Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гена биосинтеза ауксина tmsl под контролем клубнеспецифического промотора на клубнеобразование картофеля in vitro

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние гена биосинтеза ауксина tmsl под контролем клубнеспецифического промотора на клубнеобразование картофеля in vitro"

На правах рукописи

Колачевская Оксана Олеговна

ВЛИЯНИЕ ГЕНА БИОСИНТЕЗА АУКСИНА tmsl ПОД КОНТРОЛЕМ КЛУБНЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ПРОМОТОРА НА КЛУБНЕОБРАЗОВАНИЕ КАРТОФЕЛЯ in vitro

03.01.05 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I 9 ФЕВ 2015

Москва-2015

005559277

005559277

Работа выполнена в лаборатории сигнальных систем контроля онтогенеза им. академика М.Х. Чайлахяна Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Романов Георгий Александрович

Официальные оппоненты:

Чуб Владимир Викторович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, профессор кафедры физиологии растений.

Шпаковский Георгий Вячеславович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, заведующий лабораторией механизмов генной экспрессии.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет.

Зашита состоится 14 апреля 2015 г. в часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.Факс: (499) 977-80-18, е-тай m-azarkovich@ippras.ru: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук www.ippras.ru.

Автореферат разослан 09 февраля 2015 г. Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат биологических наук

Азаркович Марина Ивановна

Актуальность проблемы. Картофель является одной из основных сельскохозяйственных культур в мире, поэтому вопросы регуляции клубнеобразования и роль фитогормонов в этом процессе имеют не только научное, но и большое практическое значение. С помощью классических методов физиологии растений показано, что клубнеобразование у картофеля находится под гормональным контролем. В общих чертах изучена динамика фитогормонов в онтогенезе клубней и выявлена важная роль гиббереллинов (ГА), в основном, как ингибирующих факторов, в гормональной регуляции клубнеобразования (Аксенова и др., 2012). Роль других фитогормонов в клубнеобразовании менее изучена. В случае ауксинов было показано, что введение ИУК в среду культивирования картофеля увеличивало число и ускоряло рост клубней (Аксенова и др., 2000; Romanov et al., 2000), а выросшие в почве крупные клубни содержали ИУК в большей концентрации по сравнению с мелкими клубнями (Пузина, 2000). Недавно путем точных измерений было показано, что концентрация ауксинов в кончиках столонов возрастает в несколько раз непосредственно перед инициацией клубней (Roumeliotis et al., 2012). Все это указывало на существенную роль ауксинов в процессах инициации и роста клубней. Однако к началу работы в литературе отсутствовали сведения о попытках создания новых форм картофеля с модифицированным синтезом ауксина. В этой связи представляло интерес изучить эффекты направленного изменения эндогенного содержания ауксинов в растениях картофеля, с использованием трансгенного подхода. В качестве гена биосинтеза ауксина был выбран агробактериальный ген tmsl, кодирующий фермент трансформации триптофана в индол-3-ацетамид - прямой предшественник ауксина.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение влияния трансгена биосинтеза ауксина tmsl под контролем клубнеспецифичного ВЗЗ-промотора гена пататина на эндогенное содержание ауксина, а также способности к клубнеобразованию растений картофеля in vitro в различных условиях выращивания.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Получить трансформированные растения картофеля, экспрессирующие ген tmsl с клубнеспецифичным промотором ВЗЗ.

2) Определить уровни экспрессии трансгена tmsl в клубнях и побегах у разных линий трансформантов.

3) Исследовать влияние, оказываемое экспрессией гена tmsl на эндогенное содержание ауксина и ряда других фитогормонов.

4) Изучить влияние трансгена tmsl на динамику образования клубней в условиях различной длины дня и при различном содержании сахарозы в среде.

5) Оценить влияние экзогенных фитогормонов на способность к клубнеобразованию у контрольных и трансформированных геном tmsl растений.

Научная новизна. На основе сконструированных векторов впервые получены трансгенные растения картофеля, содержащие агробактериальный ген биосинтеза ауксина tmsl под контролем клубнеспецифичного промотора пататина класса I (ВЗЗ-промотор).

Доказана органоспецифичная экспрессия гена tmsl в трансгенных растениях: увеличение в 3.5-4.4 раза содержания ауксина в клубнях, но не в побегах ВЗЗ-tmsl трансформантов картофеля. Показано, что преимущественная экспрессия tmsl в клубнях проявляется у большинства независимо трансформированных растений в возрасте 1-2 месяцев, хотя у более старых растений относительный уровень экспрессии этого трансгена варьирует. Обнаружено, что в результате трансформации геном tmsl в клубнях и побегах растений изменялось эндогенное содержание не только ИУК, но и некоторых других фитогормонов, в частности, жасмоновой и салициловой кислот. Факт повышения уровня ауксина при экспрессии tmsl прямо указывает на существование у растений картофеля двухстадийного п}ти биосинтеза ауксина, с индол-3-ацетамидом в качестве промежуточного продукта.

Установлено, что ВЗЗ-tmsl трансформанты картофеля характеризуются повышенным уровнем клубнеобразования in vitro в большинстве испытанных условий освещения и содержания сахарозы в среде, а степень позитивного влияния экзогенных гормонов (ИУК и кинетина) на клубнеобразование трансгенных растений существенно снижена по сравнению с контролем. Все эти результаты свидетельствуют об участии ауксина в регуляции клубнеобразования у картофеля.

