Влияние фитогормонов и водного дефицита на инициацию, рост клубней и активность белоксинтезирующей системы растений-регенерантов картофеля in vitro

Мирзохонова, Гулби Олтибоевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние фитогормонов и водного дефицита на инициацию, рост клубней и активность белоксинтезирующей системы растений-регенерантов картофеля in vitro
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние фитогормонов и водного дефицита на инициацию, рост клубней и активность белоксинтезирующей системы растений-регенерантов картофеля in vitro"

На правах рукописи

j/rn

Ми/ \

МИРЗОХОНОВА ГУЛБИ ОЛТИБОЕВНА

ВЛИЯНИЕ ФИТОГОРМОНОВ И ВОДНОГО ДЕФИЦИТА НА ИНИЦИАЦИЮ, РОСТ КЛУБНЕЙ И АКТИВНОСТЬ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO

(03.00.12 - физиология и биохимия растений)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Душанбе - 2006

Работа выполнена в Институте физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан

Защита состоится "28" де кабря 2006 г. в II00 часов на заседании диссертационного совета Д 047.001.01 при Институте физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан (734063, г. Душанбе, ул. Айни, 299/2, E-mail: asrtkarimov@mail.ru; lab.gen@mail.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Индиры Ганди АН Республики Таджикистан.

Научный руководитель: член-корреспондент

АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор К.А. Алиев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Абдуллаев Абдуманон,

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Рахмихудоев Гуламад

Ведущая организация:

Таджикский государственный национальный университет

Автореферат разослан " 27 " ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совет" доктор биологических наук

Джумаев Б.Б.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Познание молекулярно-физиологических механизмов адаптации растений в связи с изменениями условий внешней среды и их способности адекватно реагировать на эти изменения связано с пониманием точной и оперативной экспрессии генов. В ответ на действие экстремального фактора происходят адаптационные перестройки в растении с изменением интенсивности синтеза белков и их качественного состава (Thomashov, 1998; Плотников, 1992; Кулаева, Кузнецов, 2003).

Известно, что неспецифическое увеличение трансляционной активности полисом под воздействием обезвоживания связано с увеличением доли тяжелых полисом (Ryazanovetal., 1991). Показано, что стабильность мРНК значительно меняется под влиянием света и засухи у проростков пшеницы (Плотников и др., 2000).

Можно предположить, что модуляция стабильности мРНК в стрессовых условиях является одним из главных факторов системы адаптации растений. Состояние мРНК и трансляционная активность разных классов полирибосом могут в определенной степени влиять на реализацию потенциала продуктивности растений.

Для сельскохозяйственных культур эти вопросы практически не изучены. Для этой цели растение картофеля in vitro является уникальным объектом. Внимание исследователей обращено на принципы регуляции продукционного процесса и защитные реакции растений картофеля при стрессовых воздействиях, особенно фитопатогенов и водного дефицита, физиоло-го-биохимические основы которых далеко не полностью изучены. Одним из подходов является получение мутаций у растений картофеля путем воздействия различными стрессовыми факторами на клеточном уровне, тем или иным образом затрагивающего защитные механизмы - например, к болезням (Delaney, 1997), высоким температурам (Давлятназарова и др., 2003). Другим подходом является получение трансгенных растений, проявляющих повышенную устойчивость к фитопатогенам (Somssich, Hahlbrock, 1998), вирусам (Keen, 1992; Захарьев и др., 1989), гормонам (Аксенова и др., 1999), осмоустойчивость (Kavi Kishor et al., 1995) и т.д.

Контроль за активностью гена может осуществляться на различных уровнях: транскрипции, трансляции, процессинга, транспорта, деградации мРНК и белка. Исследование регуляции генов затруднено несовершенными методиками количественного и качественного анализа функции генов и, самое главное, отсутствием модельных систем растений. С этой точки зрения пробирочные регенераты картофеля являются удобной модельной системой, позволяющей исследовать роль фитогормонов в регуляции роста и развития, определять устойчивость к стрессовым воздействиям и дают возможность изучения их функциональной роли на уровне молекулярно-физиологических процессов в клетках растений.

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы - изучение влияния фитогормонов и водного стресса на инициацию и рост клубней, синтез белков, формирование полирибосомных комплексов и поли (А)-содержащих РНК

в процессе роста и развития регенерантов разных генотипов картофеля in vitro.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

• выявление оптимальных условий микроклубнеобразования растений-регенерантов картофеля in vitro;

• изучение поли (А)-содержащих РНК при гормональном воздействии на различных стадиях клубнеобразования расгений-регенерантов картофеля in vitro;

• изучение полнрибосом регенерантов картофеля in vitro в условиях температурного и водного стресса;

• определение содержания фотосинтетических пигментов при гормональном воздействии на регенеранты картофеля in vitro',

• изучение содержания и активности рибулозо-1,5-бисфосфаткарбок-силазы/оксигеназы (Рубиско) регенерантов картофеля in vitro при температурном и водном стрессе.

Научная новизна. Отчетливо проявились различия в регуляции фазы инициации и фазы роста клубней при использовании ауксинов и цитокининов в культуральных средах выращивания растений картофеля in vitro. Фаза инициации и фаза роста клубней независимо от генотипов картофеля при более высокой концентрации фитогормонов ускоряются при более низком содержании сахарозы в культуральной среде и, наоборот, при низких концентрациях гормонов инициация происходит при более высоком содержании сахарозы в системе in vitro. Регуляция этих процессов связана с активной экспрессией генов и появлением новых белковых компонентов. Влияние фитогормонов на сырую массу клубней (урожай) было эффективным при действии кинетина на рост и НУК на инициацию образования клубней. На начальных этапах инициации столонов доля поли (А)+ последовательностей мРНК выше, чем поли (А)++ мРНК. В период закладки и активного роста клубней наблюдается увеличение доли поли (А)++ мРНК. Количество поли (А)+ содержащих мРНК в эти периоды клубнеобразования не изменяется. Следовательно, на разных этапах формирования клубней проявляется активность разных по набору групп генов. В период инициации столонов и закладки клубней активную роль играют группы генов с короткими поли (А)+ последовательностями мРНК. В фазе интенсивного роста участвуют другие гены- с большим набором поли (А)++ последовательностей мРНК.

Практическая ценность диссертации. Содержание полирибосомных комплексов можно использовать как тест на действие дефицита воды на экспрессию генома и, возможно, стрессов вообше. При получении микроклубней in vitro большое значение имеет соотношение фитогормонов и сахарозы. Разработана биотехнология получения микроклубней картофеля больших размеров с использованием пробирок больших размеров.

Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены/ представлены на следующих конференциях и симпозиумах:

• Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений, Душанбе 2004;

• International symposium Transgenic plants and biosafety, Moscov, 2004;

• Республиканский симпозиум "Экономика и наука Горно-Бадахшан-ской автономной области: прошлое, настоящее, будущее", Хорог, 2005;

• Научно-практическое совещание "Использование оздоровленного материала в семеноводстве картофеля", Муминабад, 2005;

• Международная конференция "Физиологические и молекулярно-ге-нетические аспекты сохранения биоразнообразия", Вологда, - Россия 2005г;

• International Congress Bio Vision Alexandria, 2006.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (3 главы), выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 129 стр., содержит 24 рисунка, 9 таблиц. Количество цитированных источников 137.

Публикации. По материалам диссертаций опубликовано 10 работ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили темперературоустойчивые растения-регенеранты картофеля (Solanum tuberosum L.), полученные на основе сорта Жуковский ранний. В качестве контрольного варианта использовали исходный сорт Жуковский ранний (обозначен как контрольный вариант) и температуроустойчивые растения-регенеранты (ТУ-растения-регенеранты), полученные ранее в лаборатории молекулярной биологии и генной инженерии Института физиологии растений и генетики АН РТ (Давлятназарова и др., 2003).

Растения обоих вариантов размножали клонированием in vitro на среде Мурасиге и Скуга (MC) (Murashige, Skoog, 1962), содержащей витамины, агар, сахарозу (Методические рек., 1985). Растения культивировали при +20...+22°С и 16-часовом освещении люминесцентными лампами белого цвета (60 Вт/м).

Меристемные растения выращивали на питательной среде MC в течение 20-25 дней при 16-часовом фотопериоде и освещении 6000 люкс. Для опытов брали растения, достигшие высоты 5-7 см.

В экспериментах использовали одноузловые черенки с одним листом и высаживали на среду MC, содержащую от 3 до 10 % сахарозы в зависимости от задачи опыта, с добавлением различных концентраций кинетика и НУК. Растения культивировали в течение 20 дней в обычном режиме культивирования in vitro. После этого часть растений переносит! в режим клуб-необразования (культивировали в течение 80 дней при температуре +16°С, при 14-часовом освещении. Еженедельно регистрировали высоту стебля, число образовавшихся клубней и их размер. В конце опыта измеряли также высоту стебля, массу стебля, сырую массу корней, количество клубней, сырую массу клубней в зависимости от размера пробирок, используемых в опытах. В опытах анализировали по 50 растений в 3-х- кратной повторнос-ти. На рисунках и таблицах приведены усредненные значения всех опытов.

Выделение полирибосом. Для выделения полирибосом 1 г сырого веса пробирочных растений (3-4 пробирочных растения) гомогенизировали в 3 мл

5 мМ HEPES буфере pH 7,8, содержащем 10 мМ MgCl,, 1мм фенилметил-сульфонилфторида, при 10000 об./мин в течение 5 мин. К супернатанту добавляли тритон Х-100 до конечной концентрации 0,2 %. По 1 мл необработанного и обработанного тритоном Х-100 супернатанта наносили на линейный градиент сахарозы (10-30 %) и центрифугировали в течение 90 мин при 27000 об./мин в роторе SW41 центрифуги BEKMAN L5-65. Оптическую плотность градиента измеряли при 254 нм, используя оптическую систему ISCO.

Долю полирибосом в % рассчитывали на основании значений оптической плотности площади, занимаемой в градиенте сахарозы, от общей площади градиента.

Выделение РНК проводили следующим образом. 0,5 г образца (пробирочных растений) растирали в стерильной фарфоровой ступке с 2 мл экстрагирующего буфера (3 М NaCl, 0,3 М дигидрат цитрата натрия) и переносили в микропробирку Eppendorf (1,5 мл), нагревали 5 мин и быстро охлаждали на льду (0°.. .-1 °С). Сразу же добавляли ? объема насыщенного фенола и 1/2 объема хлороформа. Тщательно перемешивали на "Вортексе" и помещали в холодильник на 3 - 4 ч, далее центрифугировали 5 мин при 14000 об./мин и осторожно отбирали водную фазу. Фенол-хлороформовую очистку повторяли еще один раз с добавлением 1/2 объема изоамилового спирта и центрифугировали для отделения водной фазы. Водную фазу осторожно отделяли и РНК осаждали тремя объемами холодного этилового спирта. Суммарную РНК отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 14000 об./мин. Осадок промывали чистым холодным ацетоном, высушивали и РНК растворяли в стерильной дистиллированной воде.

Поли (А)-содержащие мРНК определяли в ходе двухстадийной аффинной хроматографии на поли (и)-Сефарозе. Поли (А)++ мРНК элюировали при +60°С, поли (А)+ мРНК (однократная очистка) элюированием при +30°С с буфером (0,1 м трис-HCl, pH 7.8, 0,012М MgCL,). Соотношение молекул мРНК с короткими и длинными поли (А)-последовательностями на З'-конце определяли в ходе термальной ступенчатой элюции с колонки поли (U)-Ce-фарозы при температуре +30°С и +60°С соответственно. Содержание РНК определяли исходя из пропорции 22,0 Е2540,5=1мг РНК.

В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические значения всех опытов.

Определение содержания пигментов. Для определения содержания пигментов использовали ацетоновую вытяжку. Для этого 0,1 - 0,2 г исследуемого растительного материала растирали в ступке холодным ацетоном до гомогенной массы со стеклянным песком. Гомогенат фильтровали через стеклянный фильтр (№3). Объем экстракта доводили до 3 мл ацетоном.

Спектры поглощения пигментов измеряли на спектрофотометре LKB Ultrospec- II при 662 нм, 644 нм и 720 нм. Содержание пигментов (мкг/мл) рассчитывали по формуле (Шлык, 1971):

- содержание хлорофилл а: хла = 9,784 х Е66, - 0,990 х Е^,

- содержание хлорофилл Ь: хль = 21,426 х Е^ - 4,650 х Е66Г

Работу проводили на регенерантах картофеля (Solanum tuberosum L.) сортов Жуковский ранний, Кардинал, Пикассо и температуроустойчивых растениях-регенерантах (ТУ-растения-регенеранты). Пробирочные растения выращивали в термостатируемой комнате (+20...+24°С), освещенность 6000 лк, влажность 80 % при 16-часовом фотопериоде. Клубнеобразование пробирочных растений осуществляли на среде MC с добавками различных концентрации кинетина (0,1 мг и 1,0 мг), НУК (0,1 мг и 1,0 мг), 5 и 9 % сахарозы при короткодневном фотопериоде.

Выделение белков. Анализ суммарных белков проводили на побегах пробирочных растений картофеля in vitro. Белки выделяли с использованием буфера, содержащего 50 мМ Трис pH 8,2; 2 мМ ЭДТА; 5 мМ дитриото-ла; 3 % сахарозы. Материал быстро растирали в фарфоровой ступке с добавлением (1 мл) буфера на холоде и центрифугировали при 14 000 об.//мин в течение 10 мин в центрифуге типа-320а.

