Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биохимическая характеристика генома хлоропластов и биотехнология безвирусного картофеля в Таджикистане

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биохимическая характеристика генома хлоропластов и биотехнология безвирусного картофеля в Таджикистане"

На правах рукописи

КАРИМОВ МУЗАФАР

Р Г Б ОД

* - : г

МОЛ ЕКУЛ Я РНО-БИ ОХИ МИ Ч ЕСКДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОМА ХЛОРОПЛАСТОВ И БИОТЕХНОЛОГИЯ БЕЗВИРУСНОГО КАРТОФЕЛЯ В ТАДЖИКИСТАНЕ

03.00.04—Б И ОХ ИМ ИЯ ОЗ.ООЛ2-ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ДУШАНБЕ - 1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и генной инженерии Института физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан и лаборатории биотехнологии Таджикского аграрного университета.

Научный консультант: академик Академии (Наук Республики Таджикистан, Заслуженный деятель науки Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор Насыров Ю. С.

Официальные оппоненты: доктор химических .наук, профессор Шибнев В. А.,

доктор биологических наук, профессор Бабаджанова М. А.,

доктор биологических наук, Эргашев А. Э.

Ведущее учреждение: Памирский биологический институт Академии «аук Республики Таджикистан.

Защита диссертации состоится « »__1998 г.

заседании Диссертационного Совета по защите докторских диссертаций по специальности Д 065.01.06 по присуждению ученой степени доктора биологических наук при Таджикском Государственном Национальном Университете (734025, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ТГНУ. Автореферат разослан с/^О^^—1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук X. ЮЛ ДАШ ЕВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование структурно-функцнональ-ных особенностей хлоропластного генома и его взаимодействия с ядерной генетической системой является важным "вопросом современной биохимии и физиологии растений. Это объясняется тем, что с фотоснн-тетической деятельностью растений связано решение проблемы обеспечения человечества пищевыми и энергетическими ресурсами. Особый интерес представляет исследование генов, огветственных за синтез ключевого фермента фотосинтеза-рибулозо - 1,5-бнсфосфат-карбоксилазы -оксигенаэы (К.Ф.4.1.1.39), я ее функциональной активности у различных по типам метаболизма растений. В связи с этим необходимо более глубокое изучение структурной организации хлоропластного генома с использованием различных рестриктаз и их клонирование, т.е. получение рекомбинантных молекул ДНК для создания банка ценных генов. Особый интерес представляет исследование ДНК хлоропластов как системы векторов для синтетической селекции растений, устойчивых к воздействию экстремальных факторов. Эти иследования имеют как фундаментальное, так и практическое значение, особенно для таких важнейших сельскохозяйственных культур Таджикистана, как хлопчатник и картофель.

В первую очередь необходимо разобраться в структуре генов, ответственных за устойчивость к г>кстремалы.^1м факторам среды, н установить регуляторный механизм экспрессии в процессе роста и развития растений. Успех в этом направлении может быть достигнут при условии создания банка генов хлоропластного генома, поскольку хлоропласта являются органеллами, ответственными за , продукционный процесс.

Из названных выше культур - картофель в условиях Таджикистана поражается наиболее сильно вирусными заболеваниями, потерн от которых составляют 35-40%. В результате этого в последние годы -урожайность картофеля в Республике снизилась на 80- !00ц/га. Наша Республика остро нуждается в оздоровлении семеноводства. Ориентация на завозной картофель не гложет служить основой развития семено-водлва, снижения себестоимости продукции и увеличения товарного производства. ." •

Все это требует скорейшего создания и Внедрения в Таджикистане новых технолошй выращивания семенного и продовольственного-, картофеля. Одним нз перспективных подходов в этом направлении является использование новейших методов биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии в картофелеводстве. Несмотря на больщую значимость перехода семеноводства картофеля на безвнрусиу1о основу, данная проблема остаётся ещё не решённой.

Одним из подхода получения безвирусного семенного картофеля является применение биотехнологических методов, что в свою очередь позволит возродить утраченные ценные признаки у различных сортов. .

Вместе с тем. развитие исследований апикальных меристемных культур in vitro стимулировало разработку в нашей лаборатории методов молекулярной биологии для изучения генома хлоропластов и для совершенствования способов выделения протопластов из разных растений и их размножения на искусственных питательных средах.

Экономически оправданным является использование меристемных культур высокоурожайных сортов картофеля, i,v. размножение на основе методов биотехнологии.

Цель работы - изучение хлоропластного генома, выявление его биохимических особенностей, а также использование их в разработке принципов биогехнологических методов для получения оздоровленных сортов сельскохозяйственных растений.

В связи с этим в задачи работы входило:

• разработать новые методы выделения ДНК из хлоропластов сельскохозяйственных растений и пластид клубней картофеля -амилопластов;

- выявить особенности хлоропластного генома у растений, относящихся к разли'-'ЫМ таксономическим группам;

- выяснить особенности хлоропластных и амилопластных геномов у картофеля; '

- изучить морфо-физиологическне и биохимические параметры оздоровленных и неоздоровленных сортов картофеля;

- исследовать белковые спекгры клубней картофеля в зависимости от их физиологического состояния;

- изучить . фотосинтетическую активность оздоровленных и нео- 'оровлепных сортов картофеля:

- сравнить карбоксилазную и оксигеназную активность и содержание РБФКО у оздоровленных и неоздоровленных сортов картофеля;

- использовать микро- и макроклубнн картофеля в разных экологических и агроклиматических условиях горных и предгорных зонах Таджикистана с целью внедрения в производство безви-русног о картофелеводства.

Научная новизна и практическая значимость. В работе впервые применен метод энзиматнческого получения протопластов высших растений для препаративного выделения пластидных ДНК. Проведено сравнительное изучение ее физико- химических характеристик. Показано, что дивергенция полинуклеотидных последовательностей ХГ1-ДНК вдет медленнее, чем цуклеотидных последовательностей ядерных

ДНК злаковых растений. Впервые проведено сравнение амнлонласт-ного и хлорогшастного геномов картофеля, что важно не только дня понимания ядерно- цитоплазматических взаимоотношений в растительной клетке, но и для разработки биотехнологических приемов быстрого размножения картофеля.

Используя культуру меристем, удалось оздоровить рад районированных и перспективных сортов картофеля. Установлено, что по интенсивности фотосинтеза оздоровленные сорта значительно превосходят неоздоровленные. Отмечены различия между оздоровленными и неоздоровленными сортами по ряду физиологических и биохимпче-, ских показателей. Экспериментально установлена высокая степень белковых вариаций внутри сортов, позволяющая их маркировку.

Установлено, что накопление вирусов в клетке картофеля существенно блокирует биосинтез ключевого фермента фотосинтеза-рибулоэо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы-оксигеназы (РБФКО).

Результаты изучения хлоронластных ДНК растений могут найти свое применение в проблеме повышения фотосинтетической продуктивности растений. Другим аспектом всестороннего изучения ДНК пластид является установление филогенетических связей у разных генотипов, что представляет интерес для практической селекции.

Выделение протопластов из клетки клу^лей картофеля нашло применение в биотехнологии размножения картофеля, что очень важно для разработки новых технологий семеноводства картофеля на безвирусной основе.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод выделения ХП-ДНК путем культивирования протопластов, позволяющий увеличить выход ДНК.

2. Установлена идентичность геномов хлореплистов и амнлоплас-тов и выявлена роль ядерного генома в их структурно-функциональной дифференциации.

3. Соотношение карбоксилазнон и оксигеназной активности фермента РБФКи определяет продуктивность растений.

4. Усовершенствован метод купы ры апикальных меристем :у различных генотипов картофеля для получения безвирусного семенного материала.

5. Высокогорная зона Таджикистана исключительно благоприятна для создания генбзнка бс-звирусного картофеля. Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 2-м Всесоюзном симпозиуме "Структура й функции нуклеиновых кислот и биосинтез белка в растениях" (Ташкент, 19"?}, на конференции молодых ученых И неги гута общей . гецетИки.А И СССР (1977), на конференции молодых ученых; меисфаку; Хстскон проблемной НИЛ им. А.Н. Белозерского Московского Госуниверм'гге-

та им. М.В. Ломоносова (1977/1978), на межрегиональной конференции "Нуклеиновые кислоты и хроматин растений"(Черновцы, 1978), на семинарах лаборатории биохимической генетики Института общей ге-нетнкнАН СССР0978), Института физиологии н биофизики растений АН Тадас ССР( 1978), Инстшута экспериментальной ботанйки АН БССР (1979), на IV- ом Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" ( Москва, 1979), на конференции, посвященной 50-летию Башкирской АССР (Уфа, 1979), на конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Душанбе, 1981), на конференции "Геном растений" (Черновцы, 1983), на симпозиуме "Геном растений структура и экспрессия" (Уфа. 1983), на Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1986), на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1986), на 1У-ой конференции биохимиков Республик Средней Азии и Казахстана ( Ашхабад, 1986), на У-ом сьезде Всесоюзного общества генетнков и селекционеров им Н.И. Вавилова (Москва, 1987), ка Республиканской конференции специалистов агропромышленного комплекса Таджикистана (Душанбе, 1988), на республиканской научной конференции " Актуальные проблемы фтнко- химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), на конференции профессорского-преподавательского состава ТСХИ (Душанбе. 1991), на 1-ом Международном Всеиранском конгрессе аграрникоз(Мешхед, 1993), на научной конференции, посвященной 60- летию агрономического факультета "Пуп повышения предутчтивностн сельскохозяйственных культур" (Душанбе, 1995), на научно- теоретической конференции "Научные основы прогрессивных технологий хранения и переработки сельскохозяйственных продукций для.создания продуктов питания человека" (Углич, Украина, '995), на научных конференциях Биохимического общества Республики Таджикистан (Душанбе, 1996-1997), на республиканской конференции, посвященной 50-летию Таджикского Государственного Национального университета (Душанбе, 1998), на расширенном заседании ученого совета факультета агробизнеса, плодо-овошеводства, виноградарства и агрономического факультета Таджикского аграрного университета (Душанбе. 1998), на расширенном заседании кафедр биохимии, физиологии растений и ботаники биологического факультета Таджикского Государственного Национального университета (Душанбе, 1998).

, Публикации. По материалам диссертации опубликовано 47 работ.

Структур» и ооьем диссертации. Диссертационная работа со-И'-< введения, четырех глав, обсуждения результатов, заключения, выкидав и списка цитированной литературы. Объем диссертации со-• ёгатйляетстраницах машинописного текста н включает 24 'рисун-

ка, 29 таблиц к 2 схемы. Список Использованной литературы включает наименований, в том числе (на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Объект исследований. Объектом исследований служили регенераты картофеля (Solanum tuberosum L.), а также пшеница (Triticum aestivum L.), рожь (Secale cereale L.), тритикале (Triticale aestivesecale) и ячмень (Hordeum vulgare L.).

Методы исследований. Хлоропластнуто ДНК выделяли по методу, описанному в работе (Каримов и др., 1978). Пластиднуго ДНК выделяли щелочным методом (Botty, Zeech, 1982). Рестрикцию хлоро-пластнон ДНК осуществляли согласно (Манниатис и др., 1984). Лиги-рование осуществляли с помощью ДНК- лигазы фага- Т4. Для лиги-рования по "тупым" и "липким" концам ДНК использовали буфер следующего состава (10х):0,66 М трнс- HCI рН 7,6; MgCIj- 50 мМ, ДТТ- 50 мМ; АТФ- 10 мМ. ДНК-лигазы брали по 0,8-10 ед. Лигиро-вание вели в течение ночи при Ю°С.

Выделение и очистку РБФКО проводили по методу Ливана и Кридла (Lyivan, Criddl, 1972) в модификации (флиев, Васильева, 1984). Карбоксилазную активность РБФКО определяли радиометрическим методом (Романова, 1980) по скорости включения Н2 14 COj в кислот-нонерасгооримые продукты реакции в прису^твии субстрата - РБФ. Оксигсндзную активность РБФКО определяли полярографическим Методом.

Содержапие белка определяли по методу Гринберга и Крэдо-на (¡984), основанном на взаимодействии белка с бромфеноловым синим с последующим определением на спектрофотометре "Ультраспек-1 Г'при 540 нм.

Электрофорез белков .проводили по методу Леммли (Laemmly, 1970) на пластинах размером (1 Юх 100x1 мм) в полиакриламидном геле, градиент концентрации от 7,5 до 15%. Электрофорез проводили при напряжении 290 в., силе тока 25 мА в течение 5 часов. Использовали прибор ЬКБ (Швеция). Окрашивание проводили в течение 2-х часов с красителем кумасси (G- 250).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Препаративное выделение хлоропласткой ДНК in высших ряст тин. Получение хлорогагастнон ДНК из растений семейства злаковых представляет определенные методические трудности, в основном связанные с обработкой жестких листьев. Обычные процедуры зыделения хлоропластов с помощью высокоскоростной гомогенизации или растирания в жидком азоте не давали возможности получить npehapa-

тнвные количества пласгидной ДНК, свободной от примесей других видов клеточных ДНК. Поэтому нами был.разработан способ выделения, основанный на применении фермента целлюлизина, используемый для получения активных протопластов и позволяющий избежать механических повреждений клеточных органелл. Основное внимание было уделено оптимизации процедуры выделения протопластов из злаковых растений и тщательному контролю всех стадий очистки хлоропластов. Основные методические приемы были выполнены на проростках ячменя (Hordeum vulgare L.).

Листья ячменя измельчали на отрезки 2-3 см, обрабатывали с нижней стороны корундом и помещали в чашки Петри с раствором, содержащим 0,4 М маши гг. )% бычий сывороточный альбумин и 1,5% целлюлнзин (Calbiochem, США), pH 5,6. После 18 часов инкубации при 4"' С v темноте чашки встряхивали и протопласты дважды отмывали от фермента 3-5-кратным объемом 0,4 М маннпта+1 мМ CaCh. D указанных условиях сохраняется до 90-95% интактных протопластов от общего числа клеток, а их выход достигает не менее 4-5x10 в расчете на 1г листьев.

