Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ (SOLANUM TUBEROSUM L.), УСТОЙЧИВЫХ К ГЕРБИЦИДУ ГЛИФОСАТ ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ МУТАНТНОГО АГОА ГЕНА Е. COLI

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ (SOLANUM TUBEROSUM L.), УСТОЙЧИВЫХ К ГЕРБИЦИДУ ГЛИФОСАТ ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ МУТАНТНОГО АГОА ГЕНА Е. COLI"

л-ззззч

На правах рукописи

КАБРАЛЬ ЭСКАЛАНТЕ БЬЕНВЕНИДО

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ (SOLANUM TUBEROSUM L.), УСТОЙЧИВЫХ к ГЕРБИЦИДУ ГЛИФОСАТ ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ МУТАНТНОГО

aroA ГЕНА Е. coli Специальность 03.00.23 — Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственнон академии имени К- А. Тимирязева и в отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель — доктор биологических наук, академик РАСХН В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты; доктор биологических наук М. Ф. Шемякин, кандидат биологических наук Н. В. Хадеева.

Ведущее учреждение—Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Защита состоится.........і998 г.

о .... часов на заседании диссертационного совета Д.20.40.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан........ 1998 г.

Ученый г >етарь диссертации совета —

кандидат би^ .ах паук

С. А. Меликова

«ПАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

и^аЛЬИТСЛ пробя°ыы' Современное растениеводство обладает неисчерпаемыми возможностями. Достаточно сказать. что HcnoZ^I

izrze ВРеМЯ С0РТа И Гй0РВДЫ «« се Ь ~ Г "сГ — =::=

свыше 1000 ц/га Щ,7е7у1ГВ 0 ^Г СВеКЛа И Ка№*ы,ь *

я^Г Д И3 ВаЖНШ причик данного положения, несомненно

КИ. но и на культурные виды растений в прп™ и „„ 0рня

РИЯХ И Р^ЙХ инги0иР№ЩНй в бакте-

синтегаза), 2 0И ГГТ'^ Синтетаз^ (EPSP-

нокислот. В J „ H б^ЙНТе3а аршатических ами-

« лнк. в Z71TIITZ12 "5ТГлокусом плаз" является хлорогшстнш знаимом^^.Га! S^™ В

ний в структурной ^ "^Г SaMeHa 0ДН0Й пары ОСНОва" в положении К Замещению серика на ^

«ого типа (Stalker о.ГetTшъ

лучены мутации, сооо~ Z'^IT Escherlchla «>11 также по-осуцествлено КгРеЭИСТеНТНадТЬ * так,

глифосату ТИРУЮЩеГ° шсок°Р«зистентную i

табака. ro^JTrylZIZnnJcZ^T Растения

—^ г^-жт гягтг^т:

доиэменить тактику борьбы и J ' СуЩвСтвен™

прежде всего на уменьш^и калии^-р Последнее имеет важное значке ПрИМеняе*« гербицидов,

ческой прополки с У^тГ ip^LTT ПРСЙЛеШ йрим« *ими-

ЦН6 МСХА | фонд научной литес

мд научной литературы

глифосатрезистентных растений картофеля в связи с частым применением этого гербицида для борьбы с различной сорной растительностью в посадках этой важнейшей продовольственной культуры.

Цель и аадачм. Цель настоящей работы - введение в геном картофеля мутантного агоА гена Е. coli, кодирующего мутантную EPSP-син-тетазу для получения устойчивых линий к гербициду глифосат. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать оптимальные питательные среды для индукции побегообразования в реципиетных тканях картофеля.

2. Отработать экспериментальную систему регенерации растений.

3. Провести трансформацию картофеля агробактериальной векторной конструкцией pGV3850::pPREP3 и изучить экспрессию бактериального мутантного агоА гена в трансгенных растениях.

4. Провести тестирование трансгенных растений на устойчивость к селективному антибиотику канамицину и гербициду глифосат.

Научная ношена и практическая значимость. В настоящей работе впервые получены трансгенные растения картофеля, в которых экспрес-сируется бактериальный мутантный ген устойчивости к гербициду глифосат -с принципиально новой точечной мутацией в его структурной части, заключающейся в замене 6 на С в нуклеотнлной последовательности гена дикого типа, приводящей к замещению адалина на пролин в 104 положении аминокислотной последовательности кодируемой EPSP-синтетазы. Проведено детальное исследование интеграции в растительный геном мутантного агоА гена, его организации и экспрессии в трансгенных растениях картофеля. Показано, что индивидуальные клоны различаются как по количеству копий встроенного гена, так и уровню его экспрессии и\или толерантности к глифосату. Выявлено, что уровень экспрессии гена в трансгенных растениях картофеля может зависеть как от количества копий, так и его инсерционного сайта в хромосому.

Показано, что реализация морфогенных потенций у картофеля в значительной степени зависит от способа регенерации побегов. Отмечена явная зависимость эффективности агробактериальной трансформации от природы реципиетных растительных клеток. Отработана эффективная система трансформации и, таким образом, данная работа предоставляет определенный методический подход к переносу генов в растения при использовании агробактериальных векторов.

Полученные трансгенные линии картофеля могут Оыть использованы

для дальнейших исследований по повышению их уровня толерантности к глифосагу с целью применения в качестве селекционного материала.