Концентрацию белков определяли по Бредфорду (Bredford, 1976) с использованием красителя кумасси G-250 (Serva). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Спектрометрические измерения проводили на приборе LKB Ultrospek - II (Швеция) при 595 нм. При электрофорезе на стартовые участки геля наносили одинаковое количество белка.

Электрофорез белков. Суммарный электрофорез белков пробирочных растений проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 0,1 % додецильсульфата натрия (ДДС-Na) по методу Лэммли (Laemmli, 1970) на приборе для электрофореза (США) модели 4027, с охлаждением Мультитемп II (Швеция), источник питания модели 2197 LKB (Швеция). Электрофорез проводили в вертикальном приборе при напряжении 200 В, постоянной силе тока 50 мА. Перед нанесением образцы белков нагревали 2-3 мин в кипящей водяной бане и быстро центрифугировали при 14000 об./мин в течение 5 мин. Гель фиксировали в 10 % трихлоруксусной кислоте (ТХУ) и окрашивали 0,05 % кумасси R250 ("Sigma") в 40 % этаноле, содержащем 10 % уксусной кислоты. Гель отмывали 7 % уксусной кислотой 2-3 раза. В качестве маркеров использовали: РНК-азу (12,1 кД), карбоангидразу (29 кД), овальбумин (45 кД), альбумин (67 кД). Все белки от фирмы "Sigma", США.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Инициация и рост клубней регенерантов картофеля in vitro

Как видно из данных рис. 1, кинетин существенно влияет на инициацию клубней как у исходного сорта Жуковский ранний, так и у ТУ-растений-регенерантов картофеля. Уровень этих процессов во многом определяется соотношением концентрации сахарозы и кинетина в культуральной среде и чувствительностью генотипа растений к этим факторам клубнеобразова-ния. Высокая стимуляция инициации клубней кинетином проявилась при содержании сахарозы от 5 % до 7 % у исходного сорта Жуковский ранний (контроль) и у ТУ-растений-регенерантов от 7 % до 9 % сахарозы, т. е. каж-

дому генотипу свойственна различная чувствительность к концентрации сахарозы. Кроме того, инициирующий эффект кинетина зависел не только от концентрации сахарозы, но и от концентрации кинетина в культуральной среде. Так, при низких концентрациях кинетина высокий уровень инициации клубнеобразования был при более высокой концентрации сахарозы (57 %), тогда как при более высокой концентрации кинетина инициирующая активность проявилась при более низких концентрациях сахарозы (3-5 %). Действие НУК на инициацию образования клубней оказалось более сильным и однообразным. На фоне низкого содержания сахарозы для культивирования исходного сорта Жуковский ранний и ТУ-растений-регенерантов наблюдалась стимуляция инициации клубней под действием НУК (рис. 1). При 3 % содержании сахарозы концентрация НУК практически не оказывала влияния на инициацию клубней у обоих генотипов картофеля. При более высокой концентрации сахарозы эффект от действия НУК проявлялся только у исходного сорта Жуковский ранний (контрольный вариант), тогда как у ТУ-растений-регенерантов НУК не оказывала существенного влияния на инициацию образования клубней. Необходимо отметить некоторые особенности реакций каждого генотипа на инициацию образования клубней под влиянием НУК. У ТУ-растений-регенерантов НУК оказывала существенное влияние при более высокой концентрации сахарозы (7-10 %), тогда как у исходного сорта Жуковский ранний эффект от действия НУК проявился при 5-7 % содержании сахарозы.

о -,-,-,-,---,-,-,-,-,-

3. 5. 7. 9. 10. 3. 5. 7. 9. 10.

Сахароза, %

Рис.1. Влияние фитогормонов на инициацию образования клубней при различной концентрации сахарозы. 1. Без гормонов; 2. НУК (0,5 мг/л); 3. Кинетин (0,021 мг/л); 4. НУК (0,5 мг/л) + Кинетин (0,2 мг/л). А - исходный сорт Жуковский ранний; Б- ТУ-растения-рсгенеранты.

Итак, обнаружена обратная зависимость действия гормонов и углеводов на инициацию дифференцировки клеток столонов, в результате чего происходит активизация морфогенетической потенции и увеличение продуктивности растений.

В обоих вариантах опытов (контрольный - исходный сорт Жуковский ранний и опыт температуроустойчивые-растения-регенеранты) НУК существенно стимулировала рост клубней. Так же, как при инициации образования клубней, уровень стимуляции роста клубней под влиянием НУК зависел от содержания сахарозы в культуральной среде выращивания регене-рантов. Рост клубней также зависел от генотипа растений.

Таким образом, полученные результаты показали, что действие ауксинов и цитокининов на ростовые процессы и морфофизиологические реакции растений регенерантов на уровне гормональной регуляции фазы инициации и фазы роста клубнеобразования картофеля in vitro различно.

Наиболее значимые результаты получены при действии ауксинов и цитокининов на сырую массу клубней регенерантов картофеля (табл. 1).

Таблица 1

Влияние фитогормонов на сырую массу клубней регенерантов картофеля in vitro (мг/растение)

Варианты опыта Без фитогормонов +НУК (0,5мг/л) +Кинетин (0,2мг/л) НУК + кинетин (0,5+ 0,2мг/л) Максимальная масса одного клубня

Контроль (сорт Жуковский) 117±12 234±41 224±38 347±46 893±47

Опыт (температуро-устойчивые-растения-регенеранты) 82±7 181+33 169±31 229±29 367±49

Как показали результаты экспериментов (табл. 1), действие цитокининов при пороговом содержании сахарозы в культуральной среде на урожай клубней отчетливо отличалось.

Общая масса и размер клубней увеличивались на средах с низким содержанием сахарозы, НУК и кинетина. Действие кинетина в отдельности на эти процессы было значительно сильнее. Наиболее выраженное действие НУК было отмечено у исходного сорта Жуковский ранний, тогда как у ТУ-растений-регенерантов действие НУК менее выражено даже при оптимальной концентрации сахарозы в культуральной среде. ,

Таким образом, фаза инициации и фаза роста клубней требуют различных концентраций фитогормонов, и эти процессы зависят от концентрации сахарозы в культуральной среде. Уровень потребности растений в этих веществах имеет генотипическую зависимость. Вместе с тем, следует особо отметить, что сахароза в комплексе с фитогормонами может играть в процессе клубнеобразования двоякую роль: индуцирующую и энергетическую (образование новых клеток в процессе морфогенеза). Более того, индуциру-

ющая роль сахарозы в сочетании с действием ауксина важна для инициации процессов клубнеобразования, тогда как энергетическая в сочетании с действием цитокинина больше имеет значение для их роста.

Инициация и рост клубней независимо от генотипов картофеля при более высокой концентрации фитогормонов ускоряются при более низком содержании сахарозы в культивируемой среде и, наоборот, при низких концентрациях гормонов инициация происходит при более высоком содержании сахарозы в системе in vitro.

Можно предположить, что фитогормоны и углеводы инициируют активацию одних и тех же генов, которые регулируют фазы инициации и фазы роста клубней. Проверка данного предположения стала задачей следующих наших экспериментов.

Синтез белков у растений-регенерантов картофеля в процессе роста растений и инициации столоно-клубнеобразования in vitro

Для анализа синтезируемых белков пробирочных растений использовали методы гель-электрофореза в денатурирующих условиях (0,1% доде-цильсульфат натрия).

Нами в работе (Мирзохонова и др., 2004) было показано, что рибосомы обратимо связаны с мРНК при снятии действия водного дефицита растений картофеля. Было выдвинуто предположение, что ассоциация и диссоциация полисом носят адаптивный и генотипический характер. При создании водного дефицита у одних генотипов происходило разрушение полисом, у других полисомы мигрировали в области низких концентраций градиента сахарозы. В этих условиях важно было уточнить качественные и количественные характеристики белков растений, мигрирующих вверх при центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы.

Предполагается, что среди этих белков могут находиться регулятор-ные белки, играющие важную роль в трансляционной активности рибосом. В зависимости от гормонального и углеводного воздействия может активироваться экспрессия различных групп генов, ответственных за процесс инициации столоно-клубнеобразования и изменения размера клубней в условиях in vitro.

Белки на ПААГ распределялись в диапазоне от 10 до 90 кД, что соответствует результатам работы (Rajapakse et al., 1991), проведенной на микроклубнях картофеля. Анализ белков позволил выявить некоторые различия в вариантах с использованием кинетина и НУК. Эти различия между вариантами обнаружились в опыте с белками с молекулярной массой 22кД, 27кД, 53Кд, 70кД, 90кД, интенсивность которых менялась от наличия в культуральной среде кинетина или НУК.

В этих условиях было выявлено три группы белков, состоящих из 2 - 3 компонентов с молекулярной массой 22кД, 27кД, 50кД и 70кД (табл. 2).

Таблица 2

Пептиды, синтезируемые растениями-регенерантами in vitro

Rr М.м., кД Сорт, линии

ТУ-растение-регенерант Жуковский ранний Пикассо Кардинал

1 2 1 2 1 2 1 2

0,13 100 - - - - + + + +

0,15 90 + + + + + + + + + + + + + +

0,16 84 - + - + - + - +

0,17 80 - + - + - + - +

0,19 78 + + + + + + + + + -

0,24 70 + + + + + - + + + + + + + +

0,22 67 + - + - + - + -

0,25 58 + + + + + + + +

0.30 50

0,32 48 + + + + + + + + + + + + +

0,35 44 + + + + + + + +

0,40 34

0,58 27 + + + + + + + + + + + + + + +

0,56 23

0,55 22 + + + + + + - + +

0,63 17

0,70 12 + + + + + + + +

0,72 10 + + + + + + + +

На электрофореграмме отчетливо были видны белковые компонеты с молекулярной массой 53кД, 70кД, 78кД, 27кД, 22кД. Интенсивность этих белковых зон неодинакова в разных фазах развития растений. Эти белковые зоны более интенсивные в фазе столоно-клубнеобразования по сравнению с фазой роста растений. В фазе столоно-клубнеобразования появляется ряд других белковых компонентов, которые не заметны в фазе роста растений. К таким относятся белки, расположенные в области 45 и 29 кД, и белки с молекулярной массой 57кД. Эти данные указывают на то, что набор белковых компонентов фазы роста растений существенно отличается от набора белков фазы столоно-клубнеобразования. На этой фазе развития растений in vitro появляются дополнительные белковые компоненты, характерные только для фазы столоно-клубнеобразования. Для всех этапов развития растений in vitro характерен стабильный синтез двух белковых компонентов, относящихся к 53 кД и 27 кД. Белок с молекулярной массой 53 кД, видимо, относится к большой субъединице ключевого фермента фотосин-

теза - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Рубиско), а белок с молекулярной массой 27 кД - это белок потатин.

Изменения белковых компонентов при электрофорезе в условиях денатурации, видимо, обусловлены изменением на уровне синтеза РНК, особенно фракций поли (А)-содержащих РНК. Содержание общей РНК растений картофеля резко возрастает при добавлении в культуральную среду фито-гормонов: цитокинина и ауксина. В этих условиях содержание общей РНК возрастает примерно в два раза. Общее содержание РНК в условиях фито-гормонального воздействия в фазе роста и фазе столоно-клубнеобразова-ния практически одинаково. Возможно, некоторые из этих белков играют регуляторную роль в процесе трансляции.

Вместе с тем, следует отметить, что увеличение содержания фракций поли (А)-содержащих РНК наблюдается в фазе столоно-клубнеобразова-ния. Это, очевидно, указывает на то, что в фазе столоно-клубнеобразова-ния происходит переключение новых групп генов и, следовательно, синтез белков, регулирующих процесс столоно-клубнеобразования.

Таким образом, изменения в наборе белковых компонентов обусловлены изменением активации транскрипционной системы клетки в условиях не только фитогормонального воздействия, но и, видимо, в обычных условиях, что и послужило предпосылкой постановки следующих опытов.

Действие гормонов на трансляционную активность полирибосом и ноли (Л) последовательностей мРНК у регенерантов картофеля in vitro

Разделение суммарной РНК с помощью ступенчатой аффинной хроматографии на поли (и)-Сефарозе позволило оценить долю поли (А)++- и поли (А)+- последовательностей мРНК от общей суммы РНК клеток при различных условиях культивирования регенерантов в условиях in vitro. Этот показатель достаточно полно отражает уровень эффективности экспрессии той или иной группы генов.

Как видно из данных рис. 2, характер изменения поли (А)-содержащих мРНК по мере формирования клубней в условиях in vitro не одинаков. На начальных этапах инициации столонов доля поли (А)+ последовательностей мРНК выше, чем поли (А)++ мРНК. В период закладки и активного роста клубней наблюдается увеличение доли поли (А)++ мРНК. Количество поли (А)+ содержащих мРНК в эти периоды клубнеобразования не изменяется. Следовательно, можно сказать, что на разных этапах формирования клубней проявляется активность разных по набору групп генов. В период инициации столонов и закладки клубней активную роль играют группы генов с короткими поли (А)+ последовательностями мРНК. В фазе интенсивного роста участвуют другие гены с большим набором поли (А)++ последовательностей мРНК. К такому выводу мы пришли на основании использования метода ступенчатой термальной элюции с колонки поли (и)-Сефарозы, поскольку при температуре +30°С элюируются молекулы мРНК с короткими поли (А) последовательностями, а при +60°С молекулы с относительно длинными поли (А)-последовательностями.

Характер изменения поли (А)-содержащих мРНК показал, что степень их вариации под действием гормонов специфична для каждого сорта.

