Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Содержание и активность рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у оздоровленных растений картофеля в связи с их продуктивностью

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бобохонов, Рустам Сатторович, Душанбе

61- W-'à/ÔTi-'í

Mil

СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ ТАДШ ЩЖ1СШ.1 АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ШЯ Ш1 РЕСПУБЛИКИ ТАДШШШ ШШ0Л0Ш1 РАСТЕНИЙ I гшиш

УДК 581.143:577.175.1

m САТТОРОШЧ

СОДЕРЖАНИЕ И АКТИВНОСТЬ ШШ03.0-1,5-ШСФ0СФАТ~ КАРБОКСМЛАЗЫ/0КШ*ЕНАЗЫ У ОЗДОРОВЛЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ В СВЯЗИ С ИХ ПРОДУКТИВНОСТЬЮ

(Ш.00*12 ** физиология растений)

ДИССЕРТАЦИЯ на Фоиокаш® ученой сзевпенн

Научные руштотшт: чдвн-коррвопондвнт АН Республики Тадяшсхан» докзюр нар, яро$вссор К.АДЖШ, дшшор биологических наук

1.К.1АР1МШ

- 1999 iv

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ ........................ 4

I. ОБЗОР ЖТЕРАТУРЫ ХЛ. Краткая характеристика РБФКО...........10

1.2. РБФ-карбоксилаза/оксигеназа - бифункциональный фермент......................15

1.3. Влияние различных факторов на активность и содержание РБФКО................. 19

1.4. Роль РБФКО в фотосинтезе и фотодиханщ;г,-..... 25

1.5. Функция РБФКО в онтогенезе ...... ...... 28

П. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объект исследований................ 34

2.2. Краткая характеристика оздоровления картофеля и способы его размножения .......... 34

2.3. Использование оздоровленного материала

в производстве .......... ........ 37

2.4. Методы исследований............. . . 43

Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Карбоксилазная и оксигеназная активность

РБФКО у оздоровленного картофеля ......... 47

3.2. Карбоксилазная и оксигеназная активность РБФКО у различных по продуктивности сортов и

линий картофеля ................. 60

3.3. Интенсивность фотосинтеза, активность РБФКО

стр.

и некоторые морфофизи©логические параметры

листьев оздоровленных и неоздоровленных

растений картофеля .... ............. 66

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................... 88

ВЫВОДЫ......................... 91

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА ................. 93

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы внимание исследователей направлено на по** иска путей повышения продуктивности са льскохозяйствекных растений © использованием генефико-селекционных, физиоюго-гештическмх и геанмнженерных подходов и методов увеличения активности фото« синтетического аппарата растений * хжоромаотов (Насыров, 1979; Абдуллаев, 1990; Алиев, 1998), Хлоропласты высокопродуктивных сортов по фотосинтетической и фотохимической активности имеют преимущество над хлоропластами менее продуктивных сортов (Воло« дарский и др., 1982; Насыров и др., 1984; Абдуллаев и др., 1988; Бабаджавова» 1990; Якубова и др., 1996). В работах ряда авторов также отмечено, что интенсивность циклического и нециклического фотофосфорилировашш у хлоропяастов высокопродуктивных сортов выше, чем у менее продуктивных (Гиллер, 1982; Якубова, 1984).

Вместе с тем, образование биопродуктов и их расход в много« численных цепях биохимических реакций растений теснейшим образом связано с активностью рйбулозо~1,5~бисфосфаткарбоксйлазы~оксиге~ назы (РБФКО), регулирующей фотосинтетический и фотодыхательный процессы. РБФКО относится к ферментам с двойным свойством ("ашм~

епгутез" ) и .находится в хлоропластах в двух состояниях-свободном и мембраносвязанном, для которых характерна различная ферментативная активность (Рязанов, Опирин, 1989). Растворимая (РС) РБФКО локализована в матриксе хлоропласта, а связанная (МС)~ ассоциирована с тилакоидными мембранами (МО РБФКО). Впервые было доказано, что МС РБФКО освобождается из тилакоидных мембран листьев гороха при обработке ЭДТА (Алиев ш др., 1982). Подтвержде-

нив ассоциации фермента с мембранной системой хлоропластов было получено в дальнейшем, в том числе и в электроннонуикроекопичес-ких исследованиях ( Rc^ha-vemdra et el, , 1981; Алиев и др., 1982; 1984; Koopi et ai. , 1984; Чугунова и др., 1993). Также впервые было показано изменение отношения активности PC РБФКО к МС РБФКО под действием фитогормонов (Чугунова и др., 1993). Кроме того, в этой работе впервые был отмечен положительный эффект действия кинетина ( ш ram ) на содержание МС РБФКО,

