Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика физиологических этапов при клональном размножении микроклубней картофеля в биореакторах

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Характеристика физиологических этапов при клональном размножении микроклубней картофеля в биореакторах"

V 1 и

1 3 т : '

На правах рукописи

ДЕРЯБИН Александр Николаевич

ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ЭТАПОВ

ПРИ КЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ МИКРОКЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ В БИОРЕАКТОРАХ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений имени К.А.Тимирязева РАН

Научный руководитель - чл.-корр. РАН, академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор Р.Г.Бутенко

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Л.Н.Цоглин

кандидат биологических наук Л.М.Хромова

Ведущее учреждение - Институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (Москва)

го

Защита диссертации состоится "22" мая 1997 г. в "{0_ " часов на заседаний Диссертационного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К.002.45.01 при Институте физиологии растений имени К.А.Тимирязева РАН по адресу:

Россия, 127276, г.Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан " " апреля 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. Для получения стабильных и гарантированных урожаев картофеля необходим свободный от патогенов безвирусный посадочный материал [Шмыгля, Лодочкин, 1983; Трофимец и др., 1985; 1988; 1994]. Одним из путей решения данной проблемы является использование в качестве оздоровленного материала микроклубней (клубни картофеля размером до 10 мм, получаемые в условиях in vitro) [Остапенко, 1983; Мелик-Саркисов и др., 1985; Трофимец и др., 1985; Макаров, 1990; Овчинникова, 1992]. В связи с этим, актуальна задача совершенствования способов получения микроклубней с целью повышения производительности процесса и сведения к минимуму возможности повторного заражения. Исследователи США и Японии предлагают для получения микроклубней картофеля использовать "замкнутые системы" биореакторов - одного из перспективных направлений повышения эффективности процесса массового получения первичного безвирусного материала. Выбор обоснован имеющимися положительными результатами по разработке технологии клонального микроразмножения в биореакторах для лилии, гладиолусов, гиацинта, филодендрона и др. [Липский, 1993; Takayama, Akita, 1994]. Известные в настоящее время типы биореакторов для получения микроклубней картофеля являются не промышленными, а модельными лабораторными установками [McCown, Joyce, 1991; Akita, Takayama, 1994]. Поэтому, создание эффективной промышленной биореакторной установки по получению микроклубней картофеля предусматривает на первом этапе работы изучение физиологических процессов, связанных с каждым этапом клубнеобразования и выявления возможностей воздействия на направление и их скорость.

Цель работы состояла в изучении и регулировании этапов столоно- и клуб-необразования в культуре in vitro на жидких питательных средах в биореакторах модельных конструкций, а также разработка подходов к созданию технологии массового получения оздоровленных микроклубней картофеля.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать оптимальные условия культивирования и изучить динамику развития столонов и формирования микроклубней картофеля на жидких питательных средах в биореакторах модельных конструкций;

2. Выявить для сортов картофеля разных групп спелости универсальный режим синхронизации развития столонов;

3. Провести скрининг веществ регуляторного действия для выявления соединений, снимающих апикальное доминирование, индуцирующих развитие латеральных столонов и изучить их влияние на кпубнеобразование;

4. Выявить преимущества практического применения пневмоимпульсного биореактора для получения микроклубней картофеля;

5. Провести оценку семенных качеств микроклубней картофеля в условиях вегетационного опыта в почвенной культуре.

Научная новизна работы. Впервые доказана принципиальная возможность применения, созданного в Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН, пневмоимпульсного биореактора для получения оздоровленных микроклубней картофеля. Подобран универсальный режим синхронизации развития столонов при воздействии на исходные стеблевые экслланты пониженными положительными температурами. Оптимизирован для условий in vitro метод определения физиологической зрелости микроклубней картофеля при помощи водного раствора 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида.

Практическая значимость работы. Разработана и успешно апробирована лабораторная модель пневмоимпульсного биореактора и показана принципиальная возможность использования в практике всей технологии получения оздоровленных микроклубней картофеля. Выявленны в ходе экспериментов особенности физиологических этапов (столоно- и клубнеобразование) в биореакторах на жидких питательных средах, что необходимо учитывать при разработке технологии массового получения оздоровленного семенного материала картофеля. Показана практическая возможность использования микроклубней, получаемых в биореакторах модельных конструкций, в качестве полноценного оздоровленного посадочного материала.

Апробация работы. Результаты работы доложены на: научных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР (Москва, 1994; 1996) и биологического факультета МГУ имени Н.П.Огарева (Саранск, 1997); XXIII научной конференции "Огаревские чтения" (МГУ им.Н.П.Огарева, Саранск, 1994); V планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (ИБХ, Москва, 1S95).

Основные положения работы были представлены на: XXIV научной конференции "Огаревские чтения" (МГУ имени Н.П.Огарева, Саранск, 1995); III Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1995); III Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (ТСХА, Москва, 1995); Всемирном конгрессе по биологии in vitro (USA, San Francisco, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре работы, подана заявка на изобретение, одна статья принята в печать.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (четыре главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на •/¿'/страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков, 5 таблиц, иллюстрирована 12 фотографиями. Список цитируемой литературы включает 197 наименований, из которых 118 зарубежные.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Государственной научно-технической программы России "Новейшие методы биоинженерии" направление "Генная и клеточная инженерия".

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходным материалом для работы служили пробирочные растения картофеля (Solanum tuberosum L.) сортов: Жуковский (раннеспелый). Невский (среднеран-ний), Луговской (среднеспелый) и Ласунак (поздний), оздоровленные во Всероссийском НПО по картофелеводству РАСХН методом культуры апикальных меристем.

Эксплантами служили микрочеренки, состоящие из участка стебля с одним листом и пазушной почки, вычлененные из средней части 4-х недельных асептических растений.

Столонообразование инициировали на среде МС1*. В опытах по изучению действия экзогенных факторов на снятие апикального доминирования, индукцию развития латеральных столонов, МС1 содержала соответствующие компоненты, что указано при изложении результатов. Учитывали: 1. - развитие столонов с учетом их длины и морфологии; 2. - число латеральных столонов на исходный эксплант.