Фаза инициации клубней

Рис. 2. Изменение поли (А)-содержащих компонентов РНК в ходе роста клубней регенерантов картофеля в условиях in vitro (Сорт Жуковский ранний). 1. 20-дневные пробирочные растения; 2. Начало образования столонов (фаза столонообразования); 3. Начало закладки клубней (фаза инициации); 4. Активный рост клубней (фаза роста). I-поли (А) +; Н-поли (А ) ++.

Добавление гормонов и углеводов в культуральную среду приводит к увеличению содержания поли (А)-последовательностей в разной степени (табл.3).

Таблица 3

Действие гормонов на содержание РНК у регенерантов картофеля сорта Жуковский ранний

Варианты опыта Суммарное содержание РНК (мкг/г сырого веса) Поли (А) РНК (мкг/г сыр. веса), элюции при Отношение поли (А) ++ к поли (А)+ % мРНК от общей РНК Масса клубней на растении, мг

30°С 60°С

Контроль (5% сахарозы) 11,3±1,7 0,089 0,029 0,4 97±21

+0,5мг/л НУК 20,4±3,8 0,068 0,560 3,2 3,6 462±43

+0,2мг/л кинетина 22,8±4,2 0,068 0,111 1,4 1,1 289±22

+0,5мг/л НУК+0,2мг/л кинетина 25,7±5,8 0,077 0,420 5,9 2,2 471±47

Имеются сведения, что длина поли (А)-последовательностей у мРНК определяет морфогенетическую потенцию растений (Плотников и др., 2000). Кроме того, длина поли (А)-последовательностей играет важную роль в стабилизации мРНК и трансляционной активности: чем длиннее последовательность поли (А), тем устойчивее мРНК и тем выше трансляционная активность (Morelli et al., 1994), т.е. она является энхансером трансляции.

В ряде работ отмечена существенная роль гормонов в трансляционной активации растений (Алиев, 1998; Альберте и др., 1998; Плотников и др., 1998; Кулаева, Кузнецов, 2003).

Мы изучали влияние гормонов (НУК, ИУК, кинетина) на степень по-лиаденилирования мРНК регенерантов картофеля в системе in vitro. Гормоны, вносимые в культуральную среду в оптимальных концентрациях с одновременным добавлением сахарозы в оптимальной концентрации (5 %), не одинаково стимулируют процесс полиаденилирования мРНК (табл. 3).

Отношение поли (А)++ к поли (А)+ - последовательностям мРНК у контрольного варианта составляет 0,4. Добавление кинетина в культуральную среду незначительно повышает отношение этих форм мРНК и соответствует 1,4. При добавлении НУК в культуральную среду отношение поли (А)++ к поли (А)+-последовательносги составляет 8,2, а при совместном использовании кинетина и НУК в культуралыюй среде это значение составляет 5,9 (табл. 3). Следует особо отметить, что степень полиаденилирования мРНК под действием гормонов зависит от наличия в культуральной среде углеводов (5%). Напротив, при отсутствии или низкой концентрации углеводов (1-2%) в культуральной среде степень полиаденилирования мРНК остается низкой, т.е. доля длинных поли (А)++-последовательностей не увеличивается даже в фазе активного роста клубней. Обшее содержание поли (А)-содержащих РНК колеблется от 1 до 3 % в зависимости от наличия гормонов при оптимальной концентрации сахарозы (5 %), необходимой для активного клу бнеобразования.

Одним из способов оценки состояния белоксинтезирующего аппарата в растениях является определение соотношения полирибосом и рибосом, что характеризует соотношение скоростей инициации и элонгации при синтезе белка. Добавление в культуральную среду гормонов и углеводов в разных соотношениях может влиять на трансляционную активность посредством формирования различных по размеру полисом.

В табл. 4 представлены результаты по определению доли полирибосом в препаратах рибосом в различных условиях культивирования регенерантов картофеля. Можно видеть, что при изменении углеводного статуса и неизменной концентрации гормонов (НУК, кинетин) в период активного роста клубней у регенерантов происходит существенное изменение доли полирибосом, которая колеблется от 30% до 68% в зависимости от генотипа и концентрации сахарозы. При повышении концентрации углеводов до 9% в культуральной среде у всех генотипов картофеля происходит диссоциация большей части полирибосом. Усиление диссоциации полирибосом наблюдается во всех вариантах эксперимента при высокой концентрации углеводов, особенно при наличии в культуральной среде НУК.

Таблица 4

Содержание полирибосом и поли (А)-содержащих РНК у различных генотипов картофеля в зависимости от содержания углеводов и гормонов

Варианты опыта Полирибосомы, % Сумарное содержание поли (Л) РНК (мг/г сыр. веса)

Сорт Жуковский ранний

+Кинетин (0,2мг/л +5% сахароза) 61,8 0,944±0,049

+Кинетин (0,2мг/л +9% сахароза) 50,4 0,08410,013

+НУК (0,5мг/л +5% сахароза) 65,0 0,99110,074

+НУК (0,5мг/л + 9%сахароза) 42,2 0,05310,017

Сорт Кардинал

+ Кинетин (0,2мг/л 5% сахарозы) 66,6 0,83710,029

+Кинетин (0,2мг/л+ 9%сахароза) 53,7 0,07310,016

+НУК (0,5мг/л +5% сахароза) 59,9 0,89710,049

+НУК (0,5мг/л +9% сахароза) 32,7 0,05310,012

ТУ-растения-регенеранты*

+Кинетин (0,2мг/л +5% сахароз+) 60,3 0,38910,022

+Кинетин (0,2мг/л+ 9% сахароза) 40,7 0,03710,013

+НУК (0,5мг/л+ 5% сахароза) 57,7 0,54310,071

+НУК (0,5мг/л+ 9%сахароза) 30,9 0,08410,0191

* ТУ-растения-регенеранты (температуроустойчивые-растения-регенеранты)

Формирование полирибосом в присутствии кинетина несколько выше, чем при добавлении НУК.

Таким образом, представленные в работе данные свидетельствуют о том, что в процессе инициации и роста клубней в системе in vitro функционируют разные по длине поли (А)-последовательности мРНК. Их трансляционная активность зависит от наличия гормонов в культуральной среде выращивания регенерантов. Активация полирибосомной системы также зависит от наличия в среде выращивания гормонов, действие которых регулируется дозой углеводов.

Возможно, нормальный ход транскрипции и трансляции в клетке в определенной мере регулируется наряду с другими факторами соотношением

гормонов и углеводов, нарушение которого приводит к изменению регуляции экспрессии генов. Кроме того, обнаруженный ранее (Мирзохонова и др., 2004) факт обратной зависимости действия гормонов и углеводов на инициацию дифференцировки сголоновых клеток, а также полученные результаты по разной экспрессии генов в онтогенезе растений свидетельствуют о том, что в сложном механизме активации морфогенетической потенции сголоновых клеток определенное значение имеет накопление физиологически значимой дозы гормонов и углеводов в клетке.

Содержание фотосинтетических пигментов у генотипов картофеля при культивировании в условиях in vitro

При культивировании регенерантов картофеля на среде с различными концентрациями фитогормонов и сахарозы наблюдались некоторые мор-фофизиологические изменения.

При высоких концентрациях фитогормонов и сахарозы регенеранты характеризовались необычным фенотипом: регенеранты 3-4 -недельного возраста имели ярко выраженное потемнение листьев, уменьшенный рост и укороченные корневые волоски. Следует отметить, что ТУ-растения-реге-неранты заметно отличались от контрольных по ряду ростовых показателей, особенно при 9 % сахарозы и 0,1 мг цитокинина (кинетин) или 1,0 мг ауксина (НУК) в культуральной среде. ТУ-растения-регенеранты характеризовались более высоким ростом и развитыми корневыми волосками. При повышенной концентрации кинетина (1,0 мг/л) и сахарозы (9%) наблюдалось различное влияние на образование корневой системы, микроклубней и листьев. Так, у листьев сорта Жуковский ранний были заметны потемнения по краям листа и растения имели укороченный стебель. Корни формировались в пазухе нижних стеблей, микроклубни не формировались. У расте-ний-регенерантов сорта Кардинал наблюдалось утолщение стебля, уменьшение листовой пластинки, корни формировались в пазухе нижнего стебля, микроклубни имели темный цвет.

При низкой концентрации сахарозы (4 %) и кинетина (0,5 мг) у всех изученных сортов и линий наблюдалось образование микроклубней. Необходимо отметить, что у растений-регенерантов сортов Жуковский ранний и Кардинал наблюдалось раннее пожелтение листьев, а у ТУ-растений-регенерантов листья были темно-зелеными.

В условиях выращивания регенерантов при 4 % сахарозы и 1,0 мг кинетина существенных морфологических изменений у всех использованных в опыте сортов и линий картофеля не наблюдалось (Жуковский ранний, Кардинал, ТУ-растения-регенеранты).

При низких концентрациях сахарозы (4 %) и высокой концентрации НУК (1,0 мг/л) наблюдались различные морфологические изменения у использованных в опыте сортов и линий. В этих условиях резко уменьшилось корнеобразование у ТУ-расгений-регенерантов, но наблюдалось образования микроклубней, тогда как у растений-регенерантов сорта Жуковский ранний усиливалось образование корневой системы, но не наблюдалось

образование микроклубней. А у растений-регенерантов сорта Кардинал наблюдалось образования корневой системы и микроклубней.

Наблюдаемые морфологические изменения в этих условиях могут быть обусловлены изменениями фотосинтетических показателей.

Так, у ТУ-растений-регенерантов заметное повышение содержания как хлорофилла а, так и хлорофилла Ь имело место при повышенных концентрациях сахарозы (9 %) и низких концентрациях ауксина (НУК - 0,1 мг). Повышение концентрации ауксина (1мг) и сахарозы (9 %) также оказывало стимулирующий эффект на синтез хлорофиллов (а и Ъ). Вместе с тем, следует отметить, что при низких концентрациях кинетина (0,1мг) и низких (5 %) и высоких концентрациях сахарозы (9 %) существенного усиления синтеза-хлорофиллов (а иЬ) не происходило, так как в этих условиях культивирования регенерантов содержание хлорофиллов было примерно в 2 раза меньше, чем в присутствии НУК. Некоторое стимулирование синтеза хлорофиллов было при повышенных концентрациях кинетина (1 мг) и сахарозы (9 %) у ТУ-растений-регенерантов. Особо необходимо отметить, что отношение хлорофиллов Ь/а во всех вариантах эксперимента составляло приблизительно 1/3. У ТУ-растений-регенерантов некоторое усиление синтеза хлорофилла наблюдалось при повышенном содержании сахарозы (9 %).

Иначе реагируют на изменение содержания сахарозы, цитокинина и ауксина растения-регенеранты исходного (контрольного) сорта Жуковский ранний. При всех концентрациях кинетина (0,1 или 1 мг), НУК (0,1 и 1 мг)и сахарозы 5 или 9 % в культуральной среде не наблюдалось заметного увеличения содержания хлорофиллов (а и Ь). Наоборот, увеличение содержания сахарозы в культуральной среде (9 %) оказывало ингибирующее действие на синтез фотосинтетических пигментов у контрольных растений. Увеличение содержания хлорофиллов (а и Ь) наблюдалось только лишь в условиях пониженного содержания сахарозы (5 %) и повышенного содержания кинетина в культуральной среде. Причем, наблюдаемое увеличение содержания хлорофиллов характерно только при низких концентрациях сахарозы (5 %) в сочетании с низким (0,1 мг) или высоким (1 мг) содержанием кинетина у исходного-контрольного варианта (сорт Жуковский ранний). Особо необходимо отметить усиление синтеза хлорофилла Ь при высокой концентрации кинетина (1 мг) и низком содержании сахарозы (5 %) у контрольного варианта.

У растений сорта Кардинал наивысшее содержание фотосинтетических пигментов было при низких концентрациях НУК (0,1мг) и высоком содержании сахарозы (9 %) в культуральной среде. Повышение концентрации НУК или кинетина (от 0,1 до 1мг) и сахарозы (5 или 9 %) не оказывало заметного эффекта на синтез хлорофиллов (а и Ь). Но низкая концентрация кинетина (0,1мг) и низкая концентрация сахарозы (5 %) несколько усиливали синтез хлорофиллов, особенно хлорофилла а.

Таким образом, отмеченные нами морфологические и фенотипические изменения у ТУ-растений-регенерантов и у контрольных сортов картофеля (Жуковский ранний, Кардинал) при выращивании их в условиях с различ-

ным содержанием фитогормонов и сахарозы in vitro позволили установить, что высокая концентрация сахарозы в сочетании с фитогормонами приводит к изменению образования фотосинтетических пигментов в растительных клетках. Причем, их воздействие на содержание фотосинтетических пигментов высокоспецифично и зависит от генотипа растения. Содержание хлорофилла b в регенерантах составляет приблизительно 1/3 часть от суммы хлорофил-лов. У всех исследованных сортов и линий ТУ-растений-регенерантов значения этого коэффицента были близки. Это имело место только при определенном соотношении фитогормонов и сахарозы в культуральной среде выращивания регенерантов in vitro. Полу четшые данные указывают на то, что содержание фотосинтетических пигментов отражает сортовые особенности, а снижение или увеличение содержание каждого пигмента (а и Ь) не всегда приводило к изменению соотношения между хлорофиллом а и общей суммой хло-рофиллов. Изменения соотношения хлорофиллов а/b в регенерантах коррелируют с сортовыми различиями по продуктивности. Имеется определенная корреляция между продуктивностью пробирочных растений (клубневой продуктивностью) и отношением хлорофиллов а/b: чем выше коэффицент а/Ь, тем ниже клубневая продуктивность и, наоборот. Такая тенденция имела место у всех изученных сортов и линий картофеля в условиях in vitro, что, возможно, связано с изменением деятельности фотосинтетического аппарата в условиях гормонального и углеводного воздействия. Необходимо заметить что корреляция между отношением хлорофиллов а/b и урожайностью наблюдается до определенного значения.

