Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биотехнологические аспекты безвирусного картофелеводства

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биотехнологические аспекты безвирусного картофелеводства"

Р ОС СИ Й С КАЯ Л К Л А Е М II я .....-СЕЛЬ С К ОХО 3 ЯЙСТВ Е. ННЬ1Х_11АУ К^......

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ

БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи Мелик-Саркисов Олег Суренович ФИЗИОЛОГО-БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ

АСПЕКТЫ БЕЗВИРУСНОГО КАРТОФЕЛЕВОДСТВА

........ 03.00.23'-^биотехнология

03.00.12 — физиология растений

Автореферат на соискание у_ченой степени доктора биологических наук

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи Мелик-Саркисов Олег Суренович

ФИЗИОЛОГО-БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БЕЗВИРУСНОГО КАРТОФЕЛЕВОДСТВА

03.00.23 — биотехнология

03.00.12 — физиология растений

Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук

Работа выполнена но Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии п 1975- 1995 гг.

Официальные оппоненты:

доктор биологических паук, академик РАН А.Т. Мокроносов доктор биологических паук B.D. Мазин доктор сельскохозяйственных паук, профессор Л. II. Постпикон

Ведущее учреждение — Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства

дании специализированного совета Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

(127550 Москва, ул. Тимирязевская, 42)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита диссертации состоится »

Я?/*? УЦО0

часов на засе

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук С.А. Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Успехи, достигнутые в последнее годы биотехнологией, создали возможность решения научных проблем новой отрасли современного сельскохозяйственного производства - безвирусного семеноводства. Потери урожая, обусловленные вирусной инфекцией у различных культур и в различных климатических условиях, достигают значительных размеров. Например у картофеля вирусные болезни снижают урожайность на 20-60% (Сгозпгег, 1984, Атабеков, 1988).

Относительная доля ущерба от вирусной инфекции в общей сумме потерь, причиняемого в комплексе всеми биотическими вредоносными факторами, будет возрастать по мере снижения потерь урожая, вызываемого другими патогенами и сорняками, с которыми ведется прямая борьба.

Усовершенствование методов оздоровления и клонального микроразмножения оздоровленного посадочного материала, изучение основных физиологических особенностей онтогенеза безвирусных растений с последующей разработкой рекомендаций по из возделыванию - главный путь снижения потерь урожая от вирусной инфекции. Актуальность этих разработок будет возрастать по мере интенсификации сельскохозяйственного производства.

Поэтому, разработка эффективных биотехнологических приемов, интенсифицирующих процесс клонального микроразмножения оздоровленного посадочного материала, является первостепенной задачей в процессе перевода семеноводства страны на безвирусную основу.

Наличие или отсутствие вирусной инфекции существенно меняет практически все параметры на всех уровнях - от функциональной активности фотосинтетического аппарата,

активности ферментативных систем, потребления и накопления элементов минерального питания и до архитектоники и скорости прохождения фенофаз (Kaplan, Bergman, 1985, Hull, 1990). До разработки биотехнологических методов получения безвирусных растений изучение основных физиологических показателей у такой важной продовольственной культуры, как картофель, проводились без учета наличия или отсутствия вирусной инфекции.

Недостаток данных по основным физиологическим параметрам безвирусного растения препятствовало разработке рекомендации по возделыванию сортов, свободных от вирусной инфекции и сдерживало перевод семеноводства картофеля на безвирусную основу с применением биотехнологических методов.

Цель и задачи исследований. На основе физиолого-биотехнологических исследований разработать научную систему и промышленную технологию картофелеводства на безвирусной основе. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

• оптимизировать методы культивирования апикальной меристемы для получения регенерантов картофеля;

• интенсифицировать процесс размножения безвирусных растений картофеля в культуре in vitro;

• изучить влияние условий в культуре in vitro на цитогенетическую стабильность генома для сохранения сортовых признаков размножаемых растений картофеля;

• провести сравнительное изучение основных физиологических параметров у инфицированных и свободных от вирусной инфекции растений картофеля для разработки промышленной технологии получения первичного безвирусного посадочного материала с целью перевода семеноводства на безвирусную основу.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые на основе предложенной нами теории направленного органогенеза в культуре in vitro были разработаны опти-

мальные условия, индуцирующие клубнеобразование у регене-рантов картофеля.

Впервые доказана возможность использования индуцированных в культуре in vitro микроклубней картофеля в качестве полноценного посадочного материала в первичном семеноводстве.

Предложено использовать эффект клубнеобразвания in vitro у регенерантов картофеля на ранних стадиях развития с целью сохранения и размножения уникальных форм (авторское свидетельство № 1376990).

Доказано, что увеличение содержания сахарозы в культу-ральной среде, необходимое для индукции клубнеобразования в культуре in vitro, вызывает нежелательный при клональном микроразмножении цитогенетический эффект и предложены пути его устранения.

Выявлено репарационное действие фруктозы для устранения цитогенетических изменений в культуре in vitro при клональном микроразмножении.

Впервые показано, что наличие или отсутствие вирусного генома в клетках растений картофеля меняет основные физиологические параметры у вегетирующего растения. На этой основе дана сравнительная физиология инфицированных и свободных от вирусов растений и разработаны рекомендации по возделыванию картофеля на безвирусной основе.

На основании результатов исследований разработана и предложена не имеющая мировых аналогов промышленная технология получения миниклубней для первичного семеноводства картофеля на безвирусной основе (авторские свидетельства №№ 1376990, 1628249, 1660633, 1671200, 1720593).

Апробация работы проведена на: 3-й Всесоюзной конференции "Культура клеток растений", г. Абовян, 1979, 1-й Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений, Москва, 1981, 4-й Всесоюзной конференции "Культура клеток и биотехнология", Кишинев, 1983 Кроме того, на заседании Научного Совета по проблемам молекулярной биологии отделения биохимии, биофизики и химии

физиологически активных соединений АН СССР, 1985, на научно-методическом совещании "Перспективы использования методов генетической инженерии и биотехнологии в растениеводстве", Ялта, 1985, на Всесоюзной конференции "Состояние и перспективы развития сельскохозяйственной биотехнологии", Москва, 1986, на 1-ом съезде ВОГИС им. Н.И.Вавилова, Москва, 1987, на Президиуме Академии наук Армении, Ереван, 1986, на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1.988, на заседании Научно-технического Совета Государственного агропромышленного комитета СССР, 1987, на Всесоюзной научно-технической конференции "Применение биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине", Ленинград, 1988, на Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология", Новосибирск, 1988, на международной конференции "Проблемы и перспективы биотехнологии", Братислава, 1989, на Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре in vitro, Звенигород, 1989, на 7-ом Международном Конгрессе по культуре растительных клеток и тканей, Амстердам, Нидерланды, 1990, на 1-ом Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1991, на 8-ом Международном симпозиуме по протопластам, Уппсала, Швеция, 1991.

Результаты исследований неоднократно демонстрировались на Всесоюзной выставке достижений народного хозяйства, Международном форуме по обмену технологиями, Пловдив, Болгария, 1990 г., Международном конгрессе-ярмарке "Биотехника", Гановер, 1990 и 1992 гг.

Реализация результатов исследований. Научно обоснованные разработки широко применяются в научно-исследовательских учреждениях и в ряде передовых хозяйств страны. Технология производства безвирусного посадочного материала картофеля на основе биотехнологических методов рассмотрена и принята на Научно-техническом Совете Государственного агропромышленного комитета СССР и рекомендована к широкому внедрению в производство (Протокол N 3/5 от

26.09.87 г). Результаты исследований и разработок были внедрены на экспериментальной и научно-производственной базе "Горки Ленинские" ВНИИ СХБ, в Московском отделении ВИР, Экспериментальном хозяйстве "Большевик", в Биотехнологических центрах Армении и Таджикистана, в Белгородском сельскохозяйственном институте. Промышленная установка с 1990 г. работает в г. Зеленограде.

Под руководством автора разработаны методические рекомендации "Получение бсзпирусного посадочного материала картофеля микроклубнями, индуцированными в культуре ¡п vit.ro" (Москва, 1985 г.) и "Технология культивирования и размножения регенерантов картофеля" (Москва, 1990 г.).

Результаты, опубликованные в научных изданиях, используются в учебном процессе ТСХА, МГУ и других ВУЗах.

Семь авторских свидетельств, полученных автором, дают возможность внедрения разработок в народное хозяйства.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Картофель, будучи вегетативно размножаемой культурой, в значительной степени подвергается воздействию вирусной инфекции. Системно распространяясь по всему растению, вирусы попадают в клубни, заражают потомство и из года в год снижают выход продукции. Усовершенствование биотехнологических методов культуры ткани и клеток для оздоровления и клонального микроразмножения растений дает возможность повысить биологический потенциал картофеля. Ценность этих технологий не только в том, что с их помощью получают высококачественный посадочный материал, но и в том, что значительно ускоряется размножение новых сортов. Оздоровленные сорта существенно меняют основные физиологические параметры в сторону резкого повышения биологического потенциала растений.

1. Сравнительное изучение основных физиологических параметров инфицированного и свободного от вирусной инфекции картофеля в процессе онтогенеза

1.1. Фотосинтетическая деятельность инфицированного и свободного от вирусной инфекции картофеля.

Вирусные инфекции изменяют все параметры растений картофеля на всех этапах онтогенеза (Kaplan, Bergman, 1985, Hull, 1990). Действие вирусной инфекции на растения обусловлено, по-видимому, тем, что нарушаются нормальные связи ядерного и хлоропластного геномов и возникают новые, несвойственные клетке взаимоотношения, вызванные внедрением чужеродного вирусного генома.

Изучение физиологии картофеля обычно проводилось без строгого учета вирусных заболеваний, в лучшем случае, на визуально отобранных растениях. В результате, физиология безвирусного картофеля осталась практически неизученной. Важнейшим этапом в этом направлении стало исследование его фотосинтетического аппарата.

Нами изучена физиология безвирусных растений и действие вирусной инфекции на фотосинтетический аппарат картофеля.

Сравнительное исследование фотосинтетического аппарата безвирусных и инфицированных растений проводили на раннеспелом картофеле сорта Изобилие при действии на него Х-вируса картофеля (ХВК).

Измерения газообмена, световых кривых и параметров фотосинтетического аппарата листьев показали, что с повышением фотосинтетической активности, которую в наших экспериментах определяли в основном интенсивностью освещения, возрастали различия в параметрах безвирусных и инфицированных растений (рис.1). При этом, у больных растений, наряду с изменением фотосинтеза, происходило снижение светового насыщения газообмена СС>2.

При высоких освещенностях и высоком уровне фотосинтетического газообмена различия параметров безвирусных и

О 200 гор ' *00 ¿00

IIИт енсибноеть сбгта, £г/м 2

У

г

Рис.1 Световые кривые фотосинтеза (1,2) и относительное изменение световых кривых (.'¡,5) у инфицированных ХВК растений картофеля. 1 - безвирусные растения; 2 - 3-я вегетация после инокулирования; 3 - 1-я, 4 - 2-я, 5 - 3-я вегетация после иноку-лирования растений ХВК. Вертикальными штриховыми линиями покапаны насыщающая и полунасыщающая интенсивности света для больных и здоровых растений. Заштрихованная область - зона возможной активации фотосинтеза у листьев инокулированных

инфицированных растений существенны (в 2 раза и более). При выращивании растений в условиях пониженной освещенности (по сравнению с солнечной 100-120 Вт/м) патофизиологические проявления незначительны, снижение скорости газообмена и значений параметров фотосинтетического аппарата не превышают 12-20%, исключая число реакционных центров фотосистемы 11, которое уменьшается на 30-35%.

При таком характере изменений параметров под действием вирусной инфекции снижение интенсивности освещения от солнечной до 100-120 Вт/м приводит к падению фотосинтетической активности безвирусных растений и к сравнительно небольшому уменьшению СС^-газообмена инфицированных

растений.