Интенсивность ризогенеза оценивали в баллах, на основе следующей классификации: 0 - отсутствует; 3 - длина корней до 5 мм; 5-5-10 мм; 7-10-15 мм; 9 - более 15 мм.

pajs'/T'/q •утппипа провопили гюеинкубацией эксплантов в условиях низких положительных температур (2, 4 и 7°С) в течение 2, 4, 6 и 24 часов в питательной среде МС1.

Цитологические наблюдения. Частоту встречаемости (Ktw) фаз митоза в меристемах пазушных почек эксплантов определяли через 24 часа после холодовой экспозиции. В контрольном варианте экспланты выдерживали при температуре 20°С. Учитывали число клеток, находящихся в стадии метафазы, анафазы и в тело-фазы после фиксации пазушных почек в фиксаторе Кларка, на давленном препара-

" МС1 - жидкая питательная среда Мурасиге и Скуга [Murashige & Skoog, 1962], содержащая 2% сахарозы и витамины: В, и В6 по 1 мг/л [Хромова и др., 1995].

те окрашенном насыщенным раствором ацетокармина [Паушева, 1980]. Просматривали по 400 клеток на меристему. На каждый вариант было проанализировано пс 10-12 меристем.

Клубнеобразование индуцировали средой МС2". Измеряли размер микроклубней (мм), отмечали место их формирования (пазушные / столонные), иерархию расположения на столонах, а также массу (мг) по фракциям (< и >5 мм диаметром).

Эффективность столонообразования/клубнеобразования определяли как процентное отношение числа столонов/микроклубней к числу эксплантов в культураль-ных сосудах каждого варианта опыта [Lentini, Earle, 1991].

Степень зрелости микроклубней определяли по методу, предложеному для семенного картофеля [Sacher, Iritani, 1982] и основанному на способности водного раствора ТТХ" медленно восстанавливаться в тканях клубня, изменяя окраску от i светло-желтой до красной. Авторы применяемого метода использовали ТТХ в качестве индикатора метаболической активности тканей и для определения возраста клубней картофеля.

Микроклубни, полученные нами в экспериментах, разрезали строго вдоль по центральной оси на две части и помещали в 0.5% водный раствор ТТХ. Через 2 часа экспозиции по разнице в скорости проникновения ТТХ (мм/ч) в апикальные и базаль-ные ткани судили о степени зрелости. Если скорость проникновения ТТХ была больше в базапьной части, чем в апикальной, то микроклубни считали физиологически зрелыми, и наоборот. Было проанализировано 30-40 микроклубней разных размеров каждого сорта.

Содержание растворимых Сахаров в питательной среде определяли фенол-сернокислым методом [Dubois et al„ 1956] с последующим измерением оптической плотности (экстинкции) на спектрофотометре СФ-26 ("ЛОМО", Россия) в 10 мм кювете при 490 нм. Определения проводили по трем биологическим повторностям.

Содержание О? и СО? определяли на газовом хроматографе с детектором по теплопроводности [Ракитин В.Ю., Ракитин Л.Ю., 1974].

Содержание этилена в атмосфере сосудов определяли на газовом хроматографе (пламенно-ионизационный детектор), снабженным устройством для концентрирования углеводородов [Ракитин В.Ю., 1973; Ракитин В.Ю., Ракитин Л.Ю., 1986].

• МС2 - жидкая питательная среда Мурасиге и Скуга [МигавЫде & Бкоод, 1962], содержащая 8% сахарозы и витамины: В! и В6 по 1 мг/л [Хромова и др., 1995].

*ТТХ - 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый (С1эН,5С1М4)

Аппаратурное культивирование проводили в биореакторах следующих модельных конструкций:

- роллерный аппарат (модификация аппарата Стюарда с соавторами) [Steward et al., 1952], используя специально изготовленные культуральные сосуды цилиндрической формы емкостью 300 мл. Сосуды закрепляли перпендикулярно дискам, насаженным на металлическую полуось, наклоненную к горизонту под углом 3°, что гарантировало равномерное перетекание среды внутри сосуда. Скорость вращения дисков составляла 4 об./мин. Прототипом данных культуральных сосудов явился биореактор роллерного типа [McCown, Joyce, 1991];

- пневмоимпульсный биореактор, разработанный в Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР имени К.А.Тимирязева РАН [Орешников и др., 1996].

Аэрацию питательной среды осуществляли путем подачи стерильного воздуха с регулируемой скоростью газообмена (-0.10 л/мин). Интенсивность обмена питательной среды составляла -100 мл/мин.

Опыты по оптимизации развития столонов также включали стациойарный тип культивирования с пассивным расположением эксплантов на дне культуральных сосудов и шейкер (95 об./мин.). Использовали плоскодонные колбы на 250 мл.

Все этапы клубнеобразования проводили на жидких питательных средах в условиях непрерывной темноты при температуре 20±2°С.

Микроклубни хранили в холодильной камере при температуре 4°С в пробирках закрытых металлической фольгой.

Оценку всхожести микроклубней после 4-х месяцев хранения проводили в условиях повышенной влажности в чашках Петри на фильтровальной бумаге. Каждые 10 дней учитывали число микроклубней с проросшими глазками и длину ростков.

Вегетационные опыты проводили в вегетационном домике ИФР РАН, в почвенной культуре, используя сосуды емкостью ~5 литров (высота 25 см, диаметр ту см). Для высадки (23 мая 1996 г.) брали микроклубни диаметром 3-4 мм после 4-х месяцев хранения. В каждый вегетационный сосуд сажали по 3 микроклубня на расстоянии 6-7 см друг от друга, глубина посадки 20-25 мм. Было вцсажено 30-36 микроклубней каждого сорта. Регулярно проводили рыхление почвы и вносили минеральные компоненты среды МС1 по 100 мл / сосуд. Полив проводили каждые 2-4 дня водопроводной водой.

Морфометрические измерения. В течение вегетационного опыта проводили наблюдения за ростом и развитием растений, при этом учитывали следующие па-

раметры: 1- высоту основного побега; 2 - количество и вид боковых побегов (подземные / боковые). По окончании опыта (3 сентября) растения извлекали из почвы и определяли: 1 - число клубней на куст; 2 - среднюю массу одного клубня (г).

Режимы стерилизации питательных сред, инструментов и оборудования -общепринятые в практике работ in vitro [Бутенко, 1964; Калинин и др., 1980].

Степень синхронизации процессов (развитие столонов, выравненность микроклубней) оценивали с помощью метода выявления частоты встречаемости парных явлений в выборке (метод "близнецов"), предложенным Маршаллом с сотрудниками [Marshall et al., 1993]. Частоту встречаемости одинаковых параметров (Ktw) определяли как отношение фактически выявленных парных явлений ^ф) к теоретически ожидаемому в выборке данного объема (Nt), выраженного в процентах.

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам [Лакин, 1973; Доспехов, 1985]. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента при 5% уровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Столонообразование. Оптимизация условий культивирования - первый и обязательный этап в начале любого исследования. При работе с жидкими питательными средами, в отличие от агаризованных, это особенно актуально, так как возрастает опасность подвергнуть экспланты частичному затоплению, либо появлению признаков витрификации, следствием которых являются анатомо-морфологические изменения тканей, деформация и замедленное развитие [Геринг, 1991]. Кроме того, по мнению японских ученых, эффективность кпубнеобразования в биореакторах во многом зависит от условий развития исходных стеблевых эксплантов [Akita, Takayama, 1994]. Поэтому нами была проведена серия экспериментов по подбору условий, благоприятных для первого этапа кпубнеобразования - инициации и роста столонов - посредством выявления оптимального соотношения - объем культураль-ного сосуда (\/с):объем питательной среды (Умс).число эксплантов (п). Анализ данных показал, что для развития столонов оптимальными являются условия, когда на один исходный эксплант приходится 0.25-0.30 мл питательной среды и 20 мл объема культурального сосуда. В дальнейших экспериментах мы учитывали данное соотношение Vc:VMc:n.

Сравнительный анализ развития столонов при различных типах культивирования показал преимущество аппаратных режимов, по сравнению с выращиванием в условиях стационара и на шейкере. Средняя длина столонов при культивировании в роллерном аппарате и пневмоимпульсном биореакторе была в 1.4-1.7 раза

больше, чем в стационаре и на шейкере. В.А.Высоцкий [1986] также отмечал, что особенностью культивирования эксплантов некоторых видов растений при выращивании в жидкой среде в аппаратах роллерного типа является стимуляция их развития. Можно предположить, что это связано с различной степенью аэрации эксплантов в культуральных сосудах при различных типах культивирования. При выращивании в роллере стеблевые экспланты за счет адгезии прилегают к внутренним стенкам сосудов и снабжаются воздухом, а при вращении дисков периодически увлажняются питательной средой, в отличие от находящихся неподвижно эксплантов в условиях стационара. Следовательно, при культивировании в роллере и пневмоим-пульсном биореакторе увеличивается поверхность соприкосновения среды с воздухом и ее насыщение кислородом, благодаря чему улучшается развитие столонов.

Известно, что в разных зонах стебля картофеля содержание фитогормонов различно, так как существует градиент фитогормонов [Пузина, Кириллова, 1995; 1996]. Изменение соотношения основных фитогормонов в тканях (ГК, АБК, ИУК, ци-токинины) на каждом этапе клубнеобразования связано с изменением характера клеточных делений [Платонова, Кораблева, 1992; Кос!а, Окагаша, 1983; Э&гнк, 1991]. Мы предположили, что синхронизируя клеточные циклы на определенных ключевых этапах развития столона и микроклубня, можно добиться одновременности начала отдельных этапов клубнеобразования. С этой целью нами была предпринята попытка синхронизировать клеточные циклы в латеральных меристемах исходных эксплантов посредством воздействия на них низкими положительными температурами. Согласно полученным результатам, все применяемые нами режимы предобработки синхронизировали развитие столонов, о чем свидетельствовал низкий (не более 5%) процент отклонений от средней выборки столонов, не входящих по длине в доверительный интервал (Рис.1). Однако, ярко выраженное явление синхронизации роста стс"с::с2у сорта Пугпрской наблюдали при 2-х часовой экспозиции исходных экс-

20'С 4'С 2ч 4'С 4ч 2' С 2 ч. 2' С 4 ч 7 ' С 24 ч

СОРТ

вэжукоесхий плугоесяой

РЕЖИМЫ ОХЛАЖДЕНИЯ

100

плантов при 2 и 4°С и 4 - часовой Рис.1. Эффективность столоно-образования (ЭС, %) /пинии/ и число столонов, не входящих в доверительный интервал по длине (%) /гистограмма/ на 1 сутки культивирования на среде МС1 после предобработке стеблевых эксплантов пониженными положи. тельными температурами.

±

при 4°С, а также при 24-часовой экспозиции на 7°С. В отличии от этого сорта, толерантного к пониженным температурам, у сорта Жуковский при жесткой низкотемпературной обработке (2 и 4°С) наблюдали снижение эффективности столонообразо-вания. Следовательно, в процессе эксперимента ярко выявилась роль генотипа в ответной реакции на низкие положительные температуры.

Результаты цитологического анализа синхронизации клеточных делений через сутки после холодовой экспозиции эксплантов сорта Луговской продемонстрировали увеличение доли клеток, находящихся в стадии метафазы: в варианте 4°С -13.2%, 7°С - 23.1%, в контроле (20°С) этот показатель был на уровне 5.7% (Рис.2).. Исходя из результатов наших экспериментов, можно было заключить, что наиболее универсальным режимом для синхронизации развития столонов разных сортов картофеля in vitro является преинкубация исходных эксплантов в питательной среде

при 7°С в течение 24 часов. Рис.2. Частота встречаемости отдельных стадий митоза (Ktw, %) в клетках меристем пазушных почек поспе предобработки стеблевых эксплантов картофеля сорта Луговской пониженными положительными температурами

С целью получения большого числа клубнеобразующих столонов мы провели скрининг, целью которого было выявление соединений, которые снимали бы апикальное доминирование и позволяли инициировать развитие латеральных столонов. Для этого, в базовую среду МС1 были внесены соответствующие компоненты (по вариантам) в оптимальных для клубнеобразования концентрациях, рекомендованных многими авторами. Результаты проведенного на роллере эксперимента показали, что все изученные вещества, кроме кумарина и паклобутразола, стимулировали образование латеральных столонов у сорта Жуковский (Рис.3). Однако, регуляторы роста вызывали отклонения в морфологии столонов. Развитие столонов было угнетено, они были деформированы и имели слаборазвитую корневую систему (0-3 балла).