Вместе с тем, необходимо констатировать, что между общим содержанием хлорофиллов и продуктивностью на уровне пробирочных растений не обнаруживается прямой корреляции, что характерно для всех изученных сортов и линий регенерантов картофеля in vitro.

Можно также предположить, что высокая концентрация углеводов в культуральной среде влияет на отношение содержания хлорофиллов b/а (по сравнению с фитогормонами), и это является одной из причин нарушения функции фотосинтеза и отражается на продуктивности.

Действие водного стресса на содержание полирибосом растений - регенерантов картофеля

Устойчивость растений к стрессовым экологическим факторам среды является сложным молекулярно-генетическим процессом, связанным с изменением синтеза многих белков и их качественного состава в клетках растений. Нормальный рост и развитие растений в экстремальных условиях зависит от их способности адекватно реагировать на изменение внешних условий, от точной и оперативной регуляции экспрессии многих генов. Количество и состав мРНК также зависит как от частоты транскрипции гена, так и от нормы распада мРНК в составе полирибосомных комплексов.

Известны два противоположных мнения в отношении полирибосомных комплексов при действии экстремальных внешних факторов. Одни считают, что неспецифическое увеличение трансляционной активности поли-

сом проростков злаков in vitro связано с увеличением доли тяжелых полисом (Киль и др., 1991; Морелли и др., 1994). Другие считают, что низкая температура и гипоксия коррелируют с появлением в клетках растений коротких, легких полисом, увеличением синтеза и накоплением растворимого фактора элонгации. Вместе с тем, стабильность мРНК в составе полирибосом в созревшем зерне кукурузы подвергается изменению под влиянием засухи, инсоляции (Плотников и др., 2000).

Исходя из этих результатов, можно предположить, что модуляция стабильности мРНК в составе полирибосом является одним из центральных компонентов системы адаптации растений к экстремальным внешним условиям среды через изменение физиологического состояния организма в целом.

В связи с этим одной из задач нашей работы было изучение действия водного дефицита на полисомную систему регенерантов картофеля.

На рис. 3 представлены данные по фракционированию гомогенатов из пробирочных растений-регенерантов картофеля в градиенте сахарозы. Видно, что во фракциях 18 - 22, т.е. в лёгкой зоне градиента сахарозы сосредоточен рибосомный материал, в то время как полисомный материал распределён в более плотной части градиента. Полисомный материал занимает более обширную зону градиента: 4-15 фракции. При обработке гомогена-та тритоном Х-100 полисомный материал занимает более узкую зону градиента, т.е. происходит заметное уменьшение пика, а рибосомная зона резко возрастает вследствие разрушения мембранных систем клетки и полисом. В этом случае полисомный материал составляет примерно 20 % от необработанного материала.

Содержание полисомного материала также сильно уменьшается при подсушивании регенерантов в течение 1,5 - 2,0 ч при температуре +41 °С. В этом случае полисомный пик составляет около 15 - 22% от контрольного варианта. В норме полисомный материал занимает около 80 % зоны градиента сахарозы. Таким образом, эти результаты указывают на то, что при водном дефиците происходит резкое уменьшение количества полисомного материала в клетке, вследствие чего происходит падение белоксинтезиру-ющей активности клетки. Этот процесс прямо зависит от состояния водного гомеостаза клетки, и восстановление его быстро происходит при переносе растений на среду с 6-бензиламинопурином (БАП). В присутствии БАП и при восстановлении водного режима происходит резкое увеличение количества полисом. Следует отметить, что доля полисом при обработке проростков БАП составляло 44 - 47 %, а при восстановлении водного дефицита она составляла около 58 - 64 % от контрольного варианта.

номер фракций

Рис. 3. Влияние обезвоживания на седиментационное распределение полирибосом регенеранта картофеля в градиенте сахарозы (10-30%). А. Контрольный вариант (не подвергнутый подсушиванию). Б. При подсушивании растений в течение 2ч. В. Обработка проростков БАЛ (1м?У1л). 1. Обработанные препараты тритоном Х~ 100 (0,2%). 2. Необрабопшнные препараты тритоном Х-100

Таким образом, в наших опытах показано, что общее содержание полисом в тканях растений, подверженных внешним стрессовым воздействиям (водному дефициту), восстанавливается до определённого уровня при восстановлении водного гомеостаза, и этот процесс усиливается при добавлении в среду БАП. Восстановление полисом после обезвоживания растений примерно одинаковое как у картофеля сорта Жуковский ранний, так и у температуроустойчивой линии, но доля полисомного материала у ТУ-растений-регенерантов несколько выше, чем у исходного сорта.

Как видно из данных табл. 5, накопление мембраносвяза! шых Рубиско тесно связано с формированием полирибосомного материала в клетке. Усиление образования полирибосом сопровождается увеличением содержания мембра-носвязанного Рубиско и, i гаоборот, уменьшение полирибосом приводит к сш оке-нию доли этой формы фермента хлоропласгов. Взаимосвязь полирибосом и ферментных комплексов хлоропласгов напрямую зависит от состоя! шя водного гомеостаза тканей растений. Даш 1ые табл. 5 показывают, что между содержанием полирибосом и состоянием фермент-мембранного комплекса имеется прямая зависимость и этот процесс находится в корреляции с гомеосгазом растительной клетки. На общее содержание фермент-мембранного комплекса и полирибосом большое влияние оказывают фитогормоны. Так, например, при добавлении в среду выращивания регенерантов в условиях in vitro БАП происходит увеличение не только доли полирибосом, но и содержания фермент-мембранного комплекса хлоропласгов (Рубиско). Формирование полирибосом и ферми ггных комплексов не является сортовым признаком, т.к. достоверная разница между сортом Жуковский ранний и ТУ расгений-регенерантов по этим физиологическим показателям практически не обнаруживается.

Таким образом, полирибосомы являются одним из первичных, чувствительных к водному дефициту (обезвоживанию) звеньев белок-синтезирую-щих систем растений.

Таблица 5

Влияние обезвоживания на содержание полисом и Рубиско у растений- регенерантов картофеля

Вариант ! %полисом % Рубиско

Сорт Жуковский ранний ТУ растенин-регснеранты Сорт Жуковский ранний ТУ растения-регенеранты

Контроль (20°С) 100 100 100 100

1ч подсушивания (41°С) 77±4 81 ±4 82±3 83±4

1,5ч подсушивания (41°С) 71 ±4 78±3 80±3 81 ±4

2,5ч подсушивания (41°С) 28±2 30±2 41±3 44±3

Перенос в нормальные условия 58±3 64±4 72±3 75+4

БАП 0,1 мг/мл 0,5мг/мл 22±1 44±2 22±2 47±2 13±1 37±2 15±2 48±3

Эти результаты позволяют предполагать что имеется тесная связь этой формы полирибосом с синтезом компонентов фермент-мембранных комплексов, так как наблюдается одновременное уменьшение содержания ферментных комплексов и полирибосом в тканях растений при водном стрессе и таким путём в клетке происходит адаптационный процесс на уровне фермент-мембранных комплексов при различных стрессовых ситуациях.

Итак, экспериментальные результаты дают основание высказать мысль о том, что водный стресс вызывает реорганизацию фермент-мембранных фотосинтетических комплексов, замедляет скорость фермент-субстратных взаимодействий и изменяет направленность их функций (на примере Рубис-ко). Это важнейшая составляющая адаптационного механизма в условиях стресса, так как при водном дефиците изменяется содержание полирибосом в зависимости от продолжительности воздействия водного стресса. При устранении водного дефицита содержание полирибосом восстанавливается до определенного уровня. Это восстановление усиливается при наличии в среде цитокинина конкретный механизм действия которого является предметом дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1 .У расгений-регенерантов картофеля в системе in vitro при действии водного дефицита происходит деградация полирибосом, которые являются одним из первичных, чувствительных к водному дефициту (обезвоживанию) звеньев белок-синтезирующих систем растений. При устранении водного дефицита содержание полирибосом восстанавливается до определенного уровня. Это восстановление усиливается при наличии в среде цитокинина.

2 .Водный стресс вызывает реорганизацию фермент-мембранных фотосинтетических комплексов, замедляет скорость фермент-субстратных взаимодействий и изменяет направленность их функций (на примере Рубиско).

3.Разное сочетание концентрации сахарозы (5-9 %) и фитогормонов (0,1-1,0 мг/л НУК; 0,1-1,0 мг/л кинетина) приводит к изменению уровня содержания фотосинтетических пигментов в растениях-регенерантах картофеля в системе in vitro. Их действие на содержание фотосинтетических пигментов является высокоспецифичным и зависит от генотипа растений.

4.Между содержанием полирибосом и состоянием фермент-мембранного комплекса (Рубиско) имеется прямая зависимость, и этот процесс находится в корреляции с водным гомеостазом растительной клетки. На общее содержание фермент - мембранного комплекса и полирибосом большое влияние оказывают фитогормоны. Высокое содержание сахарозы в культуральной среде вызывает диссоциацию полирибосом.

5.Инициация и рост клубнейinvitro независимо от генотипов картофеля при повышенных концентрациях фитогормонов ускоряются при низком содержании сахарозы в культуральной среде и, наоборот, при низких концен-

трациях гормонов инициация происходит при более высоком содержании сахарозы.

6.Количество и масса образующихся клубней зависит от объема используемых в опытах пробирок. При культивировании регенерантов в пробирках с большим объемом (32 мм) количество образовавшихся клубней доходило до 27 штук. Средняя их масса соответственно уменьшалась. Максимальная масса клубней достигала 750 мг (сорт Жуковский ранний) и 260 мг (у ТУ-растений-регенерантов). Размер и количество клубней у растений имеет генотипический характер и проявляется независимо от использования при культивировании регенерантов картофеля in vitro фитогормонов.

7. Белки на ПААГ у растений-регенерантов картофеля распределялись в диапазоне от 10 до 90 кД. Интенсивность этих белковых зон неодинакова в разных фазах развития растений. Они более интенсивны в фазе столоно-клубнеобразования по сравнению с фазой роста растений. В фазе столоно-клубнеобразования появляется ряд других белковых компонентов, которые не заметны в фазе роста растений. К ним относятся белки, расположенные в области 45 и 29 кД, и белки с молекулярной массой 57кД.

8. Характер изменения поли (А)-содержащих мРНК по мере формирования клубней в условиях in vitro не одинаков. На начальных этапах инициации столонов доля поли (А) + последовательностей мРНК выше, чем поли (А)++ мРНК. В период закладки и активного роста клубней наблюдается увеличение доли поли (А)++ мРНК. Количество поли (А)+ содержащих мРНК в эти периоды клубнеобразования не изменяется. Следовательно, на разных этапах формирования клубней проявляется активность разных по набору групп генов. В период инициации образования столонов и закладки клубней активную роль играют группы генов с короткими поли (А)+ последовательностями мРНК, в фазе интенсивного роста участвуют другие гены- с большим набором поли (А)++ последовательностей мРНК.

9.В процессе инициации и роста клубней в системе in vitro функционируют разные по длине поли (А)-последовательности мРНК. Их трансляционная активность зависит от гормонов, на действие которых влияет доза углеводов в культуральной среде выращивания регенерантов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Алиев К.А., Давлятназарова З.Б., Назарова H.H., Мирзохонова Г.О. Физиологические особенности регенерации растений картофеля. Международный симпозиум "Физиология трансгенного растения и проблемы биобе-зопастности" (Transgenic plants and Biosafety). Тезисы докладов, Москва, 2004, , с. 23-24.

2. Давлятназарова З.Б., Каримов Б.К., Авгонова Х.Х., Мирзохонова Г.О., Назарова H.H., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования in vitro. Материалы научной конференции "Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений", Душанбе, Изд-во "Дониш", 2004, с. 62-63.

3. Алиев К.А., Назарова H.H., Мирзохонова Г.О., Авганова Х.Х., Алиев М.А.. Клеточно-модифицированные растения картофеля как модель изучения эффекта цитокининов на продуктивность in vitro. Материалы Межд. конференции "Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия'1,19-23 сентября, Вологда, 2005. с.7.

4. Давлятназарова З.Б., Мирзохонова Г.О., Назарова H.H., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования у различных генотипов картофеля in vitro. Материалы респ. симпозиума "Экономика и наука Горно-Бадахшанской автономной области: прошлое, настояшее, будушее". Хорог, 2005, с.187-189.

5.Мирзохонова Г.О., Давлятназарова З.Б., НазароваН.Н,Алиев К. А. Действие водного стресса на содержание полирибосом растений - реге-нерантов картофеля. Докл. АН РТ, 2004, №11-12, с.70-78.

6.Давлятназарова З.Б., Назарова H.H., Мирзохонова Г.О., Каримов Б.К., Эсаналиева Ш.А., Алиев К.А. Рост и клубнеобразование регенеран-тов картофеля в зависимости от условий выращивания in vitro. Докл. АН РТ, 2004, №11-12, с.79-92.

7.Мирзохонова Г.О., Назарова H.H., Давлятназарова З.Б., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования у различных генотипов картофеля in vitro. Известия АН РТ. Отд. биол. и мед.наук., № 6, 2005, с.40-44.

8. Мирзохонова Г.О., Назарова H.H., Давлятназарова З.Б., Каримов Б.К., Алиев К.А. Гормональная регуляция инициации и роста клубней реге-нерантов картофеля in vitro. Известия АН РТ. Отд. биол. и мед.наук., 2005, №6, с.45-51.

