Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительные исследования панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов тихого океана

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительные исследования панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов тихого океана"

[Мхоокеэддюй!-, научно-исследовательский рыбо.чозяйственкый

с. о

центр

На правах рукописи

ПИВНЕНКО Татьяна Николаевна

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ ГИДРОБИОНТОВ ТИХОГО ОКЕАНА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток

Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохоэяйственный

центр

На правах рукописи

ПИВНЕНКО Татьяна Николаевна

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ ГИДРОБИОНТОВ ТИХОГО ОКЕАНА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток

Работа выполнена в Тихоокеанском научно-исследователь--ском рыбохозяйственном центре (ТИНРО-центр) , г. Еладивосток

Научный консультант - доктор биологических наук, лауреат Государственной премии СССР, профессор Л.М. Зпштейн

Ойициалъшзэ оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Э.Я. Костецкий

доктор биологических наук, профессор С.С. Михайлов

доктор биологических наук, профессор Е.В. Розенгарт

Вэдущая оргаснизацяя - Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится декабря 1958 г. в

13 час на заседании специализированного совета Д. 002. 89. 01. по защите диссертаций на соискание ученой степе™ доктора биологических наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, Санкт -Петербург, проспект М.Тореза, 44).

С диссертацией мотаю ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Автореферат разослан " " _ 1998 г.

Ученьй секретарь специализированного совета Д. 002. 89. 01. доктор биологически;-: наук,

профессор Маслова М.Н.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Исследование ферментов как биологических катализаторов представляет собой одно из наиболее перспективных направлений современной биохимии. Теоретические аспекты взаимосвязи структуры и механизма действия ферментов, а также направления их практического применения исследуются и разрабатываются на протяжении многих лет. Однако, эта проблема не теряет своей актуальности, так как для развития современных технологических процессов необходимо упростить и удешевить многоступенчатую и высокозатратную процедуру выделения ферментных препаратов, а для совершенствования способов применения определить тонкие механизмы действия биокатализаторов, находить пути регулирования процессов in vivo и in vitro, масштабировать их.

В этом смысле протеолитические ферменты представляют собой весьма обширный и благодатный материал, область применения которого распространяется от кожевенной н текстильной до пищевой промышленности, а в медицине - от микробиологии до онкологии. Протеиназы включены в реализацию многих клеточных функций: биогенез структур, фагоцитоз, деление, движение, гуморальная, нейро- и имму-норегуляция. В таких процессах как свертывание крови, активация системы комплимента, переваривание пищи протеолиз служит не только для запуска, но и для реа-лгояцт-'и всего процесса. Это определяет неограниченные возможности применения проте!иаз п качестве лекарственных средств.

Одним го богатейших источников для выделения протеолитических ферментов являются внутренние органы морских организмов. Перспективы их изучения и использования определяются обширной сырьевой базой за счет утилизации отходов рыбного промысла и неординарными свойствами биокатализаторов из морских организмов. Поиск и идентификация новых ферментов, обладающих необычными свойствами, весьма актуальны для биохимии, так как позволяют выявить новые принципы и механизмы каталитического действия. Одним из таких необычных свойств ферментов гидробионтов, ранее неизвестным для сериновых протеиназ, оказалась их способность гидролнзовать нативный коллаген.

сокращения: акк - Е-аминокапроновая кислота, атээ - этиловый эфир вцетил-1-тирозина, бтмэ -метиловый эфир ыа-бензоил-1-тирозина, бз - бе roo ил, бамэ - метиловый эфир na-бснзоил-!-аргинина, бапна - гара-ншроанилид ка-беюояя-!-зргинина, елеймэ - метиловый эфир na-бегооил-]-лейцива, гау- гегерояухеин,, гфлна - пара-ннтроянилвд гаугарил-1-фенилаланина, гмда - 1,6-гексаметилендиамин, дмсф - д им етилсульфоиил фторид, дсп- додецилсульфат натрия, дфф -диюопропилфторфосфат, дцкд - дицихдогексиикарбодиимид, пааг - полна криламидный геяь, тамэ - метиловый эфир n-Toírerr-l-apnimrjra, тлмэ - метиловый эфир к-тозил-1-лизина, сти -соевый трипсииовый ингибитор (кунятца), тлхмк - хлоржггилхетон м-ипил-л-ияшн, тфхмк -хлорметилкетон №тозил-1-фенилш1а!шна, эдта - этилекдкмтнгетраацетет

Первоначгшьво такие ферменты были обнаружены у ракообразных, паразитических насекомых и гельминтов, что связывалось с приспособлением к условиям обитания и пищевым потребностям (Grant, Eisen, 1980, Bowles at ei., 1988). В дальнейшем эти коллагеиолктичеекмг ферменты были идентифицированы как трипсины и химо-трипсины (Сахаров, 1992, Рудеисквя и др.,1996). Однако оставались не выясненными дьа основных момента. Во-первых, факторы, определяющие проявление указанных свойств (эволюционные или адаптационные) и, во-вторых, механизм коллагенолиза в присутствии сериновых протеиназ. Ферментативная деструкция коллагена, как известно, является весьма сложным процессом, осуществляется узкоспецифичными металлозавнеимыми протеиназами и имеет mhoi офакторную систему регуляции (Соловьева, 1994). Нарушения этих процессов вызывают ряд патологических изменений всего организма. Изучение коллагенолиза в различных условиях, в том числе под действием сериновых протеин аз, поможет уточнить детали его протекания и экзогенной регуляции, а также значительно расширить сферу применения вновь предлагаемых ферментных препаратов.

Сравнительное изучение свойств протеиназ различного происхождения позволит установить взаимосвязи между различиями в строении молекул и осуществлении ими каталитических функций, а также дать рекомендации по их практическому применению.

Цып, и задэчм исследовании. Цзиыо настоящей работы явилось сравнительное исследование сериновых протеиназ гидробяоытоа Тихого океана, включая, во-первых. установление закономерностей распределения фермецтов в панкреатической ткани животных различных таксономических групп согласно тканевой активности и физико-химическим свойствам, во-вторых, определение основных каталитических свойств и субстратно-ингябиторной специфичности, в-трзтьих, разработка эффективных методов выделения и стабилизации ферментов, и, в-четвертых, использование полученных результатов для создания наиболее рациональных способов применения ферментов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- исследовать состав панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов, включая активности по различным субстратам, состав и заряд изоформ, молекулярную массу,

- определить перспективные объекты для получения ферментных препаратов,

- определ}ггь оптимальные условия выделения ферментов, разработать методы получения высожоочнщешшх комплексных препаратов,

изучить взаимодействие ферментов с растворимыми и иммобилизованными лиган-дами, синтезировать эффективные аффинные сорбенты, получить гомогенные препараты трипсина и химотрипсина,

- сравнить субстратно-ингибиторную специфичность ферментов различного происхождения и установить роль отдельных ферментов в процессе гидролиза коллагена,

определить эффективные способы стабилизации ферментов и разработать методы получения препаратов пролонгированного действия,

- разработать способы применения ферментных препаратов с учетом их субстратной специфичности и физико-химических свойств.

Научная новизна работы.

1. Впервые проведен сравнительный анализ широкого спектра свойств панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов различных таксономических групп.

2. Выявлены общие закономерности, связывающие свойства ферментов, строение пищеварительной системы и таксономическое распределение видов.

3. Установлены основные различия в осуществлении каталитических функций ферментами анионного и катионного зарядов. Уточнены особенности субстратной и ингибиторной специфичностей.

4. Предоожен двухстадийный механизм гидролиза фибриллярного коллагена в присутствии экзогенных сериновых протеиназ.

5. Исследовано взаимодействие панкреатических сериновых протеиназ с растворимыми и иммобилизованными лигандами и выдвинуты предположения о структурных различиях в составе активных центров, синтезированы аффинные сорбенты, соответствующие специфичности протеиназ.

6. Разработаны и обоснованы методы очистки, стабилизации, регуляции активности и использования протеолитаческих ферментов гидробионтов.

Пра/стичесггая значимость.

1. Выполненные исследования послужили основанием для выбора наиболее перспективных объектов для выделения ферментов.

2. Разработан универсальный метод получения высокоочищенных комплексных препаратов сериновых протеиназ с использованием ступенчатой ультрафильтрации, применимый ко всем источникам сырья, включая беспозвоночных, рыб, морских л наземных млекопитающих.

3. Предложены высокоспецифичные аффинные сорбенты на основе доступных компонентов для выделения анионных форм трипсина и химотрипсина. Оптимизированы условия проведения хроматографии.

4. Разработаны методы иммобилизации ферментов и получения термостабильных и кислоторезистентных препаратов.

5, Разработаны способы применения сериновых протенназ гидробионтов в микробиологической, пищевой ¡1 рыбной промышленности, сельском хозяйстве, медицине.

Основные тголожезми. вьшосгасые на защиту

1. Данные о распределении панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов согласно их активности и физико-химическим свойствам - основа направленного поиска перспективных объектов исследования и выделения ферментных препаратов.

2. Способность к глубокой деструкции коллагена сериновыми протеиназами рыб и ракообразных • принципиальный отличительный признак субстратной специфич-ностн этих ферменте®.

3. Гидролиз коллагена в присутствии экзогенных сериновых протеиназ включает по крайней мере две стадии: а) инициация н распад трехцепочечной молекулы коллагена, б) гидролиз до низкомолехуляриых компонентов. Гидролиз коллагена может быть осуществлен с низкой скоростью при введении реагентов - доноров дисулъфид-ных связей при отсутствии экзогенных ферментов.

4. На регуляцию процесса кодяа; енолиза оказывают влияние ингибиторы метаядо зависимых протеиназ, ингибиторы сериновых протеиназ, реагенты - доноры диеулъ-фидных связей, в число которых входят те же сериноаые протенназы и белковые ингибиторы. В присутствии последних процесс принимает обратимый характер, зависящий от концентрации ингибитора.

5. Анионные трипсины (гидробкоатов) характеризуются высокой эффективностью гидролиза эфирных и нитроаншшдцых субстратов, увеличением цуклеофильности активного центра в щелочной зоне рН, повышенной гадрофобностью субстрат-связывающих участков и снижением селективности взаимодействия с растворимыми и иммобилизованными лнгандамя, специфичными для химотрипсийа.

6. Аффинные сорбенты, содержащие ГМДА в качестве лиганда или пространственной группы, обеспечивают селективное связывание и высокую степень очистки анионных трипсинов к химотркпсииов. Ионно-адсорбционная и ориентированная иммобилизация ферментов эффективны для получения препаратов с повышенной термо- и кислотореаистентностью.

7. Панкреатические серииовые протеиназы гидробионтов - перспективные лекар-оттешгые и технические препараты для использования в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и других отраслях.

Публикации и апробация работы. Основное содержание работы изложено в 51 публикации, из которых 5 представляют собой авторские свидетельства на изобретения, 6 - патенты Российской Федерации.

