Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и свойства белковых ингибиторов сериновых протеиназ и биоспецифические сорбенты на их основе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура и свойства белковых ингибиторов сериновых протеиназ и биоспецифические сорбенты на их основе"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Н. БАХА

</92 л/1

На правах рукописи УДК 577-156.02

ВАЛУЕВА Татьяна Александровна

СТРУКТУРА И СВОЙСТВА БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ И БИОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СОРБЕНТЫ НА ИХ ОСНОВЕ

(03.00.04 - биологическая химия)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва, 1990

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н. Баха АН СССР в лаборатории белковых регуляторов ферментов.

Официальные оппонент: доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент АН СССР, И.С.Кулаев,

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РСФСР, А.М.Безбородое, доктор биологических наук, профессор, академик АН ГССР, Г.И.Квеситадзе.

Вгдущзя организация: Межфакультетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова.

Защита состоится "_"___1Э90 г. в "to" часов

на заседании специализированного совета Д.002.96.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии мм. А.Н.Баха АН СССР (117071, Москва, В-71, Ленинский проспект, 33, корп.2),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Ленинский проспект, зз, корп.1).

Автореферат разослан "___1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

К.Л.Гладилин

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В течение последних десятилетий возникло и интенсивно развивается новое научное направление, основным предметом изучения которого являются природные ингибиторы протеиназ и их роль в регуляции процессов протеолиза. Протеолиз осуществляет многочисленные регуляторные функции, выступая в качестве "пускового механизма" в ряде важнейших физиологических процессов такта, как свертывание крови и фибринолиз, секреция белковых, веществ, развитие и дифференцировка, оплодотворение и т. д. (Neurath, Walsh, 1976; Davie, Fujikawa, 1975; Blobel, Dobber-stein, 1975; Cabib, Farkas, 1971; Meizel, Mukerji, 1975). Кроме того, протеолитические ферменты участвуют в процессинге белков у высших животных, бактерий, вирусов и фагов (Bernstein, 1974; Нег-shko. Fry, 1975; showe et al., 1976), в переносе белковых веществ через мембраны (Aiyappa, Lampen, 1977), в образовании белковых гормонов и других физиологически активных пептидов, а также активации зимогенов ферментов (Steiner et al., 1974; Takai et al., 1977). Один из механизмов регуляции активности протеолитических ферментов связан с присутствием. в тканях животных, растений и у микроорганизмов белков-ингибиторов протеаз. Общим свойством этих белков является способнос'ть образовывать с ферментами высскоассо-щшрованные комплексы, устойчивые при физиологических значениях pH. При этом ферменты полностью теряют свою активность. Поскольку белки-ингибиторы протеаз обнаружены практически у всех живых организмов, стоящих на разных ступенях эволюционного развития, очевидно, что механизмы регуляции.протеолиза с их участием являются в эволюционном отношении достаточно древними и, вероятно, наиболее универсальными.

Актуальность изучения белковых ингибиторов протеиназ обусловлена важными физиологическими функциями, которые они выполняют в кивом организме. Накоплено значительное число данных о защитной Функции ингибиторов протеиназ у животных и человека. Их действие направлено на нейтрализацию лизосомальных ферментов, играющих важную роль как в процессах фагоцитоза, так и развития различных патологических состояний (Janoíf, Blcdin, 1973; Schiessler et al., 1977). В растениях ингибиторы протеиназ, очевидно, участвуют в регуляции активности эндогенных' протеиназ (Белозерский и со-авт.,1902). Кроме тот, было высказано предположение, .что ингиби-

-г-

торы, локализованные в цитоплазме, могут предохранять белки растительной клетки от неконтролируемого протеолиза в случае повреждения внутриклеточных структур и освобождения протеиназ (Ваиш-garther, Chrispeels, 1976). В соответствии с последними данными ингибиторам протеаз принадлежит важная роль в защите растений от поражения насекомыми и фитопатогенными микроорганизмами (Ryan, 1973; Mosolov et al., 1976, 1979; Hilder et ab, 1987). В связи с этим изучение особенностей структуры и функциональной активности белковых ингибиторов протеаз, а также механизма их взаимодействия с ферментами является одной из фундаментальных проблем современной биохимии.

Среди высших растений наиболее богаты ингибиторами представители таких семейств, как бобовые, пасленовые и злаковые. У всех растений присутствуют, как правило, несколько белков-ингибиторов, и поэтому вполне вероятно предположить, что множественность форм ингибиторов отражает разнообразие их функций в организме. Одним из подходов к пониманию физиологических функций белковых ингибиторов протеиназ может послужить сравнительное изучение множественных форм, выделенных как из одного, так и из различных объектов, направленное на выяснение природа происхождения этих форм и выявление особенностей их структур!! и функциональной активности.

Не менее важны и -актуальны' практические аспекты изучения белковых ингибиторов протеиназ, которые определяются, в первую очередь, необходимостью решения ряда задач медицины, связанных с возможностью их использования в качестве терапевтических средств пролонгированного действия и гемосороентов для селективного удат ления из крови избытка протеолигических ферментов. Это обстоятельство стало особенно актуальным в последние годы, когда била выявлена ведущая роль протеолиза в генезисе таких тяжелых заболеваний человека, как сепсис, гнойный перитонит, панкреатит, почеч-но-печевочная недостаточность и другие (Moni, 196З; Иэсхина и со-авт., 1977). Кроме того, создание антипротеинззных сорбентов позволило бы решить ряд биотехнологических задач, связанных с использованием иммобилизованных белковых .ингибиторов протеиназ для получения высокоочищенных препаратов ферментов и удаления из многокомпонентных белковых систем протеиназ, обычно разрушающих белки в процессе их выделения.

Цели и задачи исследовать. Работа посвящена изучению свойств белковых ингибиторов протеиназ, выделенных из различных объектов.

выяснению особенностей их взаимодействия с протеиназами, поиску взаимосвязи между структурой и физиологической активностью ингибиторов, а также разработке теоретических подходов к созданию биоспецифических сорбентов на их основе.

Исходя из поставленной цели и учитывая, что в процессе выполнения работы необходимо было не только решить принципиальные задачи химии белка и энзимологии, но и синтезировать сорбенты для конкретного биомедицинского применения, общая схема исследования включала следующие этапы:

1. Разработка способов выделения и очистки белков-ингибиторов сериновых протеиназ из семян бобовых и злаковых растений, клубней картофеля и белка яиц птиц.

2. Изучение физико-химических свойств выделенных ингибиторов, химического состава, л- и С-кснцевых последовательностей и особенностей их пространственной структуры.

3. Изучение множественных форм ингибиторов и выяснение механизма их образования.

4. Изучение спектра действия ингибиторов на протеиназы и особенностей структуры образующихся комплексов с ферментами.

5. Исследование строения ферментсвязывающих центров ингибиторов.

6. Разработка подходов и поиск оптимальных условий синтеза иммобилизованных белков-ингибиторов протеиназ с минимальным изменением их активности.

В качестве источников для выделения ингибиторов использовали зрелые семена бобовых растений - фасоли {Phaaeolus vulgaris L.) сорта Tweed wonder и гледичии (Gledttsla trlacanthos I.), злаковых - кукурузы (Zea туз L.) сорта Днепровский 247, клубни картофеля сортов Любимец и Лорх и белки яиц утки Черри Велли.

Научная новизна работы. Решение поставленных задач позволило классифицировать белки-ингибиторы, выделенные из различных объектов, определить особенности происхождения мнонественных форм ингибиторов у бобовых и пасленовых растений, установить взаимосвязь между структурой и их функциональной активностью, а также сформулировать общие принципы регулирования свойств иммобилизованных белков.

В работе: 1) Выделены новые белки-ингибиторы сериновых протеиназ из семян фасоли, гледичии, кукурузы, клубней картофеля и белка яиц утки. Исследован их химический состав, N- и с-концевне

аминокислотные последовательности, физико-химические свойства, особенности пространственной структуры и спектр действия на ферменты. 2) Из семян кукурузы впервые выделен Селок-ингиОитор микробных сериновых протешшз, который имеет субъединичную структуру и образует с ферментами комплексы различного состава. 3) Показано, что наличие множественных форм ингибиторов сершювых нротеи-наз в семенах исследованных бобовых растений и клубнях картофеля не является следствием протеолитической деградации одной или нескольких исходных форм, а обусловлено генетическими причинами и, по-видимому, связано с разнообразием функций, выполняемых этими белками ln viva. 4) Для выделенных ингибиторов определено число и структура ферментсвязывавщих центров. Показано, что специфичность действия на ферменты ингибиторов, принадлежащих к одному семейству родственных белков, определяется, в первую очередь, природой аминокислотного остатка, находящегося в положении Р1 ферментсвязывэкщего центра. 5) Впервые для ингибиторов серино-еых протеиназ, имеющих несколько ферментсвязывавщих центров, обнаружено, что структура комплексов ингибитора с ферментами зависит от порядка присоединения последних, при этом способность ферментов связываться с каждым центром определяется состоянием остальных. 6) Сформулирован и экспериментально проверен общий подход к созданию специфических антипротеиназных гемосорбентов* заключающийся в иммобилизации белкоЕого ингибитора сериновых протеиназ в объеме синтетического гидрогеля. 7) Сформулирован подход к направленному регулированию структуры, а следовательно,и активности растворимых иммобилизованных производных белков-ингибиторов путем подбора полимера-носителя. 8) Исследована применимость разработанных подходов для решения биотехнологических задач по получению высокоочищешшх 11репаратов протеолитических ферментов.

Практическая значимость работы. Сформулированные в работе общие подходы к иммобилизации белкових ингибиторов сериновых протеиназ легли в основу создания нового поколения высокоспецифических гемосорбентов. На гемосорбент "ОвосорО", содержащий иммобилизованный в объеме полиакриламидного геля овомукоид из белка утиных яиц, разработана и утверждена научно-техническая документация, проведены широкие медико-биологические исследования на животных и на ПО "Белыедпрепарагы" выпущена опытная партия сорбента, которая успешно ироыла клинические испытания. Внедрение сорбента "ОвосорО" открывает перед медициной широкие возможности для

перехода от применения угольных гемосорбентов к использованию высокоэффективного, гемосовместимого и специфического сорбента, действие которого направлено на селективное извлечение протеиназ из крови больных при лечении острых заболеваний.

Разработанные подходы к синтезу водорастворимых полимерных производных ингибиторов сериновых протеиназ могут быть положены в основу создания лекарственных препаратов пролонгированного действия для лечения хронических заболеваний, требующих многократной антипротеиназной терапии.

На основе применения иммобилизованных ингибиторов протеиназ разработаны простые и эффективные методы разделения и очистки ряда протеолитических ферментов растительного и микробного происхождения, имеющих важное значение в медицинской практике и других областях народного хозяйства.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на х конференции ФЕБО (Париж, 1975), Э-ем Всесоюзном симпозиуме "Структу-тура и функции активных центров ферментов "-(Пущино-на-Оке, 1976), г и 5-ом Всесоюзных симпозиумах по химии белков и пептидов (Минск, 1977; Баку, 1980), 2, з, 4, 5 и 6-ом Всесоюзных симпозиумах "Инженерная энзимология" (Абовян, 1977; Ленинград, 1980; Киев, 1983; Кобулетти, 1985; Вильнюс, 1988), 2-ом Всесоюзном симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Углич, 1979), 5, 7 и з-см Всесоюзных симпозиумах "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Рига, 1981; Минск, 1985; Киев, 1989), 4-ой Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов" (Рига, 1982), Всесоюзной конференции по аффинной хроматографии (Вильнюс, 1982), 4-ом Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзи-мологии (Алма-Ата,1983), 2-ом Мевдународном симпозиуме "Молекулярная и клеточная регуляция ферментативной активности" (Халле,

1986), 7-ом Международном симпозиуме по гемосорбции (Киев, 1986), 3-ем Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции лизосом" (Тбилиси, 1986), 2-ой Всесоюзной конференции "Новые источники пищевого белка" (Кобулетти, 1986), з-ей Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1987), 4-ом Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата, 1987), 30-ом Микросимпозиумё ИШАК по макромолекулам (Прага,

1987), 4-ой Международной Конференции по химии и биотехнологии биологически активных природных продуктов (Будапешт, 1997). Всесоюзной конференции "Выделение, очистка и анализ биологически ак-

тившх соединения "(Сухуми, 1987), Международном симпозиуме по инженерной энзимологии (Братислава, 1988), 8-оы Международном симпозиуме по биотехнологии (Париж, 1988), расширенном заседании Ученого совета Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (1989).

Работа на различных этапах ее выполнения отмечена премиями за лучшую научную работу Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 70 печатных работ и получено з авторских свидетельства СССР.

Вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследования, методического подхода и обобщения полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах разработок от постановки задачи и эксперимента, проведения самого эксперимента и до обсуждения полученных результатов.

2. Белки-ингибиторы трипсина и а-химотрипсина из бобовых растений.

На основании общности свойств и гомологии первичной структуры природные ингибиторы протеиназ было предложено относить к нескольким семействам родственных белков (Laskowski, Kato, 1980). Среди растений особенно высоким содержанием ингибиторов трипсина и а-химотрипсина характеризуются представители бобовых. Семейство бобовых растений по классификации Хатчинсона (Hutchinson, 1969) по морфологическим признакам делят на три отдельных семейства: Fäbaceae или Papllionaceae (мотыльковые), Щпозасеае (мимозовые) и Cœaalplnteae (цезальпиниевые). Цезальпиниевые в эволюционном плане объединяют наиболее древних, а мотыльковые - наиболее молодых представителей бобовых. Ингибиторы, содержащиеся в этих растениях, принято делить на два семейства (типа): семейство ингибитора Баумана-Бирк (ВВГ) и семейство ингибитора Кунитца (STI). Анализ литературных данных показал, что большинство растений, принадлежащих мотыльковым, содержат белки-ингибиторы как типа BBI, так и типа STI. В то же время б семенах шелкового дерева и ряда других представителей семейства мимозовых были обнаружены только ингибиторы типа STI. В целях выяснения вопроса, может ли наличие или отсутствие ингибиторов определенного типа служить таксономическим признаком у бобовых, было проведено изучение ингибиторов трипсина и а-химотрипсина в семенах фасоли и гледичии-Первое из растений принадлежит к семейству мотыльковых, а второе - цезальпиниевых.

Мпожествешше формы ингибитора трипсина и а-хлмотрипсина в семенах фасоли. Препарат ингибитора трипсина, полученный в результате аффинной хроматографии на трилсин-сефарозе водного экстракта из семян фасоли, по данным фракционирования с помощью метода изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле (ПЛАТ) в диапазоне рн з-ю и в градиенте плотности сахарозы в диапазоне рн 4-6 содержит четыре белковых компонента с р1 4,3, 4,5, 4,7 и 5,1 (ИТФ-4,3, ИТФ-4,5, ИТФ-4,7 и ИТФ-5,1), причем все они обладают высокой активностью по отношению,к трипсину (рис.1).

