Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ ЭПИБРАССИНОЛИДА И АМБИОЛА НА ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС И УЛЬТРАСТРУКТУРУ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ РЕГУЛЯЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ ЭПИБРАССИНОЛИДА И АМБИОЛА НА ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС И УЛЬТРАСТРУКТУРУ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ РЕГУЛЯЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ"

На правах рукописи

ЕВСЮНИНА Анжела Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ЭПИБРАССИНОЛИДА И АМБИОЛА НА ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС И УЛЬТРАСТРУКТУРУ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ РЕГУЛЯЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории биохимии фнтоиммунитета Института биохимии им. А.Н, Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Н.П. Кораблева

Официальные оппонента:

доктор биологических наук, профессор Е.Б. Кириченко

кандидат биологических наук, И.И. Чернядьев

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет км. М.В.Ломоносова, биологический факультет

Зашита состоится «//» 2006 года в ^ часов на заседании

диссертационного совета К 002.247.01 ПО защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т, 33, корп. 2,

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т, 33, корп. 1.

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. Выяснен»« механизмов регуляции ростовых процессов в связи с устойчивостью растений к стрессовым воздействиям являет«» важной проблемой биологии. Актуальным направлением работ в згой области представляется изучение сигнальным молекул, в том числе стрессовых фигогормоков я нх Синтетических аналогов, контролирующих рост и устойчивость растений картофеля. В основе исследований лежит концепция о взаимосвязи стадий онтогенеза с устойчивостыо. Например, формирование реакций иммунитета сопряжено с длительностью генетически закрепленного признака глубокого покоя у клубней картофеля различных сортов.

Одним из перспективных подходов к решению задач, связанных с повышением продуктивности картофеля, является скрининг физиологически активных соешшенМ нового поколения, обладающих свойствами регуляторов роста н иммуномодуляторов. Основные биологические параметры отбора такого рода соединений - их влияние на покой и ростовые процессы после его окончания. Ранее были выявлены две группы веществ -брассиностсроиды н антиокенданты, способные регулировать рост и устойчивость растений к неблагоприятным факторам. Изучение влияния представителей этих групп -зпибрассинолида и амбнола на картофель важно для понимания механизма нх действия и определения наиболее эффективных путей разработки технологии применения.

Получение сведений об изменениях в гормональном балансе, морфогенезе и ультраструкгуре тканей точек роста позволяет выяснить взаимодействие физиологически активных соединений с функционированием сигнальных систем, включающих стрессовые фнтогормоны (этилен, абецнэовая кислота) и выявить зоны апикальных меристем, воспринимающие регуляторные сигналы.

Особый интерес для изучения представляют генетически модифицированные (трансгенные) растения картофеля, обладающие защитными свойствами против фитопетогенов. Исследование морфогенеза и тонкой структуры клеток отдельных органов исходных и трансгенных растений необходимо для определения посттраискртшионных изменений в ответных реакциях на действие физиологически активных вешеств и оптимизации путей их использования в биотехнология.

Пс.ть работы и задачи исследовании. Цель работы - исследование механизма действия этгнбрасснколида и амбнола при регулятгаи покоя и роста растений картофеля путем выявления изменений в гормональном балансе, морфогенезе и ультраструкгуре клеток апикальных меристем.

В работе были поставлены следующие задачи: 1) Изучить действие эпибрасеннолида и амбиола на покой прост растений картофеля;

2) Определить содержание фитогормонов (этилен, абсцкзовая кислота, р-индолилуксуеная кислота, цитокнкины) в отдельных органах растений картофеля на разных стадиях онтогенеза и под действием эгтнбрассинол ида н амбиола;

3) Изучить влияние элибрассннолвда на отдельные клеточные параметры тканей апикальных меристем клубней картофеля;

4) Исследовать действие амбиола на формирование морфогенетических признаков у регеиерантов исходных и трансгснных растений картофеля;

5) Изучить влияние амбиола на плаепшный аппарат клеток апикальных меристем клубней исходных н трансгенных растений картофеля.

Научная новизна работы. Впервые проведено не следование структурно-функциональных и гормональных изменение в тканях исходных и трансформированных по гену дефензина (трансгенных) растений картофеля под действием эпибрассинолпда и амбиола, регулирующих ростовые процессы на разных стадиях онтогенеза.

Установлено, что эпибрассинолид в рост-ингибирующих концентрациях пролонгирует состояние глубокого покоя путем изменяли гормонального баланса в тканях апикальных меристем - увеличения образования этилена и абсциэовой кислоты. Показано, что клетками-мишенями, воспринимающими регуляторные сигналы этилена и абсиизовой кислоты, являются клетки стержневой меристемы апексов, способность которых к растяжению определяет переход от покоя к росту.

Установлено, что регуляция ростовых процессов в растениях картофеля под действием амбиола определяется его влиянием на содержание фитогормонов н изменением соотношения аукенны+цигокикнны/абедазовая кислота.

Амбиол изменяет морфогенетнческие признаки у регенератов исходных и трансгенных растений картофеля, регулирует формирование стебля, образование листьев и корней. Установлены различия в ответных реакциях на амбиол пластаного аппарата клеток исходных н трансгенных растений. Амбиол стимулирует днфференмировку внутренней мембранной системы пластид, а том числе, интенсивное формирование трубчатого мембранного комплекса в пластидах клеток апикальных меристем.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные сведения о механизме действия эпибрассинолида н амбиола расширяют представления о регуляции ростовых процессов в растениях картофеля на разных стадиях онтогенеза и могут быть использованы для разработки новых биотехнологий повышения продуктивности картофеля и его устойчивости к стрессовым воздейст виям.

Изменение гормонального баланса • один из важных показателей при скрининге физиологически активных веществ, регулирующих покой и рост. Повышение содержания стрессовых фитогормонов (этилена и абсиизовой кислоты) может служить биохимическим

тестом пролонгирования глубокого покоя, стадии онтогенеза, во время которой растения обладакмг комплексной устойчивостью к болезням, неблагоприятным условиям температуры

ч влзжйости.

В качестве ещё одного теста изменения стадии онтогенезе предлагается определение способности к растяжению клегок-мишеней (клеток стержневой меристемы апексов), воспринимающих регуляторные сигналы.

Результаты анализа поспранскрнпционаых изменений в тканях трэ реформ 1«рованных по гену лефекзкна растений позволяют наметить пути использования физиологически активных всшеств как для коррекции выявленных отклонений в росте и развитии, так и для усиления положительных эффектов трансформации. Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на: International Symposium "Signalling Systems of Plant Cells" (Moscow, Russia, 200t); VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва, 2001); 17'* international Conference on Plant Growth Substances (Brno, Czech Republic, 2001); VI Международной конференция «Биоантнокскдант» (Москва, 2002); Ш Съезде Всероссийского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); V съезде Общества физиологов растений (Пенза, 2003); II International Congress «Biotechnology: state of the art and prospects of development» (Moscow, Russia, 2003); XI съезде Русского ботанического ебшесгва (Новосибирск-Барнаул, 2003); IV Международной научной конференции «Регуляторы роста, развития и продуктивности растений» (Беларусь, Минск, 2005), Публикации. Г1о теме диссертации опубликовано 16 печатных работ (9 статей н 7 тезисов). Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», »Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на/^¿"страницах мшшшепненого текста и содержит 26 рисунков, 9 таблиц и 27 электронно-м икроскопическш фотографий. Библиография включает в себя /$0 названий отечественных и зарубежных авгорой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования - растения картофеля Solanum tuberosum L.., на разных стадиях онтогенеза. В опытах использовали: 1) клубни картофеля, 2) точки роста (апикальные уеристемы • апексы) клубней картофеля, 3) отдельные органы растений, выращенных в полевих условиях, 4) растення-регенеранты, полученные in vitro на искусственных ¡титггельных средах.

