Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительные исследования вериновых гидролаз гидробионтов, каталитические свойства, выделение, использование в таксономии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительные исследования вериновых гидролаз гидробионтов, каталитические свойства, выделение, использование в таксономии"

• РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА.

На правах рукописи

ЭПИТЕЙН Леонид Мендельевич

УДК 577.152.344

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СЕШНОВЫХ ГИДРОЛАЗ ГИДРОЕИОНТОЗ. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ВЫДЕЛЕНИЕ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ТАКСОНОМ®.

03.00.04 -'биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ - ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена в лаборатории биохимии Тихоокеанского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (ТИНРО).

Научный консультант: профессор А.П, БРЕСТКИН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Э.Я. КОСТЕЦКИЙ доктор медицинских наук, профессор С.С. МИХАЙЛОВ доктор медицинских наук, профессор В,К. РОЗЕНГАРТ

Ведущее учреждение - ВОЕННО-!гЩЩЩИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени С.М. КИРОВА.

Защита состоится "2 " июня 1992 г. в 13-00 часов на заседании специализированного совета Д.002.89.01 при Институте эволюционной физиологии и биохишш имени K.M. Сеченова Российской Академии Наук по адресу: Г94223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан "с2 9" /К 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

Д.002.89.01 доктор биологических наук,

профессор • М.Н. МАСЛОВА

■ •»I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1 Актуальность теш» Согласно международной номенклатуре в насгоящее время известно около 2500 ферментов, из которых на класс гидролаз приходится наибольшее количество. Из этого класса с точки зрения практического применения особый интерес представляют те эстеразы и протеазы, которые можно по механизму действия и строению активного центра объединить понятием "Сериновые гидролазы".

Сериновые гзздролазя широко используются в народном хозяйстве страны (кислая и щелочная фосфатазы как диагностические препараты •в медицине, холинэстераза - в химической промышленности для индикации фосфорорганических соединений, протеазы как лекарственное средство в медицине и в пищевой промышленности для ускорения созревания продуктов и многих других отраслях).Сфера расширения использования этих ферментов ограничена недостаточной сырьевой базой. Проблема выпуска гидролаз требует поиска новых природных источников сырья и эффективных способов их выделения.

Ферменты из органов и тканей гидробионтов в промышленных масштабах не производятся. ПостановлениемПраЕительства было поручено ТИНРО разработать из отходов рыбопереработки технологии очистки многих ценных биологически активных веществ (БАБ) и среди них ферментов класса гидролаз: кислая и щелочная фосфатазы (КФ и Щ5), холинэстеразы (ХЭ), протеазы, в том числе трипсин (Тр) и химотрип-син (ХТр). Известно, что юрское сырье при обработке на пищевые цели используется не более, чем на 60 %. Выпускаемый небогатый ассортимент промышленных препаратов гидролаз из теплокровных имеет невысокую удельную активность. Это не позволяет использовать многие из них как лекарственное средство. Таким образом, актуальность этого направления работ не вызывала сомнения.

Другой аспект работы - использование данных субстратной и ин-гибиторной специфичностей в качестве характерных биохимических признаков для уточнения таксономии отдельных видов гидробионтов, в частности, кальмаров. Актуальность этого направления для биологов-прогнозистов очевидна, так как правильная систематика является основой более точного прогноза, воспроизводства и рационального ЕЫЛОЕа.

При сравнительном изучении сеойств гидролаз животных, стоящих на разных ступенях эволюции, имелась уникальная возможность дать ответ на вопрос, какой из ферментов является конститутивным.

Согласно теории Е.М. Крепса те из ферментов,, которые играют .

важную жизненную функцию, наиболее защищены от влияния внешней среды, что сказывается на более медленном изменении их структуры. Таким образом, это давало возможность приложить теорию Е.М. Крепса. применительно к сериноЕым гидролазам, что является актуальным с теоретической точки зрения.

Важным моментом поиска стабильных гидролаз есть изучение их термостабильности. В этой связи было важно сравнить полученные нами данные с теорией В.Я. Александрова по обоснованию различий в термостабильности белков тепло- и хладолюбивых организмов. Актуальность этого раздела работ состоит в том, что на основе теоретических гипотез можно было предсказать правильное направление поиска наиболее термостабильных препаратов.

Данная работа рассматривает комплексную технологию выделения ЕАВ на примере трех крупнейших групп гидробионгов: беспозвоночные, рыбы, млекопитающие. При этом, каждая группа представлена именно тем видом, который является для рыбной отрасли, наиболее Еажным объектом или с точки зрения его объема, или стабильности и технической возможности вылова. Исходя из этого, в основном, из беспозвоночных рассматривается кальмар; из рыб - минтай; лосось; из млекопитающих - ластоногие.

Делыэ работы является сравнительное комплексное изучение свойств сериновых гидролаз: фосфатаз, ХЭ, протеаз морских гидробионтов и сравнение полученных экспериментальных данных с аналогичными "реперныш" ферментами, наземных животных. Требовалось, разработать эффективные технологичные методы выделения и очистки ферментов на основании полученных данных сравнительной энзимологии. Была поставлена задача создания приоритетных способов уточнения систематического ранга особей с использованием данных субстратного и ингибиторного анализа ферментов и испытание разработанного метода в практике определения таксономической принадлежности кальмаров.

Научная новизна работы. В диссертации впервые подробно проведен скрининг гидролазной активности органов и тканей различных морских организмов, в результате которого выявлены новые перспективные источники ферментов. На основе системного подхода к изучению физико-химических свойств гидролаз разработаны эффективные методы выделения и очистки фосфатаз, холинэстераз, протеаз и по-

лучены препараты, по удельной активдости не уступающие коммерческим препаратам отечественных и зарубежных фирм. Научная новизна и оригинальность методов выделения и очистки ферментов, их применение защищены 21 авторскими свидетельствами на изобретение. Обнаруженная высокая концентрация гидролаз во многих органах и тканях гидробионтов является основанием для использования морских организмов как сырья для промышленного получения этих ферментов.

Видовое разнообразие свойств фермента дает возможность разработать принципиально новый "способ уточнения таксономии водных организмов", приоритет которого защищен тремя авторскими свидетельствами на изобретение. Применение этого способа позволило уточнить систематическое древо кальмаров Бартрама, командорского и др., что в сбою очередь, используется для рекомендаций по их промышленному вылову.

На основе исследований по термостабильности ферментов сделан вывод о том, что теплолюбивые особи имеют менее чувствительные к изменению температуры ферментные системы.

Нами высказано предположение, что субстратная специфичность, которая является наиболее важным физиологическим свойством фермента, изменяется медленнее в процессе эволюции, чем ингибиторная. Таким образом, первая может дать значительные различия лишь при сравнении "молодых" и "древних" видов, в то время как вторая -при исследовании на значительно более низком таксономическом уровне.

Практическая ценность работы: Рекомендованы новые промышленные источники сырья для получения гидролитических ферментов - не используемые ранее внутренности промысловых морских гидробионтов: рыб, беспозвоночных, млекопитающих. Разработаны методы выделения и очистки гидролаз, используемые для их промышленного получения. Налажено производство препаратов и заготовка сырья в опытно-промышленном масштабе на многих предприятиях страны. Экономическая эффективность от внедрения составляет 5 млн. рублей. Разработанный способ уточнения таксономии головоногих моллюсков для популя-ционной дифференциации видов на основе свойств гидролаз используется биологами в рвбной промышленности с целью выдачи правильных рекомендаций по рациональному вылову определенной группировки кальмаров ео избежании снижения ее численности. На основе теоретических предпосылок экспериментально найдены наиболее термо - и рН стабильные гидролазы из многих органов и тканей гидробионтов.

Положения, выносимые на защиту:

- морские организмы по содержанию гидролаз превосходят наземных животных и, .таким образом, являются промышленным экономически выгодным источником сырья для наработки ферментов;

- характеристика субстратной и ингибиторной специфичности гидролаз органов и тканей гидробионтов значительно отличается от аналогичной характеристики "классических" ферментов наземных лсивотны:

- субстратно-ингибиторные показатели каталитических свойств конститутивного фермента являются характерным биохимическим признаком особи, не зависящим от ее физического состояния, времени вылова и т.д.;

- теплолюбивые особи имеют менее чувствительные к изменению температуры ферментные система;

- субстратная специфичность, являющаяся наиболее важным физиологическим свойством фермента, изменяется много медленнее в процессе эволюции,чем ингнбиторная;

- субстратно-ингибиторный анализ каталитических свойств фермента может быть использован при уточнении систематики кальмаров, а значит, и при рекомендациях по, рациональному вылову и воспроизводству вида;

- при разработке методов ввделения гидролаз гидробионтов необходимо прежде всего учитывать их физико-химические свойства и отличия от ранее известных таковых наземных кивотных. Эти характеристики говорят, как правило, в пользу большего различия свойств гидробионтов от наземных животных, чем внутри морских организмов, что следует использовать при разработке новых методов выделения гидролаз и применения ферментов в народном хозяйстве.

Публикации и апробация работы. Всего по теме диссертации опубликовано 39 работ и получено 21 авторских свидетельств на изобретение.

' Результаты работы доложены на 4-ой Всесоюзной конференции по изучению моллюсков (Ленинград, ЗИН АН СССР, 1975 г.); Всесоюзной конференции по исследованию промысловых беспозвоночных на пищевые, кормовые и технические цели (Одесса, ИНЫМ АН УССР, ноябрь, 1977 г.); 2-ой Всесоюзной конференции по морской биологии (Владивосток, Институт биологии моря АН СССР, сентябрь, 1982 г.); 4-ой Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимреактиЕов" (Рига, НПО "Биохимреактив", 1982 г.); 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, январь, 1985 г.);

1-ом Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, ТИНРО, май, 1988 г.); 6-ой Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Рига, НПО "Биолар", декабрь, 1990 г.);

2-ом Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидро-бионтов" (Владивосток, ТИНРО, 1991 г.); Всесоюзном совещании "Рациональное использование рыб, беспозвоночных, водорослей" (Владивосток, ТИНРО, 1991 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения и 4 глав, в каждой из которых имеется обзор литературы по рассматриваемой проблеме, описание материалов и методов исследования, изложение экспериментальных данных, их обсуждение и выводы. Отдельно приведены общие выводы и заключение. Список используемой литературы включае т 740 наименований. Рзбота изложена на 425 страницах. Текст диссертации иллюстрирован 55 рис. и 84 табл.

