Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и их роль в защитной системе растения

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и их роль в защитной системе растения"

005015347

Парфенов Игорь Александрович

ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ И ИХ РОЛЬ В ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЕ РАСТЕНИЯ

специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

12 мар гт

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

005015347

Работа выполнена в лаборатории биохимии протеолиза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Т. А. Валуева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Р. А. Звягильская доктор биологических наук, профессор М. А. Белозерский

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра РАН

Защита состоится «12.» марта 2012 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждение науки Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071,Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33. строение 1.

Автореферат разослан «££» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А. Ф. Орловский

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Протеолитические ферменты (протеиназы, протеазы или пептидазы) - это группа ферментов, которые катализируют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Регулирование активности протеиназ имеет решающее значение в обмене веществ животных и растений. Один из путей регуляции протеолитических ферментов включает присутствие в клетках животных, растений и микроорганизмов специфических молекул, подавляющих их активность, в том числе и белковой природы. Белки-ингибиторы протеиназ представлены во всех типах живых организмов, число видов которых составляет около двух тысяч [Rawlings et al., 2004].

Белковые ингибиторы протеиназ представляют собой большую и разнообразную в структурном отношении группу белков, способных образовывать стехиометрические комплексы с протеолитическими ферментами, в результате чего последние утрачивают ферментативную активность. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что структуры молекул белковых ингибиторов протеиназ, механизм ингибирования и природа их комплексов с ферментами крайне разнообразна [Валуева, Мосолов, 1999; Otlewski et al., 2005]. В связи с этим, изучение новых белковых ингибиторов представляет особый интерес.

В настоящее время известно несколько тысяч аминокислотных последовательностей белков, обладающих способностью ингибировать протеиназы [Rawlings et al., 2004]. Несмотря на то, что установлена структура большого числа ингибиторов и механизмы их взаимодействия с протеиназами, для большинства из них точная физиологическая функция не установлена или является малоизученной. Белковые ингибиторы протеиназ принимают непосредственное участие в регуляции многих биохимических процессов [Wei et al., 2009]. Так, в растениях они могут обладать несколькими функциями: выступать в роли запасных белков, контролировать активность эндогенных протеиназ, а также участвовать в защитных реакциях растений. Показано, что белки-ингибиторы растений способны in vivo подавлять активность экстрацеллюлярных протеиназ патогенных микроорганизмов и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых-вредителей [Lawrence, Koundal, 2002; Мосолов, Валуева, 2005]. В связи с развитием современных методов молекулярной биологии и генной инженерии по созданию растений, устойчивых к действию патогенов,

изучение белков-ингибиторов имеет важное не только теоретическое, но и практическое значение для сельского хозяйства.

К настоящему времени проведено много исследований и накоплено достаточное количество данных о белках-ингибиторах, представленных в картофеле (Solarium tuberosum L.), который является одной из важнейших мировых сельскохозяйственных культур [Bauw et al., 2006]. Часть этих белков объединяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz-type proteinase inhibitors). Установлено, что белки PKPI представлены многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и С-концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере, пять различных структурных групп, три из которых - PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C - относительно хорошо изучены [Ishikawa et al., 1994; Heibges et al., 2003; Bauw et al., 2006]. Однако структурные особенности белков PKPI, определяющие специфичность их взаимодействия с различными ферментами остаются малоизученными. Несмотря на то, что накоплено достаточное количество данных о свойствах белков PKPI, выделенных из клубней различных сортов картофеля, их первичная структура, как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически отсутствуют данные об их свойствах. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI является актуальной задачей современной биохимии. Кроме того, информация о структуре и функциях ранее не изученных белков, принадлежащих к данному семейству, а также генов, кодирующих их, позволит судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.

Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение из клубней картофеля сорта Юбилей Жукова и характеристика новых белков, действующих как высокоэффективные ингибиторы сериновых протеиназ, и кодирующих их генов, а также исследование взаимосвязи структуры и специфичности действия продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи.

1. Провести скрининг белков, обладающих способностью ингибировать сериновые протеиназы, в клубнях картофеля нового сорта Юбилей Жукова, созданного российскими селекционерами. Исходя из

полученных данных, идентифицировать белки, относящиеся к подсемейству PKPI.

2. Выделить высокоэффективный ингибитор сериновых протеиназ подсемейства РКР1 и охарактеризовать специфичность его действия на протеолитические ферменты: а-химотрипсин, трипсин, субтилизин и папаин. Установить N-концевую последовательность нового белка, изучить его физико-химические свойства и возможное участие в защитной системе картофеля.

3. Выделить и охарактеризовать «ДНК, кодирующую новый белок, выделенный из клубней картофеля. Для этого синтезировать олигонуклеотидные праймеры для амплификации кДНК из генома картофеля.

4. Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии выделенной кДНК в Escherichia coli. Получить рекомбинантный белок, кодируемый новой, ранее неизвестной кДНК, и охарактеризовать специфичность его действия на протеиназы.

Научная новизна и практическая значимость работы: Из картофеля сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок, обозначенный PKCI (potato Kunitz-type chymotrypsin inhibitor), который одинаково эффективно действовал на а-химотрипсин и трипсин и обладал способностью одновременно связывать оба фермента, образуя с ними тройные комплексы. Таким образом, выделенный белок PKCI, является «двуглавым» ингибитором трипсина и химотрипсина, который содержит два независимых и одновременно действующих реактивных центра.

Установлена N-концевая последовательность белка PKCI, что позволило отнести его к структурной группе PKPI-B. Исследованы физико-химические свойства белка PKCI и показано, что он обладает высокой термо- и рН-стабильностью. Показано, что ингибитор угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Вагу, поражающих растения картофеля. Это свидетельствует о возможном его участии в защитной системе растения.

Определена нуклеотидная последовательность кДНК, обозначенной как PKPIJ-B. Разработан метод экспрессии этой кДНК в Е. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделен, очищен и охарактеризован рекомбинантный белок PKPIJ-B. Показано, что рекомбинантный белок одинаково эффективно подавляет активность а-химотрипсина и трипсина и

5

так же, как и белок РКС1, обладает способностью образовывать с этими ферментами тройные комплексы. Сделано заключение, белок РКРи-В идентичен белку РКС1, который кодируется в геноме картофеля кДНК РКРМ-В. Сравнительный анализ восстановленных аминокислотных последовательностей белка РКС1 с последовательностями белков группы РКР1-В, присутствующих в клубнях различных сортов картофеля и действующих как ингибиторы протеиназ, показал, что наиболее вариабельным является С-концевой участок их молекул, расположенный между остатками Суэ147 и Суз164, в котором локализован реактивный центр, ответственный за связывание а-химотрипсина.

Сделано заключение, что в состав реактивного центра, ответственного за связывание трипсина, входят остатки Агд68-Р1те69, а в центре, ответственном за связывание химотрипсина, находятся остатки МеИ53-Бег154. Полученные данные позволяют сделать заключение, что отсутствие или присутствие определенных аминокислотных остатков в первичной структуре ингибиторов РКР1 определяет специфичность их действия.

Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченной к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009); XXII и XXIII Зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, 2010, 2011); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010" (Москва, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации" (г. Екатеринбург, 2010); I Всероссийской виртуальной интернет - конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии" (г. Казань, 2010); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Петрозаводск, 2011); Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, 8 тезисов в материалах конференций.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 135 страницах; содержит 22 рисунка и 6 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 232 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы.

В обзоре литературы рассматривается структура, механизм действия и функции сериновых протеиназ. Подробно рассматривается классификация, молекулярная структура и механизмы действия белковых ингибиторов протеиназ, а также их различные функции в растениях. Делается акцент на ингибиторах семейства SKTI, а также, подсемействе PKPI из картофеля.

Глава 2. Основные результаты и их обсуждение Выделение и очистка белка-ингибитора а-химотрипсина

Для первичного скрининга белковых ингибиторов, белки, осажденные сульфатом аммония (75% насыщения) из сока картофеля (S. tuberosum, сорт Юбилей Жукова), разделяли методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-75. В полученных фракциях измеряли ингибиторную активность по отношению к сериновым протеиназам.

В результате гель-хроматографии были получены три белковых компонента: I, II и III. В компоненте I присутствовали высокомолекулярные белки, большая часть которых является представителями семейства пататинов (М, - 50000). Белки, содержащиеся в компоненте II (Mr ~ 2025000), обладали способностью эффективно ингибировать а-химотрипсин. В состав компонента III входили белки (Мг - 10000), не действующие на а-химотрипсин.

Белки компонента II разделяли с помощью ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе CL-6B, уравновешенной 0,4 М Na-ацетатным буфером, рН 4,3. Связавшиеся с сорбентом белки элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCI от 0 до 0,5 М в стартовом буфере. Белки разделялись на три основных компонента, обозначенных как 1а, На и Ilia (рис. 1А, кривая 1). Все три белковых компонента эффективно подавляли активности а-химотрипсина и трипсина, в то же время значительно слабее действовали на субтилизин Карлсберг (рис. 1А, кривые 2-4 соответственно).

Диск-электрофорез полученных компонентов в Оэ-Ыа-ПААГ показал, что только компонент Ша, элюировавшийся при концентрации ЫаС!, равной 0,38 М, содержал единственный белок с молекулярной массой 23+1 кДа, молекула которого состоит из одной полипептидной цепи (рис. 1В). Это дало основание предположить, что выделенный белок является

ПААГ-электрофорез (Б) компонентов, обладающих активностью ингибиторов протеиназ

А - la,lia,Illa, - белковые компоненты, 1 - А2ао', 2-4 - активность ингибиторов трипсина, а-химотрипсина и субтилизина соответственно (в % от исходной активности фермента), в качестве субстратов использовали ВАРА, Suc-GGF-pNa и Z-AAL-pNa; 5 - концентрация NaCI [М].

Б - М - белки-маркеры, I - компонент la; II - компонент lia; III - компонент Illa.

Было изучено влияние белка PKCI на активность сериновых протеиназ (рис. 2), Ингибитор слабо подавлял активность субтилизина Карлсберг и не действовал на цистеиновую протеиназу, папаин (рис. 2, кривые 3 и 4 соответственно), но в равной степени эффективно подавлял активность а-химотрипсина и трипсина. Зависимости степени их ингибирования от количества внесенного ингибитора сохраняли линейный характер практически до полного угнетения (рис. 2, кривые 1 и 2). Расчеты показали, что с 1 молем ингибитора связывается 1 моль, как а-химотрипсина, так и трипсина.

Оказалось, что с а-химотрипсином белок РКС1 связывается несколько сильнее, чем с трипсином, поскольку для него линейный характер данной зависимости сохраняется на более протяженном участке вплоть до 85% ингибирования.

о/ /о

Рис. 2. Влияние белка РКС1 на активность трипсина (1), а-химотрипсина (2), субтилизина Карсберг (3) и папаина (4)

Измеряли остаточную активность ферментов (% от исходной) при различных соотношениях ингибитор/фермент. Для определения активностей трипсина, а-химотрипсина, субтилизина и папаина использовали в качестве субстратов ВАРА, Бис-ССР-рЫа, г-ААЬр!Ма и рСРЬрМа соответственно.

Расчет равновесных константы диссоциации (К|) комплексов а-химотрипсин/трипсин-РКС1 показал, что для а-химотрипсина значение К, рассчитанное при гидролизе Бис-СбР-рЫа (0,3 мМ), составило величину, равную 0,3 ± ОД нМ, а для трипсина - 1,2 ± ОД нМ при гидролизе ВАРА -(1,35 мМ) (табл. 1). Это подтверждает сделанное выше заключение о том, что белок РКС1 сильнее связывает а-химотрипсин, чем трипсин.

Таблица 1. Константы диссоциации (К!) комплексов РКС! с исследуемыми ферментами

Фермент (нМ)* Субстрат (мМ) Ki.hM

а-химотрипсин (13,95) Трипсин (4,71) Suc-GGF-pNa (0,3) ВАРА (1.35) 0,3+ ОД 1,2 ± ОД

* - реальные концентрации активных ферментов, определенные титрованием активных центров [Shonbaum et а!., 1961: Chase, Shaw, 1967].

МОЛЬ/ МОЛЬ

Рис. 3. ВЭЖХ белка PKCI (А) и его смесей С ферментами (Б и В) Оптическую плотность измеряли при 280 нм, Б - смесь эквимолярных количеств трипсина и PKCI: В- смесь эквимолярных количеств трипсина, а-химотрипсина и PKCI. Белки-маркеры. I - БСА (67 кДа), II - яичный альбумин (43 кДа), III - химотрипсиноген (25 кДа)

Определение молекулярной массы ингибитора и его комплексов с а-химотрипсином и трипсином

При ВЭЖХ ингибитор PKCI элюировался в виде одного гомогенного белкового компонента (рис. ЗА). Рассчитанное значение его молекулярной массы 23 ± 1 кДа соответствовало величине, определенной методом Ds-Na-ПААГ-электрофореза. Совпадение значений молекулярной массы, полученных двумя различными способами, подтверждало, что молекула белка состоит из одной полипептидной цепи.