растений. При пониженных освещенностях безвирусные и инфицированные растения картофеля как бы выравниваются по своим фотосинтетическим показателям. Можно предположить, что при высокой освещенности фотосинтез инфицированных растений лимитируется под действием инфекции на фотосинтетический аппарат, а при ее снижении главным лимитирующим фактором становится свет.

Зависимость действия вирусов на растения картофеля от уровня фотосинтетической активности вероятно зависит от связи развития вирусной инфекции с деятельностью фотосинтетического аппарата. Об этом лее свидетельствуют результаты измерения скорости реакции Хилла по выделению СО на хлоропластах из листьев контрольных (безвирусных) растений и растений 1-го и 2-го года поражения ХВК. Зрелые листья (с законченным ростом листовой пластинки) больных и здоровых растений практически не различались по этому параметру. У молодых листьев инфицированных растений скорость выделения кислорода была в два раза выше, чем у безвирусных практически при одинаковой скорости СО2-газообмена.

Следует отметить, что измерения числа реакционных центров фотосистемы 11 по флуоресценции с добавлением диурона, проведенные на тех же суспензиях хлоропластов, показали, что скорость выделения кислорода увеличивается за счет активации фотосистем, а не из-за изменения их числа. По-видимому, в молодых листьях инфицированных растений, в которых происходит активное развитие инфекции, часть энергии фотосинтетических реакций расходуется на потребности вирусов. Связь фотосинтетического аппарата с репликацией вирусов подтверждает работа, в которой показано, что в протопластах табака ингибирование фотосинтеза диуроном прекращало синтез ВТМ (Нг'готш, 1985).

Существенные изменения физиологических параметров растений, в том числе и их гормонального состояния под действием вирусной инфекции, не могут не сказываться на развитии растений в онтогенезе. Так, под влиянием вирусной

инфекции период вегетации растений картофеля увеличивается на 15-20%.

Безвирусньте растения картофеля в первые 35 суток развития (примерно 2/3 вегетационного периода для данного сорта) дают большую величину суммарного фотосинтеза (рис.2). Объяснить это можно за счет быстрого роста листовой поверхности в начальный период вегетации, когда площадь листьев на 35-е сутки на 30% выше, чем у инфицированных. К концу онтогенеза рост листовой поверхности безвирусных растений снижается, а у инфицированных продолжается с прежней скоростью за счет большей длительности вегетационного периода, что приводит на последних этапах вегетации к выравниванию их суммарной листовой поверхности. Суммарный же фотосинтез за весь период вегетации (площадь под кривыми на рис.2) у здоровых растений почти на 40% выше, чем у инфицированных.

Следовательно, насыщающая фотосинтез интенсивность света для листьев 7-9-го ярусов находится в пределах от 100 до 200 Вт/м в зависимости от их возраста. Световые кривые молодых листьев 11-го яруса имели более высокое световое насыщение.

По световым кривым листья 7-го яруса безвирусных и инфицированных растений в первой половине вегетации практически не отличались. Во второй ее половине (45 суток от всходов) фотосинтетическая активность листьев 7-го яруса безвирусных растений снижалась в результате старения, а у инфицированных к этому моменту она оставалась еще на достаточно высоком уровне.

Изменения световых кривых листьев различных ярусов связаны не только с их развитием, но и с онтогенезом всего растения. В период максимальной активности безвирусных растений (35 суток от всходов) листья 8,9 и 11-го ярусов имели значительно более высокий уровень фотосинтетического газообмена при насыщающих интенсивностях света. Подобного увеличения активности у листьев 7-го яруса не произошло, что, вероятно, связано с начинающимся снижением фотосинтеза в результате старения.

Рис.2. Динамика фотосинтеза (1,2) и дыхания (3,4) безвирусных (1,3) и инфицированных ХВК (2,4) растений картофеля.

Аналогичная активация произошла и у инфицированных растений, но в степени. Это, по-видимому, свидетельствует о более высоком потенциале безвирусных растений картофеля по сравнению с инфицированными ХВК в оптимальных условиях выращивания. Максимум суммарного фотосинтеза вирусных растений наступал к 42-45-м суткам в основном за счет увеличения листовой поверхности растений.

Существенные различия были отмечены в динамике газообмена растений в течение светового дня, измеренной в период максимальной фотосинтетической их активности (35 дней с момента всходов). Изменения скорости фотосинтеза и дыхания безвирусных растений носили более глубокий

характер, чем" инфицированных, со значительным" уменьшением фотосинтеза в середине светового дня.

Значения параметров замедленной флуоресценции в онтогенезе картофеля претерпевают значительные колебания и увеличиваются с возрастом растения (рис.3). Отношение величин индукционного максимума и стационарного уровня свечения в начальный период вегетации у безвирусных растений выше. Во второй половине вегетации снижение этого показателя у инфицированных растений происходит медленнее, что также свидетельствует о растянутости онтогенеза больных растений.

Литературные данные подтверждают постепенное накопление патофизиологических проявлений в процессе последовательных вегетаций зараженного смешанными вирусными инфекциями картофеля в естественных условиях.

Рис.3. Измерение параметров ЗФ в онтогенезе безвирусных (1, 3, 5) и инфицированных ХВК (2,4,6) растений картофеля: 1, 2 - индукционный максимум ЗФ; 3,4 - стационарный уровень ЗФ; 5, 6 -отношение индукционного максимума к стационарному уровню ЗФ.

Изменение параметров фотосинтетического аппарата в шести последовательных вегетациях безвирусного и инфицированного ХВК картофеля показало, что у выбранного сорта при инфекции ХВК не происходило накопления патофизиологических проявлений на уровне фотосинтетического аппарата. Снижение уровня газообмена и содержания пигментов по сравнению с безвирусным контролем не превышало 20-22% и не увеличивалось с каждой последующей вегетацией.

Как видно из представленных данных, степень влияния инфекции на фотосинтетический аппарат зависела от интенсивности освещения растений, но, скорее она определяется совокупностью внешних условий, влияющих на уровень фотосинтетической активности (табл.1).

Вероятно, это обусловлено взаимосвязью фотосинтеза и развитием инфекции. Именно этим можно объяснить сильное влияние вирусных инфекций и существенное преимущество безвирусного картофеля в южных районах. В умеренных и северных широтах безвирусные растения по сравнению с инфицированными имеют больший суммарный за вегетацию фотосинтез, в основном за счет более раннего развития листовой поверхности. Не менее важным их преимуществом является и более короткий вегетационный период. В то же время большая фотосинтетическая активность и значительно более высокий уровень светового насыщения безвирусных растений картофеля свидетельствуют о значительных его преимуществах по продуктивности именно в южных районах, где такие растения способны полностью реализовать свой высокий фотосинтетический потенциал.

Довольно значительные (до 35%) изменения при действии ХВК наблюдались в числе реакционных центров фотосистемы 11. Этим, в определенной степени, можно объяснить большие различия в потенциальных фотосинтетических возможностях листьев безвирусного и инфицированного картофеля, которые заключаются в способности здоровых растений реализовать в оптимальных условиях скорость фотосинтеза в 1,5 большую, чем у инфицированных.

Таблица 1.

Максимальные значения скорости фотосинтеза листьев картофеля и 6-и последовательных репродукциях и относительные изменения параметров фотосинтетического аппарата растений, инфицированных ХВК.

Параметры Вегетации

1 2 3 4 5 6

Фотосинтез,

МЛ.ДМ .4

То же

Безвирусные растения 26,2 21,1 14,4 17,4 24,3 24,4

Инфицированные растения 21,7 16,5 14,1 15,1 17,8 20,3

% от безвирусных

Фотосинтез 83 78 96 87 79 83

Дыхание 112 109 104 108 116 103

РЦ ФС 1 96 88 89 91 84 90

РЦ ФС 11 78 64 69 71 67 68

Хлорофиллы 80' 81 82 87 83 88

Каротиноиды 79 82 86. 85 87 84

В зависимости от условий, главными факторами, определяющими фотосинтез, могут становиться как "количественные" (содержание пигментов и реакционных центров), так и "интенсивные" (состояние мембран хлоропластов) характеристики системы.

Таким образом, между развитием инфекции ХВК в листе картофеля и фотосинтезом, по-видимому, существует взаимосвязь, выражающаяся в потреблении вирусами части первичных продуктов фотосинтетических реакций. При этом степень воздействия ХВК на растения зависит от уровня фотосинтетической активности, которая определяется условиями выра-

щивания, что и определяет значительно большую вредоносность вирусов в южных районах возделывания картофеля.

При выращивании картофеля в условиях пониженной интенсивности света (близкой к среднему значению ФАР летнего периода в умеренных широтах) наблюдается незначительное (на 15-20%) снижение параметров фотосинтетического аппарата под действием инфекции ХВК и не происходит "накопления" патофизиологических проявлений при многократных клубневых репродукциях инфицированного материала.

Высокая продуктивность безвирусного картофеля по сравнению с пораженными в северных и средних широтах зависит в основном от более быстрого развития листовой поверхности и несколько большей фотосинтетической активностью на ранних стадиях онтогенеза. В южных районах, наряду с листовой поверхностью, ведущим фактором становится высокая скорость фотосинтеза и высокий уровень его светового насыщения, позволяющие растениям значительно эффективнее реализовать энергию света. Это свидетельствует о рациональности внедрения безвирусного картофелеводства в южных районах.

В наибольшей степени инфекция ХВК отражается на числе реакционных центров фотосистемы 11 и на соотношении их между фотосистемами 11 и 1.

1.2. Особенности минерального питания оздоровленного от вирусной инфекции картофеля.

Одним из важнейших факторов широкомасштабного внедрения беззвирусного картофелеводства в производство способствовало изучение физиологии безвирусных растений с учетом научно-обоснованных агротехнических приемов его возделывания.

В этой связи, проведенное нами исследование процессов минерального питания больных и здоровых растений картофеля имеет важное значение, поскольку позволяет скоррек-

тировать систему применения удобрений, а также оптимизировать дорогостоящий и трудоемкий процесс безвирусного семеноводства, снизить себестоимость семенного материала.

Целыо исследований было изучить особенности минерального питании оздорокленного от вирусной инфекции картофеля. В процессе работы проведено сравнительное изучение динамики поступления, распределения и накопления в растениях основных элементов минерального питания, а также общей биомассы и формирования урожая у безвирусных и инфицированных комплексом наиболее распространенных X, У и Б-вирусов растений картофеля при различных условиях минерального питания.

Отмечено, что безвирусные растения отличались более интенсивным ростом, большей урожайностью и более интенсивной окраской листьев. За период вегетации они накапливали в 1,5 раза больше сухих веществ, чем инфицированные, а урожай клубней оздоровленных растений был примерно на 70% выше. При этом, доля клубней в пересчете на сухую массу у оздоровленных растений составила 27-28%, т.е. была на 2,56,9% больше, чем у инфицированных (21-24,5%)).

Относительное содержание азота, фосфора и калия в целых растениях устойчиво снижалась по мере накопления биомассы. Различия в содержании фосфора между оздоровленными и инфицированными растениями были не существенны, в то же время, как азота и калия у первых из них было существенно меньше в течение всей вегетации. Объяснить это можно тем, что эти два элемента у оздоровленных растений вовлекается в метаболизм и используются в построении тканей.

Безвирусные растения выносили азота и калия на 21-37%, а фосфора на 70-80% (в зависимости от возраста) больше, чем инфицированные. Существенная разница в выносе фосфора обусловлена тем, что безвирусные и инфицированные растения практически не различались по его содержанию и, следовательно, различие в выносе определялось только величиной прироста биомассы, в то время, как применительно к азоту и калию, эти различия у тех и других растений привело к уменьшению различий в выносе.

Максимальные суточные выносы всех основных питательных элементов наблюдаются в период от 60 до 70 суток от посадки, что соответствует фенологической фазе цветения и интенсивного клубнеобразования, т.е. наибольшего прироста сухого вещества (рис.4).

Максимальные величины суточного выноса азота и калия у безвирусных растений в 1,5-1,6, а по фосфору в 1,9-2,0 раза больше, чем у инфицированных.