Апробация работы. Материалы диссертации отражены в отчетах кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ЮА и являются часть» программы исследований "Получение трансгенных растений картофеля, томатов, сои и люцерны путем введения бактериальных генов". Докладывались на заседаниях кафедры (ежегодно), научных семинарах в отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики РАН, научной конференции МСХА, на 8 Международном конгрессе IUPAC по химии пестицидов (Вашингтон, ОНА. 1994),

Структура м объём работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методический раздел, результаты и обсуждение, выводы. Содержит таблиц и рисунков. Библиография включает источников отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Растительный материал. Исходным материалом служили растения четырех генотипов картофеля (Solarium tuberosum L.): сортов Кенне-бек, Луговской, Резерв и Ресурс, предоставленные НИИ картофельного хозяйства (п. Коренево, Моск. обл.). Источником реципиентных клеток для трансформации являлись фрагменты ткани листа, стебля, микроклубня и пазушные почки из стерильных пробирочных растений.

Агробак термальный «гамм н пяаэывда. Растительные ткани инфицировали штаммом A. tumefaclens pGV3850, в котором участки Т-ДНК в Ti-плазмиде, определяющие онкогекность, замещены на последовательности pBR322. Он несет коинтегрант "обезоруженной" Tl-плазмиды и промежуточного (интегративного) вектора рРКЕРЗ, полученного в лаборатории доктора Пирувян Э.С. (отдел молекулярной генетики растений. Институт молекулярной генетики РАН). Данная векторная плаэмида содержит мутантньгй ген агоА Е. coll, за исключением последовательностей, кодирующих две N-концевые аминокислоты и последовательность, кодирующую транзитный пептид малой суйьединицы РВФК/о гороха (обеспечивающий транспорт мутантной EPSP-синтетазы в хлоропласта) под контролем 353 промотора РНК вируса цветной капусты (ВМЦК).

В исследованиях применяли: Агарозу (Sigma), рестрикционные эн-донуклеазы (Fermentas). тритонХ-100 (Ferak), GuS CN (Fluka), sarco-

syl (Sigma), KIT PO? (Biopol); антибиотики - Канамишш (KmJ, карбе-кициллин (Cb), рифдмпицин (Rf), спектиномицин (Sp), стрептомицин (Sm) (отечественное), цефотаксим (Cx) (Roussel); фиторегуляторы -ВАЛ (б-Сенэиламинопурин), зеатин (6- [4-окси-3-метил-транс-2-бутени-ламино]пурин), кинетин (б-фурфуриламинопурин), 2,4-Д (2.4-дихдорфе-ноксиуксусная кислота). ИУК ( р-индол ил-3-y ксусная кислота ). НУК (а-нафтилуксусная кислота) {Serva); глифосат - стандартный препарат, технический препарат (Раундап, изопропиламиновая соль, 36 X д.в.) (Monsanto).

Мндукцмм каллусной ткаки на листовых и стеблевых эксллантах проводили на среде с 6,0 мг/л 2,4-Д в сочетании с зеатином (0,05 мг/л) и кинетином (0,2 мг/л). Для субкультивирования каллуса концентрация 2,4-Д составила 3 мг/л. На клубневых эксплантах (микроклубня) каллус получали и суОкуль т ив и ровал и соответственно на средах с 3 и 2 мг/л 2,4-Д, зеатином и кинетином в тех же концентрациях. За основу питательного субстрата взята среда MS с модификацией по составу биологически активных веществ.

Регенерация растений. Исследовали три варианта ре генерационных сред в каллусной ткани из листа и стебля» содержащие: 1. 2 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л ИУК, 0,1 мг/л НУК; 2. 0.5 мг/л кинетина. 1,0 мг/л зеатина, 0,2 мг/л ИУК; 3. 2,5 мг/л эеатина, 0,2 мг/л ИУК и три варианта в клубневом каллусе, содержащие: 4. 3.0 мг/л 6-БАП, 0.1 мг/л ИУК, 0,03 мг/л НУК; 5. 1.0 мг/л кинетина, 0,5 мг/л 6-БАП. 0,1 МГ/Л ИУК; 6. 1,0 мг/л кинетина, 0,5 мг/л зеатина, 0,1 мг/л ИУК. Основой питательного субстрата служила среда MS, несколько измененная по составу биологически активных веществ. Стеблевой органогенез изучали в трех вариантах способов регенерации: посредством прямого органогенеза из зксплакта, в первичной и в пассируемой (4 пассажа) каллусной ткани. Культивирование проводили в течение 12 недель с пересадкой тканей на свежую среду каждые 3 недели.

Получение бактериальной культуры. Агробактерии выращивали на твердой (агар 1,5 X) и жидкой LB-среде (Миллер Дк., 1977). в которую добавляли: MgSÛ4.7H20 - 2.1СГ3 M, сахарозу - 0,2 Г и антибиотики - СЬ - 100 мкг/мл, Rf - 50 мкг/мл, Sp - 50 мкг/мл. Sin - 100 мкг/мл. Для получения инокулята ночную агробактериальную культуру разводили в соотношении 1:50 соответствующей жидкой средой ДЛЯ культивирования растительных тканей.

Трансформация и селекция. Методика инокуляции тканей картофеля

A. tumefaclens была несколько модифицирована, фрагмента тканей кратковременно (2-3 ч) выдерживали в суспензии агрсбактерий при одновременном умеренном круговом вращении (110-120 оЭ/мин) на термостат ируемой качалке при температуре 25±1°С, после чего зараженные ткани перемещали на соответствующую агаризованную среду и инкубировали при стандартных условиях в течение 12-36 ч. Селекцию трансформированных тканей и регенерннтов вели на среде с 50 мкг/мл Km. Лг-робактерии удаляли добавлением в среду 500 мкг/мл Сх, который в норме нетоксичен для растительных клеток. Достигшие высоты около 1 см растеньица-регенеранты укореняли на среде с 500 мкг/мл Сх и 50 мкг/мл Km для дальнейшей селекции, минеральными элементами по MS, без органических добавок. Укоренившиеся побеги расчеренковывади на среде того ле состава без антибиотиков.

