Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТРАНСФОРМАЦИЯ КАРТОФЕЛЯ И ТАБАКА ГЕНАМИ ДЕФЕНЗИНОВ И ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ BWI-LA

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ТРАНСФОРМАЦИЯ КАРТОФЕЛЯ И ТАБАКА ГЕНАМИ ДЕФЕНЗИНОВ И ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ BWI-LA"



На правах рукописи

ЧЕРЕДНИЧЕНКО Михаил Юрьевич

ТРАНСФОРМАЦИЯ КАРТОФЕЛЯ И ТАБАКА ГЕНАМИ ДЕФЕНЗИНОВ И ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ В\У1-1а

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им К.А. Тимирязева

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор биологических наук, академик РАСХН, проф Шевелуха В С.

доктор биологических наук Поляков А В

кандидат биологических наук Огаркова О А

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита диссертации состоится «2Й. п декабря 2004 г. в и часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии им. К А. Тимирязева по адресу 127550. г. Москва, ул Тимирязевская, 49 (тел/факс 976-40-72)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиоте МСХА им К.А. Тимирязева

Автореферат разослан «22-» ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.И. Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Картофель {Solatium tuberosum L.) является одной из ведущих сельскохозяйственных культур как в нашей стране, так н во всем мире. Однако многие из районированных его сортов не обладают устойчивостью к вирусным, бактериальным и грибным патогенам. Потери урожая от болезней в период вегетации и хранения составляют 25-30 %, а в годы эпифитотий могут доходить до 90 %.

Требования сельскохозяйственного производства к продуктивности и качеству сортов различных культур, в том числе картофеля, их устойчивости к болезням и вредителям постоянно растут. Поэтому создание форм картофеля, толерантных к биотическим стрессам, остается актуальной проблемой. Для решения этой задачи наряду с традиционными методами селекции целесообразно использование методов биотехнологии, и, в первую очередь, клеточной и генетической инженерии, которые позволяют ускорить селекционный процесс.

В генноинженерных программах по селекции сельскохозяйственных растений приоритет отдается использованию генов общей устойчивости, обеспечивающих защиту одновременно против нескольких видов фитопатогенов (Ryan, 1990, Michaud, 1997, Мосолов др., 2001, Парашина и др., 2Q00, Ляпкова и др., 2001). В связи с этим представляют интерес гены таких защитных растительных белков, как дефензины и ингибиторы протеолитических ферментов, обладающие широким спектром действия (Concei?3o, Broekaert, 1998, Penninckx et al., 1996, Дунаевский и др., 2000).

Дефензины растений, представленные небольшими (около 5 кДа), обычно основными, цистеин-богатыми пептидами, принадлежат к семейству антимикробных белков со специфическим ар-мотивом (Bruix et al., 1993, Broekaert et al., 1995, De Samblanx et a]., 1997). Это семейство антипатогенных белков достаточно широко представлено не только у растений, но и у других многоклеточных организмов, что свидетельствует о важности этих молекул как основных компонентов стратегии защиты от стрессовых факторов (Osborn et al., 1995, Terras et al., 1995, Thomma et al., 1998). В растениях экспрессия генов дефензинов может быть индуцирована как биотическими, так и абиотическими стрессами, что приводит к их накоплению в определенных типах клеток (ConceifSo, Broekaert, 1998).

В работах по трансформации растений генами дефензинов имеются противоречивые данные об их эффективности, что явилось одним из важных мотивов для проведения таких экспериментов в нашем исследовании.

ЦНБ МСХА

фонд научной литепя-п/ры

Белки-ингибиторы протеолитических ферментов растений являются регуляторами эндогенных протеин аз и локализованы в межклеточном пространстве н клеточной стенке. Обнаружены также растительные ингибиторы протенназ, активно действующие на экзогенные ферменты патогенных микроорганизмов и насекомых (Ryan, 1990, Валуева, Мосолов, 1995). Большинство известных и исследованных ингибиторов протеиназ из растений взаимодействуют с такими широко распространенными сериновыми протеиназами, как трипсин, химотрипсин и субтилизин. К настоящему времени ингибиторы протеиназ идентифицированы у многих видов растений (Мосолов и др., 1993, Antcheva et al, 1996, Bueno et al, 1999, Цыбина, 2002) При этом для разных видов растений показаны различия как по эффективности проводимых протеолитических реакций, так и по их направленности (Eckelkamp et al, 1993, Дунаевский и др., 2000, Мосолов и др, 2001)

Получение и анализ трансгенных линий растений, несущих гены дефензипов и ингибиторов протеиназ, может представлять как научный интерес при изучении экспрессии чужеродного гена в геноме генетически модифицированного организма (ГМО), так и иметь прикладное значение в селекционной практике

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований являлась оптимизация технологий трансформации, получение на их основе и изучение трансгенных растений картофеля, содержащих экспрессирующий ген rs дефензина редьки RS-AFP2, ген ас дефензина амаранта AC-AFP2, ген 1р ингибитора протеиназ гречихи BWI-la

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи-

1 Изучить на различных вариантах питательных сред регенерационную способность различных типов эксплантов 20 сортов картофеля, отличающихся по своей устойчивости к основным фитопатогенам.

2. Оптимизировать методику трансформации картофеля и табака с целью повышения ее эффективности. Получить трансгенные растения картофеля с генами rs дефензина редьки и ас дефензина амаранта, а также трансгенные растения табака и картофеля с геном 1р ингибитора протеиназ гречихи

3. Определить у трансформированных линий картофеля и табака наличие генетической вставки, ее копийность и уровень экспрессии.