Количество питательных веществ, необходимое для построения единицы массы сухого вещества, особенно велико в фазе всходов, далее, в процессе вегетации оно постепенно снижается и стабилизируется по азоту и калию в начале фазы цветения, а по фосфору - в фазе бутонизации. Вынос азота в расчете на единицу массы урожая у инфицированных растений был на 40-57%, а калия на 44-49% выше, чем у оздоровленных. Несмотря на значительную разницу в выносе фосфора, различия его в удельном выносе оказались небольшими (менее 16%).

Безвирусные растения отличались более узким соотношением азота фосфора и калия в течение всей вегетации. Эти различия достигали наибольшей величины в фазе всходов, когда отношение N^305 и К20:Р2С>5 у оздоровленных растений было соответственно в 1,6 и 2,0 раза уже, чем у больных растений. Соотношение Ы:Р205:Кз0 в валовом выносе при уборке урожая составляло 2,6:1:4,3 у здоровых и 3,6:1:5,6 у инфицированных растений (сорт Гатчинский).

Существенные различия были и в распределении питательных веществ по органам растения. В клубнях азота, фосфора и калия у свободных от инфекции растений содержалось на 3-7% больше, чем у инфицированных за счет уменьшения их количества в листьях и стеблях. Объяснить это можно большей массой клубней у безвирусных растений.

При изучении влияния вирусной инфекции на продуктивность картофеля, усвоение и накопление элементов • минерального питания опыты проводили в гидропонных установках, позволяющих контролировать состав питательного раствора и

получить данные для оптимизации процесса выращивания миниклубней в промышленной установке.

Эксперимент проводили на средах с 0,5, 1, 2 и 4-х кратными дозами полного питательного раствора Кнопа (табл.2).

Гатчинский • Невский

Рис.4. Скорость выноса питательных веществ в зависимости от возраста растений:

------------- вирусные растения

- безвирусные растения

Безвирусные растения вегетировали интенсивнее и накапливали больше биомассы при всех уровнях концентрации питательного раствора, отличаясь от инфицированных большей относительной продуктивностью. Фенологические фазы наступали у них на 7-10 суток раньше, чем у инфицированных. Максимальное накопление биомассы в обоих вариантах наблюдалось при единичной концентрации питательного раствора.

В процессе вегетации и при всех уровнях минерального питания содержание основных веществ в сухой массе у безвирусных растений было ниже, чем у инфицированных. При

Таблица 2.

Сухая биомасса, содержание и вынос основных элементов питания у растений картофеля во время уборки при раз личных уровнях минерального питания

(сорт Невский)

Концентрация раствора, Сухая масса, г/растение Содержание, % к сухой массе Вынос, г/растение

отаед. растение клубни N Р2Оо к2о N Р2Об к2о

Безвирусные (в возрасте 84 суток)

0,5 46,8 13,4 2,07 0,37 1,96 0,97 0,17 0,92

1 65,1 17,7 2,87 0,56 2,35 1,87 0,37 1,53

2 58,8 11,4 3,53 0,82 3,39 2,08 0,48 2,00

4 17,1 1,4 3,8 1,31 4,33 0,65 0,22 0,74

Инфицированные (в возрасте 94 суток)

0,5 34,8 7,5 2,77 0,49 2,53 0,97 0,17 0,88

1 46,2 10,1 3,68 0,74 3,34 1,70 0,34 1,54

2 38,5 6,9 4,06 0,98 3,85 1,56 0,38 1,48

4 9,9 0,4 4,71 1,58 4,65 0,47 0,16 0,46

этом, безвирусные растения выносили больше питательных

веществ по сравнению с инфицированными. В то же премн, удельный вынос, рассчитанный на единицу урожая клубней у инфицированных растений был выше, чем у безнирусиых. Соответственно они расходовали на формирование единицы веса клубней в 1,5-1,6 раза больше элементов питания.

Соотношение основных питательных элементов п выносе N:P205:K20 у инфицированных растений было несколько шире, чем у безвирусных и значительно сужалось с увеличением концентрации питательной среды.

В результате изучения влияния вирусной инфекции на продуктивность картофеля и поглощение азота растениями в зависимости от уровня азотного питания было показано, что наиболее оптимальная для роста биомассы его доза в питательном растворе для здоровых растений была выше, чем для инфицированных и составляла соответственно 277 и 260%.

Наибольшее же накопление массы клубней наблюдалось при более низкой концентрации раствора, чем максимум биомассы.

На всех уровнях питательного раствора доля массы клубней в общей биомассе у безвирусных растений была выше, чем в биомассе инфицированных. Максимум удельного веса клубней у вирусных растений достигался при более высоком уровне азотного питания, но был существенно ниже, чем у свободных от вирусов растений.

Удельный вынос растениями азота с ростом его концентрации увеличивается, при этом у инфицированных dtii процессы происходят быстрее, чем у оздоровленных (рис.5). Безвирусные растения отличаются меньшим удельным выносом азота независимо от уровня концентрации в питательном растворе и, вследствие этого, большей эффективностью его использования для формирования хозяйственно ценной части урожая.

симости от концентрации азота в питательном растворе:

- безвирусные растения

--------------- инфицированные растения

Таким образом, безвирусный картофель отличается от инфицированного по ряду показателей, характеризующих минеральное питание, и по биологической и хозяйственной урожайности. Его преимущества заключаются как в высокой урожайности, так и в меньшем выносе питательных веществ на единицу их веса. В связи с тем, что здоровые растения имеют повышенную биологическую'массу и урожай, для их развития требуется примерно в 1,4 раза больше питательных веществ, чем это необходимо для инфицированных.

2. Оздоровление картофеля

методом апикальной меристемы

Получение безвирусных растений картофеля путем регенерации изолированных апексов возможно зависит от соета па культуральной среды, световых и температурных ус.чшшп, физиологического состояния изолированных апексов, < ¡лисой изолирования, условий выращивания исходных растений, расположения меристем на проростках и ряда других. Эффективность действия различных факторов на регенерацию изолированных апексов во многом взаимосвязано. В сними с этим мы изучали влияние физиологического состояния клубил картофеля и сроков изолирования апексов на их способность к регенерации в зависимости от гормонального состава питательной среды (табл.3).

Использование проростков, полученных от отделенных от клубней глазков, значительно увеличило число растеппи-регенерантов, т.е. отмечено ингибирующее влияние клубня на способность изолированных меристем к регенерации. Такой способ подготовки проростков позволил не только получать больше полностью регенерировавших растений, но и значительно увеличил общее число регенерантов, что свидетельствует о более однородной реакции на действие экзогенных регуляторов роста.

Физиологическое состояние изолированных апексов определяется содержанием метаболитов и эндогенных регулятор"» роста, состав и концентрация которых меняются при переходе от глубокого покоя к вынужденному и в течение вынужденного покоя.

Метаболизм клубней в период глубокого покоя связан с предотвращением прорастания, а в период вынужденного пни приобретают способность к росту. При культивировании изолированных апексов in vitro успех регенерации определяемся не только количеством и соотношением, но и наличием экзогенных регуляторов роста в составе культуральной среды.

Таблица 3.

Влияние гибберсловой кислоты и кинетина па морфогенез изолированных апсксов картофеля (сорт Истринский).

Концентрация гормона мг/л Февраль Апрель Июнь

получено пригодных к пересадке регене рантов, %

474 Истринский 474 Истринский 474 Истринский

ГК 1,0 3,0

кинетин 1,0 3,0

ГК 1,0 3,0 кинетин 1,0 3,0

72 35

0 0

80 70

0 0

Глазки, пророщенные на клубне

40 35

0 0

25 25

5 0

25 30

50 65

30 35

15 0

Глазки, отделенные от клубня

50 25

5 10

80 70

15 0

42 39

25 20

50 60

25 0

20 20

85 50

60 63

50 45

Известно, что клубни- картофеля наиболее активно прорастают при обработке их ГК и цитокининами и слабо реагируют на обработку ИУК и НУК (Кораблева, 1979, Smith, Rappoport, 1962, Nemberg, 1970). Это согласуется с данными по культивированию изолированных апексов картофеля in vitro, где основными индукторами органогенеза являются ГК и

кинетин (Трофимец, 1977, Репагю, ЛейоЩ, 1973). Их .состав..и_________

концентрации в рекомендуемых средах различны, что зависит от влияния многих факторов. В связи с этим было неясно, нужно ли в соответствии со сроком изолирования меристем изменять состав и концентрацию регуляторов роста в среде.

Полученные нами данные позволили выявить способность изолированных апексов картофеля к регенерации в зависимости от срока изолирования и присутствия регуляторов роста в составе культуральной среды (табл.3). ГК наиболее актинии способствовала органогенезу при изолировании в феврале, н начальный период вынужденного покоя. С увеличением продолжительности вынужденного покоя (апрель, июнь) способность к органогенезу на среде с ГК снижалась, а на среде с кинетином увеличивалась. Эта зависимость наблюдалась как у отделенных, так и у пророщенных на клубне глазков у апексом различных сортов, но активность к органогенезу зависела от сорта. Под влиянием ГК она была выше у апексов раннего сорта (№ 474), а под влиянием кинетина - у средне-позднего сорта Истринский.

Таким образом, для успешного органогенеза апексов, изолированных в разные сроки вынужденного покоя, изменение их физиологического состояния требует соответствующих изменений в составе экзогенных гормонов в среде.

Известно, сто старая среда при выращивании меристем ингибирует их дальнейший морфогенез (Винклер, Диба, 1972, Трофимец и др., 1975) и поэтому растение картофеля, пригодное к черенкованию, может быть получено только после нескольких пересадок образовавшихся из меристем побегов.

Нами разработан метод культивирования эксплантов на жидкой среде, который позволяет исключить пересадки и увеличить число побегов. Для этого образовавшиеся из меристемы побеги (2 мм) культивировали на качалке в колбах, содержащих жидкую среду Мурасиге и Скута того же состава.

У раннего картофеля сорта Изобилие морфогенез наиболее активно проходил в варианте с наименьшей концентрацией кинетина - 0,001мг/л, а при 1,0 мг/л морфогенез изолированных меристем ингибировался. У средне-позднего сорта

Истринский регенерация проходила на среде с 1 мг/л кинетина более активно, что согласуется с нашими данными о том, что питательная среда, содержащая этот гормон, более способствует морфогенезу среднепоздних сортов, чем ранних.

Метод культивирования эксплантов на жидкой среде может быть рекомендован вместо пересадок эксплантов картофеля на свежую среду, что позволит увеличить исходное число побегов в 20 раз, а с учетом дальнейшего 2-3 кратного черенкования значительно повысить выход растений-регенерантов.

Морфология полученных из меристем растений-регенерантов была разной в зависимости от регулятора роста, что во многом связано с характером функционирования апикальных меристем. Результаты морфометрического анализа ультраструктуры показали, что на ранних этапах морфогенеза (2-й пластохров) между действием ГК и кинетина различий нет. При продолжительном культивировании ГК способствует развитию хондриома, а кинетин - развитию пластид.

3. Формообразовательные процессы картофеля в культуре in vitro под действием гормональных и углеводных компонентов культуральной среды и условий выращивания

Существующая система размножения оздоровленного посадочного материала включает ряд этапов, два из которых проводят в контролируемых условиях пробирочной культуры, а последующие - в теплицах. При их круглогодичной эксплуатации резко возрастает себестоимость посадочного материала из-за высоких затрат на энергоресурсы. Видимо, это и стало основной причиной того, что оздоровление не получило должного распространения и сдерживает перевод семеноводства на безвирусную основу.

Основываясь на фундаментальных исследованиях по морфогенезу и клубнеобразованию in vitro (Бутенко, 1964, Gregory, 1965), нами был разработан метод индукции клубне-образования у картофеля в культуре in vitro (Морозов, Мелик-

Саркисов, 1978). Изменяя условия культивирования мерикло-нов (температурный и световой режимы, а также питан культуралыюй среды), мы получали пробирочные клубни и впервые предложили использовать их в качестве посадочного материала. Эти разработки положили начало новому направлению в клональном микроразмножении картофеля.