Практическая значимость. Впервые предложен и осуществлен способ повышения продуктивности картофеля путем органоспецифичного увеличения содержания ауксина за счет экспрессии рекомбинантной полинуклеотидной последовательности ВЗЗ:tmsl преимущественно в клубнях. Полученные результаты могут быть использованы как в дальнейших исследованиях клубнеобразования картофеля, так и на практике. Данные фундаментального характера о направлении и механизмах влияния гена tmsl с клубнеспецифичным промотором на клубнеобразование картофеля и эндогенные уровни фитогормонов углубляют понимание комплексной гормональной регуляции этого процесса и полезны при подготовке лекционного материала для чтения курсов физиологии, биохимии и генетики растений в высших учебных заведениях. Практическое применение результатов данного исследования дает перспективы получения новых сортов картофеля повышенной урожайности и с более ранним и синхронным образованием клубней независимо от светового режима, что имеет большое значение, например, в высоких широтах.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной научной конференции «Современные аспекты генетической инженерии растений» (Киев, Украина, 2011); VII Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, Беларусь, 2011); VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); Third International Symposium «Intracellular Signalling and Bioactive Molecules Design» (Lviv, Ukraine, 2012); IV и V Всероссийских симпозиумах «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность» (Москва, 2012; 2014); Международной конференции «Биология -наука XXI века» (Москва, 2012); Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013); Годичном собрании Общества физиологов растений России и Международной научной конференции «Физиология растений -теоретическая основа инновационных arpo- и фитобиотехнологий» (Калининград, 2014); International Conference on Bioorganic Chemistry, Biotechnology and Bionanotechnology» (Moscow, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, | включая 1 главу в зарубежной монографии и 5 статей, в том числе 2 в зарубежном и отечественном рецензируемых журналах.

Струю-ура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение, I заключение и выводы, а также списка цитируемой литературы. Материалы i диссертации изложены на 128 страницах машинописного текста, содержат 6 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 140 источников, в т.ч. 111 зарубежных.

i

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования и культура in vitro. Объектом исследования служили растения картофеля сорта Дезире, которые выращивали на агаризованной среде Мурасиге-Скуга (МС) без гормонов с добавлением сахарозы (2%). Растения размножали одноузловыми черенками длиной около 1 см, далее культивировали в условиях длинного дня (ДД, световой период 16 ч) при 22-24°С, 4 недели до следующего черенкования. В опытах на клубнеобразование испытывали различное содержание сахарозы в среде: 1, 3, 5 и 8%; условия длинного и короткого (8 ч) дня (КД), а также полной темноты; добавление в среду гормонов: ИУК (1 мг/л) или кинетина(1 мг/л).

Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих ген tmsl (iaaM) под контролем промотора гена пататина ВЗЗ (проводилось в лаборатории проф. Я.И. Бурьянова, ФИБХ, Пущино). Агробактериальный ген триптофанмонооксигеназы

(1пк1, или /ааМ), отвечающий за первую стадию 2-стадийного пути биосинтеза ИУК, был клонирован в бинарный вектор рВт-ВЗЗ под контроль клубнеспецифичного промотора гена пататина класса I (ВЗЗ-промотор). Для трансформации растений готовили ночную культуру клеток А2гоЬааепит 1ите/аС1еп.ч, содержащих трансформирующий вектор рВт-ВЗЗ.

Агробактериальная трансформация картофеля. Здоровые листья 4-недельных пробирочных растений картофеля отрезали, удаляя 1 мм основания листа и надрезая главную жилку несколько раз поперёк с интервалом 1 мм. Экспланты помещали чашки Петри с 30-40 мл жидкой среды, содержащей 100 мкл бактериальной суспензии. В одну чашку помещали 10-15 листьев, на каждый эксперимент брали по 3-5 чашек. Чашки помещали на 15 мин на шейкер (50 грт) при комнатной температуре, и затем инкубировали 48 ч в темноте.

Регенерация побегов растений. Спустя двое суток инкубации в жидкой среде с агробактериями экспланты без отмывки переносили надрезами вниз на агаризованную среду для индукции каллусов и инкубировали 7-8 дней в условиях длинного дня при 27°С. За это время из раневой ткани начиналось развитие каллуса. Через неделю экспланты переносили на среду для регенерации побегов и инкубировали ещё 14-17 дней, после чего переносили их на свежую среду такого же состава каждые 10 дней, пока из почек, возникших на каллусе, не развивались побеги 2-3 см в длину. Побеги, достигшие этой длины, переносили на среду МС и в дальнейшем выросшие трансформанты размножали черенкованием, аналогично исходным растениям.

Выделение ДНК и РНК из растений для ПЦР. Выделение ДНК из растительных тканей проводили СТАБ-методом; выделение РНК - Тризольным методом.

Анализ геномной ДНК и кДНК трансгенных растений методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология). Реакцию проводили в объёме 25 мкл, содержащем 2.5 мкл (ЗЫТР, 2.5 мкл 10х буфера (Силекс), 0.3 мкл Н^Л^ полимеразы, 5 мкл геномной ДНК или 1 мкл кДНК, и по 10 пмоль каждого праймера. После начальной денатурации в течение 2 мин при 95°С проводили 30 циклов ПЦР (денатурация при 95°С в течение 50 с, отжиг при 55°С в течение 60 с, синтез при 72°С в течение 30 с) и выдерживали в конце 5 мин при 72°С.

ПЦР в режиме реального времени. ПЦР-РВ осуществляли на амплификаторе АНК-32 (Синтол). Реакцию проводили в объёме 25 мкл, содержащем 12.5 мкл БУВЯ-Огееп; 1 мкл кДНК (не менее 100 нг вещества) и по 0.1 мМ каждого праймера. Праймеры подбирали так, чтобы длина амплифицируемых фрагментов составляла =100 н.п. Аналитическая повторность опытов трехкратная. После начальной денатурации в течение 10 мин при 95°С проводили 30 циклов ПЦР-РВ (денатурация при 95°С в течение 15 сек, отжиг при 60°С в течение 30 сек, синтез при 72°С в

течение 30 сек) и выдерживали в конце 5 мин при 72°С. Исходное количество ДНК-матриц определяли по калибровочным прямым, построенным по данным ПЦР-РВ для генов домашнего хозяйства картофеля (актина и тубулина), взятых в четырёх концентрациях (исходная концентрация ДНК, разведения хЮ"1, хЮ"2, х10"3).