Трансформация пазушних почек. В области пазушной почки, еще не пошедшей в рост, хорошо отточенным скальпелем проводили надсечку и в место поранения стерильной петлей или стеклянной палочкой наносили каплю жидкой культуры агробактерш, пометали черенки с зараженными почками на безгормональную агаризованную среду и инкубировали при стандартних условиях в течение 12-36 ч. Наращивали проростки на среде того же состава с 500 мкг/мл Ск. Выросшие побеги расчеренковывади на среде, содержащей 50 мкг/мл канамицина.

Анализ на присутствие в геноме картофеля мутантного аг о А гена Е. coli м селективного маркерного гена npt-II. а так ж проверку трансгенных растения на заражение Д. tumefaclens осуществляли с' помощью метода подимеразной цепной реакции (PCR) по методике, описанной Эдуардсом с соавт. (Edwards К. et al., 1991). Температура денатурации равнялась 93°С, температура отжига npt-U и "virB прай-меров с ДНК-матрицей равнялась 55°С , агоА праймера - 65°С , реакция полимеризации проходила при 70°С для npt-ІІ и vlrB праймеров и при ?2°С для агоА праймера.

Вццеление растительной ДНК и РНК проводили по методикам (Гло-вер Д., 1988).

Внделеиие плазмидной ДНК. обработку рестрикционными эндонукле-азами, блот-гнбрюкзацжо ДНК по Сзузерну и доттибрндизацнонний анажкв растительной РНК проводили по соответствующим методикам (Ма-niatls Т. et al., 1982).

Устойчивость трансгвнннх растений картофеля к гербициду гдифо-сат была исследована в трех типах экспериментов: 1. Тестирование

интенсивности каллусогенеза из листовых дисков на среде с различными концентрациями глифосата, 2. определение прироста биомассы при пролиферации каллуса на среде с различными концентрациями глифосата, 3. учет прироста высоты растений и их выживаемости после обработки различными концентрациями глифосата.

Статистичесиу» обработку результатов проводили с использованием программного комплекса статистической обработки экспериментальных данных ЭТЛдг отдела информационно-вычислительного обслуживания МСХА.

РЕЗУЛЬТАТЫ N ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование иорфогеннмх потенций сортов-реципиентов.

Отработка системы эффективной регенерации побегов является первоочередной задачей при подходе к генетической трансформации любых видов растений с помощью агробактериальных векторов. На первом этапе исследований перед нами стояла задача подобрать оптимальный состав регенерационной питательной среды и определить оптимальное сочетание факториальных условий, которыми являются: генотип картофеля, природа экспланта, питательная среда и способ регенерации для того, чтобы в комбинации с условиями трансформации с наибольшей эффективностью провести генетическую модифицикацию картофеля.

1.1. Изучение влияния индуцирующей среда на стеблевой органогенез в кадлусной ткани картофеля.

' На основе результатов, приведенных в таблице 1, отобраны индуцирующие среды, которые с наибольшей эффективность» вызывали процесс регенерадии побегов. Все использованные варианты регенерацион-ных сред проявляли индуцирующее действие на ткани картофеля всех четырех сортов, но с большей эффективностью кадлусная ткань как листа, так и стебля реагировала на среду, содержащую в качестве индуцирующего фактора 2,5 мг/л зеатина и 0,2 мг/л ИУК в сочетании с 3.0 г/л сахарозы и 36,0 г/л маннита (вариант 3), а каплус из микроклубня проявил лучший морфогенный ответ на среде с 0.5 мг/л зеатина, 1,0 мг/л кинетина и 0,1 мг/л ИУК так же в комбинации с сахарозой и маннитом в указанных концентрациях (вариант 6). Эти варианты регенерационных сред были выбраны для проведения дальнейших исследований.

1.2. Зависимость интенсивности стеблевого органогенеза у картофеля от генотипа, происхождения экспхамта и способа регенерации.

Морфогенная активность исследуемых сортов картофеля достаточно

четко проявилась в приведенном выше эксперименте. Однако, длительное прохождение неорганизованного роста in vitro способствует повышен»» риска возникновения генетической изменчивости в популяциях клеток каллусных тканей (D'Amato F., 1985, Сидоров В.A.. 1990), ив

Таблица 1

Влияние питательной среды на стеблевой органогенез в каллусной ткани картофеля различного происхождения (посалено по 20 каллусов на вариант)

1----------1 ■ 1 Генотип .....1

|Вари- *

¿ксплант 1 1

|ант ткани Кенкебек 1 Луговской Резерв Ресурс )

(среды

[ ! 1 ' 1

А I * В 1 А ! В г А I i В А I ■ в !

1 1 листа 10 15 1 14 32 8 11 10 14 1

стебля 13 35 1 11 18 16 34 12 19 1

1 2 листа 12 21 1 15 54 12 20 12 25 |

стебля 15 53 1 и 26 11 20 13 36 |

1 з листа 16 58 | 16 88 14 42 14 40 |

стебля 18 65 1 15 62 17 51 15 57 |

1 4 клубня 12 27 I 10 17 12 22 10 13 |

t 5 14 34 1 ю 19 13 23 8 15 1

1 6 17 54 1 16 38 16 40 14 33 |

1 > 1

А - количество регенерировавших клллусов. 8 - количество ростекий-регенерантов.