Последующий цикл исследований был посвящен изучении) факторов, влияющих на клубнеобразование in vitro у перспективных сортов картофеля.

3.1. Рост и клубнеобразование картофеля in vitro под действием цитокининов.

Внесение цитокининов (кинетин, 6-БАП, зеатин) и культуральную среду вызвало заметные изменения в разви тии растений. Все препараты ингибировали рост основных побегом по сравнению с контролем у апикальных, медиальных и базальных черенков, причем тем больше, чем выше Пыла концентрация цитокининов.

Одновременно при этом снижалась корнеобразовательпам активность черенков, особенно при применении зеатина.

Как видно из таблицы 4, изученные цитокинины при добавлении их в культуральную среду способствуют клубне-образованию пробирочных растений картофеля. У обоих изученных сортов (Истринский и Повировец) на средах с кинетином и б-БАП выявлена зависимость числа растений с клубнями от концентрации цитокининов. Максимальное число растений с клубнями у обоих сортов наблюдали в среде, содержащей по 0,5 мг/л кинетина или 6-БАП. Снижение или увеличение концентрации этих гормонов снижало число растений с клубнями, а также их количество на растении. Такая зависимость наблюдалась у всех трех типов (апикальные, медиальные и базальные) черенков обоих сортов. R то же время, тип черенка также оказывал влияние на их клубнеобразующую способность.

Сорт Повировец характеризовался гораздо более высокой клубнеобразующей способностью, чем сорт Истринский.

Таблица 4.

Клубиеобразование картофеля in vitro под действием цитокипинов

Сорт Тип черенка Контроль Концентрация гормонов, мг/л

Кинетин 6-БАП Зеатин

0,25 0,5 1,0 0,25 0,5 1,0 0,05 ОД 0,2

Растения, образовавшие микроклубни, %

Повировец А 0 33 20 13 7 33 13 20 20 20

Б 7 33 60 40 13 53 40 20 53 33

В 7 40 60 53 20 60 53 20 33 40

Истринский А 0 7 26 7 7 13 7 0 7 20

Б 0 13 33 26 20 26 13 7 13 20

В 0 20 33 20 33 40 26 13 13 33

Высокой эффективностью в индукции процессов клубне-образования обладал зеатин уже при концентрациях значительно ниже, чем кинетин и 6-БАП. Однако, под влиянием зеатина наблюдали отклонения в росте и развитии растений картофеля.

Аналогичные исследования по изучению влияния цитоки-нинов на рост и клубнеобразование растений in vitro, проведенные на сорте Янтарный, показали его высокую клубне-образующую способность и подтвердили основные закономерности, выявленные нами на сортах Повировец и Истринский.

Проведенные исследования позволили определить оптимальные концентрации цитокининов, способствующие изучению клубнеобразовавания. Одновременно установлена сорто-специфичность данного процесса и большая клубнеобразующая способность у базальных черенков. В качестве индукторов клубнеобразования следует использовать кинетин и 6-БАП (0,5 мг/л), т.к. под влиянием зеатина наблюдались отклонения в росте и развитии пробирочных растений и клубней.

3.2. Рост и клубнеобразование картофеля in vitro под действием сахарозы

Клубнеобразование, согласно многим экспериментальным данным, стимулируется высоким содержанием сахарозы в верхушках столонов. Для роста клубней требуется необходимый запас Сахаров, а при недостаточном снабжении ассими-лятами рост клубней ингибируется.

В связи с этим, мы изучали влияние на рост и клубнеобразование различных ее концентраций в культуральной среде.

Выявлено, что высокие концентрации сахарозы (6-8%) инги-бировали рост растений картофеля. При этом степень ингиби-рования зависела от сорта. Так, растения сорта Повировец оказались более устойчивыми к действию сахарозы, чем у Истринского.

На средах, содержащих 10 и 12% сахарозы побеги растений сорта Истринский были искривлены, имели утолщения, напоминающие клубни. Наиболее характерно это для медиальных и

Таблица 5.

Клубиеобразование картофеля в культуре in vitro в зависимости от концентрации сахарозы.

CJ

о

Сорт Тип черенка Растения, образовавшие микроклубни, % Число микроклубней на 15 растений

концентрация сахарозы, % концентрация сахарозы, %

2 4 6 8 10 12 2 4 6 | 8 10 12

30 суток культивирования

Повировец А 0 0 13 53 13 20 0 0 2 11 2 2

Б 0 13 40 100 60 73 0 2 6 15 10 15

В 0 33 100 100 100 100 0 5 18 18 19 19

Истринский А 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Б 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

В 0 0 0 0 20 13 0 0 0 0 3 2

базальных черенков. Растения сорта Повировец по морфологии мало отличались от контрольных. С увеличением содержания сахарозы (10-12%) в культуральной уменьшался размер листьев. У обоих сортов они имели вид чешуек и антоциановое окрашивание (нижние листья и нижняя часть стебля).

Количество образовавшихся на растениях листьев на средах с различным содержанием сахарозы уменьшалось с увеличением ее количества.

Увеличение содержания сахарозы в среде ингибировало корнеобразование, причем у Истринского в большей степени.

Изученные сорта резко различались и по способности к клубнеобразованию на средах с сахарозой (табл.5). Если у сорта Повировец клубни формировались уже в первый месяц культивирования, то у сорта Истринский эти процессы активизировались лишь к концу 2-го месяца культивирования. Как правило, у изученных сортов число растений, образующих клубни и число клубней на растении увеличивалось от апикальных к базальным черенкам. Выявленные закономерности в действии сахарозы наблюдались и на сорте Янтарный.

Таким образом, сахароза в повышенных концентрациях угнетает рост растений и в то же время стимулирует процесс клубнеобразования.

Причем, эти эффекты являются сортоспецифичными. Клубнеобразующий эффект оказался более выраженным у базальных черенков.

3.3. Изменения роста и клубнеобразования картофеля in vitro под действием температуры

Температура относится к числу наиболее существенных факторов внешней среды, влияющих на клубнеобразование. Поэтому, было важно определить ее параметры, наиболее благоприятные для образования у исследуемых сортов микроклубней в культуре in vitro.

Наиболее благоприятными для получения микроклубней были относительно низкие температуры - +10—Ы5°С, не оказывающие ингибирующего действия на рост основных побегов. При выращивании в этих условиях в течение 1 мес.

средняя высота стебля у всех изученных нами сортов составила 9-10 см, т.е. они были достаточно выровненными, несмотря на то, что при температуре +24—1-25°С наибольшей скоростью роста обладал сорт Янтарный, несколько меньшей -Бирюза и Самородок, самыми слаборослыми были растения сорта Истринский. На фоне пониженных температур рост основных побегов не ингибировался под влиянием кинетина и повышенной концентрации (4%).

Пониженные температуры в сочетании с индукционной средой ингибировали корнеобразование, тормозили рост корней в длину, а также тормозили развитие фотосинтезирующей части растений, что, как было показано, способствуют стимуляции клубнеобразования {Чайлахян, 1984, Gregory, 1956).

Индуцирующее действие пониженных температур на клубнеобразование у разных сортов проявилось неодинаков. У сортов Изобилие и Бирюза индукция температурой имела место уже на контрольной среде (табл.6). У Бирюзы наибольший клубнеобразующий эффект наблюдали при +15°С на всех типах черенков. Повышение или снижение температуры приводило к ослаблению клубнеобразующего эффекта. Для всех типов черенков сорта Изобилие оптимальной оказалась температура +10°С, повышение которой также приводило к уменьшению числа растений с клубнями. У сорта Бирюза наибольшей клубнеобразующей активностью обладали растения, выращенные . из апикальных черенков, а у сорта Изобилие - из медиальных. Сорта Истринский и Самородок слабо реагировали на температурный фактор при выращивании на контрольной среде. Отмечены лишь единичные случаи появления микроклубней.

Под действием кинетина и сахарозы существенно увеличивалось число клубненосных растений и клубней на одном растении (табл.6). При этом, способность апикальных черенков сорта Бирюза к клубнеобразованию на индукционной среде не зависела от температуры.

Интересно отметить, что сорт Истринский, у которого в неиндукционных условиях почти не образовывались клубни, при действии кинетина и сахарозы число растений,

образовавших микроклубни, достигло 60%. При этом, отмечено повышение количества растений с клубнями от апикальных черенков к базальным. Характерно, что и на контрольной и на индукционной средах наибольшее число растений с клубнями образовывалось у базальных черенков при температуре +20°С.

Таблица 6.

Клубнеобразование картофеля in vitro в зависимости от температуры и состава культуральной среды.

Сорт Тип Контроль Кинетин + 4%

черенка сахарозы

10°С 15°С 20°С ю°с 15°С 20°С

Растения, образовавшие микроклубни, %

А 0 0 0 33 13 20

Истринский Б 7 0 0 47 13 20

В 0 7 20 53 53 67

А 0 0 0 7 0 0

Самородок Б 0 0 0 7 0 0

В 0 0 7 13 13 0

А 47 73 33 100 100 93

Бирюза Б 13 40 20 100 87 47

В 7 33 0 87 47 53

А 7 7 0 53 60 33

Изобилие Б 40 20 7 33 47 27

Б 20 13 7 40 7 40

Пониженные (+10°—П5°С) температуры способствовали у сортов с высокой клубнеобразующей способностью (Бирюза, Изобилие) активизации этого процесса у всех типов черенков, в

том числе и апикальных. Это характерно как для контрольной, так и для индукционной сред.

По-видимому, пониженная температура вызывает перераспределение гормональных уровней у растений, что способствует клубнеобразованию.

Таким образом, выявлено индуцирующее действие температур в пределах от +10 до +15°С на процесс клубне-образования картофеля in vitro, которое проявилось на индуцирующей среде у всех исследованных сортов. В то же время, на контрольной среде сорта с низкой клубнеобразующей способностью более эффективно образовывали клубни. Показано также, что пониженные температуры активизируют клубнеобразование у апикальные и медиальных черенков.

3.4. Рост и клубнеобразование картофеля in vitro в зависимости от различной продолжительности светового дня.

В процессе исследований отмечено влияние различной продолжительности светового дня на образование столонов. В подавляющем большинстве вариантов испытуемых культу-ральных сред и сортов число столонов увеличивалось в зависимости от продолжительности светового дня от 6 до 10 часов.

Короткий световой день, как правило, индуцировал клубнеобразование картофеля у всех исследованных сортов. При этом, частота образования клубней увеличивалась с увеличением продолжительности светового дня от 6 к 10 час. {табл.7).

Способность к формированию клубней, как правило, увеличивалась от апикальных к базальным черенкам, по-видимому, более зрелым в физиологическом отношении, которые й в условиях длительного культивирования in vitro сохранили способность легче и быстрее формировать клубни, чем более молодые апикальные черенки, что особенно четко проявляется на контрольной среде. Тем не менее, короткий день активизировал клубнеобразующую способность апикальных и медиальных черенков.

Таблица 7.

Клубнсобразоиапие картофеля in vitro в зависимости от различной продолжительности светового дня.

Состав среды Продолжительность свет, дня Истринский Бирюза Изобилие

Тип черенка

А Б В А Б В А В В

Растения, образовавшие микроклубни, %

Контроль б 7 7 13 7 7 13 0 0 0

8 7 7 20 7 7 26 20 0 13

10 53 66 87 40 47 66 33 60 60

16 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4% сахарозы 6 20 13 40 0 13 33 7 0 33

8 13 20 52 40 47 66 33 47 60

10 74 66 87 66 60 80 66 93 93

16 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6-БАП + 4%

сахарозы 6 40 40 60 7 26 33 60 60 66

8 33 47 60 53 53 66 37 87 93

10 60 66 80 63 66 66 80 93 100

16 0 0 0 0 0 7 0 0 0

Кинетин + 4%

6 47 40 47 26 26 53 33 80 74

8 74 66 74 40 66 80 74 80 93

10 80 80 80 74 80 93 100 93 93

16 0 0 0 0 1 20 0 0 0

Цитокинины в составе культуральной среды стимулировали клубнеобразование как на коротком, так и на длинном дне, но в последнем случае эффект проявляется лишь через 60 суток.