Теоретически, изменение содержания РБФКО до определенной величины может приводить к адекватному изменению скорости фотосинтетического цикла, т.е. является лимитирующим фактором. С другой стороны, содержание РБФКО не оказывает влияния на этот про« цесс м не является лимитирующим фактором. Поэтому использование в опытах меристемных растений имеет определенное преимущество. Так, в работе ( stit et , 1994) показано, что у полученных

методом генной инженерии растений табака с пониженной экспрессией генов больших субъединиц РБФКО, обнаруживается адекватное изменение скорости фотосинтетического цикла, состава и распределения углеводов, а также роста растений от карбоксилирующей функции фермента.

Одним из возможных принципов регуляции активности РБФКО и фотосинтетической продуктивности является исследование отношения между экспрессией генов больших и малых субъединиц, контролирующих функции трансляционной системы (хлоропласт, цитоплазма) и соотношение свободной и мембраносвязанной форм фермента (Алиев и др., 1984, 1998).

Исследование генной экспрессии субъединиц РБФКО открывает

новые подходы в изучении конкретных механизмов, через которые реализуется кооперация ядерно-ци топлазма тиче ск ой и хлоропласт-ной трансляционных систем (Насыров и др., 1972, 1984, 1996), Вместе с тем, карбоксилазная активность РБФКО имеет важное значение в регуляции фотосинтеза и фотодыхания, а»¿следовательно, и продуктивности растений. Если исходить из относительного постоянства карбоксилазной и оксигеназной активности фермента, то увеличение фотосинтетической продуктивности будет наблюдаться при одновременном повышении фотосинтеза и фотодыхания. С другой стороны, физиологическая роль фотодыхания в формировании продуктивности растений до конца еще не решена. Но, очевидно, что положительную роль в продукционном процессе играют карбоксилазная и оксигеназная функции РБФКО и их генетическая регуляция. Если это так, то регулирование фотосинтетической продуктивности будет реальным* Особую роль в решении этой проблемы должно играть использование идей и методов биотехнологии. Поэтому включение меристемных растений, т.е. свободных от инфекций, в физиологические эксперименты вносит новое познание этого сложного механизма - взаимосвязи синтеза и активности РБФКО в регуляции скорости фотосинтеза, распределения продуктов и продукционного процесса.

Эксперименты показали, что интенсивное развитие вирусов, бактерий и грибов приходится на начало интенсивного формирования ассимиляционного аппарата. Ими используется до 50%, образующихся в процессе фотосинтеза, биопродуктов (Бобохонов и др., 1998). Следовательно, их накопление на этой стадии развития растений отрицательно сказывается на хозяйственно-ценной урожай-

ности картофеля. Поэтому сравнительное исследование донорно-ак-цепторных отношений у оздоровленных растений в связи с экспрессией РБФКО у различных по продуктивности сортов, представляет чрезвычайно большой научный и практический интерес.

Актуальность работы. Согласно физиолого-генетической концепции Ю.С.Насырова (1982;; 1994) фотосинтез, как главный компонент продукционного процесса, играет важную роль в повышении урожайности сельскохозяйственных растений и его улучшение связано с использованием методов и достижений генетики, селекции и биотехнологии (генная и клеточная инженерия).

В этой связи в регуляции фотосинтетической продуктивности сельскохозяйственных растений ведущую роль играет рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа, как бифункциональный фермент. РБФКО участвует в фотосинтетической фиксации С02 с образованием энергоемких продуктов (Алиев, Фархади, 1987) и их расходовании в процессе фотодыхания, Поэтому ферменту РБФКО уделяется большое внимание со стороны многих исследователей.

Исследованиями Ю.С.Насырова и его учеников (Якубова М.М., Усманов П.Д., Гиллер ЮЛ2», Абдуллаев Х.А.) было показано, что хлоропласты высокопродуктивных сортов по фотохимической активности, фотофосфорилированию и инфраструктуре превосходят хлоропласты менее продуктивных сортов. Однако, само по себе повышение интенсивности фотосинтеза не является обязательным признаком увеличения хозяйственной продуктивности, поскольку общая продуктивность зависит не только от способности ассимилировать 00^ с участием РБФК (как карбоксилирующий фермент), но и от РБФКО (как окси~ генирующий фермент), т.е. от фотосинтеза и фотодыхания.