9.Мирзохонова Г.О., Назарова H.H., Алиев К.А. Сравнительное изучение влияния гормонов, углеводов на трансляционную активность полирибосом и поли (А) последовательностей мРНК у регенерантов картофеля. Докл. АН РТ, 2006,Т.49, №1, с.84-91.

Ю.Алиев К.А., Алиева С. К., Умаров Х.У., Мирзохонова Г.О., Назарова H.H., Файзиева С.А., Каримов Б.К. Биотехнология растений в Таджикистане. В сб. Вклад физиологии, генетики, селекции и биотехнологии растений в решение проблем сельского хозяйства Таджикистана. Душанбе, Изд-во "Дониш", 2006. с.35-58.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мирзохонова, Гулби Олтибоевна

Введение.стр.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Современное состояние и перспективы в области изучения гормонов растений.

1.2. Открытие мембранного рецептора цитокинина-сенсорной гистидиновой киназы.

1.3. Внутриклеточные рецепторы цитокинина.

1.4. Гены первичного ответа на цитокинин и регуляция их экспрессии.

1.5. Хлоропласты и цитокинины.

1.6. Культуры меристемы - основа «безвирусного» семеноводства картофеля.

1.7. Взаимосвязь Сахаров и гормонов.

1.8. Гормональный контроль формирования трансляционной системы растений.

1.9. Роль малых молекул РНК в регуляции физиолого-биохимических процессов растений.

Глава 2. Экспериментальная часть.

Материалы и методы.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Содержание фотосинтетических пигментов у генотипов картофеля при культивировании в условиях in vitro.

3.2. Инициация и рост клубней регенерантов картофеля in vitro.

3.3. Синтез белков растений-регенерантов картофеля в процессе роста растений и инициации столоно-клубнеобразования in vitro.

3.4. Действие гормонов на трансляционную активность полирибосом и поли (А) последовательностей мРНК у регенерантов картофеля in vitro.

Глава 4. Действие водного стресса на содержание полирибосом растений-регенерантов картофеля.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние фитогормонов и водного дефицита на инициацию, рост клубней и активность белоксинтезирующей системы растений-регенерантов картофеля in vitro"

Актуальность работы. Достижения в области изучения генов, ответственных за определенные этапы развития растений их ответные реакции на стрессовые воздействия и генома растений в целом идут по нарастающей.

Познание молекулярно-физиологических механизмов адаптации растений в связи с изменениями условий внешней среды и их способности адекватно реагировать на эти изменения связано с пониманием точной и оперативной экспрессии генов. В ответ на действие экстремального фактора происходят адаптационные перестройки в растении с изменением интенсивности синтеза белков и их качественного состава (Thomashov, 1998; Плотников, 1992; Кулаева, Кузнецов, 2003).

При этом количественное изменение мРНК в клетке напрямую зависит от частоты транскрипции генов и от их процессинга в цитоплазме (Плотников, 1992; Johnson et al., 1998; Gutierrez et al., 1999).

Период полужизни индивидуальных мРНК в клетках растений в зависимости от процесса полиаделинирования может варьировать от нескольких минут до нескольких часов, поскольку нуклеотидная группа КЭП на 5-конце и поли (А)-последовательности на 3-конце защищают мРНК (эукариотических клеток) от деградации эндонуклеазами. Наличие поли (А)-последовательностей и их количество также является элементом вторичной структуры и внутренней стабильности мРНК (Ryazanov et al., 1991; Толкачева и др., 1996).

Известно, что неспецифическое увеличение трансляционной активности полисом под воздействием обезвоживания связано с увеличением доли тяжелых полисом (Ryazanov et al., 1991). Вместе с тем обнаружено, что увеличение трансляционной активности полисом в условиях холода и обезвоживания коррелирует с усилением экспрессии гена субъединицы а-фактора элонгации трансляции (Толкачева и др., 1996).

В других работах показано, что стабильность мРНК значительно меняется под влиянием света и засухи у проростков пшеницы (Плотников и др., 2000).

Таким образом, можно предположить, что модуляция стабильности мРНК, в стрессовых условиях является одним из главных факторов системы адаптации растений. Состояние мРНК и трансляционная активность разных классов полирибосом могут в определенной степени влиять на реализацию потенциала продуктивности растений.

В связи с этим мы провели работу по изучению влияния гормонов и углеводов на трансляционную активность полирибосом и поли (А)-последовательностей мРНК регенерантов картофеля в связи с их продуктивностью в системе in vitro.

Для сельскохозяйственных культур эти вопросы практически не изучены. Для этой цели растение картофеля in vitro является уникальным объектом, особенно в молекулярной биологии и биотехнологических исследованиях.

Имеются данные о взаимозависимости уровней регуляции клубнеобразования от гормональной и углеводной системы в культивируемой среде (Vreugdenhil, Helder 1992; Simkol994; Xin-Xu et al., 1998). Эти данные не всегда можно интерпретировать однозначно. Наиболее детально изучена роль гиббереллинов на рост столонов и ингибирующий процесс инициации клубней (Xin-Xu et al., 1998; Чайлахян, 1984; Ewing, 1995). Имеются противоречивые данные в изучении конкретной роли ауксинов и цитокининов в процессе клубнеобразования in vitro. Например, цитокинины инициировали рост клубней в изолированных столонах (Palmer, Smith, 1970). Вместе с тем, использование 6-БАП (6-бензиламинопурин) не повлияло на образование клубней (Xin-Xu et al., 1998). Добавление ИУКа у одних исследователей вызывало рост клубней (Me Grady et al., 1986), а у других оказывало ингибирующий эффект (Xin-Xu et al., 1998). Таким образом, имеющиеся данные о роли ауксинов и цитокининов в процессах инициации и роста клубней у изолированных систем растений картофеля не поддаются однозначной интерпретации, что и послужило задачей настоящей работы.

В процессе инициации и роста клубней картофеля, по всей вероятности происходит поэтапная экспрессия генов, которые регулируются углеводами и гормонами, по всей вероятности, ведущую роль играет поэтапная экспрессия генов, которые регулируются гормонами (Алиев, 1998).

В последнее время особое влияние исследователей обращено на принципы регуляции продукционного процесса и защитные реакции растений картофеля при стрессовых воздействиях, особенно фитопатогенов и водного дефицита, физиолого-биохимические основы которых далеко не полностью изучены. Одним из подходов является получение мутаций у растений картофеля путем воздействия различными стрессовыми факторами на клеточном уровне, тем или иным образом затрагивающего защитные механизмы - например, к болезням (Delaney, 1997), высоким температурам (Давлятназарова и др., 2003). Другим подходом является получение трансгенных растений, проявляющих повышенную устойчивость к фитопатогенам (Somssich, Hahlbrock, 1998), вирусам (Keen, 1992; Захарьев и др., 1989), гормонам (Аксенова и др., 1999), осмоустойчивость (Kavi Kishor et al., 1995) и т.д.

Контроль за активностью гена может осуществляться на различных уровнях: транскрипции, трансляции, процессинга, транспорта, деградации мРНК и белка. Исследование регуляции генов затруднено несовершенными методиками количественного и качественного анализа функции генов и, самое главное, отсутствием модельных систем растений. С этой точки зрения пробирочные регенеранты картофеля являются удобной модельной системой, позволяющей исследовать роль фитогормонов в регуляции роста и развития, определять устойчивость к стрессовым воздействиям и открывают возможность изучения их функциональной роли на уровне молекулярно-физиологических процессов, в клетках растений.

В литературе имеются противоречивые сведения, свидетельствующие об участии фитогормонов в развитиии стрессового ответа (Salah,Tardieu, 1996; Maleck, Lawton, 1998; Kudoyarova et al., 1998), однако ничего не известно о механизме этого процесса. Один из подходов, с помощью которого можно изучать роль фитогормонов в процессах роста, развития и стрессового ответа, является использование устойчивых к стрессовым факторам генотипов растений с измененой экспрессией гиперчувствительных генов к высокой температуре (Авганова и др., 2006)

В настоящее время еще рано говорить о конкретных механизмах действия гормонов в переключении множественных генов, экспрессия которых регулирует процессы роста, развития и продуктивности растений. Известно, что цитокинины играют нетолько регуляторную роль но и в определенных условиях определяют устойчивость растений и некоторые стрессовые факторы (Thomas et al., 1999). В последних работах, имеются сведения о том, что гормоны в сочетании с углеводами регулируют ход клубнеобразования картофеля in vitro (Аксенов и др., 2000; Назарова и др., 2004), где возможно важную роль в этих процессах играет повседневное экспрессии генов, которая также слабо изучена. Однако конкретные механизмы действия гормонов и углеводов в процессе микроклубнеобразования не достаточно изучено. Не ясно их молекулярная и физиологическая основа. По этой причине познание молекулярно-биологических механизмов взаимодействия гормонов и углеводов в процессе роста, развития и клубнеобразования картофеля и их физиологической основы на удобном объекте как растений-регенерантов, имеют общебиологическое значение и являются актуальной задачей.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

• выявление оптимальных условий микроклубнеобразования растений-регенерантов картофеля in vitro;

• изучение поли (А)-содержащих РНК при гормональном воздействии на различных стадиях клубнеобразования растений-регенерантов картофеля in vitro',

• изучение полирибосом регенерантов картофеля in vitro в условиях температурного и водного стресса;

• определение содержания фотосинтетических пигментов при гормональном воздействии на регенеранты картофеля in vitro;

• изучение содержания и активности рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Рубиско) регенерантов картофеля in vitro при температурном и водном стрессе.

Научная новизна. Отчетливо проявились различия в регуляции фазы инициации и фазы роста клубней при использовании ауксинов и цитокининов в культуральных средах выращивания растений картофеля in vitro. Фаза инициации и фаза роста клубней независимо от генотипов картофеля при более высокой концентрации фитогормонов ускоряются при более низком содержании сахарозы в культуральной среде и, наоборот, при низких концентрациях гормонов инициация происходит при более высоком содержании сахарозы в системе in vitro. Регуляция этих процессов связана с активной экспрессией генов и появлением новых белковых компонентов. Влияние фитогормонов на сырую массу клубней (урожай) было эффективным при действии кинетина на рост и НУК на инициацию образования клубней. На начальных этапах инициации столонов доля поли (А)+ последовательностей мРНК выше, чем поли (А)++ мРНК. В период закладки и активного роста клубней наблюдается увеличение доли поли (А)++ мРНК. Количество поли (А)+ содержащих мРНК в эти периоды клубнеобразования не изменяется. Следовательно, на разных этапах формирования клубней проявляется активность разных по набору групп генов. В период инициации столонов и закладки клубней активную роль играют группы генов с короткими поли (А)+ последовательностями мРНК. В фазе интенсивного роста участвуют другие гены- с большим набором поли (А)44" последовательностей мРНК.

Практическая значимость работы. Содержание полирибосомных комплексов можно использовать как тест на действие дефицита воды на экспрессию генома и, возможно, стрессов вообше. При получении микроклубней in vitro большое значение имеет соотношение фитогормонов и сахарозы. Разработана биотехнология получения микроклубней картофеля больших размеров с использованием пробирок больших размеров.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены/ представлены на следующих конференциях и симпозиумах:

• Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений, Душанбе 2004;

• International symposium Transgenic plants and biosafety, Moscov, 2004;

• Республиканский симпозиум «Экономика и наука Горно-Бадахшанской автономной области: прошлое, настоящее, будущее», Хорог, 2005;

• Научно-практическое совещание «Использование оздоровленного материала в семеноводстве картофеля», Муминабад, 2005;

• Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия», Вологда, -Россия 2005г;

• International Congress BioVision Alexandria, 2006.

Структура и объем работы: Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (3 главы), выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 129 стр., содержит 24 рисунка, 9 таблиц. Количество цитированных источников 137.

Публикации. По материалам диссертаций опубликовано 10 работ.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Мирзохонова, Гулби Олтибоевна

Выводы

1. У растений-регенерантов картофеля в системе in vitro при действии водного дефицита происходит деградация полирибосом, которые являются одним из первичных, чувствительных к водному дефициту (обезвоживанию) звеньев белок-синтезирующих систем растений. При устранении водного дефицита содержание полирибосом восстанавливается до определенного уровня. Это восстановление усиливается при наличии в среде цитокинина.

2. Водный стресс вызывает реорганизацию фермент-мембранных фотосинтетических комплексов, замедляет скорость фермент-субстратных взаимодействий и изменяет направленность их функций (на примере Рубиско).

3. Разное сочетание концентрации сахарозы (5-9 %) и фитогормонов (0,11,0 мг/л НУК; 0,1-1,0 мг/л кинетина) приводит к изменению уровня содержания фотосинтетических пигментов в растениях-регенерантах картофеля в системе in vitro. Их действие на содержание фотосинтетических пигментов является высокоспецифичным и зависит от генотипа растений.

4. Между содержанием полирибосом и состоянием фермент-мембранного комплекса (Рубиско) имеется прямая зависимость, и этот процесс находится в корреляции с водным гомеостазом растительной клетки. На общее содержание фермент - мембранного комплекса и полирибосом большое влияние оказывают фитогормоны. Высокое содержание сахарозы в культуральной среде вызывает диссоциацию полирибосом.

5. Инициация и рост клубней in vitro независимо от генотипов картофеля при повышенных концентрациях фитогормонов ускоряются при низком содержании сахарозы в культуральной среде и, наоборот, при низких концентрациях гормонов инициация происходит при более высоком содержании сахарозы.