Рис.1. Изоэлектрофокусирование ингибитора трипсина из фасоли в градиенте плотности сахарозы и рн 4-6 (А) и ПААГ в интервале рН 3-9 (Б). 1 - А280, г - рн; з - активность (Ж); а - суммарный препарат; О - ИТФ-4,3; б - ИТФ-4,5; г - ИТФ-4,7; 3 - ИТФ-5,1.

Образование множественных форм белков-ингибиторов протеиназ может быть обусловлено как генетическими причинами, так и возмож-' костью происхождения различных форм из общего предшественника в результате ограниченного протеолиза. Например, некоторые из форм ингибиторов трипсина и химотрипсина, обнаруженные в семенах маша, образуются путем отщепления Н-концевых фрагментов от одной или двух исходных форм под действием эндогенной сериновой протеиназы семян (Ьогепзеп et а1., 1981). В то же время, по крайней мере, четыре из шести ферм ингибитора трипсина и химотрипсина, полученные из семян нута методом аффинной хроматографии, возникли в результате частичного протеолиза молекул белка иммобилизованной-

протещазой в ходе очистки (ВеХете е1; а!., 1975; ВеХеи, 1977), Поскольку те же четыре актившх компонента ИТФ были выделены из семян фасоли методом, исключающим стадию аффинной хроматографии (гель-хроматография экстракта и последующее изоэлектрофокусирова-ше), то это свидетельствует о том, что множественные формы ингибиторов трипсина первоначально присутствуют в экстракте семян, а не возникают в результате протеолитической деградации на стадии аффинной хроматографии.

Значения" М всех четырех форм ингибитора, определенные с помощью диск-электрофореза в присутствии вэ-Ыа и гель-хроматографии при рН 2,0, близки и равны приблизительно 10000.'В то же время значение м^ М'Ф-4,3, рассчитанное из данных гель-хроматографии при рН 8,0, составляет величину 18000 ± юоо. Это свидетельствует о способности молекул белка к обратимой рН-зависимой димеризации, характерной для молекул белков-'ингибиторов семейства ВВ1 (В1гк, 1987).

Белки близки по аминокислотному составу (табл.1); они характеризуются, прежде всего, высоким содержанием остатков цистеина (14 остатков на молекулу с мг юооо). При титровании з^-дитио-Оис-(2-нитробензойной кислотой) (реактивом Эллмана) (Е1Хтап, 1966) нативных ингибиторов не было обнаружено свободных сульфгид-рильннх групп. Это позволило заключить, что эни входят в состав дисульфидных связей, число которых равно семи на молекулу каждой формы ингибитора. Для всех форм характерно низкое содержание ароматических аминокислот и аминокислот с боковыми цепями гидрофобного характера. Совокушюсть свойств позволяет отнести выделенные ингибиторы к семейству низкомолекулярных ингибиторов типа ВВ1, стабильная конформация нативных молекул которых поддерживается за счет высокого содержания дисульфидных связей.

Различия в аминокислотном составе форм невелики. ИТФ-4,5 и ИТФ-4,7 содержат остатки метионина и валина, отсутствующие у других форм. Кроме того, отдельные белки различаются по содержанию остатков серина, асларагиновой и глутаниновой кислот, иролина, глицина, изолейцина и гистидина.

Ингибиторы из фасоли, как и большинство ингибиторов типа ВВ1, имеют различающиеся н-концевыэ аминокислотные последовательности, которые установлены для трех белков; у двух из них. с помощью метода Эдмша идентифицировано 6-7 аминокислотных остатков, а у • ИТФ-4.3 с помощью автоматического секЕенироваиия - 23 остатков:

ИТФ-4,5 -

ИТФ-5,1 - K-I-G-E-{P45_-Ej...

ИТФ-4,3 - Н-QJP-tT-D-I-P-C-E-A-L-K-A-O-C-D-S-C-A-C-T-K-S-I-P-

1 10 20 -A-E-C-R-.•* 29

Таблица 1.

АлхмокислотнМ состав ингибиторов трипсина и а-хилотрипсина из селян бобовых

Амино- Ч и с_л .0___0. с_т_а _т_к_о _в___н_а___M о л е кулу

кислота 1 г 3 4 5 6 7 8 9 10

Asp 16 П 11 13 12 16 16 16 17 26

Ihr 7 в S 6 2 6 6 6 7 7

Ser 16 15 16 в 8 15 15 15 13 11

от 5 5 7 9 7 18 18 18 15 18

Pro 6 5 6 7 6 15 15 16 13 10

Oly 2 г 3 5 0 20 20 20 22 16

Ala 5 3 4 4 4 8 8 9 10 8

Val 0 1 0 1 1 14 14 13 11 14

1/2 Суз 14 14 14 14 14 4 4 4 4 4

Met О 2 0 1 1 2 2 2 1 2

Ile 8 4 '4 4 2 13 13 13 9 14

leu 3 3 3 3 2 17 16 7 15

Туг 2 1 1 2 2 5 6 5 10 9

Phe 1 2 1 1 2 7 7 7 4 4

His 6 6 6 6 5 14 14 14 10 Ю

Lys 5 4 5 6 1 3 3 3 3 2

Arg 2 4 3 3 2 8 8 8 8 9

Тгр 0 0 0 0 0 1 1 1 1 2

Общее число остатков 96 95 90 94 71 186 187 186 164 181

Молекулярная масса 10100 1 0200 9170 10200 8000 20200 20400 20200 17700 201СХ

*) 1-4 - белки-ингибиторы из фасоли: 1 - ИТФ-4,3. 2 - ИТФ-4,5, 3-ИТФ-4,7, 4 - ИТФ-5,1; 5 - BBi (Odani, IKenaka, 1972); 6-9 -ингибиторы из гледичии: б - ИТГ-5,7, 7 - ИТГ-5,9, 8 - ИТГ-6,1; 9 - ИХГ, 10 - STI (Koide, Ikenaka, 1973). ■ В случае ИТФ-4,7 не удалось идентифицировать N-концевой ами-

нокислотшй остаток с помощью метода Эдмана. Это может быть связано с присутствием у белка в этом положении ацилированного аминокислотного остатка или остатка пироглутаминовой кислоты. Следует отметить, что последний обнаружен в качестве н-концевого у ряда ингибиторов протеиназ, выделенных из растений (Haas et ai., 1975; Richardson, 1979).

При сравнении N-концерых аминокислотных последовательностей обращает на себя внимание гомологичное расположение остатков про-лина у трех форм ингибитора. Это, а также сравнение аминокислотного состава выделенных ингибиторов исключают возможность их возникновения из одной или двух первоначально присутствующих в семенах фасоли форм в результате ограниченного протеолиза и свидетельствуют в пользу того, что их образование обусловлено генетическими причинами и они являются истинными изоингибиторами.

Ингибиторы из семян фасоли эффективно подавляют активность трипсина и а-химотрипсина, но не действуют на панкреатическую эластазу, субтилизин и протеиназы Str.griseus, Sac.cerevtalae, Asp. oryzae.' Константы диссоциации комплексов различных форм ингибитора с трипсином и а-химотрипсином, рассчитанные по методу Грина (Green, Work, 1953), составляют величины 1,2х10~10 и 0,5х

х10~9М; 0,8х10~8 И 1 ,5ПО~9М; Э,2х10~9 И 2,3x10"%; 1,5х10~9И — 1 п

2,2x10 М, соответственно для ИТФ-4,3, ИТФ-4,5, ИТФ-4,7 И ИГФ-5,1. Таким образом, ИТФ-4,5 и ИТФ-5,1 являются более эффективными ингибиторами а-химотрипсина, чем трипсина. Можно предположить , что действие ингибиторов in vivo направлено на подавление активности ферментов с различной тринсино- и химотрипсиноподобной специфичностью.

Множественные формы ингибиторов трипсина и а-химотрипсина в семенах гледичии. Ингибиторы трипсина (ИТГ) и а-химотрипсина (ИХГ) из гледичии (Gledltsta trlacanthou L.) были выделены из водного экстракта семян гледичии методом аффинной хроматографии последовательно, сначала на иммобилизованном трипсине, а затем на иммобилизованном а-химотрипсине. По данным диск-электрофореза в присутствии cs-Na (рис.2) оба ингибитора Еедут себя как гомогенные белки с мг около гоооо. Аналогичные результаты получены при гель-хроматографии препаратов ингибиторов при рн 8 и 2. Это свидетельствует о том, что в семенах гледичии полностью отсутствуют низкомолекулярные формы ингибиторов.

По данным изоэлектрофокусирования ингибитор трипсина преде-

тавлен тремя молекулярными формами с р1 5,7, 5»9 и 6,1 (ИТГ-5,7, ИТГ-5,9 и ИТГ-6,1, соответственно (рис.з).

2 - «а» Рис. 2. Диск-электрофорез

3 _ ^ ингибитора трипсина (А) и

ингибитора а-химотрипсйна

4 - -» (Б) из гледичии в 20 Ж-ном

ПЛАТ в присутствии СБ-Па и ^ ' р-меркаптоэтанола, а- бел-

6 —- — ки-маркерн, Мг*. 1 - 94000,

а А в г - б7ооо, з - 43000, 4 -

30000, 5 - 20100, 6-14400.

Рис.з. Изоэлектрофокусирование ингибитора трипсина из гледичии ' в градиенте плотности сахарозы и рН 5-7 (А) и ПААГ в интервале рН 4-6,5 (Б)! 1 - а280, 2 - рН; а - исходный препарат, б - ИТГ-5,7, 6 - ИТГ-5,9, . г - ИТГ-6,1.

Все три белка одинаково эффективно подавляют активность трипсина, константы диссоциации комплексов этих ингибиторов с трипсином составляют величину (1,1 ± с,з) х ю-10 м.

При определении и- и с-концевых аминокислотных последовательностей белков обнаружена полная идентичность .пяти первых остатков в и-концевом и пяти последних остатков в с-концевом положении их

молекул: (d/h)-í-v-l-(d/n)-.*. .-b-q-L-y-y.

Анализ аминокислотного состава множественных форм ингибиторов (табл.1) выявил небольшие различия в содержании остатков фенил аланина, валина, аланина, пролина и лещина.

При изучении пептидных карт триптических гидролизатов восстановленных и карбоксиматшшровашшх белков били обнаружены незначительные различия в первичной структуре молекулярных фора. Двадцать из 24-25 пептидных фрагментов, образующихся в результате гидролиза ИТГ-5,7, ИТГ-5,9 и ИТГ-6,1 трипсинам, оказались идентичными, а 4-5 пептидов различались до своему положению на хрома-тограммах. В то же время ни прямой, ни конкурентный иммунофермен-тный анализ не выявили достоверных различий иммунологических свойств трех форм ингибитора трипсина. Это свидетельствует в пользу значительной гомологии первичных структур выделенных белков.

Результаты сравнительного изучения множественных форм ингибитора трипсина позволяют заключить, что их образование не может быть результатом посттрансляционной протеолитической модификации исходной общей молекулы ингибитора, а также результатом ограниченного протеолиза ингибитора в процессе выделения на иммобилизованном трипсине. Небольшие различия в первичной структуре локализованы во внутренних участках аминокислотных последовательностей молекул. Следовательно, возникновение всех трех форм ингибитора обусловлено генетическими причинами и они являются истинными изо-ингибиторами. Высокая степень гомологии первичных структур, а также идентичность функциональных и иммунологических свойств позволяет предположить, что в основе их образования лежит множественность аллелей одного генного локуса.

Ингибитор а-химотрипсина из семян гледичии представлен двумя множественными формами с изоэлектрическими точками при pH 5,7 и 5,1. Количественно преобладающая форма с pi 5,1 была выделена в гомогенном состоянии. Определены ее н- и с-концевые последовательности ; G-X- ( D/N ) -А- ( E/Q ) -... -Ii-F.

Аминокислотный состав ШСГ-5,1 приведен в габл.1. Видно, что состав этого ингибитора и ингибиторов трипсина из гледичии характеризуется рядом черт, общих для ингибиторов семейства STI. Они так же, как STI, содержат по две дисульфидиые связи на молекулу и характеризуются высоким содержанием остатков гидрофобных аминокислот (Pro, Gly, Val, beu, Ile). Доля неполярных боковых цепей, рассчитанная по методу Бигелоу (Bigeiow, 1967), составляет для

итг-о,э9, для ихг - 0,34 и для sti - о,29. В то же Бремя ингибиторы из гледичии сильно отличаются по аминокислотному составу от ингибиторов из фасоли и других ингибиторов семейства bbi. Эти отличия в первую очередь вырзжаются в низком содержании остатков цистина и более высоком содержании аминокислот с боковыми цепями гидрофобного характера, доля которых у итф-4,3 равна 0,22, а у bbi - 0,21. Возможно, что из-за меньшего числа дасульфидных связей для поддержания стабильной конформации ингибиторов из гледичии большое значение имеют гидрофобные взаимодействия.

Таким образом, на основании величины молекулярной массы и особенностей аминокислотного состава ингибиторы из гледичии следует отнести к семейству родственных белков, типичным представителем которого является sti. Поскольку при гель-хроматографии и электрофорезе в диссоциирующих условиях препаратов ингибиторов не обнаружено белков с мг ниже гоооо, то можно сделать вывод, что' в семенах гледичии полностью отсутствуют ингибиторы протеиназ семейства BBI.

ИТГ эффективно действует на трипсин, образуя с ферментом эк-вимолярный комплекс, но слабо нестехиометрически подавляет активность а-химотрипсина. По характеру действия на эти два фермента ингибитор из гледичии напоминает STI (Kunitz, 1946; Wu, Las-kowski, 1955) -

Как следует из данных, приведенных на рис. 4, ингибирование а-химотрипсина ИХГ носит конкурентный характер и зависит от природы субстрата, используемого для определения ферментативной активности. В случае неспецифического субстрата а-химотрипсина этилового эфира и,а-бензоиларгинина (ВАЛЕ) кривая ингибирования имеет линейный характер до достижения 60 % ингибирования. Полная потеря активности а-химотрипсина имеет место при молярном соотношении ингибитор/фермент 1,2:1, что можно рассматривать как свидетельство образования эквимолярного комплекса ингибитора с ферментом. При использовании для определения остаточной ферментативной активности казеина или специфического субстрата этилового эфира N.o-бензоилтирозина (втее) ингибирование имеет нестехиометричес-кий характер. Подобный характер ингибирования наблюдали для ряда других ингибиторов протеиназ (Bieth, 1980). Возможна, что субст-ратзависимая диссоциация комплекса ингибитора с ферментом имеет важное значение для регуляции процессов протеолиза In vivo (Barth et al., 1978). Данные гель-хроматографии комплексов ИХГ с а-химо-

' -14- : .

трипсином, образующихся в условиях как избытка фермента, так и избытка ингибитора, свидетельствуют о том, что молекула ингибитора может связать одну молекулу фермента.

Рис.4. Действие ингибитора а-химотрипсина из семян гледичии на активность (%) а--химотрипсина. В качестве субстрата . для определения активности фермента исполь-. зовали ваее (1), казеин (2) и втее (3).