Для разрушения протопластов применяли простую процедуру продпвливания их суспензией через иглу шприца Рекорд, соединенную с насадкой дня миля и i ровых фильтров, имеющую прокладку из 4 слоев ткани "Мираклод". Для полного разрушения протопластов достаточно трех- пяти последова1ельных пассажей, при этом более 95% хлоропластов при наблюдении в фазово- контрастном устройстве сохраняли ореол вокруг наружного края. Суспензию разрушенных протопластов центрифугировали дважды при 3000 об./мин. в течение 15 мин. и осадок хлоропластов ресуспендировали в буферном растворе, содержащем 0,05 М трис- HCl, о",3 М маннита, 0,003 М ЭДТА, 0,1 % альбумина pH 7,8. Суспензию наслаивали на ступенчатый градиент сахарозы (1,0, 1,5 и 2,0 М в буфере того же состава), центрифугировали при 25000 об./ мнн. в течение 90 мин. ( Spinco, SW- 27 ),отбирали темно-зеленый слой хлоропластов, который ресуспендировали в исходном буфере, содержащем вместо ЭДТА I мМ Mg С1г. Визуальный анализ препаратов хлоропластов на стадии градиентного центрифугирования /тока мл. что использование протопластов позволяет получить четкие Зоны хлоропластов в отличие от размытых диффузных слоев, характерных для препаратов, выделенных высокоскоростной гомогенизацией лтегокой ткани. Суспензии хлоропластов ячменя, выделенные из протопластов, выглядели вполне однородными и, независимо от разных партии листового материала, содержали не более 5 разрушенных пластид. Общий выход нативных хлоропластов составлял в среднем 5x1 ös пластид на ir листьев.

Близкие результаты по выходу пластид были поручены нами при выделении протопластов из других злаковых растений: ржи, пшеницы, тритикале, пырея и п'нснично-пырейного гибрида.

Выделение хлороиласшой ДИК злаковых растений проводили двумя методами. На начальном этапе исследований для опенки выхода ДНК использовали модифицированную проце;туру Марм. >а (Маппиг , 1961). Суспензию хлоропластов обрабатывали панкреатической ДНК-азой и лизнровалн 2 % раствором саркозилз, затем проводили два цикла хлорсформенной депротеинизацнн и избирательное осаждение ДНК нзопропиловым спиртом. Основную партию препаратов, предназначенную для изучения физико-химических характеристик . и реетрикционного анализа, получали по методу Колоднера и Тева-ри (К.о!ос1пег, Те\\'ап , 1975 ). К хлоропластам для удаления ядерной ДНК добавляли 100 мкг/мл панкреатической ДНК-азы, инкубировали 60 мин при 4° С, ДНК-азу отмывали и вносили одновременно проназу из расчета 200 мкг/мл, саркозилат натрия до конечной концентрации 2%. Пробы инкубировали 30 мин. при 37 0 С, добавляли СзС1 до 1 М и "выдерживали при 0й С 1.5-2 часа. Смесь центрифугировали при 2000 об./мин. в течение 20 мин., осадок отбрасывали, а к супериаташу добавляли сухой СбС1 до плотности 1,700 г/см , а также этндпйбромида до конечной концентрации 250 мкг/мл. Ультрацентрнфугнрованне проводили в роторе Т1-50 при 44000 об/мин в течение 44 часов при 20" С.

Флуоресцирующую полосу хлоропластьой ДИК отбирали с помощью шприца.

Сравнивали выходы хиоропласгной ДНК ячменя при двух, методах ее выделения - по Колоднеру и Тевари и по протопласт ному методу. Независимо от партий листового материала средний выход чистой ДНК при использовании протопластного метода составляет 40-50 мкг в расчете на 10 г исходной листовой массы. Этот показатель примерно в 10 раз выше, чем при методе Колоднера и Тевари (5 мкг/Юг пиегьев), в котором размельчение листьев достигается высокоскоростной гомогенизацией. Для оценки ингактности пластид определяли содержание хлорофилла п препаратах на разных стадиях выделения хлороиласшой ДНК (табл. I).

Как видно из габл.1, различия конечном выходе *ДНК в основном связаны с повреждением хлоропластов. Значительная ген-еря хлорофилла наблюдается уже на начальной стадии фракционирования пластид, указывает на их разрушение в процессе высокоскоростной гсмогенеэацпн. Так как метод Колоднера и 'Геварн включает также обработку суспензии хлоропластов ДНК-зой, то ма^ый выход ДНК может быть вызван действием фермента на частично разрушенные- хлоропласты.

Таблица 1

Содержание хлорофилла в препаратах хлоропластов ячменя ___на разных стадиях их пол^ешш_____

Хлорсф ни, мкгй" сь цххо веса

Этапы вьдавния ЛИСТЬЕВ

хюрогтоов МевддКожднера Прогогаианый .

иТязари мекщ

Профцчьтрсжанный юмогаш 380 320

ОсадакЗОООх« 80 300

Хлорог кисть 1, оч1 вденные ь 45 240

1раттлекоц1$ешргцни

сахарозы

Напротив, при использовании протопластного метода существенной потери хлорофилла не наблюдалось на всех стадиях очистки хлоропластов. Близкие значения по конечному выходу пластидной ДНК были получены эизиматическим методом при выделении ДНК из 7-15- дневных проросгкоЕ ржи, пшеницы, их амфидиплоидного гибрида-тритикале, пырея и ншенично-пырейного гибрида. Таким образом, можно заключить, что предложенный нами способ выделения гшас-тндиой ДНК из злаковых растений позволяет существенно повысить выход ингактных хлоропластов и облегчить процедуру экстракции вы-сокопо' (мерной ДНК.

2. Выделение амилон ластов и амилопластной ДНК клубней картофеля дной из экспериментальных задач наших исследований является сравнительное изучение хлоропластнон и амилопластной ДНК. Препаративные методы фракционирования амилопластной ДНК не разработаны, поэтому была сделана попытка распространить способ целлтоли-зиновой обработка на ткани клубней картофеля. В первых же экспериментах было установлено, что при обработке целлюличином ткань клубней необходимо мацерировагь. Для этого был использован "Мацерозим" (СаГЫосЬет , США ). Общая схема выделения выглядит следующим образом: небольшие кусочки клубней помешали в лизи-рующий растнор, содержащий 0,5 М маннита, 0.1 М СаСЬ. 0,02 М аскорбиновой кислоты. 0,1% альбумина, 1,5% мацерозима и 1.5 ' цел-JЦOлизшia, рН 5,6: инкубировали при 25° С в течение 18 часов и отфильтрованным ¡омиенаг осветляли при 100 ху V, течение 5 мин. Амн-яопласты осаждали при 2500 .43, отмывали дважды от фермента и фракционировали з ступенчатом градиенте сахарозы (1,0, 1,5 и 2,0 М в трнс-11С1 буфере. рН 7,9). Амшюгшасты отбирали из о ой зоны, (между и 2,0 М сахарозы) и дальнейшее выделение ДНК прово-;пшI так же,как и дан хлорогизасшых ДНК.

Результаты исследований ДНК, выделенной из амилопластов в линейном градиенте СяС1 показали, что амилопластная ДНК в УФ -свете флюоресцирует в виде одной полосы. Количество ДНК, полученной таким способом, составляло 4 мкг на один грамм сырой тканн клубней картофеля, что по меньшей мере в 20 раз выше, чем при использовании гомогенезации для разрушения клеток и фенопьной де-прогеннизацин (Лобов, и др., 1977).

Следует отметить, что разработанный нами метод выделения пластидной ДНК был успешно применен для выделения ДНК из листьев картофеля и гороха. Препараты хлоропластной ДНК юроха использовались в исследованиях по клонированию ВсоШ фрагментов ДНК хлорогшасгов в составе шгазмиды ЯЗР 2124 (Андрианов и др., 1978).

Применение протопластного метода особенно оправдано в случаях, когда растительного материала немного. Так, например, данные о физико-химических характеристиках хлоропластных ДНК пырея и пшеннчно-пырейного гибрида были получены из крайне незначительных количеств листового материала (72 и 42 г зеленой массы соответственно). Средние выходы хлоропластной ДНК из большинства изученных нами растений, составляющие около 50 миг ДНК при обработке 10 г листьев, вполне достаточны для проведения основных физико-химических исследований ДНК - рсстрккцяошгого анализа, определения плавучей плотносги, температуры плавления и нуклео-тидного состава.

3. Анализ физика- хпдпгчесетгх характеристик х.троплпстпоП ДНК злаковых растеплй.

Разработка удойного метода выделения пластпд н их пысокопо-лнмерной ДНК позволила перейти к решению следующей экспериментальной задачи- сравнению хлоропластных ДНК разных генотипов злаковых растений. Обычно при проведении исследований нлас-тидных ДНК большинство экспериментаторов ограничиваются углубленной характеристикой одного из видов высших растений (Ко1о<Зпег, Тет/ап, 1975), либо одним перспективным методом, например рестрнк-ционным анализом, сравниваются хлоропластные ДНК растений из различных систематических групп (А1с1н5оп е1 п!.,1976). Мы поставили задачу комплексно сравшгть хлоропласшые геномы пшеницы, рзкл п их амфнднплоида- тритикале( 2п~ 56), а также пырея и одного га пше-■нично- пырейных гибридов (ТлГ/сит а§г01г!{!сиш Ост 2л= 56).

Распределение плавучей плотности очищен.1ых хлоропязстм1ых ДНК злаковых растений, при равновесном центрифугировании"в -градиенте хлористого цезия приведено на рис.1.

Рис. I. Распределение ДНК хлоропластов в градиенте хлористого цезия: I - пшеница; II - рожь; III - тритикале; IV - пырей; V -пшенично-пырейный гибрид; VI - ячмень; VII-смесь ДНК хлоропластов и митохондрий. Ультра центрифугирование проводили в течение 24 час. при 20СС, 40 ООО об/мин. Spinco Б, fkcknian. В качестве маркёрз использовали ДНК М. iyxockikticin с плотностью 1,371 г'см-\ . Можно г.идеть, что пики являются симметричными, дополнительные Ш кги, соотаетстъующне гшавучей плотности ядерных (1.702 г/см)

и мнто.тондриалытых ДНК (1.707 г/см), в образцах пластидных ДНК не обнаруживаются. Для пшеницы, ржи, тритикале, пырея, пшенично-пырейного гибрида и ячмеля были получены следующие значения плаву 1 ей плотности их хяоропласшых ДНК (в г/см): 1,6972; 1,6976; 1,6972; 1,6971; 1,6971 и 1,6975? (табл.2). Видно, что показатели практически идентичны, различие между ними статистически недостоверно. за хлюченнсм, возможно, ДНК ячменя.

Таблица 2

. Физико- химические характеристики ДНК хлоропласта» некоторых видов растений

: Содержание оснований, в мол. % : Тгш. : Плавучая

Растения :_______: : плотность.

: А : Г : Т : : Ц :5-МЦ: Г + Ц : С" : г/см3

Цшеница 30,68 19,56 30,14 19,62 - 39,2 85,2 1,6972

Рожь 30,63 19,63 30,19 19,55 . 39,2 85,6 1,6976

Тритикале 30,49 19,76 29,91 19,83 - 39,6 85,2 1,6972

Пырей 30,57 19,68 30,02 19,74 - 39.4 • 85,0 1,6971

ППГ 30,54 19,70 29,96 19,89 - 3>,5 85,1 1,6971

Ячмень 30,40 19,96 29,77 19.87 - 39,8 > 1,6978

Горох* 30,11 19.5130,36 19,49 . 39,0 -

Картофель 30,28 19,90 29,94 19,20 - 39,! 84,7 1,6962

Клубни картофеля 30.39 19,83 29,97 19,09 - 38,9 84,7 1,6964

Е.соЬ 24,4124,86 24,86 25,96 - 50,72 89.5 1,710

В качестве дополнительных физик, -химических характеристик оыли исследованы кривые плавления (габл.2), при этом обнаружено, •по Тпл. всех хлороплдстных ДНК находится в узком интервале, в среднем около 85% с малым, носящим статистический характер, отклонением у плгспцшоП ДНК ржи. Гипсрхромтм ДНК исследованных образцов находился в пределах 30%; ренатурацня имела место п сред-<ем за 3 часа при 60", что свидетельствует о гомотхгнностй вопулйп'« лолекул ДНК в препаратах (рис.2).

Рис.2. Кривые плавления ДНК хлоропластов злаковых растений и ДНК фага 12 (и 1 SSO

Важной характеристикой ДНК являются данные о нуклео-П(ДКОМ составе, которые могут бьпъ получены по речулмаим определения плавучей плотности н температуры плавления. Достаточное количество очишенной ДНК позволило провести прямое хроматогра-фическое определение нуклеотидшн о состава. На основании этого анашш (таб;Г.1) можно сделать заключение, что хлоропдастные ДНК .злаковых растений характеризуются сходным в пределах ..„vwr. % содержанием ГЦ пар. В пределах точное!и, достигаемой хром.гпмрафом "Варшн", ь препаратах не обнаруживается 5- мстилшшлнн, чк>, по

и

мнению многих исследователей, является надежным критерием чистоты препаратов пласшдньи ДНК.

4. Молекулярная гибридизация хлоропластных ДНК некоторых видов злаковых растений.