Определение содержания фитогормонов методом ультра-разрешающей жидкостной хроматограф»и/масс-спектрометрии (LC-MS/MS) проводили на базе лаборатории физиологии растений Университета г. Вагенингена, Нидерланды. Для определения ИУК 200 мг растительной ткани растирали в ступке с жидким азотом и дважды экстрагировали 1 мл холодного метанола, содержащего 0.1 нмоль/мл [фенил-,3С6]-ИУК в качестве внутреннего стандарта. Объединённые метанольные фракции очищали на анионообменных колонках, высушивали, перерастворяли в смеси ацетонитрил:вода:формалин (25:75:0.1) и пропускали через фильтры Minisart SRP40.45-mm (Sartorius). Количественное определение ИУК проводили с внешним стандартом ИУК на тандемном квадрупольном масс-спектрометре Waters Xevo. Количество ИУК определяли по калибровочной кривой с известными количествами внешних стандартов, с учетом площади пика внутреннего стандарта. Результаты анализировали, используя программное обеспечение MassLynx4.1 (Waters). Аналогичным методом проведено определение ряда фитогормонов и их метаболитов в одной пробе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика полученных линий /ffiii-трансформантов картофеля

Получение трансформированных растений. На первом этапе исследования на основе вектора клонирования PBS и бинарного вектора pBin-B33 был сконструирован вектор pBin-B33-tmsl, включающий ген биосинтеза ауксина Imsl, присоединенный к кпубнеспецифичному промотору гена пататина класса I (ВЗЗ-промотор). Этим вектором были трансформированы агробактерии Agrobacterium tumefaciens. Вектор трансформации, кроме целевой конструкции, содержал маркерный ген устойчивости к канамицину (npt II), что облегчало отбор трансформированных клонов как бактерий, так и полученных позднее растений. На втором этапе полученные трансгенные агробактерии размножали в жидкой среде LB и проводили агробактериальную трансформацию растений картофеля Solanum tuberosum L., используя листовые экспланты (см. «Объекты и методы»), В результате трансформации и последовательных гормональных воздействий на экспланты была получена серия растений-регенерантов, устойчивых к селективному агенту -антибиотику канамицину.

Отбор и проверка трансформантов. Для отбора клонов, содержащих целевую конструкцию ВЗЗ:lmsl, из молодых листьев этих растений выделяли тотальную ДНК и проводили ПЦР с праймерами, подобранными к встраиваемой конструкции таким образом, чтобы амплифицируемый участок ДНК начинался в последовательности промотора ВЗЗ, заканчивался в экзоне tmsl и имел достаточную протяжённость (375

н.о.) (Рис.1). Таким образом, мы исключали из дальнейшей работы линии, где ген синтеза ИУК был интегрирован в геном, но не находился под контролем клубнеспецифичного промотора. Отобранные таким образом растения были размножены черенкованием и выращивались в дальнейшем на среде без антибиотиков, содержащей 2% сахарозы, при 16-часовом (ДД) освещении белым дневным светом, т.е. в условиях, способствующих вегетативному росту надземных органов растений и неблагоприятных для клубнеобразования. В первых же пассажах обнаружилось, что некоторые линии существенно отстают в скорости роста от контрольных растений (линии А4-13 и А4-15) и имеют более мелкие листья. Эти линии не использовали в последующих исследованиях.

6/26 А1-2 А4-7 М А4-11 А4-13 А4-15« 7/29 К А4-8 А4-10 А4-12 А4-14 А4-18'

-375 н.о.

A4-19 А4-21 А4-24 М А5-5 А5-8 "» А4-20 A4-22 А4-25 А5-3 А5-6 Н2СИ

Рис. 1. ПЦР-анализ геномной ДНК на наличие конструкции ВЗЗ:tmsl. Обозначения продуктов ПЦР: 6/26, 7/29, - плазмидная ДНК разных клонов Е. coli, содержащая векторную конструкцию; А1-2, А4-7 и др. -ДНК независимо трансформированных этой же конструкцией линий картофеля; К - ДНК контрольных (^трансформированных) растений; М - маркёр молекулярной массы ДНК. Наличие полосы ампликонов размером 375 н.о. доказывает присутствие в ДНК трансгенных линий гена tmsl, слитого с промотором ВЗЗ.

Уже на этом этапе обнаружилось, что некоторые линии растений, несущих целевую конструкцию, образуют клубни при выращивании в условиях ДД и низкого содержания сахарозы в среде, хотя обычно этот процесс активизировался после 4-х недель вегетативного роста. Это согласовывалось с данными по положительному влиянию экзогенного ауксина на способность к клубнеобразованию (снижение влияния фотопериода и пороговой концентрации сахарозы), полученными ранее в нашей лаборатории (Аксенова и др., 2000; Romanov et al., 2000).

Из полутора десятков линий трансформированных конструкцией ВЗЗ:tmsl растений, для дальнейших исследований были отобраны те, которые мало отличались от контрольных по характеристикам вегетативного роста и развития, но проявляли способность образовывать клубни в неоптимальных условиях. Эти линии в возрасте 4-х недель были проверены на экспрессию встроенного гена методом ОТ-ПЦР после выделения тотальной РНК из клубней и побегов и обратной транскрипции.