которых, в той или иной степени с отражением таковой, возникают вновь образовавшиеся растения. Поэтому поиск альтернативных способов регенерации, сводящих к минимуму нежелательное в нашей работе указанное явление, представлял особо важную задачу.

Ив данных, представленных в таблице 2, отчетливо видно, что в трех вариантах способов регенерации морфогенный ответ у картофеля в исследуемых тканях носил четко определенный характер, а именно; независимо от генотипа процесс стеблевого органогенеза проходы с интенсивность», характеризуемой следующим вое растащим рядом: прямой органогенезе пассируемый каллус<первичный каллус - для листовых и стеблевых тканей, и первичный каллус<пассируемый каллус<прямой ор-

ганогенез - при использовании кусочков ткани из микроклубня. Анализ ответа гзнотипа клртофеля на природу экспланта, взятого для регенерации. показал, что реализация морфогенетических потенций изучаемых сортов в значительной степени зависит от последней. Так, при иден-

Таблица 2

Стеблевой органогенез у картофеля в зависимости от генотипа, природы экслланта и способа регенерации (Средние из трех опытов по £5 зксплантов и каллусов «а вариант)

I-1--1-1—1-1

Кол-во регенери- |Кол-во регенеран-| ровавтих эксплан-)tob на один экс- | тов и каллусов, %1плант и каллус I 1 II Ш| I II Ш I

Генотип

Способ регенераций

-1

0,80 1,32 3.08] 4,60 7.44 1,121 1,99 2,13 2,4SI

Кеннебек

прямой органогенез первичный каллус пассируемы:*! каллус

32.0 44.0 80,0 80,0 92,0 72,0 60,0 68,0 76,0

-1

2,04 1.88 5.721 12,40 10,46 0,96| 4,33 3.20 1,75|

Луговской

прямой органогенез первичный кадлус пассируемый каллус

69,3 64,0 98,7 100.0 100,0 56,0 88.0 80,0 64.0

Резерв

прямой органогенез первичный каллус пассируемый каллус

40,0 52,0 88,0 88,0 96,0 60,3 72,0 76,0 63.0

0,92 1,53 3,321 5,36 7,60 1,041 2,64 2,36 1.031

Ресурс

прямой органогенез первичный каллус пассируемый каллус

60,0 56.0 93,3 100,0 100,0 41,3 86,7 84,0 52,0

1,96 1,76 4,72( 10,08 8,12 0.841 2,85 2,49 1,68(

Экс п л ант ткани:, I - лист«. П - стебля. III - мякроклубн*.

тичных условиях регенерационной среды в эксперименте с листовой и стеблевой тканями, первая обеспечила больший морфогенный эффект для сортов Луговской и Ресурс, а последняя для сортов Кеннебек и Ре-верв, причем это отмечаюсь по всем трем способам регенерации.

Сравнительный анализ ре генерационного потенциала исследуемых сортов картофеля установил четко выраженную зависимость данного показателя от генотипа. При использовании в качестве исходного экс-

пданта как листовых, так и стеблевых сегментов по его величине используемые в работе реципиенты можно расположить в следующей последовательности: Луговской>Ресур^Резерв>Кеннебек, что наблюдается при всех трех изучаемых способах регенерации. В эксперименте с клубневыми дисками морфогенный эффект от генотипа картофеля в некоторой сто-пени зависел от способа, при котором индуцировались побеги. При регенерации путем прямого органогенеза из кусочков ткани микроклубня более интенсивно по сравнению с сортами Кеннебек и Резерв регенерировали Луговской и Ресурс (в приведенном порядке). Однако, когда регенерация проводилась в кадлусной ткани( как первичной, так и прошедшей процесс пассирования), они отставали от двух первых. Морфогенный потенциал у сорта Кеннебек по сравнению с таковым у сорта Резерв здесь лучший к дгух тиг(ах каллуса и отставая при способе регенерации прямо из экспланта.

Итак, в первой серии исследований установлено, что оптимальным способом получения побегов-грансформаятов картофеля с помощью агро-бактериалъного вектора может служить регенерация; в листовых и стеблевых тканях - через первичный каллус, в клубневых тканях -посредством прямого органогенеза. В соответствии с задачей наших ■ исследований регенерацию побегов из инокулированных агробактериями тканей картофеля мы проводили и через пассируемый, отобранный по селективному фактору каллус.

2. Трансформация растений картофеля посредством А. ЪшеГас1бП5 (рОТ3860;:рРИЕРЗ),

Отработанная нами система трансформации и регенерации дала возможность получить на селективной среде серию растений-регенеран-тов у всех ревдпиентиых генотипов картофеля (таблица 3). ■ При этом по в и 8 укоренившихся на среде с Кт клонов, полученных из культура инокулированных тканей, изолировано соответственно у сортов Луговской и Ресурс, что по отношению к общему числу побегов составляет соответственно 9,4713,00 и 10,0013,35 г выхода укоренившихся растений. Из 50 обработанных пазушных почек сорта Ресурс на среде Сев Кт индуцировано 36 побегов, из которых на среде о антибиотиком 1 (2,7612,74 I) образовал корневую систему. Укоренение на среде с Кт не наблюдалось у рет.грантов сортов Кеннебек и Резерв, что в пол-нок-мере указывает на отсутствие трансформированных растений, причем пассирование их калдусных ткаией на среде с антибиотиком приводило к полной их гибели. По-видимому, эти сорта оказались менее или

Рис. 1. а - Оивмческаа карта пло»~ милы рРЯЕРЗ, Ь - коиитегрант "ове-эоружениой" Т|-гип*в**иды PGV3850 и прсмежуточного »вкгора рРЯЕРЭ.