Суммарное содержание оснований, выявляемое прямой хроматографией гидролизатов пластидных ДНК, является достаточно крупномасштабным признаком, не имеющим информации о распределении нуклеотндов в ДНК. В тоже время метод термической денатурации не настольхо чувствителен, чтобы выявить различия во внутримолекулярной гетерогенности ДНК. Поэтому дальнейшая информация о степени близости геномов хлоропластов ряда злаковых получена нами методом молекулярной гибридизации. Результаты гибридизации пластидных ДНК с фрагментироваиной реперной ДИК хлоропластов пшеницы суммированы в табл. 2. Обнаруживается полная идентичность геномов' пшеницы и тритикале, в то же время хлоропластные ДНК ржи и, особенно, ячменя характеризуются меньшей относительной гомологией с указанными видами. ^ '

Таблица 3

Молекулярная гибридизация хлоропластных ДНК

Образец ДНК : Радиоактивность, Гомология, %, среднее на фильтре : нмп./мин.(-фон) : из 5 определений (М ± 6)

Пшеница* 1595 100 ± 3

Тритикале 1643 103 ± 5

Рожь . ' 1472 92 ± 2

Ячмень 1089 68 ± б

Е.соК 14 <1

♦-реперная ДНК пшеницы, удельная активность 4000 имп./мин.; инкубация при 60° в течение 18-24 час. при соотношении меченой ДНК ^ иммобилизованной на фильтрах 1:30; абсолютное связывание 40%,

5. Рсстрикцноппый алгяиз хлоропласшых ДНК , злаковых растений. | >

На рис.3 приведены картины распределения йсоРЛ- фрагментов хлоропластных ДНК пшеницы, ржи, трнтмкале и ячменя после, их

и

Рис.3. Распределение фрагментов Д11К хлоропластов при

электрофорезе в I Кг ном геле агарозы (схема негативов). IЛНК-фага X , 2.ДНК пшеницы, З.ДНК тритикале. 4.ДНК ржи, 5ЛНК ячменя, 6.ДНК пшеницы без обработки ферментов ЕеоШ

электрофореза в агарознои геле. На электрофореграммах выявляется ГЧ9 полос разной интенсивности свечения, причем их общее расположение достаточно сходно в хдоропластных ДНК пшеницы и тритикале. Определенные различия обнаруживаются в ДНК ржи в области фрагментов с молекулярным весом от 0,95 до 3,3x10 дальтон и особенно г> хлорспластной ДНК ячменя. Таким образом, рестрнкцион-

ный анализ полностью подгверждзет результаты молекулярной гибридизации этих ДНК.

6. Сравнение геномов хлоропластев и амилоплаетоп картофеля Амилопласты, функция которых состоит в запасании крах м-та. представляют собой одну из разновидностей лейкопластов. ' Геном амилопластов изучен недостаточно, в связи с чем целесообразно провести сравнение хлоронластной и амилонластной ДНК. Исследование хлоропластной и аммлопластной ДНК показало, что температуры плавления этих ДНК совпадают (84,7°С), показатели плавучей плотности также идентичны и соответствуют 1,696 г/см в отличие от ■ДНК ядер клубней, которая оказалось более тяжелой - 1,702 г/см. Не" было выявлено также различий в содержании отдельных оснований этих ДНК (табл.2). На завершающем этапе этой серии исследований изучался гидролиз пластидных ДНК в условиях избытка энцонукпеазы ЕсоШ, который показал сходные картины распределения фрагментов ДНК (рис.4) и совпадающие показатели по молекулярному весу выявленных фрагментов.

:гг---г

— —

---

——— - ---- ------ 1

Г

I 2 а 4 5 е

йю.4. Каршт -эпек1роф;решчегкого ¡хсгспзпи Еои <и ^»хи ма пшДНК амкттс-топ и хлоропгапш шркх^я и 1% ааапозном гаг (схема с ногапюаЛ 1 -ДНК фага Х;2 "5-ДНК хлоре* шш в;4 - ДНК у.щу<>-

гшалов&шицхшг.и ферма» ми ДсоШ,

Таким образом, все перечисленные выше результаты сравнения амшгопластной л хлоропласггной ДНК картофеля приводят нас к заключению о идентичности геномов пластид. Структурно-функциональное отличие амнлопластов от других пластид связано с выяснением ядерного генома клубней, спецализирующихся на накоплении значительного количества крахмала.

7, Размножение и оздоровление исходного посадочного материала картофеля I В данной главе приводятся и обсуждаются результаты исследований по использованию методов биотехнологии с целью организации семеноводства картофеля на безвирусной основе в Таджикистане. Работы по освобождению зараженных сортов картофеля от вирусов с использованием метода культуры апикальной меристемы ведугся нами с 1586 г. Вирусе этической контроль растений осуществляли с применением методов ИФА- диагностики. Испьпание и размножение оздоровленного материала проводили в предгорье (1700 м над ур, моря) и в условиях открытого грунта горной зоны( 1900-2200м).

Начиная с 1990г., ведутся работы по повторному оздоровлению основных районированных и перспективных сортов Лорх, Невский, Кардинал, Ранняя роза и др. Для этих целей отбираются клубни здоровых клонов, свободных от латентной инфекции вирусов X, Я, Ь. 1\ М и У Тщательность в отборе клубней является важным элементом работы, поскольку она позволяет свести до минимума вероятность попадания первичной инфекции ь эксплантаиты и, следовательно, расширяв" ч возможность получения полноценных безвирусных регенерап-тов(Алнев, 1997).

Для освобождения картофеля от распространенных мозаичных вирусов X, I,, М, У, А и др. необходимо сочетание термотерапии с методом культивир' -алия верхушечной меристемы (размером 100-25()мк) на искусственных питательных средах (Трофимец и др,, 1978'>. При этом эффективность оздоровления зависит как от размера эксплантатов, так и от условий развития меристемы. Данные различных авторов свидетельствуют, что наибольшая зона верхушечной меристемы свободна от вирусов Ь,У и А, меньшая - от X и наименьшая - от 8 и М вирусов. Поэтому освобождение картофеля от вирусов 8 и М в большинстве случаев способствует и оздоровлению вирусов 1,.У,Л и X. Однако при этом очень трудно получить регенераты от меристемы размером менее 100 мк (Трофимец и др., 1978) Для регенерации целого растения необходимо, чтобы к>пынвируемый участок меристемы включал хотя бы один листовой зачаток, а его размер был не менее 0,1мк(М-.мь:оз.1973).

. Учитывая '-то, для культивирования мы вычленяли верчушечную меригн-.муэтиолированныхрсспгоъ клубней , прошедших тсрмотсра-

IS

пию, с одним ярнморднем и размером 150-200 мк. Эту работу, как правило, проводили весной ( в марте-апреле ), так как , по, литературным данным, это время года способствует лучшему росту меристемы (Трофнмец и др., 1978 ). Для получения регенератов использовали питательную среду Мурасчге-Скуга с последующей 3-х- кратной пересадкой выращенных меристемных ростков на новую среду.

Культивирование ростков и растений осуществляли в световой комнате с регулируемыми условиями; температурой 22-23°С, влажности- не ниже 70 % и интенсивностью света 2 тыс. гаокс при i 6-ти- часовом светоперноде, для чего использовали люминесцентные лампы и лампы накаливания. Количество получаемых меристемных регенеран-тов зависит от сорта картофеля и составляет 5-8 %. По приживаемости меристемы и органогенезу лучшие результаты получены по сортам Кардинал, Лорх, Ранняя роза и Невский. Врбмя от посадки меристемы на питательную среду до получения проростка с 4-5 листочками составляло от 3 до 6 месяцев в зависимости от сорта.

Начальным этапом ускоренного размножения исходного оздоровленного картофеля является мнкрочеренкованне пробирочных' растении с последующим укоренением п выращнванйем черенков in vitro. При этом из одного пробирочного растеря получается до 5-6 черенков ( по числу междоузлии ), которые через 23-25 дней подрастают и становятся пригодными к пгресадкс в почву иш к повторному черенкованию. Таким образом, за 4 месяца из одного исходного растения можно получить 3,5-4 тыс. растений.

Затем проводили работы по укоренению черенков пробирочных растений in vivo. В качестве субсграта кспользовайи торф, горф+ перлит и торф+песок в соотношении 3:1. Как в световой комнате, так и в теплице укоренен ,л черенков и развитие растений нз них происходило интенсивнее на субстрате торф+песок. Лучше укоренялись черенки с двумя междоузлиями, чем с одним. Высокая степень укоренения черенками отмечена у сортов Лорх, Ранняя роза-до 92% н Кярди-нал -до 78 %. Этот прием позволяет на ранних этапах размножения безыГрусного материала вырастить из одного пробирочного растения минимум 3-4 растения и добиться экономии дефицитных и дорогостоящих компонентов питательной среды, используемых в ; пробирочной культуре. ; ; fi 1

Технология производства тепличных, клубней с успехом - пр№су няется во многих регионах Российской Феде! ции, Беларуси, Украине.'

Растения были однородными, расщслле!те их по • морфолотг.чео кнм признакам не отмечалось. '

Но результатам визуальной оценки и серодиагностика fprri проводилась в фазе массового цветания) вирусные растения э явной itim скрытой форме не были выявлены.'

Уборка клубней проводилась з начале июля, когда растения ве-гетнровали и на них еще не развивались признаки макроспориоза. Тем не менее, к это*,,., времени под каждым кустом формировалось достаточное количество клубней.. '

Из приведенных данных также следует, что при раннем сроке посадки (начало марта) увеличивается средняя масса одного клубня и соответственно общая масса клубней; при относительно поздних сроках посадки (середина марта- начало апреля) на • единицу тепличной площади приходится больше клубней, но преимущественно мелкой фракции. В целом, на наш взгляд, предпочтение слезет отдавать ран-нсвесснниу. срокам посадки, которые позволяют: I) получить больше клубней средней фракции, пригодных для механизированной посадки: 2) избежать массового заселения растений тлями-переноечнкам, а следовательно, и повторного заражения посадок афидофнльными вирусами; 3) проращивать клубни ко времени оптимальных сроков посадки в горной и предгорной зонах.

Работы в горной зоне по размножению оздоровленного картофеля проводились в период с апреля по сентябрь. При этом пробирочная рассада вывозилась в три срока: апрель, май и июль. Вывезенный в-апреле и мае пробирочный маршал доращивался в предгорной зоне (1300 м над ур.м.); вывезен- 1Я в июне рассада проходила период адаптации и доращивания непосредственно в горной зоне (1500-2000м над ур.м., Гармский ранен), где и было организовано размножение всего имеющегося безвнрусного картофеля.

8. Интенсивность и прод} ктишюсть фотосинтеза разных генотипов картофеля

Интенсивность фотосинтеза листьев. В табл.4 представлены результаты измерения интенсивности фотосинтеза у разных сортов картофеля, в тем числе оздоровленного сорта Невский. Из данных г?б лнцы видно, что интенсивность фотосинтеза резко меняется по мере увеличения листовой поверхности и этот процесс зависит также от сорта кг.рюфеля. У исследованных сортов в фазе бутонизации интенсив-носгп. процесса максимальная, а в последующие фазы развития она постепенно уменьшается. Необходимо подчеркнуть, что шпгенскшюсть фотосинтеза листьев оздоровленных сортов в фазе бутонизации н цветения заметно превосходит интенсивность процесса неоздоровленных сортов. Превышение интенсивности фотосинтеза в эти фазы развития картофеля у оздоровленного сорта Невский составляет 23- 30%, а у сорта, Полет- 17-25% соответственно. ''

Таблица 4

Интенсивность фотосинтеза растений картофеля и онтогенез (мг СО: /дм'.час)

¡Фазы ратвмтнм, две

СОРТ ¡добугонимцик. бутонизация: цветение: сдареваняе

Невский

(контроль) 12.2 ±1,2 Нсвский (оздоровленный) 13,4 ±1,3 Полет (ие-оздоровлеп-

ЙЬЙ) 11,7 ± 1,7

Полет (ото-рсвлсиьыв) 12,5 ±1,2

25.1 * 2,7 23.7 ± и 3,7 ± О,! 31,0 ±},1 302 ±2,2 7,4 ±0,6

23.2 11,9 20Л ±2,1 8,1 ±0,4 273 ±2,1 25,1 ±2,7 8,3 ±0,7

Следует подчеркнуть, что по интенсивно<~т фотосинтеза в фазах бутонизации и цветения сорт Невский значительно превосходит сорт Полет. Наиболее полное представление о количестве ассимилированного СО2 при накоплении биологического урожая даюг исследования дневной динамики интенсивности видимого Фотосинтеза, которая зависит от сорта и от фазы развития. Максимальная итеношнооть фотосинтеза в фазе буюнизацни- и цветения отмечена в первой половине дня. Дневной ход интенсивное ги водимого фотосинтеза имеет вид одновершинной крицей с максимумом в 13 часов, и по характеру прохождения процесса все исследованные сорта почти не отличаются друг от друга.

Таким образом, величина интенсивности фотосинтеза зависит не только от сорта, но и от фазы развития растений. Наблюдались о: ;чия по величине интенсивности фотосинтез, между оздоровленным* К неоздоровленным сортом. Максимальной величины фотосинтез достигает в 13 часов дня и составляет для оздоровленного сорта 28,432,2 мгСОг/час. Неоздоровлеиный сорт имеет значительно меньшую величину интенсивности фотосинтеза в 13 часов дня -24,2-26,4 мг СО з /час.

и

Ё &

п

р

а

\7

*

.& Ч ~ «

О Й и

г

-и й 1С

& В

5 &

-4-

-Ь

ч-

■4-

50

а

и ы

п

ы I ь к

а «

10 13 16 10 13 16 10 13 16

время, часы невский попет кемеровский

Рис. 5. Дневной ход интенсивности фотосинтеза оздоровленных ..............-— и контрольных ............. сортов картофеля.