-—I-1-1—

6 12 1а моль ингибитора

моль фермента

Как изоингибиторы трипсина, так и ингибитор а-химотрипсина из гледичии не действуют на иротеиназы микроорганизмов. В то же время ингибиторы трипсина подавляют активность нлазмина и тромбина человека, Ингибитор а-химотрипсина, не действующий на бычий трипсин, не активен по отношению к плазмину и тромбину человека. 00а ингибитора эффективно подавляют активности трипсшю- и химо-трипсиноподобных ферментов пилорических придатков лососевых рыб. Следует отметить, что в отличие от избирательного действия ингибиторов из гледичии на бычий трипсин и а-химотрипсин, действие их на панкреатические протеиназы лососевых одинаково. Это может свидетельствовать о значительно большем сходстве субстратсвязывающих участков у трипсина- и химотрнпсиноподобных ферментов рцб, чем у трипсина и а-химотрипсина высших животных.

Как И'ГГ, так и ИХГ не оказывают влияния на активность панкреатической эластазы свиньи, но эффективно подавляют активность лейкоцитарной эластазы человека.

Таким образом, по характеру действия на ферменты ингибиторы из гледичии можно отнести к группе высокомолекулярных ингибиторов протеиназ тина ингибитора Куштца.

Сходство физико-химических свойств, аминокислотного состава и характера действия на ферменты И'ГГ и ИХГ позволяет высказать предположение, что они являются изоингиОиторами, хотя и обладают различной специфичностью. Для того, чтобы выяснить, чем определя-

100 г

ются различия функциональной активности этих родственшх белков было проведено изучение структуры их ферментсвязывающих центров.

Строение ферментсвязивакщнх центров ингибиторов трипсина и а-химотрипсина из бобовых растений, при образовании комплексов с протеиназой пептидная цепь молекулы белка-ингибитора располагается в активном центре фермента так же, как и в случае обычных белковых субстратов (Sweet et al., 1974). В непосредственный контакт с протеиназой вступает относительно небольшой участок молекулы ингибитора, названный реактивным центром. По аналогии с системой обозначений, предложенной Шехтером и Бергером (schechter. Berger, 1967) для пептидной связи, атакуемой протеиназой в молекуле субстрата, связь Р.,-Р^ названа пептидной связью реактивного центра. Для изучения природы аминокислотных остатков, образующих связь Р1—р^"'* обычно используют методы химической модификации белков-ингибиторов специфическими реагентами и метод ограниченного протеолиза ингибитора соответствующей протеиназой (Laskowski, Se-alock, 1971), в результате которого избирательно расщепляется только пептидная связь реактивного центра. При этом ингибиторы а--химотрипсина и ферментов сходной специфичности как правило теряют свою активность, а у ингибиторов трипсина она практически сохраняется и утрачивается лишь в результате последующего отщепления остатка р, карбоксипептидазой В.

При обработке малеиновым ангидридом все четыре формы ингибитора трипсина и а-химотрипсина из фасоли утрачивают активность по отношению к трипсину при полном сохранении антихимотриптической активности. Это указывает на то, что в составе реактивных центров, ответственных за связывание трипсина, у всех форм присутствуют остатки лизина и что ингибиторы содержат два различных и независимо действующих центра связывания этих ферментов. Было установлено, что при ограниченном протеолизе трипсином при рН 3 в молекуле ИТФ-4,3 расщепляется только одна пептидная связь Lys—Ser, а при действии а-химотрипсина в тех же условиях гидролизу подвергается только связь beu-Ser. На рис.5 представлено влияние ограниченного протеолиза трипсином и а-химогрипсином при рн з на активность ИТФ-4,3.

ингибитор, модифицированный' трипсином, сохраняет активность по отношению к трипсину и а-химотрипсину, однако после обработки карбоксипептидазой В антитриптическая активность ингибитора значительно снижается при полном сохранении активности по отношению

к а-химотрипсину. После действия а-хиыотрипсина при рН 3 ингибитор утрачивает способность подавлять активность а-химотрипсина при полном сохранении способности ингибировать трипсин. Эти данные подтверждают наличие у ингибитора из фасоли двух различных и действующих независимо ферментсвязывашцих центров.

ингибитор/фермент, лкг/лкг Рис.5. Влияние ограниченного протеолиза трипсином (А) и а-хи-мотрипсином (Б) при рН з на активность {%) ингибитора из фасоли. А - действие ингибитора, модифицированного и обработанного карбо-ксипептидазой В', на трипсин (1) и а-химотрипслн (2); модифицированного, но не обработанного карбоксипептидазой В, на трипсин (3) и а-химотридсин (4); нативного - на трипсин (5). Б - действие Модифицированного ингибитора на а-химотрщсин (1), трипсин (2) и нативного - на а-хлмотрипсин (3).

Ингибитор, модифицированный трипсином и а-химотридсином при рН 3, подвергали окислению надауравышой кислотой и образовавшиеся пептидные фрагменты разделяли высокоэффективной гель-хроматографией. Анализ И- и с-концевих последовательностей и аминокислотного состава выделенных пептидов позволил установить первичцую структуру ингибитора в области реактивных центров и локализовать их в молекуле: трипсин

22 23 а-хилотрилст

64 65

Эти результаты свидетельствуют о высокой степени гомологии между первичной структурой в области реактивных центров ингибитора из фасоли и других представителей этого семейства родственных белков, выделенных из семян бобовых, принадлежащих к мотыльковым,-СОИ, нута, лимской фасоли И других (Odani, Ikenaka, 1972; Belew, Eaker, 1976; Tan, Steven3, 1971 )•

Трипсинсвязывающий центр расположен в N-концевой части молекулы ИТФ-4,3, а химотрипсинсвязывающий - в С-кокцеЕой ее части. Как и у всех представителей ингибиторов семейства ВБ1 аминокислотные последовательности в области двух реактивных центров изученного ингибитора отличаются высокой степенью гомологии. Это указывает на то, что молекула этого белка также состоит из двух доменов, и подтверждает существующее мнение о возникновении ингибиторов типа ВВХ в результате дупликации гена предшественника и последующей дивергентной эволюции.

Попытки провести ограниченный протеолиз ингибитора трипсина из гледичии как трипсином, так и а-химотрипсином при рн 3 оказались неудачны™. Поскольку все белковые ингибиторы трипсина в положении Р1 содержат как правила остатки лизина или аргинина (Las-kowski, Kato, 1980) было изучено влияние модификации свободных аминогрупп молекулы ингибитора на его активность. Обработка белка как малеиновым ангидридом, так и тринитробензолсульфокислотой (ТНВС) приводит к потере активности ингибитора, при этом модификации подвергаются все 15 свободных аминогрупп его молекулы (табл.1).

Изучение кинетики модификации аминогрупп ТНБС показывает, что в молекуле ИТГ существуют два типа аминогрупп: "быстро" и "медленно" реагирующих с ТНБС. При этом модификация каждого типа аминогрупп характеризуется своей константой скорости реакции первого порядка kjj и kJj). Зависимость шактивации ИТГ от степени его модификации описывается уравнением реакции первого порядка с константой скорости (ка) 0,12 мин-1.

С помощью компьютерного анализа были рассчитаны значения всех параметров реакции: кб=о,115 ± 0,004 шш"1, 1^=0,026 + 0,004 мин'1, число "быстрых" аминогрупп 6,70 ± о,67, число "медленных" аминогрупп 6,99 ± 0,52. Близкие значения к^ и ка свидетельствуют о том, что только одна из "быстро" реагирующих аминогрупп существенна для проявления активности ингибитора.

Таким образом, ингибитор трипсина из гледичии имеет ' один

центр, ответственный за взаимодействие с трипсином, и в его состав входит остаток лизина.

С целью определения природа аминокислотных остатков химотри-псинсвязывающего центра ИХГ белок подвергали протеолизу при рН 3. В результате обработки а-химотрипсином в кислой среде теряется около зо % активности ингибитора по сравнению с контролем.

Результаты электрофореза в ПААГ в присутствии' DS-Na и 0-мер-каптоэтанола, представленные на рис.6, свидетельствуют о том, что ингибитор а-химотрипсина.в результате инкубации с ферментом при рн 3 расщепляется на два пептидных фрагмента с мр 15500+1000 и 3500+1000. По данным анализа и- и с-концевых аминокислот пептидная связь, по которой происходит специфическое расщепление а-хи-мотрипсином в кислой среде, идентифицирована как Met-Val. В соответствии с выходом метионинсульфона после гидролиза окисленного модифицированного ингибитора карбоксипептидазой А степень модификации ингибитора составляет примерно 25 % , что согласуется со степенью снижения активности.

Поскольку ИХГ содержит только один остаток метионина (см. табл.1 ), то с целью повышения степени модификации этого важного для активности ингибитора остатка был применен метод химического расщепления бежа бромцианом.

Как следует из данных, приведенных на рис.6, в результате обработки бромцианом ингибитор расщепляется на два пептида примерно той же молекулярной массы (15800+100Q и 4000+1000), что и при обработке а-химотрипсином. Анализ N-концевых аминокислот свидетельствует о том, что и в этом случае происходит расщепление ингибитора по пептидной связи Met-Val. Степень модификации ингибитора, определенная по содержанию гомосеринлактона, составляет 76 %. При этом активность модифицированного бромцианом ингибитора снижается на во %. Изучение спектров кругового дихроизма в дальней Уф-области нативного и модифицированного бромцианом ингибитора показало, что модификация не приводит к сколь-нибудь существенным изменениям конформации белковой молекулы.

Таким образом, остаток метионина важен для проявления активности ИХГ, а пептидная связь Met-Vax входит в состав его фермент-связывающего центра.

Сравнение двух близко родственных ингибиторов из гледичии, принадлежащих к одному семейству, но обладающих различной специфичностью действия на ферменты, свидетельствует о том, что они

различаются природой аминокислотных остатков, локализованных в ферментсвязывающих центрах. Следовательно, различная специфичность родственных белковых ингибиторов протешшз обусловлена, в первую очередь, химической природой аминокислотных остатков, расположенных в положений Р1 реактивного центра.

Рис.б. Диск-электрофорез в ПДЛГ В присутствии DS-Na II р-меркаптоэтанолз модифицированного а-химотрипсином при рН 3 (3- 40 лиг, 7-15 15 лкг, 5-30 лнг) и контрольного к нему (4- 15 лкг, ь - зо лкг), модифицированного бромцианом (а- ю лкг) и контрольного к нему (9 -ю шг) препаратов ингибитора а-химотрипсина из гледичии, 1 и 2 - белки-маркеры.

Наличие в семенах гледичии ингибиторов типа sri показывает, что они присутствуют у представителей всех трех семейств бобовых растений - мотыльковых, мимозовых и цезалышяиевых. В то же время в семенах гледичии не обнаружены ингибиторы типа BBI. Эти ингибиторы не были обнаружены и у других представителей семейства це-зэльпиниевых (Moriolca et al., 1988).

Следует отметить также, что только у двух видов бобовых растений, относящихся к семейству мимозовых, присутствуют ингибиторы, типа BBI. Можно заключить, что признаком, отличающим цезальпиниевые - наиболее древние среди бобовых - от представителей других семейств (мотыльковых и, возможно, мимозовых), служит отсутствие у первых низкомолекулпрных ингибиторов протеиназ семейства ингибитора Баумана-Бирк.

В то же время ингибиторы типа BBI чаще встречаются у мотыльковых - филогенетически наиболее молодого семейства бобовых, при этом многие представители этого' семейства содержат только этот тип ингибиторов. Можно предположить, что существует определенная взаимосвязь между распределением ингибиторов типа sti и bbi и эволюцией бобовых. По-видимому, бобовые растения, которые вначале содержали только ингибиторы типа Кунитца, постепенно в ходе эво-

94000--

67000--

43000—■ ■

зоооо — !•

20100-j'

i

14400--1

6500-i

1234 5 6709

люции от деревьев к травам и по мере адаптации к умеренному климату приобрели ингибиторы семейства Баумана-Бирк, которые могли возникнуть в, процессе дивергентной эволюции путем дупликации гена ингибитора -предшественника. На более раннее происхождение ингибиторов типа sti указывает факт обнаружения ингибиторов, гомологичных ингибитору Кунитца, в растениях другого семейства Gramlneae (злаковые). Однако, в отличие от ингибиторов семейства sti из бобовых эти ингибиторы, названные бифункциональными, не действуют на трипсин и а-химотрипсин, но подавляют активность сериноаых протеиназ микроорганизмов и эндогенных а-амилаз.

3. Ингибитор сериновшс протеиназ цикроорганизиов из семян

кукурузы

Бифункциональные ингибиторы протеиназ микроорганизмов и а--аммлаз выделены из семян ячменя, пшеницы, ржи и тритикале, принадлежащих к подсемейству Pootcieae (мятликовые) (Mundy et al., 1983, 1934; Mosoiov, shuj/gin, 1986). Ингибитор этого типа содержится также в семенах риса, входящего в другое подсемейство злаковых Oryzoideae (рисовые) (Kato et al., 1972)- В то же время в семенах ячменя обнаружены ингибиторы сериновых микробных протеиназ, отнесенные к другому семейству, так называемых, "цистеин-не-зависимых" ингибиторов протеиназ (iioisen et al., 19В1), молекулы которых состоят из нескольких полипеитидных цепей (суоъединиц) и характеризуются отсутствием дисульфидных связей как внутри субъ-едошиц, так и между ними.

С точки зрения выяснения вопроса распространения у 1гредста-вителей различных подсемейств злаковых двух типов ингибиторов, способных подавлять активность ферментов микроорганизмов, большой интерес представляет кукуруза, принадлежащая к подсемейству Pant— coldeae (просовых).

По данным гель-хроматографии ингибитор, выделенный из семян кукурузы методом аффинной хромаtoi рафии на субтилизин-сефарозе, имеет значение мр 17000+1ооо. При диск-электрофорезе в присутствии cs-Na, р-меркаптоэтанола и 8М мочевины обнаруживаются четыре пептидных компонента, мг которых составляют величины 5300, 4300, 2900 и 2200+500, соответственно (рис.7). Компонент, соответствующий исходному ингибитору, отсутствует. Это позволяет заключить, что молекула ингибитора состоит из четырех пептидных цепей (субъ-едтшц), характеризующихся различными значениями молекулярной массы. Пептиды в порядке увеличешя их электрофоретической под-

вижности били обозначены А, в, сип. Все четыре пептида проявляют активность ингибиторов суотилизина, при этом наибольшей активностью обладают пептиды с и D. Их удельная активность сравнима с активностью исходного ингибитора.

1нс.7. Диск-электрофорез ингибитора из семян кукурузы (а) в присутствии 8М мочевины, »s-Na и р-меркаптоэтанола, б - Пептидные маркеры: 1 - миоглобин, мг 17200, 2-6 - фрагменты миоглобина, Мг 14600, 8200, 6300, 2500 И 1645, соответственно.