_ bS$tf*»r*t

12Z2 i'i' Mfonouf

EES) ****** mm*

wwe ?r-/t*«(S$rj« *r«HMMW№WM«mt*/0 'en)

HI /w^tAiaiwwiww, квЛфрмцш*

невосприимчивыми к штамму A. tumefaciens pGV3850.

Поскольку селекция на устойчивость к Km не дает полной гарантии получения трансгенных побегов {Van Montagu м. et al. 1984), трансформированный фенотип мы подтвердили при выявлении присутствия в растительном геноме последовательностей ДНК, гомологичных последовательностям исходной плаэмиды рРКЕРЗ и соответствуивим анализом и тестированием на экспрессии введенных в растения картофеля генов.

2.1. Интеграция Т-ДНК в геном картофеля.

Из в проанализированных с помощью метода полимерааной цепной реакции (PCR) на присутствие «утантного агоА гена клонов сорта Лу-говспой положительный сигнал давали 6 регенерантов; из 9 проанализированных клонов сорта Ресурс- 2 каона (рис. 2а), что полностью совпадает с данными PCR на присутствие гена устойчивости к антибиотику Km - npt-H (рис. 26). На контрольных дорожках (ДНК нетранс-генного растения и реакционная смесь без ДНК) сигналы отсутствуют. Обобщенные результаты осуществления генетической трансформации растений картофеля представлены в таблице 3. В целом листовые диски в нашей работе являлись наиболее эффективной реципиентной системой; из б подученных трансформированных

побегов 5 (или 62,50 X из трансформантов) изолировано из листовых тканей.

- It -

Таблица 3

Результаты селекции трансформированных А. ИлюГас1еп5 (р<ЗУЗ&50: :рРКЕРЗ) растений картофеля

1-т- П- i --1

Спо- | Количество побегов 1 1

(Исходный Реципиентиая соб 1- • 1 —(Частота |

1 генотип ткань реге- 1 |укоренив-1 транс-1трансфер-t

нера- {общее {шихся на (генных)мадии |

ции 1 1 Km-среде | 1 1

лист К1 Г" 1 6

[Кенвебек стебель К1 1 17 - - |

микроклубень КО ! Ю - 1

пае. почка - I 39 - - J

лист К1 1 37 3 3 8.11.10-г1

лист кг 1 19 4 1 Б,26Л0-г|

¡ЛуговскоЙ стебель К1 I 25 1 1 4,00.10~г1

микрокаубень о 1 14 1 1 ?,14.10*2|

пав. почка - 1 43 - - |

I 1 .

t

лист К1 1 13 - 1

I Резерв стебель К1 1 21 - - |

микроклубень КО 1 8 - - |

пав. почка - I 45 - |

лист К1 1 | 29 1 1 Э,45.10"21

лист к2 1 21 7 - |

| Ресурс стебель к1 1 13 - 1

микрому Сень кО 1 17 ■ - - |

паз. почка - 1 Эб 1 1 г, тело"2!

, 1. 1

Обработано агровактариями по каждому варианту 150 сегмвнтов листа и стебля. 100 сегментов микроклубня н SO naewmix почек.

кО - регенерация прямо и» вксплакта. к1 - первичный каллус, к2 - пассируемый квллус.

В итоге ло двум исходкьм сортам и рааличнш системам регенерат цик мы получили трансгенные линии картофеля, которые были обоэначе-

r~

t г 3 1 í 6 7 15 10 И й 13 II 15 'S 17 (í (9 20 Ü

.1,— y w — ' ........»MI—W -щИ

-'■ráL JftMttiiirtMTi

a

( Í3 И E ? в 9J0 H

г::' ••:

Г. , : , ■ ¡t

е- 1 ... ■■■.. _

_ 7Ú0 ^

:m

1 254567(19«

O -«o

В

Рис. 2. Электрофоретическое разделение продуктов полимврлэиой цепной реакции; а - специфических для «год гена {размер продукта реакции 700 п.н); дорожки 1-9 - растения сорта Лугобской: 2) К2.02, 3) Y.Z.03. 4) К2.04. 5) К2.05. б) К2.07, 7) К2.09: 10) Л Btrlt С650 п.н.К 11-19 - растения сорта Ресурс: 18) К4.9.01, 19) K49.10; 20) нетранегенное растение: 21) реакционная смесь без ДНК: 22) плавмида рРЛЕРЭ. б - специфических для tut-II гена (размер продукта реакции 700 п.н.); дорожки 1-6 - линии сорта Лугоаскэй: 1) К2.С2, 2) К2.03, 3) К2.04, 4) K2.0S, 5) К2.07, 6) К2.09; 7J A Bell; 6-9 - лмши сорта Ресурс: в) K4S.01, fl) К49.10: 10) нетрекегенное растение: 11) мламида рРКЕРЭ. в - специфических для v 1 гВ гена (размер продукта реакции бей n.M.): дорожки - 1) К49.01. 2) К49.10, Э) нет-рансгенное растении, 4) K2.Ö2. 5) К2.0Э, в) К2.04, 7) К2.03. 8) K2.D7. 9) К2.С9, 10) агроЛвктериальпая плаемида PGV3850.