9.Карбексилазная и оксигеназвяи активность РБФКО в онтогенезе листа картофеля

Известно, 'по функциональная активность РБФКО зависит от синтеза больших и малых субъединиц, состояния фермента, наличия акучъазы и других Факторов. В работе А.'Г.Макроносова (1981) пока-•заца зависимость карбоксилазной активности фермента от возраста листа! картофеля. В связи с тем, что в процессе развития хпропластов набшодаето! изменение соотношения карбоксилазной и оксигсназной рмданостн РБФКО, а также исходя из положения, что мембранная

2J

(Алиев и др., 1982), мы исследовали функцию РБФКО в онттенос листа картофеля. Исследование фермента картофеля представляет интерес, так как картофель теряет ь процессе дыхания более 30% аосими-лячов. Кроме toro, особенности синтеза и соотношения карбоксилаз-нон и окенгеназной активности РБФКО в процессе развития jihciu картофеля практически не исследованы.

В опыте брали второй лист картофеля оздорс-нлtnuoi о сорта Нси-скнй, продолжительность жизни которого составляй' ЗЗОО дней. Признаки старения появляются на 35-40 день ст начала развития лисп. Второй лист картофеля имеет высокую карбоксилазную активность и играет важную роль в развитии целого растения. В зависимости от возраста и физиологического состояния листья можно подразделить на три группы: (8-14- дневныг), зрелые (20-30- аненные), старые (45-50 -дневные).

В табл. 5 приведены данные по содержанию и активности РБФКО в онтогенезе листа картофеля. Из этил данных видно, что нарастание карбокенлазной активности фермента происходит до 21 дня, затем несколько снижается и резко снижается у старого листа. Кпрбоксн-лззная активность фермента у 50- дневного листа в 2 раза ниже, чем у зрелого. Подобные изменения происходят и с окенгеназной активностью РБФКО в процессе роста и формирования лист. Хотя следует отметить, что при старении листа снижение окенгеназной активности происходит постепенно, в то время как карбокенлазная стокается более резко.

Содержание хлорофн.тлл в молодых и зрелых листьях в расчете на единицу площади почти одинаковое. Содержание его снижается в 2 раза к 28 дню с момента появления листа и в 7 раз - у старого листа (возрасте 50 дней) (габлл).

Таблица 5

Содержание и активность РБФКО в онтогенезе второго листа оздоровленного картофеля сорта Невский

Возраст : Содержание : Карбокснлтз- ; Ükchi ена\>- : Содержание липа, : РБФКО : пая активность,: ная :хлороф»да^

активность

дни : мг/дмг : мкК мин/ мг :мкМ мнн/мг : mi/дм-

: белка : белка ;

3 1! ,3 i 0,!5 0,26 í 0603 0,02 ¡ i 0,002 3.98 ± 0,06

14 13,3 ± 0,30 0J¡2 x 0,02 0,029 i 0,003 4,40 t 0,0

21 16,4 i 0.20 0,57 i 0.05 0,034 i 0.003 3,65 л 0.05

2S 10,4 t 0,50 0,43 i 0.04 _ 0,034 i 0,002 . 1.84,i 0.0Ó,

35 7,51 OJO 0,40 + 0,02 0,025 t 0,002 1,22.:t. 0,02

5<L_ ____LíLtíL/A. Q.014 i 0,001.' ,

2А

Следует отмстить, -по у стареющих листьев карбоксила зная ак-тизпогть гораздо ниже, чем у молодых листьев. Соотношение карбокенлазной и okcv казной активности РБФКО остается постоянным у молодых и средних по возрасту листьев и уменьшается у стареющих. Значение карбокенлазной и оксигеназной активности фермента до 2i!-wc.nikno гозрасга листа имеет otношение 6,4 а в 50-дневном 5,0. Следовательно, соотношение карбокенлазной и оксигеназной активности остаося постоянным до 30-дневного возраста листа. Если учесть, чгс в процессе реализации оксигеназной функции РБФКО в основном происходит образование глицина и серича (Мокроносов, ¡981; Алнеь и др.. ¡984), то имеющиеся данные об увеличении суммарных величин 1лнцина и ссрина ч онтогенезе листа также указывают в какой-то степени на изменение соотношения карбокенлазной и окенгепеэной актишюсти фермента при старении листа.

Таблица 6

Содержание и активность РФБКО в онтогенезе второго листа контрольных растений картофеля сорта Невский

Возрт :т ; Содержание : Карбоксилазная : Оксш еназная : Содержание листа, : РБФКО, : активность, : активность. : хлорофилла,

дни : мг/дм? мкГ. мин./мг : мхМ мнн./мг: мг/дм3

: : белка : белка :

8 10,8 10,15 0,24 ±0,03 0.020 ±0,002 3.17+0,08

14 14,1 ±0,25 0,31 ±0,02 0,029 ±0,003 3,29+0,07

21 5.7+0,33 0,44 ±0 05 0,035 +0,003 2,47 3:0,06

2€ : :,1 +0,35 0,23+0.03 0,052 ±0,005 1,12 ±0.03

36 4,2 ±0,15 0,'7 ±0,02 0,047 ±0,005 А, 17 ±0,02

50 1.1 ±0,20 0,12+0,02 0,027 ±0,002 0,12 ±0,02

Таким образом, уменьшение отношения карбокенлазной и оксигеназной активности у стареющих листьев происходит за счет быстрого снижсннл карбокенлазной активности фермента. При старении листьев уровено жспгеназной активности РБФКО снижается более медленно, чем карС пкеилазная акптаность фермента. Так как карбсксилазная и ок'пгема ;;.ая функции РБФКО регулируют два относительно противоположных процесса фотосинтетического ап парата-фотоейнтеэ и фо-

тсдыхание, соотношение актив месте »4 фермента может слоить одним ;п важных показателей активности фотосннтетнческого аппзрата. Функциональная активность РБФКО коррелирует в онтогенезе листа с его синтезом. Карбоксилазная и окег.генезная функции РБФКО листа с максимальной площадью в 3 раза выше, чем у молодых листьев. Необходимо отметить, что максимальное количество фермента и максимальная его активность наблюдаются в 21-28 -дневном возрасте листа. Поскольку после 30 дней развития листа увеличение его размера почти не наблюдается, можно предположить, чгэ синтез и увеличение активности РБФКО таким образом связаны с процессами росла и развития листа.

Определенный интерес представляют данные функциональной зк-тнвностн РБФКО у оздоровленного растения картофеля (табл.5). Как* видно из данных табл.6, содержание РБФКО заметно снижается с возрастом листа, хотя отчетливой разницы по этим показателям между оздоровленными и контрольным» растениями не наблюдается (табл.5,6). У контрольных растений карбоксилазная активность фермента несколько ниже по сравчепию с оздоровленными растениями у 28 -дневного и резко падает у Зб-и 50 -дневного листа. По мерс снижения карбокенлазной активности РБФКО происхоотгг значительное повышение окенгеназной функции фермента. Оксигсназная активность резк-о увеличивается у 28-36 -дневного листа. 3 этот период наблюдается максимальное накопление биопродуктов не только в листе, но ц интенсивно идет формирование клубней !

Таким образом, п период интенсивного накопления вирусов г» листе, происходит снижение карбоксплолпой активное™ и параллельно увеличивается оксигсазная функция РЬФКО, что влияет на биопро-дугшвность растений. Объяснением тгого можег служить резкое разрушение хлорофилла в период накопления биопродукгов у 35-50-дневного листа. Можно конетатировзгь, что в период интенсивной работы листа у неоздоровленных растений происходит значительное накопление вирусов, которое влияет на карбоксилазную окспгеназмую активность фермента, вследствие чего, очевидно, происходит уменьшение урожайности картофеля. Кроме того, в клуонлх накапливается достаточное количество вирусов, которые уменьшают их атграги-руюнито способность, т.е. уменьшают способность притягивать био-' продукты из вегетативных органов растений картофеля.

10. Морфофизиэдогическис показ»..гли фотосиптеза картофеля

Для определения хозяйственного урожая были изучены: площадь листьев растений и их фотоа;:ггетичеа(й потенциал (ФП), суточный прирост сухой биомассы растений. Листовая поверхность шр?ет паж-

1С

ную роль в формировании биологического и хозяйственного урожая картофеля.

Изучение сезонной динамики листовой поверхности (рис.6) показало, ч» о после энергичного роста на первых этапах прорастания лист быстро приобретает свойственную ему фотосинтетнческую активность.

Максимальная величина обычно наблюдается в фазу бутонизации и в первые дни фалл цветения. Все исследованные сорта и даже оздоровленные по эшм параметрам не отличались друг от друга. Результаты многолетних исследований показали, что независимо от времени посадки (весенняя, летняя и поздняя) общая величина листовой поверхности практически не отличалась. Это указывает на то,что .формирование листовой поверхности у картофеля сгрогс детерминиро-ванно.

Одним и» ваясксйшкх факторов формирования урожая, наряду с площадью листьев, являйся чистая продуктивность фотосинтеза (Фч.нр.). 'Эти данные суммированы в тдбя.7. Из этой таблицы видно, что исследованные сорта картофеля различаются по величине чистой продуктивности фотосинтеза. Различия проявляются в разной степени

и в гавнснмостн от фазы развития, растений. %

м

О

.ж

л es

Й. &

с

с;

iOOOOg

Яооос аооо*-

TOOog бОСО«* SOCO Ь AQQ S J»0 |

tftnn

21.04 1.05 11.05 21.05 31 0Ы 0.06 20.05 30.06 ксходы бутониааци?! цветение созрвваниб

Рис.6. сезонная динамика нарастания

ПЛОШАДИ ЛИСТЬЕВ (1) И НАКОПЛЕНИЕ СУХОЙ БИОМАССЫ (2)7 ОЗДОРОВЛЕННЫХ -И КОНТРОЛЬНЫХ- - • СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ

Так, на начальном этапе вегетации максимальную величину Фч.пр. наблюдали у оздоровленного сорта Невский. Наивысшее накопление имело место в фазе бутонизации у всех исследоваиных генотипов картофеля. У оздоровленного сорта Невский в фазе бутонизашш и цветения чистая продуктивность фотосинтеза, рассчитанная на единицу площади листьев, составляет 6,6К-6.89г/м2 а сутки, тогда как у-,тру» ах генотипов она несколько меньше. Таким образом, по этому показателю ~ оздоровленные сорта имеют значительное преимущество, чем неоздо-ровленные.

Ход накопления чистой продуктивности совпадает с ходом прироста сухой биомассы. Динамика накопления сухой биомассы у всех-исследованных генотипов картофеля не отличалась. Максимальная его величина наблюдается в фазе созревания. Динамика накопления общей листовой поверхности у всех изученных сортов имеет одновершинную кривую с максимумом в начальные фазы созревания (рис.6). Оздоровленный сорт Невский имеет- большую листовую поверхность по сравнению с другими исследованными сортами.

Таблица7

Дпнпмика чистой продуктивности фотосинтеза у оздоровленных и неоздоронлешшых сортов картофеля (г/м1 в сутки)

ДАТА УЧЕТА

СОРТ 22.04 1.05 Г| .05 21.05 1 31.0-^ 10.06 20.06 30.06

Нсвский

(исоэдоров- 1.09 2.47 4.02 5.42 5.84 4.61 2-Я 0.51

ленный, кон-

троль)

Иевкнй 2.14 3.54 4.73 6.68 6.8? 4.96 2.88 0.Н5

(оздоров-

ленный)

Полет 1.18 2.56 3.8') 6.18 7.20 5.10 3,30 0.82

Кемеровский 1.21 2.66 ЗГ§4 6.33 7.50 5.11 Г 3.37

В табл. 8 представлены данные по урожайности всех исследованных сортов картофеля. Из таблицы видно, что оздоровленный '■орт Невский формирует хозяйственно-ценный •'рожай, значительно превышающий другие исследованные генотипы картофеля. Несздоровлеи-нын сорт Невский имеет более низкие величины .хозяйственно-ценного урожая в расчете на одно растение. По результатам многолетних наблюдений оздоровленные сорта имеют более кустистую форму. Ко;Ш-чество стеблей у них хорошо коррелирует с урожайностью. По этой причине, видимо, оздоровленные сорта картофеля превосходят по урожайности неоздоровленные. ГТрн пересчете данных табл. Юна I га при схеме посадки 60x25 см урожайность исследованных сортов составляет: Невский (неоздоровленный, контроль) - 320 ц/га, Невский

(оздоровленный) - 413 ц/га, Полет - 350 ц/га, Кемеровский - 340 ц/га. Таким образом, ло урожаЙносги оздоровленный сорт Невский превосходит другие сорта на 60-90 ц/га.

Таблица 8

Урожайность оздоровленных и пеоздоровленных сортов

каротофеля

Урожайность по каждому растению, кг Средняя урожайность

СОРТ 1 2 3 4 5 • 6 7 8 9 10 на 1 растение, кг в ц/га

Невский (исоздоров данный, контроль) 0.49 0.45 0.39 0.S2 0.4S 0.54 0,50 0.47 0.48 0.49 0.48 320

Невкий (оздоровлс 'ННЫЙ) 0.S8 0.67 0.51 0.72 0.63 0.52 0.59 0.65 0.59 0.74 0.62 413

Полет 0.51 0.47 0.49 0.53 0.64 0.50 0.47 0.49 0.63 0.58 0.53 353

Кенеров 0.54 0.50 0.4? 0.46 0.60 0.53 0,52 0.44 0.49 0.50 0.50 Г 357 "1

екни

-11. Электрофоретический анализ белков оздоровленных клубней картофеля К настоящему времени показана возможность использования запасных белков в качестве чфф'.члнйнмх генетических маркеров. Нан-болс. Подходящим при электрофоретическом анализе многие авторы сч1ггают спирторасгеоримую функцию белков, среди которых различают тлиадины пшеницы, ¡орцеины ячменя, сскалнны ржи, ьвеннны овса, зеины кукурузы и ногатины картофеля. Возможности использования специфичен лх белков в идентификации сортов семенного картофеля - главное качество семенного контроля, по;(ученных методом' биотехнологии, не достаточно изучены. Необходимо отметить, что в Международном иеьтре картофеля (CIP, Idmv, Peru) проведена паспортизация генофонда с использованием электрофоретических белков -маркеров (Huamann, Stegemann, 1989), что позволило освободиться от повторных и многократно встречающихся идетгтичных кленов под равными номерами.