Сам факт наличия ингибиторной активности у таких низкомолекулярных пептидов представляет значительный интерес. Молекулярная масса у пептидов С и D даже несколько ниже, чем у ингибиторов из растений семейства тыквенных - самых низкомолекулярных из описанных до настоящего времени природных белковых ингибиторов серино-BHX Протеиназ (Wieczorek et al., 1985).

Пептид D отличается отсутствием остатков серила, гистидина и фенилаланина; последние отсутствуют также и в пептиде с, а гисти-дин не обнаруживается и в пептиде в. Пептиды различаются природой N-концевого аминокислотного остатка. Сравнение N-концевых остатков и аминокислотного состава пептидов исключает возможность их возникновения в результате ограниченного протеолиза одной или двух исходных молекул бежа.

В целом, аминокислотный состав всех пептидов характеризуется низким содержанием ароматических аминокислот (4,3 %) и высоким содержанием аспарагиновой и глутэминовой кислот или их амидов (19И %), а также взлина (11,3 иролина (7,8 %) и других аминокислот с боковыми цепями гидрофобного характера. Доля неполяр-, ннх боковых цепей, рассчитанная по методу Бигелоу, составляет величину о,зб, а средняя гидрофобность молекулы ингибитора, определенная с учетом фактора гидрофобности каждого отдельного аминокислотного остатка (Bigeiow, 1976), - 1073- В каждом пептиде содержится но остатку метионина. Наиболее существенной особенностью аминокислотного состава пептидов является полное отсутствие остатков цистеина и цистина. Эти результаты позволяют заключить, что взаимодействие между отдельными пептидными цепями, образующими молекулу ингибитора из кукурузы, происходит не за счет образо-

вания дисульфидных связей, а осуществляется в результате ионных и гидрофобных взаимодействий.

Ингибитор из кукурузы эффективно подавляет активность различных субтилизинов (BPl/, Карлсберг, субтилизин 72), а также се-риновых протеиназ из Азр. oryzae, Аар. terrícola и Str. grtsem. Кроме того, белок оказывает ингибирующее действие на протеиназы животного происхождения - а-химотрилсин, панкреатическую и лейкоцитарную эластазы, но совсем не действует на трипсин.

В табл.2 приведены значения констант диссоциации (к^) и констант скоростей образования (k+i) и распада комплексов ингибитора с субтилизином Карлсберг и а-химотрипсином, на основании которых мокно сделать заключение, что белок, выделенный из семян кукурузы, является более эффективным ингибитором микробной протэ-иназы-субтилизина, чем а-химотрипсина. Ингибирование а-химотрип-сша имеет конкурентный характер и указывает на легкую диссоциацию комплексов ингибитора с этим ферментом в присутствии субстрата.

Таблица 2.

Равновесные и кинетические констанш взаимодействия ингибитора из кукурузы с субпииизтол Карлсберг и а-хилстрипсинол

Фермент х ю8,ы k+i х ю 4,м х ю-3,о-1

Субтилизин

Карлсберг 0,18 20,0 0,36

а-Химотрипсин 3,70 2,7 1,00

Для выяснения природа аминокислотного остатка, находящегося в положении Р1 реактивного центра, ингибитор подвергали обработке реагентами, специфически модифицирующими остатки лизина и метио-нина в белках.

Для модификации остатков лизина ингибитор обрабатывали ТНБС. Несмотря на то, что в условиях обработки модификации подвергались 8 из 9 свободах аминогрупп, ирисутствующих в молекуле белка, процесс сопровождался лишь частичной 20%) потерей активности ингибитора. Можно предположить, что это связано с нарушением электростатических взаимодействий в молекуле ингибитора, играющих существенную роль в поддержании его пространственной структуры.

Обработка ингибитора реагентами, модифицирующими в кислой

среде остатки метионина в.белках: перекисью водорода, йодуксусной кислотой и хлорамином Т, приводит к полной инактивации ингибитора по отношению как к субтилизину, так и а-химотрипсину.

Известно, что при обработке белков перекисью водорода или хлорамином Т, кроме остатков метионина, окислению могут подвергаться и некоторые другие аминокислотные остатки, что может привести к нарушению пространственной структуры белковой молекулы. Сравнение КД-слектров нативного, модифицированного перекисью водорода, а также выдержанного при рН 2,8 в отсутствии перекиси водорода контрольного препарата ингибитора указывает на незначительное изменение содержания р-изгибов и некоторое увеличение доли неупорядоченной структуры в белке. Поскольку активность контрольного препарата сохранялась при этом полностью, можно заключить, что небольшие изменения вторичной структуры вызваны инкубацией белка при рН 2,8 и не приводят к существенному нарушению конформации молекулы.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что в положении р., реактивного центра ингибитора из семян кукурузы располагается остаток метионина и что субтилизин и а-химотрипсин связываются с молекулой ингибитора по одному и тому же реактивному центру.

Данные гель-хроматографии комплексов ингибитора с субтилизи-ном и а-химотрипсином, образующихся в условиях как избытка фермента, так и избытка ингибитора, указывают на то, что молекула ингибитора, состоящая из четырех полипептидных цепей, не диссоциирует при образовании комплексов с ферментами. Однако, комплексы ингибитора с субтилизином и а-химотрипсином характеризуются различным составом. Первый из них содержит одну недиссоциированную молекулу ингибитора и две молекулы фермента, в то время как во втором с одной недассоциированной молекулой ингибитора связана только одна молекула а-химотрипсина. В то же время при взаимодействии с субтилизином в случае избытка ингибитора наблюдается образование "ненасыщенного" комплекса, содержащего одну недиссоциированную молекулу ингибитора и одну молекулу фермента.

Как уже отмечвлось, каждая из четырех полипептидных цепей, входящих в состав молекулы ингибитора, активна по отношению к субтилизину, однако только Пептида с и В характеризуются достаточно высокой' удельной активностью. Можно предположить, что при образовании комплекса субтилизин связывается с этими пептидам*!. Об-

наружение в смесях фермента с ингибитором "ненасыщенного" комплекса, по-видимому, свидетельствует о том, что процесс их взаимодействия протекает в две стадии. Сначала молекула субтшшзина связывается с наиболее активным пептидом D, а затем по мере увеличения количества фермента происходит присоединение второй молекулы суотилизина к пептиду с. ■ •

Таким образом, ряд свойств, прежде всего, отсутствие дисуль-фидных мостиков и наличие четвертичной структуры, которая сохраняется при взаимодействии с ферментами, а также специфичность действия указывают на принадлежность ингибитора из семян кукурузы к семейству "цистеин-независимых" белков-ингибиторов. Подобные ингибиторы выделены из многих растений, относящихся к различным семействам (Ryan, Balls, 1962; Plunlcett et al., 1982; Kuo et al., 1984; Svendsen et al., 1984; Yoshikawa et al., 1985; Seidl et al., 1988), однако большинство из них, подобно ингибитору из ячменя (Boisen et al., 1981), состоят из одинаковых субъедшшц, число которых колеблется от 2 до 5. В то же время типичный представитель этого семейства ингибитор I из клубней картофеля представляет собой тетрамер, содержащий четыре субъедишцы, имеющие одинаковые значения молекулярной массы, но различную первичную структуру (Melville, Byan, 1972). №)ГИбИТОр ИЗ кукурузы, близкий ПО свойствам к ингибитору I, также представляет собой тетрамер, состоящий из четырех субьединиц, но они отличаются как по значению молекулярных масс, так и, по-видимому, по первичной структуре.

4. Белки-ингибиторы а-хшотрипсина из клубней картофеля

Растения семейства пасленоЕых занимают второе место среди высших растений (после бобовых) по содержанию белковых ингибиторов протеиназ и среди них на первом месте стоит карта}юль, у которого эти белки присутствуют как в клубнях, так и в надземных частях растения. В отличие от бобовых, характеризующихся сильно выраженной активностью ингибиторов трипсина, в клубнях картофеля содержится целый набор ингибиторов а-химотрипсина. При гель-хроматографии термостабильных белков из клубней картофеля активность ингибиторов а-химотрипсина распределяется по трем белковым компонентам с молекулярными массами 40000,. 25000 и бооо Да (рис.а).

Важной проблемой в изучении ингибиторов сершювых протеиназ из клубней картофеля является выяснение возможной связи между высоко - и низкомолекулярными формами. В ряде работ была продемонстрирована высокая степень гомологии аминокислотных последователь-

ностей (до 75 %) между высокомолекулярным ингибитором (Мг~ 25000) Й низкомолекулярдами ингибиторами (Мг бооо) (Ryan, Haas, 1977! Graham et'al., 1985). Било высказано предположение о возможности образования шзкомолекулярных форм ингибиторов из высокомолекулярных в результате ограниченного протеолнза (Реагсе et ai.f 1982). Для решения этого вопроса были выделены высоко- и низко-молекуллрше ингибиторы из клубней картофеля и проведено сравни-

Рис.8. Гель-хроматография термостабильных белков из клубней картофеля на сефздексе 0-75. 1 - aoqo' 2 ~ активность {%) ингибитора а-химотрипсина. I-III - белки с t^. 40000, 25000 и ьооо.-

Низкомолекулярные ингибитора а-химотрипсинз из клубней картофеля. Компонент III, содержащий ингибиторы а-химотрипсина (см рис.8), разделяли ионообменной хроматографией на КМ-целлюлозе в условиях повышающейся концентрации Nací от о до 0,25 М (рис.9). В этой группе белков присутствуют, по крайней мере, шесть компонентов , активных по отношению к а-химотрипсину, один из которых подавляет также активность трипсина. Компоненты, элюирующиеся при концентрации соли, равной о,об, 0,08 и 0,17 и (ИХК-I, ИТК и ИХК-11, соответствешю), после рехроматографш в тех же условиях были гомогенны по данным' дйск-электрофореза при рН э в присутствии 6М мочев!Шы.

Все выделенные ингибиторы не действуют на субтилизин. ИХК-1 и ИХК-11 не активны по отношению к трипсину,.но нестехиометричес-ки подавляют активность панкреатической эластазы свиньи. В табл.з

приведены значения констант диссоциации комплексов ингибиторов с ферментами. Видно, что ИХК-1 и ИХК-П являются эффективными ингибиторами а-химотрилсина. По данным титрования ингибитора ферментом по методу Грина и гель-хроматографии комплексов с а-химотрип-сином установлено, что ингибиторы взаимодействуют с ферментом в отношении 1И. Значение к^ для комплексов НТК с трипсином примерно в 20 раз ниже, чем для комплекса с а-химотринсшюм, то есть ИТК является более эффективным ингибитором трипсина, чем а-химо-.трипсвна.

ров а-гимотрипсшш из клубней картофеля на КМ-целлюлозе. 1 -а280, 2 - концентрация МаС1 (м), 3- активность (%) ингибитора а--химотрипсина, 4 - активность (Ж) ингибитора трипсина.

Наиболее детально был изучен ИХК-1. По дашшм изоэлектрофо-кусирования в диапазоне рн 8,0-9,5 и определения ы-концевой аминокислоты белок гомогенен, в качестве ы-концевого идентифицирован остаток пролина. По дашшм анализа аминокислотного состава ИХК-1 содержит в своем составе 45 аминокислотных остатков и значение его иг составляет 5200. Характерной особенностью аминокислотного состава ингибитора является высокое содержание остатков аспараги-новой. кислоти..(8 остатков) и цистеша (6 остатков), а также отсутствие метионина и триптофана. Поскольку молекула ИХК-1 обладает основными свойствами (р1 равно 8,4). преобладание остатков кислых аминокислот (Ю) над основными (5) свидетельствует о высокой степени амидирования остатков аспарагиновой и глутаминовой кис-

лот. Отсутствие свободных сульфгидрильных групп, установленное по результатам титрования реактивом Эллмана, указывает на наличие 3 дисульфидных связей в молекуле ингибитора.

Таблицу з.

Констпашы диссоциации (к^) колплексов низкололепулярсих ингибиторов из нлубней картофеля с ферлентали

Ингибитор К± х ю9 м

а-химотрипсин трипсин

ИХК-1 0,24 -

ихк-п 0,75 -

итк 27,0 1,3

Сравнение н-концевой аминокислотной последовательности ИХК-1, включающей зо аминокислотных остатков:

N в т

1 У 10 20 30

с последовательностью низкомблекулярного ингибитора (РС1-1), выделенного из американского сорта картофеля (Назз е1 а1., 1982), указывает на то, что 14 из зо, то есть примерно 40 %, известных остатков гомологичны. Обнаружено наличие микрогетерогенности в первичной структуре белка в положениях 5, 14 и зо. Следует отметить ,.что это явление характерно для многих ингибиторов протеиназ растительного происхождения, в частности, для субъединиц высокомолекулярных ингибиторов из клубней картофеля (МсЬагДзоп, Соп-з!пз, 1975).

Высокомолекулярный ингибитор с 7,3 из клубней картофеля. В результате изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы и рй от б до 8 компонента II из термостабильных белков клубней картофеля (см. рис.в) был выделен белок с р1 7,3, обладающий в равной степени высокой активностью как по отношению к а-хю,го-трипсину, так и по отношению к трипсину. По дашшм седиментацион-ного. анализа и определения н-концевых аминокислотных остатков белок гомогенен и содержит в качестве к-концевого остаток метиони-на. Значения м , определенные методом гель-хроматографии при рн 8 и седаментационного равновесия, бл1:зки и составляют величину Зюоо ± юоо. Однако, по результатам диск-электрофореза в присутствии ге-Иа и р-меркаптоэтанола молекулярная масса ингибитора со-

ставила величину 15000 + 1000. Это позволяет заключить, что молекула ингибитора с ыр 31 ооо состоит из двух одинаковых полипептидных цепей (суОъединид) и представляет собой димер. Диссоциация на субъединицы легко происходит при pH 2. Таким образом, связь между субъединицами обусловлена, по-видимому, гидрофобными и ионными взаимодействиями.

Аминокислотный состав ингибитора с pi 7,3 (ИХК-7,3) характеризуется высоким содержанием остатков цистина (7 на молекулу с мг <* 15000), а также аспарагиновой и глутаминовой кислот, пролина, тирозина, лизина и аминокислот с боковыми цепями гидрофобного характера. Доля неполярных боковых цепей составляет 0,27- Это согласуется с представлениями о том, что гидрофобные взаимодействия вносят основной вклад в стабилизацию пространственной структуры белка.

По аминокислотному составу ингибитор сходен с ингибитором а--химотрипсшш II из картофеля (Bryant et al., 1976) и, по-видимому, может быть отнесен к семейству родственник белков-ингибиторов, типичным представителем которого является ингибитор II (Melville, Ryan, 1972).

Ингибитор эффективно подавляет активность трипсина, а-химо-трипсина, субтилизина и протеиназ Str. grtseus. В табл.4 приведены значения констант диссоциации комплексов ингибитора с различными ферментами.

Таблица 4.