При ВЭЖХ смесей, содержащих избыток белка PKCI и а-химотрипсин или трипсин, в элюатах присутствовали более тяжелые компоненты. Их молекулярные массы составляли величины 46 и 45 (± 1) кДа (рис. ЗБ), что практически равно сумме молекулярных масс белка PKCI и а-химотрипсина/трипсина, соответственно. Это указывает на то, что ингибитор взаимодействует с ферментами в соотношении 1:1, образуя с ними стехиометрические комплексы (моль/моль), устойчивые в условиях ВЭЖХ. При ВЭЖХ смесей, содержащих избыток белка PKCI, а-химотрипсин и трипсин, элюировался только один тяжелый компонент с молекулярной массой 63 ± 1 кДа (рис. ЗВ), представляющий собой вероятнее всего тройной комплекс ингибитора с ферментами, в котором с одной молекулой белка PKCI связывались одновременно одна молекула а-химотрипсина и одна молекула трипсина. Это давало основания предположить, что ингибитор является «двуглавым»

ю

Время удержания (мин)

и содержит два независимых реактивных центра, ответственных за связывание каждой из этих протеиназ. Определение Ы-концевой последовательности

Секвенированием по Эдману были установлены первые 20 аминокислотных остатков белка РКС1. На рис. 4 приведено сравнение его Ы-концевой аминокислотной последовательности с последовательностями белков: Р5Р1-21-6.3, РКТ1-22, РКБ1, Р1Н5, КР1 А-к1, КР1 В-к2 и Р1-2, выделенных из клубней картофеля сортов Истринский [Ревина и др., 2010; \Zalueva ег а1., 2000], РгоуНа [Не1Ьдез е1 а1., 2003], Кигаэ [Bauw е1 а1., 2006] и Е1капа [Роиугеаи е! а!., 2003] соответственно.

Белки РКР1 принято разделять на три структурные группы: РКР1-А, РКР1-В и РКР1-С ^зЫкам/а е1 а1., 1994]. Белки РКР1, относящиеся к указанным трем структурным группам, имеют различное строение (М- и С-концевых участков, а также обладают различной специфичностью действия на протеиназы [|БЫка\лга е1 а1., 1994].

Видно, что последовательности белков РКС1, РБР1-21-6.3, РКТ1-22 Р1Н5, КР1 В-к2 и Р1-2 значительно отличались от последовательностей белков РКБ1 и КР1 А-к1 (рис. 4), что указывает на их принадлежность к различным структурным группам ингибиторов РКР1. В работе [Ревина 2004] было показано, что белок РКБ1 входит в состав группы РКР1-С. Белок КР1 А-к1 входит в группу РКР1-А [Ваи\л/ е! а1., 2006]. В тоже время первые 9 аминокислотных остатков белков РКС1, Р5Р1-21-6.3, РКТ1-22, Р1Н5, КР1 В-к2 и Р1-2 полностью совпадали (рис. 4). Эти остатки обнаружены в последовательностях всех белков структурной группы РКР1-В и являются консервативными [^¡каша е1 а1., 1994]. Таким образом, белок РКС1 был отнесен именно к этой структурной группе.

7-Р801т?У1Л)УТ0КБШЙа5¥ РИС' 4" СРавнение концевых

последовательностей белков РКР1,

21РзсАТР\гсутото®1$у „ „

выделенных из клубней картофеля 3 1,Р80АТР\'10УгеК£Х0р1.$У различных СОртов и действующих как

* 1\'1РЕ¥\1>а08КР1ЯШЕКТ11 ингибиторы протеиназ

5 ШПАТР\'Цт0КБ10Ш1$У 1 - РКС1, 2 - РКТ1-22 [Ревина и др., 2010], 3 -

6 ЬР<;ОАТ;'У1,В1токрхт)$КГ.«У ^1-21-6.3 ^а1иеуа 01 а1- 200°1.4 - Р™ греБИНа

- г »сп, тэгг п ГТ/птг И ДР" 2004]' 5 ' Р1Н5 [Ие'Ь9е3 е< а1" 20031' 6 " КР'

В-к2 [Bauw е( а1„ 2006], 7 - Р1-2 [Роиугеаи е! а1., 5 Е^Р&РУЮТНекаНРЗ&ЗУ 2003], 8 - КР1 А-к1 [Bauw е( а1„ 2006].

Различающиеся остатки выделены серым цветом.

Определение рН и термостабильности белка РКС1

Были исследованы рИ- и термостабильность белка РКС1 (рис. 5) Видно, что при инкубации белка в течение 20 ч при различных значениях рН наблюдалось определенное снижение его активности по отношению к а-химотрипсину, наиболее выраженное при рН 2,0 и 12,0 (рис. 5а), где ее потеря составила 30 и 70%, соответственно.

Рис. 5. Зависимость активности белка PKCI по отношению к а-химотрипсину от рН (а) и температуры (б)

1 - инкубация при рН 6,0, 2 - инкубация при рН 2,0. В качестве субстрата использовали Suc-GGF-pNa. Измеряли степень ингибирования фермента (%) при соотношении ингибитор/фермент (моль/моль).

Нагревание белка PKCI в течение 10 мин при температурах от 50 до 90°С приводило к значительному снижению активности ингибитора по отношению к а-химотрипсину, как при рН 6,0, так и при рН 2,0 (рис.5б). При температуре 90^ ингибитор практически полностью терял свою активность. Таким образом, имеются все основания предполагать, что при сильно кислых и щелочных значениях рН, а также при высоких температурах среды белок PKCI теряет конформацию нативной молекулы.

Изучение фунгицидной активности белка PKCI

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что некоторые белки PKPI накапливаются в тканях клубней картофеля сорта Истринский при инфицировании оомицетом P. Infestans [Валуева и др., 2003]. Было показано, что эти белки in vitro не только подавляют активность экзопротеиназ, секретируемых патогенными микроорганизмами [Гвоздева и

12

др., 2004], но и угнетают их рост и развитие [Ревина и др., 2010]. В связи с этим было исследовано действие на рост и развитие фитопатогекных микроорганизмов белка РКС1, выделенного из картофеля сорта Юбилей Жукова, который обладает к ним повышенной устойчивостью. На рис. 6 представлены результаты изучения влияния белка РКС1 на рост гиф и развитие макроконидий гриба Р. си1тогит и зооспор оомицета Р. ¡п!ез1апз. Гриб Р. си1тогит вызывает у растения картофеля фузариозное увядание, а оомицет Р. /п/еБ/алх - фитофтороз.

Рис. 6. Влияние белка РКС1 на рост гиф и повреждение макроконидий гриба Р. си1тогит (а) и зооспор оомицета Р. /лfesfans (б)

1 - длина гиф; 2 - количество лизированных макроконидий или зооспор. Приведены средние значения трех независимых экспериментов со стандартной ошибкой от 2 до 10%.

На рис 6а, видно, что при добавлении 400 мкг белка РКС1 длина растущих гиф гриба уменьшалась на 60% по сравнению с контролем (кривая 1), при этом более чем 50% макроконидий оказывались поврежденными (кривая 2). При той же концентрации белка РКС1 длина гиф оомицета уменьшалась на 50% (рис. 66, кривая 1) и разрушению подвергались всего 30% его зооспор (рис. 66, кривая 2). Это свидетельствует о том, что белок РКС1 слабее действовал на рост и развитие оомицета чем актиномицета. На основании этого можно предположить, что данный белок наряду с другими известными факторами включен в защитную систему картофеля.

Характеристика генов, кодирующих ингибиторы PKPI-B в геноме картофеля сорта Юбилей Жукова.