4. Выявить возможные изменения у трансгенных растений в уровне накопления растворимых фенольных соединений и лигнина.

Научная новизна и практическая ценность работы Выявлены условия для эффективной регенерации и генетической трансформации 20 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, различающихся по степени

устойчивости к основным грибным и бактериальным патогенам. Определены сорта картофеля, обладающие наибольшей регенерационной способностью, и предложены условия проведения трансформации сортов картофеля и табака от этапа прекультивации до этапа регенерации. Впервые получены растения табака и картофеля, экспрессирующие ген 1р ингибитора сериновых протеиназ гречихи, который участвует в системе защиты растений от насекомых и фитопатогенных микроорганизмов. Полученные в работе результаты и разработанные методики могут быть использованы при размножении в культуре in vitro различных сортов картофеля и табака, при создании трансгенных линий и их оценке на устойчивость к различным заболеваниям. Созданные трансгенные линии картофеля с геном rs дефензина редыси, геном ас дефензина амаранта и геном 1р ингибитора протеиназ гречихи, экспрессирующие соответствующие пептидные антибиотики, могут быть использованы в качестве исходного материала в дальнейшей селекционной работе.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной научно-практической конференции «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке», Москва, 2000 г.; Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые — возрождению сельского хозяйства России в XXI веке», Брянск, 2000 г.; П Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000 г.; научной конференции памяти Грегора Менделя, Москва, 2001 г.; Международной научно-практической конференции молодых ученых «Биотехнология — возрождению сельского хозяйства России в XXI веке», Санкт-Петербург, 2001 г.; научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева, Москва, 2002 г.; 2-ой конференции МОГиС им. Н.И. Вавилова, Москва, 2003 г.; IV Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2004 г.; Международном симпозиуме «Физиология трансгенных растений и проблемы безопасности», Москва, 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и

обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на_

страницах машинописного текста, содержит_рисунков и_таблиц. Список

цитируемой литературы включает_наименований, из них_иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования. В работе были использованы растения картофеля 20 сортов отечественной и зарубежной селекции. Стерильные пробирочные растения отобранных сортов были предоставлены к б н. Мусиным С.М. и к б н. Хромовой Л М. (ВНИИ картофельного хозяйства им А Г. Лорха) В экспериментах также использовались растения табака сорта Самсун, предоставленные к.б.н. Хадеевой Н.В. (ИОГен им. Н И. Вавилова)

Векторные плазмидьг Генноинженерные конструкции, содержащие функциональные гены дефензинов редьки (rs) и амаранта (ос) были предоставлены ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии; векторная плазмида, содержащая ген ингибитора протеиназ гречихи (1р), была предоставлена НИИ ФХБ им. А Н Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова.

Культивирование эксплантов т vitro и получение регенерантов Регенеранты из эксплантов получали методом прямого органогенеза на среде Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962), содержащей 3 % сахарозы и различные сочетания цитокининов и ауксинов.

Получение трансгенных растений Трансформация картофеля проводилась по базовой методике, разработанной в лаборатории генной и клеточной инженерии ВНИИКХ им. А Г. Лорха (Методические указания..., 1995). Агробактериальную трансформацию табака проводили по Horsch и др (1985).

Анализ трансформированных растений Выделение тотальной растительной ДНК производили по методу Edwards et al (1991)

ПЦР-анализ проводили по стандартным методикам с использованием прабмеров, комплементарных последовательности гена nptll

Блот-гибридизацию по Саузерну проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). В качестве зонда использовали фрагмент ДНК, комплементарный соответствующему гену.

Для проведения Нозерн-блот-гибридизации ро1у(А)т-мРНК была изолирована с использованием набора для выделения мРНК (Quickprepmicro-mRNA purification kit, Pharmacia Biotech, США). В качестве зонда использовался фрагмент векторной конструкции длиной 1,2 т.н п , содержащий ген 1р. Для выравнивания уровней экспрессии использовался ДНК-зонд длиной 1,8 т.н.п , содержащий ГШЗ-ген а-тубулинов арабидопсиса. Для визуализации гибридизации использовали систему Phosphorimager (Kodak, США)

Проведение биотеста Штамм фитопатогенного гриба Fusarium sp был предоставлен кафедрой фитопатологии МСХА им К.А. Тимирязева. Штамм

бактерии Е. coli (DH1) был предоставлен лабораторией генетики растений ИОГен им. Н.И. Вавилова.

В случае тестирования антибактериального эффекта растертые фрагменты побега (стебли и листы) контрольных и трансгенных растений наносили на чашки Петри, предварительно засеянные бактериальной культурой (К coli), и инкубировали при комнатной температуре (22-25°С). Результаты теста оценивали через 24-48 часов.

Анализ фунгицидной активности проводили на чашках Петри, которые засевались спорами гриба Fusarium sp. Через 2 дня, после нарастания гриба, на чашку помещали растертые фрагменты побега (стебли и листья) контрольных и трансгенных растений и инкубировали при комнатной температуре (22-25°С), Результаты теста оценивали через 48-72 часа. В качестве контроля использовали экспланты нетрансформированных линий картофеля.

Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений, флавоноидов и лигнина проводили по стандартным методикам (Запрометов, 1971, Загоскина и др., 2003).

Статистическая обработка данных. Статистические показатели и достоверность различий рассчитывали по Доспехову (1985). В таблицах приведены средние величины и указаны доверительные интервалы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Зависимость эффективности регенерации от генотипа выбранных сортов картофеля и условий проведения трансформации

Исследование генотип-специфичности различных сортов картофеля при культивировании и морфогенезе in vitro

Наиболее критичным этапом трансформации, от которого в основном зависит эффективность получения трансгенных растений, является этап регенерации, в связи с чем было проведено изучение регенерационной способности различных сортов картофеля в культуре in vitro на разных типах эксплантов на 4 вариантах питательных сред.