Результаты работы были представлены на 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986); 1-ом Всесоюзном симпозиуме «Препаративная хроматография физиологически активных веществ на полимерных сорбентах» (Ленинград, октябрь 1988); Всесоюзном совещании «БАВ при комплексной утилизации гидробионтов» (Владивосток, ТИНЮ, май 1988); Всесоюзной конференции «Методы полупения, анализа и применения ферментов» (Рига, НПО «БИОЛАР» декабрь 1990); Всесоюзном совещании «БАВ гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты» (Владивосток, сентябрь 1991); Международной конференции «Технология переработки гидробионтов» (Москва, ВНИРО, 1994); научной конференции «Рыбохозяйственное исследование океана» (Владивосток, Дальрыбвтуз, 1996); Конгрессе «Поиск н создание лекарственных средств» (Москва, 1996); Втором биохимическом съезде (Мосхза, 1997), 2-ой дальневосточной региональной конференции с Всероссийским участием «Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке», Владивосток, 1998 г. Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результа ты работы и их обсуждение, изложенные в б-ти главах, заключение и выводы. Список использованной литературы включает 422 наименования. Работа изложена на 307 страницах печатного текста, иллюстрированного 36 рисунками и 67 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы Сбор биологического материала. Для выделения и исследования ферментов использовали панкреатическую ткань, а именно: пилорические придатки костистых рыб и иглокожих, гепатопанкреас ракообразных и моллюсков, поджелудочную железу хрящевых рыб и млекопитающих. Органы и ткани заготавливали на месте вылова и замороживали. Сырье хранили при температуре не менее минус 18° С, либо сублимировали и хранили в темноте без доступа воздуха при температуре не выше 10° С.

Определение ферментативной активности. Скорость деградации белковых субстратов оценивали по накоплению низкомолекулярных продуктов, определяемых

спектрофотометрически. При этом для растворимых или предварительно растворенных белков (гемоглобин, казеин, альбумины, протамин, производства НПО «БИОЛАР», а также денатурированный коллаген) количество пептидов определяли во фракции, неосаждаемой 5 % ТХУ, а для нерастворимых (фибрин, коллагены I типа из кожи теленка и ахилессовых сухожилий производства НПО «БИОЛАР») - послз фильтрации суспензии гидролизованного субстрата. Для каждого вида субстратов были подобраны оптимальные концентрации, при которых изменение скорости реакции имело линейную зависимость. В основу определения активности по низкомолекулярным субстратам были положены модифицированные методы Шверта и Такенака (1955) и Хаммеля (1959) для эфиров и Эрлангера (1961) для нитро-анилвдов соответствующих аминокислот (ТАМЭ, ТЛМЭ, БАМЭ, БАпНА, АТЭЭ, БТМЭ, ГФпНА производства «Sigma», США). Величина активности оценивалась по изменению концентрации расщепленного субстрата (мкМ) за единицу времени на мг белка. Кинетические параметры гидролиза субстратов V^ и Км , а также К; - обобщенную константу ингнбирования - рассчитывали согласно метода Ланнуивера-Берк в координатах двойных обратных величин 1/v и 1 /S.

Для разделения и очистки протеолитических ферментов использовали метод ступенчатой ультрафияьтрации с применением половолоконных мембран (фирма «Мифил», Россия) из ароматического полисульфона, имеющих значения номинальной отсекаемой молекулярной массы 100 к 15 кД и использованных последовательно. При этом на мембраны подавайся предварительно очищенный от взвесей водный экстракт измельченной панкреатической ткаяк. Для достижения полного выхода активного материала, а также активации проферментов экстракцию проводили в присутствии ионов кальция в течении 10-12 час при температуре 6-8° С. Полученные препараты лиофилгоировалн и использовали непосредственно, либо подвергали дальнейшей очистке. Молекулярную массу ферментов" и продуктов ферментативной деструкции определяли следующими методами: гель-фильтрацией на полизинилоксидных сорбентах «ТоуореагЬ, Япония, или электрофорезом в 7,5 или 10 % ПААГ в присутствий ДСН, согласно соответствующим калибровочным графикам. Для разделения изо-форм по заряду их молекул использовали нонообмешгую хроматографию на ДЭАЭ- и КМ-сефадексах, а для определения pi - изоэлектрофокусирование на пластинках ПААГ (LKB, Швеции) в градиенте рН от 3,0 до 6,0, создаваемом амфолинами.

Синтез аффинных сорбентов с использованием в качестве лигандов природных высокомолекулярных ингибиторов (тразилола, соевого ингибитора трипсина, озому-коида) проводили яри .активации матриц глутаровым альдегидом или на основе BrCN-акшЕированиой сефаршы 4В. Для связывания аминокислот (аргинина, лизнка, триптофана, тирозина и фгнплалаиияа) или их производных использовали конъюгаты 8

ГМДА или с-АКК с BrCN-актнвированной агарозой в присутствии ДЦКД. Сорбенты, предложенные для очистки анионных протеиназ, были синтезированы в Институте биохимии им. А-В.Палладнна, Институте физической химии, Институте молекулярной биологии и генетикн АН УССР в период 1985-1991 гг. Носители на основе бумаги и целлюлозы были активированы радиохимическим методом, предложенным А.П. Мелешевичем (1983), для получения альдегидных групп.

Для иммобилизации ферментов применяли альгинаты натрия и кальция производства ТИНРО-центра, а также эпителий слизистой оболочки кишечника, полученный на заводе медпрепаратов Санкт-Петербурга. В обоих случаях для иммобилизации не использовали дополнительных сшивающих реагентов.

Испытания ферментных препаратов проводили в НПО «Питательные среды» Махачкала, Приморском сельскохозяйственном институте, Владивостокском медицинском институте, рыбообрабатывающих предприятиях Приморского края я Сахалинской облаете и других учреждениях.

Для обеспечения достоверности данных проводили статистическую обработку, определяя среднюю квадратичную ошибку с учетом доверительного интервала Д = + 10 % н надежности Р = 0,85-0,95. Факторный анализ и многомерное шкалирование осуществляли в системе STATISTICA (Stat Soft Inc.USA). Для факторного анализа корреляционная матрица была составлена для 8 переменных с использованием метода главных компонент, число выделенных факторов 2, метод вращения осей не применялся.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Содержите н состав серяновых протенназ в панкреатической ткани

гвдробнонтов

Для установления закономерностей распределения ферментов трипсинового и химотрнпсинового типов в панкреатической ткани гидробионтов различных таксономических групп были исследованы основные каталитические и молекулярные свойства этих ферментов н проведено сопоставление полученных данных с имеющимися литературными сведениями. Панкреатическая ткань присутствует у всех рассмотренных видов животных в форме различных органо-ткалевых структур, но образует аналогичный по биологическим свойствам, ферментативным функциям (специфичности) и механизму действия набор протсолнтическнх ферментов.

Видовой состав объектов, взтых для сравнительного изучения, включает представителей следующих основных групп: моллюсков, иглокожих, ракообразных, рыб (хрящевых а костистых), млекопитающих (табл. I).

Таблица 1. Перечень видов, использованных для сравнительной оценки распределения и свойств трипсинов и химотрипсинов в панкреатической ткани _гндробкоктов по собственным и литературным данным_

БЕСПОЗВОНОЧНЫЕ ПОЗВОНОЧНЫЕ

Класс Иглокятие: Класс Хояшевые рыбы:

1. Кукумаршг «дакеказ Сиситагш japónica Морские звезды: 2. Asterias amurensis 3. Derir,asterias imbrícala! m 4. Aphslasreias japónica167 5. Distalasíerias nipón167 6. Paiiria pectinifera167 7. Lysastrc&oma authosticia,6J-16B 8. Evasíerias troctellí"1 Класс Ракя-сбржшые: 9. Краб камчисий Paralithoides camtschatica 10. Краб стригум Chionocctíes opilio 11. Краб водоагшй Cáncer pegums 12. KpaS манящий1" Uca pugilator 13-Крзб песчаный1'1 Рагшгиз pelagicus 14.Краб ш>ор!Щ;««дьго Corcinos rnaenxs 15.Креветкзт Penaeus japónica 16.Кревсгкз1ТО Procsmbrus clarhi í7.Криль гигзрктшгский Euphausia superta Класс Mwiwooas: 23. Кошачья акула УЛ Gingtyostcma cirratum 24. Акула катран418,344,315 Squahis acanthias 25.Акуяа полярная Somniosus pacijictis 26.Скат хьостокол418£>о5>,агк americana Класс Костистые рыбы:

27.Баррахудз Sphyraena barracuda4is 28.Терпуг одноперый Pleurogrammus azortus 29.Каыбала желтоперая Limando áspera 30. Сельдь тихоокеанская Clupca pallassi pallassi 31. Аггтоус151 Er.graulis euristole 32. Cí.ptfy'J-u"1*' Sardmops sagax 33. Мойва*®*1,134 MaUotus villosus 34. МйШтгй Theragra chalcogramma 35.Навата Elegirán gracilis 36.Троси гр^нландсках*59 Gadus ogac 37. ЮгргГ77*173 Cyprirms carpió 38. Cea?35 Parasihirus osotas 3&.Безжеяудо«лш рыба35" Tcmrogaizbnis adspersus 40. ДЕвжодьшшдая рыба145 Proiopízna aethiopicus 41.Форель рздужназ 27* Salmo gairdneri 42. Кета Onchorhyncus keía 43. Горбуша O. gorbusha 44. Чакычг O. tschawytcha 45. Нерка O. nerka 46. Кюкуч O. kisutch 47. Голец Salvelintis malma Класс Млекопитающие: 48. Кит усатый47 Ralacnopters acutorastrat 49. Мора Odobenus rosmakus linnaeus 50-Морской котик Callorhinus ursinus 51. Ларга Phoca larga 52. Бых*37 Bes taurus

18.Калъизр коиавдорский Berritcuihis jKogüter 19.Клдьмар тихоокеанский Todarodes расфсиз 20.Кальмар новозеландский Ommastrephes sloam 21.Мидия сьедобиаа Mytüus edulis 22.Гргбешох монский Pecten jesoensis

Протеолитическая активность панкреатической ткани гидробионтов. Удельную аггивкссть опредетялн по скорости деструкции казеина, гемоглобина и коллагена

при различных рН. Ветчины казенно- и коллагенолитической активности в условиях оптимальных для сериновых протеиназ изменялись в весьма широких пределах для отдельных видов внутри рассматриваемых классов. Однако соотношение активностей по указанным субстратам, выраженное в процентном отношении как коллаген-казеиновый индекс, имело минимальные пределы колебаний.

Этот показатель значительно снижался по мере продвижения от беспозвоночных и рыб к млекопитающим и оказался в большей степени связан с таксономическим распределением видов, чем с адаптацией к пищевым потребностям.

Активность, состав изоформ и молекулярная масса трипсинов и химотрип-синов. Все исследованные виды ракообразных и рыб содержали множественные анионные изоформы трипсина и химотрипсина, у беспозвоночных катионных форм не обнаружено, у рыб они представлены минорными компонентами, у млекопитающих преобладали катионные изоформы.

Наибольшей изменчивости подвержены свойства трипсинов различного происхождения, присутствующих у всех исследованных видов. Химотрипсин не был обнаружен у моллюсков и иглокожих. Активность этого фермента возрастала по мере разделения желудочного и кишечного пищеварения в ряду ракообразные - рыбы - млекопитающие и достигала максимума, у высших позвоночных. Наибольшее количество изоформ трипсина и химотрипсина обнаружено у костистых рыб, а также у ракообразных. Молекулярная масса трипсинов варьировала от 30-31 кД у ракообразных до 19-21 кД у морских млекопитающих, для химотрипсина пределы изменений существенно меньше - от 24-29 у рыб и ракообразных до 21-24 у морских млекопитающих.

Исследованные параметры можно разделить на две группы. К первой группе относятся: активности по белковым, эфирным и амидным субстратам, отражающие, главным образом, количественное содержание ферментов в панкреатической ткани, величины этих показателей изменялись в довольно широких пределах внутри выделенных таксономических групп, что, наиболее вероятно, связано с адаптационными изменениями к целому комплексу жизненных потребностей, главными из которых в данном случае являются пищевые. Ко второй группе относятся: молекулярная масса, состав изоформ, их заряд, соотношение содержания трипсина и химотрипсина, а также коллаген-казеиновый индекс; они являются характерными для таксономических групп (на уровне классов); определение этих параметров с высокой степенью достоверности позволяет отнести исследуемую ферментную систему к тому или иному таксономическому разряду. Обобщение приведенных данных позволило представить следующую классификацию ферментов трипсннового и химотрнп-сннового типа согласно их свойствам и таксономическому распределению (табл.2).

Таблица 2. Классификация панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов

Параметры Беспозвоночные Позвоночные

Ракообразные Моллюски Иглокожие Костистые рыбы Хрящевые рыбы Млекопитающие

Казеинолити-ческая акт-ть, Е/г 1,8-8,7 0,05-0,5 0,1-2,0 1,1-12 11-35 22-33

Коллагеноли-тическая акт-ть, Е/г 0,01-0,14 0 н.о. 0,01-0,08 н.о. 0,01-0,02

Коллаген-казеиновый индекс, % 1,2+0,2 0 н.о. 0,8+0,1 н.о. 0,06±0,02

Активность трипсина, мкМ/г 19-36 0,2-0,9 0,2-2,5 4-40 17-30 11-54

Количество изоформ — трипсина + 4 0 н.о. 2 0 4-6 1-2 1-2 1 1 1

Мол. масса трипсина, кД 24-31 н.о. 24-28 22-28 24-25 17-24

Активность химотрип-снна, мкМ/г 1,0-2,1 0 0 3-38 18-25 21-41

Количество изоформ -хнмотрип- + сина 1-3 0 0 0 2 1-3 1 1 1 1

Молмасса химотрип-сииа, кД 24-28 0 0 24-26 24-25 21-24

Строение панкреатической ткани Днф< гсзное Дискретное

Гепагопанкреас Пшюрнческне придатки Поджелудочная железа

И.о. - не определялось; заряд молекул: катконнын +, анионный выделены преобладающие изоформы

Прн попытке подтвердить предлагаемую классификацию с помощью многомерного статистического анализа, а именно факторного анализа получено следующее распределение (рнс.1).

2.0 1.5 1.0 0.5

<м

е* о.о

Еч

М

5 -0.5

-1.0

-1.5

-2.0 -2

Рис. 1. Видовое распределение гидробионтов согласно свойствам панкреатических сериновых протеиназ по результатам факторного анализа. Классы: - ракообразные, 2 л - костистые рыбы, 3 О - хрящевые рыбы, 4 0 - млекопитающие

В анализе участвовали только те объекты, для которых были известны все искомые параметры, взятые в качестве переменных величин (активности по всем субстратам, количество и заряд изоформ, молекулярные массы), всего 8 переменных. По этой причине в результаты анализа не были включены моллюски и иглокожие. Наибольшие величины факторных нагрузок имели показатели общей протеолитической активности, количества изоформ и молекулярной массы. Полученные результаты подтверждают значительные различия между высшими позвоночными (в данном случае млекопитающими) и низшими позвоночными (костистыми рыбами) и беспозвоночными (ракообразными) в составе и распределении панкреатических сериновых протеиназ. В образованной таким образом совокупности данных можно выделить два надхластера: I (млекопитающие + хрящевые рыбы) н Н (костистые рыбы + ракообразные). Представители этих над кластеров четко разделены по строению поджелудочной железы, образующей у млекопитающих и хрящевых рыб дискретный орган, а у костистых рыб и ракообразных - имеющей диффузное строение, хотя и различного типа.

Далее исследованные виды группируются следующим образом. Отдельные, далеко отстоящие кластеры образуют млекопитающие (I) и хрящевые рыбы (2). Для костистых рыб можно выделить три кластера, из которых один, достаточно плотный, образован лососевыми (1). другой, размытый, - видами рыб из различных семейств

13

ч

I N

! в \

р.гоэтак \

\ РьЧагда \ \ ™ С.игБ^ги),

.О.догЬи§\ Удегка а у ф

|\АО.Ке1а ^^

I

Р.са'1

♦ ♦ / О.дзЫа

/ А

РКаволи

V

^а

Ь.агрега

А /

/

\ R.acuros

\ в \

У

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 Фактор 1

0.5

1.0

♦ . С1а5Б=1 а с/аэ5=2

• с1а$5=3 я с!а55=4

1.5

2.

(3), в нем сближены; виды, привлеченные параметры которых значительно отличаются при внешнем рассмотрении, например,сом, камбала и сельдь. Еще один кластер образуют тресковые рыбы (4) и непосредственно примыкающие к ним представители раков (отрад равноногих) из класса ракообразных. Крабы (отряд десятиногих), относящиеся к этому же классу, группируются отдельно (2).

Применение другого метода - многомерного шкалирования, учитывающего все переменные, в основном повторяет полученное распределение. Попытка такого вида статистической обработки данных впервые предпринята для анализа панкреатических сериновых протенназ и, безусловно, требует развития с уточнением включаемых в рассмотрение параметров и привлечением большего количества видов. Тем не менее очевидны дальнейшие перспективы использования этого метода. Непосредственное проведение анализа с использованием статистического пакета STATISTICA (STAT SOFT Inc. USA) было выполнено сотрудниками ТИНРО-центра Е.В. Якудшм н Е.Э. Борнсовцом.

Дальнейшие исследования были продолжены с использованием ферментов из следующих объектов: тихоокеанских лососей, камчатского краба (анионные нзоформы) н быка (катионные формы). Для панкреатических протенназ последнего установлены четкие критерии взаимосвязи между структурой молекул н их каталитическими свойствами, они послужили репсрными в данном исследовании.

Указанные ферментные системы гндробионгов не только обладают высокой активностью, но и являются типичными по составу н свойствам для представителей своих таксономических групп. Кроме того, данные виды являются объектами массового промысла и образуют обширную сырьевую базу для получения ферментных препаратов.

Выделение и очистка ферментных препаратов

Первый этап работ по выделению протеолнтических ферментов гидробионтов был направлен из разработку эффективных и доступных для промышленного производства методов очистки и получения препаратов комплексного состава. В дальнейшем для очистки индивидуальных протенназ использовали аффинную хроматографию на сорбентах, содержащих различные лиганды. Варьирование условий выделения позволило не только определить оптимальные условия выделения, но и исследовать свойства самих ферментов. В свою очередь уточненные свойства легли в основу выбора аффинных лигандов для создания узкокоспецифичных сорбентов.

Применение ультрафшслрацконвой технологии для разделения и очистки панкреатических пг-с.тскназ гндробношов. Для практического применения наи-

14

большее значение имеют препараты комплексного состава, содержащие целый ряд прогеолнтическнх ферментов и обладающие наиболее широкой субстратной специфичностью. В силу физико-химических различий панкреатических сериновых протеиназ, имеющих анионный заряд молекул, методы их очистки потребовали иных подходов уже на начальных этапах выделения. Использование ступенчатой ультрафильтрации определило значительные преимущества данного метода перед предложенными ранее (основанными на осаждении белков органическими растворителями) с точки зрения его зкологичности, экономичности и мобильности. Ряд приемов предварительной очистки экстрактов (ступенчатое сепарирование, введение адсорбентов, предварительная микрофильтрация) позволили добиться максимального удаления взвесей, что весьма важно для обеспечения высокой скорости процесса и предотвращения инактивации ферментов вследствие поляризационной концентрации. Ступенчатая ультрафильтрация способна вычленить из многокомпонентной смеси достаточно узкую полосу веществ с молекулярной массой, соответствующей параметрам трипсина и химотрипсина. Этой задаче вполне соответствовали мембраны с пределами пропускания молекул 15 и 100 кД. Состав полученных препаратов был проанализирован хроматографически, и было показано наличие небольшого количества примесей. В дальнейшем метод был распространен на панкреатическую ткань других видов, включая рыб, беспозвоночных, наземных и морских млекопитающих, птиц. Новизна технического решения защищена патентом РФ.

Очистка и выделение сериновых протеиназ методом аффинной хроматографии.

Аффинные сорбенты для очистки трипсина и химотрипсина, содержащие природные высокомолекулярные ингибиторы (СТИ, овомуходы, тразнлол и др.), оказались малоэффективными для разделения и очистки анионных форм трипсина и химотрипсина из-за весьма низкой селективности. В связывании ферментов на данных сорбентах важную роль играют неспецифические взаимодействия.

Аффинные сорбенты, содержащие в качестве лигандов аминокислоты и их производные (аргинин, фенилаланин и триптофан). Было установлено, что связывание сериновых протеиназ трипсинового и химотрипсинового типов на таких сорбентах обеспечивается взаимодействием с активными центрами ферментов независимо от общего заряда молекул. Высокая эффективность очистки трипсина всех видов наблюдалась при использовании аффинных сорбентов, содержащих аргинин. Даже присоединение к нему таз ильной группировки не проводило к значительному увеличению сорбции химотрипсина. Однако в этом случае образовывался более устойчивый фермент-лнгандный комплекс, в котором согласно гипотезе C.B. Веревки (1996) взаимодействие БгПодучастка связывания субстрата с аргинином усилено связью меэззду Б'гподучастком н тоз ильной группировкой. Ароматические

аминокислоты и их производные как лиганда в целом обеспечивали преимущественную сорбцию химотрипсииов всех типов. Но в этих случаях также наблюдалась довольно значительная сорбция анионных трипсинов, и образующиеся комплексы были весьма прочны и могли быть разрушены только «деформирующими» растворами.

Взаимодействия, наблюдаемые между сорбентами, содержащими специфические аминокислоты, и ферментами различного происхождения весьма сходны. Отмеченные отличия, вероятно, являются следствием различного вклада поверхностных гидрофобных участков молекул ферментов, взаимодействующих с гидрофобными же лигандами. Это предположение подтверждается разными показателями очистки трипсинов и химотрипсииов различного происхождения на сорбенте фенил-агароза, в котором высокая концентрация лиганда (10 мМ) делает маловероятной возможность биоспецифического взаимодействия.

Лигавды аффинных сорбентов

Высокомолекулярные природные ингибиторы На основе гексаметилендн амина Аминокислоты и их производные

Специфичны к катаонным формам Т и ХТ Специфичны к анионным формам Т и ХТ Специфичны вне зависимости от заряда молекул Т и ХТ

Гексаметилендиамии

Гетероауксин-гексаметалепднамнн

Бензоил-е-амино-капроновая кислота-гексаметилендаамин

Концентрация лиганда, мМ/см

0,02 1 0,07-0,09

0,05

0,12-1,4

0,01 | 1,6

Специфичность и суммарная сорбционная емкость,

Т Т ХТ ХТ Т ХТ

(93 %), (76-90 %), (100%), (60-96 %), (100%), (90 %),

ХТ ХТ Т т ХТ Т

(4%) (35-73%) (73%) (60-90 %), (55%) (32 %)

Рис. 2. Схематическое изображение свойств аффинных сорбентов, использованных для очистки трипсинов (Т) и химотрипсииов (ХТ) различного происхождения Аффинные сорбенты для выделения анионных форм трипсина и химотрипснна. На данном этапе работы была предпринята попытка синтеза аффинных сорбентов, специфичных для ферментов с анионным зарядом молекул (первоначально серино-вых протеиназ тихоокеанских лососей).

Рис. 3. Разделение методом электрофореза в ПААГ: 1-бел-ки-маркеры, 2 - препарат до хроматографии, 3 - фракция после суммарной элюции на сорбенте ГМДА-бумага, 4 - после специфической элюции на ГМДА -бумага, 5 - после суммарной элюции на ГАУ-бумага, 6 - то же на ГАУ-целлюлоза, 7 - то же на БЗ-АКК-ГМДА - силохром

Предполагалось, что такие сорбенты должны сочетать в себе способность реагировать и с активными центрами, и со специфическими поверхностными гидрофобными шга ионкзрроваташт участками. Кроме того, вновь предлагаемые сорбенты Съит стпезирозаиьз на основе доступных и дешевых реагентов, так как были предназначены для использования в промышленных масштабах. В качестве матриц были взяты следующие компоненты: снлохром, аминосилохром, сополимер силохрома и поливинилового спирта, полиглнцидилметакрилат, полиглицидилметакрилат-винил-пнрролидон, акролеин-вкнилпирролидон, полнглицидшьметакрилат-бумага, акролеин-бумага, бумага, целлюлоза микрокристаллическая.

Основные свойства сорбентов представлены на рис. 2. Разделение сорбционной емкости на общую и специфическую подразумевает, соответственно, все количество белка, которое десорбируется под влиянием раствора, содержащего 1,5 М №С1 и 30 % изопропанол, и количество белка, содержащего только трипсиновую или химо-трипенновую активность, которое может быть десорбировано введением реагентов, взаимодействующих с активными центрами фермгнтов, таких как лизин, е-АКК, триптофан и др. Полученные фракции имели различный состав, отраженный на рис. 3.

100 во 60 40 20 О

-®~Ряд2

сила (I) В

1,25

Рис. 4. Зависимость ссрбдни цитаат (I) и химотрипсина (2) кеты на сорбентах, содержащих в качестве литанда ГМДА в различных концентрациях: А -полнтлицидащ.метакрнлат-бумага (0,18 мМ/ьш), Б - акролеин-бумага (0,03 мМ/мл), В - микрокристаллическая целлюлоза (0,07 мМ/мл), Г - бумага (0,02 мМ/мл).

Аффинные сорбенты, содержащий в качестве лигандов 1,6-гексаметилендиамин. Результаты взаимодействия сериновых протенназ трех исследуемых объектов с сорбентами данной группы показали высокую специфичность данных сорбентов только по отношению к ашюпным формам трипсинов. То, что в образовании фермент-лигандного комплекса существенную роль играют гидрофобные взаимодействия, подтверждает зависимость количества сорбированных ферментов от ионной силы раствора, используемого для нанесения, на сорбентах с различными концентрациями лигандов (ркс.4). Сорбция катнонных трипсина (10-19 % от наносимого количества с учетом сорбционной емкости) и химотрипсина (15-30 %) была низкой далее для сорбентов с небольшой концентрацией лиганда и сопровождалась отсутствием трипсин-химсприпсивовой селехтивности н невысокой степенью очистки.

Аффинные сорбенты, имыощне в качестве лиганда гетероауксин (2-При взаимодействии иммобилизованного ГАУ с трип-

сипами и химотриисинамн различного происхождения наблюдались значительные различия в видовой селективности. Полученные результаты позволили предположить, что связывание этого лиганда с химотрипсинами всех видов обеспечивается по классической схеме путем взаимодействия с «гидрофобным карманом». Для ка-гиснного трипсина связь с лигандом обеспечивалась за счет неспецифических взаимодействий и хроматография сопровождалась низкой степенью очистки. Анионные лее трипсины благодаря усиленной гидрофобности субстратсвязывающих участков активного центра имели высокое сродство к иммобилизованному ГАУ.

Аффинные сорбенты, имеющие в качестве лиганда бензоил-е-аминокапроновую кислоту - гексаметилепднамин. Данный лиганд обладал неспецифическим сродством к катионным протеиназам и обеспечивал незначительное преимущество в связывании химотрнпенна (59-82 %) перед трипсином (38-40 %). При этом хроматография обоих ферментов сопровождалась невысокой степенью очистки, наличием большого количества примесей.

Высокая эффективность очистки была достигнута для анионных химотрипсинов и, особенно, трипсинов. При низких концентрациях различные составляющие одного и того же лиганда, вероятно, взаимодействовали по крайней мере с двумя субстрат-связьгваюпщми участками трипсина, что объясняет избирательность в отношении этого фермзнта. С увеличением концентрации лиганда переориентация специфичности сорбента (преимущественная сорбция химотрнпенна) может быть связана с участием л связывании химотрипсином двух молекул лиганда, а именно двух бензольных колец, одно ез которых свягывзется с гидрофобным «карманом», а второе - с эффек-терным участком. Такая структура и ориентация лиганда более благоприятна для взаимодействия с химотряпсином чем структура гетероаукенна в той же концентрации.

Таким образом, комплексообразующие (ингибиторные и сорбционные) свойства иммобилизованных лнгандов значительно отличаются от свойств тех же самых компонентов в растворимом состоянии. Если для растворимых лигандов решающую роль играет взаимодействие между их реактивными центрами и активными центрами ферментов, то для иммобилизованных - первоочередным становится процесс взаимодействия с заряженными и гидрофобными группами на поверхности молекул. В конечном итоге биоспецифическая сорбция может быть достигнута либо при отсутствии подобных взаимодействий, либо усилена ими при благоприятной ориентации. Поэтому для сериновых протеиназ, имеющих различный поверхностный заряд молекул, образование биоспецифических комплексов между растворимыми и иммобилизованными высокомолекулярными природными ингибиторами имеет столь резко выраженные различия и практически одинаково для аминокислот и их производных.

В составе специфических лигандов для аффинной хроматографии анионных се-риновых протеиназ ГМДА выступал не только в качестве снейсера, но и обеспечивал либо образование аффинных комплексов, либо благоприятную ориентацию по отношению к гидрофобным группировкам. Для катионных ферментов не выполняется ни одно, ни другое действия. Весьма наглядно ка примере данных сорбентов обнаружился переход от аффинной к гидрофобной сорбции по мере увеличения концентрации лигандов.

Новизна технических решений была защищена авторскими свидетельствами на изобретение. На основании полученных результатов разработаны опытно-промышленные регламенты синтеза аффинных сорбентов и выделения ферментных препаратов, включая условия удаления элюентов и концентрирования фракций с использованием метода улътрафильтрации.

Исследование субстратно-ингибиторной специфичности

панкреатических сериковых протеиназ! различного происхождения

Для изучения специфичности действия панкреатических ферментных систем и отдельных ферментов были взяты очищенные методом ультрафильтрации препараты: пнлорин (из пнлорическнх придатков кеты), гепатопанкреатин (из гепатопанхреаса камчатского краба) к панкреатин (из поджелудочной железы быка), а также индивидуальные ферменты, очищенные методом аффинной хроматографии.

Таблица 3. Гидролитическая активность препаратов различного происхождения по отношению к белковым субстратам

Субстрат Относительная активность, %

Панкреатин (бык) Пилорин (кета) Гепатопан креатин (краб)

Гемоглобин 100 100 100

Казеин 92 78 93

Протамин 47 57 34

Фибр5!К 9 10 11

Коллаген из кожа теленка 0,05 0,6 0,8

Калл? ген из ахиллесов! сухожилий 0,05 1,1 1,5

Денатурироеалкый коллаген 0,5 3 5

Первоначально нами были исследованы степень и скорость деструкции белковых субстратов, имеющих различный аминокислотный состав, структуру молекул или межмолекулярных образований. Затем с помощью специфических низкомоле-куляряых субстратов и ингибиторов был определен вклад отдельных ферментов.

В табл. 3 приведены данные об относительной активности трех видов ферментных препаратов по способности их гидролизовать различные белковые субстраты При этом максимальная величина активности определена по отношению к гемоглобину и минимальная - к нативному коллагену из кожи теленка. Для белков, образующих растворы, а также фибрина, имеющего неупорядоченную структуру белковых агрегатов, степень протеолиза близка как в относительном, так и в абсолютном выражении.

Только при гидролизе коллагена ферментами различного происхождения были обнаружены значительные отличия. Ферменты в составе панкреатина проявили очень слабую способность гидролизовать коллаген обоих видов даже в денатурированном состоянии. Протеиназы краба и лосося гидролизовали коллаген в весьма близких соотношениях по всем трем исследованным его видам.

Молекулярный состав гидролизатов. Ферментные препараты из панкреатической ткани различных организмов, содержащие преимущественно протеиназы трипсинозого и химотрипсинового типа, при гидролизе растворимых и агрегированных белков образовывали близкий по составу набор ннзкомолекулярных компонентов. Количество и характер распределения полученных в результате гидролиза пептидных фракций были аналогичны для казеина, гемоглобина, протамнна н фибрина, что можно объяснить наличием одинакового количества доступных для ферментативного гидролиза пептидных связей.

При гель-фильтрации продуктов гидролиза нерастворимого коллагена панкреатином была обнаружена только одна фракция с мол. массой более 20 кД. При обработке коллагена пилорином и гепатопанкреагином образовывался целый рад продуктов с мол. массой более 8,5 кД (рис.5).

Кинетика гидролиза белковых субстратов. В левой части рис. 5 представлены зависимости скоростей ферментативного гидролиза белковых субстратов от концентрации последних. Для казенна (также как гемоглобина и протамнна) в пределах рассматриваемых концентраций зависимость имела одинаковый линейный характер для всех исследуемых ферментных препаратов. При гидролизе фибрина наблюдался процесс снижения его скорости после достижения максимального значения при концентрации более 30-60 мкМ, что соответствует насыщению, а затем ингибированию избытком субстрата н/илн продуктами его гидролиза.

150

750 [8], мМ

1500

У,мл

13], м

12 10

•ь» ц]

ь

2 0

сэ ю о _ . о « о

' - 15], У ' " Й

Рис. 5. Ккнзтика гидролиза бглхов (слева) и фракционный состав гидролтатов (справа), определенный методом гель-фкльтращш на сорбенте «ТоуореатМО», для субстрата г,: А - хазгкна, В - фибрина, С - нерастворимого коллагена под действием гепатопангфеатнна(краб) —, пихюрнна (кета)---и панкреатина (бык) —.

Подобное явление было наиболее ярко выражено при деструкции коллагена ферментами кеты и краба, что соответствовало накоплению низкомолекулярных компонентов в составе гидролнзатов. Для панкреатических ферментов быка (также как и дтя бычьего кристаллического трипсина) эта зависимость не имела выраженного характера, оставаясь на очень низком уровне вне зависимости от концентрации субстрата.

Гидролиз коллагена: вклад отдельных протеиназ и влияние различных факторов. Полученные результаты позволили предположить, что механизм гидролиза коллагена под действием сериновых протеиназ и способы его регуляции подчиняются иным закономерностям, чем процессы деструкции других белков. Для их определения необходимо было выяснить влияние различных факторов на процесс гидролиза нерастворимого коллагена. Прежде всего было показано, что заряд молекул ферментов не влияет на их коллагенолитическую способность. После а цитирования по методу Клоца е-аминогрупп лизина, образующих на поверхности молекул бычьих трипсина и химотрипсина положительный заряд, наблюдалось равномерное снижение активности последних по отношению ко всем видам субстратов, включая коллаген.

Ссглзено существующим в настоящее время представлениям (Мосолов, 1994) тканевые препараты коллагена содержат латентную коллагеназу, связанную с субстратом или ингибитором посредством дисульфидных связей, восстановление которых приводит к распаду этого комплекса и активации фермента.

Для того, чтобы установить влияние ферментов различных классов изучали, процесс коллагеполиза в присутствии ЭД'ГА - ингибитора меташюпротеиназ, а затем в присутствии СТИ - ингибитора сериновых протеиназ (табл. 4).

ЭДТА не оказывал ингнбирующего действия на процессы гидролиза нгокомолекулярных субстратов, казеина и термоденатурированного коллагена. В то же время значительно тормозился процесс коллагенолиза, это имело место даже в случае бычьего кристаллического трипсина, заведомо несодержавшего любые примесные ферменты. При добавлении в реакционную смесь СТИ активность в отношении всех субстратов, кроме нерастворимого коллагена, снижалась соответственно изменению специфических активностей трипсина и химотрипсина. При этом трипсины всех видов инактнвировались полностью, а химотрипсины быка и кеты теряли свою активность почти на 90 %. Активность химотрипсина краба уменьшалась только на 54 %, что и объясняет незначительное падение скорости гидролиза казеина и денатурированного коллагена.

Тем не менее, внесение в систему обоих эффекторов вызвало полную остановку гидролиза нерастворимого коллагена при сохранении способности ферментов краба к разложению казеина н денатурированного коллагена. Это свидетельствует о том, что

механизм ксллагеяолнза значительно отличается от механизма расщепления х&зеика п денатурированного коляагепа и может быть осуществлен ферментами нескольких типов, з ключа я метзллозавискглые протгиназы, возможно, эндогенного происхождения.

Таблица 4. Зяилние ЭД1А и СТИ на активность протеиназ по отношению к __________различным субстратам.__

Эффекторы Остаточная активность по субст] ратам, %

Казгии Денатурированный коллаген Нерастворимый коллаген ТАМЭ АТЭЭ

ПИЛОРИН (кета)

60 мМ ЭДТА 1 124 92 27 117 125

0,02 мМ СТИ 2 0 55 0 9

60 мМ ЭДТА -г 0,02мМ СТИ 0 0 0 0 8

ПАНКРЕ АТИН (бык)

60 мМ ЭДТА 97 125 38 106 119

0,02 кМ СТИ 2 0 48 0 16

60 мМ ЭДТА -г 0,02мМ СТИ 0 0 0 0 10

ГЕГ1АТ011АН КРЕАТИН (краб)

60 мМ ЭДТА 149 112 46 120 127

0,02 мМ СТИ 67 52 44 0 36

60 мМ ЭДТА + 0,02мМ СТИ 107 62 0 0 44

БЫЧИЙ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ ТРИПСИН

60 мМ ЭДТА 94 - ' 31 102 -

0,02 мМ СТИ 30 - 27 23 -

60 мМ ЭДТА + 0,02мМ СТИ 10 - 38 19 -

Полученные результаты согласуются с предположением Чена и соавторов (1991) о сложном механизме гидролиза фибриллярного коллагена сериновыми протеииазами. При увеличении концентрации ЭДТА скорость гидролиза нерастворимого коллагена снижалась до некоторой определенной величины, после чего оставалась постоянной в широких пределах концентраций (рнс.6). Термоденату-ркрованкый коллаген образует в растворе неструктурированные одноцепочечные образования, вероятность содержания эндогенной коллагеназы также исключена.

Лилорин

Пилорин

-

123 -100 -

< во-

40 -200 1

10 20 40 60

[ЭДТА], мМ Гепатопанкрватин

160 140

120 ^о 100

. 50 < 60 40 20 0

\

\

\

20 40

[ЭДТА], мМ Панкреатин

140

120

100

£ 80

< 60

40

20

0

<

0,002 0,01 СТИ,мМ

0,03

Гепатопанкрватин

0,01 СГИ, мМ

0.03

Пан креатин

10 20 40 60

[ЭДТА'-ММ СТИ, мМ

Рис.6. Влияние ЭДТА и СТИ на гидролиз нерастворимого коллагена (—),

термоденатурнрованного коллагена (--) И казеина (—) под действием различных

ферментных препаратов.

!0

Поэтому в присутствии ЭДТА процесс ферментативного гидролиза денатурированного коллагена определяется только действием еериковых протеиназ, изменением стерических условий фермент-субстратного взаимодействия и практически совпадает с процессом гидролиза казенна ферментами всех исследованных видов, а также бычьим кристаллическим трипсином.

Зависимость скорости гидролиза казеина от концентрации СТИ носила типичный для сериновых протеиназ характер (за исключением химотрипснна краба). Изменение скорости гидролиза нерастворимого коллагена было «аномальным», когда после ожидаемого снижения активности ферментов происходило почти полное ее восстановление. Подобные изменения, но в различной форме, наблюдались для всех трех видов препаратов, причем именно в тех случаях, когда имел место избыток ингибитора, несвязавшегося с ферментами (рис. 6). Последнее обстоятельство позволило предположить вероятность реакции тнол-дисульфидного обмена, приводящего к активации проколлагеназы, так как белковые ингибиторы из сои содержат доступные для восстановления дисульфидные связи. Восстановительное расщепление дисуль-фндных связей приводит к потере ингибиторных свойств (Мосолов, 1971). В свою очередь, потеря ингибиторных свойств может вызывать реактивацию изучаемых сериновых протеиназ. В полученной сложной реакционной системе химотрипсик образует легко диссоциирующие комплексы и способен расщеплять инак-тивированный ингибитор.

Наличие такой многокомпонентной реакционной системы объясняет обратимый характер реакции и соответствует обратимости процесса тиол-дисульфидной активации латентной коллагеказы (ТБсЬегвсЬе, Массайпеу, 1983).

Для упрощения системы, в которой происходила реакция расщепления коллагена, были проведещл опыты по влиянию СТИ, а также окисленного глугатиона, восстанавливающего дисульфидные связи, на этот процесс в отсутствии экзогенных ферментов (табл.5). В присутствии глугатиона наблюдался распад коллагена, степень которого увеличивалась по мере роста концентрации этого реагента. При этом обнаруженная коллагенолитнческая активность была довольно велика и составляла более ¡0 % от активности пнлорнна. Распад коллагена в присутствии СТИ также имел место, хотя наблюдаемая величина «активности» была на порядок ниже чем в случае глугатиона, что согласуется с различиями в количестве доступных для восстановления 8-5 связей. Таким образом можно утверждать, что механизм гидролиза фибриллярного коллагена под действием сериновых протеииаз включает два этапа.

Инициация гидролиза, определяемая функционированием металлозависимых протенназ, подавляется ЭДТА и активируется реагентами, имеющими доступные дисульфидные связи. В качестве последних могут выступать экзогенные сериновые протеиназы и белковые ингибиторы. На начальной стадии различия в скорости и степени гидролиза между протеиназами различного происхождения зависят, вероятно, от их третичной структуры и наличия доступных дисульфидных связей.

Таблица 5. Влияние глутатнона и соевого ингибитора трипсина _на гидролиз коллагена при отсутствии ферментов_

Реагенты Концентрация, мМ Коллагенолитическая

активность, Е/г

Окисленный глутатион 0,1 0,07

0,5 0,16

СТИ 0,5 0,01

1,5 0,02

СТИ + глутатион 0,5 + 0,1 0,2

1,0 + 0,1 0,34

1,5 + 0,1 0,23

На втором этапе гидролиза его скорость полностью определяется субстратной специфичностью серннозых протенназ. Последняя для протенназ краба и лосося значительно швре чем для аналогичных ферментов быка. Соответственно этому наблюдаемая степень деструкции коллагена значительно выше.

Субстратная специфичность гидролиза низкомолекулярных субстратов. При исследовании взаимодействия с ннзкомолекулярными субстратами были использованы ферменты, выделенные методом аффинной хроматографии, а также бычьи кристаллические трипсин и химотрипсин («Биолар», Латвия). В качестве субстратов были взяты эфиры и нитроанилиды, содержащие в своем составе только одну аминокислоту, что позволило охарактеризовать первичный подучасток связывания.

Ферменты рыб и ракообразных с большей скоростью расщепляли субстраты, образованные «неспецифическими» аминокилотами (рис. 7), высокая скорость гидролиза БЛейМЭ приближает свойства протенназ химотрипсинового типа к таковым, известным для свиного химотрипсина С.

При определении кинетических параметров гидролиза расчитывали его эффективность как соотношение Ушах и Км- Для трипсинов кеты и особенно краба характерна высокая скорость гидролиза эфирных и ншроанилндных субстратов, образованных аргинином и лизином. Более высокая по сравнению с бычьим трипсином эффективность достигалась для эфирных субстратов более продуктивной катали-

I 27

тнческой стадией, а для ншроаиилддиых - более благоприятными условиями связы

вання субстратов (табл. 6). з -

I « i

Л i i

1 1,5

0,5 В

Рис.7. Субстратная специфичносп ферментных препаратов различноп происхождения по отношению i эфир1шм производив» аминокислот

ТАргШ ТГ,из*К> БйвйИЭ БТкрКЭ

Высокая активность анионных трипсинов не снижалась при увеличении рН (до 9,5 благодаря сохранению активной конформацин в тех условиях, где их катионные аналоги принимают неактивную зимогеиподобную форму. Различия каталитических параметров в таких условиях позволили предположить, что изменение конформацин анионных протеиназ сопровождается увеличением нуклеофнльности активного центра.

Для трипсина краба гидролиз ТАМЭ при рН 9,5 сопровождался увеличением скорости и эффективности без изменения Км, в случае же БАлНА параметр» гидролиза менялись незначительно (рис. 8). Однако следует заметить, что указанны« высокие значения рН-оотимумов действия анионных трипсинов не являются физиологически выполнимыми (Barnard, 1977). Поэтому эффективность действия указанных ферментов правильнее оценивать при рН 8,0-8,5, а увеличение скорости гидролиза в более высокой зоне рН считать не следствием эволюционных или адаптационных изменений, а косвенным, опосредованным отражением отличий структуры молекул ферментов различных типов.