Методом обратной транскрипции, используя мРНК как матрицу, выделенную из 2-х недельных проростков картофеля сорта Юбилей Жукова, была получена полная кДНК картофеля. Затем с помощью ПЦР со специфическими праймерами, синтезированными нами, была получена кДНК, обозначенная как PKPIJ-B. Последовательность нуклеотидов в этой кДНК характеризовалась высокой степенью сходства (от 95,2 до 96,6% идентичных н.п.) с генами PKPI-B9 (AY693424), PKPI-B10 (AF536175.1) [Сперанская и др., 2005], Р/-2 (AY166690) [Pouvreau et al., 2003], KP¡ B-k2 (DQ168333.1) [Bauw et a!., 2006], P1H5 (AF492359), P4D11 (AF4955584) и S1C1 (AF492769) [Heibges et al., 2003], которые были обнаружены в картофеле сортов Истринский, Elkana, Kuras, Provita и Saturna, соответственно. Однако она значительно отличалась от последовательности gCDI-Bl (Q41484) из сорта Danshaku, содержащей только 90,7% идентичных н.п. [Ishikawa et al., 1994]. Оценка степени сходства последовательностей генов и полученной кДНК PKPIJ-B, кодирующих белки PKPI-B в картофеле семи сортов, показала, что они содержат от 89 до 99% идентичных н.п. При этом, наиболее вариабельные участки последовательностей расположены в 5'-концевой части молекул. Анализируя положения замен нуклеотидов в этих последовательностях можно сделать заключение, что они локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации.

На рис. 7 приведено филогенетическое дерево, из которого видно, что сорта японской и европейской (в том числе российской) селекции находятся на разных ветвях «дерева», что соответствует гипотезе, предложенной в работе [Heibges et al., 2003], о высокой внутри- и межсортовой вариабельности белков PKPI. Действительно, замены в нуклеотидных последовательностях могут приводить к полиморфизму аллелей одного и того же генного локуса в геноме тетраплоидного картофеля

0.005

73

65

91

98

100

96

■ KPi B-k2

-P4D11

-S1C1

- PKPI-B9

• Pt-2

• P1HS -PKPIJ-B

- PKPI-B10

- gCDI-B1

Рис. 7. Филогенетическое дерево генов, кодирующих белки PKPI-B в различных сортах картофеля

Построено с использованием программы MEGA 4 по принципу максимального подобия. Числа в узлах ветвей (bootstraps) - индексы поддержки каждого узла, полученные при расчете 100-кратной повторности.

Гетерологичная экспрессия белка PKPIJ-B

Рекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка PKPIJ-B в Е. coli штамма BL-21(DE3), была создана на основе экспрессионного вектора рЕТ23а.

Продукт экспрессии, представляющий собой рекомбинантный белок PKPIJ-B, был обнаружен в основном в тельцах включения и в меньшем количестве в растворимой фракции клеточных белков Е. coli штамма BL-21(DE3). Молекулярная масса полученного рекомбинантного белка PKPIJ-B, определенная методом DS-Na-ПААГ-электрофореза, имела значение около 25 кДа, что совпадало с расчетной величиной. В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором рЕТ23а, не содержащим вставки, белковый продукт с такой молекулярной массой не был обнаружен.

Для получения рекомбинантного белка PKPIJ-B клетки Е. coli разрушали ультразвуком. Нерастворимая фракция с тельцами включения Е. coli была солюбилизирована в денатурирующем буфере. Наши предварительные эксперименты показали, что присутствие небелковых и белковых примесей отрицательно сказывается на процессе его ренатурации и низкому выходу целевого белка. В связи с этим денатурированные тельца включения были подвергнуты очистке от примесей на колонке (2,5x30 см) с Mono Q, уравновешенным 0,05 М Трис-НС1-буфером, pH 8,0, содержащим 7

15

М мочевину. Связанный с сорбентом материал элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере. Данная процедура позволила практически полностью отделить целевой продукт от белковых и небелковых примесей, содержащихся в клеточном лизате Е. coli.

Рефолдинг солюбилизированных белков телец включения Е. coli проводили путем диализа против 0,05 М Трис-НС1-буфера, pH 7,5 при 4°С в течение 24 ч. Ренатурированный белок PKPIJ-B дополнительно очищали до гомогенности методом анионообменной FPLC-хроматографии на ДЭАЭ-Toyopearl, уравновешенном 0,05 М Трис-НС1-буфере, pH 7,5. Связавшийся с ионообменником белокэлюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере.

По данным DS-Na-ПААГ-электрофореза компонент 1-1, элюировавшейся при 0,15 М NaCl, содержал гомогенный белок PKPIJ-B с молекулярной массой 25 кДа (рис 8А). Можно заключить, что молекула белка состоит из одной полипептидной цепи. Следует отметить, что молекулярная масса рекомбинантного белка несколько выше, чем у PKCI, выделенного из клубней картофеля. Это связано с присутствием дополнительных аминокислотных остатков, которые был введены при создании экспрессионной плазмиды.

Была исследована активность рекомбинантного белка PKPIJ-B по отношению к протеолитическим ферментам. Показано, что он эффективно подавлял активность а-химотрипсина и в меньшей степени трипсина (рис. 8Б).

Зависимость степени подавлении активности а-химотрипсина от количества добавленного ингибитора сохраняла линейный характер до достижения 80%-ного ингибирования (рис. 8Б, кривая 2). Расчеты показали, что 1 моль ингибитора стехиометрически связывался с 1 молем а-химотрипсина, а также с 1 молем трипсина.

Исследования при помощи ВЭЖХ, смесей, содержащих избыток рекомбинантного белка PKPIJ-B, а-химотрипсина и трипсина, элюировался только один тяжелый компонент с молекулярной массой 65 ± 1 кДа, представляющий собой вероятнее всего тройной комплекс ингибитора с ферментами, в котором с одной молекулой белка PKPIJ-B связывались одновременно одна молекула а-химотрипсина и одна молекула трипсина. Таким образом, рекомбинантный белок PKPIJ-B и выделенный нами из

16

клубней картофеля белок РКС1 обладают одинаковым характером действия на протеиназы и способны образовывать тройные комплексы, в которых одна молекула ингибитора связывается одновременно две молекулы а-химотрипсина и трипсина. Это с большой степенью вероятности I свидетельствует о том, что белок РКС1 идентичен рекомбинантному белку I РКРи-В.

! ® кДа

|

I 67,0

1 43,0

)

I 30,0

20,1 14,4

Рис. 8. А - ОБ-Ыа-ПААГ-электрофорез рекомбинантного белка РКРи-В (А) и его влияние (Б) на активность а-химотрипсина (1) и трипсина (2)

А: М - белки-маркеры, 1 - белок РКРи-В

Б: Влияние рекомбинантного белка на активность а-химотрипсина (1) и трипсина (2). Для определения активностей а-химотрипсина и трипсина использовали в качестве субстратов Зис-СвР-рЫа и ВАРА, соответственно.

4,8. Аминокислотная последовательность белка РКС1

На основании сравнения Ы-концевых участков белков РКС1 и РКРи-В, их молекулярных масс, а также действия на протеиназы с возможностью образовывать тройные комплексы позволило утверждать, что белок РКС1 кодируется в геноме картофеля выделенным фрагментом гена РКРЮ-В.