Известно, что количество клубневого потомства зависит от числа клубнеобразующих столонов [Haverkort et al., 1990; Struik et al., 1991]. Для выявления возмож-

Ktw

20"C 4°С2ч. 7°C 6 v.

режимы предобработки эксплантов

СТАДИИ МИТОЗА » МЕТА® АЗА яТЕЛОФАЗА •■АНАФАЗА I 'ИНТЕРФАЗА

латеральных столонов/эксплант, шт.

32,521,51 -0,50

—1 1

il

1

¡ы

ilN'i1:

Щ

контр.

3

гад сзб

Рис.3. Эффективность применения регуляторов роста для снятия апикального доминирования и развития латеральных столонов в культуре столонов картофеля сорта Жуковский. Обозначения: контр,- среда MCI; 1. МС1 + кумарин а) 25 мг/л; б) 75 мг/л;

2. МС1 + кинетин а) 5 мг/л; б) 10 мг/л; 3. MCI + БАП а) 5 мг/л; б) 10 мг/л; 4. МС1 + ДХИБ-Na а)100 мг/л; б) 200 мг/л; 5. МС1 + паклобутразол а) 0.5%; 6)1.0%; 6. МС1 + АЛ АР а) 6 мг/л; б) 10 мг/л.

ной взаимосвязи между числом столонов и количеством образовавшихся на 52 сутки после индуцирования средой МС2 микроклубней, был проведен расчет коэффициентов корреляции. Однако, высокой положительной корреляции (г=0.7 и выше) не было обнаружено ни в одном из вариантов, что требует поиска других способов индукции ветвления столонов.

Культивирование в замкнутой системе пневмоимпульсного биореактора имеет определенные особенности. Это выражается в возможности регулирования интенсивности и способа аэрации: 1. - подача стерильного воздуха непосредственно в культурапьный сосуд с эксплантами; 2. - барботаж (аэрация) питательной среды, находящейся в отдельной от сосуда с эксплантами емкости. С целью комплексного чтапя столонообразования (рост и ветвление столонов), мы выбрали второй способ аэрации со следующими вариантами интенсивности поступления питательной среды в сосуд с эксплантами: 1.-15 секунд в минуту; 2. - 20 минут каждые три часа. Скорость газообмена в емкости с питательной средой (интенсивность вентиляции) в 1-ом и во 2-ом вариантах была равна -0.10 л/мин. 2-ой вариант также включал режим без барботажа питательной среды (3-ий вариант).

. Анализ развития столонов в пневмоимпульсных биореакторах также выявил зависимость их длины от интенсивности поступления питательной среды в сосуд с эксплантами и скорости газообмена. Развитие столонов было наилучшим при использовании 1-ого варианта культивирования (ризогенез 7-9 баллов). Отсутствие

вентиляции (3 вариант) вызывало торможение развития пазушных почек и ризоге-неза (1- 3 балла), что требовало дополнительных исследований по изучению изменения газового состава в культуральных сосудах в начальный период столонообра-зования.

Мы провели хроматографический анализ СОг, 02 и этилена в модельных культуральных сосудах для выяснения динамики содержания этих газов в первые часы после черенкования'. Через 30 минут после черенкования пробирочных растений сорта Луговской в условиях ¡n vivo, по 8 эксплантов из сосуда со средой МС1 были помещены в пузырьки объемом 15 мл с 200 мкл МС1. Пузырьки закрывали специальными резиновыми пробками, через которые шприцем производили забор газа через следующие промежутки времени: 0, 1, 4 и 5 часов. В результате дыхания эксплантов и выделения ими этилена газовый состав сосудов изменялся: через 5 часов содержание этилена увеличилось в два раза (от 5.910"3 мкл/л /нормальная концентрация этилена в воздухе/до 10"2 мкл/л), содержание CO¡ увеличилось более чем в 12 раз (от 0.35 до 4.27 мл/л), а Ог уменьшилось с 210.0 до 205.5 мл/л (рис.4.). Из литературных данных известно, что самая высокая скорость синтеза этилена наблюдается в наиболее активно растущих зонах стебля и листьев, а именно в меристемах [Уоринг, Филлипс, 1984]. Произведенный расчет скорости выделения этилена показал, что на протяжении примерно первых трех часов после

Рис.4. Динамика содержания этилена, углекислого газа и кислорода в культуральных сосудах при отсутствии вентиляции в первые часы после черенкования пробирочных растений сорта Луговской на одноузловые экспланты. Условия культивирования: объем сосуда -15.25 мл; объем среды МС1 - 200 мкл; число стеблевых эксплантов - 8 шт.

' Этот раздел работы выполнен совместно с канд. биол. наук В.Ю.Ракитиным.

черенкования синтез этилена был наиболее интенсивным, что, вероятно, является ответом на резкое изменение условий существования эксплантов (так называемый "стрессовый" этилен). Параллельно наблюдали интенсивное поглощение кислорода и выделение углекислого газа. Учитывая данные опыта, можно заключить, что отсутствие вентиляции в культуральных сосудах вызывало накопление этилена и СОг, при этом содержание кислорода уменьшалось.