6. Количество и масса образующихся клубней зависит от объема используемых в опытах пробирок. При культивировании регенерантов в пробирках с большим объемом (32 мм) количество образовавшихся клубней доходило до 27 штук. Средняя их масса соответственно уменьшалась. Максимальная масса клубней достигала 750 мг (сорт Жуковский ранний) и 260 мг (у ТУ-растений-регенерантов). Размер и количество клубней у растений имеет генотипический характер и проявляется независимо от использования при культивировании регенерантов картофеля in vitro фитогормонов.

8. Характер изменения поли (А)-содержащих мРНК по мере формирования клубней в условиях in vitro не одинаков. На начальных этапах инициации столонов доля поли (А) + последовательностей мРНК выше, чем поли (А)++ мРНК. В период закладки и активного роста клубней наблюдается увеличение доли поли (А)"1"1" мРНК. Количество поли (А)+ содержащих мРНК в эти периоды клубнеобразования не изменяется. Следовательно, на разных этапах формирования клубней проявляется активность разных по набору групп генов. В период инициации образования столонов и закладки клубней активную роль играют группы генов с короткими поли (А)+ последовательностями мРНК, в фазе интенсивного роста участвуют другие гены- с большим набором поли (А)++ последовательностей мРНК.

9. В процессе инициации и роста клубней в системе in vitro функционируют разные по длине поли (А)-последовательности мРНК. Их трансляционная активность зависит от гормонов, на действие которых влияет доза углеводов в культуральной среде выращивания регенерантов.

Заключение

Регенеранты, полученные при глубоком температурном (45°.47°С) воздействии имели разную чувствительность к цитокинину, ауксину и содержанию сахарозы в культуральной среде. Более того регенеранты полученные при неглубоком воздействии температуры (до 41°С) со временем теряли приобретенные признаки (Давлятназарова и др., 2003). Растения-регенеранты, полученные при воздействии высокой температуры

45°.47°С) имели иные морфофизиологические характеристики. У них листья были опушенные, плотные, с коричневатым оттенком и имели компактный рост. Было отмечено высокое накопление пролина при повторном воздействии температурного фактора. Эти признаки сохранялись в течении ряда поколений и испытаны в полевых условиях. Из всех полученных линий (их было 7), преспективными оказались две линии, отмеченные нами линии А и Б, отличающихся по урожайности и по потребности к сахарозе в системе in vitro.

Исходя из этих показателей, можем сделать предположение, что глубокий температурный шок (45°.47°С) вызывает необратимую мутацию, которая имеет ряд агрономически полезных признаков, хотя действие глубокого шока на растения как мутагенный фактор интерпретируется в литературе неоднозначно.

Всегда считалось, что температурные воздействия не приводят к мутации и являются не мутационными факторами. Изменения, вызванные температурой (тепловой шок), приводят к включению соответствующих модификаций геномных систем ответа, которые исчезают при возврате к исходной температуре (Morimoto, 1993). Вместе с тем, после открытия мобильных генетических систем (МГЭ) стало ясно, что инсерции и эксцизии МГЭ в кодирующих и регуляторных зонах генов могут вызывать их генетическую изменчивость. Показано, что перемещение МГЭ оказывает влияние на функции отдельных мендельских генов (Arkhipova et al., 1995). Было найдено, что инсерции МГЭ в известные гены объясняются видимой генетической изменчивостью, т.е. инсерционный мутагенез оказался новым и весьма важным источником изменчивости мендельских генов у эукариотических объектов (Charlesworth, Langley, 1989).

В последних работах было обнаружено, что тепловой шок не является мутагенным, но его влияние осушествляется опосредованно через индукцию транспозиции МГЭ (Васильева, Ратнер, 2000). В других работах отмечено, что действие теплового шока (глубокого) напоминает результаты действия у-облучения (Васильева и др., 1998). Это говорит о том, что индуцированная изменчивость полигенов после действия немутагенного фактора - теплового шока (глубокого) - сравнимы с изменчивостью после действия у-облучения, которое является классическим мутагенным фактором. Возможно, главный механизм действия высокой температуры тоже связан с инсерциями копий МГЭ. Таким образом, эти исследования указывают на то, что у-облучение в отличие от воздействия теплового шока, кроме перемещений МГЭ, индуцирует двухцепочные разрывы ДНК. Тепловой шок также как и у-облучение могут являтся мутагенным фактором проявляющимся посредством МГЭ, поэтому эти признаки могут являтся наследственно-направленными.

Устойчивость растений к стрессовым экологическим факторам среды является сложным молекулярно-генетическим процессом, связанным с изменением синтеза многих белков и их качественного состава в клетках растений. Нормальный рост и развитие растений в экстремальных условиях зависит от их способности адекватно реагировать на изменение внешних условий, от точной и оперативной регуляции экспрессии многих генов. Количество и качество мРНК также зависит как от частоты транскрипции гена, так и от нормы распада мРНК в составе полирибосомных комплексов.

Разделение суммарной РНК с помощью ступенчатой аффинной хроматографии на поли (У)-Сефарозе позволило оценить долю поли (А)++- и поли (А)+- последовательностей мРНК от общей суммы РНК клеток при различных условиях культивирования регенерантов в условиях in vitro. Этот показатель достаточно полно отражает уровень эффективности экспрессии той или иной группы генов в зависимости от условий воздействия на расстения.

Наличие гормонов и углеводов приводит к увеличению содержания поли (А)-последовательностей в разной степени.

Следует отметить, что действие углеводов оказалось более сложным, чем мы предполагали. При увеличении концентрации углеводов в культуральной среде происходит резкое уменьшение содержания в клетке поли (А)-последовательностей мРНК, усиливается диссоциация полирибосом. Нарушение посттранскрипционного процесса не компенсируется дозой гормонов. Возможно, нормальный ход транскрипционного и трансляционного процесса в клетке регулируется определенным соотношением гормонов и углеводов, нарушение которого приводит к изменению экспрессии генов. Кроме того, мы обнаружили факт обратной зависимости действия гормонов и углеводов на инициацию дифференцировки стволовых клеток, и полученные результаты о разной экспрессии генов в онтогенезе растений свидетельствуют о том, что активация морфогенетической потенции стволовых клеток начинается с накоплением физиологически значимой дозы гормонов и углеводов в клетке.

Экологические и физиологические факторы существенно влияют на формирование полирибосом и фермент-мембранного комплекса фотосинтеза.

Накопление мембраносвязанных Рубиско тесно связано с формированием полирибосомного материала в клетке. Усиление образования полирибосом сопровождается увеличением процентного содержания мембраносвязанного Рубиско и, наоборот, уменьшение полирибосом приводит к снижению доли этой формы фермента хлоропластов. Взаимосвязь полирибосом и ферментных комплексов хлоропластов напрямую зависит от состояния водного гомеостаза тканей растений.

На общее содержание фермент-мембранного комплекса и полирибосом большое влияние оказывают фитогормоны. Так, например, при добавлении в среду выращивания регенерантов в условиях in vitro БАП происходит увеличение не только доли полирибосом, но и содержания мембранно-ферментного комплекса хлоропластов (Рубиско).

Таким образом, полирибосомы являются одним из первичных, чувствительных к водному дефициту (обезвоживанию) звеньев белок-синтезирующих систем растений.

Экспериментальные результаты дают основание высказать мысль о том, что водный стресс вызывает декомплектизацию фермент-мембранных фотосинтетических комплексов, замедляет скорость фермент-субстратных взаимодействий и изменяет направленность их функций (на примере Рубиско) и в комплексе составляет важнейший элемент адаптационного механизма в условиях стресса, так как при водном дефиците изменяется содержание полирибосом в зависимости от продолжительности воздействия водного стресса. При устранении водного дефицита содержание полирибосом восстанавливается до определенного уровня. Это восстановление усиливается при наличии в среде БАП (6-бензиламинопурин).

Более того, предпологается, что полирибосомная система адекватно реагирует на изменение концентрации азона, Иф-радиации радиоактивности в биосфере, это дает возможность использовать изменение полирибосомных комплексов растений для глобального анализа экспрессии генов в связи с изменением экологических условий. В связи с этим горные зоны Таджикистана является есстественной лабораторией для проведения мониторинга растений - изменения компонентов биосферы и исспользования их для долгосрочного прогнозирования изменения состояния растений под воздействием климата и для настоящих нужд человека.

Морфогенетическая характеристика каллусогенеза картофеля в зависимости от температурного режима культивирования.

Варианты Масса каллусов, мг Размер каллусов, мм цвет консистенция эмбриогенный неэмбриогенный

1. 37°С 99±5 6,2±0,1 Зеленовато желтый Крупные бугорчатые образования 41 59

2. 41°С 48±0,6 5,0±0,2 Светло желтый Зернистые образования 33 67

3. 45°С 31±0,5 4,1±0,2 Коричневато желтый Рыхлые, зернистые образования 17 83

4. 47°С 18±0,4 3,4±0,2 Коричневато желтый Мелкие, зернистые образования 14 86

Удалось получить большое разнообразие каллусов, при различных температурных режимах, отличающихся между собой по морфологическим признакам. Существенные различия обнаруженны по размеру, массе, цвету, консистенции и морфогенетической потенции. Наиболее морфогенными оказались каллусы с зеленовато-желтым или светло-желтым оттенком, имеющие зернистые, крупные, бугорчатые образования.

Каллусы, имеющие коричневато-желтый цвет с мелкозернистым или рыхло-зернистым образованием имели низкую эмбриогенную потенцию (всего 14-17%).

Обобщая результаты этих экспериментов следует указать, что каллусы, образовавшиеся при различных температурных условиях обладают разным эмбриогенным потенциалом, различающимся по ряду морфологических показателей. Образование эмбриогенных структур и переход к органогенезу зависит от многих факторов, таких как соотношение гормонов, углеводов, генотипа и др.

Так, по данным Б.Г. Анненкова и Т.А. Белуги (1991) обнаружили, что каллусообразование у картофеля имеет сортовую специфичность и отзывчивость к цитокинину (кинетину), а также имеет сезонную зависимость. По утверждению И.М.Сурикова (1983) эмбриогенетическая активность каллусов зависит от длительности эксплатации сортов в производстве. Он пологает, что в процессе эксплуатации сортов происходит постепенная утрата способности генотипа к регенерации из каллусов. Сортоспецифичность по регенерационной способности отмечена в работе ДЖ. Опатрна (Opatrna et.al.,1992), где отмечено различие между сортами по интенсивности каллусообразования и регенерации растений. Влияние генотипа на процессы каллусогенеза и их пролиферации с образованием растений отмечены в культуре in vitro для других культур (Рахимбаев и др., 1992; Карабаев и др., 1996,2004).

Существует и другая точка зрения, согласно которой каллусообразование и его пролиферация не является существенным фактором, зависящим от генотипа (Гибари и др., 1989). Они считают, что каллусообразующая способность скорее в значительной степени зависит от условий культивирования и происхождения инициальных клеток. Способности эксплантов определенного генотипа реагировать на условия культивирования зависит от нормы реакции генотипа на конкретные условия среды. Поэтому при изменении условий культивирования эксплантатов эта норма реакции может изменится следующим образом:

• При гетерогенности исходного экспланта на путь пролиферации каллуса могут вступить клетки других сопутствующих тканей, принципиально различающихся по своим морфогенетическим потенциям.

• При однообразии клеток исходного экспланта под действием факторов (компонентов) культивирования могут экспрессироваться ранее «спящие» или могут ингибироватся ранее активные гены.

По этим причинам, для любого генотипа можно подобрать такие условия, при корорых частота каллусогенеза и его пролиферации будут высокими.

Морфогенез каллусов должен завершатся формированием микрорастений in vitro с тонким стеблем, слабой корневой системой и нежными листьями. Учитывая тотипотентность растений, предложены методы ускоренного размножения in vitro. В 1970г. Р.Г. Бутенко и Г.Н. Винклером был предложен метод микрочеренкования in vitro для картофеля, котрый получил в дальнейшем широкое распространение (Бутенко, 1970, 1979, 1990 ). Технология микроразмножения картофеля широко практикуется при ускоренном размножении растений, свободных от вирусов и патогенов (Алиев и др. 1997; Муминджанов, 2000, 2003). В настоящее время метод микроклонального размножения используется не только в научных исследованиях, но и является объектом производства и торговли и насчитывает более 200 видов растений (Jones, Petolino, 1987; Глеба, 1996). Метод ускоренного микроразмножения на комерческой основе используется для такие культур, как картофель, масличная пальма, кокос, финиковая пальма, какао, сахарный тросник, киви и многое другое.

Однако достигнутые успехи в микроклональном размножении, обусловленны, прежде всего успехом эмперического подхода поиска подходящих компонентов питательных сред и режимов культивирования, а не углубленными, целенаправленными молекулярно-физиологическими исследованиями, которые привели бы к оптимальным решениям (Иванов, 2002, 2004).

Молекулярно-физиологические вопросы каллусогенеза, пролиферации каллусов и регенерации растений нуждаются в углубленом исследовании, связанном с решением механизма направленной дифференциации и ростовых процессов, обуславливающих получение клонов, устойчивых к стрессовым факторам среды и высокой продуктивностью.

Отношение поли (А)*"1" к поли (А)+-последовательностям мРНК у контрольного варианта составляет 0,4. Добавление кинетина в культуральную среду незначительно повышает отношение этих форм мРНК и соответствует 1,4 при добавлении НУК в культуральную среду отношение поли (А)*"1" к поли (А)+-последовательности составляет 8,2 а при совместном использовании кинетина и НУК в культуральной среде это значение несколько увеличивается и составляет 5,9.