Опыты проводили на нескольких сортах картофеля - Невский, Скороплодный, Ьронтшкий (меристемкый) и Дезире (исходные и трансгенные растения). Трансформация картофеля с. Дезире по гену антимикробных пептидов - лефензинов из амаранта Amaranth us

caudatus L. была проведена no Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН [Ляпкова и др., 2001]. Использованные физиологически активные вещества:

- эпибрассннолид (22 R, 23R,24R)-2a,3tx,22, 23-тетраокси-В-гомо-7-окса-5а-эргоетан-6-ОН), синтезированный в Институте биоорганической химии АНБ, Минск (Хрипач, 19931;

— ачбиол {диг11лро*лор11д-2-мети.1-4-д(шет1иамииомггш-5-гидрокс11бензвч|1дааола), синтезированный в Инспгтуте биохимической физики им. Н.М. Эмануэле РАН [Смирнов и др., 1984],

Изучение влияния физиологически актив»их веществ на ростовые процессы в апикальных меристемах. Клубни картофеля сорта Бронницкий обрабатывали растворами эпибрасскнолида в концентрации 10"'- 5 мг/л, сорта Невский - в концентрации 10^-10"* мг/л; сортов Невский и Дезире - растворами амбиола (концентрации 1-60 мг/л). Из контрольных и опытных клубней в разное время после обработки изолировали точки роста (апексы) для оценки интенсивности прорастания.

Интенсивность выделения этилена клубнями определяли методом газовой хроматографии [Ward, 1978; Ракигнн, Ракктин, 1986], на хроматографе (Цвет, Газохром, Россия), оборудованном колонкой Порапак N 3000x2 мм (несущий таз гелий 23 см3 /мин'1), при температуре камеры, инжектора« пламенно-ионизационного детектора S0,100 и 150°С. соответственно.

Содержание абсинзовой кислоты метолом ГЖХ [Müborrow, 1970; Сухова и др., 1987] определяли в очищенном иетаноловом экстракте на газовом хроматографе (Цвет, Газохром, Россия), с пламенно-ионизационным детектором н колонкой OV-1, (несущий газ азот, 30 см1 /мин'1). Содержание связанной абсинзовой кислоты определяли после щелочного гидролиза экстракта с 10%-ой NaoH в течение I часа при 60°С,

Содержание р-кндолнлуксусной кислоты, абсинзовой кислоты и цитокйнмнфв (зеатнн-Н1еатнн~рнбознд) в тканях растений картофеля определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [Веселое, Кудоярова, 1990]. Пробы для анализов отбирали в фазу цветения растения (листья) и после уборки урожая (клубки). Растительный материал фиксировали жидким азотом, высушивали в термостате при 55-60°С, Экстракцию изученных групп фнтогормонов проводили из одной навески (от 250 до 500 мг сухой массы) комплексным методом [Власов и др., 1979].

Вегетационные и полевые опыты проводили па базе агробиосганции Орловского государственного университета, в типовом вегетационном домике и на опытном поле (площадь учетной делянки — 160 м2). Картофель выращивали стандартным методом в соответствии с общепринятой агротехникой.

Для изучения влияния «мбноля ня рост и продуктивность картофеля растения в фазе бутонизации опрыскивали раствором препарата в концентрации 30 мт/л, из расчета 100 мл на одно растение. Контрольные растения опрыскивали водой.

Продуктивность картофеля в почвенной культуре определяли взвешиванием клубней в сосудах (9 биологических повторностей), в полевом опыте - путем пробных копок (каждый 5-ыЯ куст по диагонали делянки, всего 50 кустов), урожайность рассчитывали в w'ra. Культивирован не растений in vitro. Стебли экеллантов исходных н трап стенных растений картофеля с. Дезнре разрезали на несколько равных частей размером около 1 см (для каждого варианта опыта и контроля) и высаживали в стерильные пробирки с 20 мл регеяерацноиной среды Мурасиге-Скуга [Murashige, Skoog, 1962]. Дня изучения влияния амбиола на рост регенератов препарат добавляли в среду для выращивания до получения в неб конечных концентраций амбиола 5, 20, 40 и 60 ыт/я. Закрытые пробирки пометали в климокамеру с фотопериодом 16читенпературой21°С

МорфолопНкпанический анализ. У регенератов, культивируемых в клямокамере, измеряли длину образовавшихся корней (на 7 сутки). На 21 сутки измеряли высоту растения, подсчитывали количество листьев; корни и листья отделяли и взвешивали. Электронная микроскопия. Электронно-микроскопическое исследование проводили по общепринятой методике. Алексы фиксировали в 2,5%-ном глутаровом альдегиде, приготовленном на 0,1 М (Na-K) фосфатном буфере, рН 7,1*7,2, дофиксировалн в 1%-ноы растворе OsO+, обезвоживали в серии спиртов возрастающей крепости и ацетоне и заключали в эпоксидную смолу ЭПОН-812 [tuft, 196)]. Для сравнительного ультраструктурного изучения брали клетки из различных зон апикальных меристем. Предварительную ориентировку срезов ддя определения эоиальиостн апексов выполняли с помощью полутонких срезов под световым микроскопом. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме "LKB-3" (Швепия) контрастировали шпратом свинца по Рейвольдсу [Reynolds, 1963] я просматривали под электронным микроскопом "JEM-100C" (Япония). Морфометрмчгскую обработку электронно-микроскопических изображений проводили по методу Агетасова-Стефанова (1979), а также с помощью компьютерной программы «Cell Сошлет», специально разработанной для измерения площадей клеток и различных внутриклеточных структур по отсканированным изображениям, полученным с электронного микроскопа [Платонова и др., 2003].

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы «Microsoft Excel». Результаты измерений, выраженные средними арифметическим и показателями и их стандарты ми ошибками, представлены в таблицах и графиках. Эксперименты выполняли в 3-х и более биологических повториостях, каждый вариант не менее 3-х аналитических повториостей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение влияния эппбрассннолнла н амбиол» на ростовые происссы я гормональный баланс растений картофеля

1.1. Действие эпибрассчнолида но покой и рост клубней картофеля Брассиностеронаы - фктогормоны с широким спектром биологической активности, влияющие на различные физиологические процессы растений [Хрипач, 1993; Clouse, Sasse, 1998]. Представляло интерес выяснить, можно ли с помощью брасснностероидов, в частности, эпибрассинолнда (ЭБ) воздействовать на покой клубней картофеля. Продолжительность глубокого покоя клубней связана с высоким уровнем фятогорыона абедазовой кислоты. В связи с этим, было изучено действие ЭБ на продолжительность глубокого покоя клубней, выделение этилена целыми клубнями, уровень свободной и связанной абсцизовой кислоты в точках роста клубней, в также на отдельные

ультросгруктурные параметры клеток апикальных меристем клубней.

Обработка клубней картофеля с.Брокниикий в состоянии глубокого покоя в широком диапазоне концентраций ЭБ в течение нескольких сезонов позволила установить ингвбируюшие (WMo'J мг/л) и стимулирующие (1-5 мг/л) рост концентрации препарата (рис. 1),

Обработка клубней картофеля с. Невский ЭБ в концентрациях 10"* - Ю"3 мг/л перед закладкой на хранение приводила к сокращению их способности к прорастанию (рис. 2). Способность обработанных клубней к прорастанию определяли после окончания глубокого покоя у контрольных клубней (90 дней). Длительность глубокого покоя у клубней, обработанных ЭБ, заметно увеличивалась — наибольший эффект был отмечен при кониентрапин 10"1 мг/л (36-38 суток). Клубни опытных вариантов отличались от контрольных задержкой прорастания в разное время после начала хранения.

• иг* кг1 кг* ю4 t

кемивнтфвчия эб. ifrfn Рмс. 1. Влнянн* »пнбрассинолида на роет «пмм* «лувн*А картофеля сорт* Бронницам* (обработка в состояния покой). 1«!

Рмс. 2. Влияй»* эпи6р»ссииопид» иа продолжительность глубокого ООИОЯ ■пубнай *аптй<Ь*лн соота Httcni.

Величина этой задержки зависела от концентрации ЭБ и составляла 38, 36, 17 и 7 суток спустя 2, 4, 5 и 7 месяцев после закладкн на хранение соответственно (рис. 2). Таким

образом, обработка клубней ЭБ перед закладкой иа хранение понижает их способность к прорастанию и удлиняет период глубокого покоя.

Опыты показали, что под действием ЭБ усиливалось выделение этилена целыми клубнями картофеля (рис. 3). Интенсивность выделения этилена клубнями изменялась ш зависимости от физиологического состояния (глубокий покой, окончание глубокого покоя, прорастание) и концентрации ЭБ. Контрольные клубки выделяли этилен в наименьшем количестве во время глубокого покоя и в максимальном — при активном прорастании. Стимулирующее действие ЭБ на выделение этилена в наибольшей степени проявлялось при концентрации 1Q"1 мг/л на 1 и 7 сутки после обработки. На 30 и 60 сутки все обработанные ЭБ клубни выделяли этилен в приблизительно одинаковом, но в большем, чем в контроле, количестве. На 150 сутки ЭБ не влиял да выделение этилена клубнями.

Определение содержания свободной и связанной абсцкзовой кислоты (АБК) в

точках роста клубней картофеля показало, что изменения в количестве этого фитогормона, как и этилена, зависят от времени анализа и концентрации ЭБ (табл.1).

Концентрация ЭБ, мг/л Сутки от начала хранения

30 «о 120 150

А В А В А В А В

Ф 6.1 ±08 1,6 ±0.1 ы±ол 1.7 ±0.1 15±01 0Л ±0.1 1.1 ±0.1 ОЛ±ОЛ

Iff4 £8*0.7 12*0.2 5.4 2.1*0.1 22±02 u±oa 1J ±0Д 05 ± 02

Iff' *4±09 2j6*02 &2±0.4 2,7 ±03 3£±03 ы±оз 23 ±03 1.6*0.2

10J ILS±U> 2.7*0.3 9Я± 1.1 7^±09 Х5±03 2.4 ±03

Т»Лл. 1. Влияние эппбрассинопнаа на садерекаиие свободной (А) я связанной (В) «бсцюооой кислоты [мкг г'1 (сырой массы) в апикальных меристемах клубяеЯ картофеля ори храпения (сутки). Первоначальное содержание: свобллной АБК - 8 А связанной АБК-1Л [мкг г1) (сырой массы).

КомцФмтрацня ЭБ, лйг/п

Рис. S. Влияние ЭБ на интенсивность выдалания тимма клубнями картоф*лм

В тканях точек роста контрольных клубней максимум свободной АБК отмечен во время глубокого покоя (30 и 60 суток после уборки). После окончания покоя (120 и 150 дней после уборки) содержание свободной АБК в тканях точек роста уменьшалось более чем в 3 и 5 раз соответственно. Изменения в содержании связанной АБК менее выражены; ее количество снижалось в точках роста контрольных клубней примерно в 2 раза при активном прорастании, ЭБ вызывает увеличение в содержании свободной АБК при концентрациях 10"* и, особенно, 10"1 мг/л. Этот эффект сохраняется во время глубокого покоя, после его окончания и при прорастании (табл.1). Под действием ЭБ несколько увеличивалось содержание связанной АБК, что наиболее выражено при прорастании (120 »150 дней хранения). Следовательно, обработка ЭБ целых клубней картофеля сразу после уборки приводит к усилению образования АБК в точках роста клубней и к изменению соотношения свободная АБК/связанная АБК. Изменение этого соотношения играет важную роль в регуляции покоя клубней картофеля н переходе к активному росту, поскольку повышение содержания свободной АБК приводит к ннгибированню ростовых процессов.

Таким образом, обработка эпибрассинолнлом в рост-ингибнруюшнх концентрациях целых клубней картофеля приводит к усилению выделения этилена, повышению содержания абсцизовой кислоты, изменению соотношения свободная АБК/свяэанная АБК и удлинению периода покоя клубней.

1.2. Действие амбиола на ростовые процессы кяубней картофеля

Амбиол принадлежит к одному из 14 классов химических соединений, действующих как антиоксиданты и является препаратом комплексного действия с росг-регупирующими и адалто генными свойствами ¡Смирнов и др., 1984; Rajasekaran, Blake, 1999]. Однако до

начата наших исследований не было данных о действии амбиола на растения картофеля.

Испытания амбиола на клубнях картофеля, с. Невский показали следующее (рис. 4). При обработке клубней в состояния покоя препаратом в концентрациях 5, 20, 40 и 60 мг/л не было установлено, заметного влияния на рост апексов. После окончания глубокого покоя чувствительность клубней к амбнолу возрастает. Так, в концентрации 5 мг/л он подавляет прорастание, а при 20 и 60 мг/л - стимулирует. Из приведенных данных следует, что влияние амбиола на клубни картофеля зависит от их физиологического состояния н становится

□Покоя ЦПрфр«от*ии*

Кечоитфиим «нвмйпв, ыг/л

Рис. 4. Влипни* амбиола м роет апаксоа клубней картофеля сорта Нввсшй

белее выраженным при переходе от покоя к активному росту,

В качестве модели для изучения механизма действия амбиола особый интерес представляют трансгенные растения картофеля, несущие ген антимикробных пептидов -дефензинов. Установлено, что зги соединения обладают фунпщидяым и антибактериальным действием, что имеет большое значение для повышения фитоиммунитета и продуктивности растений картофеля.

Обработка клубней исходных и трансгенных растений картофеля сорта Дезире амбиолом показала, что препарат в концентрации 5 мг/л нвгнбирует рост апексов. При концентрациях 20 н 60 мг/л амбиол стимулировал рост апексов только на клубнях трансгенных растений, а у исходных - подавлял (рис. 5). Обнаруженные различия ростовых реакций клубней исходных и трансгенных растений в контроле а под действием амбнола хорошо коррелируют с данными о связи стимуляции прорастания с усилением активности Независимой АТФ-аэы плазм ал ем мы клубней, и снижении активности фермента при подавлении роста (Ладыженская и др., 2001].

1.3. Изучения влияния амбиола на гор.мональный баланс и продуктивность растений картофеля

Для изучения действия амбиола были проведены эксперименты в вегетационном домике и полевых условиях. Опыты показали, что обработка растений амбиолом в фазу бутонизации изменяет гормональный баланс, как листьев, так и клубней, что выражается в повышении уровня ауксинов (ИУК) и цитокинннов (зеатин+зевтнн-рибознд (З+ЗР)), снижении содержания АБК и изменении соотношения между этими фитогормонами (табл.2).

Вариант ПУК З+ЗР АБК Соотношение фнтогормонов

ЦУК/АБК З+ЗР/АБК

Контроль 25*2 62Я ± 4.4 ЗЛО ±0.20 10 25

Амбнол 125 ±11 198.ÍÜ8.1 1.40 ± 0.09 »9 142

Табл. 2, Влияние амбиола на содержание фнтогормонов в листьях картофеля, мкг/г сухой массы

Такнм образом, обработка амбиолом растений картофеля изменяет баланс фнтогормонов в листьях. Известно, что повышение уровня И УК и щггокннинов активизирует

о t го ы

КйнцнггрАцир Амбндт, мгУл

Рис. В. Влияни* iM&tOtiM к* рост апикальных меристем кпубнай исходного и транспмнога пртофми сорта Даэира

фотосиктетнческие процессы. Обработка амбистом усиливала интенсивность фотосинтеза у молодых растений сосны и способствовала их росту, в том числе в условиях засухи (1Ц)а5еквгап, В1аке, 1999]. Под влиянием амбиола на фоне изменения гормонального статуса листьев картофеля значительно возрастала интенсивность нециклического фотофосфорилнрованмл и фотосинтеза [Кириллова и др., 2003]. Возможно, стимулирующее влияние амбиола на фотосинтегнческие процессы связано с его актиоксидантнымн свойствами.

В листьях растений, обработанных амбиолом, повысилось соотношение З+ЗР/АБК. Это важный показатель, так как цигокиняны н АБК регулируют величину открытия устькчной щели, а от работы устьиц во многом зависит водный обмен, интенсивность фотосинтеза и скорость роста растений. У растений картофеля, обработанных амбиолом, увеличивалась ширина устьичной щели и водоудерживаюшая способность листьев [Пузинаи др., 2001]. Наши опыты подтвердили, что под влиянием амбиола соотношение З+ЗР/АБК возрастает почти в 6 раз (табл.2). Изменения гормонального баланса в листьях картофеля под действием амбиола могут отражаться на процессах дыхания, транслирацин, фотосинтеза и, следовательно, на продуктивности растений.

Обработка растений картофеля амбиолом имела пролонгированное действие, проявившееся в изменении гормонального баланса клубней (табл. 3). Амбнол повышал

Содержание ауксинов и цкгокининов и снижал уровень АБК в клубнях, но в меньшей степени, чем в листьях. Это, по-

Табл. 3. Влияние амбиола на содержание вцдимому, связано с разной фитогормонов в клубнях картофеля (мкг/ г

сухой массы, АБК- иг/г) чувствительностью тканей к амбнолу и

эффектом последействия. Полученные данные согласуются с предположением о действии амбиола как препарата с шгтокининовой активностью и фактора, ингибнрующего окисление ауксинов, что способствует стабилизации в тканях растений этих гормонов и скорости регулируемых ими процессов [Дмитриев и др., 1986; Воронина и др., 2001],

Вариант Вегетационный опыт Полевой опыт

Масса клубней в густе, г Калчкпв кл} бней а кусте,« СрСЯНаЧ МАССА клубящ г М*си клублей ■ кусте, г Урожайность, IVга

Конто оль 253 ±17 5*0.3 50.6 ± 4.0 393*11 161*5

Амбнол 312*21 4 ±03 78.0 ±3.7 425*15 174*6

Табл. 4. Влияние аибноля иа продуктивность картофеля

Обработка амбиолом повышала продуктивность растений, причем иа фоне снижения числа клубней в кусте увеличивалась их масса. Полевые испытания подтвердили результаты вегетационных опытов (табл. 4), Таким образом, повышение продуктивности картофеля под

Вариант ПУК З+ЗР АБК

Контроль 3.0 ± ОД 1.4 * 0.1 44.7 ± 4.3

Амбнол 12.5*1.1 3.6*0,3 17.8*1.1

действием амбиола связано с увеличением содержания количества цитокининов, ауксинов и усилением процессов фотосинтеза.

Полевые испытания, проверенные в течение 3-х сезонов, подтвердили положительное влияние амбиола на продуктивность картофеля. Действие амбиола на урожайность было более эффективным а голы с повышенным температурным режимом н недостатком влаги. Последнее подтверждает, что амбио.т усиливает адаптацию растений к неблагоприятным условиям окружающей среды, выступая в роли антистрессового фактора.

2. Изучения влияния амбяола на морфогенез исходных н трансгенных растений

картофеля

Универсальность путей морфогенеза в опытах in vivo и in vitro позволило нам выбрать в качестве модели растения-регенераты, выращенные с добавлением в питательную среду амбиола в концентрациях, установленных ранее. Изучение действия амбиола на развитие в онтогенезе морфогенетическнх признаков у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля с. Дезире показало следующее.

На 7 сутки выращивания в контроле у регенерантов трансгенных растений развивалась более мощная корневая система (рис. 6а). Присутствие амбиола в среде для выращивания изменяло интенсивность начальных этапов корнеобраэования у регенерантов растений, однако в отдельных вариантах этот эффект проявлялся по-разному. Амбнол в концентратом 5 мг/л нигнбнровал рост корней регенерантов исходных и трансгенных форм, 20 мг/л - не влиял на их рост. При концентрации амбиола 60 мг/л в 2 раза увеличивалась длина корней у исходных и трансгенных растений (рис. 6а).

На 21 сутки культивирования рост корней у исходных и трансгенных форм под действием амбиола происходил уже с другой интенсивностью. Так, в контроле сырая масса корней регенерантов исходных растений была в 1,3 раза больше, чем трансгенных (рис.66). Амбиол вызывал уменьшение массы корней у исходных и трансгенных растений, особенно при концентрации 5 мг/л (в 3-4 раза).

Трансгенные растения на ранних этапах развития лучше и быстрее формировали корневую систему, но в дальнейшем отставали в росте корней от исходных форм. Действие амбиола на корневую систему на начальных этапах развития регенерантов было различным, но впоследствии рост корней подавлялся во всех вариантах опыта. Таким образом, на 21 сутки культивирования усиливался рост-ингибируюший эффект амбиола на процесс корнеобразовання у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля.

На 21 сутки культивирования регенеранты исходных растений в контроле были выше трансгенных (рис. 6в). Амбнол в концентрации 5 в 60 мг/л не влияя на высоту побегов, при

20 мг/л снижал ей, а при 40 мг/л ингибщ'овал рост исходных растений н стимулировал его у трансгенных.

5« 1:

I

I

I

I

1

%

I

}

I

I

т/я

ta г/»

о

1

I

а

Г

I

г/л

<4 <0

*В, к'/«

9.11 ь 0.1

§ о.ое 0.04 0.01 о

1

*>

г/и

□ Исходны* ЯТраксгенные Рис, в. Влияние амбиола на развитие морфогенетических признаков у реганерантов исходных и трансгенных растений картофеля С.Деэире

• ) длина корнай

б) сырая масса корней

в) высота побегов

г) число листьев

д) сырая масса листьев

По числу н массе листьев рогенеранты в контроле не различались. Амбиол в концентрации 5 мг/л стимулировал образование листьев у исходных растений, а при более высоких концентрациях, как правило, не влиял на образование нормальных листьев у исходных и трансгенных растений {рис. 6, г, д). В контроле не было ни укороченных безлиственных побегов, ни побегов с рудиментарными мелкими листочками. Амбиол во

веек испытанных концентрациях приводил к появлению тех или иных особенностей развития растений (табл. 5). При концентрации амбиола 3 мг/л, наряду со стимуляцией листообраэовання у регенератов исходных растений, наблюдалось наибольшее количество побегов безлиственных иди с рудиментарными листьями. При концентрациях амбиола 20-60 мг/л также встречались регенеранты с рудиментарными листьями (исходные растения) и безлиственные (трансгенные формы) (табл. 5).

Тип регенеранта Морфогея (тв чеекке показателя побегов Концентрация амбиола, мг/л

0 I 5 I 20 1 40 | 60

% от овшего числа регеиерантов

Исходные Ветвящиеся (с рудиментарными листьями) 0 20 10 20 0

Трансгенные 0 30 0 0 0

Исходные Рудиментарные (без листьев, но С корнями) 0 20 0 Ф 0

Трансгенныс 0 0 20 20 10

Табл. 5, Особенвостн развития побегов регенератов исходных н траисгенных растений картофеля на 21 сутки культивирования

Надо отметить, что появление измененных по морфологии форм растений, несомненно, представляет большой интерес, так как наряду с нежелательными изменениями могут появляться растения сцелымрядом хозяйственно-ценных признаков [Лепех, 1990),

Очевидно, что процессы роста и органогенеза растений необходимо рассматривать во взаимосвязи между гормональным комплексом и функциями генетического аппарата. Было отмечено, что экспрессия бактериального гена в трансгенных растениях приводит к изменениям морфологии н гормонального баланса растений (Голдснкова и др., 2002]. Все это позволяет предположить, что экспрессия гена дефензина может оказать влияние на баланс фитогормонов трансформированных растений картофеля. Известно, что для образования корней требуются более высокие концентрации ауксинов, чем для их роста [$коо& 1971; Либберт, 1976]. Изменение содержания ауксинов может быть причиной отличий в формировании корневой системы у регенератов исходных н трансгеикых растений на разных стадиях развития (7 и 21 сутки культивирования). Амбиол влиял на рост корней регенерантов исходных и трансгекных растений, подавляя или стимулируя корнеобразование в зависимости от концентрации и стадии развития. Действие амбиола на кориеобразование может быть связано с его способностью ингибировать окисление ауксинов и стабилизировать их количество в тканях растений ¡Воронина и др., 2001].

Амбиол по-разному действует на процессы побего-н листобразования регенератов исходных и трансгенных растений. Важно подчеркнуть, что амбиол в концентрации 5 мг/л

может либо ингибировать рост апексов клубней (рис, 4, 5) и корней растений-регенерантов (рис. 6 а, б), либо стимулировать листообразование у регенерангов исходных растений (рис.6 г, д). Процесс лисгообразования в наибольшей степени зависит от уровня шггокннинов, и слабое развитие листьев или их полное отсутствие в вариантах с амбиолом, вероятно, связано с низким уровнем шггокншиов в местах листовых зачатков. Возмещено, наличие гена дефензнна в трансгенных растениях изменяет также чувствительность клеток образующихся корней и зачатков листьев к цитокининам и ауксинам. Наши исследования показали, что амбиол повышает содержание шггокннинов в тканях растений картофеля (табл. 2, 3). По-вндимому, добавление амбкела в среду для выращивания изменяет гормональный баланс растущих регенератов или путем перераспределения гормонов между отдельными органами растений, или за счет изменения их содержания. Сдвиг гормонального баланса может изменять морфологическую компетентность инициальных меристем, обеспечивающих органогенез, что приводит к изменению направленности морфогенегического развития растений. Возможно, с этим связано и появление тех или иных особенностей развития регеверантов при определенных концентрациях амбнола.

Таким образом, в опытах на регенерантах исходных и трансгенных растений картофеля подтверждены рост-регулирующие (стимулирующие и ингнбирующие) свойства препарата амбиол. Установлены различия в развитии отдельных морфогенетических признаков между регенератами исходных и трансгенных растений картофеля, как в контроле, так и под действием амбнола. Корнеобразование является наиболее чувствительным параметром при органогенезе исходных и траи стенных растений картофеля под действием амбнола. Можно полагать, что обнаруженные нами особенности роста и развития регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля связаны с изменением гормонального баланса, вызванным экспрессией гена дефензива я с влиянием амбиола.

3. Ультраструктурные аспекты действия эанбрассннолндй и амбнола на ткани апикальных меристем клубней картофеля

Известно, что точки роста (апексы) растений, несмотря на свои малые размеры, гетерогенны в цитологическом и физиологическом отношении. Они состоят из нескольких зон (рис. 7) со специфической морфогеиетической функцией. Для изучения структурно-функциональных изменений в апикальных меристемах клубней картофеля использовали электронную микроскопию с привлечением методов ультраструктурной морфометрии.

Рис, 7. Схема строения апекса клубня картофеля при прорастании: I - туника, 2 - центральная меристема, 3 - стержневая меристема, 4 -периферическая меристема, 8 - листовой зачаток.

3,/. У.чыпраморфометрическое изучение влияния элибрассинодида на рост кчеток апикальных меристем

Начальные этапы прорастания клубней картофеля связаны с процессом растяжения клеток апикальной меристемы. При этом происходит увеличение размеров клеток вследствие обводнения цитоплазмы. В связи с этим, рассматривали действие эпнбрассинолида на объемы клеток и нч вакуолярной системы при установленных ранее на клубнях меристем ного картофеля с. Бронницкий рост-ингибируюших (10^-10'1 мг/л)

Электронном икроскопические

наблюдения н улътраморфометрические

измерения показали, что при этих

концентрациях ЭБ уменьшались общие

объемы клеток и их вакуолярной

системы во всех зонах апексов и

особенно значительно в зоне

Стержневой меристемы (табл. б).

Уменьшение общего объема вакуолей

сопровождалось увеличением общего

числа вакуолей в клетках (табл. 6), т.е.

происходило «дробление» вакуолей.

Анализируя приведенные данные,

можно заключить, что одно из

Табл. 6. Объемы (У* условные проявлений действие ЭБ на ткани точек морфометрнческяе единицы) клеток н вакуолей

в различных зонах апексов клубней картофеля роста клубней картофеля - его влияние

под действием эпибрассшгодндя щ процесс растяжения клеток. Однако

действие ЭБ неоднозначно по отношению к функционально различным зонам апексов. Наиболее чувствительна к действию ЭБ зона стержневой меристемы. В этой зоне значительно подавлялся процесс растяжения клеток под действием ЭБ в концентрациях, замедляющих ростовые процессы в апикальных меристемах клубней картофеля. В связи с этим, можно полагать, что клетки зоны стержневой меристемы являются клетками' мишенями, воспринимающими сигнал данного регулятора роста. Это очень важно, так как зона стержневой меристемы играет ведущую роль в процессе вегетативного роста апексов клубней картофеля.

Очевидно, что влияние брасснностероидов на процесс растяжения растительных клеток - лишь один из аспектов их полифункционального действия на растение. В наших

концентрациях.

Кипиш трапм ЭБ (мг/л) V, юнлм Ч|1СЛ4 ыкуолеА ■■•ерем V, мкушкй V, шшлй вдкусцш

Туннк«

0 304 ±13 5Я ± 03 20*0.7 3.4 * 0.2

0.001 228 ±12 7.8 ±0.2 16 ± ал 2.0 ±0.2

001 250 ±12 8.0*0.2 17*0.6 2.1 ± 0.2

Центральная меристема

0 664 ±2Я 6Л ±0,4 87 ±7 15.0*0.9

0.001 401*18 8.6 ±0.5 52±4 11.5*1.5

<Ш 420 ±18 9.0 ±0,5 57 ±5 10.4*0.8

Стержневая меристема

0 930 * 29 2.9 ± 0.2 350 ± 18 129± 9

0.001 400*18 6.0 ±0.3 86 ±10 14.0*0.5

0.01 410± 18 64*0.2 96 ±9 15.0 ±

Пернфе рнческая меристема

0 312*22 6.7 ±0.6 30 ±4.5 4.6 * 0.4

0.001 480 ±16 7.2 ±0.4 26 ±3.5 3.6*0.3

<Ш 490 ±16 7.7 ±0.4 24 ± 3.5 3.1 ±03

исследованиях установлено, что ЭБ увеличивает содержание абсциэовой кислоты и этилена в тканях клубней картофеля, пролонгируя период глубокого покоя (рнс. 3, табл. 1 >.

Один из механизмов рост-регулирующего действия ЭБ на ростовые процессы в клубнях картофеля состоит в его влиянии на процесс растяжения клеток апексов, особенно в зоне стержневой меристемы, вследствие чего задерживается прорастание клубней.

3,2. Ультраструюпурное и яюрфометрическое изучение влияния амбио.ча на пчастидный аппарат клеток апикальных меристем клубней исходных и трансгенных растений картофеля

Ранее было установлено, что амбиол обладает свойствами регулятора роста, стимулируя или подавляя прорастание клубней исходных и трансгенных растений в зависимости от концентрации (рис. 5). Представляло интерес оценить влияние амбиол а на пяастидный аппарат клеток апексов клубней исходных и трансгеяных растений картофеля. Известно, что структура пластид является показателем функционального состояния клеток. Была исследована зона стержневой меристемы апексов, клетки которой наиболее чувствительны к регуляторам роста.

Согласно наблюдениям, пластщшый аппарат меток стержневой меристемы апексов клубней исходных растений картофеля с. Дезире (в контроле) представлен 1-2 лейкопластами на срез клетки (табл. 7).

Вариант опыта Число пластид Общая площадь пласт нд, мкм* Площадь одной пластиды, мкм1

Контроль №0) исходные 1.56 ±0.10 5.33 ± 0.61 3.42 ±0.49

трансгенные 1.77 ±0.21 4.7» ±0.77 2.71 ±032

Амбиол, 5мг/л исходные 1.43 ±0.16 2.81 ±0.47 1.97 ±038

трансгенные 1.93 ±0.18 3.01 ±033 1.56 ±0.13

Амбиол, 60 мг/л исходные 1.14 ±0.07 2.23 ± ОЛЯ 1.96 ±0.28

тра негенные 1.55 ± 0.10 6.36 ±0.69 439 ±0.51

Табл. 7* Морфометрнческая характеристика пластид в клетках апексов клубней исходных и трансгенных растеинй картофеля под влиянием амбиол а

Пластиды клеток имели округлую, вытянутую или слегка неправильную форму и достаточно разнообразную морфологию. В подавляющем большинство лейкопласты содержали различной величины крахмальные зерна, иногда - округлые белковые включения, а в ряде случаев пластоглобулы с различной степенью осмиофильности (табл. 8).

В неоднородной по электронной плотности (иногда достаточно конденсированной) строме (матряксе) наблюдались отдельные элементы внутренней мембранной системы в виде одиночных мембранных структур. Хорошо просматривался достаточно развитый периферический пластндный рогикулум, представленный светлыми пузырьками или

отдельными электронно-прозрачными тяжами по периферии лейкопласта. Элементы

пластндкого ретикулума представляют собой инвагинации внутренней мембраны

пластааной оболочки Число, величина и форма таких инвагинаций могут варьировать.

Предполагается, что степень

развития пластндкого ретикулума

определяет интенсивность обмена

между пластидой и цитоплазмой, а

также интенсивность синтетических

процессов в оболочке пластиды.

Пласгадный ретикулум в

функциональном отношении

соответствует канальцам

агрануляркого эндоплазматического

Табл. 8. Ультраструктурная характеристика ретикулума цитоплазмы, сходен с

пластид в клетках апексов клубней исходных н „„„„ ^ М0рфолоп111 „ является в трансгенпых растений картофеля под

действием амбнола (в % от числа лейкопластах местом синтеза и

просмотренных пластид) модификации изопреноилных

[Муравннк, Иванова, 2003} и фенольных [Загоскина и др., 2000] соединений.

В клетках апексов клубней исходных и трансгенных растений картофеля встречались одиночные пластиды (табл. 8), внутренняя мембранная система которых представлена так называемым трубчатым комплексом, состоящим из густой сети трубочек одного размера, соединенных друг с другом и образующих единую систему - трубчатый мембранный комплекс (ГМК). Эта разновидность внутренней мембранной системы обеспечивает лейкопластам дополнительную способность к биосинтезу изопреноидов [Васильев, 1977]. В отдельных клетках наблюдали пластиды с ТМК на разных этапах его формирования. Встречалисьединичные достаточно крупные, делящиеся перетяжкой и почкующиеся пластиды.

Изучение пластидного аппарата клеток апексов клубней трансгенных растений картофеля в контроле но выявило различий в числе пластид на срез клетки, в величине средней площади одной пластиды я а обшей площади тастндного аппарата между клетками апикальных меристем клубней трансгенных и исходных растений картофеля (табл.7). Морфология пластид была также разнообразна и сходна с картиной, наблюдаемой в клетках исходных растений по содержанию в строме внутренних мембранных структур, в том числе и ТМК, который в клетках контрольных растений встречался довольно релко. Однако наблюдались и некоторые отличия от клеток исходных растений по содержанию отдельных внутриплаепшкых структур (табл. В). Кроме того, в клетках апексов трансгенных растений

Характернстн ка пластид Исходные | Трансгенные

Концентрация амбнола, мг/л

0 5 60 0 5 60

Кряшил 80 80 60 98 99 92

БспкФвде включили 3 10 4 25 13 16

ОшшАчныс МС 28 30 44 32 32 68

ТМК 3 24 3 7 12

Перяфсрнчгскай регикулум 21 40 40 4« 40 62

Плястогоовулы 35 4« 33 10 10 40

Делящиеся 4 3 3 11 8 14

Пихуишака - 3 3 2 10 10 1«

чаше встречались пластиды с признаками деления и почкования (табл.8), что указывает на более активные процессы пролиферации пластид.

Таким образом, несмотря на общее сходство в размерах н ультраструктурной морфологии пластидного аппарата клеток апексов клубней исходных и трансгенных растений в контроле, некоторые различия по количеству отдельных внутрипластидных структурных элементов, по-видимому, могут свидетельствовать о большей функциональной активности пластид клеток трансгенных растений при росте апексов. Этот факт хорошо коррелирует с нашими наблюдениями за ростовыми процессами после выхода клубней из покоя, согласно которым клубня трансгенных растений лучше прорастали п их апексы имели больший вес по сравнению с апексами клубней исходных растений.

Сравнительная оценка морфометрических характеристик пластидного аппарата клеток исходных и трансгенных растений показала, что амбноя в концентрации 5 мг/л уменьшал общую атощадь пластид в клетках исходных л трансгенных форм (табл. 7). При этом наблюдались лишь некоторые различия в динамике отложения запасных веществ в пластидах исходных и трансгенных растений, но не менялись процессы пролиферации пластид в клетках обеих форм растений (табл. 8), Однако следует особо отметить, что амбиол (5 мг/л) стимулировал формирование ТМК в матриксе пластид как у исходных, так и у трансгенных форм растений.

Прн концентрации амбиола (60 мг/л) наблюдалась корреляция между интенсивностью ростовых процессов в апикальных меристемах исходных и трансгепных растений и изменением числа и размеров пластид в их клетках (табл. 7). Усиление роста апексов клубней траясгенных растений сопровождалось увеличением площади пластид (укрупнением пластид), следствием чего, могло быть усиление синтетических процессов в оболочке пластид и активизация транспорта метаболитов между пластидами и цитозолем. В противоположность этому, подавление роста апексов исходных растений при этой концентрации амбиола коррелировало с уменьшением числа и размеров пластид в их клетках. Однако на фоне этих различий в клетках обеих форм растений возрастало число пластид с развитой внутренней мембранной системой - одиночными мембранными структурами, периферическим рстикулумом и, что особенно интересно, ТМК (у исходных растений — в 8 раз, у трансгенных — в 4 раза) (табл. 8, рис, 8 а, б).

Изменения ультраструктуры клеточных органелл достаточно полно отражают нх функциональное состояние, а точные количественные параметры этих органелл в дополнении к их морфологическим особенностям дают представление о функциональной активности самих клеток. Наблюдаемая в наших опытах корреляция между интенсивностью ростовых процессов в апикальных меристемах клубней исходных и трансгенных растений

картофеля под действием амбнола и размерами пластидного аппарата их клеток подтверждают эта

Рис. 8. Образование трубчатого мембранного комплекса в клетках апексов исходных (а) н тря не генных (б) растений картофеля под действием ямбноля (60 мт/л)

Следует отметить, что амбиол во всех испытанных концентрациях, несмотря на его неоднозначное влияние на размеры и пролиферацию пластид, вызывал заметную диффсренцнровку пластидного аппарата как в клетках исходных, так я трансгенных растений. Это выражалось в развитии внутренней мембранной системы пластид • периферического ретинулума, одиночных мембранных структур, и, в особенности, трубчатого мембранного комплекса. Выявленный нами эффект амбнола, направленный на развитие мембранной системы пластид клеток апексов клубней картофеля, согласуется с данными о действии другого синтетического антноксиданга - нонола, который проявил себя как индуктор дифферешшровкн пластидного аппарата клеток корней этиолированных проростков пшеницы, стимулируя в них синтез пигментов каротняондной природы [Замятина в др., 2003]. Подобные эффекты являются, безусловно, новой стороной действия антиокскаантов на растеши.

Таким образом, амСиод индуцировал дифференпнровку пластид в сторону усложнения их внутренней мембранной структуры, придающей пластидам дополнительную способность к синтезу взопреноидных и фенолытых соединений, выполняющих важную роль в реакциях устойчивости. Можно предположить, что потенциальная способность пластид к биосинтезу защитных соединений в реакциях иммунитета может быть оптимизирована под действием амбнола.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рег>л*шы роста и локон определяете» сгрухтурно-фунпшон&шнымн особенностями апикальных меристем растений картофеля ва разных стадиях онтогенеза. Иядуксия покоя, его длительность и прерывание связаны с изменениями соотношения шипбнторы/стимуляторы роста и чувствительности клеток апексов к действию сигнальных молекул фитогормонов [Метдкцкий, КораСлееа, 1984; Тарчевский, 2002].

В настоящей работе основное внимание обращено ва исследование гормонального баланса и ультр »структуры клеток апикальных меристем клубней картофеля под действием эпибрассинояида и амбиола. Такой подход позволил получить новые данные об участии в регуляции покоя ве только абсциэовой кислоты, но и этилена, а также оценить изменения в ультраструггуре клеток различных зон апикальных и «растем и выявить клетки, наиболее чувствительные к действию фитогормонов и их синтетических «налогов.

Ранее было показано, что ингибирование роста во время глубокого покоя клубней картофеля связано с влиянием абсциэовой кислоты, а прерывание покоя сопровождается уменьшением в точках роста содержания абсиизовой квелоты н увеличением габберелловов кислоты. Интенсивность образования этилена тканями незначительна во время глубокого покоя н несколько увеличивается при прорастаний. Эта данные не позволяли связать способность клеток к синтезу этилена с регуляцией покоя. Однако результаты последующих экспериментов показывают, что это не так. С одной стороны, было установлено, что экзогенный этилен, введенный в ткани при обработке растений этилекпродупентом 2-хлорэтшфосфоновой кислотой (2-ХЭФК), стимулирует синтез абсциэовой кислоты, способствует индукции глубокого покоя и его пролонгированию [ЗисЬоуа е< а!., 1993]. С другой стороны, результаты настоящей работы показывают, что аналогичный эффект может быть получен при стимуляции синтеза эндогенного этилена под действием эпибрассииолида. Способность эпибрассииолида усиливать образование этилена в тканях растений была показана рядом исследователей [Кац&пагш й а!., 1982; Меп&, ТЬопиоп, 1983].

В клубнях картофеля элибрассинолкд стимулирует образование этилена и абснизовой кислоты, что коррелирует с длительностью глубокого покоя. Опыты с метаболическими ингибиторами (СоСЬ и аминоокснуксусиая кислота) показали, что эпибрассинолнд стимулирует активность ферментов синтеза н расщепления эндогенного предшественника этилена в метиониновом цикле - синтезы и окещмзы 1 -аминовдклопропаи-1 -карбоновой кислоты (Кораблева и др., 1997],

Эффективность применения физиологически активных веществ для регуляции покоя и роста картофеля зависит от знания механизма их действия на отдельные органы растений и, в особенности, на меристематические ткани точек роста. При этом важно определить внутриклеточные изменения, происходящие в функционально различных зонах апикальных

меристем {Платонова, 1998]. Ультраморфометрическнй анализ клеток различных зон апсксов клубней показывает, что стимуляция или подавление растяжения является одним нэ эффектов эпибрассинолида на клеточном уровне. Наиболее чувствительна к эпнбрассинолиду стержневая меристема, играющая ведущую роль на начальных стадиях роста. Клетки стержневой меристемы являются клетками-мишенями, воспринимающими сигналы этилена и абенизовой кислоты, содержание которых изменяется под действием эпибраосинолида. Ранее было установлено, что клубни картофеля во время глубокого покоя обладают более высокой устойчивостью к болезням, чем при прорастании. В этой связи использование эпибрассинолида для пролонгирования глубокого покоя эффективно для сокращения потерь от преждевременного прорастания и повышения иммунного статуса клубней.

Механизм действия амбиола на рост и развитие картофеля связан с изменением гормонального баланса в клубнях и листьях вегетируюшнх растений. Амбиол в несколько раз увеличивает соотношение иняолнлуксуснэя кислота'абсцнзовая кислота и зезтин+эеатин-рибоэна/абецнэовая кислота в листьях как за счет увеличения содержания ауксинов и цитокининов, так и снижения абсцизовой кислоты. Под влиянием амбиола ускоряются темпы роста и повышается продуктивность растений за счет увеличения массы клубней. Повышение продуктивности растений, обработанных амбиолом, может быть следствием увеличения количества цитокининов и ауксинов, а также усиления процесса фотофосфорилирования и интенсивности фотосинтеза [Чернядьев, 2000; Кириллова и др., 2003].

В опытах с регенератами исходных и трансформированных по гену дефензина (трансгенных) растений картофеля было установлено, что амбиол изменяет морфогенетические признаки, регулирует формирование стебля, образование листьев н корней. Обнаружены различия в ответных реакциях на амбиол пластидного аппарата клеток исходных и трансгенных растений. Амбиол стимулирует дифференикровку внутренней мембранной системы пластид: периферического ретнкулума, одиночных мембранных структур, и, в особенности, трубчатого мембранного комплекса Подобное усложнение внутренней организации пластид повышает биосинтетические возможности пластидного аппарата клеток апикальных меристем, связанные с синтезом нзопреноидных и фенольных соединений, которые могут быть реализованы при защите растений в ответ на различные стрессовые воздействия (болезни, обезвоживание, охлаждение и др.).

Полученные сведения позволяют составить представление о механизме действия эпибрассинолида и амбнола, а также выявить биологические параметры для включения этих физиологически активных веществ в современные технологии повышения продуктивности картофеля и его устойчивости к стрессовым воздействиям.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что эпибрассннолид в зависимости от концентрации оказывает лнгвбирующее или стимулирующее действие на рост апексов клубней картофеля.

2. Обработка клубней эпибрассююлндом в рост-ингибируюших концентрациях приводит к усилению синтеза этилена и абсцнзовой кислоты, подавлению роста апексов и продлению периода глубокого покоя.