Анализ динамики содержания газов (этилен, СОг, Ог) в культуральных сосудах с эксплантами пневмоимпульсных биореакторов выявил зависимость их концентрации от скорости газообмена и интенсивности поступления питательной среды (рис.5). При режиме интенсивного поступления питательной среды в сосуд с эксплантами (1 вариант) и при наличие аэрации среды, вентиляция шла быстрее, чем при 2 или 3 вариантах, о чем свидетельствовало быстрое уменьшение концентрации этилена. Уже на 3 сутки культивирования содержание этилена в сосуде с эксплантами было равно его концентрации в воздухе, тогда как во 2-ом и 3-ем вариантах - в 6-20 раз выше. Динамика содержания 02 и СОг также выявила влияние скорости газообмена и интенсивности поступления питательной среды с сосуд с эксплантами (рис.5). Благодаря более интенсивной вентиляции (1 вариант) уровень Ог и С02 в течение первой недели культивирования приблизился к атмосферному. Применение менее интенсивных вариантов поступления питательной среды в сосуды с эксплантами (2 и 3) приводило к накоплению в культуральных сосудах СОг и уменьшению уровня Ог, особенно в первые трое суток. 8 дальнейшем наблюдалась тенденция к выравниванию уровня СО2 с атмосферным, однако, на 7 сутки его концентрация еще была в 5-9 раз выше. Концентрация 02 продолжала постепенно уменьшаться, и на 7 сутки в 2-ом и 3-ем вариантах его величина была ниже атмосферного - 195 мл/л (в воздухе - 210 мл/л). СледоыспвГюмо, мО~/:с:::ю быстро растущей и морфологически нормальной культуры столонов картофеля возможно при достаточно интенсивном орошении эксплантов питательной средой и наличии аэрации (1 вариант), для восстановления газового состава в культуральных сосудах с атмосферным. Опыт с применением первого способа аэрации - поступления стерильного воздуха непосредственно в культуральный сосуд с эксплантами (скорость газообмена 0.19 л/мин) показал, что уже через 3 часа после начала культивирования, концентрация этилена, по сравнению с начальной уменьшилась в 50 раз и составляла 0.03 мкл/л. Соответственно, существует возможность контролирования

3 4 5 время, сутки

С02, мл / л Рис.5. Динамика содержания эти-

лена, кислорода и углекислого газа в начальный период столонооб-разования на среде МС1 в сосуде с эксплантами пневмоимпульсного биореактора при различных режимах выращивания (сорт fly-говской).

Условия культивирования: объем питательной среды МС1 - 200 мл; количество эксплантов - 50 шт. Обозначения. Интенсивность поступления питательной среды в сосуд с эксплантами: 1,-15 секунд в минуту (1 вариант); 2,- 20 минут каждые три часа (2 вариант). Скорость газообмена в емкости с питательной средой (интенсивность аэрации среды) -0.10 л/мин; 3- 20 минут каждые три часа (3 вариант), без аэрации питательной среды. Интенсивность обмена (интенсивность циркуляции) питательной средой между емкостью со средой и сосудом с эксплантами -100 мл/мин.

уровня этилена и других газов в сосудах с эксплантами пневмоимпульсного биореактора, либо экзогенного введения этилена/этиленпродуцирующих соединений для регуляции развития столонов и процесса клубнеобразования.

Нарушение вентиляции в культуральных сосудах сразу после индукции клуб-необразования средой МС2 через 4-6 суток вызывало формирование в субапикальных зонах столонов сорта Жуковский ненормальных клубнеподобных структур (см. Фото), что соответствовало наблюдениям других ученых [Vreugdenhil, Struik, 1989], показавших ингибирующее влияние этилена на клубнеобразование.

Фото.1. Формирование ненормальных кпубнепо-добных утолщений в субапикальных зонах столонов (2) на 6 сутки после индукции клубне-образования средой МС2 при нарушении вентиляции в культуральных сосудах. 1,- (контроль) без нарушения вентиляция.

В период столонообразования нами получены данные по определению скорости роста столонов и интенсивности потребления Сахаров, показавшие наличие периодичности протекания данных физиологических процессов у картофеля (Рис.6). Приведенные по двум сортам усредненные графики свидетельствуют о большом сходстве ритмов роста столонов между ними. Однако, между сортами обнаруживаются существенные различия - за период наблюдений (13 суток) у раннеспелого сорта Жуковский кривая скорости роста столонов имела четко выраженные три пика максимального суточного прироста, а у среднераннего Луговского - два. Это может служить косвенным подтверждением сохранения сортовой специфики при культивировании ¡п У|'(го. В первые сутки после черенкования экспланты находились в стрессовом состоянии, вследствие резкого изменения условий существования. Об этом свидетельствовало активное потребление Сахаров, основных субстратов дыхания, в первый день после черенкования.

Ритмичность роста - это регулярно повторяющаяся смена периодов активного и замедленного роста [Кефели, 1973]. Наблюдения показали, чю и«йб7;с;;;;сс периодическое уменьшение скорости роста столонов было связано с формированием нового метамера (междоузлия). Кривые скорости роста столонов и потребления Сахаров у обоих сортов картофеля оказались весьма сходными, что говорит о сопряженности данных физиологических процессов. По окончанию исследования (на 13 сутки) концентрация Сахаров в питательной среде оставалась на нелимитирую-щем рост столонов уровне и составляла у сорта Жуковский - 1.45%, у сорта Лу-говской -1.35%.

14

Рис.6. Периодичность процессов роста столонов (1) и потребления Сахаров (2) у различных сортов картофеля при культивировании на роллере на среде МС1. Представлены средние значения двух независимых опытов. Обозначения: Vst - скорость роста (прирост) столонов, мм / су т.; Vs - интенсивность потребления Сахаров, г/л'сут.'1

При всех типах культивирования в темноте на среде MCI экспланты формировали ортотропно растущие столоны. В роллерных сосудах столоны имели диатропную ориентацию роста, что можно объяснить нарушением геотропизма за счет периодической смены положения эксплантов в пространстве при вращении дисков роллера. Однако, морфологические характеристики столонов во всех случаях полностью соответствовали определению, без отступления от нормы [Бут, 1966; Ewing, Struik, 1992]. При последующим индуцировании клубнеобразования мы наблюдали в субапикальных зонах столонов формирование микроклубней, что дополнительно подтверждает, что объект наших исследований - культура столонов.