Контролем служил ген пататина класса I, экспрессия которого, как и ожидалось, наблюдалась в основном в клубнях. В большинстве отобранных линий трансформантов действительно обнаружилась транскрипция гена /от^/, которая коррелировала с транскрипцией гена пататина (Рис. 2).

(те* Кк Кп А1-2к А4-7к А4-7п А4-8п А4-24п" А1-2п М А4-8к А4-24к

_ ___ -492 н.о.

ра(_ Кк Кп

А1-2к А4-7к А1-2п М

А4-7п А4-8п А4-24п А4-8к А4-24к "

-159 н.о.

Рис. 2. ПЦР-анализ кДНК, полученной обратной транскрипцией на выделенной из клубней (к) и побегов (п) РНК, с праймерами к целевому гену (верхний ряд) и контрольному гену «домашнего хозяйства» пататина (нижний ряд). Растения культивировали в течение 4 недель на ДД при 5% содержании сахарозы в среде. Клоны обозначены так же, как на Рис. 1. Результаты показывают корреляцию у большинства линий клубнеспецифичной экспрессии гена пататина класса I и встроенного гена

Таким образом, в результате генно-инженерных работ впервые были созданы трансгенные растения картофеля нового типа, экспрессирующие агробактериальный ген биосинтеза ауксина под контролем клубнеспецифичного промотора. Однако факт присутствия и экспрессии трансгена еще не гарантировал сам по себе клубнеспецифичного повышения уровня ауксина.

Поэтому наша дальнейшая работа была направлена на количественное изучение биохимических характеристик полученных трансгенных линий картофеля.

Анализ экспрессии трансгена. Измерение уровней экспрессии трансгена ¡тх I в клубнях и побегах четырёх независимых линий трансформантов проводили методом ПЦР в режиме реального времени, которые показали, что клубнеспецифичность экспрессии выражена в разных линиях в большей или меньшей степени. Экспрессия трансгена в клубнях была активней, чем в побегах, в большинстве измерений, особенно в период роста (4 недели) молодых клубней (Рис. 3). В этом возрасте уровень экспрессии гена в клубнях линии А1-2 превышал в 10.2 раза, в клубнях линии А4-7 - в 89 раз, а в линии А4-8 (8-недельные растения) - в И .6 раз уровень его экспрессии в побегах этих растений. По мере роста клубней уровни экспрессии изменялись по-разному, в зависимости от линии (Рис. 3, средние и правые столбики).

Наиболее стабильную экспрессию, и вместе с тем относительно небольшие различия между клубнями и побегами в позднем периоде культивирования показали линии А1-2 (Рис. За) и А4-8 (Рис. Зв). Между этими линиями наблюдалось также

сходство по способности к клубнеобразованию. Высокую активность гена 1тх 1 в клубнях в первые 2 месяца культивирования и резкое снижение её к 3-му месяцу культивирования показала линия А4-7 (Рис. 36). В отличие от остальных, у линии А4-24 в первый месяц наблюдалась невысокая и примерно равная для клубней и побегов экспрессия Шя], а максимум экспрессии приходился на 2-ой месяц (Рис. Зг).

51 •

1 2 4 недели

8 недель

01 ' ¡J 2,5

12 недель

0,5

4 недели 8 недель 12 недель

4 недели

8 недель

12 недель

I

4 недели

I

¡недель 12 недель

Рис. 3. Количественный ПЦР-анализ экспрессии гена tmsl в клубнях (коричневые столбики) и побегах (зелёные столбики) трансформированных линий картофеля разного возраста. Высота столбиков пропорциональна логарифму относительного содержания транскриптов tmsl. а) линия А1-2; б) линия А4-7; в) линия А4-8; г) линия А4-24.

Экспрессию трансгена в побегах можно объяснить описанным ранее (Rocha-Sosa et al., 1989; Наумкина и др., 2007) фактом активации промотора ВЗЗ высоким (3-10%) уровнем сахарозы, поскольку анализируемые растения выращивали на среде, содержащей 5% сахарозы для стимуляции клубнеобразования.

Определение содержания ИУК. Содержание эндогенной ИУК определяли в клубнях и побегах растений возрастом 4 недели методом ультраразрешающей

хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Из четырёх исследованных линий трансформантов три показали повышенное (в 3.5-4.4 раз) по сравнению с контрольными растениями содержание ИУК в клубнях, самое высокое содержание ИУК отмечено у линии А1-2, несколько более низкое, но сходное между собой у линий А4-7 и А4-8 (Рис. 4). При этом у трансформантов резко повышалось соотношение клубни:побеги содержания эндогенного ауксина до 1.4 в растениях линии А4-8, 1.45 в линии А1-2 и 1.98 в линии А4-7, по сравнению с 0.33 у контрольных растений. Характерно, что клон А4-24 с низким уровнем экспрессии трансгена обнаружил и относительно низкое содержание ИУК в клубнях.

100

> 5

80 -

60

40

20

контроль А1-2

А4-7

А4-8

А4-24

Рис. 4. Содержание свободной эндогенной ИУК в клубнях (коричневые столбики) и побегах (зелёные столбики) независимых линий ВЗЗ.Гт«/-трансформантов картофеля по отношению к ее содержанию у контрольных растений (пунктирная линия). Растения культивировали в течение 4 недель на ДЦ при 5% содержании сахарозы в среде.

Измерение содержания других фитогормонов в клубнях и побегах трансформантов выявило ряд дополнительных изменений гормонального статуса растений. В частности, в клубнях проявилась общая тенденция повышения содержания жасмоновой кислоты (Рис. 5а) и снижения содержания салициловой кислоты (Рис. 56). В побегах можно отметить заметное повышение уровня салициловой кислоты (Рис. 56), а также снижение содержания жасмоновой кислоты (Рис. 5а). Также отмечалось снижение содержания в клубнях цитокининов (данные не приводятся). Можно предположить, что сходные изменения в уровнях эндогенного содержания некоторых фитогормонов, наблюдаемые у всех или большинства линий независимых трансформантов, возникают как следствие изменения содержания ИУК. Надо отметить, что диапазон этих согласованных изменений нецелевых фитогормонов в клубнях в целом существенно меньше, чем диапазон изменений

ИУК, поэтому вряд ли эти изменения могут быть ведущими в проявлении фенотипических эффектов у трансформантов. Разнонаправленные изменения гормонального статуса, обнаруженные у отдельных линий независимых трансформантов, видимо, представляют собой особенности данных линий, которые могут влиять на их ростовые и физиологические свойства.

Рис.5. Эндогенное содержание жасмоновой кислоты (а) и салициловой кислоты (б) в клубнях и побегах независимых линий B33:fm.s./-трансформантов картофеля и контрольных растений. Растения культивировали в течение 4 недель на ДД при 5% содержании сахарозы в среде.

Изучение влияния трансгена tmsl на динамику образования клубней в условиях различной длины дня

Известно, что клубнеобразование у картофеля находится под комплексным контролем фитогормонов (Prat, 2004; Sarkar, 2008; Aksenova et al., 2014), а при выращивании in vitro этот процесс также сильно зависит от содержания сахарозы в среде (Gregory, 1956; Ewing, 1985). Кроме того, формы картофеля различаются по зависимости от длины дня - есть облигатно или факультативно короткодневные и нейтральные сорта. В последние десятилетия для изучения регуляции процессов онтогенеза успешно используются трансгенные формы картофеля. В частности, в предшествующих работах лаборатории (Аксёнова и др. 1999, 2000) было показано, что введение гена rolB (ауксиноподобный эффект) под контролем ВЗЗ-промотора повлияло на морфогенез растений картофеля и снизило зависимость процесса клубнеобразования от экзогенной сахарозы и светового режима.

Наши опыты с трансформантами нестрого-короткодневного сорта Дезире, содержащими ген tmsl, согласуются с этими результатами. Так, при выращивании растений в темноте при благоприятном содержании сахарозы в среде, инициация клубней у трансформантов по гену tmsl начиналась на неделю раньше контрольных растений и была более активной в первые 2 недели, после чего различия сглаживались при более высоком содержании сахарозы в среде (8%) и сохранялись при более низком (5%) (Рис. 6).

а б

Время, недели Время, недели

Рис. 6. Динамика клубнеобразования картофеля при выращивании контрольных и ВЗЗ :№51 -растений в темноте на среде МС с различными концентрациями сахарозы: 5% (а) и 8% (б).

В стимулирующем клубнеобразование световом режиме (КД) все исследованные линии трансгенных растений также начинали формировать клубни на 5-7 дней раньше контрольных растений и процесс заложения клубней происходил у них быстрее, хотя к концу эксперимента различия между ними и контрольными растениями по числу клубней были не очень существенными (в 1.25-1.6 раз) (Рис.7).

Время, неаели

—•— Контроль — А1-2

1 2 3 4 5 6 7

Время, недели

Рис. 7. Динамика клубнеобразования картофеля при выращивании контрольных и ВЗЗ -растений в условиях короткого дня (КД) на среде МС с различными концентрациями сахарозы: 5% (а) и 8% (б).

Наибольшие отличия от контрольных растений трансформанты проявили в неиндуцирующих условиях (ДД): здесь индукция клубней начиналась у них даже на бедной по сахарозе среде (3%) на 2-3-й неделе, тогда как контрольные растения

13

начинали формировать клубни начиная с 4-й недели. При более благоприятном для клубнеобразования содержании сахарозы в среде трансформанты по гену закладывали и развивали клубни быстрее и интенсивнее, чем контроль, опережая его в первые 3 недели в 4-5 раз, и сохраняя преимущество в 2 раза в конце эксперимента (6 недель) (Рис. 8). Таким образом, введение гена ускоряет переход к

клубнеобразованию и его интенсивность как в индуцирующих, так и, в ещё большей степени, в неиндуцирующих условиях освещения.

100

2345678 012345

время, недели Время, недели

Рис. 8. Динамика клубнеобразования картофеля при выращивании контрольных и В33:«т^7-растений в условиях длинного дня (ДД) на среде МС с различными концентрациями сахарозы: 3% (а); 5% (б); 8% (в).

2 3 4 5

Время, недели

Исследование зависимости клубнеобразования от содержания сахарозы в среде

У различных линий растений, экспрессирующих ген /тз1, наблюдалось снижение пороговой концентрации сахарозы в среде для инициации клубней по сравнению с контрольными растениями. Растения линии А1-2 образовывали клубни даже при 1% содержании сахарозы в среде на ДД к 5-й неделе; у контрольных растений ничего подобного не наблюдалось. В темноте и на ДД клубнеобразование у трансформантов начиналось при 3% сахарозы в среде со 2 недели, а у контрольных растений на неделю позже.

Экспрессия гена ускоряла инициацию клубней при благоприятном для

клубнеобразования содержании сахарозы в среде у большинства изучаемых линий в среднем на неделю: на 5% и 8% микроклубни появлялись у трансформантов начиная с 1-й недели при любом освещении, а у контрольных растений - только спустя еще неделю.

Во всех условиях выращивания количество клубней, образованных трансформантами, превышало соответствующее число у контрольных растений в 1.55 раз в течении всего времени культивирования (Рис. 9). Средняя масса одного клубня, в зависимости от линии трансформантов, превышала таковую в контроле на 81-250% на среде, содержащей 3% сахарозы (ДД); на 41-173% на среде с 5% сахарозы; и на 35-162% на среде с 8% сахарозы (КД+ДД) (Табл. 1).

А4-24 А4-8 контроль А1-2

Рис. 9. Клубни после 7 недель культивирования растений на ДД при 5%-ном содержании сахарозы в среде.

Таблица 1. Средняя масса одного клубня при выращивании растений в различных условиях освещения в зависимости от содержания сахарозы в среде.

Фотопериод Растения Масса клубня (мг) в зависимости от содержания сахарозы:

3% 5% 8%

кд Контроль 33±12а 81±15а 80±10а

А1-2 38±10* 101±15а 120±30а

А4-7 44±7а 114±10ь 190±8Ь

А4-8 21±5а 133±12ь 200±10ь

А4-24 30±10а 89±9а 67±15а

ДД Контроль 32±5а 77±4а 80±За

А1-2 112±20ь 166±17ь 210±40ь

А4-7 58±1с 88±6а 80±8а

А4-8 18±4d 210±90ь 108±20с

А4-24 30±9а 140±9Ь 85±7а

Таким образом, экспрессия трансгена 1т$1 ускоряла переход к клубнеобразованию и его интенсивность как в индуцирующих, так и, в ещё большей степени, в неиндуцирующих условиях освещения. В результате увеличения числа и средней массы клубней их урожайность (масса клубней на одно растение) у трансформантов значительно превышала таковую у контрольных растений в большинстве испытанных условий выращивания (Табл. 2). Растения линии А1-2 с относительно высокой и стабильной экспрессией трансгена и повышенным в 4.4 раза содержанием ИУК проявляли повышение продуктивности по сравнению с контролем в 2.1-5.9 раз во всех условиях культивирования. Меньше всего отличались по урожайности от контроля растения линии А4-24 (в двух случаях из шести, превышение в 1.9-2.5 раз), в которых содержание ИУК было наименьшим (в 1.3 раза выше контрольного). Линии А4-7 и А4-8, содержание ИУК в которых превышало контрольное, соответственно, в 3.7 и 3.5 раз, заняли промежуточное положение (по четыре случая из шести, превышение в 2.0-4.5 и 2.4-5.8 раз).

Таблица 2. Средняя урожайность клубней (мг) на одно растение в различных условиях выращивания

Фотопериод Растения Масса клубней (мг) в зависимости от содержания сахарозы в среде, %

3 5 8

кд контроль 3.3±1а 26.7±4а 40.1 ±6"

А1-2 9.5±2Ь 57.3±7Ь 96.0±13с

А4-7 4.4±1а 37.9±5а 157.7±12ь

А4-8 3.15±1а 63.3±9Ь 164.0±18ь

А4-24 3.0±1а 50.5±6Ь 46.9±5а

ДД контроль 6.1±2а 21.6±6а 30.0±5а

А1-2 36.9±8Ь 90.3±9С 172.2±14ь

А4-7 27.2±5Ь 43.0±8Ь 72.5±12с

А4-8 6.7±2а 124.7±13а 101.3±17с'

А4-24 8.4±0.9а 48.2±5Ь 74.4±9С

Влияние экзогенных гормонов на способность к клубнеобразованию трансформантов по гену «я.?/

Экспрессирующие ген ¡т$1 линии показали определённые отличия от контрольных растений по отношению к экзогенным фитогормонам. На среде с низким содержанием сахарозы (3%) добавление 1 мг/л ИУК стимулировало

клубнеобразование и у контрольных растений, и у трансформантов, но у последних стимуляция проявлялась только в первые 4 недели на ДД, после чего количество клубней на средах с ИУК и б/г выравнивалось, а у контрольных растений разница увеличивалась с 3-й недели до конца культивирования, достигая 30% к 7-й неделе. Добавление в среду 1 мг/л кинетина усиливало клубнеобразование у контрольных растений с 1-й недели, а у трансформантов - со 2-й; во всех вариантах разница достигала 15-50% к концу 7-й недели (Рис. 10).

а б

80 60 40

20

£ 100

г? юо

1 2 3 4 5 6 время, недели

1 2 3 4 5 6 7 время, недели

Рис. 10. Влияние экзогенных ИУК и кинетина на клубнеобразование контрольных растений и линий трансформантов по гену на

среде, содержащей 3% сахарозы, а-А1-2; б- А4-7; в- А4-8; г- А4-24; д-контроль

£ 100

2 3 4 5 6 7 8 время, недели

80 60 40 20

При выращивании на среде, содержащей 8% сахарозы, ИУК способствовала усилению клубнеобразования у контрольных растений с 1-й недели культивирования до 7-й; из всех линий трансформантов усиление клубнеобразования со 2-й недели отмечалась только у растений линии А1-2; у растений остальных линий клубнеобразование угнеталось при добавлении ИУК на 2-30% к концу 7-й недели. Добавление кинетина в среду стимулировало клубнеобразование у контрольных растений, начиная с 1-й недели, и приводило к 100% растений с клубнями на 4-й неделе, в то время как во всех линиях трансформантов проявлялось угнетение клубнеобразования до 3-й недели по сравнению с растениями на среде без гормонов, а 100%-ное образование клубней наступало лишь к 5-й - 7-й неделе (Рис. 11). а б

время, недели

время, недели

^ 100

1 2 3 4 5 6 7 время, недели

1 2 3 4 5 6 7 время, недели

Рис. 11. Влияние экзогенных ИУК и кинехша на клубнеобразование контрольных растений и разных линий трансформантов по гену Ш_з1 на среде, содержащей 8% сахарозы, а- А1-2; б- А4-7; в- А4-8; г- А4-24; д-контроль.

1 2 3 4 5 6 7 8 время, недели

Таким образом, реакция растений с введённым геном на экзогенные

фитогормоны была позитивной только при содержании сахарозы в среде ниже оптимального, а при его увеличении всё ярче проявлялось подавление клубнеобразования как экзогенным кинетином, так и, особенно, экзогенной ИУК. Вероятнее всего, это связано с повышенным содержанием эндогенного ауксина, когда избыток гормонов в среде начинает играть ингибирующую роль. Зависимость действия экзогенных фитогормонов от содержания сахарозы в среде указывает на взаимосвязь гормональной и углеводной регуляции клубнеобразования. Подобная связь была выявлена ранее в работах нашей лаборатории (МасЬаскоуа е1 а1. 1997; Аксёнова и др. 2000), хотя молекулярные механизмы её нуждаются в дальнейшем исследовании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клубнеобразование у картофеля - сложный процесс, регулируемый комплексом внешних (температура, освещение, минеральное снабжение) и внутренних (гормональный статус, углеводные запасы) факторов. С целью изучения участия одного из основных фитогормонов - ауксина - в регуляции этого процесса мы получили растения картофеля, трансформированные конструкцией с геном синтеза ауксина 1т$1 и изучили особенности физиологических реакций полученных растений в различных условиях культивирования. В нашей модельной системе экспрессия гена Шз1 в клубнях бьиа в целом выше, чем в побегах, что приводило к избирательному повышению содержания ИУК в клубнях. Факт повышения уровня ауксина при экспрессии /отя./ прямо указывает на существование у растений картофеля двухстадийного пути биосинтеза ауксина, с индол-3-ацетамидом в качестве промежуточного продукта. Обнаружено, что локальное повышение уровня ауксина ускоряет и усиливает процесс клубнеобразования, снижает зависимость клубнеобразования от длины дня и пороговый уровень углеводного снабжения, необходимый для формирования клубней. Повышение эндогенного содержания ИУК в клубнях оказало влияние на гормональный баланс у трансформантов и на их ответную реакцию на воздействие экзогенных фитогормонов (ауксина, цитокинина). Все эти результаты подтверждают участие ауксина в регуляции клубнеобразования у картофеля. Возможно, увеличение эндогенного содержания ИУК способствует образованию клубней у картофеля в неблагоприятных условиях.

выводы

1. На основе сконструированных векторов впервые получены трансгенные растения картофеля, содержащие агробактериальный ген биосинтеза ауксина tmsl под контролем клубнеспецифичного промотора пататина класса I.

2. С помощью обратной транскрипции и ИТ TP в режиме реального времени доказана органоспецифичная экспрессия гена tmsl в трансгенных растениях. Преимущественная экспрессия tmsl в клубнях проявлялась у большинства независимых трансформантов в возрасте 1-2 месяца.

3. Измерение содержания фитогормонов на основе метода ультраразрешающей жидкостной хроматографии/масс спектрометрии показало увеличение в 1.5-2 раза содержания ауксина в клубнях, но не в побегах ВЗЗ-гот^7-трансформантов картофеля.

4. Параллельно с изменением содержания ауксина обнаружены изменения в содержании других фитогормонов (жасмоновой и салициловой кислот, цитокининов) в клубнях В33-/т.у/-трансформантов картофеля.

5. B33-/m.v/-трансформанты картофеля характеризовались повышенным уровнем клубнеобразования in vitro в большинстве испытанных условий освещения и содержания сахарозы в среде.

6. Внесение в среду культивирования экзогенных фитогормонов - ИУК и кинетина -по-разному влияло на клубнеобразование трансформантов и контрольных растений; это влияние зависело от содержания сахарозы в среде. Фитогормоны, особенно ауксин, в целом в меньшей степени стимулировали клубнеобразование у B33-/ms/-трансформантов по сравнению с контрольными растениями.

7. Работа показывает возможности трансгенного подхода с использованием тканеспецифичных промоторов для направленного воздействия на гормональный баланс и клубнеобразование у картофеля.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Kolachevskaya О.О., Alekseeva V.V., Sergeeva L.I., Rukavtsova E.B., Getman I.A., Vreugdenhil D., Buryanov Y.I., Romanov G.A. (2014) Expression of Auxin synthesis gene tmsl under control of tuber-specific promoter enchances potato tuberization in vitro. J. Integrative. Plant Biology. Doi [ 10.1111 /j ipb. 12314].

2. Aksenova N.P., Sergeeva L.I., Kolachevskaya O.O., Romanov G.A. (2014) Hormonal regulation of tuber formation in potato. Bulbous Plants. Biotechnology. K.G. Ramawat & J.M. Merillon (eds.) CRC Press, p. 3-36.

3. Колачевская O.O., Алексеева B.B., Сергеева Л.И., Рукавцова Е.Б., Гетман

И.А., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2014) Синтез ауксина и клубнеобразование у трансформантов картофеля с клубнеспецифичной экспрессией гена tmsl. Сборник статей VВсероссийского симпозиума «Трансгенныерастения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность» Москва, 1-4 декабря, с. 121-124.

4. Аксенова Н.П., Сергеева Л.И., Константинова Т.Н., Голяновская С.А., Колачевская О.О., Романов Г.А. (2013) Регуляция покоя и прорастания клубней картофеля. Физиология растений, т. 60, № 3, с. 307-319.

5. Колачевская О.О., Алексеева В.В., Ломин С.Н., Сергеева Л.И., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2012) Изучение характеристик клубнеобразования у трансформантов картофеля с измененным гормональным статусом. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова., т. 8, № 4, с. 31-32.