3. Наибольшая чувствительность к действию эпибрасинолнда обнаружена у клеток стержневой зоны апикальных меристем клубней, способность которых к растяжению определяет прерывание или пролонгирование периода глубокого покоя.

4. Обработка клубней картофеля амбиолом в концентрациях 20-60 мт/л стимулирует рост апексов. Наблюдается различная чувствительность апексов к действию амбиола в покое н при прорастании.

5. Показано, что обработка амбиолом вегетирующих растений картофеля в фазу бутонизации приводит к повышению в тканях листьев и клубней содержания р-иидолилуксусной кислоты и интоюгнннов, уменьшению количества абспюовой кислоты и повышению продуктивности растений.

6. Амбиол ингибирует кориеобразованне у регенеращгов исходных и трансформированных по гену дефензина растений картофеля, стимулирует образование листьев у регенерантов исходных растений, по-разному, в зависимости от концентрации, изменяет формирование стебля у исходных и трансгенных растений. Кориеобразованне является наиболее чувствительным параметром при органогенезе исходных и трансгенных растений картофеля под действием амбиола

7. Выявлены различна по площади пластид и содержанию отдельных внутрипласткдных структур в ответных реакциях на действие амбиола пластидного аппарата клеток апикальных меристем клубней исходных и трансформированных по гену дефензива растений картофеля. Наблюдается корреляция между изменением обшей площади пластид в клетках н стимуляцией или подавлением ростовых процессов, в апикальных меристемах клубней исходных и трансгенных растений картофеля.

8. Показано, что амбиол стимулирует дифференцнровку внутренней мембраннной системы пластид, в том числе интенсивное формирование трубчатого мембранного комплекса в пластидах клеток апикальных меристем клубней исходных и трансгенных растений картофеля.

Список осн овны * работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Korableva N.P., Platonova Т.A., Dogonadize M.Z., Evsyunlna A.S., Machackova I, Effect of brasiinoliäe on the formation of ethylene, abscislc actd and growth of apical meristems by regulation of potato tubers dormancy // Biología plantarum, 2001, v, 85, №9, p, 132-137,

2. Литкова H.C., Лоскутова H.A., Майсурян А.Н., Мазин D.A., Корабпева Н.П.. Платонова Т.А., Ладыженская Э.П., Еаеюинна A.C. Получение генетически модифицированных растений картофеля, несущих ген защитного пептида из амаранта // Прикладная биохимия и микробиология, 2001, т.37, Ла 3, с. 349-354.

3. Кораблева Н.П., Платонова Т.А., Евсюиина A.C., Ладыженская Э.П., Бнбик Н.Д., Воронина С,С., Кузнецов Ю.В., Смирнов Л.Д. Влияние амбиола на ростовые процессы, устойчивость к стресс-факторам и продуктивность картофеля // Материалы международной научно-практической конференции «Продукционный процесс (теория, метода, его роль в формировании урожайности различных культур)», Орловский государственный Аграрный университет. Орел, 2001, с. 136-144.

4. Евеюнина A.C., Ляпкоаа Н.С., Платонове Т.А., Корзблдва Н.П. Влияние амбиола на рост стеблей у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля // Прикладная биохимия н микробиология, 2002, т. 38, № 2, с. 203-207.

5. ТА. Платонова, A.C. Евсюиина, Н.С. Ляпкова, Н.П. Кораблева. Морфогенетнческие изменения у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля под влиянием амбиола. И Прикладная биохимия и микробиология, 2002, T.3S, № 6, с, 689-703.

6. И.Г. Кириллова, A.C. Евсмнииа, Т.И. Пузина, Н.П. Кораблева. Влияние амбиола и 2-хлорътияфосфоновой кислоты на содержание фитогормонощ в листьях и клубнях картофеля И Прикладная биохимия и микробиология, 2003, т. 39, №.2. С.237-241.

7. Кириллова Н.Г., Кораблева Н.П., Евеюнана A.C. Влияние антиоксидантл амбиола на повышение устойчивости растений картофеля к засухе Н Материалы XI съезда Русского ботанического общества «Ботанические исследования в Азиатской России» Новосибирск-Барнаул, 2003, е. 231-232,

8. И.Г. Кириллова, A.C. Евсюннна, Н.П. Кораблева. Влияние антиоксиданта амбиола на показатели фотосинтетической активности, рост и продуктивность растений картофеля fl Материалы симпозиума «Рациональные технологии в современном сельскохозяйственном производстве». Сельский консультационный центр, Орел, 2003, с.28-31.

9. ТА Платонова, A.C. Евсюиина, СВ. Беликов, НЛ. Кораблева. Ультраморфометрическое изучение пластидного аппарата клеток апихачьных меристем клубней исходных и трансгенных растений картофеля под влиянием амбиола Н Прикладная биохимия и микробиология, 2005, т. 41, №3, с. 330-339.

Тезисы

1. Korabieva N.P., Ladyzbenskaya E.P., Platonova T.A., Evsyunloa A.S., Lyapkova N.S., Majsuran A.N., Mazin V.V, The comparative study of initio! and transformed potato plants carrying the gene of defensine from Amaranthus caudatus L, in relation to growth, morphogenesis and !{* translocation across plasma membrane. Abstracts of Internationa) Symposium «Signalling Systems of Plant Cells», Moscow, Russia, 2001. ONT1, Pushchino, p. 78-79.

2. Korabteva N.P., Platonova T.A., Evsyuntni A.S„ Ladyzhenskaya E.P., Dogonadze M.Z. Ethylene is an inducer of both the synthesis of terpenoid compounds and the reshtanse of potato plants to pathogens. Abstracts of lntmational Symposium «Signalling Systems of Plant Celts», Moscow, Russia, 2001. ONT1, Pushchino, P. 79.

3. Кириллова И.Г., Еяскшина А.СИ Кораблева Н.П. Сравнительное изучение действия препаратов амбиол и 2-ХЭФК на содержание фитогормонов в листьях растения картофеля. Тезисы докладов VI Международной конферешш «Регуляторы роста и развитая растений в биотехнологиях». М., МСХА, 2001, C.9S-99.

4. N. Korableva, Л, Evsyuniua, Т. Puzina, Е. Ladyzheoskaya, Т. Platonova, L. Smirnov. Endogenous abscisic acid concentration, membrane bound If -ATP-ase activity, growth, productivity in drougth stressed, СЕРА and ambiol treated potato plants. Abstracts 17й International Conference on Plant Growth Substances, 2001, Brno, Czech Republic, p. 137.

5. Кораблева Н.П., Платонова T.A., Евсюнина А.С., Пузина Т.Н., Кириллова И.Г., Воронина С.С., Кузнецов Ю.В. Индуцирование устойчивости к неблагоприятным факторам и повышение продуктивности картофеля под действием амбиояа. Материалы VI Международной конференции «Биоантиоксилант», Москва, 2002, с. 291.

6. Кораблева Н.П., Платонова Т.А., Евсюнина А.С., Кириллова И.Г., Лузина Т.И. Индукция устойчивости картофеля к неблагоприятным факторам под действием стрессовых фитогормонов - этилена и абсцизоеой кислоты. Тезисы III Съезда Всероссийского биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, с.444,

7. Кириллова И.Г., Евсюннив А.С,, Кораблева Н.П. Влияние амбиала на рост и гормональп ый баланс апикальных меристем клубней картофеля Solarium tuberosum L. Тезисы докладов V съезда Общества физиологов растений и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиегтехнологнн», Пенза, 2003, с. 401.

Подписано в печать 15.03,2006 г. Зак. 19. Тир.100 экз. Объем 1,2 п.л. Москва, Нахимовский проспект, 32.