Констант диссоциации (кА) колплексов ИНК-7,3 с ферлешали

Фермент Субстрат кА х 10 ? к

Трипсин ВАРА 0,02

ВАКЕ 81,0

а-Химотрицсин СРРА*' 0,17

АТЕЕ 3,20

Субтилизин АТЕЕ 3,90

*) - п-нитроанилид ы.э-карбоксипропионил-ь-фюнилаланина '

Наличие зависимости между величиной к^ и природой субстрата, используемого для определения ферментативной активности, свидетельствует о конкурентном характере ингибирования.

На основании весовых отношений между ферментом и ингибитором при 100 $-ном ингиСированш были рассчитаны эквивалентные знача-

ния ыг белка-ингибитора. Полученные значения равны 14500+1000 для каждого из исследованных ферментов. Это близко к величине молекулярной массы субъединицы ингибитора, определенной с помощью диск-электрофореза. Таким образом, можно сделать вывод, что каздая субъединица способна связать одну молекулу фермента - трипсина, а-химотрипсина или субтилизина.

Исследование возможной взаимосвязи между высоко- и низкомолекулярными ингибиторами из клубней картофеля. Проведено изучение иммунологических свойств высоко- и низкомолекулярных ингибиторов протеиназ из клубней картофеля методом твердофазного иммунофер-ментного анализа, основанного на выявлении иммунных комплексов, иммобилизованных на полистироле, с помощью конъюгатов на основе меченых пероксидазой хрена кроличьих антимышиных антител. В качестве антигена для иммунизации мышей был использован ИХК-1. Исследуемые ингибиторы в растворе конкурировали с иммобилизованным ИХК-1 за связывание с антителами к нему, уменьшая тем самым юс взаимодействие с иммобилизованным ингибитором.

Концентрации ингибиторов, которые сникают на 50 % связывание ИХК-1 с антителами (150). составляют 6,3 х ю_ьм, 1,2 х Ю-5М и 1,2 х ю_4м для ИХК-1, ИТК и высокомолекулярного ингибитора, соответственно. Таким образом, иммунологически наиболее близки ИХК-1 и ИТК. Высокомолекулярный ингибитор значительно слабее взаимодействует с антителами к ИХК-1: для этих ингибиторов различаются на два порядка. ИХК-1I даже при значительном избытке не конкурирует за связывание антител с иммобилизованным ИХК-1. Полученные данные указывают на определенные различия антигенных детерминант в белках и, следовательно, на отличие первичных структур высоко- и (шзкомолекуляриых ингибиторов из клубней картофеля, свидетельствуя в пользу того, что последние не могут являться продуктами протеолиза высокомолекулярных форм.

Дополнительное подтверждение этого было получено при изучении динамики ингибиторов а-химотрипсина в процессе хранения клубней картофеля. Ингибиторы а-химотрипсина, выделенные из клубней при различных сроках хранения, исследовали с помощью гель-хроматографии (рис.ю). Картина, представленная на рис.юА, характерна для стадии покоя клубней. Компоненты I и IX соответствуют высокомолекулярным ингибиторам с и 40000 й 25000. Фракция III содержит группу низкомодекулярных ингибиторов с мг 5000. В период интенсивного прорастания клубней (май-июнь) наблюдается полное исчез-

новение низкомолекулярных ингибиторов и значительно уменьшается доля высокомолекулярных ингибиторов с мг « 25000 (рисиОБ), при этом обнаруживается значительное увеличение содержания материала с Мг 40000 и выше. Результаты анализа белков с помощью диск-электрофореза в присутствии Ш-Ма указывают на то, что доля субъедшшц высокомолекулярных ингибиторов (с мг ^ 15000) уменьшается при увеличении срока хранения клубней картофеля, и одновременно происходит накапливание низкомолекулярных фрагментов (с ыг ниже ЗООо), которые образуются в результате протеолитического расщепления ингибиторов собственными протеиназами.

0,2

0,2

280

II

20

40

ЬО

А Б 1

_ 94000

— 67000

— 43000

—30000 —20100

— 14400

80 Уе, МЛ'

Рис.10. Гель-хроматография и диск-электрофорез в присутствии Ш-На ингибиторов а-химотрипсина из клубней картофеля при разных сроках хранения. А-ноябрь-феЕраль, Б-май-июнь. 1-белки-маркеры.

Полученные результаты показывают, что распад субъедшшц высокомолекулярных ингибиторов в процессе хранения клубней не сопровождается образованием низкомолекуляршх форм скг» 5000, которые сами подвергаются разрушению на стадии интенсивного прорастания клубней. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о важной роли ингибиторов протеиназ для поддержания состояния покоя клубней картофеля.

Тагам образом, низкомолекулярные ингибиторы не образуются в клубнях картофеля в результате ограниченного протеолиза ингибитора с мг « 25000. Обнаруженное частичное иммунологическое сходство

высоко- и низкомолекулярных ингибиторов указывает на наличие гомологичных участков в их первичной структуре. Это позволяет высказать предположение, что множественный формы ингибиторов из картофеля произошли из одного предшественника", но в результате дивергентной, эволюции их структура претерпела значительные изменения.

Ферментсвязнвающие центры ИХК-7,3. Строение реактивных центров ИХК-7,3 изучали, используя как методы химической модификации, так и с помощью ограниченного протеолиза трипсином и а-хи-мотрштсином.

Обработка ИХК-7,3 малеиновым ангидридом приводит к модификации 9 из 11 свободных аминогрупп, присутствующих" в молекуле белка. При этом наблюдается полная потеря активности ингибитора по отношению к трипсину, в то же время способность ик!ибировать а--химотрипсин полностью сохраняется. Таким образом, белок содержит остаток лизина в центре, ответственном за связывание трипсина, и, кроме того, в его молекуле присутствуют два различных и действующих независимо центра связывания для трипсина и а-химотрипсина. Заключение о том, что ИХК-7,3 принадлежит к "лизиновому" типу, подтверждается также результатами опытов по модификации всех остатков аргинина в белке 1,2-циклогександионом. Практически полная модификация всех остатков аргинина в молекуле ингибитора сопровождается лишь незначительным (мецее 15 Я5) снижением активности ингибитора.

Установлено, что при ограниченном протеолизе ингибитора трипсином при рН з гидролизуется пептидная связь между остатками • 1уз-4б и с1п-47. То, что указанная последовательность действительно располагается в реактивном центре ингибитора,подтверждается снижением активности ингибитора по отношению к трипсину * при отщеплении карбоксипептидазой В лизина от молекулы модифицирование)- . го ингибитора, которое было пропорциональна количеству отщепленного лизина. Подобная обработка, так же, как малеилирование ингибитора, не оказывает влияния на активность по отношению к а-химо-трипсину.

При модификации ингибитора а-химотрипсином при рН 3 гидролизуется связь между остатками Ьеи-75 и Уа1-7б. Значительное снижение активности ингибитора по отношению к а-химотршгашу в результате модификации при полном сохраненйи^ спо'собности инглбировать трипсин свидетельствует о том, что гидролизуемая пептидная связь

располагается в центре, ответственном за связывание а-химотрипси-на. На это указывает и тот факт, что инкубация модифицированного а-имотрипсином ингибитора с а-химотрипсином в условиях, при которых происходит ресинтез гидролизованной пептидной связи, приводит практически к полному восстановлению активности.

Следует отметить, что в то время, как трипсинсвязывакщий центр локализован в И-концевой части молекулы ингибитора, химо-трипсинсвязывающий центр расположен в его с-концевой части. Такое расположение типично для двухцентровых ингибиторов протеиназ и, вероятно, как и в случае ингибиторов семейства БВХ из бобовых, указывает не только на наличие в белке доменов, но и на образование белка в результате дупликации генов одноцентровых ингибиторов .

При анализе аминокислотного состава пептидов ограниченного протеолиза трипсином и а-химотрипсином обнаружено, что основная' часть неполярных аминокислот и все остатки тирозина сосредоточены на сравнительно коротком отрезке полипептидной цепи, расположенном между двумя реактивными центрами. Можно предположить, что именно эта область принимает участие в ассоциации суОгедшащ, образующих димерную молекулу ингибитора.

Таким образом, молекула ингибитора состоит из двух одинаковых субъединиц, каждая из которых содержит два различных центра, один ответственный за связывание трипсина, другой - химотрипсина.

Было установлено, что взаимодействие с ферментами не сопровождается диссоциацией димерной молекулы ингибитора на субъединицы (Мосолов и соавт., 1973). В то же время в условиях, когда ингибитор находится в избытке (как в случае ингибитора микробных протеиназ из кукурузы), образуются преимущественно "ненасыщенные" комплексы, содержащие недиссоциированную молекулу ингибитора и одну молекулу фермента. Только при значительном увеличении отношения фермент/ингибитор наблюдается , присоединение дополнительных молекул фермента и образование."насыщенных" комплексов. Очевидно, Это может свидетельствовать либо о неравноценности центров связывания, расположенных на различных субъединицах, либо, что.представляется более вероятным, о наличии определенной взаимосвязи между ферментсвязывающими центрами отдельных субъединиц. Это взаимное влияние очевидно проявляется в том, что взаимодействие молекулы фермента с центром связывания одной из субъединиц оказывает определенное влияние на конформацию центра или

центров, расположенных на другой субъединице. В наибольшей степени этот эффект должен проявляться у ингибиторов, содержащих более двух реактивных центров связывания ферментов, например, у овому-коидов.

5.Особенности взаимодействия ыногоцентрових ингибиторов сериновых протеиназ с трипсином и а-хииотрипсшон

Известно,- что молекулы овомукондов из яичного белка различных видов птиц состоят из трех доменов, каждый из которых обычно содержит центр связывания протеипазы (Ка(,о et а1., 1976).

Овомукоид из белка тщ утки. Овомукоид выделяли из бежа утшшх яиц методом дробного осаждения этанолом в присутствии три-хлоруксуснай кислоты с последующей дополнительной очисткой аффинной хроматографией на иммобилизованном трипсине. По результатам даск-электрофэреза в присутствии ш-иа полученный препарат овому-коида имеет молекулярную массу зоооо + 1000 и не содержит примеси овоингибитора. Гомогенность утиного овомукоида подтверждается данными анализа м-концевых аминокислот. В качестве Ы-концевого идентифицирован остаток валила.

Как и все известные овомукоиды, утиный является гликопротеи-ном, в его молекуле содержится 12,5 % глюкозамина (21,6 моль на 1 моль белка) и 7,8 % других Сахаров, дающих реакцию с фенолсерной кислотой. Аминокислотный состав выделенного овомукоида обладает всеми особенностями, характерными для овомукоидов. В составе белка отсутствует триптофан, но велико содержание остатков аспараги-новой и глутамшювой кислот, глицина и цистина. Но своему химическому составу утиный овомукоид близок к овомукоида из белка куриных яиц; по отличается по специфичности действия на ферменты. Овомукоид утки эффективно подавляет активность трипсина, а-хто-трипсина, нлазмина, акрозина и лейкоцитарной эластазы человека, свиной панкреатической эластазы, субтилизина и ряда других протеиназ микроорганизмов с и^ 'ю~'-ю~8 м.

На рис.11 приведены результаты микрокалориметрического титрования овомукоида трипсином и а-химотрипсином. Видно, что для а--химотрипсина насыщение наблюдается при мольном отношении фермент/ингибитор, равном 1:1, а для трипсина - 2:1, то есть одна молекула утиного овомукоида способна связать одну молекулу а-хи-мотрипсина и две молекулы трипсина. Наличие только одного излома на кривой титрования ингибитора трипсином свидетельствует о независимости трипсинсвязывающих центров овомукоида и об юс равном

^фодстве к трипсину. Аналогичные результаты были получены при титровании ингибитора ферментами по методу Грина.

О, кдж/моль /

/ Рис.11. Калориметрическое

/ ' / титрование овомукоида из

белка утиных яиц трипсином (1) и а-хдаотрипсином (г); температура 25° с, рН 7.9. I 0,07, концентрация овомукоида 6,7x1 о-5 м. моль фермента

1 2 з '' моль ингибитора

Д]!й выяснения природы функционально важных аминокислотных остаткйё утиный овомукоид модифицировали ТНБС. Было установлено, что при кодификации всех 16 свободных аминогрупп в белке полностью ис'Шёйт способность овомукоида подавлять активность трипсина, в К ЩЗёМя как антихимотриптическая активность остается неизменной. Отсутствие влияния ТНБС на активность ингибитора по отношению к а~химотрипсину позволяет сделать вывод о том, что инакти-вацйй ингибитора по отношению к трипсину является следствием модификации е-аминогрупп остатков лизина в белке, а не изменения его конформэции. с другой стронн, это свидетельствует о том, что трипсин- и а-хммотрипсинсвязывающие центры независимы и что в с'остав обоих трипсинсвязывающих центров входят остатки лизина.

Изучение кинетики модификации и изменения активности овому-ксЩа при действии ТНБС показало, что все свободные аминогруппы Молекулы белка, в том числе и е-аминогруппы остатков лизина, входящих в состав трипсинсвязывающих центров, обладают одинаковой реакционной способностью по отношению к ТНБС. Рассчитанное значе-ййё коййёйты скорости модификации свободных аминогрупп овомукои-Дё ЙШВ блйзко к значению константы скорости инактивации и сос-тйШШё'1 величину 0,04 + 0,01 мин""1. Это отличает утиный овомукоид вт Вписанного выше ингибитора трипсина из семян гледичии, в моле-|$ле которого присутствуют аминогруппы, быстро и медленно реагирующие с ТНБС.

Таким образом, утиный овомукоид содержит три независимых фер-ментсвязываицих центра, два из которых равноценно и независимо

связывают трипсин, а один - а-химотрилсин.

Значения термодинамических параметров взаимодействия утиного овомуковда с этими ферментами, приведенные в табл.5, указывают, что основной вклад в изменение свободной энергии взаимодействия вносит энталъпийный фактор. Отрицательное значение энтальпии в обоих случаях, по-видимому, обусловлено образованием ионных, а также водородных связей, стабилизирующих структуру образующихся комплексов фермент-ингибитор. Некоторое возрастание энтропии, ре-роятно, является следствием дегидратации в области ферментсвязы-вающего центра ингибитора при взаимодействии остатка Р1 с активным центром протеиназы.

Таблица 5.

Термодинамические параметры взаимодействия оволуноиба из белна утиных яиц с трипсином и а-ашотрипсинол

Параметр * \ Ом + Т ' Ом + Хт*} Ом-Хт + Т 0м-т2 -г'

-ДН°+ 1,5,кдж/лолъ 16,5 27,0 15,5 60,0

К ± 0,4, ¿Г1 2,2x107 2,4x107 1,0x106 2, 0x1

-АР°± 0,4,КдЖ/Л0ЛЪ 41 ,9 42,1 34,2 35.9

Дв°+ 6, дж/лолъ- К 85 51 63 -вЛ

п**>± 0,1 1,9 0,9 1,9 0,9

*) Ом - овомукоид, Т - трипсин, Хт - а-химотрилсин; '**) п - число мест связывания.