Получение белхово-компоненткого состава осуществляли в ульграю-'.кнх (0.1-1,0 мм) пластинах полиакриламидного теля (11 АЛ Г) на приборе Мультифор II (1KB Швеция). Депситометрирование гелей мронол'нли на приборе Ultro Scan XL

. . Результаты анализа почазаяи, чг;о у все?, «сспедозанныл сортов и форм картофеля обнаружено до 22-23 компонентов в спектрах общего 4'u'nr.t. 1! порядке уменьшения электпофоретлчесхой подвижности объ-

единили в условные зоны, отмеченные латинскими цифрами. Обнаружено, что внутри этих зои (i - VIII) имеется значительная вариация компонентного состава белков. Гак, зона I имеет место у сорта Бирюза, сорта Невский и формы ТУ (темпера гуроустойчивмй). Количество компонентов в зоне II у сорта Бирюза и формы ТУ одинаковое (2 бел ковых компонента, относящихся к группе 70 кД), а у сорта Невский группа белков 70 кД имеет 4 компонента. Такие же различия отмечены в отношении группы белков, относящихся к 60 хД и 20 кД.

Значительные колебания в холичестве выявленных белковых компонентов отмечены при выходе клубней хартофеля из состояния покоя. Количество зон у всех исследованных сортов( Невский .Бирюза) и формы ТУ увеличивалось до Х-ХП. Наблюдается также заметная вариация в белковых компонентах внутри этих зон. Так, белковые компоненты, относящиеся к группе 100 кД у сортов Бирюза и Невский, представлены четырьмя, а у формы ТУ только одним. Группы белков, относящиеся к 90 кД у сорта Невский, представлены четырьмя компонентами", а у сорта Бирюза и формы ТУ только одним.

В области низкомопскулярных зон также имеются значительные колебания по количеству белковых спектров. Следует отметить, что при выходе из состояния покоя происходит агрегация белковых компонентов с образованием активно функционирующих ферментов, которые обеспечивают ростовые процессы на ni_ вых этапах прораста-. нил. Эти бс-лки, относящиеся к группе высокомолекулярных (130 кД), не обнаружены у клубней, находящихся в состоянии покол.

Общее кодичесгао белковых зон при выходе из состояния покоя; так же, как и у клубней в состоянии покоя, одинаковое, т.е. нх насчитывается 22-23. ' ■ Таким обратом, отмечена высокая степень белковых вариаций внутри сортов и форм, использование которых облетает их маркировку и позволяет разрабатывать вопросы контролирования селекционного процесса, особенно при семеноводстве , с использованием методов биотехнологии. . .

12. Изучение мернстемпмх линий картофеля а полевых условиях Безвнрусный семенной картофель широко используется в практике картофелеводческих хозяйств во многих странах (Бутенко, 1582), Однако, вопрос о сохранении исходных морфофизиолгогическил характеристик сортов, оздоровлешых методом at кальных меристем, остается малоизученным.

Как правило, оздоровление сортов этим методом подлостью гарантирует генетическую идентичность "¡сходного сорта, ¡1. ^отря. ¡га появление малочисленных спонтанных мутаций у растений- рехепграм-тов. Необходимо отметать, что в процессе регенерации такие 'факторы.

го

как долгое пребывание эксплантатов в среде, содержащей высокие концентрации сахарозы и фитогормоны, оказывают мутагенный эффект (Мелик-С кнеон, Овчинникова, 1985). Показано, что термо- и хемогерапия также могут в ряде случаев стать причиной изменчивости ptieiitpanrot!. В связи с этим целыо наших исследований явилось изучение стабильности меристематическнх регенерантов в процессе оздоровления картофеля.

Мы в период 19X6-1997 г.г. исследовали меристемныс линии картофеля к условиях in vitro в теплице и в поле. Всего было изучено 8 линий.

В условиях in vitro в процессе развития меристем наблюдали такие нехарактерные признаки, как многостебельностъ, сближение междоузлия, альбинизм, частичная антоцнановая пигментация и другие. Часть регенератов была не пригодна для черенкования и погибала. В некоторых случаях морфологические изменения npi. пересадке на новую питательную среду и последующих черенкованиях исчезали. Можно предположить, что генетические изменения, приводящие к морфологическим аномалиям, таким, как альбинизм, не способны были дать афильпый регенерант и погибли. В других случаях, когда генетические изменения не столь существенны, получали в ■ дальнейшем нормально ралнпые растения. Эти растения служили в дальнейшем дшг размножения в условиях теплицы и поля.

Из выращенных в тенл; ',е и в полевых условиях растений отбирали линии с высокими хозяйственно-ценными характеристиками. Изменчивость хозяйственно-ценных признаков регенерантов у различных сортов проявляется по- разному и зависит от условий внешней среды. Выделенные линии существенно отличаются по урожайности. Как видно из данных табл.9, из 8 изученных линий сорта Кардинал, линия 6 существенно отличалась по урожайности. Масса клубней линии 6 оставляла в 1991 г. 485 г/куст, а в 1993 г.- 496 г/куст, т.е. по урожайности она является наиболее стабильной в разные- годы выращивания. Менее урожайные линии этого сорта также были стабп : ,!.. > ми по годам, но резко отличались по урожайности. Некоторые линии, такие, как линии 1,3,8, были мелкоклубневыми.

, Между линиями не было отмечено резких отличий по содержанию крахмала. Его содержание колебалось между исследованными линиями oi 12 до 14%. Следовательно, по этим признакам наблюдается стабильное проявление генетической потенции сорта Кардинал. ,

Интересные данные подучили и по сортам Невский и Лорх. Как видно in табл.10, линии 6 как у сорта Невский, так и у сорта Лорх были значительно менее урожайными, чем линии 5 у сорта Невский и пинии 5 у сорта Невский и линии 8 у сорта Лорх.

Таблица 9

Урожайность различных линий сорта Кардинал, выросших в полевых условиях

: ГОД

Масса клубней, г/куст

Номер линии : общая масса : клубней, г : макро- : : клубней мини-клуб-: ней : "'о, крахмал

1991 177 .125 52 12,2 ± 1,4

I 1993 193 147 46 12,1 t 1.5

1991 154 117 37 13,9 ± 2,1

2 1993 164 130 34 12,4 ± 1,7

1991 195 165 30

3 1993 187 135 52 -

1991 205 180 25

4 1993 210 177 33 -

1991 174 143 31

5 1993 188 154 35 -

1991 485 395 90 14.3 + 1,9

"б 1993 498 412 86 13.9 i 2,1

1991 317 267 50 12,9 К 1,2

7 1993 2SS 231 67 13,2 1 1,7

1991 197 162 35 _

8 1993 211 178 33

Номер линии

Таблица 10

Урожайность картофеля сорго« Невский и Лорх _________по линиим (1*>93 г|

|__S

CUIT нквскии

общая ! макро масса I клубней

клубней '____

4 "4 ' 424 295

СОРТ ЛОРХ Масса клубней, г/куст мини клубней

Г -,7f"

184

11

50

Ж

"73

обшая масса K)jv6neîî_

_Î 54 _

48!

макро | мини кл>бней клубней

2 IS

7зГ

374

100

L-JL

If 5

Таким образом, анализ полученных результатов дает основание утверждать, что при выборке высокоурожайных линий оздоровленных сортов картофеля существенное значение имеет отбор линий, характерных доя каждого сорта отдельно. Между линиями нами не было отмечено существенных различий по содержанию крахмала. Кроме того, изученные меристемные линии не отличались от исходных сортов по морфологическим признакам, отмечены лишь отличия по фенологии, урожайности. Эти различия устойчиво проявлялись но годам, что свидетельствует о необходимости их отбора по хозяйственно- ценным признакам до их рекомендации в производство.

13. Выращивание, оздоровленных тепличных миниклубней картофеля в нолевых условных Принципы выращивания оздоровленного материала в теплице обязательно включают комплекс мероприятий, благоприятно действующих на рост, развитие н формирование максимальных клубней пробирочных регенератов картофеля. Особое место занимает выполнение агротехннческих и агросаннтарных мероприятий, включающих обработку теплиц и рассады в период развития фитонцидами, чтобы исключить массовое заражение растений вирусами, переносчиками которых является тля.

Получение миниклубней в условиях теплицы также требует разработки приемов и методов, обеспечивающих максимальный выход оздороытенных тепличных клубней картофеля с единицы площади в закрытом грунте. Были проведены опыты по изучению опшмальпых уело" ч(1 получения миниклубней от пробирочных растеши! в заьиси-мости от густоты посадки. Результаты таких экспериментов представлены в табл.11. Как видно из данных таблицы, в варианте с разными

Таблица 11

Количество тепличных клубней с I мг при различных схемах посадки щюбщючных растении, шт./м1 (в среднем за 1994-1995 гг.)

Схема"......Г______"" ___£.0X1

посадки, см__| Невский

""~бТб""" I 480* 4?"

1 320ь27_

"30 х !0 3 Т25л'1"7*

:____1-

:рдинал 46"';'37 _

~345129 "287±ЗТ"~ " 951 \1~"

..¿'.»Р*. I 612-54 _ _ ! 41 "--1? 1

295:Ч<Г~1] 10 Г- !2 ]

схемами п<хгдок количество мнннклуоней ciijii.no аарьируа ц только •ог схемы п^сл^гок. нч зльиспт и от соршп. Так, в среднем количество

з.г

клубней за два года испытания' пробирочных растений по сорту Невский составляет от 125 до 450 шт. на I м2, по сорту Кардннал-от 95 до 467 шт., а по сорту Лорх - от 101 до 512 шт..

На основании полученных данных было выявлено, что посадка пробирочных растений в торфяную почву по схеме 6x6 см у всех изученных сортов обеспечивала наибольший выход мнннклубней с I мг в пределах от 460 до 612 шт.

При выращивания пробирочных растений в торфяной почве в условиях теплицы следует обратить внимание на размер и массу мнннклубней. Как показывают данные табл.12, масса клубней от 3 до 45 г. была получена при выращивании пробирочных растений но схеме 6x6 см. Размер этих клубней составлял от 3 до 15 г. Такие клубни вполне были пригодны для дальнейшего выращивания в полевых условиях.

Результаты полевых испытаний тепличных мнннклубней суммированы, в табл. 12.

Наблюдения показали, что при использовании клубней массой менее 3 г период развития более удлиненный и требуется большая затрата труда. Как показывают данные табЛ. 12, при переносе тепличных мнннклубней в поле, наибольший урожай дают клубни массой от 15 до 30 г. При использовании мнннклубней массой от 5 до 45 г растения практически не отличались по периоду вегетации.

Таблица 12

Урожайность картофеля в зависимости от массы микроклубпей при полевом опыте (площадь 50 м1). ц/га

Масса тепличных клубней, г СОРТ

Невский, Кардинал Лорх

3-5 287+12 261+18 186111

5- 15 317114 360135 298+25

.15-30 ' 418128 485141 417135 '

30 - 45 405129 417±35 386+21

Урожайность тепличных мнннклубней при полевом испытании массой от 5 до 45 г была в пределах от 317 ц/га до 428 ц'га ( для сорта Невский). Сорт Кардинал имел урожай пр такой массе клубией в пределах 360- 485 ц/га, а сорт Лорх - 298- 417 и/га. Наиболее урожайным оказался сорт Кардинал. Не было отмечено сортовых различий в зависимости от массы клубней.

Наблюдения показали, что в первый год выращивания мшшк-лубнеи в полевых условиях отмечается некоторое увеличение' фракции

мелких клубией ( до 40 г) по сравнению с обычными тепличными клубнями массойболее 15 г.

Таким обр эм, установлена достаточно высокая эффективность использования тепличных миниклубней массой от 5 до 45 г для выращивания в полевых условиях, что значительно ускоряет организацию элитног о семеноводства картофеля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема функционирования хлорогшастой ДНК у высших растений в последнее время привлекает все большее взимание нсследо-латслей. Помимо выяснения взаимосвязи между структурой и функцией генов подход к отой проблеме может заключаться в сравнительном анализе хлоропластиых ДНК разных видов растений и в анализе ДНК функционально различных пластид одного растения. В этом плане нам представляется целесообразным обсудить следующие ¿ри направления исследований генетики фотосинтетнческого аппарата-хлоропластов:

- генетические системы хлорописгов;

- использование хлоропластиых генов в решении биотехнологии

сельскохозяйственных растений;

- использование культуры мсрнстемных клеток в решении проблемы безвиру! ото семенного картофеля в Республике Таджикистан.

Б /кспериментальной части диссертации показано, что по валовому выходу ДНК предложенный нами протопластный метод значительно превосходит существующие методы. Кроме того, немаловажно, что он особенно пригоден для растений, мезофнлльные клетки которых оказались чувствительнее к действию целлюлнзнна, чем у представителей двудольных - картофеля и гороха.

В не эяшей работе основное внимание было уделено двум вопросам- выяснению физико- химических характеристик и их сравненн-тельному анализу у ХП- ДНК злаковых растений н изучение гено-юи пластид картофеля (амилопластов и хлоропласгов). Проведенные 'эксперименты позволили установить, что показатели плавучей плотности, температуры плавления, а также „показатели нуклеотндного состава, ^ак суммарного, так и по молекулярному содержанию основании, у X]) - ДНК исследованных злаковых растений практически одинаковы.

Гходные результаты были получены и при исследовании межвидовых гибридов- тритикале и пшенично- пырейного гибрида. Вывод о сходстве нуклеотндных последовательностей ХП- ДНК злаковых дополняете я рсстрикц'нрнным анализом.