С 1978 года лаборатория безвирусных культур разрабатывает методы получения безвирусных растений картофеля из апикальных меристем, на которых, при определенных условиях образуются микроклубни (Морозова, Мелик'-Саркисов, 1978) диаметром 5-7 мм. Микроклубни, полученные in vitro, могут быть использованы в качестве исходного посадочного материала, свободного от вирусной инфекции.

Микроклубни, полученные этим методом исключают возможность их перезаражения на всех этапах получения безвирусного семенного материала картофеля и дают возможность сохранить его в течение всего осенне-зимнего периода без дополнительных затрат, связанных с пересадками. Практически появилась возможность создать своего рода "банк" оздоровленных ценных сортов картофеля, упростить и удешевить пересылку семенного материала, ускорить селекционный процесс, и, наконец, удвоить количество клубней с одного куста по сравнению с наиболее широко применяемым до этого методом размножения пробирочными растениями. Около 95% микроклубней, даже самые мелкие из них, могут быть использованы для формирования новых растений (Dodde, 1984).

Традиционная система безвирусного семеноводства картофеля включает следующие этапы: получение оздоровленного посадочного материала в элитных хозяйствах и сохранение его в здоровом состоянии на семеноводческих участках колхозов и совхозов.

На 1-м этапе получают безвирусные растения картофеля в условиях in vitro, размножают клоны, производят высадку клубней в почву и получают 1-ую репродукцию безвирусного материала.

Сущность нашей методики состоит в том, что на первом этапе после проверки полученных растений-регенерантов на содержание вирусов, безвирусные растения размножают черенкованием in vitro, а полученные клоны не высаживают, как было принято ранее, в почву, а помещают в условия,

индуцирующие клубнеобразование. Это позволяет значительно упростить систему получения безвирусного посадочного материала картофеля.

На основании полученных нами результатов, мы предлагаем следующую схему получения микроклубней картофеля в условиях in vitro.

Черенки вначале культивируют при 16-час. продолжительности светового дня, температуре +24~25°С днем и + 19~20°С ночью, освещенности 5-6 клк, на среде следующего состава (на 1 л среды): макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу, тиамин - 1,0 мг, пиридоксин - 0,5 мг, никотиновая кислота -0,5 мг, аскорбиновая кислота - 1,0 мг, 6-БАП — 0,5 мг, сахароза - 4%.

После образования у пробирочных растений 5-6 листьев их переносят в условия внешней среды, индуцирующие клубнеобразование: пониженная (+10-15°) температура и короткий (10-час.) световой день.

Образование микроклубней наблюдается, как правило, через 1-1,5 месяца после переноса растений в индукционные условия, в зависимости от сорта.

Сформировавшиеся неповрежденные микроклубни закладывают по 10 штук в пустые стерильные пробирки и хранят при +2-5°С и влажности воздуха 95%. В этих условиях микроклубни не дают проростков даже после 6 месяцев хранения, в то время, как при содержании их в комнатных условиях они не имеют периода покоя.

Полученные описанным способом микроклубни используют в дальнейшем в семеноводстве картофеля на безвирусной основе.

На экспериментальной научно-исследовательской базе ВНИИ СБ "Горки Ленинские" с 1980 г. мы изучали возможность использования полученных микроклубней в качестве безвирусного посадочного материала картофеля.

Сравнительное изучение микроклубневых и пробирочных растений картофеля в условиях открытого и закрытого грунта показало значительное превосходство первых по урожайности и количеству клубней с одного куста. Всего получено 7 тыс.

клубней первого поколения картофеля в условиях закрытого грунта и около 50 тыс.- в открытом грунте. В открытом грунте микроклубневые растения так же превосходят пробирочные по коэффициенту размножения, но несколько уступают по общей массе клубней с одного куста, т.к. имеют длинный вегетационный период и не успевают полностью сформировать урожай, что в семеноводческом процессе, однако, не имеет существенного значения.

Результаты, полученные за 4 года вегетации позволили установить принципиальную возможность создания жизнеспособного, оздоровленного посадочного материала картофеля пробирочными клубнями с посадкой их непосредственно в грунт.

При использовании образующихся in vitro микроклубней в качестве посадочного материала на экспериментальной базе Торки Ленинские" уже получено 36,9 т семенного картофеля, свободного от фитопатогенов, в т.ч. и от вирусной инфекции.

4. Изменение цитогенетической характеристики растений картофеля под действием углеводных компонентов культуральной среды

Культивирование изолированных соматических тканей растений на искусственных питательных средах с последующей регенерацией целых органов приводит к расширению генетической изменчивости. Наличие измененных форм, так называемой сомаклональной вариабельности, в потомстве регенерантов обнаружено в ряде исследований. По мнению авторов такие компоненты культуральной среды, как 6-БАП, 2,4-Д, кинетин обладают мутагенными свойствами.

Однако, такой эффект нежелателен, если это касается оздоровления или клонального микроразмножения существующих сортов сельскохозяйственных культур. Поэтому, особое значение имеют исследования генетической системы клеток в условиях культуры in vitro как на уровне генных мутаций, так и кариотипа. Используя разработанную нами теорию индукции

Таблица 8.

Цитогенстический эффект сахарозы, фруктозы и глюкозы в меристемах корней картофеля, выращенного в культуре in vitro

tc

to

Концентрация Аберрации хромосом, % Митотический индекс, %

сахарозы, % сахароза глюкоза фруктоза сахароза глюкоза фруктоза

Контроль 5,37+0,59 5,73+0,92 6,26+0,91 6,20±0,76 5,00+0,68 4,90+0,68

2 8,57±0,95 6,69±0,68 6,89±0,55 4,90±0,68 4,50±0,65 5,50+0,72

4 15,13±1,26 8,54±0,73 3,49+0,57 3,40+0,48 4,50±0,65 6,20+0,76

6 21,00±1,77 10,35±1,22 3,94+0,57 2,10±0,45 3,60+0,58 2,60+0,50

8 23.58=1,44 ll.20rl.10 3.19=0.90 2.10=0.45 3.10=0.54 2.60=0.50

направленного органогенеза в культуре растительных тканей (Морозова, Мелик-Саркисов, 1978), была предложена технология получения безвирусного посадочного материала картофеля микроклубнями, индуцированными в культуре in vitro (Мелик-Саркисов и др., 1985). Необходимым условием эффекта клуб-необразования, наряду с температурным и световым режимами, является определенный уровень (более 4%) содержания сахарозы в культуральной среде. Одновременно было выявлено,' что концентрация сахарозы свыше 2-5% подавляет пролиферацию каллуса у различных культур.

Из данных таблицы 8 видно, что с нарастанием концентрации сахарозы происходит увеличение числа аберрантных клеток и аберраций хромосом и уменьшение митотического индекса. Уже при 4%-ном уровне сахарозы в среде резко возрастал ее аберрационный эффект. Следовательно, сахароза в концентрациях, обычно используемых для индукции клуб-необразования, обладает ярко выраженным цитогенетическим эффектом. Повторение эксперимента на цитологически более удобном объекте - проращиваемых в растворах сахарозы семенах лука Батун, подтвердило мутагенный эффект сахарозы, который так же, как и в случае с картофелем, возрастал с увеличением концентрации сахарозы.

В связи с тем, что сахароза в высоких концентрациях вызывает образование аберраций хромосом, нами был изучен цитогенетический основных ее компонентов — глюкозы и фруктозы - для определения возможного компонента, вызывающего мутагенное действие этого углевода.

Включение глюкозы в качестве углеводного компонента в питательную среду вызвало угнетение роста и развития растений картофеля в вариантах с высоким ее содержанием. Практически летальными оказались 10 и 12%-ные концентрации глюкозы. При 4%-ном содержании глюкозы достоверно увеличивалось число аберрантных клеток и аберраций хромосом. На наш взгляд мутагенный эффект сахарозы и обусловлен одним из ее компонентов - глюкозой. Данные о действии глюкозы на меристемы корней картофеля представлены в табл.9.

Таблица 9.

Цитогенетический эффект комбинированных добавок Сахаров в меристемах корней картофеля, выращенного в культуре in vitro.

Концентрация Сахаров % Проанализировано анафаз Аберрации хромосом Mi Коэффициент за- 1ЦИТЫ

Всего Из них с перестройками Всего На 100 анафаз

число %

Контр. 1450 50 3,44+0,47 78 5,37±0,59 6,20+0,76

2%С 863 62 7,18±0,87 74 8,57±0,95 4,90±0,68

4%С 802 98 12,15±1,15 122 15,13±1,26 3,40±0,48

6%С 528 81 16,34+1,56 111 21,00±1,77 2,10+0,45

8%С 865 167 19,30±1,34 204 23,58±1,44 2,10±0,45

1%Ф+2%С 1442 42 2,91±0,44 58 4,02±0,51 5,50±0,72 140,93

1%Ф+4%С 1579 79 5,00+0,54 88 5,73+0,58 6,10+0,75 95,90

1%Ф+6%С 1364 64 4,69±0,57 69 5,05±0,59 6,40±0.77 101,79

<ГгФ~8%С 1500 70 4,ббг0.54 77 5.14г0,57 d.o0=0.7S :oi.(K

Примечание: Ф - фруктоза, С - сахароза

Известно, что в водном растворе часть молекул глюкозы находится в форме свободного альдегида. В настоящее время установлено, что альдегид индуцирует цитогенетические изменения (хромосомные аберрации, микроядра, сестринские хроматидные обмены) в культуре ткани. Кроме того, ацеталь-дегид вызывает генные мутации у Drosophila melanogaster (Даффус, 1987, Wicki, 1988). Предполагается, что альдегид влияет на процессы синтеза ДНК. Возможно, именно с этим связан мутагенный эффект глюкозы и сахарозы.

Фруктоза, также, как сахароза и глюкоза, в высоких концентрациях (10-12%) вызывала угнетение роста и развития растений, но при всех испытанных концентрациях (2-12%) она не индуцировала аберраций хромосом в меристемах корней картофеля (табл.8). Более того, уже при 4%-ном уровне фруктозы достоверно снижалось число аберраций хромосом по сравнению с контролем.

Отсутствие цитогенетического эффекта у растений картофеля, выращенных в культуре in vitro при воздействии фруктозы, навело на мысль об использовании питательных сред с комбинированными добавками Сахаров.

В опытах по совместному применению фруктозы и сахарозы было показано, что фруктоза обладала сильным антимутагенным эффектом и снижала в несколько раз число аберрантных клеток и аберраций хромосом, индуцированных сахарозой (табл.9).

Полученные результаты позволили предположить, что фруктоза, возможно окажет защитное действие и при облучении клеток ионизирующей радиацией. Эксперименты с облученными семенами лука Батун показали, что достоверный защитный эффект наблюдали уже при использовании небольших (1%) концентраций фруктозы (табл. 10).

Анализ спектра перестроек хромосом выявил снижение числа хроматидных фрагментов и мостов, количество которых практически достигает уровня частоты возникновения хроматидных аберраций в контроле. Следовательно, именно фруктоза оказывает репарационное действие в период синтеза ДНК, в постсинтетической фазе и профазе митоза.

Таблица JO.