Рассчитанные из термодинамических, параметров значения констант диссоциации комплексов овомукоида с трипсином и а-химотрип-сином находятся в хорошем соответствии со значениями, определенными по методу Грина.

Приведенные в табл.5 результаты свидетельствуют о том, что независимо от порядка добавления ферментов к овомукоиду в обоих случаях наблюдается равновесное образование тетрамолекулярного комплекса ингибитора с двумя молекулами трипсина и одной молекулой а-химотрипсина. Однако с термодинамической точки зрения состояние этих комплексов различно и определяется последовательностью присоединения ферментов к овомукоиду. Комплекс 0м-Хт>Т2 (ДР°= = -110,5 кдк/моль) находится в относительно метастабильном состоянии по сравнению с комплексом Ом-Т^* Хт, свободная энергия образования которого достигает максимального значения -119.7 кдж/ моль.

Величины свободных энергий и энтропий, вычисленные как разности меаду изменением этих параметров для общего равновесия: ОМ + ХТ + 2Т ом-Хт-Т2 (1) или Ом + 2Т + Хт ОМ'Тд'Хт (2) и суммой изменений Ь? и ДЭ для равновесий Ом + Хт =«= Ом-Хт и ОМ + 2Т=5=0М-То, равные 15,4 кдж/моль, -44 дж/моль-к и 6,2 кдж/ моль и -132 дж/моль-к, соответственно, указывают на то, что взаимодействие овомукоида с трипсином и а-химотрипсином затрудняет последующее присоединение фермента другого типа. При этом, если в случае (1) основной вклад в изменение разности свободной энергии вносит энтропийный фактор, то в случае (2) изменение энтропии компенсируется выигрышем в энтальпии взаимодействия.

Причина изменения энтропии при переходе к реакции ферментов с комплексом овомукоида, вероятно,, заключается в компактизации исходной структуры овомукоида с уменьшением его конформэционной подвижности при связывании овомукоида в комплекс. Естественно, что такая комлактизация должна быть большей при присоединении к овомукоиду двух молекул трипсина, чем одной молекулы а-химотрип-сшю, что и приводит к большей потере энтропии в случае (2) по сравнению с (1). •

Прямое доказательство взаимодействия между молекулами ферментов при связывании в комплекс с овомукоидом было получено при изучении поведения флуоресцентно меченных ферментов. В комплексе овомукоида с двумя молекулами трипсина, одна из которых модифицирована родамином, а другая - флуоресцеином, наблюдается возгорание флуоресценции акцептора (родамина) на 14-16 % в результате его взаимодействия с донором - флуоресцеином, то есть на молекуле овомукоида обе молекулы трипсина находятся в достаточно тесном контакте друг с другом. В еще большей степени (на 40 %) интенсивность флуоресценции родамин-трипсина возрастает при добавлении флуоресцеин-химотрилсина к комплексу овомукоида с двумя молекулами родамин-трипсина. В этом случае молекулы трипсина и а-химо-трипсина вступают уже в непосредственный контант между собой, что и обеспечивает возрастание энтальпии реакции 0м-Т2 + Хт по сравнению с реакцией Ом + Хт и возможность ее протекания, несмотря на неблагоприятное изменение энтропии.

Таким образом, в том случае, когда молекула ингибитора тлеет несколько реактивных центров, реакционная способность каждого из этих центров определяется состоянием остальных, что может приво-

дить к зависимости структуры образущегося комплекса от порядка смешения реагентов.

Подобные конформационные эффекты, по-видимому, могут проявляться также в случае образования "ненасыщенных" комплексов при взаимодействии с ферментами описанных выше ингибиторов из кукурузы и клубней картофеля, молекулы которых состоят из нескольких субъединиц.

Особенность строения многоцентровых белков-ингибиторов определяет характер их взаимодействия с протеиназами, что было продемонстрировано на примере изучения способности метилхимотрипсина, содержащего метальную группу, присоединенную к остатку гистидина--57 активного центра фермента, образовывать устойчивые комплексы с одно- или многоцентровыми ингибиторами. Метшшшотрипсин способен связывать субстраты и его конформация близка к конформации нативного фермента (Антонов, Воротынцева, 1972; Henderson, 1971). Результаты экспериментов, представленные на рис.12, показывают, что метилхимотрипсин вытесняет натившй фермент из его комплексов с утиным овомукоидом и ИХК-7,3.

ФА,%

Рис.12. Конкуренция между натизным и метилированным а-химотрипсином. Вытеснение из комплекса с ингибитором хи-мотрипсина метилхимотрипси-ном (1) и метилхимотрипсина нативным ферментом (2); А -комплекс с утиным овомукоидом, Б - комплекс с !Ш-7,Э. ФА - ферментативная активность (%).

Бремя, ч

На основании содержания активного фермента в равновесной смеси били рассчитаны значения констант ассоциации комплексов метилхимотрипсина с ингибиторами (табл.6). Из этой таблицы видно, что модификация остатка гистидина-57 в химотрипсине приводит к некоторому сшпкешш прочности комплексов, образуемых ферментом с белковыми ингибиторами. Более того, не все ингибиторц способны

взаимодействовать с модифицированным ферментом. Так БЫ и основной панкреатический ингибитор трипсина (ВРТ1) не связываются с метилхимотрипсином. Аналогичные результаты получены при изучении взаимодействия БТ1 и ВВ1 с иммобилизованным метилхимотрипсином: только БВ1 образует устойчивое соединение с ишобилизованным ферментом.

Таблица 6.

Вэаилодействие белковых ингибиторов с а-сшлсприлсинол, нативныл и летиированныл по астату гмсттдияа-Ы

Ингибитор Константа ассоциации, М~1

химотрипсин метилхимотрипсин

1 fi Утиный овомукоид 2,4 X 10' 0,9 X 10

ИХК-7-,3 0,2 х 108 0,4 х 107

Ингибитор из фасоли 2,6 х ю10 0,3 х ю9

STX 2,0 х ю^ II не взаимодействует

я '

BPTI 1,0 х 10 не взаимодействует

*) Quast, Stetrer, 1975; Vincent, Lasdunski, 1972.

Эти данные указывают на то, что sti и bpti, которые принадлежат к типу одноцентровых ингибиторов и содержат в положении Р1 реактивного центра остаток основной аминокислоты - аргинина и лизина, соответственно (Chauvet, Acher, 1967; Bidlingmeier et al-, 1972), взаимодействуют с а-химотрипсином с участием остатка гис-тидина-эт, входящего в состав каталитического участка . активного центра фермента. Такое заключение подтверждается результатами рентгеноструктурного изучения комплексов sti и bpti с трипсином (Blow et al., 1972! Sweet et al., 1974). В то же время утиный овомукоид, ингибитор из семян фасоли, BBI и ИХК-7,3 являются многоцентровыми ингибиторами и,как показано выше, в положении Р1 хи-мотрипсинсвязыващего центра содержат остаток лейцина. Поскольку ?<!одафикация остатка гистидина каталитического центра не препятствует образованию достаточно устойчивых комплексов этих ингибиторов с метилхимотрипсином, можно предположить, что в этом случае более значительный вклад вносят гидрофобные контакты с субстрат-связывающим центром фермента.

Таким образом, механизм связывания протеииаз с одно- и мно-гоцонтровыми ингибиторами может быть различен. Для одноцентровых

ингибиторов, по-видимому, определяющую роль играют взаимодействия с группами каталитического участка, в то время как многоцентровые связываются с субстратсвязываюцим участком активного центра фермента. Поскольку, как предполагают, эволюция протеолитических ферментов шла, главным образом, по лиши развития и дифференци-ровки субстратсвязывающих участков активного центра, сделанное заключение согласуется с представлениями о том, что первоначально возникли одноцентровые ингибиторы протеиназ, из которых в результате дальнейшей эволюции образовались многоцентровые.

6. Синтез и свойства иммобилизованных ингибиторов сериновых протеиназ

Способность белковых ингибиторов образовывать с ферментами соединения, характеризующиеся исключительно высокими значениями констант ассоциации (107-1(? и ~1), позволяет рассматривать их как практически идеальные лиганда для биоспецифической хроматографии протеиназ. В этом отношении белковые ингибиторы превосходят все известные синтетические ингибиторы протеиназ, включая саше эффективные (Мосолов, 1971).

Для синтеза иммобилизованных ингибиторов протеиназ был использован сополимеризациошшй метод, который включает ацилирова-ние свободных аминогрупп белка хлорангидридом ненасыщенной, например, акриловой кислоты (ХААК), и последующую сополимернзацию ненасыщенного производного ингибитора с гидрофильным мономером (Плата и соавт.,1977). При проведении сополимеризации в присутствии сшивающего агента образуется нерастворимый полимерный гидрогель, содержащий ковалентно иммобилизованные молекулы белка; в отсутствии сшивающего агента продуктом реакции является водорастворимый сополимер.

Поскольку в реакции ацилирования участвуют, главным образом, свободные аминогруппы белков, то естественно, что обработка ХААК белковых ингибиторов протеиназ, содержащих в ферментсвязывающих центрах остатки лизина, приводит к их инактивации. При этом степень инактивации определяется относительной реакционной способностью аминогрупп этих остатков в реакции ацилирования. Если она выше, чем у остальных свободных аминогрупп белка, инактивация ингибитора наступает уже при малых степенях ацилирования. Поэтому возникает необходимость защиты аминогрупп, остатков лизина реактивного центра. Разработанный на. примере ввтг способ защити этих аминогрупп от дезактивирующего действия ХААК включает предвари-

тельное связывание ингибиторов в комплекс с трипсином, ацшшрова-ние комплекса, последующее его разрушение при кислых значениях рН и выделение ацилированного ингибитора. Антитриптическая активность полученного таким образом ненасыщенного производного ВРТХ равна активности нативного ингибитора, несмотря на то, что модификации подвергается половина свободных аминогрупп молекулы ингибитора. Рассмотренный способ защиты реактивного центра может быть использован для всех белков-ингибиторов, в том числе для утиного овомукоида. Результаты микрокалориметрического титрования показывают, что термодинамические параметры взаимодействия с трипсином и а-химотрипсином утиного овомукоида, четвертая часть аминогрупп которого ацилированы ХААК, не отличаются от соответствующих параметров взаимодействия ферментов с нативным ингибитором.

Водорастворимые иммобилизованные производные белковых ингибиторов. Водорастворимые полимерные производные овомукоида синтезировали путем гомбполимеризации ацилировэнного ХААК овомукоида или путем его сополимеркзации с гидрофильным мономером, например, акриламидом. В нервом случае молекулы овомукоида соединяются непосредственно друг с другом, а во втором - они разделены длинными фрагментами полиакриламида с мг порядка юоооо.

При изучении активности продуктов гомополимеризации было обнаружено, что, чем больше их молекулярная масса, тем ниже активность ингибитора. Так, антитриптическая и антихимотриптическая активности гомополимера, содержащего две молекулы овомукоида, снижается до 85 %, а 17 молекул ингибитора - до 40 % от активности исходного ацилированного белка. Причина этого заключается в возникновении стерических препятствий для взаимодействия овомукоида с протеиназами. Естественно, что, чем больше молекул ингибитора соединяются между собой, тем выше степень экранирования их центров связывания ферментов.

При исследовании сополимеров (м 9,1хЮэ-1 ,Эхю4) было обнаружено, что активность овомукоида в сополимере с акриламидом находится на уровне активности гомополимера, содержащего такое же количество молекул ингибитора. Это означает, что, несмотря на то, что молекулы белка разделены длинными фрагментами полиакриламида, заметного изменения расстояния между этими молекулами не происходит. Этот вывод подтверждается прямым измерением методом светорассеяния среднего диаметра макромолекулы сополимера, значение которого составляет 520 Теоретический расчет для модели стати-

стнческого клубка дает величину 800-850 X, в то время как для модели тесно взаимодействующих молекул овомукоида значение среднего диаметра должно составлять величину 500-540 X, которая хорошо согласуется с экспериментально найденным значением.

Таким образом, в силу гибкости полимерной цепи и стремления молекул белка к ассоциации происходит существенное поджатие клубка сополимера, то есть молекулы ингибитора выступают в роли внутримолекулярного сшивающего агента.

Замена полиакриламида на более жесткий поли-М-акрилоилглю-козамин, статистический сегмент которого вдвое больше, чем для полиакриламида (<=< 20 X вместо 10-12 X), приводит к тому, что реальный диаметр молекулы сополимера (580 Х),хотя и не достигает значения, характерного для статистического клубка (640-700 X), но уже существенно больше, чем для сополимера блочного строения (360-400 X). Сопротивление более жесткой полимерной цепи образованию ассоциатов белков является причиной повышения в 1,5 раза активности сополимера овомукоида с N-акрилоилглюкозамином по сравнению с активностью сополимера с акриламидом.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что в случае прочного связывания белков с полимерной цепью конформация. такой системы в раствора определяется двумя факторами - гибкостью полимерной цепи и ассоциацией молекул белка. При этом, чем выше гибкость полимерной цепи, тем более компактную структуру принимает макромолекула сополимера; повышение жесткости цепи препятствует образованию ассоциатов белков и нейтрализует тем самым их возмущающее действие на конформащш макромолекулы сополимера в растворе. Обнаруженное явление, по-видимому, имеет общий характер и может быть положено в основу направленного регулирования структуры, а следовательно, и активности растворимых производных иммобилизованных белковых ингибиторов протеиназ путем подбора полимера-носителя.

Биоспецифические сорбенты на основе белковых ингибиторов протеиназ. Путем сополимеризации ацилированного ХААК утиного овомукоида с акриламидом и пЖметиленбисакрилзмидом были получены нерастворимые гидрогелевые сорбенты. Результаты изучения зависимости состава сорбента от условий проведения реакции сополимеризации показывают, что варьированием концентраций исходных веществ можно в весьма широких пределах изменять содержание иммобилизованного ингибитора в сорбенте. Синтезированные сорбенты активно

- -42-

связывают трипсин и а-химотрипсин из модельных растворов при рн 8. Изучение кинетики сорбции ферментов показало, что сорбционное равновесие устанавливается через 25-30 минут после начала контакта сорбента с раствором протеиназы, что свидетельствует о высокой проницаемости гидрогелевых сорбентов и о доступности 'иммобилизованных молекул ингибитора для высокомолекулярных субстратов.

С повышением количества иммобилизованного белка емкость сорбента (в расчете на 1 мг белка) несколько уменьшается, что обусловлено стерическими затруднениями при взаимодействии реактивных центров иммобилизованного ингибитора с молекулами ферментов, возникающими при плотном расположении молекул ингибитора в гидрогеле. Эффективность сорбции практически не изменяется при переходе от модельных растворов ферментов к плазме и цельной крови (табл. 7), что позволило использовать иммобилизованные ингибиторы в качестве гемосорбентов для удаления избытка протеиназ из крови.