Кроме того, урожайность зависит также от способности экспортировать из листьев продукты фотосинтеза и откладывать их в хозяйственной части растений. Известно также, что в определенных условиях жизнедеятельности растений соотношение К/0 играет существенную роль в регуляции фотосинтетической продуктивности и, следовательно, может обеспечить активный транспорт фотоассимиля-тов, создав при этом условия, поддерживающие фотосинтез на высоком уровне. Поэтому изучение донорно-акцепторных отношений неразрывно связано с изучением активности РБФКО. В связи с этим выяснение особенностей функции РБФКО при изменении отношений между органами у различных по продуктивности генотипов картофеля представляет интерес, как фактора, осуществляющего эндогенную регуляцию фотосинтеза на уровне целого растения.

По последним данным (Хуффер, 1997; Салимов,., Каримов, Ним ад-жанова, Алиев, 199?, 1999), транспорт и распределение ассимилятов тесно связаны с функцией РБФКО (фотосинтетической или фотодыхательной) и активно влияют на их отток из фотосинтезирующих органов растений. В свою очередь на образование и перераспределение фотосинтетических продуктов и активность РБФКО сильно влияют вирусные, вироидные и бактериальные частицы.; Конкретный механизм инактивации ассимиляции С02 и активности ключевых ферментов фотосинтеза при вирусных и бактериальных инфекциях до сих пор остается открытым. Возможно, по этой причине в физиологических исследованиях на передний план выдвигаются поиски путей управления оттоком и распределения продуктов через изучение фотосинтетических признаков и ферментов у оздоровленных сельскохозяйственных растений. В частности, у безвирусного картофеля, что подчеркивает

актуальность подобных исследований.

Цель и задачи исследования. Целью наших работ явилось исследование взаимосвязи фотосинтеза, структуры листа и РБФКО у генотипов оздоровленного картофеля, контрастных по клубневой продуктивности, фотосинтетическим признакам и имеющих различные донор-но-акцепторные отношения.

Для этого были поставлены следующие задачи:

- Изучить карбоксилазную и оксигеназную активность РБФКО у генотипов картофеля, различающихся по клубневой продуктивности.

- Исследовать содержание и активность РБФКО в онтогенезе листа у оздоровленных и неоздоровленных растений картофеля.

- Исследовать взаимосвязь интенсивности фотосинтеза, активности РБФКО в связи с УППЛ и клубневой продуктивностью картофеля,

- Изучить карбоксилазную и оксигеназную активность РБФКО в связи

с донорно-акдепторной активностью оздоровленных и неоздоровленных растений картофеля.

Научная новизна. Впервые прлучены данные, свидетельствующие о том, что в перерасчете на единицу площади листа оздоровленные растения картофеля в сравнении с неоздоровленными обладают большим содержанием РБФКО, большей общей удельной карбоксилазной и оксигеназной активностью фермента, сохраняющейся на высоком уровне на 15 дней дольше и при снижении на 28% в этот же период оксигеназной активности. Установлено, что у продуктивных линий отношение карбоксилазной активности РБФКО к оксигеназной выше и составляет 14,2-15,4. У линий же и сортов картофеля, продуктивность которых была ниже в 2-3 раза, отношение карбоксилазной активности фермента к оксигеназной было равно 3,2-5,4. Показано,

что оздоровленные растения превосходят неоздоровленные по величине интенсивности фотосинтеза, содержания хлорофилла, количеству и активности РБФКО, по площади листьев и их УПП. Все это является важнешим элементом клубневой продуктивности оздоровленных растений картофеля, обусловливающим лучшие условия при распределении фотоассимилятов между вегетативными и репродуктивными органами картофеля.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о перспективности использования физиологических признаков в повышении урожайности картофеля при оздоровлении исходного посадочного материала. Полученные экспериментальные результаты также могут быть использованы при отборе форм и линий картофеля выскоустойчивых к инфекционным болезням.

I. ОБЗОР ЖТЕРАТУРЫ 1.1. Краткая характеристика РБФКО

Многие фотосинтезирующие организмы содержат фермент рибуло-зо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу-оксигеназу. (к.ф. 4.1.1.39). Он составляет около 50% растворимых белков хяоропластов (Бабаджанова, 1967; Романова, 1975; У.емшвеаа» ВаЬг * 1977; 1±Мтшт, 197$;

ЖШш 1978; Русинова и др., 1980; Насыров, 1982; Магомедов, 1983; Маевская и др., 1984). Молекулярная масса рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы-оксигеназы (РБФКО) варьирует в пределах ОТ 112; кДа у НЬвабшрЬгтиш гаЬогот.. до 560 кДа у высших растений.