Клубнеобразование. Исследования, проведенные с сортами Жуковский и Лу-говской в период образования микроклубней на среде МС2 показали, что для клуб-необразования также характерен периодический характер (Рис.7). Динамика суточного прироста числа микроклубней у обоих сортов представляла собой затухающую кривую, имеющую форму, близкую к синусоиде. У обоих сортов кривые имели четко выраженный двухвершинный характер. Наличие на этой кривой двух фаз макси-

10-

»»nrvr WVUTtnni/ЫЙ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ВОЗРАСТ СТОЛОНОВ, СУТКИ

i~nrvr nvr/^nnWOM

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ВОЗРАСТ СТОЛОНОВ. СУТКИ

1

мумов и минимумов подтверждает концепцию Meredith [1988j о дискретном образовании клубней растением картофеля. Как свидетельствуют представленные данные, примерно на 23-26 сутки у обоих сортов наблюдали снижение показателя эффективности клубнеобразования, что можно связать с завершением периода формирования микроклубней. Далее наблюдали увеличение размеров микроклубней, о

чем свидетельствовало интен-

Укл

сорт ЖУКОВСКИЙ Vs-10"

10 15 20 25 30 35 40 45

10 8 6 4 2 0

Укл

сорт ЛУГОВСКОИ

Vs-10

10 15 20 25 30 35 40 45 ВРЕМЯ, СУТКИ

сивное поглощение Сахаров в этот период.

Рис.7. Динамика клубнеобразования (1) и поглощения Сахаров (2) у различных сортов картофеля при культивировании на среде МС2 на роллере. Соотношение \/с:Умс:п равно ~20:0.3:1. Обозначения: Укл -интенсивность клубнеобразования, кл / экспл.» сут.'1 ; Уэ -интенсивность потребления Сахаров, г/л»сут.'1

Для изучения возможности получения крупной фракции микроклубней, диаметром 5 мм и более, в различные сроки клубнеобразования проводили замену питательной среды на аналогичную по составу. Мы ис-

ходили из предположения, что в течение клубнеобразования происходит потребление питательных веществ и, в первую очередь, Сахаров, являющихся основными субстратами для образовании крахмала, т.к. в запасающих органах снабжение саха-рами - один из основных факторов, контролирующих скорость роста клубней [Hawker et а!., 1979]. Комплексный анализ полученных данных, приведенных в таблице, позволил выявить существенные различия по всем показателям микроклубней, в зависимости от сроков повторного внесения индукционной питательной среды МС2. Вторичная индукция клубнеобразования, произведенная на 15 и 22 сутки, т.е. в период активного формирования микроклубней (см. рис. 7), увеличила

Таблица

Влияние срока замены индукционной питательной среды МС2 на морфометриче-ские показатели микроклубней сортов картофеля различающихся по скороспелости при культивировании на роллерном аппарате. '

Показатель Время замены питательной среды, сутки

12 15 22 37 43

микроклубней !LZ !2 08 07 <LZ

на эксплант, шт. 0.8 1.0 1.1 1.0 0.9

средняя масса 82 98 130 93 80

микроклубня, мг 86 100 100 90 70

доля микроклубней 20 46 44 16 20

диаметром >5 мм, % 13 31 41 24 20

*-в числителе - сорт Жуковский, в знаменателе - сорт Луговской

показатель эффективности клубнеобразования, среднюю массу микрокпубней и фракцию микрокпубней, имеющих диаметр 5 мм и более. Замена питательной среды в более ранние (12 сутки) и поздние (37 сутки) сроки не оказала существенного влияния на эти показатели. По морфологическим характеристикам у полученных микроклубней отклонений выявлено не было. Следовательно, наиболее оптимальным для увеличения эффективности клубнеобразования и получения крупной фракции микроклубней (диаметром 5-6 мм) является срок замены питательной среды на аналогичную между второй и третьей неделями периода клубнеобразования при культивировании на роллере.

Преимущество использования пневмоимпульсного биореактора отразилось на размере микроклубней. Если при других типах культивирования их размеры достоверно не различались между собой, то микроклубни, полученные в пневмоимпульс-ном биореакторе имели диаметр в 1.5-1.8 раза больше (7-10 мм). Размер микроклубней тесно связан с содержанием питательных веществ в среде культивирования, т.е. размер получаемых микроклубней прямо пропорционален количеству сахарозы в питательной среде [Stallknecht, Farnsworth, 1979; 1982]. Следовательно, увеличение массы микроклубней было достигнуто благодаря нелимитированному поступлению питательных веществ к эксплантам. Наши исследования показали, что данное предположениесправедливо только для пневмоимпульсного биореактора, за счет заложенного в нем оригинального технологического решения. Наличие питательной среды в отдельной от сосуда с эксплантами емкости предоставляет воз-

можность не только изменять (уменьшать/увеличивать) ее объем в расчете на один эксплант, но и производить неоднократную замену в процессе культивирования.

С целью выяснения роли регуляторов роста и углеводов как возможных индукторов клубнеобразования in vitro был проведен эксперимент с сортом Ласунак на установке роллерного типа. Результаты показали, что на среде МС1 с регуляторами роста (БАП - 10 мг/л, кумарин - 75 мг/л) признаков клубнеобразования по истечению 30 суток культивирования не наблюдали, в отличие от безгормонального варианта. Это согласуется с данными других авторов [LeClerc et al., 1994], показавших, что наличие регуляторов роста (БАП, ССС и кумарин) в питательных средах, не содержащих повышенной концентрации сахарозы, не индуцировало клубнеобраэова-ние, по сравнению с таковыми, содержащими 8% сахарозы. По мнению этих авторов, возможна система получения микроклубней без введения с среду регуляторов роста, за счет эндогенных фиторегуляторов и под действием повышенной концентрации сахарозы. Японские исследователи [Akita, Takayama, 1994] также считают, что реально получать микроклубни картофеля на "безгормональных" питательных средах, содержащих только повышенную концентрацию сахарозы (9%) - за счет создания осмостресса. Нами показано, что при использовании в качестве осмотика не сахарозы, а маннитола - клубнеобразование наблюдали только в варианте с сахарозой (2 и 8%). Следовательно, осмостресс - не основная причина (индуктор) клубнеобразования у картофеля in vitro. Поэтому представляло интерес изучение различных форм Сахаров - сахарозы, глюкозы и фруктозы на клубнеобразование и иерархию формирования микроклубней на столонах. Постановку экспериментов осуществляли в стационарных условиях в культуре столонов картофеля сорта Лу-говской. Столонообразование инициировали средой Г.1С1, содержащей (по вариан-тсг.;) гг.упрполы: сахарозы 2%, глюкозы 2% и фруктозы 2%. Во всех вариантах отклонений в развитие столонов и морфологии не наблюдали. На / сутки, когда во всех вариантах столоны имели по 2 метамера, провели замену питательной среды на МС2, разделив каждый вариант еще на три: 1 - сахароза 8%, 2 - глюкоза 8%, 3 - фруктоза 8%. В период микроклубнеобразования был отмечен факт отсутствия ингибирования развития столонов. Анализ данных через 10 недель после индукции показал зависимость эффективности клубнеобразования (ЭК) от углеводного состава среды применяемой для инициации и развития столонов. При одинаковом составе индукционных сред (МС2), высокий показатель по ЭК наблюдали при получении столонов на средах с 2% глюкозы (84%) и в варианте с 2% фруктозы (60%),

низкий - на среде МС1 (24%). Показатель ЭК в культуре столонов, полученных на среде МС1 был ниже, независимо от вида углевода входящего в состав индукционной питательной среды. Высокий показатель ЭК наблюдали в вариантах, где в качестве индукторов столоно- и клубнеобразования выступали моносахара (84-95%). Следовательно, в период клубнеобразования важное значение в увеличении выхода микроклубней играют не только факторы, индуцирующие клубнеобразование, но и углеводный состав питательной среды применяемой для столонообразования. Невысокий показатель ЭК на среде МС2 при инициации столонообразования на МС1, возможно связан с более низким осмотическим давлением питательной среды с сахарозой, по сравнению с моносахаридами, при одинаковой нагруженности углеродом [Холодова, 1981]. Рядом авторов также показано, что добавление в индукционные для клубнеобразования среды помимо сахарозы моносахаров повышало показатель ЭК [Кулдыбаев и др., 1991], благодаря созданию оптимальной для формирования микроклубней концентрации Сахаров [Овчинникова, 1992].

Сравнительная оценка иерархии формирования микроклубней в зависимости от углеводного состава индукционных для столоно- и клубнеобразования питательных сред выявила, что независимо от углевода (2%), входящего в состав среды для столонообразования (сахароза/глюкоза/фруктоза), при индуцировании микроклубне-образования средой МС2, от 40 до 55% микроклубней формировались в пазухе листа исходного экспланта. При использовании сахарозы в качестве источника углерода для столоно- и клубнеобразования, также наблюдали формирование только пазушных микроклубней (40% в пазухе листа исходного экспланта и 60% в пазухе листа первого междоузлия столона). В остальных вариантах микроклубни формировались как в пазухах листа, так и в субапикальных зонах столонов 1-ого и 2-ого порядка, без какой-либо четкой закономерности. Поэтому, пока не представляется возможным сделать определенные выводы относительно влияния углеводного состава питательной среды на иерархию распределения микроклубней в культуре столонов. Однако, в варианте с использованием сахарозы в качестве углеводного субстрата, не ингибирующего рост, для инициации столоно- и микроклубнеобразования, факт формирования микроклубней только в пазухах листа исходной почки и 1-ого метамера позволяет предположить, что используемый нами в большинстве экспериментов период столонообразования - 7 суток - достаточен для последующей индукции микроклубней средой МС2, особенно, при аппаратных режимах культивирования.

Выше было показано, что предобработка эксллантов пониженными положительными температурами синхронизировала развитие столонов. Полученные на них (столонах) в ходе экспериментов на роллере (среда для столонообразования - МС1, среда для клубнеобразования - МС2) микроклубни картофеля сорта Луговской были проанализированы на степень физиологической зрелости. Тетразолиевый анализ показал, что фракция микроклубней диаметром 5 мм и более по степени проникновения раствора ТТХ в апикальные и базальные ткани срезов продемонстрировала выравненность популяции. Практически 100% проанализированных микроклубней имели показатель отношения скорости проникновения красителя в апикальные и базальные ткани меньше единицы, т.е. микроклубни были зрелыми. В контрольном варианте (без холодовой предобработки), у 67% микроклубней этой же фракции этот показатель был больше единицы, а у 33% - меньше единицы. Микроклубни из фракции диаметром 3-4 мм во всех вариантах показали реакцию незрелых. Можно предположить, что холодовая предобработка эксплантов приводила к выравниванию по физиологическому возрасту крупной фракции микроклубней, т.к. метод окраски срезов водным раствором ТТХ показал, что они находятся в одной стадии зрелости. Следовательно, получение фракции микроклубней, диаметром 5 мм и более, является гарантом физиологически зрелого семенного материала.

Нами выявлены существенные различия по доли проросших микроклубней в период хранения между вариантами, в которых исходные стеблевые экспланты были подвергнуты холодовой предобработке (4°С; длительность экспозиции 2 ч.) и без таковой (20°С). Микроклубни имели кожуру телесного цвета с небольшими трещинами. Их почки формировали этиолированные роски длиной от 1-3 до 8-10 мм. Через 12 недель после снятия со столонов и хранения при 4°С в темноте, доля микро-кпубней, образовавших ростки была в 1.6 раза у сорта Луговской и в 4.0 раза у сор-7û ! !czc:::-f; f/e"1-"10 п плпилнтах с холодовой предобработкой эксплантов, чем в контроле. Видимо, холодовая экспозиция стеблевых эксплантов не только синхронизировала развитие столонов, но и позволила продлить срок хранения получаемых микроклубней, предотвращая их преждевременное прорастание, что является положительным моментом в биотехнологии картофеля.

С целью изучения возможности использования микроклубней картофеля, полученных в биореакторах модельных конструкций, в качестве полноценного оздоровленного посадочного материала для получения семенного материала были проведены вегетационные опыты в почвенной культуре. Из микроклубней сформировались морфологически нормальные растения картофеля без видимых признаков от-

клонений от нормы. 80-90% материнских растений каждого сорта формировали 1-2 выходящих на поверхность подземных боковых облиственных побегов, что является обычным явлением у семейства пасленовых [Маркаров, Головко, 1995]. Визуальных отклонений от нормы по морфологическим признакам у габитуса изучаемых нами сортов картофеля в период вегетации выявлено не было. Анализ клубневого потомства микроклубней картофеля не выявил отклонений от нормы по морфологии и урожайности [Анисимов и др., 1993; АЫооугаПа, 1994 и др.]. Следовательно, оздоровленные микроклубни, получаемые в биореакторах модельных конструкций могут быть использованы в качестве полноценного материала в семеноводстве картофеля на безвирусной основе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа является актуальной в связи с необходимостью совершенствования способов массового получения оздоровленных микроклубней картофеля с привлечением замкнутых систем биореакторов для предотвращения вторичного заражение. Для изучения этапов клубнеобразования был выбран нетрадиционный - объект исследования - культура столонов. Такой подход позволил исключить из привычной схемы получения оздоровленных микроклубней картофеля стадию "фото-трофного пробирочного растения" и индуцировать микроклубнеобразование- непосредственно на столонах.