Эффективность гидролиза эфирных субстратов, образованных ароматическими аминокислотами была значительно ннжз для анионных химотрнпсинов, особенно, краба. Очень низкое сродство шпроаншшдных производных ароматических аминокислот к анионным хнмотрипсинам может быть связано с различиями в строении субстратсвязывающих участков, требующих для эффективного связывания более длинной пептидной цепочки.

субстрат - ТАМЭ

субстрат - БАпНА

ОКт □ \/тах ИКтЛЛлах

краб рН 9,5 кет рН 9,5 бык рН 9,5 рН8 рНв рНв

3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

кр«В рН 9,5 кет» рН 9,5 бьк рН 9,5 рНв рНв рНв

Рис.8. Изменение кинетических параметров гидролиза низкомолекулярных субстратов трипсинами различного происхождения при изменении рН среды.

Таблица 6. Кинетические параметры гидролиза низкомолекулярных субстратов __ трипсинами различного происхождения _

Субстрат Км, Ушах, к Субстрат Км, Ушах,

мМ мМ/мкн м* мМ мМ/мин Км*

мг* мг*

Трипсин краба Химотрипснн краба

БАМЭ 0,49 6,8 30 АТЭЭ 1,60 0,9 0,6

ТАМЭ 0,02 21,7 1300 БТМЭ 0,80 2,3 3

БАпНА 0,13 0,1 1 ГФпНА 1,56 0,01 0,006

Трипсин кеты Химотрипсин кеты

БАМЭ 0,49 4,0 8 АТЭЭ 1,9 1,8 0,9

ТАМЭ 0,04 12,2 300 БТМЭ 0,66 3,4 5

БАпНА 0,43 од 0,2 ГФпНА 1,60 0,02 0,012

Трипсин быка Химотрипснн быка

БАМЭ 0,36 4,8 15 АТЭЭ 1,86 7,8 4

ТАМЭ 0,05 17,5 360 БТМЭ 0,29 8,6 30

| БАпНА 2,61 0,2 0,06 ГФпНА 0,37 0,06 0,162

Ингибнтозная специфичность панкреатических сериновых протеиназ. При исследовании этого вопроса использовали некоторые низкомолекулярные ингибиторы и аминокислоты, высокомолекулярные природные ингибиторы, необратимые ингибиторы, образующие ковалентные связи с активными центрами ферментов, а также

пептидные препараты иммуностимулирующего действия, выделенные из разлнчга, тканей животных (цитомедины).

Полученные результаты позволяют считать, что взаимодействие акгаень! центров трипсинов кеты и, особенно, крабов с лигандамн в большей степен определяются силами гидрофобного взаимодействия, чем ионизированным группировками, как это характерно для бычьего трипсина. Аминокислоты ат фатического ряда, включая е-АКК, оказывали слабое ингибирующее влияние на прс цесс гидролиза ннзкомолекулярных субстратов. Лейцин менее других амннокисло снижал активность трипсина быка, но на трипсины кеты и краба оказывал слабо активирующее воздействие. Аминокислоты еще более слабо тормозили активност химотрипсинов быка и кеты, и совершенно не влияли на химотрипсин краба. Пр] взаимодействии ферментов всех видов с производными лейцина определено уснленн ингибирующего эффекта в ряду лей < лей-гли-гли < бз-лей при наименьшей трипсин химотрипсиновой селективности для ферментов краба и, особенно, кеты.

При взаимодействии с высокомолекулярными природными ингибиторам! обнаружено общее принципиальное сходство в стехиометрии и степени ннгиби рования трипсинов и химотрипсинов различного происхождения, сопровождающее« при этом наименьшей селективностью для ферментов кеты и необычной ус тойчивосгью химотрипсинов краба к действию ингибиторов (табл. 7).

Те же особенности (перекрестная специфичность трипсина и химотрипсин; кеты и устойчивость хнмотрипсина краба) обнаружены со взаимодействии с необратимыми ингибиторами (табл.7).

Таблица 7. Влияние ингибиторов на активность сернновых протеиназ различного

происхождения (Т - трипсин, ХТ - химотридсин)

Ингибиторы Концентрация, мМ Остаточная активность, %

Краб Кета Бык

т хт т хт т хт

Дмсф 0,5 6 10 5 2 0 0

ДФФ 0,5 0 0 0 0 0 0

Тлхмк 2,0 0 64 0 65 0 38

Тфхмк 2,0 58 68 2 23 56 2

ста МО'4 10 49 9 28 7 18

ТИ из ячменя 1-Ю"5 - - 1 29 19 39

ТИю кукурузы 510^ 59 100 35 100 14 100

ТИ из фасолн 5-Ю"4 - - 7 1 10 14

Овомукоид МО"3 7 59 6 4 12 18

Контрикал 110° 12 64 9 17 12 36

концентрация фермента - 0,5 1мМ, время инкубации - 3 час, рН - 8,0

Было установлено, что взаимодействие трипсина лососей с ТЛХМК становится необратимым только при рН 9,5. Наблюдаемое при рН 8,0 ипгибирование могло быть устранено после вытеснения ингибитора из активного центра каким-либо другим нигандом, например 1,6 ГМДА, входящим в состав аффинного сорбента. Это соответствовало увеличению эффективности гидролиза низкомолекулярных субстратов и сохранению активной конформации анионных трипсинов в тех условиях, где катионные бычьи ферменты приобретали неактивную зимогенподобную форму.

Исследовано взаимодействие сериновых протеиназ с препаратами пептидного состава, обладающими иммуностимулирующим действием (табл. 8). Влияние этих препаратов на систему гуморального иммунитета было установлено в Институте эпидемиологии и микробиологии СО РАМН под руководством чл.-корр. РАМН Н.Н. Беседновой. Известно, что некоторые из ингибиторов протеолитических ферментов вырабатываются организмом в процессе формирования неспецифической воспалительной реакции. Их активносп, направлена на ограничение повреждающего действия протеиназ. В то же время некоторые экзогенные ингибиторы сериновых протеиназ способны стимулировать развитие гуморального иммунного ответа (Кетлинский и др., 1992, Кузник и др., 1995). Нами было показано, что пептидные им-мушюмодуляторы суммарного состава содержали обратимые ингибиторы трипсина и хвмотрипсикх Для выделения ингибиторов из состава суммарных препаратов был использован метод аффинной хроматографии на сорбенте трипсин-сефароза 4В. В результате были получепы и охарактеризованы обратимые низкомолекулярные ингибиторы трипсина.

Таблица 8. Сравнительная характеристика ннгибиторных свойств исходных и очищенных методом аффинной хроматографии пептидов из состава иммунностимулирующих препаратов

Пептидный препарат Количество бежа во фракции, мг Удельная активность, 1Е/ мг Выход по ннгибиторной активности, % Степень очистки (кратность)

Ганглиин из нервной ткани кальмара

Исходный 9,9 442 100

Очищенный 0,7 642 11 1,5

Кути кули н из кутикулы куриного желудка

Исходный 10,2 475 100

Очищенный 0,8 979 16 2Д

Гепашш из печени кальмара

Исходный 16,3 109 100

Очищенный 1,6 366 33 3,5

ГЕ - ингибиторные единицы (11Е снижает активность трипсина на 1 Е в расчете на 1мг ингибитора)

Сравнительная характеристика ингибнторных свойств представлена в табл. £ где показано, что эффективность очистки невысока. Причиной этого может быть фе£ ментативная деструкция ингибиторов и конкурентный характер взаимодействия и^ мобилизованного трипсина и пептидов, входящих в состав препаратов. Тем не менее полученные результаты позволяют говорить о том, что иммунная активность може быть связана с ингибиторным действием пептидных препаратов и, наоборот, при л« карственном применении ингибиторов следует определять их иммунносп; мулнрующкс свойства.

Получение н характеристика иммобилизованных форм панкреатических сернповых протенназ

При исследовании свойств анионных протенназ была установлена их высока стабильность в отношении ионной силы, детергентов и оргашгческих растворителе? Однако, эти ферменты оказались весьма лабильны при повышенных температурах и кислой среде. Для создания более устойчивых форм ферментов были проведеш исследования по стабилизации препаратов методами ионно-адсорбционной и орнг» тированной иммобилизации.

В качестве матриц для ионно-адсорбционной иммобилизации был использованы неорганические композиты и сола альпшовой кислоты. Для срнеи тированной иммобилизации был. предложен метод с использованием в качеств матрицы препарата кишечного эпителия. Мембраны клеток, образующих кишечны: эпителий, собраны во многочисленные микроворсинки, имеющие субмнкрс скопнческую пористость, которая резко увеличивает их внешнюю открытую для сор бции поверхность. Ферменты, способные сорбироваться на такой поверхности, а* тнвируются, при этом их активные центры развернуты и обращены в сторону рег кционной среды. Белковая глобула в адсорбированном состоянии имеет более жес ткую структуру и менее подвержена конформацношшм изменениям (Фридрих, 1989] При взаимодействии сериновых протенназ с такой матрицей происходило увеличены их активности почти вдвое за счет более благоприятной ориентации активного цент ра, при которой облегчается способность ферментов связывать субстраты. Каталити ческая стадия реакции при этом протекает практически без изменений (рис.9). Тем н менее в кислой среде устойчивость данных иммобилизованных препаратов пс пытается незначительно. Более кислслорезистентными и термостабильными ока залксь коныогаты протек!¡аз с солями альгиновой кислоты. Несмотря на то, что ак тивность ферментов, иммобилизованных в среде альгинатных гелей, снижалась п сравнению с исходными (рис. 9), повышенная стабильность позволила значнтельи увеличить период инактивации ферментов в условиях различных температур, в тог

■числе в условиях основного рабочего диапазона температур (30-40° С), как это показано на рис.10.

0,4 -■

0,35 --

0,3 -

"х* г 5 > 0,25 0,2 -

0,15 -■

0,1 >г ... -

1/3, мкМ -1

Рис.9. Влияние иммобилизации на кинетику гидролиза ТАМЭ трипсином кеты: 1 - до иммобилизации (Км - 0,04 мМ, У™ - 12,2 мкМ/мин), 2 - после иммобилизации на кишечпом эпителии (Км - 0,032 мМ, У^*-12,6 мкМ/мин ), 3 - после иммобилизации в альгинате натрия(Ки - 0,064 мМ, V„ж- 10,3 мхМ/мин)

15 30 80 120 180 420 время, час

Рис.10. Термостабильностъ нативного и модифицированного пилорина при температуре 40° С: 1- натнвный препарат - К,«^- 0,0082 мин"1,2 - иммобилизованный на кишечном эпителии - 0,0042,3 - иммобилизованный в альгинате натрия - 0,0029

Практическое применение протеолнтнческнх ферментных препаратов из гпдробмонтов

В этом разделе рассмотрены различные способы применения препаратов, полученных по предложенной нами технологии ю панкреатической ткани гидро-

биоитов (табл.11). Ферментативные гндролизаты на основе различных белков к б лок-содержатцего сырья были предложены в качестве продуктов парентерально! питания (из казенна), а также аминопептидных гидролизатов, обладающих собс венной биологической активностью (из моллюсков и отходов их обработки, мол< лососевых рыб, соединительной ткани хрящевых рыб и другого сырья). Также быг определены оптимальные условия применения сернновых протеиназ различного пр исхожденкя для ферментативной обработки мясного и рыбного сырья, включая обр ботку икры рыб для удаления ястычной пленки. Новизна предлагаемых решет защищена патентами РФ. Таблица 11.

ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ _ПРОТЕИНАЗ ГИДРОБИОНТОВ_

МЕДИЦИНА 1. Лечение инфицированных ран

2. Устранение дефицита пищеварител пых ферментов

3. Получение аминопептидных гидр лизатов лечебно-профилактическо! назначения

—" ' ' I —...I I— ■ """ ' ....."""" ' ■ '■ 1 ......... ■ " I- ■!—'■■ ■

СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО Ростостимулирующая кормовая добавка:

1. Для КРС, свиней, птиц

____2. Для молоди рыб_

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ Получение питательных основ пр;

ПРОМЫШЛЕННОСТЬ 1. Гидролизе белковых субстратов

2. Использовании аминопептидного ко; цзнтрата, образующегося в процес<

__получения фермен тных препаратов_

ПИЩЕВАЯ . 1. Разложение тканевых структу

ПРОМЫШЛЕННОСТЬ (пленок, оболочек, ястыков н др.) да

увеличения выхода продукции улучшения ее качества

2. Тендернзация мясного и рыбног сырья

3. Получение пищевых аминопептидны _гидролизатов_

Важным аспектом использования протеолитических ферментных препарата является производство питательных сред посредством гидролиза рыбного сырья отходов рыбообработки в качестве источника белка, а также использования амине пептидного концентрата, образующегося на стадии ультрафильтрации в процессе пс лучения ферментных препаратов. На основе данных исследований был разработг

[ромышлениый регламент получения сухих питательных сред. При рассмотрении опросов применения протеолитических ферментных препаратов в качестве росто-тимулирующих кормовых добавок были изучены гидролиз комбикормов и их оставных частей, эффективность использования ферментных препаратов в рационах ельскохозяйственных животных и молоди рыб, предложены направления и способы [х применения. Препарат «Пилорин» прошел апробацию в Институте питания РАМН I получил гигиенический сертификат, разрешающий его применение в пищевой 1ро мы тленности.

ВЫВОДЫ:

На основании проведенных исследований установлены основные закономерности «определения сернновых протеиназ в панкреатической ткани представителей >азличных таксономических групп гидробионтов Тихого океана. Сопоставление юлученных данных позволяет классифицировать ферменты трипсинового и ошотрипсинового типов по таксономической принадлежности согласно их моле-сулярным и каталитическим свойствам. Представленная классификация подтверждается результатами факторного анализа.

I. Для характеристики субстратной специфичности панкреатических сернновых протеиназ предложен показатель - казеин-коллагеновый индекс, - величина которого >езко снижается в ряду: ракообразные - костистые рыбы - млекопитающие, незави-:нмо от пищевых потребностей отдельных видов.

5. Все исследованные виды ракообразных и рыб содержат множественные анионные ■гаоформы трипсина и химотрипсина, у беспозвоночных катионных изоформ не обнаружено, у рыб они представлены минорными компонентами. Химотрипсин не >бнаружен у моллюсков и иглокожих. Активность этого фермента возрастает по мере 1ифференциацки панкреатической ткани в ряду ракообразные - рыбы - млекопитающие и достигает максимума у млекопитающих.

На основании сравнительного анализа субстратно-ингибиторной специфичности панкреатических сернновых протеиназ гидробионтов установлено, что в целом трип-:иновые и химотрипсиновые протеиназы гидробионтов соответствуют параметрам, гвойственным каждому разряду ферментов. Определены основные структурно-функциональные особенности ферментов конкретной принадлежности. 5. Параметры процесса ферментативного гидролиза исследованными панкреатическими протештазами растворимых и агрегированных белков аналогичны. При деструкции коллагена протеаназами анионного типа обнаружены следующие различия: а) высокая скорость процесса; б) образование пизкомолекулярных

продуктов гидролиза; в) торможение скорости реакции при высоких концентрацн субстрата,

6. Предложен двухетадийиый механизм гидролиза фибриллярного коллагена присутствии сериковых протеиназ:

- первая стадия включает инициацию гидролиза и распад трехцепочечной мси кулы коллагена и определяется функционированием металлозависимых ферменте активность которых подавляется введением ЭДТА и активируется реагентами донорами дисульфндных групп; с низкой скоростью коллагенолиз может осуще< вляться при введении окисленного глутатиона и некоторых белков, включая соевь ингибитор трипсина, без введения экзогенных протеиназ;

- вторая стадия включает распад коллагена до низкомолекулярных продуктов полностью определяется специфичностью экзогенных протеиназ, при этом широк субстратная специфичность ферментов гидробионтов соответствует более глубок! степени гидролиза этого субстрата.

7. Предположен обратимый характер угнетения и реактивации коллагенолиза ги действием различных концентраций соеааго ингибитора трипсина. Этот проце определяется двумя структурно-функциональными особенностями ингибитора: образованием фермеат-ипгибнторного комплекса; б) способностью к реакции тис дисульфидного обмена. Колебательный характер коллагенолиза в присутствии эти ингибитора определяется разнонаправленными силами белок-белкового взаим действия, включающими тиол-дисульфидный обмен и инактивацию ингибитора, о разовакне и распад фермеш-ипгибиторного комплекса, протеолиз инактивированно ингибитора.

8. Выявлены следующие структурно-функциональные особенности анионных фор трипсинов: а) высокая эффективность гидролиза эфирных и нитроанилидных субс ратов, усиливающаяся при рН 9,5, благодаря сохранению активной конформации увеличению нуклсофильпости активного центра в тех условиях, где катионш аналоги приобретают неактивную зимогенподобную форму; б) усиление вкла; гидрофобных сил по сравнению с ионными в структуре первичного подучасл связывания субстрата; в) снижение селективности между трипсинами хнмотрнпеннамн при взаимодействии с растворимыми и особенно иммобнл зеванными лигаддамя.

9. Разработаны методы очистки и разделения анионных трипсинов и химотрипсино Наиболее эффективны методы ступенчатой ультрафильтрации и аффинной хромат графин. Синтезированы аффинные сорбенты, обладающие специфичностью к анио иым формам сершювых протеиназ. Исследована зависимость сорбционных свойств с

лктанда и условий проведения реакции.

к

0. Разработаны способы ионно-адсорбцноннон и ориентированной иммобилизации .■риновых протеиназ гидробяонтов на матрицах различного состава. С исполь-званием иммобилизованного трипсина выделены низкомолекулярные пептидные нгибиторы из состава комплексных препаратов иммуномодуляторов.

1. Разработана технология получения оригинальных ферментных препаратов, в том исле препарата «Пилорин», имеющего сертификат для использования в пищевой ромышленноспгн. Разработаны следующие направления использования препаратов: ) медицина: для лечения инфицированных ран, устранения дефицита собственных ерментов, приготовления лечебных и лечебно-профилактических гидролизатов; б) ;льское хозяйство: ростостимулирующая кормовая добавка; в) микробиологическая ромытленность: приготовление питательных основ для микробиологических сред; г) шцевая промышленность: увеличение выхода продукции и ее качества за счет лранения балластных белков и соединительных тканей, получение пищевых амино-ептндных гидролизатов.

'писок работ, опубликованных по теме диссертации

Пнвненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Кудииов С. А., Колодзейская М.В., Панкреатические про-азы пилорических придатхов дальневосточных лососевых // Исследования по технологии лб, беспозвоночных и годорослей дальневосточных морей. Владивосток: ТИНРО - 1981. -rn.ll. - С. 77-31

Пизкекко Т.Н., Кудинов С.А., Колодзейсхая MB., Аффинный сорбент для трипсин-эдобных прогезз // Радиационная химия и технология мономеров и полимеров. Киев: яукова думка - 1984. - С. 150-152

Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Кудкнов С.А., Колодзейская М.В., Содержание протеаз во {угренностях дальневосточных лососевых // Тез. докл. 4-ой Всесоюзной конференции Методы получения и анализа бнохимреакгавов», Рига - 1984. - С. 102 Пганегасо Т.Н., Эпшгейн Л.М., Кудино» С.А., Колодзейская MB., Протеолитические грменгы рыб // Тез. докл. Всесоюзного совещания «Исследование и рациональное исполь-«ание бкоресурсов дальневосточных морей», Владивосток: ТИНРО - 1985 - С. 187-188 Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Аюшин Н.Б., Исследование свойств прсггеолитических триетт ш пилорических првдатков рыб // Тез. докл. 5-го Всесоюзного биохимического .езда, Киев - 1986. - С. 172-173

Пнвненко Т.Н., Колодзейская MB., Маленьких Л.Б., КпадницкааГ.Сериновые протеиназы «орических придатков дальневосточных лососевых // Прикладная биохимия и иикро-тология - 1988. - Т. 24, Да 3. - С. 353-359

Пивненко Т.Н., Колодеейская М.В. Трипсин-, химотрипсинподобные протеиназы рыб // крайнею!й биохимический журнал - 1988. - Т. 60, X» 4, - С. 103-117

Софьнна Е.Е., Ахмеджанов P.A., Эпшгейн Я.М, Пюягенко Т.Н. Игаибитор трипсина га ¡чат кальмара // Химия природных соединений - 1988 - Кг 6. - С. 887-888

9. Пиьмасо Т.Н., Oreureiui Л.М., Куд:шов С.А., Колодзенс;:аа M.B. Высскосчингенз препараты сериковых протенназ дальневосточных лососей //Тез. докл. ВсесоюзкоЕ соаещааая «БАВ ара холгсжиэй yrmi-miazi гчдроЪ;.отог» В-ьссток, ТИНРО -1988. -С.

10.ГЬп>ке.!ьо Т.Н., Эпштейн Л.М., Кододаейскаг M.D., Разделение панкреатически протеиназ тихоокеанских лососей методом аффииной хроматографии // Тез. докл. l-oi Всесоюзного сншюзмуыз «Прешрстшшгх хроматография физиологически активных вещей на полимерных с&рбекгях» - Ленинград - 1988 - С. 24-25

И.Пишгысо Т.Н., Аахаан Н.Б., Ждагаок В.М. Концентрированные препараты протеодтт ческж фгрмегггой из рыбного сырь« // Тез. докл. Всесоюзного семинара «Теориа и прах-пи регулирования качества соягтай и копченой продукции» - Владивосток, ТИНРО - 1989 - С. 4

12. Пизнеико Т.Н., Элвиейн Л.М., Подкорытова A.B. Иммобилизация панкреатически протишаз в адытегате натрет // Тез. докл. Всесоюзного семинара «Теория и практга регулирсланш качества сллеиой и копченой продукции» - B-восток, ТИНРО - 1989- С. 47-48

13.Швашко Т.Н., Эпштейн Л.М., Кудкнов С.А., Колодоейская М.В. Получение и свойсп трипсиш ю гшяоряческих придатков лососей // Прикладная биохимия и микробиология 1989. - Т. 25, 4. - С. 490-49-5

Н-Швиснво Т.Н. Взишлдейсглпе шжреатическга протешгаз тихоокеанских лососей с шш( билизовзнншш и р«ютаорга5жш лжгкдзми // Владивосток: Проблемы технологии перер. боткк нетрадаа^кишото сь.'рыг ш сбыктов ДВ промысла. В-востшс ТИНРО - 1989. - С, 54-6

15.Пккнеюсо Т.Н., Ждзкнх~ В.М., ЭпнггеГш Л.М., Аюшик Н.Б. Очистка протеолиткческг ферйенгов m pafeoro сыри методом ступенчатой ультрафгшьтрации // Тез. докл. Веского кой конфгренцЕШ «Методы получения, анализа и применения ферменгоз» - Рига, НП «БЙОЛАР» - 1990. - С.24

16.ГЬажнхо Т.Н., УСданюк В.М, Эпыггейи Л.М., Султгяоя 3.3. Использование проте лятческия ферментов из рыбного ецрьг дяз производства питательных сред // Тез. дсхл. Вс союзной конференции «Метода получения, анаяюа и пркмякюи ферментов» - Рига, НП «БИОЛЛР» - 199С. - С. 169

17.Г1иыкас:о Т.Н., Эгшгейн Л.М., Маркомдез В.Г. Возможность использования рыоль протеитаз в яососгводстве // Тез. дскл. Всесоюзной конференции «Нзучгю-техтвкесы проблемы шрикуяуг)рьг в стрзнг» И Владивосток, ТИНРО - 1930 - С. 19-21

18.Пишенко Т.Н., Жддамс В.М., Згашейк Л.М., Султанов 3.3. и др. Отходы перера5сп пздробионгов в ггркизводстве сухих питательных сред // Тез. докл. Всесоюзного соБещаш «БАВ гвдробкошов - новые лекарственные, лечебно-профшахтическиг и технические прсп рзты» Владивосток - 1991 - С.13-14

19. Гриторенко А.Г., Пкшенко Т.Н., Этшпейи Л.М., Протеолитический комплекс гидр бионтоз: оиыт применения в местном лечении инфицированных рак» И Тез. докл. Вс союзшго совещания «БАВ щяробионтсв - новые декгрстЕсшке, лечебно-профилакшчесы и тсхннчгскне препараты» Владивосток - 1991 - С.14

20. Ркпогка В.Г., Ниьнгизш Т.Н. Применение трипсин-содержащих препаратов го гидр биотда при лечении гаойных рея в сосудистой хирургии Н Тез. докл. Всесоюзного совяцзн] «БАВ щяробисв-к» - наше лгкгрствеилые, лечебно-профилзктичсские и технические прел рати» Блад1г.осток - 1591 - С. 15

. Пкзнснко Т.Н., Ждзнгок В.М., Эгшитейн Л.М., Султанов 3.3. и др. Использование про--юзпичссккх комплексных препаратов из рыбного сырья для производства сухих пнта-.ггьнмх сред // Владивосток: Известия ТИНРО - 1992. - №1. - С. 140-145

Пшнгенко Т.Н., Элпгтейн Л.М., Позднгкова Ю.М., Молодцов Г.П. Влияние ферментных )5авок мя гидролиз кормовых белков и продуктивность животных // Международный льско-хозжйстзенный журнал - 1994. - № 3. - С. 51-54

'..Пивнснко Т.Н. Протеолитнческис ферменты лососевых при биоконверсии некон-«даенного белкового сыры // Владивосток: Известия ТИНРО - 1995. - Т. 118. - С. 68-73 кПивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Иммобилизация протеолнтических ферментов на эпителии [нзистой оболочки кишечника И Владивосток: Известия ТИНРО - 1995. - Т. 118. - С. 82-87 ».Наседкин A.B., Роль Л.Н., Якуш Е.В., Пишенко Т.Н. и др. Влияние температуры на ¡менение миофибриллярных белков и аминокислот в фарше сурими под воздействием эцдо-экзогенных протеиназ//Владивосток: Известия ТИНРО - 1995. - Т. 118, - С. 54-67 5. Эпштейн Л.М., Аюшнн Н.Б., Боровская Г.А., Пивненко Т.Н. и др. Изучение биологически гшвных веществ гндробионтов тихоокеанского бассейна // Тез. докл. Международной жференции «Технология переработки гндробионтов» Москва, ВНИРО - 1994, С. 97-98 Шивнепко Т.Н. Гидролиз коллагена и коллагенсодержащего сырья панкреатическими эотенжзамн гндробионтов // Тез. докл. научной конференции «Рыбохозяйственное исслг-)вание океана» - Владивосток, Дальрыбвтуз, 1996, С. 11-12

Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Окладникова C.B. Антнпротеазное и иммуно-«иулирукицее действие пептидов из купжулы куриного желудка // Тез. докл. конгресса Поиск н создание лекарственный; средств» - Москва - 1996. - С. 202

).Пнвненко Т.Н., Эпппейн Л.М., Позднякова Ю.М. Сериновые протеиназы педробионтов: <бетратшя специфичность и пргшенгние И Тез. докл. 2-ого биохимического съезда - Москва 1997 - С. 523

).Пн5венко Т.Н., Эпштейн Л.М., Позднгкова Ю.М. Исследование продуктов гидролиза ;лков фермеишымн препзрггами сернновых протенназ // Тез. дохл. нау»пio-практической жференции «Достижения современной фармацевтической науки и образования практи-хкому здравоохранению» - Пермь, ПГФА - 1997. С. 119

[.Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Субстратная специфичность панкреатических сериновых зотеиназ различного происхождения // Тез. докл. IV Симпозиума «Химия протеолнтических ермектов» - Москва - 1997. - С. 198

?.Пнвненко Т.Н. Субстратная специфичность панкреатических сернновых протеиназ разимого происхождения // Владивосток: Известия ТИНРО - 1997 - Т. 120. - С. 14-22 ¡.Пивненко Т.Н., Позднгкова Ю.М., Давидович В.В., Эпштейн Л.М. Получение и хзрак-ристика белковых щцролнзатов с использованием ферментных препаратов различной юцифичности // Владивосток: Известия ТИНРО - 1997 - Т. 120 - С. 23-31 кПивненко Т.Н., Позднякова Ю.М., Давидович В.В., Эпштейн Л.М. Ферментативные юсобц приготовления белковых гцдролнзатов с использованием протеолитнчееких грменшых препаратов // Вопросы питания - 1997. - № 5. - С.34-38 Шизненхо Т.Н., Эпштейн Л.М., Окладникова C.B., Сравнительный анализ субстратной кздкфнчкосш панкреатических сериновых протеиназ различного происхождения // Журнал юлюцконной биохимик и физиологии. - 1997. - Т.ЗЗ, Jfe 6. - С. 615-621

Зб.Пивигнко Т.Н., Эпштейн Л.М, Окладникова С.В., Гажа А.К., Бесгдкогй Н.Ь' Ангипротеазное и иммуностимулирующее действие пептидны-; компонентов ш купгкул; куриного желудка // Прикладная биохимия и микробиология. - 1998. - Т.34, Хз 4. -С. 45. 459

ЗТПмшеиш Т.Н., Эпптгейн Л.М., Окладникова С.В., Гажа А.К. Перспективы {клользсвшз: имунноаюивных пептидов, выделенных из кутикулы куриного желудка. // Материалы 2-е дальневосточной региональной конференции со Всероссийским участием «Новь' медицинские технологи« на Дальнем Воекжг», Владивосток, 1998. - С. 5-6

38. Pivnenko T.N., Epstein L.M., Fozdnyakova iu,M., Davido'vich V. V. Enzymatic methods of pre tern hydroiyzates preparing with using prepapation of different specificity 11 Journal of Food Science. 1998 ( в печати)

39. Pivnenko T.N., Epstein L.M., Pozdnyakova Ju.M., Davidovich V.V. Hydrolytic action с pancreatic serine proteinases of different origins on protein substrates including collagen // Comf Biochem. Physiol.- 1998 (в печати)

40.Дроздоза Л.И., Пиэненко Т.Н., Якуш Е.В., Эпштейн Л.М Возможность по луче! шя гелес бразного продукта на основе сои и гидролизата молок лососевых // Рыбное хоздйство - 1998 Ха 1 - С. 50-51

41.Пивкенко Т.Н., Куданов С.А, Эппгтейн Л.М., Колодаейская МВ./Способ получения прс теолжических ферментов. А.С. № 933097. БИ Jfe 21- 1982

42.Берзиаг-Берзигг Р.В., Вина И.А., Эпштейн Л.М., Пшиенко Т.Н. и др.Д^пособ получен» комплекса тдкпеожпичесик ф-грнекгов А.С. Кг 1378384. ДСП. 1983

43.Берзйка-Берзше Р.В., Вина И.А., Эаиттеш Л.М., Пнвненхо Т.Н. и до./Способ полученн протеолнпяеекого комплекса. А.С. № 1198954. ДСП. 1983

44.Пгем»екхо Т.Н., Эпштейн Л.М., Куданов С.А, Акулин В.Н. и pp. / Способ счистки трип сика. AC. Ха 1209229. БИ № 5,19S6

45.ПгГьжажо Т.Н., ЭппптГш Л.М., Кудзгков С.А, Акулин В.Н. и др. / Способ очистки трип сина. АС. Хн 1273392. БИ № 44,1986

46.ГЪокжяо Т.Н., Ждгаюж В.М., Эпштейн Л.М. /Спосоо получения протеолитическог комплекса / Патент РФ Ks 203402S - 1992. - БИ Ка 14 -1995

47.Пижтеш Т.Н., Элахгсйн Л.М, Бесед: зола Н.Н., Сыротытов Б.Я. /Способ получени пешвдо®, обладаощш иммуностимулнрутоацш, ингибшорным и гипотензивным действиям / Патент РФ № 2036548 - 1992. - БИ № 16-1995

48.Пзпа!енхо Т.Н., Злштейн Л.М., Сеиикян С.Я. и до. ./Способ приготовления икры рыб Патент РФ № 2С9С600 - 1995, БИ № 32-1997

49.ГЬкиешсо Т.Н., Эпаггсйи JI.M, Грнгоренко А.Г. и др./С«»соб лечения инфицировании pail / Патент РФ № 2036658 - 1992. - БИ № 16 - 1995

49. Пшагейко Т.Н., Эпшгейн Л.М., Ковалев НИ. /Способ приготовления икры / Патент P<i № 20433738 - 1952. - БИ Кг 26 ~ 1995

50. Пиижжо Т.Н., ЭгашеГа! Л.М, Шульгина Л.В., Блинов Ю.Г. и др./Способ приго тослеют икры рыб / Пэте.гг РФ Кз 2090103 - 1994, БИ № 26. - 1997

51. ПиеияисоТ.Н., Эпшгейн Л.М, Псдаорытоал А.В./Способ получения лекарственны губок, содериеиок БАВ ракозажнвлающгго действия / Патент РФ Jfe 2104008 от 12.06.199: по заявке Кэ 93-036118/14/035517, 199S.

№