Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы и синтез белков у регенерантов картофеля при действии экстремальных факторов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Активность рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы и синтез белков у регенерантов картофеля при действии экстремальных факторов"



На правах рукописи УДК 581.143.6:633.491

ДАВЛЯТ1I АЗ АРОВА ЗУЛЬФИЯ БУРИЕВНА

АКТИВНОСТЬ РИБУЛОЗО-1,5-БИСФОСФАТКЛРБОКСИЛАЗЫ И СИНТЕЗ БЕЛКОВ У РЕГЕНЕРАИТОВ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ

(03.00.\2 - физиология растений)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации т соискание учёной степени кандкдэта биологических наук

Душанбе - 1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и генной инженерии Института физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан.

Научный руководитель: член-корреспондент АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук , профессор Алиев К.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Абдуллаев А.А.,

кандидат биологических наук, доцент Муминджанов Х.А.

Ведущая организация : НПО "Богпарвар" Министерства

сельского хозяйства Республики Таджикистан.

Защита диссертации состоится " "ИО- 1997 г. и/О час. на заседании Диссертационного Совета Д 013.08.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растении и генетики АН Республики Таджикистан (734063, г.Душанбе, ул.Анни, 299/2).

С диссертацией можно ознакомиться и Центральной научной библиотеке им.И.Ганди АН Республики Таджикистан

Автореферат разослан

Ученый секрсгарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук,

профессор X.Абдуллаев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время для создания посадочного материала картофеля широко используется метод микро-клоналыюго размножения растений на безпнрусной основе. Он ' основан на получении растении картофеля из точек роста (меристем). Обычно эти клетки полностью свободны от вирусных частиц и бактерий. Урожайность безвирусного картофеля в Республике Таджикистан 20-80% выше, чем обычно, поэтому получение безвирусного посадочного материала картофеля становится одним из определяющих мероприятий по получению элитных семян. Кроме того, используя методы клеточной и генной инженерии, можно получить формы, приспособленные к различным экологическим зонам Таджикистана, отсюда актуальность данной работы, поскольку в горных зонах республики в гораздо меньшей степени распростра-иенц фитовирусы и переносчики болезней.

' Если обычным селекционным методом на создание сортов тре-Зуется 10-12 лет работы, то при использовании методов биотехнологии этот срок сокращается в 3-4 раза.

Перспективным подходом в решении биотехнологии сельскохозяйственных растений и в частности картофеля является разработка молекулярных основ устойчивости растений к экстремальным факторам среды и методов генетической инженерии, позволяющих внедрить в клетку картофеля гены устойчивости к гербицидам. В этом отношении известны экспериментальные работы по получению и внедрению гена ЕРБР-синтетазы, придающего устойчивость к гербициду глифосату.

Так же, как и проблема устойчивости к гербицидам картофеля, актуальной является проблема термоустойчивости. Устойчивость к этим факторам связана с функционированием генетических элементов клетки. Решение этих задач и получение растений с усиленными признаками резистентности к экстремальным факторам связано с исследованием фотосинтетнческой функции хлоропластов, прежде, всего роли рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФКО) в регуляции скорости фотосинтеза. Поэтому исследование РБФКО у различных по устойчивости форм картофеля к гербицидам и высокой температуре представляет интерес для решения взаимосвязи функции РБФКО и скорости фотосинтеза. С этой точки зрения РБФКО может быть использована как модельный фермент.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явля-пось изучение активности РБФКО и синтеза белков у регенерантов картофеля, устойчивых к гербициду (глифосату) и высокой температуре.

В связи с вышеизложенным в задачи наших исследований входило изучение следующих вопросов:

1. разработка биотехнологического метода размножения картофеля для их выращивания в разных зонах Таджикистана;

2. изучение активности РБФКО трансгенных растений и растений, устойчивых к высокой температуре;

3. изучение экспрессии генов субъединиц РБФКО у этих растений;

4. изучение состояния РБФКО-связанной с мембранами и свободной

5. изучение синтеза специфических белков в условиях температурно шока у разных по устойчивости форм картофеля.

• Научная новизна. В работе изучены условия синтеза стрессовы белков в клетках регенерантов картофеля, устойчивых к эстремаль-ным факторам среды. Исследованы синтез и активность рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы трансгенных растений и растений, устойчивых к действию высокой температуры. Впервые показано, что синтез субъедишщ РБФКО трансгенных растений существенно отличается от их синтеза у контрольных растений. Установлено, чт растения картофеля, полученные методом генетической инженерии обладают повышенной устойчивост ью к высоким концентрациям глифосата. Присутствие 0,5 мМ глифосата в первые 8 часов не оказывает заметного влияния на включение 3Н-урндина в РНК perene' рантов картофеля. После 8 часов наблюдается торможение включе ння радиоакгшшон метки в РНК у контрольных растений, а у Tpai генных растений, наоборот, резко усиливается включение метки в РНК. Растения, обладающие устойчивостью, реагируют на внедре ние гербицидов быстрее, т.е. происходит включение защитного ме ханизма в ответ на воздействие экстремальных факторов путем си теза стрессовых белков. Через 8 часор после добавления гербицид у трансгенных растений синтез РНК in vivo увеличивается более,1 в 2 раза, у контрольных остается до 12 часов на одном уровне, по< чего происходит ингнбированне синтеза. Показано наличие 7 ког поиеитов белков, которые отсутствуют у исходных контрольных растений.

Практическая значимость работы. Получена новая информа! о синтезе стрессовых белков и РБФКО траисгсниых растений кар и регенерантов с повышенной устойчивостью к высокой res ратуре, что открывает возможности практического их использов иия для разработки методов диагностики различных генотипов i тофеля на устойчивость к действию высокой температ уры и герб цидам. Оздоровление картофеля от вирусов и бактерий с исполь ванием меристемных регенерантов широко используется в семей водческих хозяйствах Республики Таджикистан.