Зависимость эффективности регенерации различных сортов картофеля от типа экспланта

Сравнительный анализ регенерационной способности 20 сортов картофеля проводили на стеблевых и листовых эксплантах. По результатам эксперимента, стеблевые экспланты всех взятых в анализ сортов давали больший процент регенерации, чем листовые экспланты (табл. 1).

Таблица I.

Эффективность регенерации (%) различных сортов картофеля в зависимости от типа экспланта (в среднем по 4 вариантам питательных сред)

Сорт Эффективность регенерации, %

листовые экспланты стеблевые экспланты

Альянс 4.6 ±2,0 45,3 ±4,9

Бинтье 5.9 ± 1,9 38,8 ±4.6

Брянский ранний 3,5 ± 1,4 64,1 ±4,8

Дезире 3.5 ±1,3 60,2 ± 5.5

Десница 4,4 ± 1,8 49,2 ± 5,3

Жуковский ранний 3,7 ± 1,7 39,5 ± 3,5

Ильинский 2,8 ± 1.1 42,4 ± 2,9

Лорх 3,3 ± 1,6 29,9 ±4,6

Лукьянове кий 3,7 ± 1,6 39,7 ± 4,3

Невский 1.5 ± 0,6 38,5 ± 5,2

Осень 1,8 ± 1,1 22,7 ±5.7

Петербургский 5,2 ± 1,6 66,6 ±4,7

Раменский 5,0 ±2.1 57,1 ± 5,5

Резерв 3.4 ± 1.8 50,9 ± 6,0

Синецвет 4,0 ± 1,4 39,3 ± 5.6

Сказка 2,6 ± 1.1 43,0 ±4,9

Сотка 4,5 ± 1.5 47,5 ± 3.7

Удача 4,8 ± 1,5 53,7 ±5,1

Эффект 5,3 ± 1,5 59,9 ± 4.4

Янтарный 4,4 ± 1,5 66.2 ±5,5

У сортов Осень, Бинтье, Ильинский на среде с 5 мг/л 6-БАП, а также на сортах Лорх и Невский на средах с 5 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК и 5 мг/л 6-БАП вообще не удалось получить регенерацию из листовых эксплантов.

Зависимость эффективности регенерации различных сортов картофеля от концентрации регуляторов роста в питательной среде

На 20 сортах картофеля отечественной и зарубежной селекции, отличающихся по степени устойчивости к основным фитопатогенам, была проведена оценка их регенерационной способности Все анализируемые сорта картофеля показывали наибольшую эффективность регенерации из стеблевых эксплантов на средах, содержащих 3 мг/л цитокинина 6-БАП с добавлением или без добавления 0,5 мг/л ауксина ИУК (табл. 2).

Таблица 2.

Эффективность регенерации (%) сортов картофеля из стеблевых эксплантов в зависимости от гормонального состава среды

Сорт Эффективность регенерации, %

3 БАП 3 БАП/ 0,5 ИУК 5 БАП/ 0,5 ИУК 5 БАП

Альянс 56,1 ± 5,4 55,4 ± 3,8 48,5 ±7,1 26,3 ± 3,2

Бинтье 54,8 ± 4,5 37,2 ±3,6 32,6 ±3,5 30,6 ± 6,8

Брянский ранний 76,3 ± 5,1 70,1 ± 5,8 68,6 ±3,9 41,7 ±4,2

Дезире 69,3 ± 5,6 71,7 ±6,1 65,6 ± 5,3 34,2 ±4,8

Десница 59,2 ± 6,9 52,7 ±3,5 57,5 ± 7,3 27,2 ±3,6

Жуковский ранний 48,2 ±3,1 43,2 ±4,3 39,6 ±2,8 26,8 ± 3,7

Ильинский 52,1 ±3,2 50,3 ± 3,7 46,5 ± 2,2 20,7 ±2,4

Лорх 45,2 ± 5,6 27,9 ±4,2 30,5 ±5,1 16,1 ±3,4

Лукъяновский 43,6 ±4,2 47,7 ±5,1 37,3 ± 5,3 30,2 ±2,6

Невский 56,6 ± 6,8 40,2 ±3,4 42,7 ± 3,2 14,4 ± 7,5

Осень 45,3 ± 6,4 24,3 ± 7,1 15,1 ± 5,2 6,2 ±4,1

Петербургский 87,1 ± 3,9 70,2 ±5,9 63,4 ± 6,8 45,8 ± 2,1

Раменский 80,2 ±4,9 61,1 ±5,9 54,7 ±5,1 32,2 ± 6,2

Резерв 79,7 ±7,1 56,2 ±6,6 45,9 ±5,2 21,6 ±5,1

Синецвет 54,2 ±7,1 42,3 ±4,1 37,1 ±8,5 23,6 ±2,7

Сказка 57,2 ± 5,1 49,1 ± 3,2 42,6 ±5,9 23,2 ± 5,4

Сотка 60,8 ±5,9 58,2 ± 3,3 45,9 ±2,5 25,1 ± 3,0

Удача 68,2 ±5,4 62,7 ±6,8 49,6 ±3,9 34,4 ±4,3

Эффект 74,1 ± 5,3 69,4 ±4,8 65,3 ± 3,8 30,6 ±3,7

Янтарный 83,2 ±5,4 73,2 ±4,6 68,4 ±3,8 40,1 ± 8,0

Низкий выход регенерантов на средах, содержащих 3 мг/л БАП с добавлением или без добавления 0,5 мг/л ИУК, был обусловлен тем, что в этих вариантах экспланты образовывали каллус, из которого в дальнейшем не были получены регенераты. Хотя подобные соотношения цитокининов и ауксинов используются при получении регенерантов из каллуса (Дмитриева, 1990), в нашем случае, по всей видимости, происходило угнетение морфогенной активности высокими концентрациями цитокинина.

Зависимость эффективности регенерации различных сортов картофеля от генотипа

Был проведен общий сравнительный анализ эффективности регенерации взятых в анализ сортов картофеля от типа экспланта и гормонального состава сред

Из 20 изученных генотипов картофеля на 4 вариантах питательных сред с различным содержанием б-БАП и ИУК наибольший морфогенный потенциал т vitro показали растения сорта Петербургский (87,1 %), Янтарный (83,2 %), Раменский (80,2 %), Резерв (79,7 %) и Брянский ранний (76,3 %), регенерировавшие побеги из стеблевых эксплантов на среде с 3 wr/л 6-БАП.

Однако для нас представляло интерес провести трансформацию сортов картофеля, изначально отличающихся друг от друга по степени устойчивости к грибным и бактериальным фитопатогенам. В связи с этим для получения трансгенных линий, экспрессирующих белки дефензина редьки RS-AFP2, дефензина амаранта Ас-АЕР2 и ингибитора протеиназ гречихи BWI-la, нами были отобраны сорта, различающиеся именно по этой характеристике.

Таким образом, на первом этапе были отобраны генотипы, перспективные для проведения генетической трансформации, а также выявлены условия получения максимального выхода регенерантов - тип экспланта и гормональный состав среды для регенерации.

Определение оптимальной концентрации антибиотиков при проведении агробактериальной трансформации картофеля и табака

При проведении трансформации растений с помощью Agrobacterium tumefaciens необходимо использование различных антибиотиков на этапе регенерации: для избавления от внешней агробактрии - клафоран (цефотаксим), для селекции полученных трансформированных линий -канамшшн.

Определение оптимальной концентрации антибиотика клафорана для ингибирования роста агробактерии

По данным наших экспериментов, достаточной концентрацией для подавления роста агробактерии оказалась концентрация клафорана 500 мг/л. При меньшей концентрации происходил агробактериальный зароет эксплантов и их последующая гибель, при большей замедлялся рост эксплантов, а у сортов картофеля Ильинский, Лорх, Лукьяновский и Осень достоверно снижалась эффективность регенерации. При концентрации 500 мг/л растения картофеля и табака практически не угнетались, и такая концентрация в подавляющем большинстве случаев являлась вполне достаточной для уничтожения внешней агробактерии и предотвращения агробактериального зароста эксплантов

Определение оптимальной концентрации антибиотика канамицина для селекции трансформированных растений картофеля и табака

Векторные генетические конструкции, которыми были трансформированы сорта картофеля и табака, в качестве маркерного содержали ген прШ (неомицинфосфотрансферазы), определяющий устойчивость к антибиотику канамицину. Известно, что при использовании канамицина в качестве селективного агента возможен отбор псевдотрансформантов, однако увеличение концентрации канамицина в среде для более строгой селекции может привести К гибели даже истинных трансгенных растений.

Растения 20 сортов картофеля черенковали и помещали на среды, содержащие соответственно 25, 50 и 100 мг/л канамицина, а также, в качестве контроля, на среду, не содержащую данный антибиотик. Исходя из полученных в экспериментах данных, можно сделать вывод о том, что концентрация канамицина 50 мг/л является достаточной для проведения селекции растений картофеля. Именно эта концентрация канамицина использовалась в дальнейшем при проведении трансформации растений картофеля. На среде с концентрацией канамицина 100 мг/л выживали растения только четырех сортов картофеля: Раменский, Резерв, Удача и Эффект. Причем корни у этих растений практически не образовывались, а рост был очень низким.

Установлена оптимальная концентрация селективного антибиотика канамицина 150 мг/л при проведении трансформации табака. Отбор на средах, содержащих меньшую концентрацию, неэффективен, а при более высоких концентрациях возможно угнетение истинно трансгенных линий.

Влияние условий проведения трансформации растений картофеля на эффективность последующей регенерации

Было проведено исследование реакции эксплантов растений картофеля различных сортов на наличие или отсутствие освещенности во время прекулыивации, в результате чего были выявлены генотип-зависимые различия. Так, экспланты сорта Альянс гораздо лучше сохраняли способность к регенерации после проведении прекулыивации в темноте, экспланты сорта Десница, Жуковский ранний, Невский и Осень, наоборот, - на свету. По другим сортам достоверных различий в реакции не наблюдалось.

При сравнении эффективности регенерации у анализируемых сортов картофеля в зависимости от продолжительности этапа прекультивации (2, 5 суток) выявлялись сортовые различия. Так, растения сорта Синецвет регенерировали после трансформации только в том случае, если прекультивация проводилась в течение 2 суток. Сорта Жуковский ранний, Лорх и Сказка давали регенерацию после трансформации только с 5-дневной

прекультивацией На остальных сортах регенерация наблюдалась в обоих вариантах в различном соотношении например, у сорта Альянс регенерация шла преимущественно после 2-дневной прекультивации, а у сорта Эффект -после 5-дневной.

В серии опьггов изучалась возможность оптимизации агробактериальной трансформации табака сорта Самсун путем добавления экссудата табака в суспензию агробактерии и использования цистеина (400 мг/л) в средах для культивирования. Как показали эксперименты, добавление цистеина как в среду для кокультивации, так и в среду для регенерации приводило к росту регенерационной способности эксплантов (76,3 % по сравнению с 53 % при использовании сред без добавления цистеина)

2. Трансформация сортов картофеля и табака генами фунгицид пых белков

В результате проведенных экспериментов по агробактериальной трансформации сортов картофеля и табака генными конструкциями, содержащими функциональные гены гу дефензина редыш, ас дефензина амаранта, 1р ингибитора протеиназ гречихи по оптимизированным методикам были получены генетически модифицированные линии 16 сортов картофеля и табака сорта Самсун.

Было получено 98 линий картофеля, трансформированных геном гя дефензина редыш* 2 линии сорта Осень, 6 линий сорта Брянский ранний, 9 линий сорта Дезире, 16 линий сорта Янтарный, 7 линий сорта Альянс, 8 линий сорта Десница, 6 линий сорта Сотка, 11 линий сорта Лорх, 12 линий сорта Сказка, 11 линий сорта Синецвет, 6 линий сорта Эффект, 4 линий сорта Жуковский ранний.

Было получено 10 линий картофеля, трансформированных геном ас дефензина амаранта: 3 линии сорта Осень, 3 линии сорта Брянский ранний, 3 линии сорта Раменский, 1 линия сорта Бинтье.

Было получено 145 линий картофеля и табака, трансформированных геном 1р ингибитора протеиназ гречихи1 5 линий картофеля сорта Резерв, 2 линии картофеля сорта Удача, 138 линий табака сорта Самсун.

3. Молекулярный анализ полученных трансформированных линий

ПЦР-анализ трансформированных линий картофеля и табака

Доказательство трансгенной природы трансформированных линий картофеля было проведено методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Так как во всех векторных конструкциях в качестве селективного маркера при трансформации был использован ген прШ неомицинфосфотрансферазы, в реакции амплификации были использованы последовательности праймеров, комлементарные прШ-гену, с помощью которых нарабатывался фрагмент соответствующей длины В качестве положительного контроля использовалась ПЦР-смесь, содержащая ДНК вектора (-10 гост), в качестве отрицательного контроля использовали ПЦР-смесь, не содержащую ДНК.

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

12345 6789 10

Рис. 1 Результаты ПЦР-анализа трансформированных линий картофеля: а) сорт Янтарный, б) сорт Десница (дорожки 1-5) и сорт Альянс (дорожки 6-10)

Результаты проведенного тестирования представлены на рис. 1. Как было показано в результате проверки, не все трансформированные линии, регенерировавшие на среде с канамицином (50 мг/л), были истинными трансгенами (табл. 3)

Как следует из табл. 3, количество трансгенных линяй было неодинаково у разных сортов картофеля, что дает возможность предполагать наличие генотипических различий в эффективности трансгеноза. Наибольший процент трансгенных растений был получен для сорта Янтарный (75 %), что совпадает с результатами других исследований (Аветисов. 1997), где также отмечали высокую способность данного сорта к трансформации

Эффективность трансгеноза (%)

Таблица 3.

Сорт Количество трансформированных линий Количество трансгенных линий Эффективность трансгеноза, %

Альянс 7 2 28,6

Дезире 9 5 55,5

Десница 8 2 25,0

Раменский 3 1 33,3

Резерв 5 3 60,0

Янтарный 16 12 75,0

Таким образом, в результате проведенного ПЦР-анализа 40 линий 4 сортов картофеля (Альянс, Дезире, Десница и Янтарный), трансформированных генетическими конструкциями, содержащими ген п дефеизина редыси; 3 линий сорта Раменский, трансформированных геном ас дефензина амаранта, и 5 линий сорта Резерв, трансформированных геном 1р ингибитора протеиназ гречихи, была подтверждена трансгенная природа: 21 линии 4 сортов картофеля (Альянс, Дезире, Десница и Янтарный), трансформированной геном гз дефензина редьки, 1 линии сорта Раменский, трансформированной векторной конструкцией, несущей ген ас дефензина амаранта, и 3 линий сорта Резерв, трансформированных геном 1р ингибитора протеиназ гречихи.

Аналогично методом ПЦР были протестированы линии табака сорта Самсун, трансформированные векторной конструкцией, несущей ген 1р ингибитора протеиназ гречихи (рис. 2). Из 138 трансформированных линий табака' положительный результат при ПЦР-анализе дали 125 линий, что составляло 90,5 %.

Рис. 2. Результаты ПЦР-анализа трансформированных линий табака . сорта Самсун

Такой высокий процент трансгенных линий, полученных при трансформации табака, по сравнению с аналогичным показателем при трансформации картофеля можно объяснить прежде всего выбранной схемой селекции на высокой концентрации канамишша (150 мг/л), что резко сокращало количество регенерировавших псевдотрансформантов. В то же время, как было сказано выше, на картофеле селекцию при столь высоких концентрациях канамицина проводить нельзя из-за полного ингибирования ростовых процессов

Анализ трансформированных линий картофеля и табака методом блот-гибриднзацнн по Саузерну

Для проведения Саузерн блот-анализа были отобраны линии, наличие в которых вставки было показано методом ПЦР. Всего были проанализированы 2 трансгенные линии картофеля сорта Дезире (Дез-13/1, Дез-12/9), I трансгенная линия сорта Десница (Д-8/1) и 1 трансгенная линия сорта Альянс (Ал-16/1), несущие конструкцию с геном rs дефензива редьки; 3 линии картофеля сорта Резерв (Рез-18/12, Рез-24/1, Рез-17/2) и 5 линий табака сорта Самсун (С-20/2, С-31/14, С-15/6, С-34/22, С-38/7), трансформированных векторной конструкцией, содержащей ген 1р ингибитора протеин аз гречихи.

В качестве зонда как в случае гена rs, так и в случае гена 1р был использован фрагмент векторной конструкции, захватывающий целевой ген. Для блот-гибридизахши по Саузерну геномная ДНК растений-гранформантов обрабатывалась рестриктазами PstI (rs-трансформанты) и В gill (Ip-трансформанты). На рис. 3 представлены результаты блот-гибридизации рестрицированной ДНК трансформированных линий с иР-меченой ДНК зонда.

У всех линий, трансформированных конструкцией с геном rs, наблюдался общий фрагмент длиной 0,95 т н.п, соответствующий фрагменту генной конструкции (рис За) В трех случаях при гибридизации ДНК линий картофеля присутствовал еще один фрагмент, вариабельный по длине, что объясняется различным расположением сайта рестрикции в геномной ДНК, фланкирующей вставку трансгена. Присутствие двух гибридизующихся фрагментов свидетельствует о монокопийностн вставки в этих линиях. В целом преобладание одиночных инсерций совпадает с литературными данными по частотности встраивания генных конструкций при Т-ДНК-опосредованной агробактериапьной трансформации (Rama et al, 1998).

а

б

12345 1234 56

Рис. 3. Результаты анализа трансгенных линий картофеля и табака методом блот-гибридизации по Саузерну: а) ген га (1 - Ал-1б/1,2 - Дез-13/1, 3 - Дез-12/9,4 - Д-8/1,5 - контроль); б)ген/р(1 - Рез-24/1,2 - Рез-18/12, 3 - Рез-17/2,4 - С-20/2,5 - С-34/22,6 - контроль) (в качестве контроля брали ДНК нетраясформированного растения сорта Резерв)

В случае линии Д-8/1, характеризующейся присутствием трех фрагментов, можно говорить о наличие двух копий трансгенной конструкции в геноме трансформированной линии.

У всех линий, трансформированных конструкцией с геном 1р, наблюдался общий фрагмент длиной 0,6 т.н.п., соответствующий фрагменту генной конструкции (рис. 36). В пяти случаях при гибридизации ДНК линий картофеля и табака присутствовал дополнительный фрагмент различной длины, что, аналогично случаю с «-геном, объясняется гибридизацией с районами, фланкирующими инсерции.

Таким образом, были проанализированы 4 линии картофеля (Дез-13/1, Дез-12/9 сорта Дезире, Д-8/1 сорта Десница и Ал-16/1 сорта Альянс), трансформированные геном м, 3 линии картофеля (Рез-18/12, Рез-24/1, Рез-17/2 сорта Резерв) и 5 линий табака (С-20/2, С-31/14, С-15/6, С-34/22, С-38/7 сорта Самсун), трансформированных геном 1р\ подтверждена их трансгенная природа, а также определена копийность встроенной векторной конструкции. У всех линий, наличие в которых генных конструкций было показано методом ПЦР, выявляли инсерции и методом блот-гибридизации по Саузерну.

Проверка фунгицидной и антибактериальной устойчивости полученных линий картофеля и табака (бнотест)

Для обнаружения антибактериального и фунгицидного действия полученных трансгенных линий картофеля и табака был проведен биотест Для биотестирования фунгицидного действия трансгенных линий нами были проведены эксперименты с фитопатогенным грибом Fusarium sp. В опытах на трансгенных линиях табака, несущих ген rs дефензина редьки и ген 1р ингибитора протеиназ гречихи, был показан фунгицидный эффект, заключавшийся в остановке роста гриба на расстоянии >5 мм от эксплантов трансгенных линий, в то время как контрольные (нетрансформированные) варианты зарастали полностью.

Биотестирование антибактериальной активности встроенных генов проводили на чашках Петри, предварительно засеянных культурой Е coli (штамм DH1) Антибактериальный эффект действия гена 1р наблюдался на трансгенных линиях картофеля сорта Резерв - Рез-24/1 и Рез-18/12 - и линий табака сорта Самсун - С-23/12, C-31/I4, С-34/22 и С-38/7

Таким образом, можно сделать вывод, что растения трансгенных линий картофеля и табака производят функциональные белки - дефензин редьки и ингибитор протеиназ гречихи, - которые оказывают защитное действие и подавляют развитие бактерии и гриба Причем линии, наличие в которых вставки было подтверждено методом ПЦР и блот-гибридизацией по Саузерну, демонстрировали экспрессию соответствующего белка и в биотестах.

Анализ экспрессии функционального гена 1р в клетках трансформированных линий картофеля и табака

Для детекции транскрипта мРНК гена ингибитора протеиназ в полученных трансгенных линиях табака и картофеля, трансформированных конструкцией с геном 1р ингибитора протеиназ гречихи, и определения уровня экспрессии гена был проведен Нозерн-блот-анализ Для гибридизации были отобраны 6 трансгенных линий картофеля - Рез-24/1, Рез-18/12, и Рез-17/2 - и табака - С-20/2, С-34/22 и С-23/12. Линии Рез-24/1, Рез-18/12, Рез-17/2, С-23/12 и С-34/22, по данным проведенного биотеста, показывали антибактериальную и антигрибную активность, в то время как линия С-20/2 таковой не проявляла.

У линий картофеля Рез-24/1, Рез-17/2 н Рез-18/12 сорта Резерв и линий табака С-34/22 и С-23/12 сорта Самсун был определен транскрипт мРНК, ожидаемой длины (-200 н п.) (рис 4)

1 2 3 4 5 6

Рис.4. Результаты Нозери блот-гибридизации трансгенных линий картофеля (1-Рез-24/1,2-Рез-17/2,3 - Рез-18/12) и табака (4 • С-34/22,5 - С-23/12,6 - С-20/2)

Как следует из рис. 4, уровень экспрессии гена 1р ингибитора протеиназ гречихи у различных линий картофеля и табака отличался. Количество мРНК было наибольшим в линии картофеля сорта Резерв Рез-18/12, что коррелировало с данными, полученными в ходе биотеста. У линий картофеля сорта Резерв Рез-17/2, Рез-24/1 и линии табака сорта Самсун С-34/22 отмечался более низкий уровень экспрессии гена 1р. Однако в связи с тем, что все протестированные в данном эксперименте линии демонстрировали антимикробную активность в биотесте, можно высказать предположение, что, несмотря на такой уровень экспрессии гена 1р, данного количества мРНК достаточно для проявления фунгицидной и антибактериальной активности.

Таким образом, была показана экспрессия гена 1р ингибитора протеиназ гречихи в клетках растений картофеля и табака. Анализ экспрессии гена у шести трансгенных линий картофеля и табака выявил различия уровня транскрипции этого гена. Показано, что различия в количестве /р-транскрипта коррелируют с данными, полученными в результате биотеста.

Анализ содержания фенольных соединений в трансформированных растениях картофеля

Ранее было показано, что полифенолы, наряду с целлюлозой, образуют барьер на пути проникновения патогенных микроорганизмов (Запрометов, 1992, 1996, Беляев и др., 1989), ингибируя рост и развитие патогенных микроорганизмов и, прежде всего, грибов, а также продуцирование и активность их метаболитов. В случае инфицирования в месте проникновения часто наблюдается активация синтеза фенольного полимера - раневого лигнина, выполняющего ряд защитных функций (Запрометов, 1996).

Таблица 4.

Содержание суммы растворимых фенольных соединений (РФС), флавоноидов (ФЛ) и лигнина (ЛГ) в контрольных и трансгенных линиях картофеля различных сортов

Сорт Линия РФС, мг/г свежей массы ФЛ, мг/г свежей массы ЛГ, мг/г свободного от экстрактивных веществ остатка

Дезире контроль 2,14 ±0,13 1.31 ±0.03 3,22 ± 0,23

Дез-13/1 0.98 ± 0,08 0,13 ±0.01 4,51 ±0,31

Дез-12/9 0,83 ±0.07 0,16 ±0,01 2,99 ±0,21

Резерв контроль 1,02 ±0,11 0,16 ±0,02 2.44 ± 0,18

Рез-24/1 1,01 ±0,09 0,08 ± 0,01 4,36 ±0,33

Рез-17/2 1,04 ±0,08 0,23 ± 0,02 2,35 ± 0,15

Рез-18/12 2,07 ±0.12 0,46 ±0,02 не опр.

Раменский контроль 0,72 ± 0,04 0,49 ± 0.02 не опр

Рам-14/1 1,57 ± 0,08 0,66 ± 0,03 не опр.

Десница контроль 1 2,71 ±0,13 1,64 ±0,03 не опр

Д-8/1 2,39 ±0,11 0,49*0.02 не опр.

В связи с тем, что существует зависимость биосинтеза фенольных соединений в тканях растений от их генотипа (Власюк, 1979, Калашникова, 2003), были исследованы полученные трансгенные линии картофеля сорта Дезире (Дез-13/1 и Дез-12/9) н сорта Десница (Д-8/1), трансформированные конструкцией, содержащей ген те дефензина редьки, трансгенная линия сорта Раменский (Рам-14/1) со встроенным геном ас дефензина амаранта и трансгенные линии сорта Резерв (Рез-24/1, Рез-17/2 и Рез-18/12), несущие ген 1р ингибитора протеиназ гречихи, для того чтобы оценить уровни накопления в них растворимых фенольных соединений (РФС), в том числе наиболее распространенных их представителей — флавоноидов, а также фенольного полимера лигнина В качестве контроля использовали растения нетрансформированных линий соответствующих сортов.

Как следует из данных, представленных в табл. 4, существуют межсортовые различия в уровне накопления РФС, при этом у контрольных линий сортов Резерв и Раменский отмечался более низкий показатель содержания РФС по сравнению с растениями сортов Дезире и Десница.

Трансгенные растения картофеля сорта Дезире содержали почти вдвое меньшее количество РФС по сравнению с растениями исходного сорта, а накопление флавоноидов снижалось в 8-10 раз Что же касается накопления

лигнина, то в трансгенной линии Дез-13/1 оно было примерно на 40 % выше, чем в контроле, в то время как у линии Дез-12/9 - достоверно не отличалось от контроля. У трансгенной линии сорта Десница Д-8/1 также наблюдалось снижение содержания РФС, в тем числе и флавоноидов, причем уровень последних падал в 3 раза.

По-видимому, введение гена rs в геном растений картофеля вызывает снижение уровня РФС (фенилпропаноидов и флавоноидов), что может быть следствием либо их преимущественного вовлечения в синтез лигнина, что наблюдалось у линии Дез-13/1, либо ослабления их биосинтетической способности, что наблюдалось у линий Дез-12/9 и Д-8/1.

У трансгенной линии Рам-14/1 наблюдался рост как содержания РФС, так н уровня флавоноидов.