Следует особо отметить, что степень полиаденилирования мРНК под действием гормонов зависит от наличия в культуральной среде углеводов (5%). Напротив, при отсутствии или низкой концентрации углеводов (1-2 %) в культуральной среде степень полиаденилирования мРНК остается низкой, т.е. доля длинных поли (А^-последовательностей не увеличивается даже в фазе активного роста клубней. Обшее содержание поли (А) РНК колеблется от 1 до 3 % в зависимости от наличия гормонов при оптимальной концентрации сахарозы (5%), необходимой для активного клубнеобразования.

Гексокиназный путь метаболизма углеводов

Альдегиды глюкоза

• Изменение баланса ауксин/цитокинин

• Метаболизм углеводов

• Изменение экспрессии генов

• Морфогенетический потенциал клетки, ткани растений - путем направленной диференцировки

Рис. 24. Схема роли углеводов в процессах морфогенеза растений картофеля

Следует отметить, что действие углеводов оказалось более сложным, чем мы предполагали (рис. 24). При увеличении концентрации углеводов в культуральной среде происходит резкое уменьшение содержания в клетке поли (А)-последовательностей мРНК, усиливается диссоциация полирибосом. Нарушение посттранскрипционного процесса не компенсируется дозой гормонов.

Возможно, нормальный ход транскрипционного и трансляционного процесса в клетке регулируется определенным соотношением гормонов и углеводов, нарушение которого приводит к изменению экспрессии генов. Так, например, при добавлении в среду выращивания регенерантов в условиях in vitro цитокинина происходит увеличение не только доли полирибосом, но и содержания мембранно-ферментного комплекса хлоропластов (Рубиско). Формирование полирибосом и ферментных комплексов не является сортовым признаком, т.к. достоверная разница между сортом Жуковский ранний и ТУ-линией по этим физиологическим показателям практически не обнаруживается.

Эти результаты позволяют предполагать, что имеется тесная связь этой формы полирибосом с синтезом компонентов мембранно-ферментных комплексов, так как наблюдается одномоментное уменьшение содержания ферментных комплексов и полирибосом в тканях растений при водном стрессе, и таким путём в клетке происходит адаптационный процесс на уровне фермент-мембранных комплексов при различных стрессовых ситуациях. Эти результаты требуют глубоких дальнейших исследований.

Итак, экспериментальные результаты дают основание высказать мысль о том, что водный стресс вызывает декомплектизацию фермент-мембранных фотосинтетических комплексов, замедляет скорость фермент-субстратных взаимодействий и изменяет направленность их функций (на примере Рубиско) и в комплексе составляет важнейший элемент адаптационного механизма в условиях стресса, так как при водном дефиците изменяет содержание полирибосом в зависимости от продолжительности воздействия водного стресса. При устранении водного дефицита содержание полирибосом восстанавливается до определенного уровня. Это восстановление усиливается при наличии в среде культивирования растений-регенерантов цитокинина.

Полученные экспериментальные результаты показывают, что различные фазы ростовых и генеративных процессов требуют экспрессии разных генов, индукции которых теснейшим образом связанны с дозой фитогормонов и углеводов. Повышенные концентрации этих компонентов в культуральной среде приводят к изменению функции геннов и, следовательно, нарушеннию ростовых и репродуктивных процессов регенерантов in vitro и, возможно, растений вообще. Что требует глубокого экспериментального анализа.

О конкретном механизме мы точно не знаем. Мы надеемся, что в будущем с использованием новых методов (PCR) найдем ответ на эти вопросы. Предполагаем, что взаимодействие гормонов и углеводов может происходить путем «взаимовлияния», способствующего проведению сигнала фитогормонов по мембранной системе и, таким образом, могут регулировать продуктивность растений in vitro, а возможно и in vivo.

Углеводы в свою очередь как и фитогормоны обладают способностью, быть на определенном этапе инициации и роста клубней регуляторами транскрипции отдельных генов. В пользу этого предположения свидетельствуют, обнаруженные различные поли (А)-содержащие РНК в процессе инициации и роста клубней in vitro в зависимости от дозы углеводов. Необходимо, также предположить, что взаимодействия фитогормонов и углеводов может происходить и путем «взаимовлияния», способствующей при проведении сигнала фитогормонов и углеводов. Косвенным подтверждением могут служить полученные нами результаты об обратном влиянии гормонов и углеводов в процессе инициации и роста клубней, где обнаруженно, что при высокой концентрации фитогормонов активная экспрессия функции генов инициации и роста клубней происходит при низком содержании углеводов или наоборот, при высоком содержании углеводов эти процесссы требуют низкого содержания гормонов. Эта проблема в последние годы является предметом многих научных лабораторий, дальнейшие исследования которых проливает свет о комплексной регуляции гормонов и углеводов в процессе роста, развития, устойчивости и урожайности растения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мирзохонова, Гулби Олтибоевна, Душанбе

1. Абдуллаев Х.А., Каримов Х.Х. Индексы фотосинтеза в селекции хлопчатника. Изд-во "Дониш". Душанбе, 2001. С. 267.

2. Авганова Х.Х., Мирзохонова Г.О., Назарова H.H., Салимов А.Ф., Алиев К.А. физиолого биохимические особенности температуроустойчивых растений-регенерантов картофеля / Докл. АН РТ. 2006. №5

3. Альберте Б., Брей Д., Пьюне ДЖ., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. Из-во «Мир» М:, 1998. т. 2. с. 313 (с.234).

4. Алиев К.А., Насыров Ю.С., Васильева В.Н. Свойства свободной и мембранносвязанной РБФ-карбоксилазы-оксигеназы в процессе биогенеза хлоропластов // Физиология растений, 1984. Т. 31, вып. 1. С. 124.

5. Алиев К.А., Васильева В.Н. Физиология растений. - 1976, т.23. -С.786-792.

6. Алиев К.А., Каримов Б.К. Возделывание оздоровленного картофеля в Таджикистане//Дониш, 1996. 72с.

7. Алиев К.А. Молекулярные механизмы биогенеза хлоропластов / Дониш Душанбе, 1997. 74с.

8. Алиев К.А. Молекулярные механизмы биогенеза фотосинтетического аппарата растений, Душанбе, «Дониш», 1998. 72с.

9. Ананиев Е., Шакирова Ф.М., Клячко Н.П., Кулаева О.Н. Влияние цитокинина полисом из предшествующих мРНК и рибосом // Докл АН СССР, 1980. Т.255. с.508-510.

10. Анненков Б.Г., Белуга Т.А. Каллусообразование у сортов картофеля / Докл. ВАСХНИЛ, 1991. №3. С.14-16.

11. Бабаджанова М.А., Бабаджанова М.П., Алиев К.А. Свободный и мембраносвязанный мультиферментные комплексы цикла Кальвина листьев хлопчатника. // Физиология растений, 2002г, т.43. с.663-669.

12. Бобохонов P.C. Содержание и активность рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы у оздоровленных растений картофеля в связи с их продуктивностью // Автореферат канд. дисс. Душанбе, 1999. 22с

13. Бровко Ф.А., Заграничная Е.К., Бозиев Х.М., Каравайко H.H., Селеванина С.Ю., Кулаева О.Н. Выделение и характеристикацитокинин-связывающего белка и этилированных проростков кукурузы// Физиология растений, 1996. Т.43. С.533-540.

14. Бутенко Р.Г. Тотипотентность растительной клетки и культуры тканей культура изолированных органов, тканей и клеток растений / М.: Наука, 1970. С.84-91.

15. Бутенко Р.Г., Кучко А.А. Получение межвидового соматического гибрида картофеля методом слияния изолированных протопластов // Докл. АН СССР, 1979. Т.247. № 2. С.491-495.

16. Бутенко Р.Г. Некоторые физиологические проблемы при культивировании in vitro картофеля // В кн.: Регуляция роста и развития картофеля / М., 1990. С.88-98.

17. Васильева JI.A., Бубеньщикова Е.В.,Ратнер В.А. Новое подтверждение явления индукции транспозиции МГЭ тяжелым тепловым шоком // Генетика, 1998. Т.34. № 9. С.1243-4250.

18. Васильева Л.А., Ратнер В.А. Тяжелый тепловой шок (ТТШ) индуцирует генетическую изменчивость полигенной системы количественного признака у дрозофилы // Генетика, 2000. Т.36. № 4. С.493-499.

19. Глеба Ю.Ю. Биотехнология растений // Соросовский образовательный Журнал, 1998. №6. С.3-8.

20. Гришунина Е.В., Сергеев Л.И., Гукасян И.А., Романов Г.А. «Углеводный метаболизм в процессе клубнеобразования у трансгенного картофеля» // Материалы Междун. симпозиума «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопастности» / М:, 2004 г. стр. 34.

21. Давлятназарова 3. Б., Алиев К.А., Бабаджанова М.П., Авганова Х.Х. Получение линий картофеля, устойчивых к высокой температуре, с использованием методов биотехнологии // Док. АН РТ, 2003. № 5-6. С.61-69.

22. Захарьев В.М., Гизатуллин Р.З., Шульга O.A., Катков B.C., Калинина Н.О., Тальянский М.Э., Атабеков И.Г., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений N. tabacum, устойчивых к Х-вирусу картофеля // Докл. АН СССР, 1989. Т.309. С.1241-1244.

23. Зыкин А.Г. Проблемы обеспечения России картофелем «вторым -хлебом». Вопросы картофелеводства. ВНИИКХ. Научные труды. М:, 2001. С. 13-18.

24. Иванов В.Б. Проблема стволовых клеток у растений // Онтогенез, 2002. Т.34. С.253-261.

25. Иванов В.Б. Меристема как саморегулирующаяся система: поддержание и ограничение пролиферации клеток // Физиология растений, 2004. Т.51. № 6. С.926-941.

26. Карабаев М. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы: физиологические и биотехнологические аспекты / Автореферат док. дисс. / Москва:, 1994. 49 стр.

27. Киль В.И., Бабишев В.А., Плотников В.К. Неспецифический прирост трансляционной in vitro активности полисом из проростков ячменя и пшеницы под действием стресса // Физиология растений, 1991. Т.32. С.730-735.

28. Кулаева О.Н. Цитоконины, их структура и функция. М.: Наука, 1973, 264с.

29. Кулаева О.Н., Кузнецов Вл.В., Кузнецов В.В. Индукция цитокинином активности нитратредуктазы в изолированных зародышах Agrostemma githagoll Физиология растений. 1978. Т.23. С.1255-1263.

30. Кулаева О.Н. Карликовые мутанты и их роль в «Зеленой революции» // Соросовский образовательный журнал, 2000. Т.6. № 8. С. 18-23.

31. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов // Физиология растений, 2002, Т.49, № 4. С.626-640.

32. Лутова JI.A., Проворов H.A., Тиходеев О.Н., Тихинович И.А., Ходжайова JI.T., Шишкова С.О. Генетика развития растений. / СПб.: Наука, 2000. С.424-426.

33. Мирзохонова Г.О., Давлятназарова З.Б., Назарова H.H., Алиев К.А. Действие водного стресса на содержание полирибосом растений-регенерантов картофеля / Докл. АН РТ 2004, T.XLVII № 11-12, стр.70-79.

34. Морозова С.Е., Мелик-саркисов О.С. размножение безвирусного картофеля, полученными in vitro / Физиология растений, 1978, т.25, №2, с.373-378.

35. Муминджанов Х.А. Физиолого биотехнологический подход к селекции и семеноводству картофеля / Душанбе, 2003, 127стр.

36. Муминджанов Х.А. Селекция и семеноводство картофеля на основе физиологических тестов и методов клеточной биотехнологии: Автореферат дис.докт.с-х.наук / Душанбе, 2000. 51с.

37. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений / М.: ВО Агропромиздат, 1987. С.80-133.

38. Назарова H.H., Давлятназарова З.Б., Мирзохонова Г.О., Каримов Б.К., Алиев К.А. Образование столонов и микроклубней картофеля в зависимости от сроков посадки in vitro! Докл. АН РТ, 2004. Т. XLVII №11-12, стр. 92-102.

39. Назарова H.H., Мирзохонова Г.О., Алиева С.К., Каримов Б.К., Алиев К.А. Некоторые особенности образования столонов у картофеля in vitro. Известия АН РТ, 2005. №3-4(153). С.36-39.

40. Плотников В.К. Стабильность мРНК как фактор регуляции экспрессии генов в клетках эукариот // Успехи совр. Биол, 1992. Т.112. С. 186-199.

41. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В. Постранскрипционная регуляция экспрессии генов растений: ряды индексов стабильности специфических мРНК in vitro и in vivo II Генетика, 1998. т. 34. с. 969-883.

42. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Сметанин Д.В. Фотоиндуцированная модуляция стабильности мРНК фитохрома А у проростков пшеницы и ячменя // Физиология растений, 2000. Т. 47. С. 203-209.

43. Полевой В.В., Саламатова Т.С. Механизмы регуляции роста растительных клеток // Биология развития растений / Под ред. Чайлахяна М.Х. и др. Л.: Наука, 1975. С Л11-125.

44. Получение безвирусного посадочного материала картофеля микроклубнями, индуцированными в культуре in vitro (Методич. рекоменд.) // Под редакцией А.Г. Шаповал ВНИИ ПМБиГ. Москва, 1985. 16 с.

45. Рахимбаев И.Р., Тивари Ш., Бишимбаева Н.К. Биотехнология зерновых Культур // Алма-Ата: Рылым, 1992. 240с.

46. Рахмихудоев Г. Свободные и мембраносвязанные рибосомы хлоропластов. Автореферат канд. дисс. Тбилиси, 1980. 24стр.

47. Роджер М.Джиффорд, Колин Л.Д. Дженкинс. Использование достижения науки о фотосинтезе в целях повышения продуктивности культурных растений. В кн.: Фотосинтез. М.:, 1987. Т.1. С.389-410.

