Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ ГОРМОНАЛЬНЫХ И УГЛЕВОДНЫХ КОМПОНЕНТОВ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ И УСЛОВИЙ ВЫРАЩИВАНИЯ НА ФОРМООБРАЗОВАТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В КУЛЬТУРЕ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ ГОРМОНАЛЬНЫХ И УГЛЕВОДНЫХ КОМПОНЕНТОВ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ И УСЛОВИЙ ВЫРАЩИВАНИЯ НА ФОРМООБРАЗОВАТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В КУЛЬТУРЕ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO"

А-305&5

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ОВЧИННИКОВА Вера Николаевна

ВЛИЯНИЕ ГОРМОНАЛЬНЫХ И УГЛЕВОДНЫХ КОМПОНЕНТОВ КУЛЬТУ РАЛ ЬНОЙ СРЕДЫ

И УСЛОВИЙ ВЫРАЩИВАНИЯ НА ФОРМООБРАЗОВАТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В КУЛЬТУРЕ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO

03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена в лаборатории безпир\< нпч кутьтур НИИ сельскохозяйственной биоіечно їсиии РАСХІІ

Научный руководитель - кандидат сельскохо ¡чаственных н^ук О. С. Мелик-Саркисов

Официальные оппоненты доктор биолої ичи кик наук, стар ший научный сотру лик 3. Б. Шамина; кандидат биологиче ских наук, старшин научный соїру шик И. Г. К и рьян.

Ведущее ччрел^ ісіше ІІІІІІ карюфільного чо ¡яіісгиа

Защита дисиріации сосіоиті я » .

1992 г в чаюв на ¡асетании сгк. циа нпировашшго сове

та Д 120.55 07 в Моемой кои сельскочо ¡ниственнои академии им К А Тимирязева, 127550, Москва, у і I имнря ¡свская, 19

С диссертацией молено ознакомиться ы биб.пшгеке ТСХА

втореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических на\к

о А. С. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

• Актуальность цройлемы. Картофель .- одна из важнейших сельскохозяйственных культур, с годами накапливает вирусную инфекцию, что приводит к значительному снижению урожая, а часто и. к полной гибели растений . В связи с этим существует проблема оздоровления и клонального микроразмножения оздоровленного картофеля. Полученные теми юга иными способами безви- . русные растения картофеля можно очень быстро размножить в больших количествах, испсяьзуя различные способы клонального микроразмножения (Muraahige, 1974).

- ; Однако, использование пробирочных растений картофеля в качестве посадочного материала малотехнологично из-за большой трудоемкости ' этого процесса. Гораздо болей эффективно использовать в качестве пооадочного материала микроклубни, полученные в пробирках. . \ ■

■ После того, как была показана способность культуре кар- тофеля образовывать микроклубни в условиях in vit го (Вутенко, 1964), в лаборатории беэвирусньгх культур ШИИ сельскохозяйственной биотехнологии впервые было предложено использовать в качестве посадочного материала микроклубни, полученные в пробирках. . , - * 1 ;^

Несмотря на то; что-микроклубни картофеля в культуре in vitro получают многие исследователи, до сих пор недостаточно изучена роль-отдельных факторов питательной.среды, в частности таких важных. как цитокинины: и углевода, и физических, условий :выращивания на:эффективность этого процесса, что не позволяет его оптимизиров!ать в достаточной' степени, тем более, что существует ^сильная, зависимость процесса клубнеобра-' зования от-специфических:сортовых особенностей.

• . > • I - ЦЕНТРАЛЬНАЯ

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сельскохоз. академии им. К. А, Тимирязева _

Инв. №.Â

Цели и задачи исследования. Поэтому, целью данной работы явилось изучение факторов, влияющих на рост и клубне образование растении картофеля в условиях in vitro, для усовершенствования и увеличения эффективности процесса клубнвобразования

у определенных перспективных сортов картофеля. В связи с этим были определены задачи исследования:

1. Изучить влияние на рост и клубнеобразование картофеля in vitro различных цитокининов - кинетина, 6-БАП, зеатина и определить их оптимальные концентрации дум процесса клубнеобра&о-вания в условиях пробирочной культуры.

...

2. Изучать влияние Сахаров на процессы роста и югуОаеобра-зования картофеля in vitro и определить их оптимальные для процесса клубнвобразования ™»центращга.

3. Изучить цитогенетические эффекты фитогормонов и различных Сахаров, используемых при выращивании растений картофеля в условиях in vitro и при индукции клубнвобразования.

4. Определить параметры внешних условий - продолжительности светового дня и температуры, оптимальных для клубнвобразования картофеля in vitro.

5« На основе полученных данных разработать оптимальный способ индукции микроклубяеобразования у картофеля.

Научная новизна работы. Изучен и оптимизирован процесс индукции микроклубней картофеля в условиях in vitro у перспективных сортов картофеля, ранее не использовавшихся в экспериментах по клубнеобразовашш in vitro. Показаны различия в действии разных цитокиншовых препаратов в культуре in vitro в специфичность реакции на условия культивирования у разных сортов.

оВпервке показано, что сомаклональная изменчивость в культуре in vitro картофеля монет вызываться одним из важнейших компонентов питательной среды - сахарозой, и, в частности, глюкозой,

образующейся в результате частичного гидролиза сахароэы.при -автоклавировании. ;

/Установлен стабилизирующий плоидность культивируемых in vitro растений картофеля эффект низких концентраций фруктозы и их антимутагенная активность.,

. Практическая ценность работы. На основе полученных в работе результатов автор составил 2 методических рекомендации по эффективному размножению безвирусного посадочного материала • картофеля в видв микроклубнвй. При использовании образовавшихся in vitro шкроклубней в , качестве посадочного материала на экспериментальной базе "Горки Ленинские" получено 36,9 т семенного .картофеля, ^ свободного от фитопатогенов. Использование данной технологии в сконструированных в лаборатории прошшлешгах гидропонных установках обеспечивает выход конечной продукции в количестве 5-6 тыс. мштклубней в год с I «2. Таким образом, показана возможность использованкя микроклубней картофеля, индуцированных в культуре in vitro в качестве полноценного посадочного материала. - - ' V

Апройоддд рдДптц, Результаты исследований доложены на Всесоюзной конферешаш. "Перспективы использования методов генетичес кой инженерии-и биотехнологии в растениеводстве (г.Ялта, 1985г.) Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск," 1988). работа удостопна серебряной медали на ШХ СССР за ISSSr. : . . ' . ';

Публикшии. По материалам диссертапзм опубликовано в ра- . бот, получено 2. авторских»Свидетельства.., • , "

Объем и структура 'работе.' /дессертациоинач работа состоит йз .введения,". обзора литературы,' методической части, результатов исследовании и их обсуждения »-библиографии.' !,1атерпала. диссертации изложены на;151 странице, машинописного, текста, включая 17

таблиц, 9 рисунков и 13 фотографии. Библиография - 217 источников, а том числе 170 зарубежной лиаературы.