Полученные трансгенные линии сорта Резерв практически не отличались от контрольных растений по содержанию РФС. При этом уровень лигнина в растениях трансгенной линии Рез-24/1 был в 1,8 раза выше, а уровень флавоноидов в 3 раза выше, чем в контроле; у линии Рез-17/2 не происходило значительных изменений в накоплении лигнина, в то время как уровень флавоноидов повышался.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и предложены условия оптимизации процесса трансформации картофеля на этапах от прекультивации до регенерации. Установлено, что наибольшей ре генерационной способностью обладали стеблевые экспланты сортов Петербургский, Янтарный, Раменский, Резерв и Брянский ранний на среде, содержащей 3 мг/л 6-БАП с добавлением и без добавления 0,5 мг/л ауксина ИУК.

2. Методом агробактериальной трансформации получено 98 линий 12 сортов картофеля (Осень, Брянский ранний, Дезире, Янтарный, Альянс, Десница, Сотка, JIopx, Сказка, Синецвет, Эффект и Жуковский ранний), трансформированных геном rs дефензина редьки; 10 линий 4 сортов картофеля (Осень, Брянский ранний, Раменский, Бинтье), трансформированных геном ас дефензина амаранта; 7 линий 2 сортов картофеля (Резерв и Удача) и 138 линий табака copia Самсун, трансформированных геном 1р ингибитора протеин аз гречихи.

3. Методом ПЦР и Саузерн блот-гибридизации показана трансгенная природа 2 трансформированных линий картофеля сорта Дезире, несущих конструкцию с геном rs дефензина редьки; 3 линий картофеля сорта Резерв и 5 линий табака сорта Самсун, трансформированных векторной конструкцией,

содержащей ген lp ингибитора протеиназ гречихи. Определена преимущественно монокопийность встроенных генных конструкций.

4. С помощью биотеста, проведенного на грибе Fusarium sp и бактерии Escherichia coli, показано, что в 2 трансгенных линиях картофеля сорта Дезире, несущих ген rs дефензина редьки, 2 трансгенных линиях картофеля сорта Резерв и 4 трансгенных линиях табака сорта Самсун, несущих ген /р ингибитора протеиназ гречихи, происходит экспрессия соответствующих генов

5. На уровне мРНК показана экспрессия гена 1р ингибитора протеиназ гречихи в клетках растений 3 трансгенных линий картофеля сорта Резерв и 2 трансгенных линий табака сорта Самсун Анализ экспрессии гена выявил различия в уровне транскрипции у протестированных линий* у линии картофеля сорта Резерв Рез-18/12 количество транскриптов было максимальным. Различия в количестве /р-транскрипта коррелируют с данными, полученными в результате биотеста.

6. Показано, что у трансгенных растений различных сортов картофеля изменяется концентрация растворимых фенольных соединений, в том числе флавоноидов, и уровень накопления лигнина. Показаны межсортовые различия по этим показателям.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Чередниченко М Ю., Чухнина Н.М., Камшонкова А С , Хромова Л М , Кочиева Е 3 Использование гена rsl для трансформации сортов картофеля // Тезисы Международной научно-практической конференции «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке» 24—27 июля 2000 г. - с 325.

2. Чередниченко МЮ., Камшонкова A.C., Чухнина НМ. Влияние условий прекультивации и векторных конструкций на эффективность регенерации различных сортов картофеля // Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». Брянск, 2-5 октября

2000 г.-с. 73-74

3. Чередниченко М.Ю., Чухнина НМ, Камшонкова АС. Получение трансгенных растений различных сортов картофеля, несущих ген дефензина rs-1 // Материалы научной конференции памяти Грегора Менделя 20 февраля

2001 г. - М.: Изд-во МСХА, 2001. - с. 151-152

4 Чередниченко М Ю. Создание трансгенных растений картофеля, несущих ген пептидного антибиотика дефензина // Доклады ТСХА. Вып. 273, ч 1. - М.: Изд-во МСХА, 2001. - с.18-22.

5. Чередниченко М.Ю. Трансформация сортов картофеля геном ас пептидного антибиотика дефензина // Материалы научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева. Москва, 26-27 февраля 2002 г. - М.: Изд-во МСХА, 2002.-с. 350-352.

6. .Чередниченко М.Ю., Вальдеррама Ромеро А.С. Получение трансгенных линий картофеля, несущих ген пептидного антибиотика // Аллоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений. - М.: Компания Спутник+, 2002. - с. 107-113.

7. Чередниченко М.Ю. Трансформация сортов картофеля генами дефензинов. // Материалы 2-й конференции МОГиС им. Н.И. Вавилова. Москва, 20-21 февраля 2003 г. Т.2. - с. 197-199

8. Чередниченко М.Ю. Эффективность регенерации при трансформации сортов картофеля // Известия ТСХА, 2003. Вып. l.-c. 108-115.

9. Чередниченко М.Ю., Денчик А.М., Кузьмина Н.А. Использование генов ингибиторов протеиназ для повышения устойчивости растений к биотическим стрессовым факторам // Тез. докл. IV Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». 31 марта 2004 г. — с.35-36.

10. Чередниченко М.Ю., Гладышко Т.О., Шейко И.А., Загоскина Н.В. Трансгенные растения картофеля и образование в них фенольных соединений // Сборник тезисов Международного симпозиума «Физиология трансгенных растений и проблемы безопасности», Москва, 29 ноября - 3 декабря 2004 г. -

с.35,

Объем 1,25 п. л.

Зах. 258

Издательство МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Тир. 100 экз.