Апробация работы. Основные результат работы были пре ставлены на Всесоюзном симношумс "Молекулярные механшм!

1етических процессов", 1986г.,Москва; V съезде Всесоюзного об-цества генетиков и селекционеров им.И.И.Вавилова, 1987г.; Symp. s in engineering plants for commercial products and applications, Kentucy, JSA, 1995; конференции "Теоретические и прикладные проблемы имнн", 1995г., Душанбе.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 пе-1атных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит нз ¡ведения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения )еэультатоп, заключения, выводов и списка цитированной литерату->ы. Работа изложена на /2/ стр. машинописного текста, иллюстри-»ована рисунками и сР таблицами. Список литературы вклю-iaer2/7 работ, из них иностранных авторов.

ОСНОВНОЕСОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследований

Объект исследовании. Объектом исследования служил картофель (Solanum tuberosum L). В работе использовались следующие :орта: Жуковский, Невский, Лорх, Эстнма, Полет, Ранняя роза и ф.

Подготовка экспериментального материала. Для экспериментов использовали регенеранты картофеля, полученные от меристем размером менее 200 мкм, ёысаженных на питательную среду Мура-:иге-С'куга с последующей пересадкой выращенных ростков. Культивировали растения в световой комнате с регулируемыми условиями: температура 22-23°С, влажность не ниже 70% и шгтен-:ивность света - 2тыс.люкс при 16 часовом светопериоде. Время эт посадки меристем до получения проростков- от 3 до 6 недель.

Методы исследований. Выделение и очистка РБФКО. Выделе-~ ниен очистку РБФКО проводили по методу Гивана и Кридла (Givan, Criddle, 1972) с некоторыми модификациями (Алиев, Васильева. 1984).

Разделение субъединиц РБФКО. К 1 мл белкового раствора., содержащего 10 мг белка, добавляли меркаптоэтанол в конечной концентрации 20% и инкубировали о течение 2-3 минут при температуре 47-50"С. Белковый раствор быстро охлаждали, наносили на колонки □ 25(10x1.0 см) для отделения меркаптоэтанола. После освобождения от меркаптоэтанола белковый раствор концентрировали добав-пением полиэтнленгликоля. Концентрированный раствор субъеди-ииц РБФКО наносили на колонку, содержащую G 150, и проводили электрофорез на ПААГ (Алиев, Фархадн, Салимопа. 1989).

Карбоксчштая активность РБФКО. Карбоксилазную активность РБФКО определяли радиометрическим методом (Романова,

1980) - по скорости включения H,4COj в кислотоустойчивые продукты реакции в присутствии субстрата - РБФ.

Получение мопоспецифических ашписывороток. Антисыворогки получали согласно методике (Володарский, 1971) с некоторыми модификациями (Фархади, 1987), используя очищенные препараты РБФКО из листьев гороха или пшеницы (концентрация фермента If 20 мг/мл).

Двойная раОиапьная иммунизация по Ухтерлиии . Реакцию преци питации проводили на предметных стеклах в 1,5%-ном агаровом геле, приготовленном на буфере 0,5 М трис-HCI, рН - 8,0. 3 мл горяч« го геля наносили на предметное стекло. Для вырезания лунок использовали штамп. Заполнив лунки растворами антисыворотки и антигена, стекла помещали в кристаллизатор до появления четких дуг преципитата (Ouchterlony, 1965,1967). Препараты окрашивали течение I часа с использованием красителя кумасси G250,

Получение преципитата. Для получения преципитата использс вали антисыворотку тигром 1:64 в разведении 1:5 (концентрация белка • 6 мг/л). К 0,1 мл раствора РБФ-карбокснлазы добавляли 0,1 мл антисыворотки и оставляли пробы в холодильнике на 24 часа. После этого растворы центрифугировали при 6000 об/мин 10 мину на центрифуге Дж 2-21 Ьзкман для отделения иммунопрецинитата, Осадок отмывали от непрорсагированного белка физиологически» раствором (0,15 М NaCI), приливая его в объеме 0,1 мл. После дву разовой промывки осадок растворяли в 0,1 мл 0,1% NaCI.

Определение сооержания белка. Навеску листьев картофеля ма< сой 5 г растирали в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния, предварительно заморозив жидким азотом до 70"С. Зател добавляли буфер для выделения в соотношении 1:4 0,1 М трнс-Н< рН - 8,0; 0,02 М ДТТ; 0,005 М ЭДТА; 0,01 М SDS ("Sigma", США). Определения проводили по методу Гринберга и Крздона (1982), основанному на взаимодействии белка с бромфеноловым синим . Содержание белков определяли па спскгрофоюмегрс "Ультраспе (LK.B, Швеция) при 540 нм.

Электрофорез в ттикрилачиОпом геле. DDC-Na- злектрофо) белков проводили по методу Леммлн (Laemmli, 1970) на пластини 110x100x1 мм в полиакриламидном геле, i радиен т концентрации 7,5 до 15%. Электрофорез проводили при напряжении 290 V, cuw тока 25 мА, 5 часов. Использовали прибор [.KB, Швеция. Окраш ванне проводили в течение 2 часов. Для oi мыкания от краен геля пользовали 7%-ную уксусную кислоту.

Получение раОиоактштых ооращо». В оиымх использовали аминокислоты мС-лейцнн 10 м1ж, "S-мп ионии 25 мЬк(Россня) и гидролизат 1,37 гБк (прошводсаа фирмы "C'lieniapol", Чехия). Листья регенератов карюфеля помешали в перильные чашки I

>и, в которые было добавлено по 3 мл днсцнллиропанной воды для федннкубации в течение 5 минут. Затем добавляли метку и инкубировали в течение 2 часов в диапазоне температур 28, 37, 40,45, 50°С{ Тщательно отмывали регенеранты картофеля от радиоактивной пепси и гомогенезировали в буфере для выделения белка. Радиоактивность измеряли с помощью сцинцилляционного счетчика, при )том использовали диоксановую сцннцилляционнуго жидкость; Электрофорез радиоактивных образцов проводили по методике Леммли (ЬаешгпИ, 1970). Гель высушивали и экспонировали с пленкой РВМ в морозильной камере при -70°С.