Сравнение аминокислотных последовательностей белков группы РКР1-В, приведенных на рис. 9, показало, что они содержат от 86,5 до 98,6% идентичных остатков, часть из которых является консервативной. Прежде

I 17

всего, это два консервативных остатка цистина, образующих дисульфидные связи, соединяющие остатки Cys49-Cys98 и Cysl47-Cysl64, первая из которых формирует большую пептидную петлю в N-концевой части молекулы, а вторая - малую в ее С-концевой части. Несмотря на высокое сходство первичных структур, рассматриваемые белки различаются по специфичности действия на а-химотрипсин и трипсин. Так, белок PSPI-21-6.3, который кодируется геном PKPI-B9, эффективно подавлял активность эластазы из лейкоцитов человека и значительно слабее действовал на трипсин и а-химотрипсин [Valueva et al., 2000]. Такой же специфичностью действия на протеиназы характеризуется белок PSPI-21-5.2, который кодируется гибридным геном, содержащем на З'-участке фрагмент гена PKPI-B9, а на 5'-участке - PKPI-A6 [Сперанская и др., 2005]. Белок PKTI-22, кодируемый геном PKPI-B10, является специфическим ингибитором трипсина [Ревина и др., 2010], а белки PKCI и Р1Н5 с одинаковой эффективностью действуют на а-химотрипсин и трипсин [Heibges et al., 2003].

Все белки, аминокислотные последовательности которых представлены на рис. 9, являются ингибиторами сериновых протеиназ и взаимодействуют с ферментами по «каноническому» субстратоподобному механизму. Молекулы ингибиторов этого типа имеют на своей поверхности специфическую структуру - «петлю связывания», в которой располагается пептидная связь Р1-Р1', образующая реактивный центр ингибитора.

Действительно, как видно на рис. 9, в аминокислотных последовательностях всех ингибиторов PKPI-B присутствует консервативный участок, окружающий остатки Arg68-Phe69, расположенные в большой пептидной петле. Показано, что они входят в состав реактивного трипсин-связывающего центра ингибиторов [Valueva et al., 2000]. Таким образом, в пространственной организации их молекул создаются условия для образования «канонической петли» связывания трипсина.

Как было установлено, белок PKCI способен одновременно связать молекулы трипсина и а-химотрипсина. Кроме того, белки Р1Н5, Kpi B-k2, P4D11, PI-2 и S1C1, обладают способностью действовать как на трипсин, так и достаточно эффективно на а-химотрипсина [Bauw et al., 2006; Heibges et al., 2003; Pouvreau et al., 2003]. Следовательно, второй реактивный центр, связывающий а-химотрипсин, должен присутствовать в их молекулах.

10 20 30 40 * 50 60 т 70 _I_I_I_I_11_I_±_|_

ЗНЬР80АТР71Е?*ЗХЕ1Ет8ШХ8«П13»13307*1б1зг53САРСА»^Г8^8С78Р88?Р^$883

5Ю?ЗВАТР7ЬС«5КЕ1Етзта113*ГвЗА133Ете1ЖР83ВА?СА5:(ЯГт8ЕТвР8в*Рфф888 6НЬ?80АТРПЕ«ЗКЕ1ЕВЯ18*КХ1818ЯвА133Ет8<8ШСА?С&$6»Г1!§!8ЕТЗРЗвТ?фа888 7НЬ?ЗЕА1Р711^3КЕ1г|я18Тй113еГйЗА133ЕП':з88?ХЗБАРСАКс1?51Х$Е~5?851?фй338 8ЫЬР8ЕА1г71Е«ЗХЕ1Е|кЬ8Га113*П13А133Е7У1318г!18ВА?гА!1с1?В|К8Е73?83Т?^£|г833 9НЬ?8ЕАТ?71Е^5КЕ-Е#513*Я118тЗА133Е7Х1318гаЗЕА?СА2!(яЫЬ:8ЕТ8?881?^1^888 »вЬ?8САГ?иЕШК81Е1К8Уа118Ш8А153Е7*18|з?Я8БАгСА*4?да8Е"в?88??Т|»5388

80 90 * 100 110 ф 120 130 140

__I_I * 1__1_±_I__I_|_

1 53Г5?й1?2еЕ12Г18П:13?ГК*С?8?Т 1«К73ЕГЕА8^3гИ11ЕТ88Г18С|Б8 8КШ7К38^3У!!

2 ЗЙГЗЙВ:ГЕЙ11Х1СГ)|18Г<(КЬГГЗг11«К73ЕУЕАЗЬ8^£?ввТХЗС*Е8 8ККК17К88ЯЗУК

3 ЗН?5?В1ГЕС-аг18ГЕ18г7К8С78Я1Х1178ЕтеАЗЬ«^ЬЕТ83НввеЕ38ЯКГТХ83»ЯГХ

4 Зй?3{£:?Е»Е1:Д1Сг;|13:|!&С73УГ1КК73ЕУЕАЗ^

5 ЗЕ?306ХГгК1^Ч8?»ХЗ:8к|г73УТХ5{КГ8ЕУЕА8^3ТК111ЕТ831138А:38-яР7.:7?.88гРЗП!

6 88?8РН1?Е^1518?ЕХ8гТЯ^8УР1!КтасгеАавг11Шг8аГ18С|^88НрГ7*ЗЗаКПг

7 82Г5Й1?Е^1^1С1»Х8г||4г78У118ЬТЗЕ?БА318ЖЛ£186Т18<Ж88В^17К88а^

8 8Н?30в:?Е1Е1^;1г?ЗИЗ:8Г.1.^'8УЛ8К73ЕУЕАП37Ш.1ЕГ381138»Е88йРК17К885ЬЗУХ

10 85Г8в11ГЕ«Е1Ш8я|18Тв!Лг73«1т8СУЕА8Ьбг1СХЕг8СТ13С|Б88КШ7К88Й|8У5

** 150 Ф 160 ,.,. 170 180 190

** I * ' ** '_I_I

гнусртгзч—Ь—880:<}::ьктз7?нсх8кавхА"н>ет;а|8гкд.-а-ЗььУС=тй--!:?ргзо:Е?сшз7|н5Х5КЯйЕА17кнхг:в78Г1!а7в-4иуе??тг-Н—88»Ейгг8к?5т»ЕСХ5тхА17»§:.-?:в7:г(^-.'— 5 [>тв:ог с>ззузтугС!!ЗкыйА17шг:ат8падг8-

6ЬЕУС?=§8-М-----0ЕЙ?;ЬЕ?57»й8УЗКК8и17«вХ?;а78.-К8:*Й-

7иуг??185й2СеГ88О:вГ:ЬК»37?ЯСХЗт!А17т-Р1ОТ85К07й-8иуг?та8^г1»Р381гв?г8ет87»й5хзкяй1А17М1хг1ВТ8гка7й-9х-у:г71|хИЬрр88ВЕйгсьхА37*нсхзкйкхА;7гах?:8У8ГЕ<г.-в-

Рис. 9. Сравнение аминокислотных последовательностей белков РКР1-В из различных сортов картофеля