48. Салимов А.Ф. Фотосинтетическая деятельность и донорно-акцепторные отношения в связи с продуктивностью оздоровленных растений картофеля // Автореферат канд. дисс. Душанбе, 1999. 24с.

49. Сатарова H.A. В сб.»Физиология засухоустойчивости растений.», Москва, Наука, 1971.

50. Селиванкина С.Ю., Каравайко H.H., Черепнева Г.Г., Прищепова А.Е., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Биологически активный зеатинсвязывающий белок из хлоропластов листьев ячменя // ДАН, 1997. Т.356. С.830-832.

51. Селиванкина С.Ю., Каравайко H.H., Земляченко Я.В., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. Регуляция транскрипции рецептором цитокинина в системах in vitro II Физиология растений, 2001. Т.48. С.434-440.

52. Суриков И.М. Получение регенерантов и первичного клубневого каллуса картофеля и зависимости от сорта, состава среды и положения эксилонты // с-х. биология, 1983. № 6. С.13-15.

53. Тарчевский И.А., Андрианова Ю.Е. Содержание пигментов как показатель мощности развития фотосинтетического аппарата у пшеницы. Физиология растений, 1980. т.27. №2. с.341-347.

54. Толкачева Т.В. Карпычев Н.В., Эльдаров М.А., Скрябин К.Г. Роль G-белков в специфичности клеточного ответа: особенности строения и функционирования а-субъединицы // Мол. Биол, 1996. Т. 30. С. 10021014.

55. Хотилева JI.B., Лемеш В.А. фотосинтетические реакции хлоропластов в связи с гетерозисом. В кн.: биоэнергетические процессы при гетерозисе / Минск, 1991. С .116-151.

56. Чайлахян М.Х. Фотопериодическая и гормональная регуляция клубнеобразования у растений / М.: Наука, 1984. 69 с.

57. Чернобровкина М.А., Чернобровкин С.Л., Мартиросян Ю.Ц., Розанов В.В., Мелик-саркисов О.С. особенности выращивания микроклубнейкартофеля в биотехнологической системе / Сельскохозяйственная биология, 1994, №3, с.65-72.

58. Шлык A.A. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений / под. Ред. Павлиновой O.A. М.: Наука, 1971. С.154-171.

59. Шумный В.К. Генная и хромосомная инженерия для растений // соровский журнал 2003 стр

60. Archipova I.R., Lyubomirskaya N.V., Ilin Y.V. Drosophila retrotransposons. N.Y., Berlin e.a.: Springer-Verlag, 1995

61. Benkova E., Witters E., van Dongen W., Kolar J., Motyka V., Brzobohaty В., van Onckelen H.A., Machackva L. Cytokinins in tobacco and Wheat Chloroplasts. Occurrence and Changes Due to Light/Dark Treatment // Plant Physiol. 1999. V.121. P.245-251.

62. Bleecker A.B., Kende H. Ethylene: A Gaseous Signal Moleküle in Plants // Annu. Rev.Cell. Dev. Biol. 2000. V.16. P.l-18.

63. Borris H. Untersuchungen über Die Steuerung der Enzymaktivitüt in pflanzlichen Embryonen durchCytokinin // Wiss.Z.Univ.Rostock. Math.-naturwiss. Reihe. 1967. Bd. 16. S.629-639.

64. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method of the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein Dye Binding//Anal. Biochem. 1976. V.72. P.248-254.

65. Burkle L., Hibberd J.M., Quick W.P., Kuhn C., Hirner B., Frommer W.B. The IiT-Sucrose Cotransporter NtSUTl is Essential for Sucrose Export from Tobacco Leaves // Plant Physiol. 1998. V.l 18. P.59-68.

66. Charlesworth B., Langley C.N. The population genetics of Drosophila transposable elements // Ann. Rev. Genet. 1998. V.23. P.251-287.

67. Chen C.M. Biosynthesis and Enzymic Regulation of the interconversion of Cytokinin // Metobolis and Molecular Activis of Cytokinins / Eds GuernJ., Peaud-Lenoel C. Heidelberg: Spinger-Verlag, 1981. P.34-43.

68. Davies H.V., Sucar metabolism in stolon tips of potato during early tuberation // L. Planzenphysiol. 1984. Bd. 113. s. 377-381.

69. D'Agostino B., Deruere Y., Kieber J.J. Characterization of the Response of the Arabidopsis Response Regulation Gene Family to Cytokinin // Plant Physiol.2000. V.124. P.1706-1717.

70. Delaney T.P. Genetic Dissection of Acquired Resistence to Disease // Plant Physiol. 1997. V.l 13. P.5-12.

71. Ewing E.E. The role hormones in potato (Solanum tuberosum L.) tuberization (Plant Hormones, Physiology, Biochemistry and molecular Biology) Ed. Davies P.G. Dordrecht: Kluwer Acad. Hubl., 1995. p. 698724.

72. Feldman L.J. The generation and Elaboration of Primary Vascular Tissue Patterns in Roots of lea mays II Am. J. Bot. 1977. V.138. P.393-401.

73. Flores S., Tobin E.M. Cytokinin Modulation of LYCP mRNA Levels: The Involvement of Posttranscriptional Regulation // Plant Mol. Biol. 1998. V.l 1. P.409-417.

74. Gan S., Amasino R.M. Inhibition of Leat Senescence by Autoregulated Production of Cytokinin // Science. 1995. V.270. P. 1986-1988.113

75. Hall J.M., Couse J.F., Korach K.S. The Multifaceted Mechanisms of Estrogen Receptor Signaling // J.Biol.Chem.2001. V.276. P.36869-36872.

76. Harmey M.A., Croweley M.C., Clineh P.E.M. Effect of growth regulation on tuberization of cultured stem pieces of Solanum tuberosum // Eur.potato./ 1966. v. 9 p. 149-151.

77. Hussey G., Stacey N.I., Factor Affecing the formation of in vitro tubers of potato (solanum tuberosum L.)// Ann. Bot. 1995, v. 75, p. 565-578.

78. Hwang I., Sheen J., Two-Component Circuitry in Arabidopsis Cytokinin Signal Traduction//Nature. 2001. V. 413. P.383-389.

79. Inoue T., Higuchi M., Hshimato Y., Sekl M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. ^identification of CRE-1 as a Cytokinin Receptor from Arabidopsis|| Nature. 2001. V.409. P.1060-1063.

80. Ivanova M., Todorov I.I., Atanassova I., Dewitte W., van Onckelen H.A. Colocalization of Cytokinins with Proteins Related to Cell Proliferation in Developing Somatic Embrios of Dactylis glomerata L.// J.Exp. Bot. 1994. V.45. P.1009-1017.

81. Ivanov V.B. Temporal Control of Root Meristematic Cell Transition to Elongation and Differentiation / Abst. Botanikertagung. 2002. P.29.

82. Iwamura A., Hanaki N., Umeda H., Nakamura A., Suzuki T., Ueguchi C., Mizuno T. Response Regulators Implicated in His-to-Asp Phosphotransfer Signaling in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V.98. V.95. P.2691-2696.

83. Gutierrez R.A., Gustavo C.M., Green P.J. Current perspectives on mRNA stability in plants: Multiple levels and Mechanisms of control// Trends Plant Sci. 1999. V. 4. p. 429-438.

84. Johnson M.A., Baker E.J., Colbert J.T., Green P.J. Determinal of RNA stability in plants//Mechanisms determing mRNA Stability and Translation in Plants/Egs. Bailey-Serres J., Gallie D.R.N.Y.: Amer. Soc. Plant Physiol. 1998. P. 40-53.

85. Jones A.M., Petolino J.F. Effekts of donor plant genotype and growth environment on anther culture of softred winter wheat (Triticum aestium L.) // Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1987. V.8. P.215-223.

86. Kakimoto T. Plant Cytokinin Biosynthetic Enzymes as Dimethylallyl Diphosphat: ATP/ADP Isopentenyl-transferases // Plant Cell Physiol. 2001. V.677-685.

87. Kavi Kishor P.B., Hong Z., Miao G.-H., Hu C.-A.A., Verma D.P.S. Overexpression of A'-Pyrrolin -5-Carboxylate Synthetase Increase Proline Production and Confers Osmotolerance in transgenic Plants // Plant Physiol. 1995. V.108. P.1387-1394.

88. Keen N.T. The Molecular Biology of Disease Resistance // Plant. Mol. Biol. 1992. V.19. P. 109-122.

89. Koch K.E. Carbohydrate-Modulaled Gene Expression in Plant // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V.47. P.509-540.

90. Kudoyarova G.R., Farhutdinov R.G., Mitrochenko A.N., Teplova I.K., Dedov A.V., Veselov S.U., Kulaeva O.N. Fast Changes in Growth Rate and Cooling of Roots of Wheat Seedling // Plant Growth Regul. 1998. V.26. P.105-108.

91. Kuhn C., Franceschi V.R., Schulz A., Lemoine R., Frommer W.B. Macromolecular Trafficking Indicated by Localization and Turnover of Sucrose Transporters in Enucleate Sieve Elements // Science. 1997. V.275. P. 1298-1300.

92. Kulaeva O.N., karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. receptor of trans-Zeatin Involved in Transcription Activation by Cytokinin // FEBS Lett. 1995. V.366. P.26-28.

93. Kulaeva O.N., Zagranichnaya T.K., Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Hall M.A., Lipkin V.M., Boziev Kh.M. A New Family of Cytokinin Receptors from Cereals // FEBS lett. 1998. V.423. P.239-242.

94. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. V.227. P.680-685.

95. Maleck K., Lawton K. Plant Strategies for Resistance to Pathogen // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. V.9. P.208-213.

96. Mc. Grady J.J., Struik P.C., Ewing E.E. Effect of Exogenous application of cytokinin of the development of potato (solanum tuberosum L.) Cutting // potatoiRes. 1986. v. 29.p. 191-205.

97. Miller C., Skoog F., Okumura F., von Saltra M., Strong F. Isolation Structure and Synthesis of Kinetin, a Substance Promoting Cell Division // J.Am.Chem. Soc. 1956. V.78. P.1375-1384.

98. Morelli Z.K., Shewmaker Ch.K., Vayda M.E. Biphasis stimulation of translational activity correlates with induction of elongation factor I subunit a upon wonding in potato tubs//Plant Fisiology/-1994.-V.106.-P.897-903.

99. Morimoto R.I. Cells in Stress: transpositional activation of heat shok genes // Science. 1993. V.259. P.1409-1410.

100. Palmer C.E. Smith O.E. Effect of kinetin on tuber formation on isolated stolons of Solanum tuberosum L. cultured in vitro (Plant cell physiol. 1970. V.). P. 303-311.

101. Rajapakse D.P., Imal T., Ishige T. Analysis of Potato Microtubes proteins by Sodium Dogecylsulfate Polyacrylamid Gel Electrophoresis // Potato Research. 1991. V.34. P.285-293.

102. Riesmeier J.W., Willmitzen L., Frommer W.B. Evidence for an Essemential Role of the Sucrose Transporter in Phloem Loading and Assimilate Partitioning // EMBO J. 1994. V. 13. P. 1 -7

103. Rodermel S. Pathways of Plastid-to-Nucleus Signaling // Trends Plant Sci. 2001. V.6. P.471-478.

104. Sturm A., Guo-Qing Tang. The Sucrose-Cleaving Enzymes of Plants are Crusial for Development, Growth and Carbon Partitioning // Trends Plant Sci. 199. V.4. P.4001-4007.

105. Suzuku T., Miwa K., Ishikawa K., Yamada H., Aiba H., Mizuno T. The Arabidopsis Sensor His-Kinase, AHK, Can Respond to Cytokinins // plant Cell Physyol. 2001. V.42. P.107-113.

106. Taniguchi M., Kiba T., Sakakibara H., Ueguchi C., mizuno T., Sugiyama T. Expresión of Arabidopsis Response Regulador Homologs Is Induced by Cytokinins and Nitrate // FEBS Lett. 1998. V.429. P.259-262.

107. Thomashov M.F. Role of Cold-responsive genes in plant Freezing Tolerance//Plant Physiol. 1998. v. 118. p. 1-7.

108. Ueguchi C., Koizumi H., Suzuki T., Mizuno T. Novel Family of Sensor Histidine Kinase Genes in Arabidopsis thaliana // Plant Cell Physiol. 2001. V.42. P.231-235.

109. Vreugdenhil D., Helder H. Hormonal and MexabolikControl of tuber formation /progress in plant Growth regulations/ Eds Karsen C.V. et al. Dordrechi: K Luver Acod. Publ., 1992, p 393-400.

110. Xin-Xu, van Zammeren A.V., Vermer E., Vreugdenhil D. The role of Gilberellin, Abscisic Acid, and sucrose in the regulation of potato Tuber formation in vitro (Plant physiol. 1998. V 117. H7575-584.

111. Yakovleva L.A., Kulaeva O.N. The Effect of Phytohormones on Phosphorylation of Ribosomal Proteins in Detached Pumpkin Cotyledons// Biochem. Physiol. Pflanz. 1987. V.182. P.359-365.

112. Yusibov V.M., Pak Chun I.L., Andrianov V.M., Piruzian E.S. Phenotypically Normal Transgenic T-cyt Tobacco Plant as a Model for the Investigation of Plant Gene Expression in Response to Phytohormonal Stress//Plant Mol. Biol. 1991. V.17. P.825-836.

Информация о работе

Мирзохонова, Гулби Олтибоевна
кандидата биологических наук
Душанбе, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Влияние фитогормонов и водного дефицита на инициацию, рост клубней и активность белоксинтезирующей системы растений-регенерантов картофеля in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы