Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура столонов и регуляция роста растений и клубнеобразование у картофеля in vitro

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Культура столонов и регуляция роста растений и клубнеобразование у картофеля in vitro"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

НАЗАРОВА НИГОРА НУРАХМАДОВНА

КУЛЬТУРА СТОЛОНОВ И РЕГУЛЯЦИЯ РОСТА РАСТЕНИЙ И КЛУБНЕОБРАЗОВАНИЯ У КАРТОФЕЛЯ IN VITRO

(03.00.12 - физиология и биохимия растений)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Душанбе - 2006

Работа выполнена в Институте физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан

Научный руководитель: член-корреспондеит

АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор К. А. Алиев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Бободжаков В.А.,

член-корр. АН Республики Таджикистан, доктор сельскохозяйственных наук, Фелалиев A.C.

Ведущая организация:

Таджикский аграрный университет

Защита состоится 06г. в/0_ часов на заседании

диссертационного совета Д047.001.01 при Институте физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан (734063, г. Душанбе, ул. Айни, 299/2). lab.gen@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Индиры Ганди АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан "/О' QjyUj Cg-gßQfi г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

£09 £ Джумаев Б.Б.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Прогресс в области современной биотехнологии растений непосредственно связан с разработкой методических приемов культивирования клеток in vitro. Этим методом получен ряд сомаклональ-ных линий, форм и сортов растений с ценными хозяйственными признаками, которые используются во многих странах мира.

С другой стороны, человеческое сообщество остро нуждается в новых знаниях и технологиях, с тем, чтобы увеличить производство продовольствия, улучшить состояние здравохранения и охрану окружающей среды. В решение этих проблем биотехнология вносит большой вклад. Поэтому применение методов биотехнологии в Республике Таджикистан является одним из важнейших факторов повышения урожайности сельскохозяйственных культур и, следовательно, экономического потенциала.

С использованием методов генной и клеточной инженерии получен ряд линий, форм культурных растений (картофель, соя, кукуруза и др.), обладающих признаками устойчивости к вирусам, патогенам и пластичности к стрессовым экологическим факторам. Благодаря этому сокращаются сроки получения новых сортов с хозяйственно полезными признаками и получения свободных от вирусов и патогенов семенного материала, что имеет большую перспективу для Республики Таджикистан.

В теоретическом плане представляет интерес изучение степени сортовой вариабельности ДНК, выявленной методом полимеразной цепной реакции (PCR), и физиологических процессов в культуре in vitro с целью разработки методов микроклонального размножения и микроклубнеобразо-вания картофеля.

Зависимость клубнеобразования от действия таких факторов, как световой режим (фитохром), гормональный статус,метаболизм углеводов и т.д. показана в ряде работ (Чайлахян, 1984; 1988; Аксенова и др., 2002; Кузнецов, Кулаева, 2004).

Вместе с тем, вопрос о конкретных путях действия фитогормонов и углеводов и их взаимодействии в процессе инициации клубнеобразования остается открытым, т. к. имеющиеся результаты не всегда можно итерпре-тировать однозначно (Hussey, Stacey, 1995; Davies,1984).

Так, для перехода регенерантов к клубнеобразованию in vitro необходимо наличие высокой концентрации сахарозы (5-10%), но есть сведения о том, что сахароза мало влияет на инициацию клубнеобразования. Также много неясного относительно роли фитогормонов в инициации клубней. Так показано, что гиббереллины способствуют росту столонов, но ингибируют формирование клубней (Simko, 1994; Eving, 1995; XinXu et. al., 1998).

Для активизации процесса клубнеобразования использовались различные сочетания гормонов и углеводов (Palmer, Smith, 1987; Бутенко,1990). Но эффективного образования микроклубней не было достигнуто, так как повышенное содержание сахарозы или кинетина не индуцировали дополнительного образования столонов с последующим образованием клубней. Не было получено положительных результатов и при культивировании микро-

черенков картофеля в темноте по методу G. Hussey и N.I. Stacey (1984), а также при изменении температурного режима (+12... +1 б°С). Поэтому исследование условий, стимулирующих столоно- и клубнеобразование у картофеля in vitro, остаётся актуальной задачей. Нам известны всего лишь две публикации (Mingo-Castel et.al., 1976; Sassey, Stacey, 1984), в которых сообщается о попытке культивировать столоны картофеля in vitro.

В последние годы многие используют новый подход для регуляции клуб-необразования картофеля in vitro. Так, в частности используются генетически трансформированные регенеранты картофеля с изменённым гормональным статусом, такие, как трансформанты, несущие гены roLB и roLC Agrobacterium Rhizogenes (Аксёнова и др., 2002).

Было бы важно изучить возможность использования столонов картофеля в гормональной и углеводной регуляции экспрессии генов, инициации и роста клубней в системе in vitro. Такое изучение до сих пор не проводилось при создании системы свободных от вирусов и патогенов клубней картофеля с использованием методов биотехнологии.

Считаем, что изучение процессов инициации и роста клубней in vitro с использованием культуры столонов позволит выяснить роль углеводов и гормонов в инициации роста клубней и применить возможности методов биотехнологии для клопального размножения картофеля.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является изучение особенностей культивирования изолированных столонов, возможности их использования в микроклональном размножении и регуляции клубнеобра-зования у генотипов картофеля. В соответствии с этим поставлены следующие задачи:

• разработка условий культивирования изолированных столонов картофеля;

• изучение ростовых процессов у регенерантов, полученных из изолированных столонов;

• изучение процессов микроклубнеобразования в зависимости от условий фотопериода;

• сравнительный анализ этапов клубнеобразования у картофеля в зависимости от воздействия углеводов в культуре in vitro.

Научная новизна работы.

« При изучении роста и размножения регенерантов картофеля in vitro обнаружена сезонность их морфогениой потенции, проявляющася в процессе микроклубнеобразования у пробирочных растений, а также при образовании столонов.

• Обнаружены некоторые особенности индукции роста изолированных столонов при изменении условий их культивирования in vitro. Полученные из столонов регенеранты обладают более высокой способностью к клубне-образовашио по сравнению с исходными меристемными растениями.

• Раработана эффективная методика культивирования столонов in vitro.

• Обнаружена сезонная зависимость каллусообразования у пробирочных растений, индуцируемых из столонов.

• Установление), что процесс клубнеобразования зависит от содержания углеводов и является фенотипической реакцией генотипов картофеля. При сравнении клубнеобразования различных генотипов картофеля (исходного сорта Жуковский-ранний и его температуроустойчивой линии-реге-ненранта) показана неоднозначная реакция по ряду характерных параметров роста, развития и индекса урожая на уровне пробирочных растений. Наиболее существенным отличием является усиление иннициации и роста клубней у клеточно-модифицированных растений под влиянием высокой концентрации сахарозы в культуральной среде по сравнению с исходным сортом Жуковский-ранний.

• Обнаружено, что процесс иннициации и темпа роста микроклубней в зависимости от концентрации сахарозы однонаправленны, но не одинаковы, так как масса сформировавшихся клубней в заключительной фазе их роста во многом определяется генотипом и, следовательно, требуют дифференцированных условий инициации и роста клубней in vitro.

• Установлена зависимость действия углеводов и гормонов в процессе дифференцировки столоновых клеток картофеля в культуре тканей in vitro, вызывающая активацию морфогенетической потенции растений.

Практическая значимость. Показана возможность использовния культуры столонов in vitro в практической биотехнологии картофеля. Регене-ранты, полученные из культуры столонов, обладают значительно более высокими темпами микроклубнеобразования и свободны от вирусов и патогенов, что позволяет наладить новую технологию микроклонального размножения с целью их ускоренного внедрения в семеноводство картофеля.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены/представлены на следующих конференциях, симпозиумах, совещаниях:

• Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений, Душанбе, 2004;

• Transgenic plants and biosafety, Moscow, 2004;

• Экономика и наука Горно-Бадахшанской автономной области: прошлое, настоящее, будущее, Хорог, 2005.

• Использование оздоровленного материала в семеноводстве картофеля, Муминобад, 2005.

• Конференции молодых ученых Таджикского аграрного университета, Душанбе, 2003-2005 гг.

• Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия, Вологда, Россия, 2005

• International Congress Bio Vision Alexandria, 2006

Структура и объем работы: Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, результатов исследований и их обсуждение, выводов, списка литературы. Работа изложена на 117 стр., содержит 26 рисунков, 9 таблиц. Количество цитированных источников 125.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект исследований. В качестве объекта исследований служили сорт картофеля (Solanum tuberosum L.) Жуковский ранний и температуроустой-чивая линия (ТУ-регенеранты), полученая от сорта Жуковский ранний (Дав-лятназарова и др., 2003). В Республике Таджикистан сорт Жуковский ранний зарекомендовал себя как перспективный, высокоурожайный и находится в процессе районирования. Эти растения переведены на культурную среду с использованием культуры апикальных меристем по рекомендации Института картофельного хозяйства РАСХН (2000) л по О.С. Мелик-Сар-кисову и др. (1988).

Столонообразоваиие in vitro. В опытах использовали пробирочные растения картофеля сорта Жуковский ранний. Для культивирования растений in vitro использовали питательную среду Мурасиге и Скуга (MC), содержащую 0,6 % сахарозы и 1; 1,5; 2,5 мг/мл кинетика в зависимости от задач эксперимента.

Растения выращивали в световой комнате при освещении 6 тыс. люкс, при 16 -часовом фотопериоде и температуре +20°С. Для индукции столонов использовали следующий способ: пробирочные растения в течение 12 ч поддерживали в световом режиме, затем помещали в темноту при температуре +22°С в течение 20-25 дней. В течение всего периода образования столонов питательную среду в пробирках не меняли. Измерение высоты растений и длины столонов отмечали каждые 10-15 дней.

Культивирование столонов in vitro. В работе использовали меристем-ные растения картофеля, культивируемые in vitro, сортов Жуковский ранний и Пикассо (среднепоздний). Культивирование изолированных столонов проводили на среде Мурасиге Скуга (MC) с добавлением 3-8 % сахарозы, 0,1-1,0 мг/л кинетика, 0,1-0,5 мг/л сх-нафтилуксусной кислоты (НУК) в темноте в течение 8-30 дней, с переводом на свет при +22°С. Растения выращивали при 1 б-часовом фотопериоде и температуре +22.. ,+23°С. В течение всего периода культивирования столонов питательную среду не меняли.

Для опытов по столоно- и клубнеобразованию использовали столоны размером 5-6 мм. С целью предотвращения истощения питательной среды использовали пробирки больших размеров (32X270 мм). После образования регенерантов из сегментов столонов растения черенковали обычным методом. Измерение высоты растений, длины столонов, инициацию клубней отмечали каждые 30 дней.

Условия образования микроклубней картофеля. В работе использовали регенеранты картофеля, полученные на основе сорта Жуковский ранний, несущие постоянно экспрессирующие гены устойчивости к высокой температуре (ТУ-регенеранты), и контрольные регенеранты сорта Жуковский ранний. Эти растения размножали клонированием in vitro на среде MC, содержащей 0,7% агара и витамины. Растения выращивали при 16-часовом освещении люминесцентными лампами дневного света.

В опытах использовали черенки с одним листочком, их высаживали на среду MC с 6% агаром и витаминами, содержащую от 2 до 9% сахарозы

(в зависимости от варианта), с добавкой или без 0,5-1,5 мг/л кинетина или нафтилуксусной кислоты (НУК). Растения культивировали в течение 70 дней при 16-часовом освещении или в темноте. Через каждые 5 дней регистрировали число образовавшихся клубней, а в конце опыта - сырую массу всех органов растений-регенерантов: корней, побегов с листьями и клубней. Содержание вирусов в регенерантах определяли методом иммунофер-ментного анализа (ИФА). Необходимые реактивы для анализа вирусов получали из Института картофельного хозяйства РАСХН (Коренево, Россия). Опыты повторяли 2-3 раза. Анализировали по 25 растений регенерантов. На графиках и в таблицах приведены усредненные арифметические значения всех опытов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Образование столонов картофеля в зависимости от сроков посадки черенков in vitro

Общее накопление сырой массы и распределение ее по органам растений - регенерантов в зависимости от сезонности показало, что распределение сырой биомассы по органам (стеблям, корням) существенно менялось в зависимости от сезонности культивирования растений в среде МС in vitro. Основная доля сырой массы стеблей накапливалась при выращивании в марте-мае и в январе-феврале. Накопление основной массы корней также приходилось на эти периоды. Увеличение биомассы корней имело место также при культивировании растений-регснерантов в июле-августе при низком приросте стеблей.

Таблица 1

Зависимость столонообразования от сроков черенкования пробирочных растений (% растений, имеющих столоны)

Сроки черенкования Сроки выращивания, дни Масса клубней, г

15 | 30 | 40 | 50 | 60

Столонообразование

Сентябрь-октябрь 0 0 12 10 0,155±0,017

Ноябрь-декабрь 0 0 0 9 11 0,147+0,012

Январь- февраль 0 0 0 7 12 0,21410,018

Март - апрель 0 0 42 97 93 0,388±0,010

Май- июнь 0 0 37 97 98 0,385±0,010

Июль - август 0 0 14 41 49 0,242±0,015

Высокий уровень образования столонов также был отмечен у растений, черенкованных в начале мая и конце июня (табл. 1). Столонообразова-ние к 40 дню выращивания наблюдалось у 37% растений и выросло до 98% после 50-60 дней выращивания. Следует отметить, что растения, черенкованные в июле-августе, развивались медленнее и образовывали столоны в

2 раза меньше. Растения, черенкованные в период с сентября по начало февраля, гораздо медленнее развивались и сголонообразование практически не наблюдалось. Образование столонов у этих растений было отмечено в конце ве

Среднее количество столонов на одно пробирочное растение, как правило, составляло 1,2 шт., а их длина - от 3,6 до 4,2 см. Количество ветвящихся столонов было очень небольшим и составляло обычно 1 на 40 пробирочных растений.

Особенности образования столонов in vitro. Столоны брали от пробирочных растений на самом раннем этапе инициации клубнеобразования. Стерильные столоны разрезали на небольшие сегменты размером 5-6 мм и погружали апикальной или нижней частями на питательную среду. Изолированные столоны картофеля культивировали в модифицированной среде МС, с добавкой 0,1 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК) и 0,5 мг/л фоли-евой кислоты, 0,1 мг/л кинетина, 3 % сахарозы при 16-часовом фотопериоде. Столоны сначала выращивали в течение 10-12 дней в темноте, затем переносили на обычный световой режим согласно методике культивирования пробирочных растений (16-часовой фотопериод). В этих условиях у сегментов столоны не развивались. Побеги начали образовываться от верхней части, находящейся над поверхностью питательной среды. Корни образовывались также из части столонов, находящихся на поверхности питательной среды. Общее количество побегов составляло около 65 %. Жизнеспособными оставались только те побеги, которые не были погружены в питательную среду.

Через 45-50 дней культивирования получались полноценные регенеран-ты, не отличающиеся от исходных пробирочных меристемных растений. Полученные таким образом регенеранты из столонов разрезали на сегменты с одним или двумя узлами и погружали на новую среду выращивания. При выращивании изолированных столонов было заметно образование регене-рантов как из нижней, так и верхних частей сегментов. Различия в индукции столоно- и клубнеобразования i [мели сортовую зависимость. Сто лоно- и клуб-необразование было высоким у сорта Жуковский ранний (90%), а у сорта Пикассо оно не превышало 50-65%. Таким образом, столоно- и клубнеобра-зование имело явно выраженный сортовой признак.

По высоте растений различий не было обнаружено. Высота растений обоих сортов не превышала 10-13 см, причем, во все периоды выращивания столоновых растений. Высота растений, по-видимому, в процессе столоно- и клубнеобразования особой роли не играла. Очевидно, значимым фактором был генетический и, возможно, гормональный статус растений. Количество столонов, образовавшихся у пробирочных растений, варьировало от 2 до 4, а их длина - от 1,5 до 5 см. Число образовавшихся микроклубней соответствовало количеству столонов на пробирочных растениях. Этот признак также имел сортовой характер.

Для объяснения этого явления в последующих опытах использовали различные варианты культуральной среды МС с добавлением гормонов и углеводов.

При повышении концентрации сахарозы до 8 % и кинетина до 1,0 мг/л не было обнаружено заметного изменения образования столонов и микроклубней у обоих сортов, но наблюдалось замедление роста и уменьшение количества столонов и клубней.

У некоторых регенерантов столоны начали ветвиться. На концах части столонов образовывались по одному клубневому утолщению. У большинства пробирочных растений столоны были короткими и на них сразу образовывались клубни.

Таким образом, изменение гормонального (1 мг/л кинетина) и углеводного (8% сахарозы) баланса в среде выращивания пробирочных растений не вызывало образования дополнительных столонов и микроклубней. У обоих использованных в опытах сортов картофеля отмечено изменение морфологии регенерантов (побегов). Верхняя часть побегов была похожа на клубни. На этих средах имело место укорачивание междоузлий. Кроме того, наблюдалось утолщение междоузлий и редукция листьев. При высоких концентрациях сахарозы, кинетина и НУК наблюдалось усиление столонооб-разования, их длина не превышала 1,2-1,5 см. При 3 % сахарозе и 0,1 мг/л НУК или кинетина она достигала 5-6 см. Таким образом, обнаружены некоторые закономерности индукции роста и развития столонов при изменении условий культивирования растений in vitro. Нам удалось разработать эффективный способ размножения изолированных столонов картофеля.

Рост и развитие регенерантов из столонов картофеля in vitro. Для выяснения морфогенетических процессов и увеличения фотосинтетической продуктивности в последние годы используются трансгенные растения картофеля (Аксёнова и др., 2002; Гришунина и др., 2004) как перспективное направление, имеющее как фундаментальное, так и прикладное значение.

В целях изучения роли физиологических факторов в клубиеобразова-нии в настоящей работе приведены результаты исследования эффекта различных факторов на фотопериодическую реакцию клубнеобразования тем-пературоустойчивых растений-регенерантов картофеля, выращенных в различных условиях фотопериода.

С этой целью исспользовали температуроустойчивые растения- регене-ранты и исходную форму - сорт Жуковский ранний в качестве контрольного варианта (рис. 1).

Контрольные растения при всех концентрациях сахарозы (5;7;9%) сформировали клубни как на ДД, так и на КД (кривые 1,2). Количество сформировавшихся клубней у этих растений на КД было выше по сравнению с растениями на ДД. При 7% -ой концентрации сахарозы контрольные растения формировали большее количество клубней, чем при 5 и 9%-ой концентрации сахарозы. Эти различия проявились чётко после 40-дневного культивирования растений. У ТУ-регенерантов наибольшая инициация клубней отмечена при 9% -ой концентрации сахарозы (кривая 4). ТУ-регенеранты проявили большую чувствительность к ингибирующему действию ДД, чем контрольные растения при такой же концентрации сахарозы (кривые 3,4). Следовательно, ТУ-регенерантам свойственна короткодневная фотопери-

одическая реакция клубиеобразования. Сравнение динамики инициации клубней у опытного варианта (ТУ-регенеранты) при 5;7;9 % содержания сахарозы выявило также зависимость ингибирующего действия ДД от уровня углеводного питания растений в условиях т \itro.

100

• ' х 90

1 80

5 70

5 60

£ 50

I 40

Ь зо а 20 10 0

Рис. 1. Динамика инициации образования клубней у регенерантов картофеля при различном содержании сахарозы в условиях длинного (ДД) и короткого (КД) дня. 1-КД, 2-ДД-исходный сорт Жуковский (контроль), 3-КД, 4-ДД-ТУрастения-регенеранты (опыт).

При низких концентрациях сахарозы (5%) в культуральной среде у ТУ-расгений-регенерантов на ДД уровень клубиеобразования был очень низким (6-17 %) во все периоды культивирования растений (кривая 4). В то же время повышение содержание сахарозы до 9 % увеличивало долю растений с клубнями до 30% (кривая 4), т.е. высокое содержание сахарозы у ТУ- растений-регенерантов в условиях ДД не привело к полному снятию ингибирующего эффекта непрерывного освещения. Сравнение динамики инициации клубней у контрольного и опытного вариантов выявило различие эффекта сахарозы на ингибирующее действие ДД. Наиболее отчетливо эти различия проявились в поздние сроки культивирования. Вместе с тем, доля растений с клубнями в контрольном варианте была выше, чем в опытном во всех вариантах эксперимента (рис. 2). Сравнение образования клубней у растений обоих вариантов показало зависимость инициации клубней от фотопериода, а также от содержания сахарозы в культивируемой среде. Активирующее действие сахарозы на снятие ингибирующего эффекта Д Д было выше у растений контрольного варианта, чем у ТУ - растений-регенерантов.

Так, количество растений с клубнями было на 20% выше в варианте КД, чем на ДД на среде 7% сахарозы в контрольном варианте. В то же время у ТУ-регенерантов влияние длины дня на клубнеобразование оказалось более зависимым от содержания сахарозы в культуральной среде. Эти растения на КД сформировали на 30% больше клубней, чем на ДД в зависимости от концентрации сахарозы. При 9%-ой концентрации сахарозы количество растений с клубнями было гораздо больше, чем при 5% и 7 % сахарозе. Следовательно, ТУ-регенеранты принципиально отличались по реакции

30 50 70 40 60 80 30 50 70

Время культивирования, дни

клубнеобразования от контрольного сорта Жуковский ранний как на ДД, так и в зависимости от содержания сахарозы в культуральной среде (рис. 3).

Рис. 2. Количество регенерантов, сформировавших клубни на 70-й день клубнеобразования в зависимости от фотопериодического и от содержания сахарозы в культуральной среде: 1-5% сахарозы; 2-7% сахарозы; 3-9% сахарозы (сорт Жуков-скийиТУ-регенеранты)

Рис.3. Динамика инициации образования клубней в условиях темноты на среде с различным содержанием сахарозы в культуральной среде на 40-й день выращивания А - сорт Жуковский (контрольный вариант), 1- 7% сахарозы; 2- 9% сахарозы, Б-температуроустойчивые растения-регенеранты (ТУ-регенеранты - опытный вариант), 1- 7% сахарозы; 2- 9% сахарозы.

В следующей серии опытов исследовали ростовые процессы растений в условиях разного фотопериода и при 7% и 9%-ой концентрации сахарозы в культуральной среде (табл.2). Как видно из данных таблицы, у растений контрольных вариантов больше образовалось мелких клубней, чем у ТУ-растений-регенерантов. Наблюдалось заметное увеличение общей сырой массы у растений опытных вариантов. Заметного увеличения массы клуб-

ней в зависимости от фотопериода в обоих вариантах опыта не наблюдалось. Также не была обнаружена зависимость величины массы клубней от концентрации сахарозы.

У всех опытных растений повышенное содержание сахарозы и КД вызвали увеличение сырой массы клубней. Следовательно, фотопериод оказал влияние на распределение сырой массы в пользу клубней. Доля массы клубней была несколько выше у клеточно - модифицированных растений на КД и при высокой концентрации сахарозы (9 %). Длина стебля растений в обоих вариантах опыта существенно не отличалась как на ДД, так и на КД. Концентрация сахарозы также не привела к изменению длины стебля растений.

Таблица 2

Действие ДД и КД на некоторые морфологические параметры регенерантов картофеля в зависимости от содержания сахарозы

Варианты Содержание сахарозы, % Фотопериод Средняя сырая масса, мг Длина стебля, см

клубней растения

Сорт Жуковский (контроль) 7 ДД 104,4± 9,3 401,6±36,2 8,7±0,25

9 ДД 92,3±6,4 332,4+50,2 10,3±0,5

7 КД 114,2 ±8,9 390,1 ±39,3 9,7+0,5

9 КД 113,5±10,3 389,2±43,1 9,4±0,4

ТУ-регенеран-ты (опыт) 7 ДД 123,3±11,7 470,2±27,2 7,8±0,6

9 ДД 136,1±10,2 563,4±22,4 8,2+0,6

7 КД 122,6+9,7 395,4±33,3 8,5±0,4

9 КД 161,7+14,2 672,4+35,2 9,5+0,6

Результаты опытов показали, что высокое содержание сахарозы в куль-туральной среде является основным условием инициации клубней. Культивируемые in vitro ТУ- растения - регенеранты существенно отличались от исходного сорта Жуковский ранний по ряду характерных изменений в регуляции инициации клубнеобразования. Наиболее характерным изменением в образовании клубней у ТУ - растений- регенерантов явилось усиление инициации клубней под влиянием высокой концентрации сахарозы, тогда как у контрольных растений картофеля (сорт Жуковский ранний) усиление образования клубней наблюдалось при низких концентрациях сахарозы. Необходимо отметить, что при культивировании растений обоих вариантов даже в непрерывной темноте инициация клубней ингибировалась высокой концентрацией сахарозы. Если у растений исходного варианта клубни образовывались более или менее равномерно в течение всего периода эксперимента, то у ТУ - растений - регенерантов клубни сформировались только в конце опыта. Таким образом, проведенные опыты свидетельствуют о

Таблица 3

Продолжительность вегетации и продуктивность столоиовых регенерантов картофеля сорта Жуковский ранний в зависимости от условий культивирования in vitro

Варианты опыта Продолжительность вегетации, дни Формирование клубней, % Сырая масса побегов, мг/расте ние Количество клубней на растении, шт. Общая сырая масса клубней, мг Масса одного клубня, мг Индекс урожая

Контроль (среда МС. 2 % сахароза, I мг/л ИМК) 85±7 63 443±71 1,3 162122 241212 0,4

Среда МС, 2 % сахароза, 1 мг/л ИМК 1 мг/л кинетина 87±5 65 511+65 1.8 450129 250127 0.8

Среда МС, 5 % сахароза, 0,1 мг/л кинетина, 1 мг/л ИМК 80±7 74 50617 2,2 607132 176143 1,2

Среда МС, 7 % сахароза, 0,5 мг/л кинетина, 1 мг/л ИМК 78+9 82 507±71 2,2 539134 245143 1.1

Среда МС, 2 % сахароза. 1 мг/л ИМК 1 мг/л НУК 78±4 88 71715 2,0 294123 47114 0.4

Среда МС, 5 % сахароза, 1 мг/л НУК, 0,5 мг/л кинетина 73+8 87 793177 3,1 11651217 376+19 1,6

Среда МС, 7 % сахароза, 1 мг/л НУК, 0,5 мг/л кинетин 78±4 89 743185 3,4 1123148 362132 1,6

сложности механизма клубнеобразования в зависимости от углеводного питания in vitro, фенотипическую реакцию генотипов картофеля на инициацию клубней, а также на рост вегетативных органов, которые и являются генотипическим признаком, проявляющимся даже на уровне культивирования растений картофеля in vitro.

Для выяснения этих вопросов в дальнейшем нами было изучена зависимость клубнеобразования у разных генотипов картофеля от концентрации сахарозы в культуральной среде регенерантов и полученных из них изолированных столонов картофеля.

Регуляция клубнеобразования у различных генотипов картофеля in vitro

Результаты опытов показали, что высокое содержание сахарозы в культуральной среде является основным условием инициации клубней. Культивируемые in vitro ТУ - растения - регенеранты существенно отличались от исходного сорта Жуковский ранний по ряду характерных изменений в регуляции инициации клубнеобразования. Наиболее характерным изменением в образовании клубней у ТУ - растений - регенерантов явилось усиление инициации клубней под влиянием высокой концентрации сахарозы. Тогда как у обычных растений картофеля (сорт Жуковский ранний) усиление образования клубней наблюдалось при низких концентрациях сахарозы.

Культивирование регенерантов на среде с кинетином (0,5-1,0 мг/л) не оказывало существенного влияния на новообразование различных органов, в том числе клубней. У растений всех вариантов образовались одинаковые сходные с контрольным вариантом по форме клубни (без кинетина). Как у ТУ-регенеранта, так и у исходного сорта Жуковский ранний при культивировании регенерантов на среде, содержащей различные концентрации сахарозы (2-9%) и низкие концентрации кинетина, образовались одинаковые по форме клубни. Количество клубней на одно пробирочное растение также было одинаковым в обоих вариантах и составляло от одного до двух клубней на растение. Особой формой отличались клубни, полученные на среде с высоким содержанием сахарозы (7-9%) и 1-2 мг/л кинетина-они имели неправильную форму,причем во всех вариантах опыта.

Новообразование органов - корней, стеблей, листьев между вариантами существенно отличалось. Так, рост корней резко ингибировался на среде, содержащей высокую концентрацию сахарозы (7-9 %) и 5 мг/л кинетина, к тому же у основания растений отмечено появление каллуса и густой щетки корней. В контрольном варианте рост корней задерживался и наблюдалась короткая щетка корней, на концах которых обычно появлялись небольшие бугорки темного цвета. Рост стеблей также угнетался при высоком содержании сахарозы и кинетина. Вместе с тем, ТУ - растения - регенеранты практически не регенерировались при высоком содержании сахарозы и кинетина. У них отмечалась густая щетка корней и удлинение побегов (стеблей). Культивирование регенерантов на средах, содержащих высокие

концентрации сахарозы и кинетина, стимулировало формирование "сидячих" клубней непосредственно в пазушной почке ТУ-регенеранта, тогда как у исходного сорт Жуковский ранний клубни чаще всего формировались на кончиках более развитых побегов.

Динамика накопления биомассы органов картофеля у разных генотипов картофеля in vitro

На рис. 4 приведена динамика накопления сырой массы и распределение ее по различным органам регенерантов в зависимости от концентрации сахарозы и кинетина. Общее накопление сырой массы напрямую зависело от концентрации фитогормона и сахарозы. Кинетин существенно менял распределение биомассы по органам регенеранта. На среде с кинетином основное содержание сырой массы отмечено в стеблях, тогда как на среде с высокой концентрацией сахарозы - в клубнях.

Культивироввние, дни

Рис.4. Сырая масса органов регенерантов различных генотипов картофеля в /печение 70 дней культивирования.

1 - сырая масса стебля,

2 - сырая масса клубня,

3 - сырая масса корней.

А - контрольный вариант (сорт Жуковский),

Б- опытный вариант (ТУ-регенерант).

Такая тенденция прослеживалась и имела место как в варианте с ТУ -растениями-регенерантами, так и у исходного сорта Жуковский ранний. Причем, у контрольного варианта количество формирующихся клубней зависело больше всего от содержания сахарозы в среде культивирования, а у ТУ-регенеранта (опытный вариант) формирование клубней зависело от

наличия кинетина и более высокой концентрации сахарозы. Во всех вариантах и на испытанных культивированных средах клубни имели противоположно направленный характер изменения. Это, возможно, является следствием антагонизма в акцептировании питательных веществ между растущими стеблями и формирующимися клубнями картофеля в условиях in vitro.

2% 5% 7% 9% 10%

Сахароза

Рис.5. Доля регенерантов, сформировавших клубни (А), и масса одного клубня (Б) при культивировании растений на среде с различными концентрациями сахарозы на 70-й день выращивания или в конце вегетации.

А. 1-доля растений с клубнями (контрольный вариант-сорт Жуковский), 2 - доля растений с клубнями (опытный вариант - ТУ-растение -регенерант). Б. 1- масса одного клубня (контрольный вариант), 2 - масса одного клубня (опытный вариант).

По всей вероятности, в гетеротрофных условиях питания (за счет куль-туральной среды и света) растущие органы регенеранта могут быть конкурирующими акцепторами. В последующих опытах были использованы раз-

личные концентрации сахарозы в процессе индукции столонов и инициации образования клубней. На рис. 5 показана зависимость инициации клубней (процент пробирочных растений (клонов), сформировавших клубни) от содержания сахарозы в среде выращивания, содержащей 0,5 мг/л кинетина. Как видно из приведенных данных, динамика инициации клубней на начальных этапах развития регенерантов в обоих вариантах существенно не отличалась. Средняя масса одного клубня, которая отражает скорость роста клубней у разных генотипов, существенно различалась.

У регенерантов опытных вариантов (ТУ - растение-регенерант) при низких концентрациях сахарозы (2%) в среде культивирования инициации клубней не происходило. При концентрации сахарозы 5% наблюдалось формирование одиночных клубней, а при 9% инициация клубней резко усиливалась. При повышении содержания сахарозы до 10% инициация образования клубней была небольшой.

В контрольных вариантах (исходный сорт Жуковский ранний) максимальное число клубней сформировалось при 5-7% концентрации сахарозы в культуралыюй среде. Инициация клубней у растений контрольных вариантов была существенно выше при низких концентрациях сахарозы. С дальнейшим повышением содержания сахарозы до 9%, хотя ускорялись темпы роста клубней, количество регенерантов, образовавших клубни, было ниже, чем при 5-7% концентрации сахарозы в культуралыюй среде. Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что в обоих вариантах эксперимента порог концентрации сахарозы, необходимый для ш шциации клубней, у разных генотипов неодинаковый. Содержание сахарозы 5-7% оказалось более благоприятным для исходного сорта Жуковский ранний (контрольный вариант), а для ТУ - растений -регенерантов (опытный вариант) порог концентрации сахарозы, инициирующий клубпеобразование, лежит между 7% и 9%. Как в контрольном, так и в опытном вариантах наблюдалось ингибирование инициации клубней при высокой концентрации сахарозы. Сравнение кривых зависимости инициации клубней и их массы от содержания сахарозы показало, что эти параметры увеличивались с повышением концентрации сахарозы. Вместе с тем, необходимо отметить различие между темпами инициации клубней и массы образовавшихся клубней в зависимости от содержания сахарозы в культуральной среде. Так, при низких концентрациях сахарозы масса клубней была ниже, чем при оптимальной. Если для контрольных растений - регенерантов оптимальной была 7%-я концентрация сахарозы, то для опытных она была выше - 9%. Анализ полученных данных позволяет высказать мысль о том, что как в контрольных, так и в опытных вариантах пороговая и оптимальная концентрации сахарозы для темпов роста клубней были сдвинуты в сторону более повышенной концентрации сахарозы по сравнению с процессами их инициации. Так, регенеранты контрольных вариантов (сорт Жуковский ранний) характеризовались более высокой способностью к инициации клубней при низких концентрациях сахарозы в культуральной среде, чем в опытных вариантах. Вместе стем, масса одного клубня контрольных вариантов коле-

балась в пределах от 0,111 мг до 364 мг, против 0,076-149 мг в опытных вариантах. Сходные результаты были получены при сравнении массы образовавшихся клубней с массой стеблей в обоих вариантах.

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что для каждого генотипа картофеля in vitro свойственна своя специфическая реакция на концентрацию сахарозы. Процессы инициации и темпы роста клубней в зависимости от концентрации сахарозы однонаправленны, но не тождественны, поскольку масса сформировавшихся клубней в заключительной фазе эксперимента и их количество во многом определялись генотипом картофеля и, следовательно, требуют разработки условий клубнеобразования для каждого сорта, линий и форм регенерантов, что имеет практическую направленность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Культивирование столонов картофеля in vitro открывает новые возможности для изучения физиологии клубнеобразования и поиска новых биотехнологических приемов, увеличивающих индексы урожая, а также позволяющих раскрыть механизмы гормональной и углеводной регуляции роста и развития растений.

Показана возможность использования культуры столонов in vitro для регуляции клубнеобразования картофеля. Обнаружено отсутствие сезонной зависимости клубнеобразования у пробирочных растений, индуцируемых из столонов. Отмечено изменение морфологии побегов при увеличении концентрации сахарозы и гормонов. Разработана методика культивирования столонов in vitro.

Подобраны оптимальные условия клубнеобразования у сорта Жуковский. Результаты, сведенные в табл. 3, отчетливо показывают, что количество образующихся клубней повышается при добавлении в культуральную среду 2-5% -го раствора сахарозы в сочетании с НУК и кинетином. В этих условиях масса клубней также выше, чем в вариантах с использованием других сред. Таким образом, среды 6 и 7 можно рекомендовать для получения микроклубней в системе in vitro. Добавление ИУК в сочетании с кинетином также не стимулирует процесс инициации роста клубней.

Столоновые растения по ряду морфологических признаков-количество и длина междоузлий, размер листовой пластинки-сходны с меристемными растениями, но по накоплению общей биомассы и времени иннициации клубней проявились существенные различия (табл.4).

Так, для столоновых регенерантов характерно более быстрое формирование корневой системы и инициация клубней по сравнению с меристемными растениями. Столоновые растения, выращенные in vitro, в отличие от меристемных растений (контрольных) характеризуются более быстрым кор-необразованием и более быстрым накоплением биомассы (за счет корней), что может быть обусловлено изменением в уровне усвоения углеводов. По другим морфогенетическим параметрам, таким, как количество и длина

междоузлий, общая площадь листьев, между столоновыми и меристемны-ми регеиерантами существенных различий не обнаружено.

Таблица 4

Морфологическая характеристика меристемных (контрольных) и столоновых растений картофеля сорта Жуковский-раиний

Параметры Контрольные растения Столоновые растения

Количество междоузлий, шт. 5,0+1,3 5,1 + 1.2

Длина междоузлий, см 1,4 ±0,4 1,2 ±0,3

Общая площадь листьев, см? 24,3 ± 3,9 23,7 ± 2,8

Сырая масса, (листья, стебель, корень), г 2,7 ± 0,8 3,4 ± 1,1

Время корнеобразования (дни после черенкования) 14,8 ± 2,1 8,4 ± 1,7

Время инициации клубней (дни после черенкования) 34,3 ± 5,9 22,7 + 4,4

Можно предположить, что различия в морфофизиологических параметрах у столоновых и меристемных регенерантов связаны с экспрессией генов гексокиназного цикла метаболизма углеводов, особенно фермента инвертазы, которая осуществляет конверсию сахарозы в глюкозу и фруктозу. Задержка этог о процесса и накопление в среде культивирования альдегида-глюкозы может оказать сильное влияние на процесс диффера щировки меристемных клеток, поскольку может проявиться мутагенный эффект, что повлечет за собой появление геномных и цитоплазматических изменений и что не наблюдается у столоновых регенерантов. Это может привести к улучшению инициации и роста клубней, что наблюдается у столоновых растений - регенерантов.

Другая важнейшая особенность столоновых регенерантов, на наш взгляд, это сокращение срока получения базисного семенного материала картофеля. Цикл получения базисного семенного материала у меристемных регенерантов доходит до 16 месяцев, а у столоновых примерно на 4 месяца меньше, т.е. составляет 12 месяцев.

Дальнейший прогресс в этом направлении во многом зависит не только от использования различных методических приёмов, но и более полного изучения особенностей культуры столонов и регуляции росга клубнеобра-зования в конкретных агрофизиологических условиях, что дает возможность разработать новые схемы селекции и семеноводства картофеля в Республике Таджикистан.

ВЫВОДЫ

1 .Разработан достаточно простой и эффективный способ культивирования изолированых столонов картофеля in vitro. Выявлены некоторые осо-

бенности индукции и роста столонов картофеля при изменении условий культивирования расгений-регенерантов. Наиболее эффективной оказалась среда с добавлением 5-7% концентрации сахарозы и НУК (1,0 мг/л) в сочетании с кинетином (0,5 мг/л). В этих условиях культивирования столоны давали полноцешше регенераты с высокой степенью морфогенетичсской потенции.

2 .Показано, что высокое содержание сахарозы в культуральной среде является основным условием инициации микроклубнеобразования. Культивируемые in vitro температуроустойчивые регенеранты (ТУ-регенеран-ты) существенно отличались от исходного сорта Жуковский ранний по ряду характерных изменений в регуляции клубнеобразования. Активизируется инициация клубнеобразования под влиянием высокой концентрации сахарозы и продолжительности периода роста клубня, тогда как у исходного сорта Жуковский ранний инициация клубнеобразования наблюдалась при низких концентрациях сахарозы и более коротких промежутках времени. Это свидетельствует о том, что инициация и рост клубней это генотипичес-ки детерменированный процесс, проявляющийся даже в условиях in vitro.

3 .Установлено влияние фотопериода (ДД и КД) на инициацию, рост клубнеобразования и распределение сырой массы независимо от генотипа картофеля. Клубнеобразование было больше у ТУ-регенерантов на КД и при высокой концентрации сахарозы. Фотопериод в условиях in vitro не привел к изменению морфогенетических признаков растений-регенералтов как у ТУ-регенерантов, так и у исходного сорта Жуковский ранний.

4.Установлено, что как у исходного сорта Жуковский ранний, так и у ТУ-регенерантов пороговая и оптимальная концентрации сахарозы для скорости роста были сдвинуты в сторону более повышенной концентрации сахарозы по сравнению с процессами инициации регенератов столонов. Регенераты исходного сорта Жуковский ранний характеризовались более высокой способностью к инициации клубней при низких концентрациях сахарозы в среде культивирования, чем у ТУ-регенерантов.

5. Полученные результаты указывают на то, что каждому генотипу картофеля in vitro свойственна своя, специфическая реакция на условия культивирования. Процессы инициации роста клубней в зависимости от содержания углеводов однонаправленны, но не одинаковы. Очевидно, этот процесс контролируется группой независимых генов, экспрессия которых является важнейшим фактором регуляции клубнеобразования, роста и развития растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Алиев К.А., Давлятназарова З.Б., Назарова H.H., Мирзохонова Г.О. Физиологические особенности регенерации растений картофеля. Международный симпозиум "Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности" (Transgenic plants and biosafety), Москва, 2004. Тезисы докладов. С. 23-24.

2.Давлятназарова З.Б., Каримов Б.К., Авгонова Х.Х., Мирзохонова Г.О., Назарова H.H., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования in vitro. Материалы научной конференции "Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений". Душанбе; Дониш, 2004. С. 62-63.

3. К.А. Алиев, H.H. Назарова, Г.О. Мирзохонова, Х.Х. Авганова, М.А. Алиев. Клеточно-модифицированные растения картофеля как модель изучения эффекта цитокининов на продуктивность in vitro. Материалы межд. конференции "Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия", 19-23 сентября, Вологда, 2005. С.7.

4.Давлятназарова З.Б., Мирзохонова Г.О., Назарова H.H., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования у различных генотипов картофеля in vitro. Материалы Респ. симпозиума "Экономика и наука Горно-Бадахшанской автономной области: прошлое, настоящее, будущее". Хорог, 2005. С.187-189.

5.Назарова H.H., Давлятназарова З.Б., Мирзохонова Г.О., Каримов Б.Б., Алиев К. А.. Образование столонов и микроклубней картофеля в зависимости от сроков посадки in vitro. Докл. All РТ, 2004, №11-12. С.92-101

6.Давлятназарова З.Б., Назарова H.H., Мирзохонова Г.О., Каримов Б.К., Эсаналиева Ш.А., Алиев К. А. Рост и клубнеобразование регенеран-тов картофеля в зависимости от условий выращивания in vitro. Докл. АН РТ, 2004, №11-12. С.79-92.

7.Назарова H.H., Мирзохонова Г.О., Алиева С.К., Каримов Б.К.,А-лиев К. А. Некоторые особенности образования столонов in vitro. Известия АН РТ, 2005, №3-4(153). С. 36-39.

8.Мирзохонова Г.О., Назарова H.H.,Давлятназарова З.Б., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования у различных генотипов картофеля in vitro. Известия АН РТ, 2005, № 3-4 (153). С.40-44.

9. Мирзохонова Г.О., Назарова H.H.,Давлятназарова З.Б., Каримов Б.К., Алиев К. А. Гормональная регуляция инициации и роста клубней реге-нерантов картофеля in vitro. Известия АН РТ, 2005, № 3-4 (153). С.45-51.

Подписано в печать 07.08.2006 г. Формат60х841/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100. Заказ № 07/01.

^Р Отпечатано в Типографии ПК «Поликомп» рснусомр г. Душанбе, 2 пр. Ш.Руставели, д. 6.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Назарова, Нигора Нурахмадовна

1. Введение.стр.

2. Обзор литературы.

2.1. Меристемы как саморегулирующая система и вопросы роста и развития растений in vitro.

2.2. Механизмы возникновения сомаклональной изменчивости растений.

2.3. Генетически-модифицированные растения как модель изучения физиолого-биохимических процессов устойчивости к стрессовым факторам среды.

2.4. Гормональная и углеводная регуляция клубнеобразования.

2.5. Генмодифицированный картофель и вопросы регуляции клубнеобразования.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Объекты и методы исследований.

3.2. Методика оздоровления картофеля.

3.2.1. Столонообразование in vitro.

3.2.2. Культивирование столонов in vitro.

3.2.3. Фотопериодическая реакция генотипов картофеля к КД и ДД.

3.2.4. Условия образования микроклубней картофеля.

3.2.5. Имунноферментный анализ вирусов картофеля.

4. Результаты исследований.

4.1. Образование столонов картофеля в зависимости от сроков посадки черенков in vitro.

4.2. Особенности образования столонов in vitro.

4.3. Рост и развитие регенерантов из столонов картофеля in vitro.

5. Регуляция клубнеобразования различных генотипов картофеля in vitro.

5.1. Действие сахарозы на репродукционные процессы in vitro.

5.2. Динамика накопления биомассы органов картофеля у различных генотипов in vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Культура столонов и регуляция роста растений и клубнеобразование у картофеля in vitro"

Актуальность проблемы. Прогресс в области современной биотехнологии растений непосредственно связана с разработкой методических приемов культивирования клеток in vitro. Этим методом получен ряд сомаклональных линий, форм и сортов растений с ценными хозяйственными признаками, которые используются во всех экономически развитых странах мира.

С другой стороны, человеческое сообщество остро нуждается в новых знаниях и технологиях, с тем, чтобы увеличить производство продовольствия, улучшить состояние здравохранения и охрану окружающей среды. В решение этих проблем биотехнология вносит большой вклад. Поэтому применение методов биотехнологии в Республике Таджикистан является одним из важнейших факторов повышения урожайности и, следовательно, экономического потенциала.

С использованием методов генной и клеточной инженерии получен ряд линий, форм культурных растений (картофель, соя, кукуруза и др.), обладающих признаками устойчивости к вирусам, патогенам и пластичности к стрессовым экологическим факторам. Благодаря этому сокращаются сроки получения новых сортов с хозяйственно полезными признаками и получения свободных от вирусов и патогенов семенного материала, что имеет большую перспективу для Республики Таджикистан.

В теоретическом плане представляет интерес изучение степени сортовой вариабельности ДНК, выявленой методом полимеразной цепной реакции (PCR), и физиологических процессов в культуре in vitro с целью разработки методов микроклонального размножения и микроклубнеобразования картофеля.

Зависимость клубнеобразования от действия таких факторов, как световой режим (фитохром), гормонов и, углеводов и т.д. показано в ряде работ X. Чайлахян, (1984; 19.88; Аксенова и др., 2002; Кузнецов, Кулаева, 2004).

Вместе с тем, вопрос о конкретных путях действия фитогормонов и углеводов и их взаимодействие в процессе инициации клубнеобразования остается открытым, т. к. имеющиеся результаты не всегда можно итерпретировать однозначно (Hussey, Stacey, 1995; Davies,1984).

Так, для перехода регенерантов к клубнеобразованию in vitro необходимо наличие высокой концентрации сахарозы (5-10%), но есть сведения о том, что сахароза мало влияет на инициацию клубнеобразования. Также много неясного относительно роли фитогормонов в инициации клубней. Так показано, что гиббереллины способствуют росту столонов, но ингибируют формирование клубней (Simko, 1994; Xin )lw et.al, 1998; E^rng, 1995).

Для активизации процесса клубнеобразования использовались различные сочетания гормонов и углеводов (Бутенко,1990; Palmer, Smith, 1987). Но эффективного образования микроклубней не было достигнуто, так как повышенное содержание сахарозы или кинетина не индуцировали дополнительного образования столонов с последующим образованием клубней. Не было получено положительных результатов и при культивировании микрочеренков картофеля в темноте по методу G. Hussey и N.I. Stacey (1984), а также при изменении температурного режима (+12, +16 0 С). Поэтому исследование условий, стимулирующих столоно- и клубнеобразование у картофеля in vitro остаётся актуальной задачей. Нам известно всего лишь две публикации (Sassey, Stacey, 1984; Mingo-Castel et.al. 1976), где сделана попытка культивировать столоны картофеля in vitro.

В последние годы многие используют новый подход для регуляции клубнеобразования картофеля in vitro. Так, в частности используются генетически трансформированные регенеранты картофеля с изменённым гормональным статусом, такие, как трансформанты, несущие гены roLB и roLC Agrobacterium Rhizogenes (Аксёнова и др., 2002).

Считаем, что изучение процессов инициации и роста клубней in vitro с использованием культуры столонов позволит выяснить роль углеводов и гормонов в инициации роста клубней и применить возможности методов биотехнологии для клонального размножения картофеля, что и явилось целью наших исследований.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение особенностей культивирования изолированных столонов, возможности их использования в микроклональном размножении, зависимости различных этапов клубнеобразования у генотипов картофеля. В соответствии с этим, поставлены следующие задачи исследований:

• разработка условий культивирования изолированных столонов картофеля;

• изучение ростовых процессов регенерантов, полученных из изолированных столонов;

• изучение процессов микроклубнеобразования у различных генотипов в зависимости от условий фотопериода;

• сравнительный анализ этапов инициации и роста клубнеобразования картофеля в зависимости от воздействия углеводов в культуре in vitro.

Научная новизна работы:

• При изучении роста и размножения регенерантов картофеля in vitro обнаружена сезонность их морфогенной потенции, проявляющая в процессе микроклубнеобразования у пробирочных растений, а также при образовании столонов.

• Обнаружены некоторые особенности индукции роста изолированных столонов при изменении условий их культивирования in vitro. Полученные из столонов регенераты обладают более высокой способностью к клубнеобоазованию по сравнению с исходными тодика культивирования столонов in vitro.

• Обнаружена сезонная зависимость калусообразования у пробирочных растений, индуцируемых из столонов.

• Установленно, что процесс клубнеобразования зависит от содержания углеводов и является фенотипической реакцией генотипов картофеля. При сравнении клубнеобразования различных генотипов картофеля (исходный сорт Жуковский-ранний и его температуроустойчивой линии-регененранта) показана неоднозначная реакция по ряду характерных параметров роста, развития и индекса урожая на уровне пробирочных растений. Наиболее существенным отличием является усиление иннициации и роста клубней у клеточно-модифицированных растений под влиянием высокой концентрации сахарозы в культуральной среде, по сравнению с исходным сортом Жуковский-ранний.

• Обнаружено, что процесс иннициации и темпа роста микроклубней в зависимости от концентрации сахарозы однонаправленны, но не тождественны, так как масса сформировавшихся клубней в заключительной фазе их роста во многом определяется генотипом и, следовательно, требуют дифференцированных условий инициации и роста клубней in vitro.

• Установлена зависимость действия углеводов и гормонов в процессе дифференцировки столоновых клеток картофеля в культуре тканей in vitro, вызывающая активацию морфогенетической потенции растений.

Практическая значимость. Показана возможность использовния культуры столонов in vitro в практической биотехнологии картофеля. Регенеранты, полученные из культуры столонов, обладают значительно более высокими темпами микроклубнеобразования и свободны от вирусов и патогенов, что позволяет наладить новую технологию микроклонального размножения с целью их ускоренного внедрения в семеноводство картофеля.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены/ представлены на следующих конференциях и симпозиумах:

• Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений, Душанбе 2004;

• International symposium Transgenic plants and biosafety , Moscov, 2004;

• Республиканский симпозиум экономики и науки ГБАО: прошлое, настоящее, будущее, Хорог, 2005.

• Научно-практическое совещание «Использование оздоровленного материала в семеноводстве картофеля», Муминобад, 2005.

• Конференции молодых ученых Таджикского аграрного университета, Душанбе, 2003-2005 гг.

• Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия», Вологда, - Россия 2005г.

• International Congress BioVision Alexandria, 2006.

Структура и объем работы: Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 117 стр., содержит 26 рисунков, 9 таблиц. Количество цитированных источников 125.

Публикации. По материалам диссертаций опубликовано 6 экспериментальных работ, 7 тезисов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Назарова, Нигора Нурахмадовна

Выводы

1. Разработан простой и эффективный способ культивирования изолированых столонов картофеля in vitro. Выявленны некоторые особенности индукции и роста столонов картофеля при изменении условий культивирования растений-регенерантов. Наиболее эффективным оказалась 5-7% концентрация сахарозы и НУК (1,0 мг/л) в сочетании с кинетином (0,5 мг/л). В этих условиях культивирования столоны давали полноценные регенеранты с высокой степенью морфогенетической потенции.

2. Показано, что высокое содержание сахарозы в культуральной среде является основным условием инициации микроклубнеобразования. Культивируемые in vitro температуроустойчивые регенеранты (ТУ-регенеранты) существенно отличались от исходного сорта Жуковский ранний по ряду характерных изменений в регуляции клубнеобразования. Активируется иннициация клубнеобразования под влиянием высокой концентрации сахарозы и продолжительности периода роста клубня, тогда как у исходного сорта Жуковский ранний иннициация клубнеобразования наблюдалось при низких концентрациях сахарозы и более коротких промежутках времени, это свидетельствует о том что, инициация и рост клубней это генотипически детерменированный процесс, проявляющийся даже в условиях in vitro.

3. Установлено влияние фотопериода (ДД и КД) на инициацию, рост клубнеобразования и распределение сырой массы независимо от генотипа картофеля. Клубнеобразование было больше у ТУ-регенерантов на КД и при высокой концентрации сахарозы. Фотопериод в условиях in vitro не привел к изменению морфогенетических признаков растений-регенерантов как у ТУ-регенерантов, так и у исходного сорта Жуковский ранний.

4. Установлено, что как у исходного сорта Жуковский ранний, так и у ТУ-регенерантов пороговая и оптимальная концентрация сахарозы для темпов роста были сдвинуты в сторону более повышенной концентрации сахарозы по сравнению с процессами их инициации. Регенеранты исходного сорта Жуковский ранний характеризовались более высокой способностью к инициации клубней при низких концентрациях сахарозы в среде культивирования, чем у ТУ-регенерантов.

5. Полученные результаты указывают на то, что каждому генотипу картофеля in vitro свойственна своя, специфическая реакция на условия культивирования. Процесс инициации темпа роста клубней в зависимости от содержания углеводов однонаправленны, но не тождественны. Очевидно, этот процесс контролируется группой независимых генов, экспрессия которых является важнейшим фактором регуляции клубнеобразования, роста и развития растений.

Заключение

Производство высоко продуктивного семенного материала картофеля во всех развитых странах основаны на применении, биотехнологии микроклонального размножения в культуре in vitro и in vivo. Для этого необходимо в культуре in vitro использовать сорта картофеля на сортовую типичность, продуктивность, отсутствие латентной инфекции, вирусов и вироидов и бактериальных болезней. Мы использовали следующие варианты перевода растений в культуру in vitro . а. Для здоровых клонов

Верхушки ростков здоровых клубней выращенных на свету (размером 0,5-1,0 см.) стерилизовали 7 мин. в растворе диацида (0,2%), затем промывали 3 раза по 1 мин. в автоклавированной воде, 1 раз по 1 мин. в 70 % этиловом спирте и ещё 1 раз промывали в автоклавированной воде. Стерильные ростки высаживали на среду Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением РНК-азы в концентрации 10 "4 м. б. Растения с сомнительной оздоровленностью.

При отсутствии исходных клонов оздоровительного материала, необходимо осуществлять выше указанную процедуру путём получения in vitro растений из пазушных или верхушечных почек. Для этого экспланты размером 1,5-2,0 мм. переносят в питательную среду МС для меристем с добавлением 10'4 м РНК-азы. Использование РНК-азы увеличивает выход свободных от вирусов растений в 2-3 раза. Растения , оздоровленные этим высказать мысль о том, что как у контрольных, так и у опытных вариантов пороговая и оптимальная концентрации сахарозы для темпов роста клубней были сдвинуты в сторону более повышенной концентрации сахарозы по сравнению с процессами их инициации. Так, регенеранты контрольных вариантов (сорт Жуковский ранний) характеризовались более высокой способностью к инициации клубней при низких концентрациях сахарозы в культуральной среде, чем в опытных вариантах (клеточно-модифицированные). Вместе с тем, масса одного клубня контрольных вариантов колебалась в пределах 0.111мг до 364 мг, против 0.076-149 мг в опытных вариантах. Сходные результаты были получены при сравнении массы образовавшихся клубней с массой стеблей у обоих вариантов.

Итак, полученные результаты указывают на то, что для каждого генотипа картофеля in vitro свойственна своя специфическая реакция на концентрацию сахарозы. Процессы инициации и темпа роста клубней в зависимости от концентрации сахарозы однонаправлены, но не тождественны, поскольку масса сформировавшихся клубней в заключительной фазе эксперимента и их количество во многом определялись генотипом картофеля и, следовательно, требуют разработки условий клубнеобразования для каждого сорта, линий и форм регенерантов, что является задачей дальнейших исследований. методом использовали для получения меристем и размножали в культуре in vitro путём черенкования (до 5-6 раз) на питательной среде МС с добавлением 0,25 - 0,5 мг НУК 1,0 мг/л ИМК что увеличивает коэффициент размножения в 1,5-2 раза.

Для повышения адаптационной способности растения выращивали in vivo на различных субстратах: почва, песок, почва-песок (1:1), почва - навоз (1:1), навоз. Коэффициент приживаемости растений увеличивался до 90-93% в полевых условиях.

Поэтому развитие методической базы прикладной биотехнологии позволяет разрабатывать технологию получения свободных от вирусов и растений картофеля с высокой потенцией урожайности в культуре in vitro. Для этого необходимо развитие ряда теоретических вопросов, таких как, действие и взаимодействие регуляторных факторов (гормонов, углеводов), их роль в реализации генетической информации в процессе репродуктивных функций растений и в управлении этими явлениями в системе in vitro и/или in vivo. Нами на примере регенерантов картофеля разрабатывались вопросы гормональной и углеводной регуляции морфогенетической потенции растений. В данной работе, вопрос морфогенетического контроля основывается на регуляторной роли углеводов и сравнении системы регенерации растений различного происхождения (меристемных или столоновый).

Исходя из этого положения изучали явления различных концентраций углеводов (сахарозы), НУК, Кинетина, фолиевой кислоты, 2,4-Д на индукцию роста, развитие и микроклубнеобразование в условиях in vitro.

Кроме того, испытывались различные среды культивирования столонов содержащие разные концентрации агара. Обычная среда содержит 0,7% агара и среда содержимого 0,3% агара -жидкая среда, которая была использована нами в сравнительных экспериментах. Как показывают полученные нами результаты регенерация столонов в жидкой среде имеет высокую морфогенетическую потенцию, чем выращивание их в твёрдой среде in vitro (табл. 7). Наиболее активное каллусообразование наблюдается при использовании в системе in vitro фолиевой кислоты, НУК, глютамина. В этих условиях процент каллусообразования составляет более 50%, с побегами 90%. В других исследованных средах образование каллусов и побегов было значительно ниже. Добавление в среду культивирования столонов 2,4Д в низких концентрациях (0,1 мг/л) значительно увеличивало образование каллусов (до 78%), но сильно снижало образование побегов. В этих условиях выращивания столонов процент каллусов с побегами составлял 40% т.е. был в два раза ниже чем в среде без 2,4Д.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Назарова, Нигора Нурахмадовна, Душанбе

1. Абдулаев Х.А., Каримов Х.Х. Индексы фотосинтеза в селекции хлопчатника. Издательство «Дониш». 2001. 267с.

2. Аксенова Н.П., Константинова Т.Н., Голяновская С.А., ГукасянИ.А., Гатс К., Романов Г.К. Клубнеобразование и рост в культуре in vitro трансгенного картофеля с суперпродукцией фитохрома В. // Физиология растений, 2002, т. 49, стр. 535-540.

3. Алиев К.А. Молекулярные механизмы биогенеза хлоропластов // Автореф. докт. диссер., Минск, 1985.

4. Алиев К.А., Каримов Б.К., Возделывание оздоровленного картофеля в Таджикистане. Изд: « Дониш», 1997г стр.43

5. Алиев К.А. Молекулярные механизмы биогенеза хлоропластов растений. Из-во «Дониш», 1998, 72с.

6. Алиев К. А., Насырова Ф. Ю., Давлятназарова 3. Б. Перспективы развития современной биотехнологии. Сборник трудов конф. «Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений», Дониш, Душанбе, 2004 Стр.25-27.

7. Батыгина Т.Б. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей.// Физиология растений. 1999. Т.46., с.884-894.

8. Бургутин А. Б., Бутенко Р. Г. , Кауров Б. А. , Ниссанка Иддагода . Селекция картофеля in vitro на устойчивость кхлористому натрию//. Физиология растений, 1996. Т.43, №4, стр.597-605.

9. Бутенко Р.Г. Некоторые физиологические проблемы при культивировании картофеля in vitro // Регуляция роста и развития картофеля // Под ред. Чайлахяна М.К. и др. М.: Наука, 1990. с.88-98.

10. Гришунина Е.В., Сергеева JI.H., Гукасян И.А., Романов Г.А. Углеводный метаболизм в процессе клубнеобразования у трансгенного картофеля. Тезисы Междун. симпоз. «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности ». Москва: 2004, стр. 34.

11. Глеба Ю.Ю., Пивень Н.М., Комарницкий И.К., Сытник К.М. Паросексуальные цитоплазматические гибриды N. tabacum + N. debney; полученные слиянием протопластов // Докл. АН. СССР 1978. 240, № 5. с.1223-1226.

12. Гостимский С., Багрова A.M.,Ежова Т.А. Обнаружение и цитогенетический анализ изменчивости, возникающей при регенерации растений и культуры тканей полевого гороха// Там же 1985-283, №4 - с. 1007 - 1011.

13. Давлятназарова З.Б., Алиев К.А., Бабаджанова М.П., Авганова Х.Х. Получение линий картофеля, устойчивых к высокой температуре с использованием методов биотехнологии. // Докл. АН РТ. 2003. № 5- 6, стр. 61-69.

14. Давлятназарова 3. Б., Каримов Б. К., Авгонова X. X., Мирзохонова Г. О., Назарова Н. Н., Алиев К. А. Регуляция клубнеобразования in vitro. Сборник трудов Конф.

15. Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений», Дониш, Душанбе, 2004, Стр.62-63

16. Жуковский М.П. Культурные растения и их сородичи. JI: Колос, 1971, стр.750.

17. Зыкин А.Г. Проблемы обеспечения России картофелем -«вторым хлебом». Вопросы картофелеводства. ВНИИКХ. Научные труды. М:2001г, стр. 13-18.

18. Иванов В.Б. Содержание ДНК в ядре и скорость развития растений// Онтогенез 1978.Т.9.С.39-53

19. Кунах В.А., Алпатова JI.K. Роль фитогормонов в изменчивости числа хромосом в культуре тканей Haplopappus gracilis // Докл. АН СССР. 1979. 245, № 4, с. 967 - 970.

20. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений и факторы, регулирующие этот процесс // Там же -1980. 14, № 1. С.73 - 81.

21. Кунах В.А. Изменчивость числа хромосом в онтогенезе высших растений // Цитология и генетикиа -1978.-12, № 2 с.160-173.

22. Ложникова Р.Н., Чайлахян М.Х Влияние света и темноты на содержание гиббереллинов в проростках и взрослых растениях бобов // Докл. АН СССР, 1969 т. 188, стр. 715-718.

23. Марков А. М. Причины цветения длиннодневных видов картофеля в условиях короткого дня и холодной ночи // Физиология растений, 2002, т. 49, стр. 521-525.

24. Мокроносов А.Т.Клубнеоброзование и донорно-акцепторные связи у картофеля (регуляция роста и развития картофеля) Под ред. 1990, стр 6-12.

25. Мелик Саркисов О., С. Овчинникова В.Н., Ульянов Р. П. Получение безвирусного посадочного материала микроклубнями индуцированными в культуре in vitro (метод, рекомендации). М: ВАСХНИЛ. 1988 , 17 стр.

26. Мирзохонова Г.О., Давлятназарова З.Б , Н.Н Назарова, Алиев К.А. Действие водного стресса на содержание полирибосом растений регенерантов. // Докл. АН РТ. 2004. Т. XL VII, № 11-12.

27. Муминджанов Х.А. Физиолого биотехнологический подход к селекции и семеноводству картофеля. Душанбе, 2003, 127стр.

28. Назарова Н.Н. , Давлятназарова З.Б., Мирзохонова Г.О., Каримов Б.К., Алиев К.А. Образование столонов и микроклубней картофеля в зависимости от срока посадки in vitro // Докл. АН РТ 2004. Т. XL VII, № 11-12, с.82-91.

29. Насыров Ю.С. Фотосинтез и генетика хлоропластов. «Наука» М.: 1975. 142с.

30. Новые технологии производства оздоровленного исходного материала в элитном семеноводстве картофеля. (Рекомендации Министерства сельского хозяйства Российской Федерации). Отв. редактор Б. В. Анисимов. Москва: «Агропрогрес», 2000. стр. 76.

31. Новые технологии производства оздоровленного исходного материала в элитном семеноводстве картофеля. Рекомендации ВНИИ картофельного хозяйства РЭН. (Москва 2000) с.77.

32. Неумывакин JI.B., Кобец Н.С., Пирузян Э.С. Получение спонтантного мутанта Escyorichia coli;, способного к сверхсинтезу пролина и устойчивого к повышенным концентрациям Na С1 // Генетика. 1990. Т.26. С.1370 1379.

33. Одинцова М.С. Геном хлоропластов: организация и экспрессия // Общие проблемы физико-химической биологии. (Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР). М.:1987. т.6. с.5-95.

34. Полевой В.В., Саламатова Т.С. Механизмы регуляции роста растений клеток // Биология развития растений // Под ред. Чайлахяна М.Х. и др. Л.: Наука. 1975 с. 111-125.

35. Решетников В.Н., Ленец А.А., Голденкова И.В., Серебрийская Т.С., Кондрацкая И.П., Пирузян Э.С. Участие стрессовых белков в формировании гиперчувствительного ответа растений Nicotiana tabacum //Изв . АН Белоруси. Сер. биол. наук. 1997. №3. с.32 36.

36. Решетников В.Н., Ленц А.А., Голденкова И.В., Серебрийская Т.С., Кондрацкая И.П., Пирузян Э.С. Участие стрессовых белков в формировании гиперчувствительного ответа растений Nicotiana tabacum // Изв. АН Белоруси. Сер. биол. наук. 1997. №3 с.32 36.

37. Семенко В.Е. и др. Механизм эндогенной регуляции фотосинтеза и адаптивные свойства хлоропласта. В сб.: Физиология фотосинтеза. М.: Наука 1982. с.164-187.

38. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматическая гибридизация послеповых. Киев.: Наука Думка. 1985. с.130.

39. Скрибчинский В.В. Фотопериодизм, его происхождение и эволюция. Л: Наука, 1975, стр. 300.

40. Сидоров В.А., Зубко A.M.,Кучко А.А. Получение мутантов картофеля in vitro и их использование в клеточной инженерии // Генетика и селекция.-1986- 19, №5 с.470-474.

41. Трофимец Л.Н. и др. Биотехнологические методы получения и оценка оздоровленного картофеля (метод, рекомендации). М: Агропромиздат, 1988,36 стр.

42. Трофимец Л. Н. Биотехнология в семеноводстве картофеля

43. Научные труды НИИКХ РСХА. «Биотехнология вкартофелеводстве. М.: 1991. с.3-12.

44. Чайлахян М.Х. Фотопериодическая и гормональная регуляция клубнеоброзования у растений.М:Наука 1984.61с

45. Чайлахян М.Х. Регуляция цветения высших растений: М: Наука, 1988, стр. 559.

46. Чайлахян М.Х. Гормональная регуляция цветения растений различных фотопериодических групп // Физиология растений, 1971, т. 18, стр.348-357.

47. Anil D., Noel Е.Т.Н. Deleted forms of plastid DNA in alpino plants from cereal other culture // Curr Genet.-1985. 9, №8. -P.671 -678

48. Bent A.F. Plant Disease Resistanse Genes: Function Muts Structure // Plant Cell. 1996.V.9.P.275-296.

49. Binns A., Meins F.J. Evidense that habituation of tobacco pith.cell division-promeming factors is heritable and potentially reversidle // Proc. Nat .Acad. Sci.USA.-1973-70/-P/2660-2662

50. Bretell R.I.S.,Pallotta M.A.,Gustafson J.P.,Apples R. Variation et the Nor loci in triticali derived from tissue culture //Ibid.-1986.-7 l,№4.-P.637-643

51. Bowling S.,Cuo A.,Cao H.,Gordon F.S., Klesid D.,Dong X. A Mutation in Arabidopsis that Leads to Constitutive Exspression // Plant Cell. 1994. V.6. P. 1845-1857

52. Bent A.F. Plant Disease Resistance Genes: Function Meets Structure // Plant. Cell. 1996. V.8. P. 1757-1771.

53. Biotechnology in Agriculture and Forestry. V.3 Potato/Ed. Bajaj Y.P.S. Berlin: Springer. 1987. 509p.

54. Chen Z.X., Malamy J.,Henning J., Conpath U., Sanchecasas P., Silva P., Pisidliano J., Klessig D.F. Induction, Modification and Transduction of the Salicylic Acid signal in plant Defense Responses // Proc. Natl. Acad Sci USA. 1995.V.92.P.4134-4137

55. Cloves F.A.L. Apicl Meristems of Roots // Biol. Rev 1959. V.34. P.501-502.

56. Cloves F.A.L. The Quieseht Centre // The Development and Function of Plants / Eds Torey.J.G., Glorkson D.T. London: Acfdemic, 1975. P.3-19.

57. Csonca L.N.Physiological and Genetic Responses of Bacteria to osmotic stress // Microbiol. Rev. 1989. V53. P.123-147.

58. Cheeseman J.M. Mechanism of salinity Toleranse in Plants // Plant Physiol. 1988. V.87. P547-550.

59. Day a., Ellis T.H.N. Chloroplast DNA deletions associated with wheat plants regeneranted from pollen: possible basis tor material inheritance of choloplast//Cells 1984,V.39,P.359-368.

60. Davis.H.V. Sugar Metabolism in stolon Tibs of potato duringf/f Earlu Tuberization // z. Pflanzenphysiol. 1984. Bd.l 13. S.377381.

61. Delaney T.P. Genetic Dissection of Acquired Resistanse to desease // Plant Physiol 1997. V.l 13. P.5-12.

62. Dolan L.,Janmaat K.,Willemsen V.,Linstead P., Polthing S.,Roberts K.,Scheries B. Cellular Organization of the Arabidopsis thaliana root//Development. 1993. V.l 19. P.71-84.

63. Donn G.,Tisher E.,Smith J.A.,Goodmann H.M. Herbicide-resistant alfalfa cellsion exsample of gene amplification in plants. J.Mol. Appl. Genet. - 1984. - 2, № 6. - P.621-635

64. Dixon R.A., Lamb C.J. Molecular Comunication in interactions belween Plants and Microbiol Patogenes //Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. V41. P.339-367.

65. Estruch J.J., Chrigui D., Grossmann K., Schell J., Spena A. The plant oncogene rol С is responsible for the relase of cytokinins from glucoside conjugates // EMBO J. 1991. V.10. P.2889-2895

66. Estruch J.J., Schell J., Spena A. The protein encoded bay the rol В plant oncogene hydrolyzes indole glucosides // EMBO J. 1991. V.10. P.3125-3128.

67. Evans D.A., Shorp W.R., BravoJ.E. Gell culture metods for crop improvement // Handbook of plant cell culture. New Vork; London: Mastillon 1984.-Vol.2.-P.47-68.

68. Ewing E.E. The role of hormones in potato ( Solanum tuderosum L.) tuberozum // Plant hormones, physiology, Biochemiaty and Molecular Biology / Ed. Davies P.G. Dordrecht: Kluwer Acad.Publ.,1995.P.698-724

69. Feldman F.J., Torey J.G. The Quiescent center and Primary vascular Tissie Potern Formation in cultured Roots of Zea mays//can. J.Bot 1975.V.53.P.2796-2803.

70. Feldman Y.J. The generation and elaboration of plant in roots of Zen Maes//Am Z.Bot. 1977. V.138. P.393-401.

71. Flor H.H. Curent status of the Gene-for Gene Consept // Annu Rev. Phytopathol 1971. V9. P.275-296.

72. Grif V.G., Ivanov V.B., Machs E.M. Cell Cycle and its Parametres in Flomering Plants // Цитология. 2002. Т. 44. C.936-980

73. Glowes F.A.L. The Quiescent center Meristems and its Dehaviour after irradiation // Meristems and Differintiation / Brookhaven Symp. Biol. 1963.VI6.P.46-58.

74. Gaffney Т., Fredrich L., Vernoij В., Nedrotto D., Nye G., Uknes., Ward E., Kessmann H.,. Ryals J. Requirement of Salicylic Acid in Plant Disease Resistanse // Sciense. 1994. V.226. P.1247-1250.

75. Gaffney Т., Fredrich L., Vernoij В., Nedrotto D., Nye G., Uknes., Ward E., Kessmann H.,. Ryals J. Requirement of Salicylic Acid for the induction of Systemic Acquired Resistanse// Sciense. 1994. V.261. P.754-756.

76. Gandin V., Vrain Т., Jonanin L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants // Plant Physiol. Biochem. 1994. V.32. P.ll-29.

77. Harmey M.A., Growleu M.C, Clinch P.E.M. The Growth regulators on Tuberization of cultured stem Pieces of solanum tuberosum//Eur. Potato. J.1996.V.P.146-151.

78. Hobe M., Brand U., Waites R., Simon R. Control of cell lnte in plant meristem // Novartis Found .Symp.237. The cell cycle and development / Chichester (UK): Wiley and sons. 2001. P.235-254

79. Hunt M., Ryals J. Systemic Acquired Resistanse signal Tranduction//Crit Rev.Plant sci. 1996. V 113. P. 1809-1819.

80. Hunt M., Ryals J., Systemic Acquired Resistance Signal Tranduction // Crit Rev. Plant Sci. 1996. VI5. P.583-606

81. Hussey G., Stacey N.I. Factors Affecting the Formation of in vitro Tuberes of Potato (Solanum tuberosum L) // Ann Bot 1984. V.53. P.565-578

82. Ivanov V.B. Temporal control of root meristematic cell transition of elongation and differentiftion / Abst. Botanickeztagung. 2002. Freiburg, 2002. P.29

83. Jarkson S.D., Heuer A., Dietze J., Pzat S. Phytochrome В mediates the photoperiodic control of Tuber formation in potato //Plant J. 1996, V. 9, p. 159-168.

84. Kenn N.T. The molecular Biology of Disease Resistans // Plant Mol. Biol. 1992. V.19. P. 109-122

85. Kenn N.T. The molecular Biology of Disease Resistans // Plant Physiol. 1995. V.108. P.1673-1678

86. Kemble R.J., Shepard J.F. Cumoplasmik DNA variation in a potato protoclonal population // Idid -1984.-69, № 2.-P.211-216

87. Koda Y., Okazawa Y. Inthiences of environment, Hormonal and nutritional factors on potato tuberization in vitro// J. Crop. Sci. 1983. V.52.P.582-591

88. Koch K.E. Carbogidrate-Modulated Gene expression in plants // Annu. Rev. Plant Phisiol.Plant Mol. Biol.l996.V.47. P509-540.

89. Lamb C.J., Lawton M.A., Dron M., Dixon R.A. Signals and Transduction Mechanisms for Activation of Plant Defense against Microbiol Attack // Cell. 1989. V.56. P.215-224

90. Lorz H., Brovn P.T.H. Variability in tissue culture derived plants-possidle origins; advantages and drawbacks //Genetic Manipulation in Plant Breeding-Berlin; Now York: Walter de GruyterCo., 1986-P.513-534.

91. Mett V.L., Lochead L.P., Reyolds P.H.S. Copper-Controlable Gene Expression System for whole Plants // Plant Mol.Biol.1993.V90. P.4567-4571.

92. Mingo-Castel A.M., Young R., Smith O.E. Kinetin induced tuberization of potato in vitro on the mode of Action of kinetin // Plant Cell Physiol. 1976. V.17. p.557-570.

93. Mc Grady J.J., Struik P.C., Ewing E.E. Effects of Exogenous Applications of cytokinin on the Development of potato (Solanum tuberosum L) Cuttings // Potato Pes. 1986. V.29. P.191-205.

94. Piruzian E.S., Meet V.L., Kodets N.S., Urmeeva F.I. The USE of Bacterial Genes Encoding Herbicicide Tolerance in Constructing Transgenic Plants // Microbiol. Sci.1988. V.5. P.241-248.

95. Palmer C.E., Smith O.E. Effect of Kinetin on Tuber Formation on Isolated Stolons of Solanum tuberosum L. Cultured in vitro // Plant Cell Phisiol. 1970. V. 11 P.303-311.

96. Palmer C.E. Smith O.E. Cytokinins and Tuber initiation in the Potato Solanum tuberosum L. // Nature. 1969. V.221 p.279-280.

97. Potter C.S., Loeffler M. Stem Cells and Cellular Pedigress-a Conceptual Introduction // Academic. 1997. P.l-27.

98. Reals J.A., Neueschwander U.H., Willits M.G., Molina A.,Steiener H.Y., Nunt M.P. Sistemic Acquired Resistanse // Plant Cell.l996.V.8.P. 1809-1819.

99. Ryan C.A. Protease inhibitors in Plants Genes for improving Defenses against insects and Patogens // Annu. Rev. Phytopathol. 1990. V.28. P.425-449.

100. Sabatini S„ Beis D., Wolkenfelt H.,Murfelt J., Guifoile Т., Malamy J., Benfey P.,LeiserO., Bechtold N., Weesduk P., Scheres B. An auxin-Dependent Distal Organizer of Pattern and Polarity in the Arabidopsis Root // Cell. 1999. V.56. P.463-472.

101. Sabatini S., Heidstra R., Scheres B. SCARECROW is involved in Positioning the stem Cell Niche in the Arabidopsis Root Meristem // Genes Dev. 2003. V.17. P.354 358.

102. Schmulling Т., Schell J., Spena A. Genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development // EMBO J. 1989. v. 7 p. 2621-2629.

103. Schmulling Т., Schafer S., Romanov G.A. Cytokinins as regulator of gene expression // Physiol. Plant. 1997. V.100. P.505-519.

104. Shedord J.F., Bidney D., Shanin E. Potato protoplast in crop improvement// Sciense 1980.208.№ 4439.P. 17-24.

105. Simonova M.S., Cabrol В., Mett V.L., Kodets N.S., Piruzian E.S. Expression of Bacterial Glyphosate-Toleranse Gene in Potato Plants // Adst te. Eighth IVPAS Int. Congr. Pestcida Chemistry. Washington (DC), 1994.V.1. P.430.

106. Simko I. Sucrose Application Couses Hormonal changres Associated with potato Tuber Induction // J.Plant Crowth Regul. 1994. V117.P.575-584.

107. Skene K.G.M., Barlass M. Studies on the fragmented shoot apex of grapevin // J. Exp. Bot. 1983-34, № 147. P.7-24.

108. Smeekens S., Rook F. Sugar senringand sugar mediated signal transduction in plants // Plants Phisiol.l997.V.115.P.7-13

109. Sonnewald U.,, Hajrezaei M.R., Kossmann J. Heyer A., Thethewey R.M., Willamiter D. Increased potato tuber size resalting from apoplastic expression of a yeast invertase // Nature Biotechnol. 1997. V.6. P.794-797.

110. Stitt M.,Sonnewald U. Regulation of metabolism in transgenetic plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 1995. V.46. P.341-368.

111. Van den Berg D., Willemsen V.,Hage W., Weisbeek P., Scheres B. Cell for in the Arabidopsis Root Meristem Determined by Direktional Signalling // Natire. 1995. V.378. P.62-65.

112. Vreugdenhil S.P., Helder H. Hormonal and Metabolic Control of Tuber Formation // Progrese in Plant Growth Regulators / Eds Korssen C.M. et al. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1992. P.393-400.

113. Weigel D., Jargens G. Stem Cells That Make Stems // Nature.2002. V.145. P.751-754.

114. Xin Xu., Van Lameren A.M., Vermer E., Vreugdenhil D. The Roll of Gibberellin, Absciscic Acid and Sucrose in the Regulation of Potato Tuber Formation in vitro // Plant Phisiol. 1998. V.l 17. P.575-584.

115. Xuzh Xu., Zipaul H., Abscisic acid induced chilling tolerance in Maize suspension- cultured Cells // plant. Physiol/ 1998. V. 99, p. 707-711.

116. Yu D„ Liu-Fan В., Klessig D.F., Chen Z. Is the High Besal Level of Salicylic Acid for Disease Resistance in Potato? // Plant Physiol. 1997. V/l 15. P.343-349.

117. Zanov V.B. Relationship between cell proliberation and transistion to Slongution in plant Koots // Jut. J. Dev. Biol. 1997. V.41. P.907-915.

118. Zong Xui S., Cheng-Zhang., Kang-Le Z. et al. Somaclonal genetics of rice Oryza sativa L. // Theor and Appl. Genet.-1983. -87. №1.- P.67-73.