМ. Таким образом, 4 из 8 полученных трансгенных линий картофеля выносят обработку глифосатом в концентрации, примерно в три раза превшцаю-т.ей используемую на полях для эффективного контроля над сорняками.

В заключение необходимо отметить, что ввиду замедленного роста глифосаттолерантных растений при их обработке гербицидом в сравнении с исходными растениями без глифосата возникает задача дальнейшего повышения уровня их устойчивости в условиях реально^ биотехнологии при массовом применении гербицида.

Выводы

1. Наиболее эффективным способом регенерации побегов в тканях картофеля является: в первичном каллусе - для эксплантов тканей листа и стебля, и посредством прямого органогенеза - для клубневой ткани.

2. Кратконременное (2-3 ч) выдерживание растительных тканей в суспензии уробактерий с последующей инкубациеГ на агаризованной среде оказалось наиболее подходящей методикой для получения трансформантов картофеля.

3. Компетентность растительных клеток к генетической трансформации и/или восприимчивость к агрооактериальному заражению или штамму агробактерий зависит от генотипа. Получены трансгенные растения сортов Луговской и Ресурс.

4. Листовая ткань являлась наиболее эффективной для трансформации рецилиентной системой. Из 8 обнаруженных трансформантов в ней получено 5 или 62,50 Z трансформированных побегов.

5. Полученные трансгенные растения картофеля представляют собой индивидуальные клоны, отличающиеся по количеству копий вставок интегрированного в геном мутантного агоА гена, уровню его экспрессии и устойчивости к гербициду глифосат.

6. Различие в показаниях экспрессии мутантного агоА гена Е. coll у трансгенных растений картофеля может быть связано как с ко-пийностью интегрированного гена, так и с сайтом его инсерции в растительную хромосому.

7. Независимо от уровня экспрессии интегрированного в геномо картофеля бактериального агоА гена существенную роль в обеспечении признака устойчивости к глифосату играют, по-видимому, и другие ре-гуляторные механизмы в клетках, в частности стабильность агоА-мРНК и/или трансл 'руемой EPSP-сигтетазы, а так же правильная ее компарт-

-го-

менталпзация, обусловливающая се активность.

8. 4 из 8 отобранных трансгенных линий картофеля выдерживают обработку глифосатом в концентрации до 30 мМ, что примерно в три раза превышает стандартную норму, применяемую в полевых условиях для эффективного контроля над сорняками.

9. Несмотря на приобретенную глифосатоустойчивость, трансгепные растения картофеля при их обработке гербицидом все же отстают в росте от контрольного варианта (без глифосата), а также от растений исходного типа без гербицида, что указывает на необходимость дальнейшего повышения уровня их резистентности в условиях реальной биотехнологии при массовом применении гербицида.

1. Кабраль Эекаланте Б., Симонова М. Л., Кобсц Н. С, Метт В. Л., Шевелуха В. С., Пирузян Э. С. Expression of bacterial glyphosate-toleranci gene in potato plants. Eighth IUPAC congress of pesticide chemistry. Washington, D. С., UCA, July 4—9, 1994.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

Объем VU п. л.

Заказ 282

Тираж WO

Типография Издательства МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44