Цитогснстичсский эффект совместного илшшил уоблученил и растворов фруктозы в нервом митозе проростков семян лука Батуи

Доза облучения и концентрация фруктозы Проанализировано анафаз Аберрации хромосом Mi Коэффициент защиты

Всего Из них с перестройками Всего На 100 анафаз

число %

Контроль 1000 46 4,60±0,66 54 5.40±0,71 12,80±1,03

5р 946 146 15,43±1,17 186 19,66±1,29 11,20±0,99

15Гр+1%Ф 1862 162 8,70+0,65 167 8,96+0,66 11,10±0,99 56,94

15Гр+2%Ф . 1174 74 6,30±0,70 84 7,15±0,75 10,30±0,96 68,51

15Гр+4%Ф 2036 136 6,68+0,55 151 7,41±0,58 10,00±0,94 72,44

20Гр 1455 255 17,52±0,99 368 26,29±1,13 10,20±0,95

20Гр+1 ТсФ 1500 124 8,20±0,70 164 10,93±0,80 10,60+0.97 59.22

20Гр+2(;*сФ 1541 143 9,20±0,73 173 11,22±0,80 Го,t30±l,08 56,96

20Гр+4%Ф 1228 128 10,42+0,87 150 12,21±0,93 9,50±0,92 56,10

При использовании метода культуры ткани, отмечена кариотипическая нестабильность регенерантов и более высокая вариабельность признаков в потомстве регенерантов картофеля, чем в исходном сорте. Доказано, что генетические изменения, выявленные в их потомстве, в большей степени обусловлены мутагенным эффектов отдельных компонентов питательной среды. В связи с этим необходимо контролировать мутационный процесс у растений в культуре in vitro, когда это касается получения генетически стабильных форм, таких, например, как получение безвирусного картофеля методом клубнеобразования in vitro.

Для индукции клубнеобразования следует использовать культуральные среды с высоким содержанием цитокининов и сахарозы. Известно, что кинетин изменяет плоидность хромосом клетки, т.е. вызывает кариотипическую нестабильность, а сахароза индуцирует хромосомные перестройки. Добавка в питательные среды фруктозы резко снижало повреждающее действие сахарозы и кинетина и привело к нормализации клеточной популяции (табл.11).

Из данных таблицы 11 видно, что включение в питательную среду 1-2%-ной фруктозы резко снижало повреждающее действие сахарозы и кинетина. Происходит нормализация клеточной популяции. Число клеток с нормальной плоидностью во всех вариантах опыта резко увеличивалось даже по сравнению с контролем и составило во многих случаях более 80%, а число аберрантных клеток и аберраций хромосом, наоборот, снижалось в несколько раз.

Таким образом, для нормализации клеточных популяций и стабилизации регенерантов картофеля необходимо добавление в культуральные среды небольшого количества фруктозы.

1 аолица л.

Цитогенетический эффект совместного действия сахарозы различпых концентрация, 0,5 мг/л кииетина 2%-ной фруктозы в меристемах корней картофеля, выращенного в культуре in vitro.

- Концентрация сахарозы(%) Проанализировано анафаз Аберрации хромосом Mi Клетки с нормальной пло-идностью (4п=48)

+фруктоза(%) + кинетин(%) Всего Из них с перестройками Всего На 100 анафаз

число %

Контроль ОС+ОФ+ 1450 50 3,44+0,47 78 5,37+0,59 6,20+0,76 51,50+6,15

кинетин 1102 102 9,25+0,87 123 11,16+0,94 3,60+0,58 57,37+4,47

2%С+кин. 500 23 4,60+0,93 26 5,20+0,99 4,80+0,68 60,60+4,91

4%С+кин. 1030 111 10,77+0,86 153 15,04+1,11 4,10+0,62 58,18+5,20

6%С+кин. 1042 186 17,85+1,18 240 23,00+1,30 4,10+0,62 56,70+6,05

8%С+кин. 610 110 18,03+1,55 143 23,44+1,71 2,70+0,51 33,33+4,30

0С+2%Ф+ кин. 1200 54 4,50+0,59 57 4,80+1,61 6,10+0,69 79,54+3,51

2%С+2%Ф+ кин. 1000 48 4,80+0,67 52 5,20+0,70 5,10+0,69 88,40+2,72

4%С+2%Ф+ кин. 1159 за 3,27+0,52 41 3,53+0,54 5,10+0,69 87,20+3,18

6%С+2%Ф+ кин. 1500 75 5,00+0,56 90 6,00+0,61 5,00+0,68 84,00+3,66

8%С+2%Ф+ кин. 1269 69 5,43+0,63 72 5,67+0,64 4,00+0,61 75,71+3,62

5. Технология и оборудование для промышленного производства бсзвирусных миниклубней картофеля

Нами разработаны технология и технические средства для промышленного производства безвирусных семенных миниклубней картофеля, включающие в себя системы для ускоренного клонального микроразмножения безвирусных растений и гидропонного производства семенных миниклубней кондиционных размера и массы.

Технологию получения безвирусных миниклубней условно можно разделить на три стадии: оздоровление сорта, размножение безвирусных растений, получение миниклубней в закрытом грунте.

Оздоровление сорта проводят по методу культуры изолированной апикальной меристемы (Волкова, Курлович, Бурова, 1988). Затем оздоровленные пробирочные растения размножают черенкованием. Черенки выращивают in vitro на культуральных средах в установке, состоящей из блока управления и световых модулей, в которых обеспечивается фотоавтотрофный рост растений в атмосфере, обогащаемой СО в течение светового периода. Создание условий, при которых фотоавтотрофный рост становится определяющим, обусловливает высокую интенсивность их роста (Цоглин, Мелик-Саркисов, Андреенко и др., 1991). Скорость роста черенков и их конечная биомасса возрастают в несколько раз по сравнению с обычными методами выращивания in vitro. Полученные растения легко адаптируются при пересадке в грунт.

Выращивание миниклубней, как правило, осуществляется в различных сыпучих субстратах в закрытом грунте. Однако, это сопряжено с большой трудоемкостью и низкой эффективностью использования площади защищенного грунта (коэффициент полезного действие не превышает 0,5-0,6). Кроме того, разовый сбор урожая в конце вегетации обуславливает крайнюю неоднородность клубней по размеру и массе (что усложняет механизацию высадки клубней в грунт) и, как следствие - низкий выход кондиционного семенного материала.

Известные методы и технические средства для выращивания растений на гидропонике (Лебедев, Абраменко, Сабинина и др., 1990) не могут быть эффективно использованы для производства миниклубней картофеля кондиционного размера, образующихся на подземных органах, т.к. не обеспечивают свободного доступа оператора к корневой зоне растений для их периодического сбора. Следует отметить, что периодический сбор их в процессе вегетации стимулирует процесс клубнеобразования.

Нами разработаны технология и технические средства для промышленного выращивания безвирусных миниклубней картофеля кондиционного размера на гидропонике в проточной культуре.

Выращивание растений до полного сбора миниклубней проводят в теплице или закрытом помещении в гидропонных установках (рис.6,7), в которых водообеспеченйе и минеральное

питание растений осуществляется путем периодического протока питательного раствора, орошающего корневую систему, а в паузах между подачей раствора происходит ее аэрация.

Безвирусные пробирочные растения или некондиционные миниклубни фиксируют в посадочных крышках, установленных с заданным шагом на жесткой раме, непосредственно под которой расположен И-образный наклонный лоток. Корневая система при этом размещается на его дне. Пространство между посадочными крышками закрыто светонепроницаемой пленкой, исключающей засветку корневой системы растений в лотках. В каждый лоток периодически подается питательный раствор.

Начальная густота растений задается шагом между посадочными крышками вдоль лотка и может варьировать в широких пределах в зависимости от сорта с целью оптимизации листового индекса посева.

Система автоматического управления технологическими процессами обеспечивает заданную цикличность потока питательного раствора, длительность и цикличность светового периода, поддержание необходимой температуры и влажности в культивационной камере.

Рис.6 Общий вид гидропонной установки

А-А

2.

Рис.7 Продольный разрез гидропонной установки: 1 - посадочная крышка; 2 - жесткая рамка; 3 - и-образный наклонный лоток; 4 - общий коллектор; 5 - сливной коллектор; 6 - бак; 7 - шарнирное соединение лотка и несущей рамки со сливным коллектором; 8 - облучательные устройства;

9 - кронштейны; 10 - трап.

Испытания технологии и технических средств" проводили на картофеле сорта Невский. Черенки оздоровленных растений выращивали в установке для ускоренного клонального микроразмножения с подачей СС>2 и вне установки (контроль) на культуральной среде Мурасиге и Скуга при 16-часовом световом дне и одинаковой интенсивности освещения. Пробирки с растениями были закрыты ватными пробками.

Скорость роста растений в установке в 2,1 раза выше, чем в контроле (с учетом времени на укоренение черенков) и составляла 12 суток. При этом биомасса растений, выращенных в установке превышала контроль в 2,9 раза.

Пробирочные растения были высажены в систему для гидропонного выращивания из расчета 32 растения на 1 м . Выращивание проводили на растворе Кнопа. Длительность - 16 часов, в последующие два месяца — 8-10 часов в сутки. Температура в помещении в первый месяц поддерживали в пределах 23-25 С при включенных источниках света и 18-20 С в ночной период, в последующие два месяца - соответственно 18-20 и 14-16 С. Длительность интервала подачи питательного раствора - 5 минут при цикличности - 4 раза в час. Уровень облучения посева составлял 80-100 Вт/м (ФАР).

Растения-регенеранты, выращенные в атмосфере с добавлением углекислоты, на 2-3 недели опережали в росте контрольные. При этом их приживаемость была 100%-ной. Клубнеобразование отмечалось на 5-6-й неделе от начала вегетации. Сбор миниклубней, достигших кондиционного размера, проводили каждые 3-4 дня в течение двух месяцев. Питательный раствор полностью меняли раз в 3 недели, а в периодах между сменами делали коллекцию в зависимости от выноса минеральных элементов и значения рН.

Производительность установки за 3,5 месяца вегетации растений составила около 1650 миниклубней с 1 м посева со средней массой каждого 5 г. Коэффициент полезного использования площади культивационной камеры составил 0,82.

Испытания показали, что разработанная технология позволяет обеспечить промышленное производство безвирусного семенного картофеля. Отличительной особенностью такого

Испытания показали, что разработанная технология позволяет обеспечить промышленное производство безвирусного семенного картофеля. Отличительной особенностью такого производства служат: ускоренный рост растений-регенерантов, практически 100%-ная их приживаемость при пересадке, высокая производительность гидропонной системы и эффективность использования площади защищенного грунта (более 80%), возможность сбора миниклубней в течение всего периода клубнеобразования, что наряду с повышением продуктивности позволяет вести их отбор по заданному их размеру.

Кроме того, новая технология позволяет активно управлять технологическими режимами культивирования путем автоматизации всех процессов. И наконец, она избавляет от трудоемких и нетехнологичных операций, благодаря отказу от использования сыпучих субстратов и наполнителей, что значительно снижает вероятность заражения растений фитопатогенными микроорганизмами, грибами, а также вредителями, развивающимися в сыпучих субстратах.

ВЫВОДЫ

1. Потребление вирусами части первичных продуктов фотосинтетических реакций приводит к значительному снижению урожая и удлинению периода вегетации растений картофеля на 25-20%. Высокая продуктивность безвирусного картофеля по сравнению с инфицированным в северных и средних широтах определяется в основном быстрым развитием листовой поверхности и большей фотосинтетической активностью на ранних стадиях онтогенеза, в то время как в южных, наряду с листовой поверхностью, ведущим фактором становится высокая скорость фотосинтеза и его уровень светового насыщения, позволяющие значительно эффективнее использовать энергию света.

2. Степень воздействия вирусной инфекции на растения картофеля зависит от уровня фотосинтетической активности, что является следствием большей вредоносности вирусов в южных районах, При выращивании в умеренных широтах наблюдается незначительное (на 15-20%) снижение параметров фотосинтетического аппарата растений и менее интенсивное "накопление" патофизиологических проявлений при многократных клубневых репродукциях инфицированного материала.

3. Безвирусные растения при большем по сравнению с инфицированными, биологическом урожае выносят меньше питательных веществ на единицу веса клубня, но в связи с' тем, что у здоровых растений выше биологическая масса и они дают и соответственно больший урожай. Для их оптимального развития требуется примерно в 1,4 раза больше питательных веществ. Максимальный суточный вынос азота и калия у безвирусных растений в 1,5-1,6 раза, а фосфора - в 1,9-2,0 раза выше, чем у инфицированных.