ОБЬьКШ И МЕТОДЫ ИССВДОВАНШ

Б опытах использовали культивируемые in vitro безвирусные растения картофеля boianum tuberoeum L. 6 перспективных сортов, оздоровленные методом культуры апикальных мариотем - Повировец, Лзобклие, Самородок, Бирюза, Янтарный, Истринский.

Исходные растения культивировали на среда Мурасиге и Скуга с и,1 мг/л ИМК и сахарозы при тенпературе +*24-25°С даем и

ночью, 1,-чао. продолжительности светового дня и освещенности 7 клк. Эти же условия являлись контрольными в проводи-шх экспериментах по изучению влияния различных факторов на процессы роста и кд>бнообраЭования растений картофеля.

Исследования проводи«« на различных типах черенков: А -апикальные черенки, взятые из верхней части, Ь - медиаяыша -из средней части Х4-5 узел), В - базалыше, взятые из нижней, части исходных растений (1-2 узел). Казвдый череньк содерти один узел с листом и почкой.

В экспериментах учитывали высоту добегов, число боковых побегов, столонов и клубней. При выращивании черенков на средах с различным содержанием вдтокиншюв и оахаров, а также при различных температурах и длине дня, подсчеты проводили на 30-е и ЬО-е сутки культивирования.

Изучение влияния различной продолжительности светового дая на рост и клубнеобразованиа проводили на черенках, которые до образования 3-4 листьев (10 дней) находились в тех же условиях, что я исходные растения (16-чао. световой день, освещенность 7 клк, температура +24-2Л днем и +19-20°С ночью). После этого их помещали в условия 6,8 и 10-час. светового дня на 30 суток.

Затем растения вновь'переносили на 16-час. световой день» Учеты* проводили на 30-е и 60-е сутки после переноса растений на короткий световой день. ' . - •, -

В опытах по изучении влияния пониженных температур черенки через 10 суток культивирования в і условиях, оптимальных для нормального роста и развития,переносил* вкамери с постоянными температурами;- +10, +15,. +20°С. Продолжительность светового дня в камерах составляла 16 час., освещенность 7 клк. Через 30 дней растения вновь инкубировали при+25°С. Учеты проводили '. через 30 и 60 суток после переноса растений в условия пониженных температур.

В каждом,варианте опыта.учитывали по 15 растений. Опыты проводили в трехкратной повторности,-.. _ .

Цитогенетическое изучение'действия гормонов и Сахаров на " растения картофеля в условиях in vitro проводили на корневых меристемах растений.. У 30-дневных;.растений фиксировали кончики корней в ацеталкогале;(1:3) при температуре +4°С в течение 4 часов. Фиксированный материал окрашивали ацетокармином и приготовляли давленные препараты по общепринятой методике (Макаров, . Сафронов, 1978). Определяли плоидность клеток, а также число

аберрантных клеток и аберраций хромосом/ ';

, В. опытах:о луком Батун (Allium fiatulo3um L.) наклюнувшиеся семена помещали в растворы Сахаров на 3 суток и затем обра-, зовавшиеся корешки фиксировали и окрашивали, как было указано выше; Облучение сухих семян лука проводили ¡Ґ-квантами 69со в ' дозах 15 и 20 Гр. на установке ГУПОС Института.Общей Генетики АН СССР.:Облученные семена проращивали в 1,2,4^-ных растворах фруктозы и анализировали первый митоз в■корнях проростков, где • . определяличислоаберрантных °клеток и аберраций хромосом анафаз-НЫМГ.методом... ' •';■', ■:''.. •.••■'■

Коэффициент защиты (Кз) вычисляли по формуле:

Кз Е (¡Рм - Рк) - (Р».и. - РФ) . 100 Рм - Рк

Где: Рм - частота аберраций хромосом после обработки мутагеном

Рк - частота аберраций хромосом без обработки мутагеном

Рф,м. - частота аберраций хромосом после обработки фруктозой и мутагеном

Рф - частота аоерраций хромосом после обработки фруктозой

Митотическии индекс (мі) определяги по числу делящихся клеток на 1000 просмотренных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДЕНИЕ

I. Влияние цитокининоь на рост, кяубяеобразование и цитога-нйтичвскую характеристику растения камоФеля 1» уНягд.

Все изученные цитокшшны икгибировали.хотя и по разному у разных сортов, рост основных побегов у всех типов черенков. Так, растения сорта Истринский реагировали, например, на введение в культуральную среду цитокининов гораздо сильнее, чем растения сорта Повировец, Зеатин, даже в очень небольшой концентрации (0,05 ж/л), приводил к утолщению побег зі, они становились бледно-зелеными, листья были очень крупные, у верхушек отмечались признаки этиоляции.

С увеличением концентрации изучаемых цитокининов снижалась корнеобразователькая активность черенков. Из всех испытанных цитокининов зеатин сильнее всего ингибировал корноообразованиа. Толстые хорни редко когда достигали длины 4-5 сы через 60 суток культивирования даже на среде о 0,05 мг/д зеатина.