Таблица 7-

Состав и свойства сорбентов на основе иммобилизованного утиного овомукоид а

Состав исходной реакционной смеси, %

11> II III - сорбента

10 1,0 0,1 0,19

10 1,0 0,8 2,85

20 1,6 1,3 3,20

15 0,8 1,5 4,30

Концентрация ово-мукоида, мг/г

Емкость сорбента, мг протеиназы/г сорбента

0,19 2,80 3,30 3,80

2)

3) ,4)

4)

1)1- акриламид, II - 11,Н-метиленбисакриламид, III - ацилирован-гшй овомукоид; 2) - раствор трипсина, рН 8; 3) - кровь собаки; 4) - плазма крови человека.

С целью повышения емкости сорбента при извлечении протеиназ из крови, рН которой (7,4) отличается от оптимума.рН действия ингибитора, разработан способ регулирования биологической активности иммобилизованного ингибитора путем направленного изменения эффективного оптимума рн. Регулирование локальной концентрации ионов водорода непосредственно в зоне действия иммобилизованного" ингибитора достигалось введением в исходную мономерную смесь ионогенных мономеров. Из рис. 13 следует, что максимальное связывание трипсина иммобилизованным в полиакриламидном гело БТ1

нзблюдается при рН 8, которое не отличается от оптимума рн действия нативного ингиоитора.

С, мг трилсина/мг имм.ЗТХ 1

о,б

0,4

0,2

6

8

10

РН

Рис. 13. Зависшость емкости сорбента (с), содержащего иммобилизованный ЗТ1, от рН. 1 - полиакриламидный гель; 2-гель на основе сополимера ак-риламида и 50 % диметиламино-этилметакрилата, кватернизо-ванного бромистым этилом; 3 -гель на основе сополимера ак-риламида и 50$ акриловой кис-• лоты.

Введение в состав носителя положительно заряженных групп мономера : сн2=с (снэ)-соо-сн2-снг-1$и

Вг

^(сн3)2(с2н6), приводит к смещению

оптимума рн в кислую область. При введении в мономерную смесь отрицательно заряженного мономера, например, акриловой кислоты, оптимум рН действия смещается в щелочную область.-

Поскольку большинство известных гемосорбентов оказывают значительное влияние на форменные элементы крови, разрушая до 80 % тромбоцитов и 25 % лейкоцитов (Лопухин, 1972), изучено влияние синтезированных сорбентов на этот процесс (табл.а). Видно, что

ЗЪбдица 8.

Влияние гелоаорбентов на некоторые компоненты крови

Компонент крови Исходная величина Концентрация иммобилизованного овомукоида, лг/г сорбента * 1 ** ъ 0 13,13 13,13 '

Лейкоциты, тис.± о,з 5,5 5,4 5,4 4,5

Тромбоциты, тс. ± 5 200 200 200 180

Эритроцита, ллн.+ 0,3 4,5 4,2 4,5 4,3

*) - объемное отношение кровь/сорбент равно 0,21; **)- объемное отношение кровь/сорбент равно о,65.

использование сорбентов практически не влияет на концентрацию форменных элементов крови даже в заведомо экстремальных условиях проЕздония эксперимента (при высоком объемном отношении сорбент/

кровь). Причина этого заключается в атравматичности самого гидро-гелевого сорбента, а также в способности овомукоида ингибировать адгезию и агрегацию тромбоцитов. Так, относительная константа агрегации тромбоцитов в плазме при введении в нее овомукоида в количестве 6,5x10"^ % снижается более, чем в три раза.

Таким образом, использование сополимеризационного подхода позволяет синтезировать биоспецифические сорбенты на основе белковых ингибиторов протеиназ, обладающие высокой емкостью по про-теиназам и высокой гемосовместимостью.

Все обнаруженные закономерности легли в основу создания ге-мосорбента "Овосорб", предназначенного для селективного извлечения протеиназ из крови больных. На гемосорбент утверждена научно-техническая документация, проведены широкие медико-биологические испытания на животных. На ПО "Белмедпрепараты" (г.Минск) выпущена опытная партия гемосорбента, которая успешно прошла клинические испытания.

Выделение и очистка протеолитических ферментов методом аффинной хроматографии является другой важной областью применения биоспецифических сорбентов на основе ингибиторов сериновых протеиназ. Высокая устойчивость выделенных в работе белков-ингибиторов к изменениям рн среды и воздействию таких факторов, как концентрированные растворы мочевины и гуанидшшюрида, облегчают подбор условий элвщш подвергающегося очистке фермента с сорбента, которые в большинстве случаев диктуются лишь его устойчивостью. Важным преимуществом белковых ингибиторов является высокая специфичность, что в сочетании с высокими значениями констант ассоциации позволяет проводить строго избирательное выделение определенного фермента из сложных смесей. На биоспецифичесган сорбентах, содержащих утиный овомукоид, шггибитор трипсина из фасоли и ви, был выделен и очищен ряд протеолитических ферментов различного происхождения (табл.9) и изучены их физико-химические свойства, химический состав и и-концевые аминокислотные остатки, а также специфичность действия.

Проведенные исследования показали, что использование синтезированных сорбентов позволяет получать высокоактивные, практически полностью гомогенные препараты протеолитических ферментов.

Попытка использовать иммобилизованный би для аффинной хроматографии цистекновых протеиназ латекса папайи была предпринята на основании опытов, в которых наблюдали образование осадка при

смешении латекса с БТ1, сопровождающееся снижением его протеоли-тической активности, пропорциональным количеству добавленного ингибитора. При вфЗмнной хроматографии все активные и неактивные, но сохранившие способность к активации, молекулы протеиназ латекса задерживаются на колонке с иммобилизованным БТ1. Основная часть связавшегося при этом активного белка элшруется при увеличении ионной силы элюирующего раствора, дополнительно активный материал может быть элшрован при рН 2. Исследования с помощью ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе сь-бв показали, что в первом случае активный материал содержит в основном различные формы химопапаина, а во втором - папаин и пептадазу А.

Таблица 9.

Пратедлшшеские ферленгт, выделенные и очищенные путел аффинной хроматографии с приленениел иллобииизованных белковых ингибиторов протеиназ

Фермент Ингибитор Источник получения

Трипсин

а-Химотрипсин

Трипсиноподобная протеиназа из Str. grlseua

Эластазоподобные ферменты из Вас. meaenterícua

Протеиназы латекса дынного дерева (Carica papaya)

Утиный овомукоид, STI Утиный овомукоид Ингибитор из фасоли

Утиный овомукоид

STI

Препараты НПО

"Виолар"

Препарат "Проназа", Kaken Chem. Оо., Япония

Культуральная

жидкость Вас. mesenterlcua

Латекс плодов данного дерева, выращенного в условиях Черноморского побережья Кавказа

Возможность применения иммобилизованного ЗТ1 для очистки ци-стеиновых протеиназ не ограничивается ферментами латекса папайи. Аналогичным образом били получены очищенные препараты Оромелаина, цистеиновой протеиназы из стеблей ананаса (Апапаа сотозиз Ь.).

Полученные результаты имеют как практическое, так и теоретическое значение в плане изучения механизма взаимодействия белковых ингибиторов с ферментами. Поскольку в втом процессе важную роль играет остаток Р1 ферментсвязыванцего центра ингибитора, существенным является присутствие в молекуле зи в этом положении остатка аргинина (Огаяа, 1966). Известно, что цистеиновне протеиназы латекса папайи и бромелвин с высокой скоростью гидролизувт

связи, образованные остатками аргинина (ЛоЫпбоп, 1975). Таким образом, можно предположить, что в рассмотренных случаях взаимодействие субстратсвязываюцего участка активного центра ферментов с остатком Р1 в молекуле ингибитора оказывается достаточным, чтобы обеспечить специфическое связывание.

Заключение

Проведенная работа, являясь завершением определенного этапа исследований, в то же время может рассматриваться как основа для дальнейшего изучения белковых ингибиторов протеиназ как в теоретическом, так и практическом аспектах.

Одним из основных представляется эволюционный аспект работы. Установлено, что многообразие форм белковых ингибиторов протеиназ у высших растений не является следствием протеолитической деградации одной или нескольких исходных форм, а обусловлено генетически™ причинами. Полученные результаты в совокупности с литературными данными показывают, что в тканях высших растений, животных и у микроорганизмов присутствуют два типа белков-ингибиторов протеиназ, одни из®которых представляют собой узкоспецифичные ингибиторы, содержащие единственный центр связывания ферментов, другие - с широкой специфичностью, обладающие деумя и более фер-ментсвязывэющими центрами. Специфичность действия одноцентровых белков, как показано на примере ингибиторов трипсина и хммотрип-сина из семян гледичии,.по-видимому, определяется, в первую очередь, природой аминокислотного остатка, находящегося в положении Р1 реактивного центра.

Обнаружено, что могут существовать определенные различия в механизме взаимодействия одно- и многоцентровых ингибиторов с протеиназами. При образовании комплексов с одноцентровыми ингибиторами, как показано на примере соевого ингибитора трипсина и основного панкреатического ингибитора трипсина, определяющую роль играет взаимодействие с группами каталитического участка активного центра фермента, в то время как многоцентровые (например, ингибитор трипсина из фасоли, ингибитор из картофеля и утиный овомукоид) связываются с его субстрзтсвязывавдим участком, очевидно, за счет гидрофобных контактов. В связи с этим можно высказать предположение, что вначале еозникли специфические одноцентровые ингибиторы, функция которых заключалась в подавлении активности строго определенных ферментов или даже одного фермента. Затем в процессе эволюции путем дупликации и слияния генов одноцентрового

ингибитора с последующими мутациями возникли дву- и более центровые ингибиторы, действие которых уже направлено на нейтрализацию активности широкого спектра протеиназ различного происхождения. Это предположение подтверждается тем, что двуиентровые ингибиторы протеиназ обнаружены у представителей эволюционно наиболее молодых семейств растений (фасоль, картофель).

Поскольку молекулы белковых ингибиторов протеиназ в большинстве случаев обладают высокой способностью к ассоциации, было высказано предположение, что на первом этапе возникновения двуцент-ровых ингибиторов образовались стабильные димеры (Мосолов, 1982). Предполагают, что аналогичным образом шла эволюция карбоксильных протеиназ (Tang, 1979). В связи с этим обладающие субъединичной структурой "цистеин-незанисимые" ингибиторы семейства ингибитора I из клубней картофеля, к которым отнесен и впервые описанный в работе ингибитор протеиназ микроорганизмов из семян кукурузы, можно рассматривать как переходные формы от одноцентровых белков-ингибиторов к многоцентровым. В какой степени ингибиторы такого типа распространены у растений, стоящих на различных этапах эволюционного развития, покажут дальнейшие исследования.

Важной задачей является изучение путей участия ингибиторов протеиназ в регуляции конкретных биохимических процессов, особенно на внутриклеточном уровне. Однако далеко не во всех случаях известны ферменты, подавление активности которых является функцией данного ингибитора in vivo. Это связано в значительной степени с недостаточной изученностью самих эндогенных протеаз и, в особенности,внутриклеточных ферментов, у растений и микроорганизмов.

Разрушение ингибиторов а-химотрипсина в процессе хранения клубней картофеля позволяет предположить, что одна из функций белковых ингибиторов протеиназ растений заключается в подавлении протеолитичеекого расщепления эндогенными ферментами запасных белков в покоящихся запасающих органах растений.

Ингибиторы, выделенные из семян кукурузы и клубней картофеля, способны подавлять активность протеиназ микроорганизмов. Очевидно функции этих белков заключается в нейтрализации протеиназ фитопатогешшх микроорганизмов и они наряду с фитоалексинами и некоторыми другими белками могут играть важную роль в защите растений. Следует отметить, что в плане изучения защитных функций ингибиторов протеиназ у растений сдельны лишь первые шага. Однако, уже показана важная роль белков-ингибиторов, в том числе и

изученных в работе ингибиторов из фасоли и картофеля, в устойчивости растений к насекомым вредителям и фитопатогенным микроорганизмам (Mosolov et al., 1976; Ryan, 1978, 1983; Hilder et al., 1987). Принимая во внимание исключительную значимость изучения механизмов естественного иммунитета у растений для защиты урожая от сельскохозяйственных вредителей и болезней, продолжение и расширение исследований в этом направлении с целью создания экологически безопасных средств защиты и хранения продуктов сельского хозяйства представляется особенно важным.

Обнаруженная в работе способность ряда ингибиторов эффективно подавлять активность лизосомальных протеиназ, которые, как показано в последние года (Веремеенко, 1971, 1988; Sohiessier et al., 1977), участвуют в патогенезе многих тяжелых заболеваний (например, эмфизема, септические и воспалительные процессы и ряд других), является фундаментом для исследования более широкого круга ингибиторов, в том числе, растительного происхождения с целью их использования в медицине.

Чрезвычайно широкие возможности открываются при использовании иммобилизованных ингибиторов протеиназ. Развитые в работе идеи и подходы к получению иммобилизованных ингибиторов протеиназ оказались перспективными для решения ряда актуальных проблем биотехнологии и медицины. Реализация предложенных подходов привела к созданию новых типов водорастворимых иммобилизованных белков-ингибиторов и нового поколения гемосорбентов для высокоэффективного и селективного извлечения из крови протеолитических ферментов.

ВЫВОДЫ

1. Выделены новые белки-ингибиторы сериновых протеиназ из семян фасоли, гледичии, кукурузы, клубней картофеля и белка яиц утки. Исследован их химический состав, м- и с-концевые аминокислотные последовательности, физико-химические свойства, особенности пространственной организации и специфичность действия на ферменты.

2. Белки-ингибиторы трипсина и а-химотрипсина в семенах фасоли представлены четырьмя истинными язоформами, имеющими одинаковую молекулярную массу (« юооо), но различающимися по положению изо-электрических точек, аминокислотному составу, строению н-концевых аминокислотных последовательностей и специфичности действия на

ферменты, Белки содержат два независимых ферментсвязывающих центра с четко разграниченной специфичностью. У всех изоформ в центре, ответственном за связывание трипсина, присутствует остаток лизина. Установлена первичная структура областей трипсин- и хкмо-трипсинсЕязывавдих центров белка-ингибитора с р1 4,3 (преобладающая форма). Показана высокая степень гомологии первичной структуры этого изоингибитора и ряда других низкомолекулярных ингибиторов сериновых протеиназ из бобовых растений, принадлежащих к семейству родственных белков-ингибиторов, типичным представителем которого является ингибитор Баумана-Вирк из сои.

3. Белки-ингибиторы трипсина и а-химотрипсина в семенах гледичии представлеш двумя близкими по молекулярной массе (^ 20000) множественными формами, одна из которых действует на трипсин, другая - на а-химотрипсин. Оба ингибитора отнесены к 'семейству родственных белков-ингибиторов, типичным представителем которого является высокомолекулярный ингибитор кунитца из сои. В семенах гледичии отсутствуют низкомолекулярше ингибиторы протеиназ семейства ингибитора Еаумана-Бирк. На основании полученных экспериментальных данных и анализа литературы высказано предположение, что наличие или отсутствие ингибиторов определенных типов может служить таксономическим признаком у бобовых.