Результаты исследований п их обсуждение

Для освобождения картофеля от распространенных мозаичных вирусов X, Ь, М, У, А и др. необходимо сочетание термотерапии с методом культивирования верхушечной меристемы (размером-100-150 мк) на искусственных питательных средах (Трофнмец и др., 1978; Каримов, 1994; Алиев, 1997). При этом эффективность оздоровления зависит как от размера эксплантантов, так и от условии развития меристемы. Данные различных авторов свидетельствуют, что наибольшая зона верхушечной меристемы свободна от вирусов Ь, У и А, меньшая - от X и наименьшая - от Б и М вирусов. Поэтому освобождение картофеля от вирусов Б и М в большинстве случаев способствует и оздоровлению от вирусов Ц У, А, и X. Однако при 4. этом очень трудно получить регенеранты от меристем размером менее 100 мк (Трофимец и др., 1978 ). Для регенерации целого растения необходимо, чтобы культивируемый участок меристемы включал хотя бы один листовой зачаток, а его размер был не менее 0,1 мк (Мэтыоз, 1973).

Учитывая эти и другие данные, нами для культивирования вы-— членялась верхушечная меристема этиолированных ростков клубней, прошедших термотерапию, с одним примордием и размером 100-150 мк. Эту работу, как правило, проводили весной (в марте, апреле), так как, по литературным данным, это время года способствует лучшему росту меристемы. Для получения регенерантов использовали питательную среду Мурасиге-Скуга с последующей трехкратной пересадкой выращенных меристемных ростков на новую среду. Культивирование ростков и растений осуществляли в световой комнате с регулируемыми условиями: температурой 22-23°С, влажностью - не менее 70% и интенсивностью света - 2 тыс.люкс при 16-часовом светопериоде, для чего использовали люминесцентные лампы и лампы накаливания. Количество получаемых меристемных регенерантов зависит от сорта картофеля и составляет 5-8%. По приживаемости меристемы и органогенезу лучшие результаты полу-

чены по сортам Ранняя роза и Невский - до 8,0%. Время от посадки меристемы на питательную среду до получения проростка с 4-5 листочками составляло от 3 до 6 месяцев.

Начальным этапом ускоренного размножения исходного оздоровленного картофеля является микрочеренкование пробирочных растений с последующим укоренением и выращиванием черенков in vitro. При этом из одного пробирочного растения получается до 5-6 черенков (по числу междоузлий), которые через 23-25 дней подрастают и становятся пригодными к пересадке в почву или повторному черенкованию. Таким образом, за 4 месяца из одного исходного растения можно получить 3,5-4 тыс.растений.

В системе первичного семеноводства картофеля на основе выращивания безвирусной элиты по сокращенной схеме важное место занимает выращивание клубневого материала от пробирочных растении, их черенков и отводков. Для этого, как правило, используют условия закрытого грунта (зимине и летние теплицы, пленочно-марлевые изоляторы и т.д.), где получают тепличные клубни. Технология производства тепличных клубней с успехом применяется во многих регионах Российской Федерации, Украине, Эстонии, в странах Западной Европы, Канаде, США, Южной Америке и Азии (Мэтыоз. 1973; Розинберг, 1990; Tukaki eta!., 1989). Имеется также опыт прямой посадки пробирочных растений в поле, минуя тепличную культуру (Белова и др., 1989; Алиев и др., 1995). Для этой цели мы использовали теплицы, марлевый изолятор и условия открытого грунта горной зоны. Против насекомых проводится также обработка теплицы каким-либо инсектицидом (сумицидин, децис, фозалон, БИ-58).

Посадку картофеля проводили а грунте, стеллажах и 8, 12 и 20-литровых пластмассовых сосудах (бытовые тазы) с отверстиями на дне н бокам. Субстрат • смесь торфа с песком, обогащаемая макро-1 микроудобрениями ( Алиев, Каримов, 1995).

Установлена зависимость роста и продуктивности растений от места, времени посадки и сорта картофеля. Интенсивное развитие растений и их высокая продуктивность наблюдались весной, в период постепенного повышения температуры воздуха и увеличения про должительиосги дня. При этом более продукшвными были растения, выращенные в тепличном грунте, однако для повышения выхО' да клубней с единицы полезной площади выгоднее оказалась посад ка в сосуды (отпадает необходимость использования поливных бороздок). Как показали наблюдения, при соотстствующем уходе в сосудах формировалось большее количество клубней, нриюдпых д, посадки и дальнейше! о размножения в i орпой юнс. Менее продук тивными ока1алпсь растения, выращенные н> черенков иробирочш

растений: у них чаше всего формируется по 1-2 мнниклубня (у наиболее продуктивного сорта Ранняя роза получали до 7-8 клубней).

В результате проведенных нами опытов показана возможность' выращивания хорошего урожая растений как в условиях открытого грунта горной зоны, так и в условиях марлевого изолятора в предгорье. В этих условиях растения формируют клубни, превосходящие тепличные как по количеству, так и по массе (табл. 1-2).

В процессе размножения исходного оздоровленного картофеля в теплице и полевых условиях особое внимание уделялось испытанию сортов и эффективности используемого метода по освобождению от вирусной инфекции.

По данным серологических анализов и визуальных оценок, среди десяти оздоровленных сортов лучший уровень оздоровленности оказался у сортов Лорх, Невский и Жуковский. Растения этих сортов были свободными от вирусной инфекции и после третьей горной репродукции, включая размножение с использованием пробирочных растений. Обнаруженные на отдельных клонах первого года сорта Лорх признаки закручивания и скручивания листьев щГм дальнейшем изучении не подтвердились (тем не менее, размноженный материал этих клонов все же был забракован). Эти сорта проявляют полевую устойчивость к вирусам мозаичной группы, высокопродуктивны во всех возделываемых зонах республики. Сравнительно ниже оказался уровень оздоровленности сортов Кардинал и Ранняя роза. Вторая их репродукция (мшшклубнямн) в 1991 году имела скрытую зараженность: сорт Кардинал - вирусами X и Б (5%, в сочетании), Ранняя роза - вирусами 5 (9,3%) и У ( 3.3%). Отобранные клоны сорта Кардинал на следующий год оказались здоровыми как по результатам серодиагностики, так и визуальным наблюдениям. Однако по сорту Ранкяя роза вновь пришлось забраковать часть клонов, т.к. у них отмечалось возрастание зараженности вирусами до 11,5% ( поливалентной сывороткой на вирусы X, Я, М) - 15,4% (вирусом У). Оба эти сорта имеют высокую продуктивность в предгорной и горной зонах, однако сильно различаются по вирусоустой-чивосги. Сорт Кардинал имеет полевую устойчивость к вирусу У и очень хорошую лежкость клубней, кроме того он отличается нема-тодоустойчивостыо. Сорт Ранняя роза этими свойствами не обладает, при инфекции мозаичных вирусов, особенно вируса У, сильно страдает от полосчатой и морщинистой мозаики, но имеег хорошие вкусовые качества. По сортам Бирюза и БМ-78-286 методом мери-стемной культуры желаемых роультатов добиться не удалось. Уже на уровне пробирочных растений и первою клубневого поколения они оказались сраженными мопшчными вирусами, к тому же не проявляли при таков полевой устойчивости к вирусным болезням. По>тому они были сняты с дальнейшего размножения.

Таблица I

Продуктивность пробирочных растений картофеля в теплице

Сорта картофеля Дата посадки и уборки Количество клубней, штЛ'уст Масса одного клубня, г Продуктивность растений, г/куст Количество клубней на один 20-л.сосуд, шт.

Бирюза 12.XlI-17.IV.91r. .8.2 7.3 60

Невский _ - _ 8.5 8.2 70 -

Лорх* 1ЛН-12ЛП.91г. 11.4 16.3 177 -

Полет* 8.4 26.0 218 -

lI.HI-8.VI.93r. 11.8 7.4 87 50.2

Невский 7.6 12.3 94 29.4

Кардинал . - . 12.0 5.2 62 40.0

Ранняя роза _ •*« 17.7 4.9 84 64.0

1аолица l

Продуктивность пробирочных растений картофеля в горной и предгорной зонах (высота - в м над ур.моря) N

Сорта картофеля Хозяйства, где проведены опыты Дата посадки и уборки картофеля Количество клубней, шт_/куст Масса одного клубня, г Продуктивность растений, г/куст

Невский Совхоз нм.Хамзы 25.V.-30.IX.89 г. 7.7 90.9 700

Файзабадского

района, 1700 ы

Бирюза и 12.6 47.6 600

Невский Совхоз "Чильдара" 3.VI-23.IX.90 г. 13 60.3 440

Тавильдаринского

Бирюза района, 1900 м п 6.0 49.2 295

Белорус.ран. м 7.0 25.0 175

Мона Лиза _ ** _ 6.V1I-28.IX.90 г. 11.7 15.4 290

Лорх Колхоз "Навруз" 4.VI-17.IX.91 г. 21.0 12Л 225

Ганчинского

района, 2200 и

Ранняя роза п 2.VI-17.IX.91 г. 31.5 12.5 394

и И 15.У1-ИЛХ/93Г. 153 - 15.3 235

Кардинал • • 13.2 8.7 115

На коллекционном уровне изучались сорта Белорусский ранний, Мона Лиза, гибрид К-690 и некоторые другие сортообразцы, а така 5 сомаклональных линий сорта Лорх и 2 сомаклона сорта Невский.

Таким образом, используя методы культуры ткини и термотерь пин, удалось оздоровить от вирусов и других болезней ряд районированных и перспективных сортов картофеля. Отработаны приемы их размножения в условиях лаборатории, теплицы, предгорной и горной зон республики.

Размножение картофеля с использованием культуры ткани позволит получить новые перспективные формы и сорта, приспособленные к различным экологическим зонам Таджикистана. Особую актуальность приобретает получение сортов, устойчивых к высокс температуре, болезням и гербецидам. Поэтому дальнейшие наши р боты были связаны с разработкой приемов получения новых форм картофеля с наилучшими хозяйственными признаками. Для этого мы использовали приемы регенерации растений из каллусных кул! тур и воздействия на |шх различных стрессовых факторов. Схемы получения регенерантов картофеля, устойчивых к факторам внеип среды приведены на рис.1.

В дальнейшем мы исследовали некоторые физиологические п; раметры регенерантов, устойчивых к высокой температуре и гибр дов, полученных в сочетании с методами генетической инженерии устойчивых к гербициду глифосату. Конструкция векторов и услс вня трасфомацин были осуществлены в нашей лаборатории, пр1 непосредственной консультации профессора Э.С.Пирузян (Инсти-молекулярной генетики АН РФ) и Урмеевой Ф.И.

Синтез РНК и быков в растениях, устойчивых к гербициду глифосату Трансгенные растения картофеля, обработанные 20 "-крат1 концентрацией глифосата, были проанализированы на устойчивость. Всего проанализировали 97 трансгенных растений. Было о наружено, что 63 растения содержали 3 копни ЕРЗР-силтетаэы, в время как остальные содержали по одной копии,

Как было показано ранее (Урмеева, 1990), растения картофе полученные методами генетической инженерии, обладают повыт но^ устойчивостью к высоким концентрациям глифосата- гербш да, обладающего широким спектром действия.

Как видно из рис.2, у трансгенных растений (регенеранты) к тофеля 0,5 мМ глифосат в первые 8 часов инкубации не оказыви заметного влияния на включение ЗН-уридина в РНК. Такой же > рактер имеет включение радиоактивной метки у контрольных р; ии||. После 8 часов выдерживания растений в среде с глифосаю происходит торможение включения радиоакшвной метки в РШ

халлус

суспензия клеток

Высев на селективных средах(экстремальная температура, гербицид, солевой раствор, токсин, антивирусная РНК н т.д.)

растение-регенерант

проверка устойчивости к стрессовым воздействиям"

получение чаллуса

отбор устойчивых клеток

получение микроклубней

.клонирован,< молекулярно.

генетические исследования

Рис.1. Получение растения-регенеранта картофеля,

устойчивого к воздействию факторов внешней среды.

нтрольных растений. В то же время у трансгенных растений резко !лнвается включение метки в РНК. Это указывает на то, что ансгенные растения обладают устойчивостью к гербициду. Добавке достаточно высокой концентрации глнфосата в среду выра-тания не ингибнрует синтез, а наоборот, усиливает синтез РНК по звненню с контрольными растениями. Интенсивность синтеза 1К у трансгенных растений примерно в 3 раза выше, чем у кон-ольных растении, не обладающих устойчивостью к глифосату.

„ г 4 « _» « 11 14. 19 18 И

Время инкубации с глифосатом, часы

Рис.2. Включение Н3 уридина в суммарну РНК.

1-трансгенные растения,

2- контроль.

Такой же характер имеет синтез общего белка у исследовании регенерантов картофеля. Как видно из рис.3, на включение иС-иминокислот в общий белок в первые 8 часов инкубации в среде, с держащей глнфосат, последний не оказывает какого-либо воздействия, Ингнбнрующее действие глифосата на включение 14С-аминокислот у контрольных растений обнаруживается после 8 час инкубации. В то же время синтез белков у трансгенных растений после 8 часов инкубации с глифосатом лнгибирующего влияния н испытывает, наоборот, усиливается их синтез в 3-4 раза.

23000

^ т

£ 16000 2

| ют

1 мое

»—♦ 1

X

У

/

Л-

а 4 0 4 10 И 14 И 1» м

Время инкубации с глифосатом, часы

Рнс.З. Включение ы ( гидролизата в белок I •трансгенные

растения, 2- контроль.

Возникает вопрос: за счет каких механизмов усиливается синтез РНК и белков у трансгенных растений? Можно предположить, что растения, обладающие устойчивостью, реагируют на внедрение гербицидов быстрее, т.е. происходит включение защитного механизма на воздействие экстремальных факторов, синтезом новых стрессовых белков, отсутствующих у растений, чувствительных к гербициду.

Таким образом, через 8 часов после добавления гербицидов у трансгенных растений синтез РНК in vivo увеличивается более, чем в 2 раза, тогда как у контрольных остается до 12 часов на одном уровне, после чего происходит ингибирование ее синтеза. Такая же картина наблюдается в отношении синтеза белков. Эти данные указывают на то, что трансгенные растения, обладащие свойством устойчивости, реагируют на добавление гербицида быстрым синтезом новых молекул РНК.

Синтез и активность РБФКО у глифосатоустойчивых растений Картофеля, Высокий уровень включения радиоактивной метки в РНК и белки, синтез которых не подвергается нигнбнрованню при выращивании растений в среде, содержащей гербицид глифосат, видимо, указывает на индукцию стрессовых генов, экспрессия которых в процессе роста растений усиливает устойчивость к повреждающему действию гербицида,

Одним из ключевых ферментов фотосинтетнческой функции растений является РБФКО. Поэтому мы предприняли попытку проследить за синтезом и карбоксилазной активностью фермента у этих растений в зависимости от концентрации глифоса;га, добавленного в среду выращивания (табл.3).

Таблица 3

Активность РБФКО у трансгенного картофеля в присутствии глифосата (0,1 мг/мл)

Варианты опытов Активность, нмл/мин на

мг белка

Контроль 3600±140

Трансгенные растения 12500±250

Контроль + глифосат 2370±110

Трансгенные растения + глифосат 12400±220

Как показывают данные табл.3, карбоксилазная активность РБФКО у зрансгенных растений в несколько раз выше, чем у контрольных растений. Добавление в среду выращивания глифосата в концентрации 0,1 мг/мл не оказывает ингибируюшего действия на активность фермеша у зрапаенных растении. В го же время актив-

ность фермента у контрольных растений при добавлении глифосата ингибируется и оно зависит от времени инкубации.

Высокая карбоксилазная активность не сопровождается синтезом de novo фермента. У всех исследованных растении содержание РБФКО остается практически неизменным. Содержание РБФКО у трансгенных и у контрольных растений независимо от времени выдерживания в среде с глифосфатом остается практически одинаковым. Можно предположить, что у трансгенных растений карбоксилазная функция РБФКО зависит от активации активирующего фермента РБФКО-активазы, который не подвергается воздействию гербицида, а у не обладающих устойчивостью к гербициду - сильно инактнвируется этот фермент, вследствие чего карбоксилазная активность РБФКО падает.

Анализ компонентного состава белков у трансгспшх растений

Электрофоретические спектры белков у трансгенных растений и устойчивых растений, полученных путем скрининга при действии высокой температуры представлены на рис.4. Видно, что образцы белков трансгенных растений четко различаются по присутствию и отсутствию отдельных компонентов в различных зонах спектра. У трансгенных растений имеется 7 компонентов, отсутствующих у исходных ко1(трольных растений. Классификация фенотипов проводилась только по этим признакам. Кроме того, у трансгениых растений спек-ф белков обнаруживает 3 быстроподвижных и 2 слабоподвижных компонента. При анализе электрофореграмм обнаружено, что у исследуемых образцов растений имеется 2 группы совместно присутствующих компонентов белков. К первой группе откосятся компоненты с молекулярной массой 90, 84, 78, 73,68, 53, 48, во вторую группу • компоненты с молокулярной массой 32, 28, 20,17.

Между растениями, устойчивыми к высокой температуре, и контрольными существенные отличия обнаружились только в облас ти быстроподвижных белковых компонентов. Количество таких белковых компонентов, которые отсутствуют у контрольных растений составляет 3-4. Кроме того, белковые компоненты, относящиеся к группе 'О кД, у трансгенных растений выражены четче, чем у контрольных растении: Компоненты, имеющие одинаковую электрофоре! ическую подвижность, присутствовали у обоих типов растений, i имели одинаковую интенсивность зоны, что указывает на идентичность их теистического котроля.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис.4. Электрофорезические спектры белкой у трансгенных и устойчивых к высокой температуре растений картофеля. Пошпешнды ращеляли в ПАА1 -е в присутствии ОРЯ-Ыа и окрашивали раствором кумасси 0-250. 1-4 - трансгенные растения; 5-8 - темиературоустончивые растения; 9-12 - контроль. Справа указаны молекулярные веса маркерных белков (кДа).

Из 7 вновь появившихся компонентов у трансгенных растений 2 необычны и по интенсивности зоны и по расположению на электро-фореграмме, т.е. они находятся в слабоподвижной зоне. Следовательно, можно сдела1ь предположение, что эти компоненты являются продуктами экспрессии бактериальною гена (1:РБР-синтгтизы), внедренною в сеном картофеля. Остальные вновь появляющиеся на элсктрофореграмме белковые компонен т либо являются продуктами частичной деградации ПРЬР-сшпетазы, либо под воздействием нового сильного промотора ( в одном случае мы использовали промотор вируса мозаики нвепюй капусты) жспрессировались новые не экспрссснрованпыс 1сны карюфеля. Кроме тою, нами было обнаружено деист пне мою к-на на усиление экспрессии гена большой субьедипицы |'|>ФКО хлоропласта.

Синтез о активность рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы у трансгенных растений картофеля • В опытах использовали меристемные пробирочные регенеранты картофеля сорта Темп и его трансг енных форм, а также среднеуро-жайного сорта Невский и высокопродуктивного сорта Жуковский. Содержание РБФКО определяли иммунофоретическим методом по составленным заранее кривым преципитации (Васильева, Алиев, На-сыров, 1981).

Как видно из данных табл.4, карбокснлазная активность фермента у картофеля сорта Невский незначительно отличается от активности фермента у высокопродуктивного сорта Жуковский. При пересчете активности на содержание РБФКО различия между высокопродуктивными и среднепродуктивными сортами более ярко выражены. Тик, общая карбоксилазиая активность фермента у высокопродуктивного картофеля сорта Жуковский в 2 раза выше, чем у среднепродуктивного сорта Невский (табл.4).

Таблица 4

Карбоксилазиая активность РБФКО у разных по продуктивности оздоровленных сортов картофеля

Сррта кар- , Урожай . Удельная ак- Общее кол- Общая кар-

тофеля, , клубней, тивность. во фермента. боксилазиая

кг/кусг Е.мг.белка мг/г сух. активность, Е

веса листа мтУгсух-всса

листа

Невский 0,62±0,058 0,35 3,28 1,14±0,027

Жуковский 0,87±0,055 0,42 4,84 2,03±0,014

Эти данные дают основание предполагать, что карбоксилазиая активность фермента в пределах сор та остается более-менее постоянной, а продуктивным сортам присуще высокое содержание фермента, связанное с эффективной комплементацией хлоропластных и ядерных геномов и высокой экспрессией генов большой и малой субъединиц РБФКО.

Исследование распределения активности н содержания РБФКО в регенератах картофеля, отличающихся по продуктивности, пока зало, что у высокоурожайного сорта содержание общо о растворимого белка больше, чем у среднепродуктнвнш о. ()1 мечено различи* содержание белков у разновозрастных листьев рек-неранюв карю-феля табл.5. Так. у третьего листа накопление рааноримых белков больше на 30"чем у в юрою липа.

Таблица 5

Включение ,4С-лейцииа в иммунопрецнпитат РБФК трансгенных растений картофеля сорта Темп

Лист Контроль Трансгенные растения

общее общее

содержание имп/мин на содержание имп/мин на

белка, мг/мл мг белка белка, мг/мл мг белка

1-й ■ 7,64±0,53 14299±118 !4,4±0,95 31160±37

2-й 8,3±0,78 10629±78 12,8±0,78 17393+77

3-й 10,6±0,71 1395б±!14 14,1±1,2 25108±152

Такая тенденция имеет место и у трансгенных растений картофеля. Содержание РБФКО по всех вариантах опыта определялось по иммуиопреципитату. Из данных табл.5 видно, что количество фермента возрастает по мере формирования листьев. Первый лист имеет в 2 раза ниже РБФКО, чем третий лист, и трансгенный регенерант отличается от контроля по содержанию РБФКО. В количественном отношении у траисгенных растений накопление РБФКО в 1,5-2 раза

больше, чем у контроля. - .....

Таким образом, исходя из этих данных, можно заключить, что возрастание обшей карбоксилазной активности РБФКО у трансгенных растений связано с высокой экспрессией генов субъединнцы фермента по сравнению с контрольными растениями.

Синтез белков в условиях температурного шока

В хлоропластах образование многих белков продолжается почти с неизменной скоростью при возрастании температуры до 43ПС. К таким полипептидам относятся большие и малые субъединицы РБФКО.