На средах с цитокининами наблюдали интенсивное развитие боковых побегов, которые образовывались уже на 7-І2 сутки культи-

•'• ч ■ . . '"■ -7 • •

вирования. Кроме того, цитокинины заметно ускоряли н развитие столонов. В опытных вариантах они появляпиоь через 3-4 суток после появления боковых побегов.т.е., например, на ІІ-ІЗ сутки у сорта Ловиравец и на 16-18 сутки у сорта Истринский. ;

Изученные цитокинины при добавлении юс в культуральную среду способствовали клубнеобразоваяию пробирочных растений картофеля. Максимальное число растения о клубнями наблюдали при содержании в среда О; 5 мг/л кинетвиа или 6-ЕАП. Снижение или увеличение концентрации этихгормонов в среде приводило к уменьшению числа растений с клубнями, а также числа клубней на растении. Такая зависимость наблюдалась практически у всех типов черенков

ва разных сортах (табл.1).

".-"'.' - V • . Таблица I

Влияние цитокшшнов на клубнеобразование картофеля в культуре іп уі.іго (растения, образовавшие микроклубни через 30 суток культивирования, %)

Тип • , Кинетин ' 6-БАП , Зеатин иоРт че- & . - -—г;——------—--————

V каН~ £ 0,25 0,5 1,0 0,25 0,5 1,0 0,05 0,1 0,2 :

О 13 7 ■ 20 40 13 7 20 20

О 0 7. 0 7 7 7 О: 26

Как правило; базальные черенки образовывали гораздо большее число растений.с кл/бнями и число клубней на растении і чем апи- -кальные черенкиі' Повировец образовывал обы'шо гораздо большее; ' число растений с клубнями и число клубнейна растении по сравнению с другими сортами! Ужесчерез 30 суток культивирования, например,.у растений, этого- сорта клубни^ обраловались аочти во всех' •. вариантах опыта, тогда как.усорта Истринский не наблюдали об-

А . А 0 . . 7 ■ 20 7 0 13 7

: §и Б 0 7 53 7 . 7 20, 20

і§§ В ' .0 7 53 13 7 40 20 .

^ А • 0 ; О ,7 ' 7 О 0 7

Є"! Б О 7 13 20. 7 20 7

к§ Вс' о/ :7л 20'' 13 , 26 26 * 20

разоваяия клубней во многих вариантах опыта на всех типах черенков.

Зеатин вызывал активное клубнеобразование уже при концентрациях значительно ниже по сравнению с кинетином и 6-ЕАП. Однако, на средах о зватином клубни формировались в основном не на столонах, а в пазухах листьев, а иногда и на верхушках побегов. Клубни, которые все же иногда образовывались на столонах, бшш в боль-, шшстве случаев неправильной формы, имели наросты каллуса. При использовании кинетяна и 6-БАП шкроклубки образовывались, как правило, на столонах в средней или нижней части растений и достигали величины 7x7 мм.

Таким образом, проведенные исследования позволили опреде-листь оптимальные концентрации цитокининов, способствующие процессу клубнеобразования. v, именно установлена сортоспеци-

фичность данного процесса и большая клубнеобразуххцая способность

«

у базалышх черенков.

На основании цблучешшх данных в качестве индукторов клубнеобразования могут быть рекомендованы только кинетин и б-ЬАП (0,5 мг/л), т.к. под влиянием зеатина наблюдались отклонения в росте и развитии пробирочных растении и клубней.

В связи с тем, что фитогормоны могут вызывать патогенетические изменения в клетках растений, культивируемых in vitro (Skirvin, Janick, 1976), нами были изучены цитогенетические эф-фектл фитогормонов, используемых при ¡тональном микроразмножении и клубнвобразовании in vitro картофеля.

ШК не вызывала увеличения частоты аберрантных клеток, а кйнетин и 6-БАП достоверно увеличивали их частоту по сравнению о контролем. При этом, частота аберрантных клеток при при.мнении о „гначовых ьлщ іт^оши (1-3 г г/л) u^ срока с Ь-и 41 Сыа значит« ыо н/ха. Ти, ^„і" о- U .1 kj-єі 'а а гвдкі^Н-

. . ' - 9 - ' ' - :

трации 3,0 мг/л число аберрантных клеток составило соответственно 9,7 и 17,7%. Зватин же, ужо в концентрации 0,2 мг/л приводил к повышению частота аберрантных клеток и аберраций хромосом, а . при концентрации 0,8 мг/л вызывал" образование свыше \Ъ% аберрантных клеток. Следовательно,' по степени увеличения мутагенного эффекта изученные цитокинины можно расположить в следующий ряд: 6-ЁАП, кинетин, зеатин. '

У расгаяяй,- выращенных на средах с высоким содержанием эе-атина или 6-БАП наблюдали появление хлорофилышх мутаций. . - Таким образом, результаты исследований показывают, что ии; токининовые препарата в сравнительно высоких концентрациях способны индуцировать цутагенный эффект. В связи с этим, для индукции мшсроклубней у, картофеля in vitro,'погвщцшс^,,предпочтительнее использовать в качестве цитокининового препарата 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л, которая не вызывает аберрационного эффекта, но обладает высокой клубнеобразующей способностью. '

?-| filottf10 оахаров на рост . кдубнеобразование и питогене-• .ТИЧ9<ЖУ» yltro.... .

рысозше концентрации сахарозы ингибировали рост основных побегов растений уизученных- сортов. Однако растений сорта Пови-, ровец оказались более устойчивыми к ингибирующему, действию саха-роэыи достоверное снижение высоты главных побегов наблюдали .лишь при концентрациисахарозы тогда как рост растений не-.которых других сортов утнотался. даже на среде, содержащей 4% сахарозы^ При;высок<й концентрации' сахарозы в. среде; (10-12^) у сорта Повировец четко наблюдалась зависимость ингибироваяия роста от; тийачеренка. Наиболее шшло в atkjc. вариантах опыта : ингибировался:рост баэалымхчерешго».У, растений же сорта Истринский такой четаой Зависимости не.наблюдали. >*

- 10 -

С повышением концентрации сахарозы в среде наблюдали образование боковых побегов, причем, более активно этот процесс шел у апикальных черенков. Так, на сорте Истринскии отмечена четкая зависимость увеличения числа боковых побегов с увеличением концентрации сахарозы в среде.

На оредах, содержащих 10 и 12% сахарозы побеги раотений обычно были сильно искривлены, имели утолщения, напомшак&ие клубни. Наиболее характерно это для медиальных и базальных черенков. В то же время, например, растения сорта Повировец по морфологии мало отличались от контрольных.

Увеличение содержания сахарозы в среде ингибировало корне-образование, причем, у Истринского в большей степени.

Заметно различались изученные сорта и по признаку столонооб-разования. Так, у сорта Ис >.анский эти процессы проходили гораздо менее активно, чем у растений сорта Повировец, которые об-раэовывали значительное число столонов, причем, у базальных черенков этот процесс шел значительно быстрее, чем у апикальных»

Изученные сорта резко различались и по способности к клуб-необразованию на средах с сахарозой в культуре in vitro (табл.2). Если у сорта Повировец клубни формировались уже в первый месяц культивирования, то у сорта Истринский процессы клубнеобразоваг-вия активизировались лишь к концу второго месяца культивирования. Как правило, у изученных сортов число растений;, образующих клубни и число клубней на растении увеличивалось от апикальных к базальныы черенкам.

Таким образом было показано, что увеличение содержания сахарозы в среде угнетает рост растений и в то же время стимулирует процесс клубнеобразования, причем, эти эффекты являются сортоопецифичными. Клубкеобразующий эффект оказался более выраженным у базальных черенков.

Сорт

А . А о •■;. 0

ê- II; Б' в 0 •■ 0 13 33

і. - А 0 V. 0

Ед Б :. 0 ■ 0

яо В г . 0 V 0

- и - : ■ ■■;. ■.;• ■. -,v..v,:

л ;vV--;- Таблица 2

Влияние сахарозы на клуЛшобраз ование картофеля '.' .. в культуре m vitro (растения, образовавшие микроклубни через 30 суток культивирования, %).

Тип , . Концентрация сахарозы,1 %'.■'■: черви- ......... 1 ■

да ■ . • 2 • - 4 6 : : 8 ■ 10 ;• 12 ■ ,-.;.

: 13 ' . 53 ІЗ V. 20 '..'•

40 100 60 .73 ,

■100 ;100 ' ІШ .' / 100 .

'.•"; о .. . о .. о. : о . .

о о . о " " о ■ . о ' : у о 20 із - ,

Растения картофеля, выращиваемые на средах о различным уров-. нем содержания сахарозы, были подвергнуты патогенетическому анализу, хоторыК отчетливо показал увеличение числа аберрантных клеток и аберраций хромосом и уменывйние митотического индекса с нарастанием концентрации сахарозы (табл.3). Ухе при 4£-номуров-не сахарозы в среде резко возрастал ее. аберрационный еффёкт. Та-. ; ким образе«,; сахароза в • кіидотрваїиг^ обычно иопаяьзуемых дня индукции хлубнеобразования, обладает ярко выраженным патогенетическим зффектом.ПоаторвЕтав зксперидантана цитологически dosée удобномобъектв-. проращиваемых врастворахсахарозы семенах лука Батун,-подтвердило мутагенный эффекг сахарозы,'который , так же',..ieaic '*.-»-'раучав: с картофелем,. возраста* о увеяпением содержания сахарозы. ■ ; • ' '■*■" .'•"..''

Поскольку в экспериментах было показано, что сахароза в высоких концентрациях вызывает образование аберраций хромосом, был изучен цитотенетический эффект основных компонентов саха-■ розы- глюкози й'фруктоза - с целью определения воздажного • компонента,' вызывающего мутагікное действие сахарозы, ■ , 4

Таблица 3

Цитогенетический эфдракт сахарозы в меристемах корней картофеля in vitro (сорт Янтарный) и лука Батун

111ium fistuloaun L.

трацш" Анафазы с пе- Аберрации Mdi„d

caxapq- рест|ойкаш, хромосом,

ЗЫ, /6 *

Solanum tuberosum L. К 7,30*0,88 8,45*0,94

4 20,41*1,87 22,64*1,73 14.19*1,93

10 21,40*1,82 34,77*2,11 26,32*2,30

allium fietulosum L. К 4,11*0,87 5,76*0,66

4 11,79*1,01 16,02*0,15 10,27*1,33

10 29,t>4*2,59 30,85*2,63 ^5,03*2,75

Включение глюкозы я аы^лих кшщентрациях в качество углеводного компонента в питательную среду при вырадивании »еренков картофеля в культуре in vitro вызвало, также как и в Ълучае о . сахарозой, значительное угнетение роста и развития растений. Практически летальной оказалась 12с5-нал концентрация глюкозы. 7 каргйфеля в культуре in vitro уха при содернании в питательной среде 42 глюкозы отмечено достоверное увеличение числа аберрантных клеток и аберраций хромосом. Таким образом, мутагенный эффект сахарозы обусловлен, по-видимому, одним из ее компонентов - глюкозой.

Известно, что в водном растворе часть молекул глюкозы находится в форма свободного альдегида, который индуцирует цато-генетпческие изменения в культуре ткани и вызывает генные мутации У Droeophila melaaogaater ( Да{фус, 1387, Wicki, 1968). Предполагается, что альдегид влияет на процессы синтеза ДНК. Возможно, именно с этим связан мутагенный эффект глюкозы и сахарозы.

V'-.''■ * • у - із - ." -

; ■ Также, как сахароза иглюкоза, фруктоза в высоких концен- • : трациях (10-12$) вызывала резкое угнетение роста и развития растений. В то же время, фруктоза при всех испытанных концентрат-,' циях (2-12$) не индуцировала аберраций хромосом в меристемах корней картофеля и лука Батун, Более того, уже 4£-ный уровень фруктозы вызывал достоверное снижение числа аберраций хромосом . по оравнению с контролем в корневых меристемах картофеля и лука.'

В опытах по совместному применении фруктозы и сахарозы V было показано, что фруктоза обладала сильным антимутагенным .^эффектом и сникала в несколько раз число аберрантных клеток и - аберраций хромосом, индуцированных сахарозой в клетках картофеля и лука Батун (табл.4). -Л'-;' ' ' ' Таблица 4 ■

Цитогенетический эффект совместного действия фруктозы ■ сахарозы в меристемах корней картофеля in vitro

Концентрация Анафазы о пе- > Аберрации

Сахаров, % рестройками, % хромосом, % '

8,45*0,94 5,33*0,64 28,44*1,88 5,14*0,57 -

Примечание; \ Ф . фруктоза, С сахароза

Полученные результаты позволили предположитьі что фрукто- . за* возможно, окажет защитное действие и при облучении клеток ионизирующей радиацией. Эксперименты о облученными семенами \ лука Батун показали, что достоверный защитный эффект наблюдается уже при использования небольших (I/O княцентраций фруктозы (табл.5).

Фруктоза оказывала защитное действие и на средах, индуїда-рующкх клубнеобразованйе, т.е. содержащих питокиншш к сахаро-

К 7,30*0,88 '

1% Ф . ' V . • у ; 7,41*0,59

8% С 15,53*1,51

If Я* 4,66*0,54

ay в высокой концентрации.

Таблица 5

Цитогенетичеекий эффект -облучения (20 Гр) и совместного действия -облучения в растворов фруктозы в корневых меристемах проростков лука Батун,

Концентрация фруктозы, % Анафазы с перестройками, % Аберрации хромосом, % Коэффициент защиты, Кз

Контроль 4,60*0,66 5,40*0,71

f -облучение 17,52*0,99 25,29*1,13

I + 20 гр 8,20*0,70 10,93*0,80 56,73

2 ■+ 20 Гр 9,20*0,73 11,22*0,80 55,63

4 + 20 Гр 10,42*0,87 12,21*0,93 51,72

При выращивании растений на питательных средах с кинети-som и 8 и IOSt-ной концентрацией сахарозы отмечается уменьшение числа клеток о нормальной пловдностью (табл.6).

Таблица 6

Цитогенетичеекий эффект совместного действия оахарозы, кинетика и фруктозы в меристемах корней картофеля, in vitro (сорт Янтарный) .

Концентрация Анафазы о пере- Аберрации „ Клетки о нор-сахароаи, % стройками, % хромосом, % мальной плоид-

ностью, 4п=48,>

К 3,44*0,47 5,37*0,59 51,50*6,15

сахароза + 0,5 мг/л кинетина

0 9,25*0,87 11,16*0,94 57,37*4,47

4 . 10,77*0,86 15,04*1,11 58,18*5,20

10 18,33*2,33 25,00*2,50 31,81*4,44

сахароза + 0,5 мг/л кинетина + 1% фруктозы

0 4,79*0,56 5,83*0,61 73,78*4,33

4 3,36*0,36 3,86*0,39 80,40*2,47

10 7,83*1,28 9,22*1,38 65,00*4,76

Добавление в питательную среду фруктозы приводило к резкому снижению повревдаыцего действия сахарозы и кинетина. Происходит нормализация клеточной популяции. Число клеток с нормаль-

ноа плоидноотью во всех вариантах опыта резко увеличивалось даже по сравнении о контролем и составило во многих случаях более 8035, а число аберрантных клеток и аберрации хромосом, наоборот, снижалось в несколько раз.

Таким образом, из результатов экспериментов следует, что для нормализации клеточных популяций и стабилизации регенеран-тов картофеля необходимо добавление небольшого количества фруктозы в питательную среду.

Цитогенетический анализ меристем корней и стеблей растений картофеля, выращенных из микроклубнел, полученных на средах о фруктозой, показал кариотипическую стабильность.

3. Комбинированное использование Сахаров и кинетина для

иняуклци процесса клубяеобразования v картофеля in vHr;.

В сгязи о обнаружением защитного действия фруктозы, нами было изучено совмеотное влияние сахарозы, фруктозы и кинетики (0,5 мг/л) на процессы роста и клуб не об раз ов акая in vitro картофеля (сорт Янтарный).

Включение в питательные среды дополнительно к сахарозе фруктозы в концентрациях Г и 2% не оказывало здесь защитного действия, как в случае о аберрациями хромосом. Наоборот, дополнительное количество сахара, обусловленное включение» в среду фруктозы, подавляло рост основных побегов по сравь. шю с тем, что наблюдалось на среде только с сахарозой, снижало число листьев на растении.

Описанные эффекты наблюдались на всех трех типах черенков. Однако ингибирующие процессы были более зачетны на растениях, выросших из базалышх черенков.

Прл васоких чонцентрацилх углелодов растения ¡моли сальное онтоцисшовое шрамьоние ни,,', ллогьоь, члкрою&с , паолъ-

- 16 -

дались отклонения в морфология - несколько утолщенные стебли с очень мелкими листьями были искривлены и загибались вниз« я агар. Микроклубни также часто были аномальными по форме.

В вариантах о низким содержанием сахарозы (2-4$) включение в питательную среду фруктозы в концентрациях I и 2% приводило к увеличению числа образующихся микроклубней. В то же время, при высоком содержании сахарозы в среде (8-10$), включение в нее фруктозы либо не изменяло, либо приводило к снижению эффективности клубяеобразования (табл.7). ,'■-;'

.- . : Таблица 7 ■

Влияние фруктозы на клубнеобразование картофеля in vitro (сорт Янтарный) '•■"

Количество микрокдубнвй __на 20 растений, шт.

X концентрация Фруктоэц. %

Концен- Тип .Растения, образовавшие Трация, че-. №КР<?«ДУ0ЯЧ. % , --

— V 0 I 2 0- I 2

А 0 0 ■ 0" 0 0 " 0

0 Б 0 0 0 0 0 0

В о , 0 20 0 0 ; 5

А 45. • 45 80 10 . 10 17

4 Б 45 55 90 10 12 19 ;

В 85 ' . 60 100 17 13 21

А 65 20 70 14 " ' 4 15

ю . Б' 60 65 . 55 13 . ' 14 II

В 100 , 80 70 21 16 14

Таким образом, проведенными исследованиями не: удалось выявить стабялизирупцего влияния фруктозы на ьрсд ;ы роста и. развития растений. Однако было показано, что дополнительное" кшлепш фруктозы в ивдуцирупцую »лубнеобразование среду, содержащую сахарозу, либо практически не изменяло эффективность клубяеобразования, либо увеличивало его. Учитывая это,а также обнаруженный нами защитный эффект фруктозы на онтогенетическом.

- 17 -

уровне, следует рекомендовать вводить в культуральньа среди, предназначенные для индукции клубнообразования m vltr. кроме А~к>% сахарозы, такле 2й фруктозы. В этом случае в среде, с одной стороны, создается оптимальная для проц ссов кл/Онеобра-аоаания концентрация Сахаров, а с другой - наличие ¿руктозы приводит к стабилизации цитогенетнческих эффектов.

4. Влияние Факторов внешне.! совд^ на n.-ст и юг/Онэ-

образование картофеля in vuro .

4.1. Температура .

Наиболее благоприятными для получения микрокяуСнаи ни растениях изучаемых сортов оказались относительно инзкиь ваготш-тельныа температуры - <-10- t-I5°C, которые также но окрали т~ гибирующего действия на рост основных побеге^. На фони попранных температур не проявился ипгибирунчий эффект кино тини j повышенно а концентрации (4%) сахарозы на рост основных noudioii. Это характерно для всех сортов к їяпов черенков, за исдлючонл-еы copio. И~тринскк2, у которого на индукционное среда ьыситл стеблей Сила зна-ытально меньше, чем на контрольной у асах типов чьр^нков.

Пониженные температуры л сочетании с индукционной средой шгибировали корнеобразование и развитие фотосин.озі ,апей части растений, что, как известно (Чайлахяи, 1984), способствует клубнеобразовш'ию, В то se время, такса воздействие привело к заметному увеличению чиола растений, образовавших столоны у сортов о крайне низкой активностью столонообразоваяия в неиндукционных условиях (Истринский, Самородок).

При одинаковой освеценнооти л продолжительноеги светового дня (16 час.), илдуиирупцеа деіствие пониженных теїшератур на

' - 18 - • у/ л' ..

процесс клубнеобразования у разных сортов проявилось в неодинаковой степени. У сортов Изобилие и Бирюза индукция температурой имела место уже; на контрольной среде (табл.8). У сорта Бирюза наибольшее число растений с клубнями и наибольшее число клубней на растении наблюдали при +15°С, а у сорта Изобилие-при +Ю°С на всех типах черенков. Кроме того, у'сорта Бирюза наибольшей клубнеобразунцей активностью обладали растения, выращенные та апикальных черенков, а у сорта Изобилие - из меди- ; альных. У сортов Истринский и Самородок в этих условияхнабл»-дали лишь единичные случаи появления микроклубней, у у .

'• . ''* -'Л-У" '-•'*■ Табйииа 8-.'\ у-У

Влияние температура и составакультуральной среда . , ": на клубнеобразование картофеля in vitro /

Сорт Тип Растения, образовавшие микроклтбни. • %

.•' КФЯТРОДЕ .; -внн?пи t # РЙШРЭИ

ка Ю°С 15°С 20°С Ю°С 15°С 20°С

к .; 0 0, о : ' 7 - о •: о

Самородок Б 0 0 0 7 • ;; 7 , о

В ' 7 ■ .33 0 :у •■: *.87 ' ° -47 •■ 53

г ■ • • ; - А 47 73 33 1100 • 100 ■ 93

Бирюза Б 13 . 40 20 : 100 87 47

В ' 7 ■ - 33 - у о 87 У' 47-. 53

А 7 -У ; .. 7 ' 0 53 60 * 33

Изобилие Б 40 ■ 20 . 7 33 47 27

.. ' В 20 13 . 7 ■ 40 У; 7 . 40

, Па индукционной /среде стимуляцию клубнеобра; шпя пони-жопнымз температурами наблюдали у всех" сортов.. Однако;у сорта;. ' Бирюза высокая способность апикальные червяков к клубнеобразоваяию в этой случае практически не зависела от'температуры. У . сорта Изобилие в индукционных-условиях четких различий в спо- . собностл формировать клубки разными. типами .черепков но уставов- ; лоно.- „ ■■ • у-. -„.-'.-у'-д.У-'."..у-у

- 19 -

4.~. Продолжительность енотового ам.

На коротком световом дне получали обычно оолов вытянута растения с меньшим числом листьев. При этом, как праылло, рис-тения из апикальных черенков росли более oktwio, чем растения из медиальных а базальних черенков.

Короткий световой день индуцировал появление боковых иоОь-гов, однако, влияние различной продолжительности короткого дня на число появившихся боковых побегов и их дл1 tty существенно зависало от сорта и состава культуральной среды.

Следует огметить более активное образование бокоьых лоОогаи апикальными черенками по сравнению с медиальными и Оааглышчи во всех вариантах опыта и на всех сораах.

Время прявления столонов у пробирочных растений чаргоЛнын зависело от сорта и состава среды. Для растении сорта Няшрнил, например, в условиях in vitro характерно активное odpojourjute столонов из всех узлов стебля даже на длинном дне (1о чис.).

На контрольной среде столоны образовывались в основном у поздних и среднейозддих сортов - Янтарний и Истрннскил, u, 11а-эначительно у ранних - Повировец, Изобилие,у среднеспелых iwp-тов (Бирюза, Самородок) на контрольной среде отмечено ид.ишч-ное образование столонов.

Под влиянием цитокининов и 4^-ноц сахарозы в таив культуральной среды на коротком дне чиало столонов у всех сортов увеличивалось. Как правило отмечено стимулирование образование столонов с увеличением продолжительности светового дня от б к 10 часам.

Короткий световой день индуцировал клубнеобраловоние картофеля у всех исследованных сортов. Причеп, частога оОра^оьа-ния кяубнел вовыизлась о /величенно*! процо." лтольнооі.і свего-

. . - 20 -вого дня от 6 к 10 часам (табл.9).

Таблица 9

.Влияние различной продолжительности светового дня на клубнеобразование картофеля in vitro (растения, образовавшие микроклубни через 30.суток культивирования, %

Сое- Продол- Истринский

тав китель- ...................

среда ность ■ Тип черенка

светово- ———————

го дня, А - к в . а

чао. Д ь а А

Бирюза

Изобилие

. Б

В

Б В

I

о я m ■

.•¡j1 В,

6 .. О . 10 16

6 , ' 8 10 1С

і 6

+ м 8

эд.я- ю

[¿^И 16

7 7 13

7 7 20

53 66 U7

О. О О

2U .13 40 13 20 52 74

О.