4. Ингибитор трипсина в семенах гледичии представлен тремя истинными изоформами, образование которых, по-видимому, обусловлено существованием множественных аллелей одного генного локуса. Установлено, что в положении Р7 реактивного центра изоингибиторов трипсина расположены остатки лизина. Ингибитор а-химотршсшт представлен двумя множественными формами. В полокешт реактивного центра преобладающей Форш идентифицирован остаток метиони-нч. Это указывает на то, что специфичность действия ингибиторов, принадлежащих к одному семейству родственных белков-ингибиторов, определяется, в первую очередь, природой аминокислотного остатка, находящегося в положении р1 ферментсвязываюцего центра.

5. Ингибитор сершювнх протеиназ микроорганизмов из семян кукурузы (н 17000) состоит из четырех различавшихся субъедишщ, каждая из которых в отдельности обладает активностью по отношению к микробной протеиназе. Ингибитор образует с ферментами устойчивые комплексы различного состава: "насыщенные", содержащие одну нсдиссоцинрованную молекулу ингибитора и две молекулы фермента, и "ненпсыщетше", в которых с одной недиссоциированнсй молекулой

ингибитора связана только одна молекула фермента.

Установлено, что ингибитор из кукурузы относится к типу ингибиторов сериновых протеиназ микроорганизмов, в ферментсвязываю-щих центрах которых присутствует остаток метионина.

6. Показано, что молекула термостабильного'ингибитора из клубней картофеля с р1 7,3 и молекулярной массой =* зоооо состоит из двух одинаковых субъединиц, каждая из которых содержит два независимых центра связывания трипсина и а-химотрипсина. Установлено строение и локализация обоих ферменгсвязываюцих центров в молекуле ингибитора. Низкомолекулярные'термостабильные ингибиторы (мг* 5000) представлены тремя множественными формами, две из них специфически подавляют активность а-химотрипсина, третья - трипсина и а-химотрипсина. На основании изучения иммунологических свойств выделенных ингибиторов и динамики их превращений в процессе хранения клубней картофеля сделано заключение, что низкомолекулярные ингибиторы не возникают в результате ограниченного протеолиза высокомолекулярных форм ингибитора, а их синтез обусловлен генетическими причинами.

7. Показано, что овомукоид из бежа яиц утки содержит три независимых ферментсвязывающих центра: два равноценных центра связывания трипсина, в состав которых входят остатки лизина, и один центр связывания а-химотрипсина. Ингибитор способен одновременно связать три молекулы фермента. Впервые для ингибиторов сериновых протеиназ, имеющих несколько ферментсвязывающих центров, обнаружено, что структура комплекса ингибитора с ферментами зависит от порядка присоединения последних. При этом способность протеиназы связываться с каждым центром определяется состоянием остальных реактивных центров ингибитора.

8. Разработан и экспериментально проверен способ синтеза иммобилизованных ингибиторов сериновых протеиназ ацилированием аминогрупп молекулы белка хлорэнгидридом ненасыщенной кислоты и последующей сополимеризацией с гидрофильными мономерами. Впервые обнаружена зависимость активности водорастворимых иммобилизованных ингибиторов протеиназ от природы полимера-носителя, что позволяет разработать' подходы к регулированию активности иммобилизованных белков. Продемонстрирована возможность целенаправленного регулирования эффективного оптимума рн действия иммобилизованных ингибиторов путем изменения заряда матрицы.

9. Обнаруженные закономерности легли в основу создания нового

поколения высокоспецифических гемосорбентов на основе белковых ингибиторов протеиназ для селективного извлечения протеиназ из крови. В модельных условиях и в экспериментах на животных продемонстрирована применимость гемосорбентов для удаления из крови избытка протеолитических ферментов. Разработан технологический регламент получения гемосорбента "Овосорб" на основе овомукоида из белка утиных яиц и на 110 "Белмедпрепараты" выпущена опытная партия гемосорбента, успешна прошедшая клинические испытания при лечении заболеваний, связанных с активацией протеолиза.

10. Разработаны простые и эффективные методы разделения и очистки протеолитических ферментов животного, растительного и микробного происхождения на иммобилизованных ингибиторах серино-вых протеиназ.

По материалам диссертации опубликовано 7 о работ. Основное содержание отражают следующие статьи:

1. Мосолов В.В., Малова Е.Л., Валуева Т.Д., Шулышна А.И. Свойства ингибитора сериновых протеиназ из картофеля.//Биоорганич.химия. 1975.Т.1.* 10.С. 1449-1457.

2. Мосолов В.В., Валуева Т.А., Соколова Е.В., Антонов В.К. Взаимодействие а-химотрипсина, метилированного по гистидину-57, с природными ингибиторами.//Докл. АН СССР.1976Л'. 221 .№ 2. С. 4844873. Мосолов В.В., Федуркина Н.В., Валуева Т.Д., Соколова Е.В.

Спирторастворимый ингибитор трипсина из фасоли.//Г1рикл. биохим. И микробиол.1976.Т.12.Ji 1. С. 37-44.

•4. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Трипсинсвязывавдий центр ингибитора сериновых протеиназ из картофеля.//Биоорганич. химия. 1976. Т.2.* ю.С. 1389-1395.

5. Валуева Т.А., Зиначева A.B., Мосолов В.В. Химотрилсинсвязыва-ющий центр ингибитора сериновых ¡тротеиназ из картофеля.//Виоорга-ганич. ХИМИЯ.1977.Т.З.* 9.С. 1273-1280.

6. Мосолов В.В., Федуркина Н.В., Валуева Т.А. Выделение и свойства изоингиоиторов трипсина из фасоли.//Биохимия.1977-Т.42.* 7.С. 1201-1212.

7- Валуева Т.Д., Зшачева A.B., Мосолов В.В. Локализация трип-синсвязывающего центра в молекуле ингибитора сериновых протеиназ из картофеля.//Докл. АН СССР.1977.Т.237.* 6.С. 1513-1516.

8. üosolo? V.V., Fedurktna N.V,, Valueva Т.A. Interaction of

trypsin-like protease from Streptomyces grlseue with an Immobilized inhibitor from kidney bean. // Bioohim. et Biophys. Acta. 1978. V.522.P.187-194.

9. Шульгин M.H., Валуева Т.Д., Кестере А.Я., Мосолов B.B. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматогра-Зми на трипсин-сефарозе.//Биохимия. 1981 .Т.46.Я» з.С. 473-479.

10. Мосолов В.В., Валуева Т.А., Мзлова Е.Л., Колосова Г.В., Че-бан А.Н. Строение реактивных центров белка-ингибитора сериновых протеиназ из фасоли.//Биохимия.1982.Т.47.Л 4.С. 561- 568.

11. Валуева Т.Д., Валуев Л.И., Ванчугова Л.В., Маклакова И.А., Мосолов В.В., Плата H.A. О регулировании оптимума pH действия иммобилизованных белков.//Прикл. биохимия и микробиол. 1982. Т.18. * з.С. 346-351.

12. Валуева Т.А., Колосова Г.В., Мосолов В.В., Валуев Л.И., Плата H.A. Способ очистки ингибиторов протеиназ.//Авторское свидетельство СССР Я 964533. 1982. Б.И. Я 37.

13. Мосолов В.В., Колосова Г.В., Валуева Т.А., Дронова Л.А. Ингибитор трипсина из семян гледичии (Gleditala triacanthoa L.). // Биохимия. 1982.Т.47.Я 5.с. 797-802.

14. Мосолов В.В., Валуева I.A., Колосова Г.В. Выделение белка-ингибитора химотрипсина из семян гледичии .(Gleditala triacanthoa L.).//Биохимия.1982.Т.47.Я 12.С 2015-2021.

15. Валуева Т.А., Малова Е.Л., Колосова Г.В., Чебан А.Н., Куликов В.А., Мосолов В.В., Северин Е.С. Выделение и характеристика белка-ингибитора трипсина и химотрипсина с pi 4,3 из семян фасо-С0ЛИ.//ПрИКЛ. бИОХИМ. И микробиол. 1983.Т. 19-Я 1. С. 116-123.

16. Маклакова И.А., Валуева Т.А., Колосова Г.В., Валуев Л.И., Мосолов В.В., Плата H.A. Ковалентная иммобилизация панкреатического ингибитора трипсина на полимерном носителе.// Прикл. биохим. и микробиол.1983.Т.19.* 5-С. 654-658.

17. Колтуковз Н.В., Валуева Т.А., Бондарчук A.A., Захарова И.Я., Мосолов В.В. Очистка протеолитических ферментов ВасШиз тезеп-tertcus методом аффинной хроматографии.//Прикл. биохим. и микробиол. 1984.Т.20.* 1.С. 64-68.

18. Мосолов В.В., Постанова Е.А., Валуева Т.А. Взаимодействие цистеиновнх протеиназ с соевым ингибитором трипсина (ингибитор КуНИТЦа).//ПрИКЛ. бИОХИМ. И Микробиол.1985.Т.21.Я 2.С. 167-172.

19. Плата H.A., Валуев Л.И., Валуева Т.А., Маклакова И.А., Чупов В.В., Мосолов В.В., Акопян В.Г., Кондаков В.Т., Щербачев В.В.

Биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ и его варианты.//Авторское свидетельство СССР № 1137383. 1985. Б.И. » 4.

го. Колтукова Н.В., Бондарчук A.A., Захарова И.Я., Валуева Т.Д.» Мосолов В.В. Некоторые физико-химические свойства протеиназ Bacillus тезеп1ег1сиа.//Прикл. биохим. и микробиол. 1985. Г.21 .№ 4-0. '495-500.

21. Валуева Т.А., Маклакова И.А., Валуев Л.И., Мосолов В.В., Платэ H.A. Биоспецифический сорбент для удаления протеиназ из биологических жидкостей.//Вопросы мед.химии.1985.Т.31. Я> 4.С.34-39.

22. Кладншщая Г.В., Валуева Т.А., Мосолов В.В. Химическая модификация ингибитора трипсина из гледичии.//Биохимия.1985.Т.50.Л 9. С. 1488-1492.

23. Малова Е.Л., Чебан А.Н., Валуева Т.А., Мосолов В.В. "Двуглавые" изоингибиторы сериновых протеиназ из фасоли.//В:"Современные проблемы биоорганической химии и химии природных соединений". Москва. ВИНИТИ. 1985.3i З.С. 161-165.

24- Валуева Т.А., Кладницкая Г.В., Мосолов В.В. Функционально важные аминокислотные остатки в ингибиторе химотрипсина из гледичии. //Биохимия.1986.Т.51.» 10.С. 1667-1672.

25- Ревика Т.А., Валуева Т.А., Ромашкин В.И., Мосолов В.В. Низ-ксмолекулярнне ингибиторы из клубней картофеля.//Биохимия. 1987. T.52.J6 4.С. 683-689.

26. Ревина Т.А., Чередникова Т.В., Валуева Т.А., Ромашкин В.И., Мосолов В.В. Иммунологическое изучение ингибиторов протеиназ из клубней картофеля.//Докл. ВАСХНИЛ.1987.Л 12.С. 3-9. . 27- Валуева Т.А., Костанова Е.А., Мосолов В.В. Синтез, свойства и некоторые перспективы применения иммобилизованных природных ингибиторов.// В :"Новые методы практической биохимии". Москва. "Наука ".1988. С. 13-19.

28. Валуева Т.А., Синаки В.А., Валуев Л.И., Чупов В.В., Мосолов В.В., Платэ H.A. Синтез и свойства биоспецифических сорбентов на основе белковых ингибиторов протеиназ.// Биотехнология.1988.Т.4. JS 4.С. 525-533.

29. Ванчугова Л.В., Валуева Т.А., Розенфельд Ы.А., Сигани В.А., Мосолов В.В., Валуев Л.И., Платэ H.A. Особенности взаимодействия многоцентрового ингибитора протеиназ с трипсином и а-химотрипси-Н0М.//Д0ХЛ. АН СССР.1983Л'.300.» З.С. 635-63730. Valueva Т.А., Sul/gin И.Н., Crigorjeva L.I., Sokolova E.V.,

Livenskaya 0.A. Isolation and characterization of protein inhibitors of microbial proteinases from cereal seeds.// Biol.Zent.bl. 1988.V.1071 .P. 51-52.

31. Ванчугова Л.В., Валуева Т.А., Ромашкин В.И., Розенфельд М.

A., Валуев Л.И., Мосолов В.В., Платэ Н.А. Взаимодействие овому-коида из белка утиных яиц с сериновыми протеиназами.// Биохимия.

1988.Т.53.* 9.С. 1455-1461.

32. Ромашкин В.И., Валуева Т.А., Ревина Т.А., Мосолов В.В.- Изо-электрические спектры белковых ингибиторов протеиназ из клубней различных сортов картофеля.//Докл. ВАСХНИЛ. 1988. * 9.С. 12-15.

33-Валуева Т.А., Григорьева Л.И., Мосолов В.В., Платэ Н.А., Валуев Л.И., Синани В.А., Чупов В.В., Николайчик Л.В., Мазур Л.И., Николайчик В.В., Царенков В.М., Хроненко Г.Б., Какарека А.В., Ромашкин В.И. Способ получения овомукоида.//Авторское свидетельство СССР X 1404513-1988. Б.И. №23.

34. Костанова Е.А., Валуева Т.А., Мосолов В.В., Головкин Б.Н. Сравнительное изучение протеиназ из плодов и листьев дынного дерева. //Прикл. биохим. и микробиол.1988.Т.2 46.С. 795-801.

35. Ревина Т.А., Чередникова Т.В., Валуева Т.А., Ромашкин В.И., Мосолов В.В. Множественные Формы ингибиторов сериновых протеиназ из клубней картофеля.//Изв. АН СССР. 1988. Сер. биологич. № 6. С. 866-872.

36. Валуев Л.И., Валуева Т.А., Ванчугова Л.В., Синани В.А., Чупов В.В., Плата Н.А. Синтез и свойства биоспецифических гидроге-левых сорбентов с иммобилизованным природным ингибитором протеиназ. //В: Полимеры медицинского назначения. Москва. ИНХС АН СССР.

1989.С. 7-22.

37. Платэ Н.А., Валуев Л.И., Ванчугова Л.В., Валуева Т.А., Постников В.А., Синани В.А., Чупов В.В. Особенности конформационного поведения сополимеров гидрофильных мономеров и ненасыщенных производных белков.//Докл. АН СССР.1989.Т.307.» З.С. 632-635.

38. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А., Чередникова Т.В., Мосолов

B.В. Множественные формы ингибитора трипсина из семян гледичии.// Биохимия.1939.Т.54.С. 593-600.

39. Валуева Т.А., Григорьева Л.И., Потапенко Н.А., Мосолов В.В. Ингибитор протеиназ микроорганизмов из семян кукурузы.// Прикл. биохим. И микробиол. 1989.Т.25.* 4.С. 477-484.

• ' A-S.KO

TII664 от 9/Х1-89г.Зак.1Ь06рЛ'ирЛОО.Тил.ВУО "Знание"