1 - РКРи-В (РКС1), 2 - РЭР1-6.3 |Уа1иеуа е1 а!., 2000], 3 - РКТ1-22 [Ревина и др., 2010], 4 -Р5Р1-21-5.2 [\7alueva й а1„ 2000], 5 - Р1Н5 [НаЬдеэ « а!., 2003;], 6 - дСР1-В1 [1зЫка\л/а е1 а1„ 1994], 7 - КР1 В-к2 [Bauw й а1„ 2006], 8 - Р4011 [Не^деэ « а!., 2003], 9 - Р(-2 [Роиугеаи е1 а1., 2003], 10 - Б1С1 [Не^деэ е1 а1., 2003]. Аминокислотные остатки, идентичные во всех последовательностях, не окрашены, а различающиеся обозначены серым цветом. Вариабельные участки окрашены в бирюзовый цвет. Реакционные центры указаны стрелками, дисульфидные связи (СуБДЭ-СуБЭв и Су5147-Суз164)- * и **, соответственно

В работе [НаЬдеэ е1 а)., 2003] была продемонстрирована важность остатка МеП53, входящего в мотив ТИг152-МеИ53-ХХ-Рго156, для проявления ингибиторами РКР1-В, действующими на трипсин, также

активности по отношению к а-химотрипсину. Так оказалось, что удаление остатка МеИ53 в результате делеции в гене Р1Н5 приводило к значительному снижению активности белка по отношению к а-химотрипсину, при этом активность по отношению к трипсину оставалась неизменной. Это указывало на то, что остаток МейБЗ может входить в состав реактивного центра, связывающего а-химотрипсин и локализованного в «канонической петле», образующейся между остатками Суз147-Суз164.

В аминокислотной последовательности белка дС01-В1 в результате делеции в нуклеотидной последовательности кодирующей его ДНК также отсутствует остаток МеИ53. В молекуле белка РКТІ-22 этот остаток присутствует, но существуют препятствия для образования «канонической» петли связывания а-химотрипсина, поскольку между остатками Суэ147-СуБІ64 расположена еще одна дисульфидная связь Су$155-Суз158. И, действительно, белок дСРІ-ВІ не действует на а-химотрипсин [15Ыка\лга еі аі., 1994], а белок РКТІ-22 очень слабо подавляет активность этого фермента [Ревина и др., 2010]. Только в молекулах белков РКСІ, Р1Н5, Крі В-к2, Р4011, РІ-2 и БІСІ возможно образование «канонической» петли между остатками Суз147-Суз164, в которой локализован мотив ТЬг152-МеИ53-ХХ-Рго156, входящий в состав химотрипсинсвязывающего реактивного центра.

Таким образом, ингибитор а-химотрипсина и трипсина РКСІ содержит два независимых реактивных центра связывания ферментов. В одном из них локализованы остатки Агд68-Рґіе69, ответственные за связывание трипсина, в другом - МеИ53-5ег154, по которым связывается а-химотрипсин.

ВЫВОДЫ:

1. Из картофеля сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок, обозначенный как PKCI, эффективно подавляющий активность а-химотрипсина и трипсина. Белок PKCI содержал два независимо действующих реактивных центра и был способен одновременно связать оба фермента. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность белка PKCI, позволившая отнести его к группе белков-ингибиторов PKPI-B.

2. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК, обозначенной как PKPIJ-B. Полученный рекомбинантный белок PKPIJ-B действует на протеиназы аналогично белку PKCI. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что при развитии клубней картофеля белок PKCI кодируется кДНК PKPIJ-B.

3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки семейства PKPI-B в картофеле различных сортов, показал, что наиболее вариабельные фрагменты последовательностей расположены в 5'-концевой части молекул и локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации.

4. Восстановлена полная аминокислотная последовательность белка PKCI. Показано, что остаток Metl53 входит в состав реактивного центра связывания химотрипсина, который локализован в С-концевом участке между остатками Cysl47 и Cysl64.

5. Показано, что белок PKCI угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestaris (Mont.) de Вагу, поражающих растение картофеля, что свидетельствует об его участии в защитной системе растения при поражении этими патогенами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах

1. Ревина Т.А., Парфенов И.А.. Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина и трипсина из клубней картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 3. С. 265-272.

2. Парфенов И.А.. Ревина Т.А., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле II Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 4. С. 402-407.

3. Valueva Т.А., Parfenov I.A., Revina Т.А., Morozkina E.V., Benevolensky S.V. Structure and properties of the potato chymotrypsin inhibitor II Plant Physiology and Biochemistry. 2012. V. 52. P. 83-90.

Тезисы конференций

1. Ревина T.A., Кладницкая Г.В., Гвоздева Е.Л., Парфенов И.А., Валуева Т.А. Специфические ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и кодирующие их гены / Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченная к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Москва. 2009. Т. 1. С. 335.

2. Парфенов И.А.. Ревина Т.А. Белок-ингибитор трипсина и химотрипсина из клубней картофеля / Тез. XXII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2010. С. 48.

3. Парфенов И.А. Новый белок-ингибитор сериновых протеиназ из клубней картофеля / Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010". Москва. 2010. С. 60.

4. Парфенов И.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующий белок ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле I Всероссийская молодежная научная конференция с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации". Екатеринбург. 2010. С. 97.

5. Парфенов И.А.. Ревина Т.А., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина из клубней картофеля и кодирующий его ген /1 Всероссийская виртуальная

интернет - конференция "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий". Казань. 2010. С. 124.

Парфенов И.А. Молекулярное клонирование генов, кодирующих белки-ингибиторы сериновых протеиназ в картофеле / Тез. XXIII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2011. С. 52. Парфенов И. А.. Валуева Т.А. Новый ингибитор химотрипсина из клубней картофеля. Выделение, очистка и характеристика природного и рекомбинантного белков / V Российский симпозиум "Белки и пептиды". Петрозаводск. 2011. С. 289.

Парфенов И.А., Валуева Т.А. Исследование свойств нового ингибитора химотрипсина из клубней картофеля Solanum tuberosum / Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова". Москва. 2011. Т. 2. С. 52.