ни: У сорта Лугопекой - линии K2.Ö2, К2.03, К2.06 - из первичного листового каллуса, линия К2.04 - ив первичного стеблевого каллуса, линия К2.07 - ив пассируемого листового каллуса, линия К2.09 - черев прямой органогенез на дисках микроклубней; у сорта Ресурс - ли-

НИЯ К49.01 - из пазушной почки, линия К49.10 - из перютного листового каллуса. Отсутствие аг роб акте риаль но го заражения в этик линиях было подтверждено проведенным ВДР с праймерам:!, комплементарными у!гВ-области И-плаэмиды А, 1шеГас1епз (рис. 2в). В отличие от

1 2 5 4 5 6 7 8 9._ (0 Н

Рис. 3. Блоттинг-гибридизация по Сауэерну геномной ДНК трансгенных линий картофеля с использованием Р-иеченной ДНК плаикквь. содержащая последовательность мутантного агоА гена. Дорожки: 1) 1.5x10 нкг плавмиды рРКЕРЗ Ссоответствует 5 копиям гена в пересчете на 10 мкг ДНК картофеля), 2) нетраноюрмиоованное растение. 3) К2.02, 4) К2.03, 5) К2.04. в) К2.05. 7) К2.07, 8) К2.09. 9) К49.01, 10) К49.10. 11) тотальная ДНИ А. ивпеГас1епз (рСУ3650:: рРКЕРЭ).

контрольной плазмиды рСТ3850, в исследуемых трансгенных линиях мы не наблюдали продукта реакции нужного размера (660 п.н.). Следовательно. результаты ПЦР на присутствие лрЬ-И и мутантного агоА генов можно считать достоверным доказательстве»! интеграции Т-ДНК в геном картофеля.и трансформированной природы отобранных линий, что было подтверждено блоттшг-1 ибридизацией по Саузерну тотальной растительной ДНК, обработанной рестрикционной зндонуклеазой ЕсоЙ! с 32Р-меченной последовательность» агоА гена. ЕсоРЬрестриктаза была выбрана с целью идентификации изменения размера гибрилиэующегося с зондом фрагмента при интеграции Т-ДНК из коинтегранта в геном растений. ЕсоГ?1 сайт является уникальным в промежуточном векторе и ближайший Есо(51 сайт в плазмиде р0У3850 находится за пределами Т-ДНК. Как видно на рис. 3, только в ДНК трансгенных линий зафиксированы сигналы, а в ДНК контрольного растения сигнал отсутствует. Одновременно в эксперименте определялась копийность встроенного в геном картофеля гена. Исходя из сравнения интенсивности эон гибридизации растительной и исходной ДНК можно определить, что трансформированные растения картофеля, вероятно, содержат от 1 до 12 копий мутантного агоА гена. Большое количество полос в треках и различие в их интенсивности говорят о неоднородном и многократной встраива-

ем

> К

нии гена в различных участках растительного генома, а так же о вероятности его тандемного встраивания.

4. Устойчивость траксгеиякж растений картофеля к гервмрдр глифосат.

Ранее били проведены эксперименты, выявившие высокую степень устойчивости полученных трансформантов картофеля к антибиотику ка-намицину, что подтверждает экспрессию в них сцепленной с агоА геном в генетической конструкции кодирующей области бактериального фермента неомицинфосфотрансфераэы-11. Проведением соответствующих биотестов показано наличие в отобранных трансгенных линиях картофеля признак толерантности к гербициду глифосату, свидетельствующий об осуществлении в их клетках интегрированного в геном протежированного из бактериальных клеток Е. coll мутантного агоА гена.

4.1. Устойчивость на уровне камусной ткани.

Результаты, представленные на рис. 5, получены на основе измерения индекса пролиферации иэ десяти навесок каллуса (отношение абсолютного прироста биомассы к сырой массе каллуса в начале пассажа) иллюстрируют интенсивность роста трансгенного и контрольного каллусов на среде с различными концентрациями глифосата. Видно, что прирост каллусной биомассы контрольных растений за 4 недели практически прекращался на среде с 0,50 мМ глифосата, в то время как трансгенные каллусы сохраняли пролиферативную активность на среде, со* держащей гербицид вплоть до 5,00 Ш. Стабильный рост,не уступающий росту каллуса на среде без глифосата,происходил до концентрации

контроль к&наыииик ГЛнфосот

Рнс. 4. Келлусообрлзов&яив на листовых дисках н»трансформированного растения (al и одной иа трансгеннык лини» картофеля - К2.04 (в) на среде с кашмицинсм (50 мкг/мд) н глифосатои (0.5 tdtf).

2,00 мМ гербицида для каллусной ткани дикий К2.02, К2.05, К2.09, и 1,00 для К2.03, К2.04, К2.07 и К49.10 (уровень эначимости-Б X). Менее устойчивой к глифосату оказалась каллусная ткань, индуцированная из фрагментов листа линии К2.01. Из диаграммы видно, что трансгенные каллусы сорта Луговской значительно более резистентны к Рис. 5. Интенсивность пролиферации каллуса из тре>исг»н»шх его А-несущих линий и исходного растения картофеля во среде с различными концентрациями глиФосата.

150

200

X к контролю

0.25 0,50 0.75 1.00 2,00 3,00 концентрация глифосата, мМ

5,00

АуГСФСЯОЯ

ШЩ] КЗ.05

кгхгг СИ «,о*

ЕЭ кг^и

М К9.0«

кг.м

140

X к контроле

0,25 0,50 0,75 1,00 2,00 3,00 концентраций глифосата, мМ

П Ресурс Н К49.01 СО «49,10

5,00

гербициду, чем трансгенные каллусы сорта Ресурс,несмотря на то, что индукция каллусообразования (как на среде с глифосатом, так ина среде без него) всегда происходила у последних более интенсивно. 4.2. Устойчивость на уровне мнтаитного растения. Результаты пробит-анализа действия различных концентраций гер-Рис. 6. Ростоаля активность траксгенны* агоА-несущнх линий и исходного растения картофеля при их обСкаботке различными концентрациями глифосато.