6. Аксенова Н.П., Константинова Т.Н., Сергеева Л.И., Голяновская С.А., Колачевская О.О. (2010) Фотопериодическая и сахарозная зависимость накопления и распределения биомассы растений картофеля in vitro. Биологические основы садоводства и овощеводства. Материалы Международной конференции, Мичуринск-наукоград РФ, 22-25 сентября, т. 3. с. 32-37.

Тезисы

7. Kolachevskaya О.О., Alekseeva V.V., Sergeeva L.I., Rukavtsova E.B., Getman I.A., Buryanov Ya.I., Romanov G.A. (2014) An increase in organ-specific auxin activity enhances the tuberization of potato plants in vitro. «International Conference on Bioorganic Chemistry, Biotechnology and Bionanotechnology», Moscow, Russia, September 15-19, Acta Naturae-, Special issue, p. 28.

8. Колачевская O.O., Алексеева B.B., Сергеева Л.И., Ломин С.Н., Гетман И.А., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2014) Влияние гена биосинтеза

21

ауксина tmsl на клубнеобразование картофеля in vitro. Материалы Годичного собрания Общества физиологов растений России и Международной научной конференции «Физиология растений - теоретическая основа инновационных агро-и фитобиотехнологий», Калининград, 19-25 мая, ч. 1, с. 249-251.

9. Колачевская О.О., Сергеева Л.И., Алексеева В.В., Ломин С.Н., Бурьянов Я.И. (2013) Изучение гормональной регуляции клубнеобразования картофеля (Solanum tuberosum L.) Тезисы Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений», Москва, 2-6 июня, с. 64.

10. Колачевская О.О., Алексеева В.В., Ломин С.Н., Сергеева Л.И., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2012) Влияние генов биосинтеза основных фитогормонов под контролем ВЗЗ-промотора на содержание фитогормонов и способность к клубнеобразованию у трансформированных растений картофеля. Материалы Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Ред. Р.Г. Василов). М.: МАКС Пресс, с. 378-379.

11. Kolachevskaya О.О., Alekseeva V.V., Lomin S.N., Sergeeva L.I., Buryanov Y.I., Romanov G.A. (2012) Manipulation of endogenous hormone status and tuber formation in potato plants. Abstracts 3rd International Symposium «Intracellular Signalling and Bioactive Molecules Design», Lviv, Ukraine, 17-23 September, p. 65.

12. Колачевская O.O., Алексеева B.B., Ломин C.H., Сергеева Л.И., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2012) Взаимодействие экзогенных и эндогенных фитогормонов при формировании клубней у растений картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro. Тезисы IV Всероссийского симпозиума «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность» Москва, 19-23 ноября, с. 53.

13. Колачевская О.О., Алексеева В.В., Ломин С.Н., Сергеева Л.И., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2012) Исследование роли эндогенных фитогормонов в регуляции конкурентных отношений акцепторных органов картофеля (Solanum tuberosum L.)

с применением методов генной инженерии. Тезисы IV Всероссийского симпозиума «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность», Москва, 19-23 ноября, с .51.

14. Колачевская О.О., Алексеева В.В., Ломин С.Н., Сергеева Л.И., Бурьянов Я.И., Романо в Г.А. (2012) Эффект гена биосинтеза ауксина tmsl на формирование клубней и содержание фитогормонов в трансгенных растениях картофеля (Solanum tuberosum L.). Тезисы IV Всероссийского симпозиума «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность», Москва, 19-23 ноября, с. 52.

15. Колачевская О.О., Алексеева В.В., Ломин С.Н., Сергеева Л.И., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2011) Изучение влияния гена биосинтеза ауксина под контролем ВЗЗ-промотора на способность к клубнеобразованию трансформированных

растений картофеля. Тезисы Международной научной конференции «Современные аспекты генетической инженерии растений», Киев, Украина, 30 мая - 01 июня, с. 31.

16. Колачевская О.О., Сергеева Л.И., Алексеева В.В., Ломин С.Н., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2011) Влияние гена биосинтеза ауксина под контролем ВЗЗ-промотора на содержание фитогормонов и способность к клубнеобразованию у трансформированных растений картофеля. Тезисы VII Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений», Минск, Беларусь, 26-28 октября, с. 101.

17. Колачевская О.О., Алексеева В.В., Ломин С.Н., Сергеева Л.И., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2011) Получение трансформированных растений картофель с генов биосинтеза ауксина под контролем клубнеспецифичного ВЗЗ-промотора. VII Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (материалы докладов), Нижний Новгород, Россия, Часть 1, с. 348-349.

18. Ломин С.Н., Колачевская О.О., Сергеева Л.И., Романов Г.А. (2011) Получение с помощью Gateway-технологии (Invitrogen) генетических конструкций для создания трансгенного картофеля с измененным уровнем фитогормонов в клубне. VII Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (материалы докладов), Нижний Новгород, Россия, Часть 2, с. 430-431.

29. Колачевская О.О., Алексеева В.В., Гетман И.А., Ломин С.Н., Сергеева Л.И., Бурьянов Я.И., Романов Г.А. (2010) Получение трансформированных растений картофеля с геном биосинтеза ауксина под контролем клубнеспецифичного ВЗЗ-промотора. Тезисы III Всероссийского симпозиума "Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности", Москва, с. 53.

Заказ № 0139. Бумага офсетная. Подписано в печать 06.02.2015г Тираж 100 шт. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,75 Отпечатано в типографии ООО «Аналитик» г. Москва, ул. Клары Цеткин, д.18, стр. 3 . Тел. 617-09-24