Подписано в печать 17 февраля 2012 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 97

Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Парфенов, Игорь Александрович, Москва

61 12-3/546

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Парфенов Игорь Александрович

ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ И ИХ РОЛЬ В ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЕ РАСТЕНИЯ

Специальность 03.01.04. - «Биохимия»

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

ВАЛУЕВА Татьяна Александровна

МОСКВА 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.................................................................................7

2. СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ И ИХ ПРИРОДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)..................................................................12

2.1. СТРУКТУРА СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ И МЕХАНИЗМ ИХ ДЕЙСТВИЯ..................................................................................12

2.2. БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ.....................................16

2.2.1. Классификация и распространение.......................................16

2.2.2. Молекулярная структура ингибиторов протеиназ.....................19

2.2.3. Механизм действия ингибиторов протеиназ...........................22

2.2.4. Ингибиторы сериновых протеиназ.......................................23

2.2.5. Геномная организация генов, кодирующих ингибиторы протеиназ в растениях.....................................................................................27

2.2.6. Семейство соевого ингибитора трипсина Кунитца (8КТ1)..........35

2.2.7. Ингибиторы протеиназ из картофеля....................................38

2.2.8. Функции ингибиторов протеиназ в растениях.........................42

2.2.8.1. Запасные белки растений..............................................42

2.2.8.2. Участие в контроле эндогенных ферментов.......................43

2.2.8.3. Участие в защитных механизмах....................................44

2.2.9. Заключение......................................................................51

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................53

3.1. Оборудование...........................................................................53

3.2. Реактивы и расходные материалы................................................53

3.3. Методы.................................................................................55

3.3.1. Выделение и очистка белкового ингибитора..........................55

3.3.1.1. Осаждение белков из клубней картофеля..........................55

3.3.1.2. Гель хроматография водорастворимых белков ...................56

3.3.1.3. Ионообменная хроматография белков..............................56

3.3.1.4. Определение концентрации белка...................................57

3.3.2. Определение ингибирующей активности белков по отношению к протеиназам...........................................................................57

3.3.3. Ds-Na-ПААГ-Электрофорез................................................58

3.3.4. Определение массы ингибитора и его комплексов....................59

3.3.5. Определение N-концевой последовательности белка................61

3.3.6. Определение термо - и pH-стабильности белка........................61

3.3.7. Определение фунгицидной активности белка-ингибитора..........62

3.3.8. Выделение РНК...............................................................62

3.3.9. Амплификация кДНК с помощью ОТ-ПЦР.............................64

3.3.10. Клонирование продуктов ПЦР...........................................65

3.3.11. Выделение плазмидной ДНК.............................................65

3.3.12. Электрофорез ДНК.........................................................66

3.3.13. Секвенирование продуктов ПЦР........................................66

3.3.14. Программное обеспечение, использованное для обработки результатов секвенирования и реконструкции нуклеотидных последовательностей амплифицированных генов............................67

3.3.15. Гетерологичная экспрессия белка......................................67

3.3.15.1. Создание генно-инженерной конструкции.......................67

3.3.15.2. Трансформация клеток E.coli экспрессионной плазмидой ....69

3.3.15.3. Оптимизация условий экспрессии.................................69

3.3.15.4. Препаративная экспрессия..........................................70

3.3.16. Выделение и очистка рекомбинантного белка РКРЫ-В............70

3.3.16.1. Ренатурация белка РКРП-В..........................................70

3.3.16.2. Хроматография рекомбинантного белка..........................71

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................72

4.1. Выделение и очистка белка-ингибитора а-химотрипсина...................72

4.2. Определение молекулярной массы ингибитора и его комплексов с а-химотрипсином и трипсином............................................................77

4.3. Определение К-концевой последовательности.................................79

4.4. Определение рН и термостабильности...........................................81

4.5. Изучение фунгицидной активности белка РКС1...............................82

4.6. Клонирование геномных нуклеотидных последовательностей, кодирующих ингибиторы РКР1-В в картофеле сорта Юбилей Жукова.........84

4.7.Гетерологичная экспрессия белка РКРИ-В.......................................90

4.8. Аминокислотная последовательность белка РКС1.............................96

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................103

6. ВЫВОДЫ...............................................................................106

7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ...107

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................109

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ЕС — классификация ферментов

SKTI - соевый ингибитор трипсина Кунитца (soybean Kunitz trypsin inhibitor)

PKPI - картофельные ингибиторы протеиназ типа Кунитца (potato Kunitz-type proteinase inhibitors)

BBI - ингибитор Бауман-Бирк (Bowman-Birk inhibitor)

PI-I - картофельный ингибитор I (potato inhibitor I)

PI-II - картофельный ингибитор II (potato inhibitor II)

BTI - ингибитор трипсина из ячменя (barley trypsin inhibitor)

SSI - ингибитор субтилизина из стрептомицетов {Streptomyces subtilisin inhibitor)

BPTI - ингибитор трипсина из панкреаса быка (bovine pancreatic Kunitz-type trypsin inhibitor)

CHFI - ингибитор фактора Хагемана из кукурузы (corn Hageman factor inhibitor)

SFTI-I - ингибитор трипсина из подсолнуха (sunflower trypsin inhibitor)

OMSVP3 — третий домен овомукоида выделенный из индейки (third domains of silver pheasant and turkey ovomucoid inhibitor)

CMTI - ингибитор трипсина из тыквы (Cucurbita maxima trypsin inhibitor) IP-3 - ингибитор пепсина 3 из Ascaris suum (Inhibitor of pepsine 3) WAP - сывороточный кислый белок (whey acidic protein)

TIMP - тканевый ингибитор металлопротеиназ (tissue inhibitor metallo-proteinase)

Tap - антикоагулянтный пептид клеща (tick anticoagulant peptide)

MIT - ингибитор трипсина из горчицы (Sinapis alba L.) (mustard inhibitor of trypsin)

WCI - ингибитор химотрипсина из крылатых бобов (winged bean chymotrypsin inhibitor)

МЖК - метилжасмоновая кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция

ETI - ингибитора трипсина из эритрины Erythrina caffra (Erythrina trypsin inhibitor)

HLE - эластаза из лейкоцитов человека (human leukocyte elastase)

HNE - эластаза из нейтрофилов человека (human neutrophil elastase)

PPE - панкреатическая эластаза свиньи (porcine pancreatic elastase)

Трис - трисгидроксиметиламинометан

Ds-Na - додецилсульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

ПСА - персульфат аммония

ТЭМЭД - тетраметилэтилендиамид

ВЭЖХ - высокоэффективная гель-хроматография

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфат.

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Протеолитические ферменты (протеиназы, протеазы или пептидазы) - это группа ферментов, которые катализируют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Они необходимы для жизнедеятельности всех организмов [58]. Очевидно, что регулирование активности протеиназ имеет решающее значение в обмене веществ животных и растений. Один из путей регуляции протеолитических ферментов включает присутствие в клетках животных, растений и микроорганизмов специфических молекул, подавляющих их активность, в том числе и белковой природы. Белки-ингибиторы протеиназ представлены во всех типах живых организмов, число видов которых составляет около двух тысяч [148, 176].

Белковые ингибиторы протеиназ представляют собой большую и разнообразную в структурном отношении группу белков, способных образовывать стехиометрические комплексы с протеолитическими ферментами, в результате чего последние утрачивают ферментативную активность. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что структуры молекул белковых ингибиторов протеиназ, механизм ингибирования и природа их комплексов с ферментами крайне разнообразна [6, 50]. В связи с этим, изучение новых белковых ингибиторов представляет особый интерес.