РБФКО была выбрана в качестве модельного белка для изучения действия высокой температуры на хлоропластиый белковый синтез и ядерио-хлоропластные взаимодействия на уровне экспрессии генов малой и большой субъединиц.

Исследования проводили на пробирочных растениях картофеля. Пробирочные регенеранты инкубировали в термостате в диапазоне температур 28, 37, 40,45 и 50"С (табл.6). Прединкубацию производили в течение 5 минут, затем добавляли 358-метионин и продолжали инкубировать еще в течение двух часов. Для определения количества 35Ь-метиоинна, поступившего за время инкубации в листья препаратов картофеля, на бумажные фильтры наносили по полоске

Таблица 6

Содержание, синтез и активность РБФКО в условиях температурного стресса

Температура. Ч" Уд.акт.. ичп/мин/ чт белка Белок, »•г/' сыр. веса Содержание РБФКО. мг/г сыр.веса Включение, имп/мин/мг РБФКО Включение метки в РБФКО от общего белка, в ° о Содержание РБФКО от общего белка, в 0 • Относительное включение мелей. от поступления Абсолютное включение метки,0• Уд.активность РБФКО. мкМоль СО2/МГ

28 122258 9,11 3,6 35,806±174 29 30 35 100 0,197±0.014

37 154414 8.75 3.8 62,285+186 44 43 41 154 0,870±0,026

40 15813? 8.10 3.4 8П25£243 52 41 46 189 0,7|4±0.028

45 55675 7.40 2,2 16622±112 27 29 40 100 0,280±0.09

50 30100 5.4 2.4 15060±45 20 - 5 10 0,45±0,004

омогената и просчитывали радиоактивность. В супернатанте опре-еляли включение метки в белок.

ООБ^а электрофорез проводили в градиенте IIААГ 7,5-15% по Ьммли ( ЬаешшИ, 1970). После электрофореза гели окрашивали, ысушнвшш и экспонировали с пленкой РВМ при 20"С. Из суперна-анта с меткой по 10 мкг наносили в лунки 1% агарозного (на барби-аловом буфере РН 8,6) геля, содержащего антитела к РБФКО, н роводили нммунофорез. Калибровочную кривую строили по очи-денной РБФКО. По высоте "ракеток" определяли содержание 'БФКО. Затем зоны преципетации вырезали, элюировалн в буфере 1 просчитывали включение метки в РБФКО. Параллельно проводи-и инкубацию регеиерантов картофеля в диапазоне температур 28, 7, 40, 50"С без метки, которые использовали для определения кар-юксилазной активности фермента.

Как показывают данные, иредегавленные в табл.6, выдержива-1не регеиерантов картофеля (пробирочные растения) в диапазоне емператур 28, 37,40° С в течение двух часов не влияет на коли-1ество белка на единицу сырою веса. Снижение содержания белка >тмечается только при выдерживании растений при 50"С. Синтез >елка определяли по абсолютному и относительному включению 1егкн в белок. Поглощение метки зависит от температуры, поэтому шейку белкового синтеза рассчитывали как отношение метки в »чищенном белке к величине ее поступления за время инкубации.

Полученные данные показали, что поглощение "Б-метионина н :го включение сущеа пенно увеличивалось в диапазоне температур !8-40"С и снижалось при 45"С. В этом интервале Температур и наблюдается интенсивный синтез специфических белков температурно-о шока. При повышении температуры до 37"С содержание РБФКО эстается на одном уровне, снижение содержания фермента наблю-щется после 404' и резкий спад происходит при 50"С.

Данные "ракетного" иммунофореза также показали уменьшение »держания РЬФК при повышении температурного режима выше эптимума. Усиление синтеза фермента обнаружено и диапазоне тем-зерагур 37-40"С, т.е. включение метки ("Б-метионнна) в РБФКО от эбшею количества белка составляет 39 и 52% соответственно. Активность РБФК определяли в свежих экстрактах пробирочных растений, выдержанных при повышенном температурном режиме. Как видно и I данных табл.6 при температуре 37 и 40"С обнаружено усиление карбокешшной активности фермента на 50 и 40% соответственно. При 45"С карбоксилазная активность фермента снижалась на 46°«и на 60%при 50"С.

Таким образом, полученные экспериментальные результаты да-юг основание думать о существовании адаптационного механизма, о ф)нкниошфо|>,шии фоюсингетическою аппарата на уровне зке-

прессии ряда хлоропластных генов. Важно отметить своеобразное реагирование трансляционной системы. В этом отношении термостабильность функции РБФКО и системы ее трансляции могут быть важным показателем устойчивости растении к температурному фактору.

Установлено, что в ответ на температурный шок в клетках реге-нерантов картофеля, устойчивых к температуре во всех диапазонах температурного шока (28, 39. 43°С), синтезируется полный набор БТШ, включающий группу высокомолекулярных и ннзкомолеку-лярных БТШ. Максимальная индукция БТШ наблюдается при 43°С, Следует отметить, что у нормальных регенсрантов картофеля максимальный синтез шокового белка 70 кДа имеет место лишь при 43°С, а у регенерантов, устойчивых к высокой температуре, синтез 70 кДа происходит во всех диапазонах температур (28, 39,43°С), но резко усиливается при 43°С (рис.4).

Таким образом, сравнительный анализ флюорограмм белков показывает существенную особенность температуроустойчивых регенерантов картофеля, проявляющуюся в постоянном синтезе белка молекулярной массой 70 кДа и отсутствием такового у нормальной регенеранта картофеля.