Смеете с Тем, нами установлено, что рестрикцнонные картины ХП-ДНК ячменя, пшеницы и картофеля сильно различаются. Известно, •но полннуклеогидные последовательности РНК хлоропласт-

пых геномов консервативны. Нам представляется, чго из этого следует вывод, что балансировка среднего показателя нуклеотидно) о состава имеет резерв во внутримолекулярной гетерогенности X!I- ДМК.

Дзнные наших исследовании, основанные на комплексе физико-химических показателей АП и ХП-ДНК (планучая плотность, температура плавления. нуклеогнлный состав, распределение в агарозном 1 ».лс ЕсоШ- фрагментов), Также наводят нас на мысль о тождестве амшю-пластного н хлорошшетного геномов картофеля. Структурно-функциональная дифференциация этих пластид связана с ядерным геномом.

Подтверждением ядерного контроля дифференцировки пластид является контроль пути фотосинтетической ассимиляции СО а у так называемых С5 - И Са - растений. В отличие от С} - растений, у которых цикл метаболизма углерода осуществляется по Кальвину с ключевым ферментом РБФКО, у О - растений фиксация СО> происходит с помощью фосфоэнолпируваткарбокснлазы, которая является чисто цн-топлазмагичееким ферментом, контролируемым ядром. Следовательно, при бнит еноте хлоропластов пивную роль принадлежит ядерному контролю. У картофеля при идентичности с хлоропластным геномом в амилопластах не функционирует ген РБФКО. Таким образом, наши эксперименты подтверждают концепцию Ю. С. Насырова о ядерно- цн-тонлазматическом контроле формирования ф .осинтетнческого аппарата (Насыров, 1975; Алиев и др., 1976; Ыаэттох', 1978).

Вполне возможно, что ялерный геном с помошью определенных метаболитов контролирует "разделение труда" между пластидами ручных тканей. Это также подтверждается на ирг 1сре формирования амилопластов, которые в генетическом отношении совершенно идентичны геному хлоропластов картофеля. По-видимому, блокирование (возможно прямая репрессия) ядерных генов эндогенным и экзогенными факторами (отсуствие света) в тканях клубня, ответственных зл биосинтез хлорофилла и компонентой фотосистем, приводит к тому; что эти пластиды дифференцируются как разервуары накопления крахмала.

Установленные нами молекулярные механизмы биогенеза хлоропластов и амилопластов послужили основой дпц использован^ их в работе по биотехнологии картофеля. Развитие биотехнологии обусловлено и прогрессом науки, и социально- экономическими потребностям» общества. В частости, с ней связаны решения главных нроблгм экологии, создание новых лекарственных препаратов и днагностику-мов болезней, и также создание новь«' высокопродуктивных сельскохозяйственных растений, устойчивых к стрессовом ж&кйсчржям (Алиев и др., 1997). • - ■.<>•'• ■

Основное внимание было сосредоточено на развитии картофелеводства, которое имеет в Таджикистане свою специфику!' 'Пто^?^' «>>»

остановились на экспериментальных разработках биотехнологии картофеля, главным образом, в уникальной высокогорной зоне Таджикистана, как естественной лаборатории безвирусного семеноводства. В горных районах на высоте 1500 м н более над уровнем моря имеются хорошие экологические условия для выращивания высококачественного семенного материала.

Не менее важное значение для нашей республики имеет устойчивость картофеля к высоким температурам. Все это требует новых методов селекции картофеля, позволяющих повысить генотшшческую вариабельность селекционного материала. По данным ФАО, до 22% мирового урожая картофеля теряется в результате гибели растений от болезней и вредителей. В наIлей республике эти потерн составляют еще большую величину. Поэтому создание новых перспективных сортов и улучшение ценных старых сортов связанно с использованием методов биотсхно1: гии, клеточной и генной инженерии.

Вместе с тем, необходимо учесть,что вирусная нагрузка на растения картофеля не только ухудшает качество клубней и резко сокращает урожайность, но она может являться основным фактором изменения генетических систем (ядро, хлоропласт, митохондрии). Эхо приводит к изменению их функций, способствует появлению мутаций, т. е. г прусы могут бъгть вектором в переносе генетических элементов и клетке. Используя методы культуры мершлемных клеток, нам удалось оздоровит. от вирусов и других болезней ряд районированных и перспективных сортов картофеля, отобрать приемы их размножения ъ условиях лаборатории, теплицы и горной зоны Таджикистана. Экспернмен-тал! !ые данные показали, что при размножении оздоровленных клубней необходим дифференцированный подход в разных -жолошче-екчх и агроклиматических зонах выращивания мс-ристемно! о макрии-ла. Так, наиболее подходящими являются горные зоны, отдельно расположенные от я юневых и персиковых садов. При таком подборе зоны имеет место незначительное заражение растений вирусами и бо--пеанами. В таких зонах также наблюдается значительное увеличение клубневой продуктивности. В этой связи была исследована фото-синтптическая продуктивность разных генотипов картофеля. Экспериментальные данные показали, что величина интенсивности фотосинтеза зависит не только от ссрта(разные по продуктивности), но и от фазы развития. При этом имеется значительное различие в шменсив-носш фотосинтеза у оздоровленных и неоздоровленных сорюв. Так, интенсивность фоюсинхеза лис п.ен оздоровленных сортов в фазе бутонизации и цветения заменю превосходит интенсивность процесса у неоздоровленных сортов. Это вполне можно объяснить тем, что именно в фазе буюинзаиии и цвеа-нил отмечается заметное увеличение поколей*^ вирусов, прийлдяших к заболеваниям растений, и по отрнца-

тельно плияет на фотосинте ги чески ¡1 процесс. Поэтому у неоздоровленпых сортов имеет место меньшая листовая поверхность, и величина хозяйственно- ценного урожая в расчете на одно растение заметно уступает оздоровленным сортам картофеля. Также необходимо отметить, что оздоровленные сорта имеют более кустистую ферму и количество стеблей у них коррелирует с урожайностью. По этой причине, видимо, оздоровленные сорта картофеля превосходят по урожайности неоздоровленные.

Экспериментальные данные показали высокую степень белковых вариаций внутри сортол н исследованных форм картофеля, позволяющих их маркировку, и дающих возможность разрабатывать вопросы контролирования селекционного процесса, особенно при семеноводстве с использованием методов биотехнологии. Необходимо подчеркнуть, что в области низкомолекулярных зон ( при электрофорезе на полиакрнламидном геле) обнаруживается значительное колебание по количеству белковых полос, особенно у клубней, находящихся в состоянии покоя. А при выходе из этого состояния имеет место агрегация белковых компонентов (низкомолекулярных) с образованием активно функционирующих ферментов, «которые обеспечивают ростовые процессы на первых этапах прорастания. &тн белковые молекулы имеют молекулярную массу до 130 кД и не обнаруживаются у клубней, находящихся в состоянии покоя.

Как было сказано выше, оздоровленные к неоздоровленные сорта картофеля существенно отличаются по ходу дневной и сезонной динамики фотосинтеза и, следовательно, по урожайности. Одно из возможных объяснений этого явления, очевидно, связано с большей потерей СО2 на фотодыхание у неоздоровленпых сортог. Отклонение в соотношении интс! тности истинного фотосинтеза и фотоды.хання, видимо, связано с началом вирусного поражения. Аналогичное явление было обнаружено в работе Хлтмахер и Крейг (НштасЬет, Кт^,1983) при стрессовых воздействиях на растение. В связи с этим изучали кар-бокенлазнуто и оксигеназную активность РБФКО у разных по степени очистки от вирусов и болезней растений картофеля.

Оксигеназная активность РБФКО занимает важное место в процессе фотодыхання у С} - растений и, следовательно, регулирует в какой -то степени биопродуктиЕностъ. Поэтому интенсивность реакции карбоксилирования и окситенировання РБФКО отражает конкурентное отношение этих функций и тесно завис от концентрации СОг в клетке. По этой причине можно объяснить низкую фотосиНтетнческуто активность неоздоровленпых сортов по сравнению с оздоровленными. Видимо, накопление вирусной инфекнин, сопровождают!; ^ болезнь, вызывает закрывание устьиц и затрудняет проникновенна ,СОг в центр карбоксилирования. Поэтому представляет чрезвычайно' боту.

mojí интерес исследование карбоксилазнон н оксигеназной активности ГБФКО у этих генотипов картофеля. Такая работа проводилась впервые не только на уровне растений, но и на разновозрастных листьях картофеля.

Полученные экспериментальные данные показали, что с ростом и развитием листа содержание РБФКО в расчете на единицу площади доспи аст максимума к 20- 30- дневному возрасту с последующим падением к 50- дневному возрасту. Такой ход изменения содержания фермента it онтогенезе листа коррелирует с карбоксилазной активностью и соответствует кривой интенсивности фотосишеза листа.

Измененне активности РБФКО в наших опытах можно связать с изменением количества фермента, так как самая высокая карбокси-лазнэя активность фермента наблюдается у 20- и 30- дневного листа '►'аргофеля.

Таким образом, экспериментальные результаты дали возможность использовать молскулярно-биохимичсскне, а также физиологические показатели для маркировки сортов при дифференциальном выращивании оздоровленного семенного картофеля в горной и предгорной зонах Республики Таджикистан. Эти работы подчеркивают пер-снскчивность применения бноте.хнологнческих методов в семеноводстве бсзвирусного картофеля.

ВЫВОДЫ

I. Разработан оригинальный метод выделения хлоропластной ДНК высших растений из протопластов, основанный на обработке тканей иеллюлизином. Выход ДНК увеличивается в 10 раз. Метод оказался приемлемым для злаковых растений, бобовых и картофеля. Сочетание обработки целякншзнном и мацератой позволило выделить ДНК чт амцлопластов клубней картофеля,

2. Сочетание физико-химического и рестрнкцноннога анализов ДНК хлоропластов и ДНК амнлопластов картофеля позволило устано-вчгь идентичность геномов хлор< ■плгеюп н амннопластов. Структурно-функциональная дифференциация этих пластид связана с действием ядерных генов. Репрессия ядерных генов эндогенными н экзо;-:> факторами (отсутствие света) в тканях клубня, ответственных за био-ciiiut.! хлорофилла н компонентов фотосистем, приводит к тому, что эти пластиды дифференцируются как резервуары накопления крахмала, ч; 3. Установлено, что оздоровленные сорта картофеля отличаются río морфо-физиологическим показателям от неоздоротленных сортов. Интенсивность фелосингсза оздоровленных сортов картофеля в два раза выше, чем нсоздоровленных. Оздоровленные сорта имеют более кус-mrrvio фоул(у. Количество стеблей у них хорошо коррелирует с уро-

жадностью. В конечном итоге оздоровленные сорта превосходят по урожайности в два раза неоздоровленные.

4. С возрастом листа картофеля наблюдается взаимосвязь между карбокснлазнои и окснгеназной активностью и количеством РБФКО. Максимальное содержание фермента и максимальная его активность имели место в 21 - 28-дневном возрасте листа. По мере старения листа происходит уменьшение отношения карбоксилазной активности

- и окснгеназной за счет более быстрого снижения карбоксилазной функции РБФКО при незначительном снижении ее окснгеназной активности.

5. Эдектрофорегнческнй анализ белков показал, что у регенерап-_ той оздоровленного картофеля общее количество белковых зон насчитывает до 23. Показано отличие по белковому составу между клубнями, находящимися в состоянии покоя и при выходе из него. Количество высокомолекулярных белковых зон при выходе из состояния покоя больше, чем у клубней, находящихся в покое, что связа-Н9 с биохимическими процессами выхода из покоя. Выявлена высокая степень белковых вариаций внутри сортов и форм, что может служить маркером в семеноводстве картофеля.

6. Необходимо при отборе высокоурожайных сортов картофеля учитывать выборку линий, особенно для оздоровленного материала. Между линиями не отмечено существенных р: личин по содержанию крахмала. Меристемные линии не отличались от исходных сортов по морфо- физиологическим показа гелям, но существенные отличия были по темпам развития и урожайности.

7. Предложена схема переноса генетической щформацин между органеллами клетки (ядро, хлоропласта, митохондрии) посредством вирусной п бактериальной инфекции.

8. Отработаны приемы получения и использования пробирочных растений и микро- макроклубней в разных шроэкологических условиях Таджикистана. Показана высокая их эффективность в предгорной и горной зонах картофелеводства. Установлена перснеюпго-ность высокогорной зоны Таджикистана для создания генбэика безьн-русного картофеля не только для республг и, но н сопредельных стран.

СПИСОК-ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: !. Каримов М.К.Алиев К.А. Выделение и очистка ДНК' хло-' роплаетов проростков гороха /'Респ. конф. молодых ученых,и специалистов Г а,тж. ССР. Донпш. Душанбе, 1976. С.44. .

2. Каримов М.К., Лысенко А.М., Вннецкий Ю.П.', Нзсыров Ю.С. Метод выделения хлоропластиоой ДНК

/Дкесоюзн.сн\ш.''Структура и функции нуклеиновых кислот н биосинтез бежа в растениях" Таш!сент."ФАН", 1977. С.25.

3. Каримов М.К., Лысенко A.M. Препаративное выделение хлоропластной ДНК из злаковых растений II "Вопросы генетики и биосферы" ИОГен, Москва. 1977. С.10-11.

4. Каримов М.К., Лысенко A.M., Винецкий Ю.П. Выделение хлоропластной ДНК с большим выходом из ячменя // "Биохимия", 1978, т.43, вып. 4, С.597-601.

5. Каримов М.К.Д1ысенко A.M., Насыров Ю.С. Гомология в нуклеотндных последовательностях хлоропластной ДНК пшеницы, ржи и тритикале//ДАН Тадж.ССР.-1978.-Т.21,К8.- С.57-60.

6. А.ндрианов В.М., Зе|!ляная Н.Ю., Каримов М.К., Амерхано-ваМ.Б., ВинецкийЮ.П. Клонирование ДНК хлоропдастов в E.coli. Конструкция и селекция рекомбинированных плазмид, содержащих фрагменты ДН.. хлоропласгов гороха // "Генетика",т.14, N9, 1978. С.1503-1512.