% * КОНТрОЛО

концентрация глифосато, мМ

* п/пшяач -+- «г.от игла кг.см

М.» М.0> «.О»

X К КОИТСНИС

■ Ресурс —1— К49.01 МО, 10

бицида на ростовую активность растений установили, что по уровню устойчивости к глифосагу полученные нам» агоА ген-несущие трансгенные линии картофеля можно расположить в следующей последовательности: К2.03>К2.02>К49.01>К2.05>К2.07>К2.04>К49.10 >К2.09 {таблица 4;. Эти данные основаны на измерении 4-х недельного среднего прироста из 10 обработанных растений, выраженного в X к высоте растений в начале обработки {3-х недельные растения). Для опрыскивания растений мы использовали рабочие растворы, приготовленные из технического препарата (Раундап, изопропиламиновая соль - 36% д,в.), выпускаемого фирмой Monsanto-

Особо важным показателем в этом эксперименте являлась выживаемость растений при их обработке гербицидом. Так, уже через двое суток после обработки глифосатом в концентрации 1 Ш наблюдалось увядание алекса исходных нетрансформированных растений,а в дальнейшем растения быстро желтели и погибали, причем отмечалось это уже при воздействии 0,1 мМ глифосата с тем лишь отличием, что процесс происходил медленнее, тогда как трансгенные растения выдерживали обработку глифосатом при концентрациях от 5,0 до 30,0 ndt. Как видно на рис. 7, растения трансгенньи линий К2.02, К2.03, К2.05 « К40.О1 выживали при опрыскивании глифосатом в концентрации до 30,0 »*), линии

Таблица 4

Характеристика трансгекных (pGV3350::pPR£P3; агоА, npt-//) линий картофеля по уровню устойчивости к антибиотику кана-мицину и гербициду глифосат |-1-1

ІТранс-I генные

Устойчивость, LDso -г-

I

1линии |к канами- значение х2 к гдифо- значение х2 |

I [цину, мг/л факт 0.05 сату, мМ факт 0,05 | і

1 1 К2.02 | 174,2229 0,9207 9,4900 19,5503 6,0098 —і 7,81001

I К2.03 ! 230,7811 1,0602 9,4900 20,9618 5,3501 7,81001

I К2.04 I 191,8514 2,8821 9,4900 8,1035 0,8695 5.99001

I К2.05 I 196,4632 1,1170 9,4900 14.2084 5,5337 7,8100)

І К2.07 I 219,6228 1,1301 9,4900 10,8397 0,7787 3,8400|

I К2.09 1 175,1734 0,2689 9,4900 3,0734 3,5777 3,84001

f К4.9.01 | 110,2269 0,4726 9,4900 14,7516 6,8053 7,8100[

IK49.10 1 118.6175 2,3845 9,4900 6,7272 0,6897 3,84001

К2.07 до 20.0 ММ. линий К2.04 и К49.10 до 10,0 мМ, а К2.09 до 5,0 1*1. Однако, в сравнении с контрольным вариантом (без гербицида) и растениями исходного типа без глифосата их рост был замедлен.

5. Экспрессия в трансгенных растениях картофеля мутантного агоА гена Е. coli.

Для подтверждения экспрессии введенного мутантного агоА гена Е. coli в трансгенных линиях картофеля проведен анализ РНК методом Новерк дот блот-гибридизации. Транскрипт, соответствующий последовательности мутантного агоА гена к последовательности, кодирующей транзитный пептид MC РВФК/О гороха, зарегистрирован у всех трансгенных линий картофеля как в интактных растениях (рис. 8а}, так и в каллусных клетках (рис. 86), что свидетельствует о том, что резистентность к глифосату происходит за счет накопления продукта трансляции - мугаитной EPSP-синтетазы в хлоропластах. Это подтверждается большей выносливостью к гербициду у интактного активно фотосинтезн-руюцего растения в сравнении с кадлусной тканью, что, как видно из сигналов РНК-гибридизации, связано с различной генной активностью, обусловленной физиологическими особенностями двух типов клеток.

Сауеерн блот-гибридизационный анализ выявил вполне заметную

Рис. 7. Ноаерн лот блоттинг-гибрилиа&иия РНК тродегенных лини* картофеля. На точку наносили 10 мкг РНК и соответствуйте» рамедение в 3 рам. а - иятоктное растение; дорожки; 1) К2.02. « К2.0э, Э) кг.04. 4) К2.05, ЗЭ К2.07. в) К2.0Э, 7) К«.01, в) К4в. 10. 9) нвтрансгвннов растение, 10} плаамида pFREPS. в - км-лусиая ткань; дорожи: 1) к2.02. 8) к2.03, 3) К2.04, 4) К2.05, 5) К2.07, в) кетрамсгенныя каллус, 7) K2.0S, 8) К49.01. 9) К49.10, 10) ДНК Е, coll ее» мутантного агоА гена. 11) плаамида рРКЕРЗ,