40 33 60 О

■ 0 0 40 60

47 66;

Q

60 80 О

7 7 13

7 7 26

40 47 66

О U О

U 13 33

40 . 47 66

66 • 60 80

О 0.0

7 26 33

53 53 66

53 66 66

О О 7

0 0 U

20 0 13

33 60 50

О О О

7 33 66 . О

о

47 93. .0

33 60 93 . О

60 60 6687 87 1 93 80 93 100 О . . О О

Дня растений всех сортов, кроме Самородка, индуцируидее деіїстзио короткого дня проявилось уже на контрольной среде. . Растения сорта Самородок ни при одной из испытанных длин дня •* но образовывали клубня.на контрольной.среде и лишь на средах с сахарозой (4%) илп с сахарозой и'.цитокиншами короткий день индуцировал клубнеобразование на растениях этс\*с , - •

Способность к формированию клубней,как правило,увеличивалась от апикальных к базальным черенкам. ;; ; : ■ .;,. ,' Распределение образовавшихся на растешіях шкроклубней зависело от продолжительности светового дня.'Основная их. часть образовывалась в нияпей и средней части растенийОднако

личение продолжительности снегового дня от 6 к 10 часа! приводило к равномерному распределен™ чикроклуошь. по bcsmj ¡.'-і j-нию. Іикроклуони образовнвшшсь в п^/хах чкстієб .їли на т -л -в ах. ¿о всех вариантах опита соотношение шдаїу палушшгы донями и клубшига на столонах примерно одинаково - 1:2.

Проведенные исследования показали, что .швеенич в кул**,-ральную среду цитокининов етшіулярует югубиообразованш и vitro, как на коротком, так и на длинном дне, ко в псі-дливч случае эффект проявдчется лишь чероз 60 диен.

Таким образом, в опытах оыли выявлены основные і а. онея'и,— нооти роста и развития пробирочных растений ывети сортов : tj>-тскреля в условиях различной продолжительности световоп дал. Исходя лз полученных результатов, в качестве оптимальных условии ДЛЯ получения МШфОКЛубНей ir. vitro ДЛЯ д8нішх CUP'.'GU HU предлагаем 10-час, световой день а добавление в чульт.,рольней среду 0,5 мг/л 6-БАП в сочетании с 4Й~но,і сахарозой.

ЗАМШШИЕ

«Іикроклубни, полученные in vitro, могут быть пралтичесгл использованы в качестве исходного посадочного материала, еис< одного от Б_руснсй инфекции. Индукция микроклубней непооридотген-но в пробирках позволяет исключить возможность пврезаражония на всех этапах получения безвирусного семенного •• нала картофеля, сохранить его в течение всего осенне-зимнего периода без дополнительных затрат, связанных с пересадками, ссздаз своего рода "банк" оздоровленных ценных сортов картофеля, упростить и удешевить пересылку семенного материала, ускорить селекционный процесс, и, наконец, удьолть количесгво клугяел с о .лого куста пэ сравнению с цаЮил^ -іроко приме ьь •/" до от^ю

. ■ 22 - ; : методом размножения пробирочными растениями. При этом показано, что около 96$ микроклубней, даже самые мелкие из них, могут быть использованы ДЛЯ формирования НОВЫХ растений (Dodda, 1984). На основании результатов нашей работы мы предлагаем следующую схему получения микроклубней картофеля в условиях in Vitro. : . '

Черенки вначале культивируют при 16-чао. продолжительности светового дня, температуре +24- +25°С днем и +19°- +20°С ночью, освещенности 5-6клк, на среде следующего состава (на Хл): макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу, тиамин- 1,0 мг, пи-ридохсин - 0,5 мг, никотиновая кислота - 0,5 мг, аскорбиновая киолота - 1,0 мг, 6-БАП - 0*5 мг, сахароза - 40г; После образования у пробирочных растений 4-5 листьев их "переносят в ус- . ловия внешней среды, индуцирующие клубяеобразование: пониженные тешературы (+10-15°С) и короткий (Ючас.) световой день, , Образование микроклубней наблюдается, как правило,-через 1-1,5 месяца после переноса раотений в индувдионные условия. Сформировавшиеся неповреждешше микроклубни закладывают на хранение в стерильные пробирки. Условия хранения -'температура +2-5°С ' и влажность воздуха 95$; Микроклубни, полученные описанным! способом, используются в дальнейшем в семеноводстве картофеля■ на безвирусной основе. ■. . . ; V ; :".■

Сравнительное изучение микроклубневых и пробирочных рао- ; тений картофеля в условиях открытого к закритог* грунта на .. экспериментальной научно-исследовательской базе /Торки Ленин-. ' ские" показало значительное превосходство первых по урожайное-> ти и'количеству хлубней с одного куста. Результаты,' получешше за 4 года вегетации, позволяют усталовить принципиальную воз--' мошость создания жизнеспособного, оздоровленного посадочного-материала' картофеля пробирочными -клубиями- о посадкой их непос^,

- 23 -

родственно в грунт. При «клользивошт ибразующихсл m vl'-rj ііиьроклубнеЛ а лачоотво посадочного материал^ fía ¿ксзиры^и-таяьной базе "Горки Ленинские" уке получено 36,9 т сьшішого картофеля, свободного от флюиатогвиов, ь -г.ч. и вируию'л инфекции.

ШВЩЫ

I .Цитокининовые препараты лнгибируют рост раї.тшььі и корней, но активизируют образование и рост боковых яобего« и cao-лонов, а также индуцируют клубнеойразовшше в культуре ir. vu о картснродя. Степень выраженности этих оффи<пов зависит от сортовых особенностей, концентрации и типа аитошшннов. Наибояии сильныи внгибирующий развитие растений эффект оказывает joa-тин. Наибольшее число полноценных микроклубпои полудиш при использовании 6-БАП и кинетина.

2. Цитокининовые препараты, содержащиеся в культуральнои среде, индуцируют аберрации хромосом, lio оцепени уволкчен»ія мутагенного эффекта цитокиншов их можно раоїоло.шть в илиду-ющий ряд: 6-БАП, кине.'ин, зеатіщ.