7. Бондарь П.И., Каримов М.К., Лобов В.П., Винецкий Ю.П. Ферментативные методы выделения амилопластнон ДНК клубней картофеля // Физиология и биохимия культурных растений, т.11, N3,1979. С.271-273.

8. Каримов М.К., Насыров Ю.С., Винецкий Ю.П. Физико-химические доказательства идентичности геномов хлоропластов и амилоида ов картофеля //ДАН АН Тадж.ССР, 1979.т.22, N3. С.204-207.

9. Каримов М.К., Лысенко A.M. Оценка дивергенции хлоропластной ДНК злаковых растений методами молекулярной биологии //IV .ice со юз. снмп. "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1979, С. 4!.

10. Каримов М.К., Лысенко A.M., Славачевская М.С. Фнзико-химнческие характеристики хлоропластной ДНК некоторых видов семейства Gramine«. II Конференция молодых ученых, Башкирский филиал АН СССР. У фа. 197.9, С. 163-165,

11. Каримов М.К., Анварова МЛ., Попова Г.Ю., Вободжанол ВЛ. Изучение хлоропластной ДНК у различных форм растении и их гибридов //"Доннш", Душанбе, 1980. С.91.

12. Лысенко A.M., Каримов М.К., Винецкий Ю.П. Выделение и физико-химическая характеристика хлоропластной ДНК некоторых представителей семейства злаковых. //В кп.:"Нуклеиновые кислоты хроматина растений", Нзд-во "Наукова думка", г.Кнеь, 1981. С.90-91.

13. Каримов М.К., Винецкий 10.11., Попова Г.Ю., Насыров Ю.С. физико-химические свойства ДНК у диплоидных и гетранлоид-ных видов хлопчатника /ЛСонф. биохимиков Средней Азям и Ка' захстяна. Душанбе, 1981 C.IK.

14. Каримов М.К., Hacupdn Ю.С. Препаративные выделения хлоропластной ДНК у протопластов ячменя и тритикале //ДЛИ АН Тадж.ССР. 1982. T.25.N4.C.241-245.

15. Попова Г.Ю., Каримов М.К., Насыров Ю.С, Хлоропяаст-ный геном диплоидных и тетраппоидных видов хлопчатника //ДАН АН Тадж-ССР. 1982,т.25, N25,0.494-497.

16. Попова Г.Ю., Каримов М.К., Насыров Ю.С. Содержание ХП-ДНК при полиплоидии растений //Конф. "Геном растений", Чер-

. новцы.ЧГУ, 1983.С.59-66.

17. Каримов М.К., Музаффарова С.М., Анварова М. Физико-химические свойства ДНК хлоропластов обкладки и мезофилла листьев кукурузы. //Научная конференция "Геном растений Черновцы,41^'.

1983. С.50-51.

18. Каримов М.К., Попова Г.Ю., Насыров Ю.С. Хлоропласт-иый геном мезоструктуры листа хлопчатника //Геном растений. Структура и экспрессия. Уфа, 1983. С. 162-167.

19. Каримов М.К., Насыроп Ю.С., Попова Г.Ю., Лобов В.П. Физико-химическая характеристика хлоропластной ДНК некоторых высших растений //Физиология и биохимия „культурных растений,

1984.T.3. N23, С. 261-266. '

20. Касымова Г.Ю., Буриченко В.К., Каримов М.К. Выделение и физико-химическая характеристика высокопол,<мерной ядерной ДНК хлопчалшка //"Химия природных соединений". 1984, N5, С .641-644.

21. Каримов М.К., Афанасьев Г'.В., Матвиенко Н.И., Насыров Ю.С. Получение банка генов хлоропластной ДНК хлопчатника //ДАН АН Тадж. ССР. 1985, т.28. N3. C.175-178.

22. Каримов М К., Алиев К.А. Рекомбинантные клоны, содержащие фрагменты хлоропластной ДНК хлопчатника //Всссоюз. био-хнм. съезд, Москва, "Нагка". 1986. C.430-43I. ■

23. Каримов М.К., Алиев КА., Фархадн З.Н., Васильева В.Н. Генетическая модификация карбоксилазы и повышение продуктивности фотосинтеза //Всесоюз. сими. мол. мех. генетических процессов. Москва, "Наукз", 1986. С.516. , .

24. Каримов М.К., Насыров Ю.С. Получение библиотеки, генов .хлоропластной ДНК хлопчатника //Тезисы IV. конф. биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, Ашхабад, 1986. СЗЗ. '

25. Каримов М.К., Алиев КА, Генетическая инженерия// Конференция биохимиков республики Средней ^зии Казахстан. Ашхабад ¡986. С.37.

26. Каримов М.К.. Алиев КА., Лифанова О .С. ИнДукгШя опухолей корончатого гала п пастенн хлопчатника /,дАН АН Тдд.ССР, 1987,Т.30.КэЮ,С.50-5б.

27. Каримов M.K., Раджабов Х.М., Холматова МДЛ Генетическая инженерия хлопчатника // V-сеъзд Всес. общ. генетиков и селек-иионеров им. H.I; Запилов. Москва, 1987.С. 176-177.

28. Каримов М.К., Насыров Ю.С. Биотехнология и получение безвирусного картофеля Ц Респ. конф. специалистов агропромышленного комплекса 'Гадж. ССР, Душанбе, 1988г, С. 28..

29. Karimov M.K.., Rachmikhudoev G., Nasyrov Yu.S. Cloning of gene rPNA in chloroplast DNA of cotton //Modem problems of Physico - Chemical Biology and Biotechnology, Alma-ata, "Nauka", 1989, P.46.

30. Насыроь Ю.С., Каримов M.K., Алехина ДА., Анварова М.А. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре тканей растений //Душанбе, ТСХИ, 1990, 20 с.

31. Каримов М.К., Анварова М., Алехина JI.A., Биотехнология получения бевирусного картофеля вусловиях Таджикистана// Тезисы докладов конференции профсссорско-преподовательского состава. Сельскохозяйственный Институт. Душанбе, 1991, С .54.

32. Каримов М.К., Семиколенова Н.И., Алехина JI.A. Влияние репродукции семенных клубней на урожай и пораженностъ безвирус-иого картофеля болезнями в Гармском районе. // Труды ТСХИ. Душанбе 1991. С.55.

33. Каримов М.К., Алехина ЛА.Анварова МА., Махмудов X. Агротехнические приемы возделывания картофеля в условиях Таджикистана.// Там же. Душанбе 1991. С.59.

34. Насыров Ю.С., Миракнлов Х.М., Каримов М.К. Новые перспективные сорта картофеля //ДАН FT 1993, т.36. N3. С.238-241.

35. Каримов М.К., Муминджанов ХА.. Анварова М.А. Методические указания, по курсу ''Сельскохозяйственная биотехнология" Душанбе,"Г 7ХИ, 1992.26с.

36. Насыров Ю.С., Миракнлов Х.М., Каримов М.К. Новые устойчивые сорта картофеля //ДАН РТ. 1993, т. 36, N4. С.330-333.

37. Каримов М.К. Получение беззнрусного картофеля методом биотехнологии// Тезисы Всеиранского конгресса аграрников. Мешхед. .ИГИ, I993.C.47. '

38. Муминджанов ХА., Каримов М.К. Семеноводство безви-русною картофеля. Душанбе, 1993.62 с.

39. Насыров Ю.С., Муминджанов Х.А.. Каримов М.К. Изучение морфобиологнческих и физиологических признаков безвнрусного посадочного материала картофеля в условиях Таджикистана. //Тезисы докладов научной конференции, посвященной 60-летию агрономического факультета "Пути, повышения продуктивности с-х культур". Душанбе. 1995 С.330-333.

лг

40. Насыров'Ю.С., Каримов М.К., Муминджанов ХА. Клеточ-нач селекция картофеля с помощью теплового воздействия //Там же. С,

41. Салимов А.Ф., Нимаджанова К.Н., Каримов М.К., Анварс а М А. Интенсивность и продуктивность фотосинтеза сортов картофеля в условиях Гиссарской долины //Груды второй научной конф. Биохимического рбщества Республики Тажикистан. Душанбе, 1996. С.39.

42. Каримов М.К. Получение двух урожаев картофеля в условиях Таджикистана / Тезисы Всеиранского Конгресса аграрников, Исфахон. ИГИ. I996.C.I70. *

43. Бобохонов Р., Давлатназарова 3., Каримов М.К., Салимов А., Мирзорахимов А.К. Карбоксилазная и оксигеназная активность РБФКО в онтогенезе листа картофеля// Физиолого-биохимические основы продуктивности растений//Труды Респ. Конф. посвященной 50-летию Таджикского Государственного национального университета. Душанбе, 1998. С.9-10.

44. Салимов А., Бобохонов Р., Ахмедов НА., Каримов М.К. Интенсивность и продуктивность фотосинтеза разных сортов картофеля //Гам же. С.ЗЗ.

45. Давлятназарова 3., Бобохонов Р., Карчмов М.К., Алиев К.А., Мнрзорахнмов А.К.Электрофоретический анализ белков оздоровленных клубней картофеля //Там же. С.20-21.

46. Каримов М.К , Нимаджанова К.Н. Размножение оздоровленного картофеля методом зеленого черенкования// А гронаука. Вестник Таджикского агроуниверситета. 1998. N3. С.72-75.

47. Каримов М.К., Салимов A.C., Нимаджанова К-Н. Генетические различия между линиями картофеля по способности образовывать нормальные клубни в различных экологических зонах Таджикистана //Груды Международной научной коннференции.ХуяЖанд.1998.С-,28.

73,

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Каримов, Музафар, Душанбе

ТАДШКСКИЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РШПУШКЙ ТАДЖИКИСТАН

КАРИМОВ МУЗАФАР

М ОЛЕКУЛЯРНО-Ш ОХИМИЧВСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОМА ПОРОЙ ЛАСТОВ И ШОТЕХНОЛОШЯ ШВИРУСНОГО КАРТОФЕЛЯ В ТАДЖИКИСТАНЕ

03,00,04 - биохимия 03.0Q.I2 - физиология растений

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени докзюра биологических наук

УДК: 581,19:581 Л: 633 Л/635.21. (573.3)

На правах рукописи

, у - ^ка^шр АН ВТ, заслуженный

I : ./?. . /2 Нй^т^жь науки РТ, Лауреат

^ Щс^рарсашенной премии ¿Г^сЛ/, шц! Абуашиибн Сино,

конеуяьганг

^^ V дорор биологических наук, ^ I йрфооор Ю.С.НАСЫРОВ

ДУШАНБЕ - 1998

С 0Д1Р1АНИ1

стр.

ВВВДШ1 ....................... 6

шва I. обзор ттЕшти . . . ..............в

1.1. ДНК хлоропластов . ... .......... 13

1.2. ДНК амияопяастов и хромопластов ....... 19

1.3. Рестрикционный анализ хяоропластной ДНК ... 21

1.4. Клонирование ХП-ДНК в бактериях...... . 28

1.5. Сравнительный рестрикционный анализ ХП-ДЖ разных видов высших растений ..... ... 29

1.6. Молекулярная форма хлоропластной ДНК .... 34

1.7. Функция хлороплаотного генома ................35

1.8. Идентификация хлоропластных промоторов .... 43

1.9. Различия между хлоропластными и прокариоти-ческими промоторами ..... ................43

1.10. Структура промоторов хлоропластных

генов........................44

1.11. Регуляция экспрессии хлоропластных

генов...........................47

1.12. Клонирование рзМ и гЪсЬ генов хлоропластов .................57

1.13. Взаимодействие вирусов и хлоропластов

растений....................60

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ........... 65

2.1. Объекты и методы исследования ................65

2.2* Выделение хлоропластной ДНК ....... 66

2.3» Выделение нлазмидной ДНЕ .................67

2.4. Определение куклеотидного

состава ХП-ДНК ........ . ..... 70

2.5. Определение температуры плавления

ХП-ДНЕ ...... ..... ....... 70

2.6. Определение плавучей плотности ............71

2.7. Выделение ядерной ДНК из высших

растений..................................72

2.8. Приготовление фрагментов ДНК ................73

2.9. Иммобилизация ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах ........ ......... . 74

2.10. Биотехнологические методы . ..........14

ШВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЖТЙДНЫХ ДНЕ ИЗ ВЫСШИХ

РАСТШЙЁ.................. 78

3.1. Получение нативных протопластов

ячменя................... 79

3.2. Процедура получения протопластов ...... 81

3.3. Выделение из протопластов интактных хлоропластов сельскохозяйственных

растений ..... ...... ....... 82

3.4. Выделение ДНК из хлоропластов...... . 86

3.5. Сравнительная оценка выхода ХП-ДНК при

разных методах ее выделения ......... ЭI

3.6. Выделение амилопластов и амилопластной ДНК

клуней картофеля ............. ЭЧ

ШВА 4. ШЗЙКО-ЖШШСКЙЕ СВОЙСТВА й РЕСТР1КВДОШМ1

АНАЛИЗ ХЛОРОПЛАСТНЫХ ДНЕ ......... . Ш

4.1. Плавучая плотность ДНЕ ...... . » . . . 103

4.2. Температура плавления, денатурация и отяшг

ХП~ДШС злаковых растений ......... . 105

4.3. Нуклеотмдяый состав ХД-ДНК злаковых

растений ......... ......... 109

4.4. Сходство нуклеотидннх последовательностей

Хй-ДЖ злаковых растений........... III

4.5. Рестрикциошшй анализ ХП-ДНК злаковых

растений ..... .......... ... 114

4.6. Сравнение геномов хлороиластов и амило-

пластов картофеля ...... 117

ГЛАВА 5. ОДЗИОДОГО-Вй ОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

КАРТОФЕЛЯ В ТАДЖИКИСТАНЕ ....... 126

5.1. Размножение и оздоровление исходного посадочного материала картофеля ,..............132

5.2. Выращивание оздоровленного картофеля ..... 140

5.3. Распределение вирусных болезней по зонам возделывания безвирусного посадочного

материала картофеля ............ . 145

5.4. Размножение картофеля методом зеленого черенкования ................. 151

5.5. Интенсивность и продуктивность фотосинтеза

разных генотипов картофеля ........ 15?