• Синтез субъсдиииц РБФКО о условиях

г температурного шока

Элентрофоретнческий анализ белков на ПААГ-е показал, что по мерс Увеличения температуры происходит усиление свечения полосы в зоне большой н малой субъеднниц РБФКО. Причем, и тснсивность этих зон пропорциональна увеличению температуры. Интенсивность свечения зоны большой и малой субъсдшиш очевидно не связана с интенсивным синтезом, при воздействии на растение экстремальной температуры н, скорее всего, происходит за счет деградации фермента. Чтобы ответить на этот вопрос, в последующих экспериментах мы использовали радиоактивные зонды при синтезе субъедшшц РБФКО. Для этого после проведения электрофореза суммарных белков в условиях денат; рации зоны, соответствующие большой н малой субъедипица» разрезали и просчитывали радиоактивность и общее содержание фермента при 545 нм на спектрофотометре "Ультраспек", кото рый позволяет измерить содержание белков в присутствии ПА с высокой точностью. Результаты этих экспериментов показали, ч по мере увеличения температурного воздействия на растение происходит одинаковое изменение карбоксилазной активности РБФКО и включение радиоактивной метки в состав молекулы фс мен га. Наблюдается увеличение карбоксилазной функции ферме! при увеличении температуры до 43"С, после этого наблюдается

Рис.5. Включение "Б-мстонина в большую и малую субъединииы РБФКО и БТШ в % от значения при 28 0 С.

1-1 час выдерживания при 40°С,

2- 2 часа выдерживания при 40°С,

Температура"С

резкое увеличение его активности. Общее содержание белков при увеличении температуры выше 43°С практически остается неизменным. Следовательно, при воздействии на листья высокой температуры происходит падение карбоксилазной активности на фане постоянства общего содержания белков. Резкую инактивацию карбоксилазной функции фермента мы связывали с разрушением молекулы фермента на соответствующие субъединнцы.

Изменение включения радиоактивной метки в субъединицы РБФКО показало, что их синтез сильно зависит от температурного во здействия (рнс.5). Синтез субъединицы фермента принципиально изменяется от температурного режима п срока его воздействия.

Максимальный синтез большой и малой субъединиц фермента наблюдается при 37-40"С, после чего происходит резкое уменьшение их синтеза. Причем, синтез и инактивация синтеза субъ-

единиц фермента (большой и малой) происходит п соответствии с воздействием температуры. Оптимальный температурный режим дл> синтеза большой и малой субьединиц соответствует 40°С. Следует отметить, что после 40°С температурного воздействия на расгепие наблюдается синтез специальных белков температурного шока. Радиоактивность белков температурного шока увеличивается по мере увеличения температуры до 50°С. Среди вновь синтезируемых белков температурного шока по-видимому, отсутствует РБФКО-актнваза или, так же, как с самим ферментом, при повышении температуры выше оптимальной происходит инактивация. Поэтому в условиях высокой температуры резко падает карбоксилазная активность фермента, хотя его количество и содержание субъединиц имеет достаточный уровень накопления.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в пределах сортов удельная активность РБФКО остается одинаковой, а у продуктивных растений отмечена более высокая общая активность фермента, связанная с увеличением его количества на единицу веса. Этот факт можно использовать для оценки продуктивности перспективных сортов и линий картофеля на ранних этапах производственного испытания.

2. Охарактеризован синтез белков теплового шока у регенерантов картофеля, устойчивых к глифосату и высокой температуре. Обнаружены существенные различия в синтезе стрессовых белков трансгенных растений. Белковые компоненты, относящиеся к группе 70кДа, у трансгснных растений выражены яснее, чем у контрольных растений. Синтез 70кДа у трансгенных растений происходит при всех температурах воздействия (от 27 до 50°С), г контрольных проявляется только после 37°С и усиливается при 43°С.

3. Получены линии картофеля, устойчивые к действию высокой та пературы и глифосату (трансгенные растения).

4. У растений, обладающих устойчивостью к глифосату, наблюдае ся синтез новых молекул РНК и синтез новых стрессовых белко!

5. Проанализирован синтез и активность РБФКО у трансгенных растений картофеля. Обнаружено увеличение экспрессии генов субъединнцы РБФКО у некоторых трансформированных расте' ний. Увеличение синтеза малой субьединины не оказывает сущ< ственного воздействия на синтез большой субьслнннцы фермен Это отрицает существующие представления о роли малой субъединицы в регуляции синтеза большой субьединины фермента крайней мере дня трансгснных растений).

5. На основе методов биотехнологии создана система оздоровления районированных и перспективных сортов картофеля. Оздоровленные сорта и линии картофеля прошли производственные испытания в разных экологических зонах Таджикистана.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

1. Алиев К.А., Фархади З.Н., Васильева В.Н., Лифанова О.С., Солн-мова З.Б. Генетическая модификация рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы и повышение продуктивности фотосинтеза/ Теэ.докл. Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва: Наука.-1986.-С.516.

2. Алиев К.А., Васильева В.Н., Фархади З.Н., Салимова З.Б. Сравнение фактора специфичности рибулозобнсфосфагкарбоксилазы у отличающихся по продуктивности растений/ Тез.докл. V съезда Всесоюзного общества генетиков и селекционеров

им.Н-.И.Вавилова 1987г., Москва.-1987.-С.18.

3. Aliev К.А., Davlatnazarova Z.B. Régulation expression of shock proteins in transgeneties potato plants/ Absst. Inter. Symp. on

- Engineering plants for commercial producls and applications, Kentucy, USA, 1995,- P.36.

4. Давлятназарова З.Б. Экспрессия белков теплового шока у разных по устойчивости регенерантов картофеля/ Тез.докл. научной конференции "Теоретические и прикладные проблемы химии", Душанбе.- 1995.- С.75.

5. Давлятназарова З.Б., Фархади З.Н., Алиев К.А. Действие высокой температуры на экспрессию генов субъединицы РБФ-карбоксилазы листьев хлопчатника/Тез.докл. Научной конференции, посвященной 60-летию аграрного факультета ТАУ, 1995.-С.54.