В настоящее время известно несколько тысяч аминокислотных последовательностей белков, обладающих способностью ингибировать протеиназы [176]. Несмотря на то, что установлена структура большого числа ингибиторов и механизмы их взаимодействия с протеиназами, для большинства из них точная физиологическая функция не установлена или является малоизученной. Считается, что ингибиторы протеиназ принимают непосредственное участие в регуляции многих биохимических процессов [222]. Так, в растениях они могут обладать несколькими функциями:

выступать в роли запасных белков, контролировать активность эндогенных протеиназ, а также участвовать в защитных реакциях растений. Показано, что белки-ингибиторы растений способны in vivo подавлять активность экстрацеллюлярных протеиназ патогенных микроорганизмов и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых-вредителей [15, 134, 153, 214]. В связи с развитием современных методов молекулярной биологии и генной инженерии по созданию растений, устойчивых к действию патогенов, изучение белков ингибиторов имеет важное не только теоретическое, но и практическое значение для сельского хозяйства.

К настоящему времени проведено много исследований и накоплено

достаточное количество данных о белках-ингибиторах, присутствующих в

клубнях картофеля {Solanum tuberosum L.), который является одной из

важнейших мировых сельскохозяйственных культур [32]. Часть этих белков

объединяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz-type

proteinase inhibitors). Установлено, что белки PKPI представлены

многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и С-

концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере,

пять структурных групп, три из которых - PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C -

относительно хорошо изучены [19, 32, 94, 107]. Однако структурные

особенности белков PKPI, определяющие специфичность их взаимодействия с

различными ферментами остаются малоизученными. Несмотря на то, что

накоплено достаточное количество данных о свойствах белков PKPI,

выделенных из клубней различных сортов картофеля, их первичная структура,

как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных

аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по

кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически

отсутствуют данные об их свойствах. Таким образом, исследование

взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI является актуальной

задачей современной биохимии. Кроме того, информация о структуре и

8

функциях ранее не изученных белков, принадлежащих к данному семейству, а также генов, кодирующих их, представляет значительный интерес, поскольку позволит судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.

Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение из клубней картофеля сорта Юбилей Жукова и характеристика новых белков, действующих как высокоэффективные ингибиторы сериновых протеиназ, и кодирующих их генов, а также исследование взаимосвязи структуры и специфичности действия продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи.

1. Провести скрининг белков, обладающих способностью ингибировать сериновые протеиназы, в клубнях картофеля нового сорта Юбилей Жукова, созданного российскими селекционерами. Исходя из полученных данных, идентифицировать белки, относящиеся к подсемейству PKPI.

2. Выделить высокоэффективный ингибитор сериновых протеиназ подсемейства PKPI, охарактеризовать специфичность его действия на протеолитические ферменты: а-химотрипсин, трипсин, субтилизин и папаин. Установить N-концевую последовательность нового белка, изучить его физико-химические свойства и возможное участие в защитной системе картофеля.

3. Выделить и охарактеризовать кДНК, кодирующую новый белок, выделенный из клубней картофеля. Для этого синтезировать олиго-праймеры для амплификации кДНК из генома картофеля.

4. Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии выделенной кДНК в Escherichia coli. Получить рекомбинантный белок, кодируемый новой, ранее неизвестной кДНК, и охарактеризовать специфичность его действия на протеиназы.

Научная новизна и практическая значимость работы; Из картофеля

сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок,

9

обозначенный PKCI, который одинаково эффективно действовал на а-химотрипсин и трипсин и обладал способностью одновременно связывать оба фермента, образуя с ними тройные комплексы.

Установлена N-концевая последовательность белка PKCI, что позволило отнести его к структурной группе PKPI-B. Исследованы физико-химические свойства белка PKCI и показано, что он обладает высокой термо- и рН-стабильностью. Показано, что белок PKCI угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Вагу, поражающих растения картофеля. Это свидетельствует о возможном его участии в защитной системе растения.

Определена нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей белок PKCI в геноме картофеля. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки структурной группы PKPI-B в картофеле различных сортов, показал, что наиболее вариабельные фрагменты последовательностей расположены в 5'-концевой части молекул и локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации.

Разработан метод экспрессии кДНК PKPIJ-B в Е. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделен, очищен и охарактеризован рекомбинантный белок PKPIJ-B, кодируемый в геноме картофеля сорта Юбилей Жукова кДНК PKPIJ-B. Показано, что рекомбинантный белок одинаково эффективно подавляет активность химотрипсина и трипсина и так же, как и белок PKCI, обладает способностью образовывать с этими ферментами тройные комплексы. Сделано заключение, что белок PKPIJ-B идентичен белку PKCI, который кодируется в геноме картофеля кДНК PKPIJ-В. Это открывает возможности использования выделенной кДНК для создания трансгенных растений, устойчивых к действию фитопатогенных микроорганизмов.

Сравнение аминокислотных последовательностей белков группы РКР1-В позволило высказать достаточно обоснованное заключение о природе и локализации реактивного центра связывания а-химотрипсина в С-концевой части молекулы белка РКС1, расположенной между остатками Суз147 и Суз 164. Таким образом, выделенный белок РКС1, является «двуглавым» ингибитором трипсина и а-химотрипсина, который содержит два независимых и одновременно действующих реактивных центра. В состав первого реактивного центра, расположенного в Ы-концевой части молекулы ингибитора и ответственного за связывание трипсина, входит А^68-РЬе69, во втором, локализованном в ее С-концевой части и ответственном за связывание химотрипсина, содержится МеИ53-8ег154. Полученные данные позволяют сделать заключение, что отсутствие или присутствие определенных аминокислотных остатков в первичной структуре ингибиторов РКР1 определяет специфичность их действия.

Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченной к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009); XXII и XXIII Зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, 2010, 2011); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010" (Москва, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации" (Екатеринбург, 2010); I Всероссийской виртуальной интернет - конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (Казань, 2010); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Петрозаводск, 2011); Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва, 2011).

2. СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ И ИХ ПРИРОДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

2.1. СТРУКТУРА СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ И МЕХАНИЗМЫ ИХ ДЕЙСТВИЯ

Сериновые протеиназы составляют одно из крупнейших суперсемейств гидролаз и объединяют около 200 ферментов [159]. Их характерной особенностью является то, что в состав активного центра входит остаток серина, играющий роль нуклеофила в каталитическом акте. Вследствие структурных особенностей сериновые протеиназы представлены в различных кланах, которые не имеют эволюционного родства. Кланы, в свою очередь, на основании гомологии аминокислотных последовательностей делятся на семейства [175]. В зависимости от расположения аминокислотных остатков в каталитическом центре выделяют 16 кланов сериновых протеиназ (8В, 8С, 8Е, ББ, БН, 81, 8К, 8Р, 8Я, 88, вТ, 8-, РА, РВ, РС). Кланы РА (Ъ/С), РВ (Б/С/Т), РС (Б/С) являются неоднородными и, помимо сериновых (8), содержат цистеиновые (С) и треониновые (Т) протеиназы. В настоящее время выделяют 47 семейств, относящихся к под-подклассу сериновых протеиназ [148]. Наиболее многочисленным и хорошо изученным является семейство химотрипсина 81, входящее в под-клан РА(8). В его состав входит более ста белков с различной функциональной активностью, первичная структура которых известна. Описано более сотни белков семейства 81 [58, 148]. Типичными представителями этого семейства являются а-химотрипси