5.6. Морфофизиологические показатели фотосинтеза картофеля................. 163

5.7. Карбоксилазная и оксигеназная активность

РБФКО в онтогенезе листа картофеля ...... 169

5.8. ЭлектрофоретическиЙ анализ белков оздоровленных клубней картофеля......... . 177

ШВА 6. ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ОЗДОРОВЛЕННОГО

КАРТОФЕЛЯ.................. 181

6.1. Изучение мериетемных линий картофеля в

полевых условиях.............. 181

6.2. Выращивание оздоровленных тепличных мини-

клубней картофеля в полевых условиях ..... 186

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................... 189

ВЫВОДЫ....................... . 207

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА............... 209

ВВЕДЕНИЕ

Исследование структурно-функциональных особенностей хлоропластного генома и его взаимодействия с ядерной генетической системой является важным вопросом современной биохимии и физиологии растений. Это объясняется тем, что о фотосинтетической деятельностью растений связано решение проблемы обеспечения человечества пищевыми и энергетическими ресурсами. Особый интерес представляет исследование генов, ответственных за синтез ключевого фермента фотосинтеза,- рибулозо-1,5-бйофосфат карбо-ксилазы-оксигеназы (К.Ф. 4.1.1.39), ее функциональной активности у различных по типам метаболизма растений. По этой причине интенсивно изучается структурная организация хлоропласт-ного генома с использованием различных рестриктаз и их клонирование, т.е. получение рекомбинантных молекул ДНК для создания банка ценных генов, нужных для генетических манипуляций растений. В этом отношении интенсивно используются хлоропласт-ные гены, ответственные за устойчивость к воздействию экстремальных факторов. Исследования в этом плане только начались, а что касается важнейщих культур возделывания в Таджикистане -хлопчатника и картофеля, они вообще отсутствуют. Вместе с тем, необходимо, прежде всего, изучить особенности этих генов, установить регуляторяый механизм экспрессии в процессе роста и развития указанных растений. Успех в этом направлении может быть достигнут при условии создания банка генов хлоропластного генома.

Молекулярно-биохимическое изучение хлоропластного генома

и создание банка генов связано о трудностями выделения высоко-очищенной ДНК хлоропластов, что ставит новую задачу - разработать методы выделения ДНК, т.к. малые выходы хлоропластной ДНК для ряда сельскохозяйственных растений, служат тормозом в плане познания и управления бшопродуктивностью растений. В связи с этим было необходимо разработать новые методы выделения хлоропластной ДНК с большим нативным выходом. В связи с чем для выделения чистой хлоропластной ДНК необходимо было разработать методы получения протопластов или использовать растения» свободные от вирусов и бактерий, т.е. получение регенерантов из апикальной меристемы, что имеет практическую ценность. Наиболее перспективным в этом плане является картофель, как одна из важнейших сельскохозяйственных культур Таджикистана, поскольку картофель в условиях Таджикистана поражается наиболее сильно вирусными заболеваниями, потери от которых составляют 35-40%. В результате этого в последние годы урожайность картофеля в республике снизилась до 80-100 ц/га.

Вместе с тем исследование генной экспрессии рибулозо-1,5-биофосфаткарбоксилазы-оксигеназы (РВФКО) открывает новые подходы в изучении конкретных механизмов, через которые реализуется кооперация ядерно-цитоплазма^ической и хлоропластной трансляционных систем (Насыров, 1975; »азуго-г 9 1978; Алиев и др., 1991; Алиев, 1995). Карбоксилазная активность РШО имеет важное значение в регуляции фотосинтеза и фотодыхания, а следовательно, и продуктивности раетений. Если исходить из относительного постоянства карбоксилазной и оксигеназной активности ферента, то увеличение фотосинтетичеекой продуктив-

а

ности будет наблюдаться при одновременном повышении фотосинтеза и фотодыхания, © другой стороны, физиологическая роль фотодыхания в форировашш продуктивности не совсем ясна в требует своего решения. Но, очевидно» что положительную связь в продукционном процессе играют карбоксилазная и океигеназная функции РВФКО и их генетическая регуляция. Цели это так, то регулирование фотосинтетичеокой продуктивности будет перспективным.

Реальный путь заключается в получении новых форм растений, обладающих высокими показателями карбоксилазной активности с применением методов биотехнологии, поскольку вирусная и бактериальная инфекции резко снижают фотосинтетическую продуктивность картофеля (Каримов и др., 1997).

Вирусные болезни картофеля широко распространены во многих странах Мира, где он является основным источником питания. Ежегодные потери урожая от вирусных болезней составляют не менее 20-30^, а от такого вируса как вирус скручивания листьев { ь ) - не менее 40$. В настоящее время известно около 20 вирусов картофеля (Зыкин, 1984). Некоторые вирусы могут довольно быстро размножаться в клетках без видимых симптомов, другие -отчетливо проявляются визуально. Независимо от проявления симптомов заболевания вирусы заметно влияют на рстение-хазяина, что сказывается на метаболитичеокой перестройке внутри клетки, на нарушений взаимодействия генетических элементов клетки (хдо-ропласты, митохондрии, ядро). Некоторые авторы причиной нарушения биохимических процессов в клетках склонны считать изменение фотосинтетической функции (Насыров, Муминджанов и др., 1997; Давлятназарова, 1997). Здесь актуальным является выяене-

ние характера взаимодействия генов хлоропластов и генов вирусов, что имеет и практическую основу в создании растений картофеля со свободным от вирусов фотосинтетическим аппаратом, что имеет важное значение в безвнрусном семеноводстве этой культуры.

В основе этого лежат методы получения безвирусной суперэлиты картофеля. Следовательно, необходимо переходить от моле-кулярно-биохимических исследований к клеточным, которые позволяют получить растения-регенеранты, свободные от вирусов. Важ-нешим элементов этой системы является оздоровление перспективных и лучших районированных сортов картофеля в Таджикистане.

Исследования влияния вирусов на фотосинтетическую активность картофеля пока единичны. Поэтому вшяенение биохимических и физиологических основ взаимодействия вирусов не только пополняют наши знания о механизмах, существующих между вирусами и геномом клетки, но также позволят разобраться в механизмах устойчивости растений к этим вредителям природы*

Кроме того, в республике практически отсутствует семеноводство высокоурожайных и устойчивых к болезням сортов. Отсюда большой интерес представляют разработка и внедрение новых биотехнологических приемов в семеноводстве картофеля, с целью внедрения в Таджикистане новых технологий выращивания семенного и товарного картофеля. Одним из перспективных приемов является использование методов биотехнологии в картофелеводстве и выявление некоторых физиолого-биохимических основ безвирусного семеноводства (Каримов и др., 1991; Алиев, Каримов, 1997; Лепешкин, 1997).

Сельскому хозяйству нужны сорта растений, обладающие нетолько высокой продуктивностью, но и устойчивостью к засухе, морозам, заболеваниям, а также к применению химических агентов и к различным вредителям. Такие возможности появятся, если будут найдены эффективные методы переноса генетической информации в растительную клетку* Поэтому начинается поиск природных векторов, т.е. растительных илазмид. Такие плазмиды обнаружены у Агробактерии, которая вызывает заболевание двудольных растений и хорошо рекомендовала себя как эффективное средство переноса генов (Пирузян, 1985).

Предполагается, что в качеств© векторов можно использовать фрагменты хлороплаетной ДНК, но эта задача пока трудно выполнима. С развитием методов молекулярной биологии процесс идентификаций генов, кодирующих хозяйственно-ценные признаки, начал находить свое решение. В тоже время регуляция экспрессии хлоропластных генов остается во многом неясной, несмотря на успехи последних лет. В большой степени это обусловлено отсутствием методов эффективной трансформации хлоропластов высших растений и, следовательно, невозможностью применять методы обратной генетики для хлоропластных генов, а также сложным взаимодействием хлоропластного и ядерного геномов в процессе развития и функционирования пластид (Алиев, 1997). Первое препятствие уже начали преодолевать, т.к. обнадеживающие успехи были ПО трансформаций С&Хажуйотопаз (ВеупЛшж ей &1„ ,1988; вхошеа ей а1. , 1989) и транзитной экспрессии в хлоропластах ВЫСШИХ растений ( Ван1е11 е-Ь &!., 1930).

Данные о структуре и регуляции хлоропластных генов еще

долго будут оставаться фундаментом для изучения этого взаимодействия. Исходя из этого, работа но изучению экспрессии хло-ропластных генов представляет интерес и в плане теоретическом и в практическом, т.е. введение мутантных генов, таких как ген (Ульмасов, 1991) и гена Ер®® -синтетазы (Урмеева, 1991) в хлоропласта, может привести к созданию новых клонов растений, устойчивых к гербициду. Особенно важно использовать в качестве объекта для создания новых форм растений картофеля, поскольку применение регенерантов из разных органов практически разработаны, известно о механизме еамоклоновой изменчивости регенерантов картофеля жта^в . Поэтому разработка и использование культуры меристем картофеля имеет также и практическую направленность (Алиев и др., 1997; Бабаев, 1997; Урузалиев, Алимга-зинова, 1997).

Необходимым требованием к новым сортам картофеля является придание им устойчивости к вирусам, вироидам и грибным заболеваниям. Не менее важное значение имеет устойчивость картофеля к стрессовым воздействиям среды (Каримов и др., 1998; Турпанов и др., 1997; Нуркиянова и др., 1997).

Одним из направлений биотехнологий, которое дает большой экономический эффект, является мик#окловальное размножение растений на безвирусной основе. Урожайность безвируеного картофеля превышает обычную на 20-50$, поэтому получение безвирусного посадочного материала становится одним из лидирующих методов получения элитных семян.

В настоящее время безвирусный меристемный картофель выращивают во всех странах и Таджикистан с его горными и чистыми

в экологическом плане зонами, наиболее перспективен для внедрения системы безвирусного картофелеводства.

Вазой безвирусного семенного картофелеводства в Таджикистане должны стать хозяйства с высокой технологией выращивания, имеющие специалистов высокого уровня и экологически чистую почву и окружающую среду; Всем этим требованиям отвечают некоторые хозяйства Файзабадского, Гарского, Джиргитальского, Ган-чинского и Шахристанского районов (Насыров, Каримов, 1991; Каримов и др., 1991).

Вместе с тем, разработка и внедрение меристемной культуры не гарантирует создание устойчивых сортов картофеля к болезням, нематодам и колорадскому жуку. В связи с этим большое внимание должно быть уделено изучению генетической и кодификационной изменчивости регенерантов картофеля in vitro , а также разработке физиолого-биохимической основы оздоровленных растений, что резко ускоряет получение новых сортов картофеля.

ШВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

q генетической автономности пластид выс-н©£вияиеь в начале нашего столетия (Корренс, 1909; layp, 1909f. цит. п© Насмреву, 1975). Открытиеявленшя, названного вдтеплазматической наследственностью (в ©тличие @т длительнее время не вызывал© ©строг© интереса еледует ©метить, чт® первые пряные дампе © существовании генов в цитоплазме были получены значительно ранее при генетическом анализе групп сцепления у Chlajnydomorias {Sager , 1954; Sager,, Hamilton , 1967; Sager, Ramanis , 1970, 1971a, 1971в). В одной из первых работ биохимического плана с помощью цитохимических методов было показан© наличие III в хлороплаетах высших растений (Сисакян, Черняк, 1952; Омеакян, Одинц©ва, i960). В 1962 г. Рис и Плаут (Bis, Plaut , 1962) и в 1965 г. лев с соавторами ( Kisleir et al. , 1965) с помощью ции цитохимического и эл@ктр®вншик|®©к@нйчеек@г© мет®д@в получили результаты, указывающие на присутствие в хлор©нлаетах дне. Однако они не были уверены в тем, чт© имеет ли обнаруженная ДНК

Молекулярные исследования начались в начале 60-х годов, когда одновременно был© показан© наличие ДИК в растительных пластидах и в митохондриях большинства эукариот (Одинцова, 1976).

Работы К@л©днера И Те вари { Kolodiier, Tewari , 1972, 1975а, I975B, I975C, 1975 d; Kolodner et al., 1975; . Koiodner et аз, 1976) подтвердили жштшв. кольцевых сужерспира-

лаз©ванных XÍI-ДЖ у высших растений, В лизатах ©чищенных нластов гороха, предварительно обработанных ДЖ-зой I, дежроте-ияязярвхшнх додещилеудьфатш ш фенолом, а затеи выдержанных е РЩ-зой и жроназой, исследователи обнаружили 25% циркулярных молекул, из которых треть имела сверхекрученную конфигурацию. В работе 1975 г. Еолоднер и Тевари е помощь© включения в ожиоан-ную выше процедуру градиентного центрифугирования в хлористом цезии с добавкой этидийбромида выделили жрежараты ХП-ДНК из нескольких растений и

формы кольцевых молекул, что позволило про них длин, и, ©«ответственно, молекулярных весов XI-ДЩ. Важно, что часть молекул была представлена в виде кольцевых димеров (3-4%) и катенанов (1-2%). Эти данные были использованы нрм кон-

Развитие работ Кояоднера & Тевари можно найти в ниях Геранна и др. ( неггшшп et al ., 1975). Слегка видоизменив метод Колоднера и Тевари (дополнительная обработка фосфо-диэетеразой и два последовательных центрмфз те хлористого цезия с этмдийбромидоы) Германн и ли жрежара