4. Изменяя условия культивирования (температурный и световой режим, а также состав культуральной среды) возможно индуцировать клубнеобразование у регенерантов картофеля в условиях in vitro. Полученные микроклубни являются полноценном фертильным посадочным материалом, который можно использовать в первичном семеноводстве.

5. Цитокининовые препараты ингибируют рост растений и корней, активизируют образование и рост боковых побегов и столонов, а также индуцируют клубнеобразование в культуре in vitro картофеля. Степень выраженности этих эффектов зависит от сортовых особенностей, концентрации и типа цитокининов. Наиболее сильный ингибирующий развитие растений эффект оказывает зеатин. Наибольшее число полноценных клубней получали при использовании 6-БАП и кинетина.

6. Сахароза в высоких концентрациях вызывает угнетение роста растений и корнеообразования, но активизирует образо-

вание столонов и боковых побегов, а также стимулирует процесс клубнеобразования у растений картофеля в культуре in vitro. Степень выраженности этих эффектов зависит от сортовых особенностей.

7. Пониженные температуры в сочетании с индукционной средой ингибиругот развитие фотосинтезиругощей части растений, но активизируют в этих условиях процесс столонообразования. Пониженные температуры индуцируют клубнеобразование у сортов с высокой клубнеобразующей активностью уже на контрольной среде. У сортов с низкой клубнеобразующей активностью стимуляция имела место лишь при выращивании на индукционной среде. Максимальный эффект клубнеобразования получен у всех сортов на индукционной среде при +10-15 С.

8. Короткий световой день оказывает индуцирующее действие на процесс клубнеобразования у всех изученных сортов картофеля. Оптимальной для получения микроклубней картофеля является 10-часовая продолжительность светового дня.

9. Сахароза и глюкоза в концентрациях, используемых для индукции микроклубней, вызывает образование большого числа аберраций хромосом, частота которых находится в прямой зависимости от их концентрации. Поэтому, эти сахара могут являться одним из важнейших факторов сомаклональной изменчивости в культуре in vitro картофеля.

10. Фруктоза не индуцирует аберраций хромосом, а в низких концентрациях (1-4%) обладает сильным антимутагенным эффектом и снижает в несколько раз их число, индуцированное цитокининами, сахарозой и облучением, стабилизирует плоидность культивируемых in vitro растений картофеля.

11. Выращивание миниклубней в разработанной биотехнологической системе в условиях гидропонного питания в среде с повышенным содержанием углекислоты, имеет ряд преимуществ, обеспечивая 100% приживаемость регенерантов, уско-

ренный их рост, большую биомассу ~ миниклубней и их ------

количество с единицы площади (до 1700 миниклубней с 1м ) ладанного размера, что крайне важный фактор для механизации высадки и практически исключает вероятность заражения патогенами.

12. Использование миниклубней в качестве посадочного материала предпочтительнее по сравнению с пробирочными растениями вследствие того, что они обладают большей энергией прорастания, коэффициентом размножения, скоростью роста, высокой всхожестью, допускают длительное хранение, транспортабельны и при использовании миниклубней кондиционного размера позволяют легко механизировать их высадку в грунт.

Многолетние производственные испытания показали высокую эффективность разработанной технологии выращивания посадочного материала.

Список публикаций, отражающих основное содержание работы.

1. Мелик-Саркисов О.С., Авакян В.А. Эффект рентгенооблу-чения картофеля при ограничении питания растений //Теоретические и практические аспекты использования ионизирующих излучений в сельском хозяйстве. Кишинев. 1976.

2. Мелик-Саркисов О.С., Додонов Г.П. Предварительные результаты влияния вирусов на урожай картофеля при заражении в различных сочетаниях в условиях высокогорья //Тезисы докладов 111 съезда Армянского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова. 1976. Ереван. С. 27-28.

3. Морозова С.Е., Мелик-Саркисов О.С. Индукция стебле-образования у эксплантатов картофеля при культивировании на жидкой среде // Доклады ВАСХНИЛ. 1977. № 5. С.14-15.

4. Морозов а С.Е., Мелик-Саркисов О.С. Размножение безвирусного картофеля клубнями, полученными in vitro // Физиология растений. 1.978. Т.25. Вып.2. С.373-378.

б. Морозова С.Е., Мелик-Саркисов О.С. Клубнеобразование у регенерантов картофеля in vitro как метод размножения безвирусных клонов //Всес. конф. "Культура клеток растений". 1979. г. Абовян. С. 145-146.

6. Морозова С.Е., Мелик-Саркисов О.С. Влияние физиологического состояния проростков картофеля на регенерацию растений из изолированных апексов //Докл. ВАСХНИЛ. 1981. № 9. С.8-10.

7. Морозова С.Е., Мелик-Саркисов О.С. Зависимость органогенеза -изолированных апексов картофеля от их физиологического состояния, срока изолирования и регуляторов роста в составе среды //Сб. "Регуляторы роста и развития растений".

Тезисы докладов" 1-й Всесоюзной конф. Москва; Наука. 1981. - -С.168-169.

8. Морозова С.ЕРостовцева З.П., Мелик-Саркисов О.С. и др. Влияние регуляторов роста в составе среды на ритм органогенеза апексов картофеля in vitro и инактивацию вирусной инфекции //Сб. "Регуляторы роста и развития растений". .Тезисы докладов 1-й Всесоюзной конф. Москва. Наука. 1981. С.169-170.

9. Влияние гибберелловой кислоты и кинетина на морфогенез изолированных в разное время года апексов картофеля //Физиология растений. 1982. Т.29. Вып.6. С.1170-1175.

10. Шатило В.И., Морозова С.Е., Мелик-Саркисов О.С. и др.

Ультраструктура клеток меристем картофеля, культивируемых на средах с различными регуляторами роста //Труды 4 Всесоюзной конф. "Культура клеток и биотехнология". Кишинев. 1983. С.43-44.

11. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С., Прозорова Т.В. и

др. Индуцированный морфогенез картофеля в культуре in vitro //Труды 4-й Всесоюзной конф. "Культура клеток и биотехнология". Кишинев. 1983. С. 110-111.

12. Мелик-Саркисов О.С., Донец И.Л., Донец Н.В. Влияние способов получения исходного материала на продуктивность картофеля // Доклады ВАСХНИЛ. 1984. № 6. С.17-19.

13. Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А. Использование клеточной биотехнологии в практической селекции и растениеводстве //Вестник с/х науки. 1984. № 7. С.91-100.

14. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Индуцированный in vitro морфогенез у сортов картофеля Янтарный, Львовянка, Повировец //Сб. научных трудов "Исследования по клеточной селекции картофеля". Москва. 1984. С.89-94.

15. Мелик-Саркисов О.С. Биотехнология безвирусного картофелеводства //Защита растений. 1984. № 12. С. 16-18.

16. Мелик-Саркисов О.С., Ульянов Р.П., Байбаков М.М. и др.

Опыт получения посадочного материала картофеля //Селекция и семеноводство. 1984. № 12. С.28-30.

17. Цоглип Л.Н., Симояян Г.Г., Четверяков А.Г., Мелик-Саркисов О.С. Влияние инфекции Х-вируса на фотосинтетический аппарат растений картофеля //Физиология растений.

1985. Т.32. Вып.2. С.388-395.

18. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Генетические особенности морфогенеза в каллусных культурах различных сортов картофеля //С/Х биология. 1985. № 3. С.67-70.

19. Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н., Ульянов Р.П.

Получение безвирусного посадочного материала картофеля микроклубнями, индуцированными в культуре in vitro -Методические рекомендации. Москва: ВАСХНИЛ. 1985. 16 С.

20. Мелик-Саркисов О.С., Симонян Г.Г., Цоглин Л.Н. и др. Поражение Х-вирусов картофеля как фактор изменения фотосинтетического аппарата растений-хозяина //Доклады ВАСХНИЛ. 1985. № 6. С.17-20.

21. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Генотипические особенности морфогенеза в каллусных культурах различных сортов картофеля //С/Х биология. 1985. № 3. С.67-71.

22. Мелик-Саркисов О.С. Индукция направленного органогенеза в культуре растительных клеток //Сб. "Новые направления биотехнологии". Пущино. 1986. С.100.

23. Мелик-Саркисов О.С. Проблемы и перспективы клеточной биотехнологии растений //Биологический журнал Армении.

1986. Т.39, № 10. С.834-846.

24. Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н. Индукция цито-кининами клубнеобразования у картофеля в культуре in vitro //Вестник с/х науки. 1986. № 4 (355). С. 100-105.

25. Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А. Перспективы клеточной биотехнологии в картофелеводстве //Сб. "Состояние и

перспективы" развития сельскохозяйственной биотехнологии". Москва. 1986. С.79-85.

26. Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А. Клеточные биотехнологии в решении проблемы картофелеводства //Вестник с/х науки. 1987. № 1. С.57-64.

27. Мелик-Саркисов О.С. Пути борьбы с вирусными болезнями растений //Вестник с/х науки. 1987. № 3. С.156-159.

28. Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А., Кривощапова Г.И. Индукция направленного органогенеза как новый метод интенсификации селекционного процесса в картофелеводстве //Тезисы докл. 5 съезда ВОГИС. Москва. 1987. Т.4. С.78.

29. Мелик-Саркисов О.С., Цоглип Л.Н., Венедиктов П.С. и др. Фотосинтетический аппарат растений картофеля, инфицированных и свободных от Х-вируса картофеля // Физиология растений. 1987. Т.34. Вып.2. С.380-389.

30. Цоглип JI.il., Андреепко Т.И., Розанов В.В., Мелик-Саркисов О.С. Четвериков А.Г. Фотосинтетический аппарат растений картофеля при длительном действии вирусной инфекции //Физиология растений. 1987. Т.34. Вып.6. С.1103-1111.

31. Овчинникова В.Н., Мелик-Саркисов О.С., Фаддеева И.Н. Индукция клубнеобразования картофеля in vitro пониженными

температурами //Вестник с/х науки. 1987. № 7. С.81-85.

32. Аветисов В.А., Кривощапова Г.И., Мелик-Саркисов О.С. Некоторые особенности культуры каллусных протопластов картофеля //Физиология растений. 1987. Т.34. Вып.З. С.595-603.

33. Мелик-Саркисов О.С., Цоглип Л.Н., Розанов В.В., Андре-енко Т.И. Фотосинтетический аппарат растений картофеля при действии вирусной инфекции //Сб. "Проблемы генетики, селекции и интенсивной технологии сельскохозяйственных культур". Душанбе. 1987. 100-102.

34. Шатило В.И., Морозова С.Е., Мелик-Саркисов О.С. Действие гибберелловой кислоты и кинетина на ультраструктуру

апикальных меристем картофеля //Физиология растений. 1988. Т.35. Вып.1. С.150-157.

35. Гартель А.Л., Мелик-Саркисов О.С., Газаряп К.Г. Сильное метилирование ДНК из клубней картофеля, обнаруженное с помощью рестрикционного анализа //Биологические науки. 1988. № 2. С.19-21.

3(5. Гартель A.JI., Мелик-Саркисов О.С. Генно-инженерные подходы создания растений, устойчивых к вирусной инфекции //С/х биология. 1988. № 2. С.40-43.

37. Розанов В.В., Мелик-Саркисов О.С., Цоглип JI.H. и др.

Динамика параметров фотосинтетического аппарата безвирусных и инфицированных Х-вирусов картофеля растений картофеля в онтогенезе //Физиология растений. 1988. Т.35. Вып.1. С.795-804.

38. Чережанова Л.В., Овчинникова В.Н., Мелик-Саркисов О.С. Факторы сомаклональной изменчивости //ДАН СССР. 1988. Т.301. № 5. С.1224-1226.

39. Чережанова Л.В., Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова

B.Н. Цитогенетический эффект сахарозы //Генетика. 1988. T.XX1Y. № 8. С.1501-1504.

40. Аветисов В.А., Соболькова Г.И., Гартель А.Л., Мелик-Саркисов О.С. Эффективная система трансформации картофеля при использовании срезов клубней //Сб. "Новые направления биотехнологии". Пущино. 1988. С.62.

41. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Биотехнологические приемы в повышении продуктивности растениеводства на современном этапе //Тезисы докл. Всесоюзной науно-техн. конф. "Применение биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине". Ленинград. 1988.

C.164-167.

42. Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А., Гартель А.Л. Использование миниклубней картофеля для получения трансформированных клонов //Сб. докл. Международной конф.

"Биология культивируемых клеток и биотехнология". Новосибирск. 1988. С.192-193.

43. Аветисов В.Л., Мелик-Са ркисов О.С. Использование

гидролитических ферментов в селекции картофеля на устойчивость к грибным заболеваниям //Сб. докл. Международной конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология". Новосибирск. 1988. С.172.

44. Аветисов В. А., Мелик-Са ркисов О.С., Соболькова Г.И. Индукция микроклубнеобразования на регенерантах из каллусов картофеля //С/х биология. 1989. № 5. С.26-29.

45. Гартель А.Л., Мелик-Саркисов О.С., Газарян К.Г. Клонирование гена глюкуронидазы под промотор гена экстенсина моркови //Доклады ВАСХНИЛ. 1989. № 3. С.7-10.

46. Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А., Соболькова Г.И.

Новый интегральный показатель потенциального развития протопластов в культуре in vit.ro //Сб ."Проблемы и перспективы биотехнологии". Братислава. ЧССР. 1989. С.58-60.

47. Мелик-Саркисов О.С., Цоглин Л.Н., Апдреепко Т.И. и др.

Безвирусное семеноводство картофеля (теория и практика) //АПК: достижения науки и техники. 1989. № 9.

48. Витол И.С., Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А. и др.

Использование пероксидазы и глютаматдегидрогеназы в качестве биохимических маркеров в биотехнологических исследованиях на картофеле //Доклады ВАСХНИЛ. 1989. № 10. С.14-16.

49. Цоглин Л.II., Мелик-Саркисов О.С., Тимонипа В.Н. и др. Состояние мембран хлоропластов и фотосинтез картофеля при вирусном патогенезе //Физиология растений. 1989. Т.36. Вып.4. С.693-702.

50. Гартель А.Л., Аветисов В.А., Соболькова Г.И., Мелик-Саркисов О.С. и др. Генетическая трансформация картофеля с использованием бинарного вектора в штамме Agrobacterium tumefaciens //Сб. Всесоюзной конф. по генетике соматических

клеток в культуре, посвященная памяти Н.И.Шапиро. Звенигород. 1989. С.89-90.

51. Мелик-Са ркисов О.С., Фаддеева И.П. Использование эффекта клубнеобразования в биотехнологии картофелеводства //Вестник с/х науки. 1989. № 9 ('379). С.86-92.

52. Гиртель А.Л., Мелик-Саркисов О.С. Трансгенные растения для сельского хозяйства: первые достижения и перспективы //Вестник с/х науки. 1990. № 4. С.57-61.

53. Мелик-Саркисов О.С., Цоглии Л.Н., Витол И.С. и др. Активность пероксидазы из листьев здоровых и пораженных Х-вирусом растений картофеля //Доклады ВАСХНИЛ. 1990. N°. 5. С.25-29.

54. Avetisov V.A., Melik-Sarkisov O.S. Some peculiarities in cultivating protoplasts isolated from callus culture //Abstracts Vll-lh Inlernnat. Congress on Plant Tissue and Cell Culture, Amsterdam. 1990. P.6.

55. Melik-Sarkisov O.S., Avetisov V.A., Sobolkova G.I., Gartel A.L. Genetic transformation of potato with binary vector in Agrobacterium rhizogenes //Abstracts VH-th Internat. Congress on Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam. 1990. P.69.

56. Дубровский И.Г., Аветисов B.A., Мелик-Саркисов О.С. Возможности использования адвентивного побегообразования на корнях в биотехнологии картофеля //Сб. "Регуляторы роста и развития картофеля". Москва: Наука. 1990. С.126-131.

57. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Новый интегральный показатель потенциального развития протопластов картофеля в культуре in vitro //Сб. "Регуляторы роста и развития картофеля". Москва. 1990. С.118-123.

58. Цоглин Л.Н., Мелик-Саркисов О.С., Розанов В.В., Апдреепко Т.И. Фотосинтетическая деятельность инфицированных и свободных от вирусной инфекции растений картофеля в процессе онтогенеза //Сб. "Регуляторы роста и развития картофеля". Москва. 1.990. С.143-150.

59. Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А., Дубровский И.Г., Витол И.С. Множественные формы некоторых оксидоредуктаз у различных видов картофеля //Физиология и биохимия культурных растений. 1990. Т.22. № 3. С.207-301.

60. Мелик-Саркисов О.С., Цоглип JI.IL, Овчинникова B.IL и др. Технология культивирования и размножения регенерантов картофеля. - Методические рекомендации. Москва: ВАСХНИЛ. 1990. 18 С.

61. Melik-Sarkisov O.S., Vitol I.S. Comparison of the biochemical composition of seed producing potato plants grown in vitro 11 Phisiologia plantarum. 1990. Vol. 79. Pt.2. P.41.

62. Гартель A.JI., Аветисов B.A., Соболъкова Г.И., Казанцев А.Г., Газарян КГ., Мелик-Саркисов О.С. Экспрессия гена

глюкуронидазы с сильного растительного промотора в каллусе трансгенного картофеля //Молекулярная биология. 1990. Т.24. Вып.З. С.752-756.

63. Tsoglin L.N., Andreenko T.I., Rozanov V.V., Melik-Sarki-

sov OS. Photosynthetic apparatus of infected and virus-free potato plant //Phisiologia plantarum. 1990. Vol.79. Pt.2. P.311.

64. Melik-Sarkisov O.S., Vitol I.S., Tsoglin L.N., Andreenko T.I., Rozanov V.V. Influence X-potato virus on potato plant

physiology //Physiology plantarum. 1990. Vol.79. Pt.2. P.572.

65. Дубровский И.Г., Витол И.С., Аветисов B.A., Мелик-Саркисов О.С. Изопероксидазный анализ развития побегов на корнях картофеля //Доклады ВАСХНИЛ. 1990. № 11. С.18-21.

66. Avetisov V.A., Melik-Sarkisov OS., Avetisova L.V. Uncommon way of morphogenesis in transformed potato tissue

//Phisiologia Plantarum. 1990. Vol.79. Fasc.2. Pt.2. P.28.

67. Аветисов B.A., Гартель А.Л., Мелик-Саркисов О.С. и др.

Система трансформации картофеля при использовании срезов клубней //Сб. "Биотехнология культивируемых клеток и биотехнология растений". Москва: Наука. 1991. С.99-103.

68. Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н., Витол И.С.

Биохимический анализ миниклубней картофеля, индуцированных в культуре in vitro //С/х биология. 1991. № 1. С.50-56.

69. Avetisov V.A., Steianovich A.M., Melik-Sarkisov O.S. Utilization of cytokinin genes to create potato forms with increased regenerative potential in the in vitro culture. //Plant biotechnology and molecular biology. First Symposium "Trends in plant Biotechnology". 1991. P.120.

70. Melik-Sarkisov O.S., Davidova Yu.V., Avetisov V.A. Creation of partners marked by various signs for the somatic hybridization of potato //Plant biotechnology and molecular biology. First Symposium "Trends in Plant Biotechology". 1991. P. 134.

71. Davidova Yu.V., Melik-Sarkisov O.S., Avetisov V.A., Protsenko M.A. Obtaining of potato clones with increased resistance to fungus infection //Plant biotechnology and molecular biology. First Symposium "Trends in Plant Biotechnology". 1991. P. 159.

72. Габель Б.М., Цоглин Л.Н., Мелик-Саркисов O.C., Чернобровкин С.Л. Установка для ускоренного микрокло-нального размножения растений //Физиология растений. 1991. Т.38. Вып.4. С.801-804.

73. Чережанова Л.В., Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова

B.Н. Цитогенетический эффект Сахаров //Генетика. Т.27. № 8.

C.1372-1378.

74. Гартель А.Л., Аветисов В.А., Соболькова Г.И., Газарян КГ., Мелик-Саркисов О.С. Промотор экстенсина более эффективно действует в каллусе, чем в органах трансгенного картофеля //Молекулярная биология. 1991. Т.25. Вып.5. С.1377-1381.

75. Avetisov V.A., Davidova Yu.V., Melik-Sarkisov O.S. The production of marker form for potato somatic hybridization and their protoplasts culture //8th International Protoplast Symposium. Uppsala. Sweden. 1991. V.82. № 1. P.9.

76. Аветисов В.Л., Стефанович A.M., Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов О.С. Использование shooty-мутанта Agrobacterium lumefaciens для повышения регенерационной активности эксплантатов картофеля в культуре in vilro //Биотехнология. № 6. С.19-22.

77. Мелик-Саркисов О.С., Габель Б.В., Цоглип Л.Н., Черяо-бровкип С.Л. Технология и оборудование для промышленного производства миниклубней картофеля //Вестник с/х науки.

1991. № 12. С.134-137.

78. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С., Давыдова Ю.В., Процеико М.А. Получение резистентных к гидролитическим ферментам клеточных клонов и регенерантов картофеля с повышенной устойчивость к фитофторозу //Биотехнология.

1992. № 1. С. 18-22.

79. Аветисов В.А., Стефанович A.M., Мелик-Саркисов О.С.

Морфогенетическая активность трансгенных и нормальных корней картофеля в культуре in vitro //Биотехнология. 1992. № 2. С.6-9.

81. Рашкович Н.Л., Мартиросян Ю.Ц., Мелик-Саркисов О.С. и др. Потребление питательных веществ инфицированными и свободными от вирусной инфекции растениями картофеля //Известия ТСХА. 1993. Вып.2. С.208-213.

82. Рашкович Н.Л., Мартиросян Ю.Ц., Мелик-Саркисов О.С. и др. Особенности потребления минеральных веществ инфицированными и свободным от вирусной инфекции растениями картофеля //Известия ТСХА. 1993. Вып.З. С.119-126.

83. Рашкович Н.Л., Мартиросян TO.IJ., Сторожепко В.А., Мелик-Саркисов О.С. Особенности потребления нитратного азота инфицированными и оздоровленными растениями картофеля //Известия ТСХА. 1993. Вып.4. С.196-200.

84. Черпобровкипа М.А., Чернобровкин С.Л., Мартиросян Ю.Ц., Розанов В.В., Мелик-Саркисов О.С. Особенности

выращивания миниклубней картофеля в биотехнологической системе //Сельскохозяйственная биология. 1994. № 3. С.65-72.

85. Мелик-Саркисов О.С., Черезканова J1.B., Овчинникова B.IL Экзогенные фитогормоны как фактор цитогенетической изменчивости клеток картофеля в культуре in vitro //Сельскохозяйственная биология. 1994. № 1. С.69-73.

86. Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А. Способ получения микроклубней картофеля in vitro //Авт. свид. № 1376990 от 21.02.86.

87. Мелик-Саркисов О.С., Цоглин Л.Н., Андреенко Т.И., Розанов В.В. Способ культивирования высших растений in vitro //Авт. свид. № 1628249 от 30.03.89.

88. Габель Б.В., Мелик-Саркисов О.С., Цоглин Л.Н., Черно-бровкин С.Л. Устройство для культивирования растений in vitro //Авт. свид. № 1721872 от 29.09.89.

89. Габель Б.В., Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н. и др. Гидропонная установка //Авт. свид. № 1660633 от 28.06.89.

90. Габель Б.В., Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н. и др. Гидропонная установка //Авт. свид. № 1671200 от 28.06.89.

91. Габель Б.В., Мелик-Саркисов О.С., Цоглин Л.Н., Черно-бровкин С.Л. Гидропонная установка //Авт. свид. № 1720593 от 05.07.90.

Подписано в печать 22.11.1995. Объем: 4,0 п.л. Формат: 60x90/16. Гарнитура: Journal, Тираж: 100 экз.

Отдел ("Центр") научной информации ИСКРАН Москва, Хлебный переулок 2/3. Телефон: 203-0403