Субъединицы РБФКО отличаются и по молекулярной массе, и по аминокислотному составу. При исследовании аминокислотного соста-

ва субъединиц фермента из разных растений обнаружено, что аминокислотный состав больших субъединиц одинаков, тогда как аминокислотный состав малых субъединиц сильно отличается (KawasMma, WiMmsBL 1970; Wettateim» 1981}.

Малые субъединицы фермента состоят из 123 аминокислотных остатков. Большие субъединицы РВФКО шпината и ячменя « из 350490 аминокислотных остатков ( Wettartedm, 1981). Гомология малых субъединиц фермента из разных объектов составляет 70-75% (Manier &t al. , 1983).

Исследования S;H -групп РВФКО с помощью таких реагентов, как йодацетамид, ПХМБ, показали, что у представителя прокариот « Chsromatiim - фермент содержит 64 Si:-группы, а у представителя эукариот - шпината - фермент имеет 96 SH «групп, у кукурузы -78 SH -групп ( Regier et al., 1983). При связывании 30 SEE -групп происходит блокирование карбоксилазной и оксшгеназной активное ш фермента из эукариот и прокариот ( ювьаье,, Ak&sawa, 1975)»

SS -группы обеспечивают сохранение структурной конформации молекул фермента. Кроме того, sa -группы активного центра участвуют в образовании комплекса фермент-субстрат ( Cbeiiet» Ander-sotü* 1976) «v

Полипептидное строение больших и малых, субъединиц РБФКО изучено у 63 видов: табака ( сьеш. e.t al.. , 1977), у рода Ре-traiia И рода Brassica , а также у Ize (Reger et al»,,. 1983).-

Большие субъединицы всех проанализированных растений при изоэлектрическом фокусировании образуют три полипептида с разными значениями изоэлектрических точек. Количество полипептидов

малых субъединиц варьирует от I до 4.

Значительная вариабельность в полипептидном строении малых субъединиц РБФКО, таким образом, может свидетельствовать о том, что ядерная ДНК, отвечающая за синтез малых субъединиц, пре* терпела большое количество мутаций в процессе эволюции. Стабильность в структуре больших субъединиц связана с физиологической функцией этой части молекулы. Так как большие субъединицы являются носителями каталитического центра фермента, то мутации в хлоропластной ДНК могли быть летальными, и изменения в структуре малых субъединиц обусловливают конформацию белковой молекулы, регулируя таким образом степень активности фермента.

С помощью рентгеноструктурного анализа, электронной микроскопии и светорассеивания обнаружено, что большие субъединицы фермента расположены под углом куба, а малые - на сторонах куба таким образом, что в целом симметрия молекулы РБФКО становится 4:2:2 ( В<шйшш. е* а1.1980).

Установлено, что молекула фермента из Вие1епа и некоторых растений симметрична, построена из промоторов двух видов и ее размеры не превышают 120 А0. Промоторы объединены в нативном ферменте таким образом, что образуют в середине отверстие диаметром около 20 А0 ( Не ЕаМеж е% а!.,, 1975» 1979).

По данным Шушаношвили (1982), плотно упакованные молекулы РБФКО составляют около 10% объема хлоропластов Би&Ьвва . Представленная им модель фермента имеет симметрично расположенные субъединицы с симметрией 4:4:4 и внешним расположением между большими субъединицами - малых.

Модель, предложенная Самсонидзе с сотр. (Самсонидзе и4др.,

1978), состоит из восьми " су бъе дш-шцп-димеров ( ьб ). Димеры располагаются в двух слоях, В каждом из этих слоев димеры контактируют друг с другом. Возможность расположения малых субъединиц внутри фермента мало вероятна, так как малые субъединицы из эвглены и некоторых растений' являются более гидрофильными, чем большие ( вютзх ег а1976) и по аналогии образования третичной структуры белков в водных растворах при самосборке располагаются снаружи и, кроме того, обнаруживаемое на электронных фотографиях отверстие в РБФКО исключает возможность расположения малых субъединиц внутри фермента, По модели, предложенной другими авторами ( ЗсМеМег а1,, 1986), большие субъедишцы упакованы в середине молекулы, а малые субъединицы расположены на нижней и верхней плоскостях молекулы фермента.

Развитие фотосинтетического �