3. Сахароза в высоких концентрациях вызывает резкое угнетение роота растений и кориеобразования, но активизирует образование столонов и боковых побегов, а также стладулирует процесс клубнеобразования у растений картофеля в культуре l .uro. Степень выраженности этих эффектов зависит от сортовых особенностей,

4.Сахароза и глюкоза в концентрациях, используемых для индукции микроклубней, вызывают образование большого числи аберраций хромосом, частота которых находится в прямое зашгси-мости от юс ионцентрации. Поотону, эти сахара могут як г ігьс ¿ одаим из важнейших факторов ссмаклиналілюї лзі.йіі іші jo г.: ь ^лъ-

туро in vitro.картофеля., ' ■'■'''"'.

5. Фруктоза не индуцирует аберраций хромосом, а в низких концентрациях (1-4%) обладает сильным антимутагенным эффектом и снижает в несколько роз их число, индуцированное цитокинина-ми, сахарозой и /"-облучением, стабилизирует. плоидаость культивируемых in vitro' растений: картофеля. • '-,'

6. Пониженные-температури в сочетании с индукционной средой иягибируют корнеобразованію и развитие фотосинтезирующей; ; части растений, но активизируют в этих условиях процесс "стодо-кообразования, причем, степень проявления этого аффекта зависит от сортовых особенностей.. '

7. Пониженные температуры. индуцируют клубнеобраз ование - у сортов с высокой клубнеобразующей активностью уже на1контрольной среде. У сортов с низкой йлубнеобразующей активностью стимуляция клубнеобраз ования пониженными температурами имела место лишь1 на индукционной среде. ¡ЛаксимальныЙ эффект клубнеобра-зования был получен:у всех сортов на индукционной-среде при +ІО-І5°С. . у ■ .' ,■■ •'.■

8. Короткий световой день способствует увеличению длины,-' стеблей и образованию боковых побегов.на контрольной и индук--ционных средах. Существенно активизирует образование столонов> на контрольной среде у поздних и среднепоздшгх сортов; незначительно у ранних, а'растения среднеспелых сортов не образо-

'"вывали сгатояов в этих условиях. Ha индукдаоышг:'средах в условиях .короткого дня.активность столонообразования былавысокой у всех сортові •'. ."' - " ,","/.* - 9. Короткий.световой-день оказывает•индуїщрутаее;действие на процесс■клубнеобразования у всех изученных'сортов картофе-• лл. Ошжладыюк для получения -шкроклубней, картофеля- даюшх; сортов яаплега?.10-час. продолжительность светового дня'./ "/,.

у '•' -25 , - '•";•■'■•' .; ... .,.'

10.'Клубнеобразующая активность обычно болоо■выра^елч '.у баэальных 'чораиков-картофеля. -v..".'," "' '"'.- " * "'

"■'..:: II. По степени отзцвчизости 'пробирочных растеши карто: феля на їшдуцирующиз хлубнеобразование условия все изученные сорта можно разделить на следующие три .группы: І, Повировоіі -эффективно образует микроклубни в шідукционішх условигсс и в . меньшей, степени в неиндукциошых; 2 .'-Изобилие, Бирюза.Ялтар-шііА, Иотринскиіі - з^ективао образует ишфоіицбпл и мидукца-ohhüx условиях и очень слабо образуют их в іюии.цукционіїих; 3• Самородок".-' 'образует: микроклубни в незначительном количест-• Bö дахе в индукционных условшїх.-.' -.,.-■.'".

.Л "12.. Для .отабкшэшдаи-.генома культивируемых in'vitro рас-,■тений картофеля рекомендуется включать-в культуралыие среды - фруктозу в небольших концентрациях и использовать из цлтоки— ниновых.препаратов 6-БАП, даыщшг наименьшее число аберраций .. хромосом. : .'.; <'■■' '-'rV.'.-, "■ '■■■'■ •■

,'Список'.работ, опубликованных«по материалам диссертации.

ІV'Мелик-Саркиоов О.С., Овчинникова В,Н.,.Ульянов Р.И.. Получение безвирусного посадочного материала картофеля микроклуб-' . ,/нями, - индуцированными в культуре in vitro. - іЛетодическке. / рекомендации. Москві: ВАСШІІИ. ISÖ5. ІЄ^.С. . . . ; .

2, Мелик-Оаркисов О.С.; -Овчинникова"В,hV-Индукция цитокини- ";• /ааш-клубнеобразованид-у картофеля в культуре in,viti-.i. ' ; //Веотник с/х науки. 1986. М (355).. C.I0Q-I05. , 3.■ Овчинникова В .Н.',■ Малик-Саркисов O.G., Фаддеева H.H. Ин-Л'ддация, клубнеобразования картофеля in,vitro, пониженными теще-.

ратурами //Ввстник с/х' науки.І987. J67 (370). С.81-85. ' . ; 4» .Ле^жанова Д,В.',^0вчинішкова В.Н., Мелик-Саркисов 0.0, '■-Факторы 'соышиюнальной иэиенчивости //ДАН'СССР. 1988. Т.301.

. ' - 26 -№ 5. С.1221-1226. . . '

5. Черепанова Л.В., Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н. Цитогенетичосккй эффект.сахарози //Генетика. 1988. Т.ХХІУ.. . !ёв. C.ID0I-I5O3. V V '

6. Мелик-Саркисов' О,С., Цоглин Л.Н., Овч ¡нникова В.Н. и др. Технология культивирования и размножения регенерантов карто- ' фоля. - Методические рекомендации. Москва: ВАСШЖ. 1990, І8С,

7. І'абель Б.В., Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н. и др. , Гидропонная' установка. - Авторское свидетельство СССР мбсоозз. 1990. ^ ; ■■ "' ; -. '•

8. Габель Б.В., Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н. и др. . Гидропонная установка. - Авторское свидетельство по заявке v. J6 4711740/15. 1990. , / ; ' • -

9. Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н.» Витоя И.С. . Биохимический состав микроклубней картофеля, индуцированных в культуре in vitro //• С/х биология. 1991. М", С.50-56.

ТО., Череканова Л.В., Мелик-Саркисов О.С., Овчинникова В.Н^ Цитогенетический эффект Сахаров //Генетика. I99I.T.27. №6. ■■ С.1372-1378. -.'.:■'•'■ "'У./- ■ :"

Объем п л

Заказ 1405

Тираж 100

Типография Московской I х «кидемпи им К А Тиуирчзева 1527550, Москва И 550, Тимирязевская ул, 44