Показанная в ходе исследования зависимость развития столонов от числа эксапантов и объема жидкой среды в культуральном сосуде выявила необходимость применения в уникальной конструкции биореактора особой системы орошения. Культура столонов омывается питательной средой, поступающей из отдельной от сосуда с эксплантами емкости, благодаря работе пневмоимпульсного насоса. Это предоставило возможность не лимитировать ее объем и получать микроклубни в 1.5-1.8 раза большего диаметра, чем при других типах культивирования. Несомненно, при получении микроклубней картофеля в пневмоимпульсном биореакторе возникают новые возможности для изучения и регулирования этапов столоно- и клубнеобразования. В частности, необходимы комплексные исследования с привлечением более точных методов определения качественного и количественного состава углеводов в питательных средах в период культивирования. В наших исследованиях предложено индуцировать клубнеобразование после формирования столонами двух метамеров (на 7 сутки культивирования). Анализ иерархии микроклубней и их вы-равненность подтверждает возможность такого подхода.

Работе присущ поисковый характер. Попытка увеличения показателя эффективности клубнеобразования путем получения большого числа клубнеобразую-щих столонов за счет снятия апикального доминирования и индуцирования развития латеральных столонов не выявила высокой положительной корреляции (г=0.7 и выше) между числом столонов и микроклубней, что требует дополнительный поиск факторов.

Выявленные при постановке экспериментов особенности культивирования культуры столонов следует учитывать при разработке технологии массового получения микроклубней картофеля в биореакторах.

ВЫВОДЫ

1. Культивирование стеблевых черенков на безгормональных жидких питательных средах в биореакторах модельных конструкций в условиях непрерывной темноты (1=20°С) позволяет получить быстрорастущую культуру столонов, тем самым исключить стадию "фототрофного пробирочного растения" и сократить время получения микроклубней;

2. Преинкубация стеблевых черенков в условиях пониженных положительных температур синхронизирует развитие столонов. Выявлена реакция генотипа на режимы охлавдения и подобран универсальный для сортов картофеля различающихся по скороспелости режим синхронизации развития столонов (7°С; длительность экспозиции - 24 ч.), при котором не наблюдается снижения эффективности столонообразования;

3. На примере сортов картофеля, контрастных по скороспелости показано, что формирование метамеров обусловливает периодичность роста столонов. Выявлено, что формирование микроклубней происходит в течение четырех недель и носит дискретный характер, по истечению которого происходит нарастание массы;

4. Нарушение вентиляции в культурапьных сосудах биореакторов модельных конструкций приводит к накоплению этилена, углекислого газа и снижению содержания кислорода, следствием которого является торможение развития столонов и нарушение процесса клубнеобразования. Особенности технического решения, заложенные в конструкции пневмоимпульсного биореактора предоставляют возможность контролирования уровня газов, либо экзогенного введения этилена / этиленпроду-цирующих соединений для регуляции этапов клубнеобразования;

5. Преимущество пневмоимпульсного биореактора, позволяющее не лимитировать поступление питательной среды к культуре столонов обеспечивает получе-

ние выравненной фракции микроклубней, размером в 1.5-1.8 раза больше, чем при других типах культивирования;

6. Вегетационные опыты показали положительную оценку клубневого потомства микроклубней как полноценного материала в семеноводстве картофеля на безвирусной основе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Юрьева Н.О., Дерябин А.Н. Возможность регуляции процесса клубнеобра-зования у картофеля (S. tuberosum L.) в условиях биореактора с использованием фитогормонов и ретардантов. Регуляторы роста и развития растений. Тез. докл. Ill Междунар. конф. (27-29 июня 1995 г.) М. РАСХН. С.208.

2. Дерябин А.Н. Возможность применения биореакторов для клонапьного микроразмножения картофеля (Solanum tuberosum L.). XXIV Огаревские чтения. Тез. докл. науч. конф. (декабрь, 1995 г.): В 3 ч., 4.2. Саранск. Изд-во Мордов. ун-та. 1995. С.14.

3. Юрьева Н.О., Орешников А.В., Дерябин А.Н. Изучение биологии микроклубней картофеля при быстром микроклональном размножении в биореакторах разного типа. Тез. докл. V Всеросс. планово-отчет. конф. по напр. "Гэнная и клеточная инженерия" (февраль, 1995). Москва. 1996. С.54.

4. Орешников А.В., Дерябин А.Н., Юрьева Н О., Бутенко Р.Г. Заявка на изобре- ' тение "Устройство для биотехнологического выращивания растительных тканей" N 96-111641. Приоритет от 10 июня 1996 г.

5. A.N.Deryabin, A.V.Oreshnikov, N.O.Yuorieva, R.G.Butenko. Scaling up the process of virus-free potato (Solanum tuberosum L.) micropropagation through bioreactors. In: "Hot Topics. Addendum Booklet". World Congress on In Vitro Biology, 1996 Meeting of the Society for In Vitro Biology. Biotechnology: from fundamental concepts to reality. San Francisco. CA. USA. June 22-27.1996. P.18.

6. Дерябин A.H., Орешников A.B., Юрьева H.O., Бутенко Р.Г. Рост столонов и индукция микроклубней картофеля in vitro при разных типах культивирования. Доклады РАН. 1997. (принята к печати).

7. N.O.Yuorieva, A.N.Deryabin and R.G.Butenko. Cold pretreatment - as a possible tool for aseptic potato explants synchronization in bioreactor tuber micropropagation. Представлено в журнал "Plant Cell Culture and Biothechnolog/ (Рукопись 7 с.)