67t 8 «

1 2 3 Ч 5 S 7 9 Э « И

6

£ * * *

связь между копийностью встроенного в геном картофеля мутантного бактериального гена и уровнем его экспрессии в полученных грансген-ных линиях: при большом и примерно среднем числе копий гена большинство трансгенных линий в сравниваемых условиях показали высокую степень его экспрессии. Однако, опираясь прежде всего на показатели экспрессии у линий К2.02, К2.05 и К49.01 можно предположить, что разница в уровнях экспрессии мутантного бактериям кого агоА гена у отобранных трансформантов в значительной степени может быть обусловлена сайтом инсерции гена в растительную хромосому, Тем не менее, как видно иэ таблицы 4, самой высокой толерантностью к глифо-сату обладает линия К2.03, точно в соответствии с самым большим у нее числом копий встроенного мутантного агоА гена, что обеспечивает в ее клетках высокий уровень его экспрессии. Видимо, высокая колий-иость гена при "удачном" местоположении в растительном геноме вносит большой вклад в уровень устойчивости к гербициду, даже без увеличения уровня его транскрипции, что наблюдается на примере К2.02,

Следует отметить отсутствие полного соответствия между уровнями транскрипции с мутантного агоА гена у трансгенных линий К2.02, К2.04, К2.04 и К2.09 и их резистентностью к глифосату, а также тот факт,что, несмотря на более высокий уровень агоА-мРНК в трансгенных каллусах линий сорта Ресурс по сравнению с каллусами сорта Луговс-кой, последние оказались более выносливыми к гербициду. Таким обра-вом, наряду с уровнем генной экспрессии, существенное влияние на устойчивость к глифосату у трансгенных растений, по-видимому, могут оказывать и другие регуляторные механизмы в клетках, в • частности стабильность продукта транскрипции и/или транслируемой EPSP-синте-таэы, а так же правильная ее компартментализация. обусловливающая ее активность. Для того, чтобы точнее объяснить различие в уровнях толерантности подученных трансгенных линий картофеля к гербициду глифосат необходимы дополнительные исследования, направленные прежде всего на определение кинетических параметров кодируемой агоА геном Е. coll мутантной EPSP-синтетазы. Несмотря на эти замечания, результаты наших исследований свидетельствуют об интеграции в геном картофеля бактериального гена устойчивости к гербициду глифосат и его экспрессии с 35$ промотора РНК ЙОД в трансгенных растениях. Следует отметить, что стандартная норма расхода глифосата, применяемая в полевых условиях, составляет 1 кг/га д.в., что в зависимости от норны расхода рабочего раствора находится в приделах 10 Ш. Таг

ким образом, 4 из 8 полученных трансгенныл линий картофеля выкосят обработку глифосатом в концентрации, примерно в три раза привыщаю-щей используемую на полях для эффективного контроля над сорняками.

В заключении необходимо отметить, что в виду замедленного роста глифосаттолерантных растений при их обработке гербицидом в сравнении с исходными растениями без глифосата возникает задача на дальнейшее повышение их уровня устойчивости в условиях биотехноло- * гни при массовом применении гербицида.

Выводы

1, Наиболее эффективным способом регенерации побегов в тканях картофеля является: в первичном каллусе - для эксплантов тканей листа и стебля, и посредством прямого органогенеза - для клубневой ткани.

Z. Кратковременное {2-3 ч) выдерживание растительных тканей в суспензии агробактерий с последующей инкубацией на агаризованной среде оказалось наиболее подходящей методикой для получения трансформантов картофеля.

3. Компетентность растительных клеток к генетической трансформации и/или восприимчивость к агробактериальному заражению или штамму агробактерий зависит от генотипа. Подучены трансгенные растения сортов Луговской и Ресурс,

4. Листовая ткань являлась наиболее эффективной для трансформации реципиентной системой. Из. 8 обнаруженных трансформантов в ней получено 5 или 62,50 X трансформированных побегов.

5. Полученные трансгенные растения картофеля представляют собой индивидуальные клоны, отличающиеся по количеству копий вставок интегрированного в геном мутантного агоА гена, уровню его экспрессии и устойчивости к гербициду глифосат.

6. Различие в показаниях экспрессии мутантного агоА гена Е. coli у трансгенных растений картофеля может быть связано как с ко-пийностыо интегрированного гена, так и с сайтом его инсерции в растительную хромосому.

7. Независимо от уровня экспрессии интегрированного а геном картофеля бактериального агоА гена существенную роль в обеспечении признака устойчивости к глифосату играют, по видимому, и другие ре-гуля торные механизмы в клетках, в частности стабильность агоА-мРНК и/или транслируемой EPSP-синтетазы, а так же правильная ее компарт-ментадизация, обусловливающая ее активность.

8. 4 из 8 отобранных транегенных линий картофеля выдерживают обработку глнфосатом в концентрации до 30 мМ, что примерно в три раза превышает стандартную норму, применяемую в полевых условиях для эффективного контроля над сорняками.

9. Несмотря на приобретенную глнфоеатоустоЙчивссть, трансгспные растения картофеля при их обработке гербицидом все же отстают в росте от контрольного варианта (без глифосата), а также от растений исходного тина без гербицида, что указывает на необходимость дальнейшего повышения уровня их резистентности в уелоовиях биотехнологии при массовом применении гербицида.

Работы, опубликованные по теме диссертации;

). К-абрлль Эекяллнге Б,р Симонова М, Л., Кобец Н. С., Al е т т В, Л , J1I е в с- л у х а В. С,. П и р у з я в Э. С. Expression of baeteriat glyphosatc-tolerance gene in potato plants. Eighth 1UPAC con-grtss of pesticide chemislrv. Wachington, D. C., USA, july 4—9, 1994,

Объем 1.25 il л

Заказ 241

Типография Издательства МСХЛ 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44

Тираж 100