СОДЕШНИЕ РАБОТЫ..

. Кислая и щелочная фосфагазы. Всего исследовано на ферментативную активность 12 видое рыб, 7 беспозвоночных и I вид млекопитающих.

Концентрацию белка определяли по микробиуретовому методу (Шапиро, 1976), методу Лоури и Кьельдаля, а также как экспресс-метод по оптической плотности раствора фермента при сравнении с раствором соответствующего буфера при 280 нм,.

Определение величины Е^ и v проводили по методу Лайнуивера -Берка В координатах I/V от I/fej ( Line we ever, Burk , 1934;

Яковлев, 1965).

Фосфатазнуга активность по фенил, у- и f-глицерофосфатам (ФФ, сХ-ГФ и j^-ГФ) определяли по методу Боданского ( Bodansky, 1933) в нашей модификации (глициноеый буфер, [s] = 3 • I0~2 М, t°= 30° С).

'При' определении ;трансферазноЯ активности количество образовавшегося неорганического фосфата измеряли по методу ( Fiske, SubDarow , 1925), концентрацию фенола определяли по фотометрическому методу (Powell, Smith , 1954) с использованием 4-амино-антипирина.

... Статистическую обработку..экспериментальных -дегаых. проводили по методу Мюллера и Фишера - Стьюдента (Mulier , I960).

Термоинактивацию ЩЭ исследовали в' термостатируемой ячейке

при заданной температуре инактивации. Для сравнения использоьали препараты Щ5 из кишечника цыплят и телят фирмы " Beanal " (Венгрия) с активностью соответственно 0,4 Е/мг и 0,14 Е/мг, которые растворяли в ТШС-буфере.

Б табл. I приведены данные ло активности I® в изученных орга нах и тканях морских организмов. Очень еысокой активностью облада ют представители беспозвоночных: кальмары, крабы, моллюски, а из рыб - липарис, терпуг, камбала. Этот вывод сделан по субстрату Ф2 но такая же закономерность по d- и/-глицерофосфату. Наивысшая ai тиеность у головоногих моллюсков. КФ присутствует почти во всех органах кальмаров, но самой высокой обладают сепия и гонады. При этом, имеется очень большая зависимость от пола и меньшая от стадии зрелости и гида кальмара.

Аналогичные исследования проведены по ЩФ. Высокой активное« обладают почка, печень, жабры. При этом,, концентрация Щ> у новозеландского выше, чем у командорского. Возможно, это связано с различиями в биологии вида: командорский - придонный вид, в то время как новозеландский - пелагический, что сказывается на его более интенсивном обмене веществ.

В общем виде можно сказать: как промышленные источники сырь; для ЩЬ можно заготавливать почки., печень и жабры целиком, при эт< предпочтительнее -, почки; для I® - сепия, гонады и ганглии, не ci держащие ЩФ.

Наиболее сложной при создании методов выделения всех исследуемых гидролаз является стадия перевода фермента в растворимое состояние путем разрушения фермент-липидного. комплекса. Как правило, исследователи применяли для этих целей детергенты. Наши многочисленные..экспериментальные, результаты показали,, что применение органических растворителей (Бресткин и др., 1970) конкретн для каждой из гидролаз (бутанол для ЩФ; бутанол+гексан для ХЭ; ацетон, спирт, изопропанол для лротеаз) дает наилучшие результат Для КФ получен препарат со степенью очистки ПО, а для СР - 49. Метод дает возможность получать препараты фосфатаз с активностью соизмеримой с известными коммерческими различных фирм.

Исследование pH зависимости активности Ш тканей гонад и ганглиев командорского и новозеландского кальмаров показало, что К£> ^сходного сырья имеет_рН0ПТ = 3,5. Столь низкая величина,j?H0:i для КФ гомогената - необычная для фосфатаз, так как у млекопитак пщх (печень быка), у дрожжей и т.д. эта величина лежит в предела около 5,0. Эти различия в рНопт говорят о своеобразии свойств i гидробионтов исходной ткани.

Таблица I

Активность К<3> морских гидробионтоЕ при [Б] = 3 • Ю-2 М ,( п= 6), рН = 3,5; 1;°= 30° С

Вид и исследуемые гп тготттт ТТТТТ* ЛТТП0111.Т <• V 10^ мк моль Р/ч

1 лапИ ИЛУ1 сдпЫ мг ткани мг белка

ФО 4-та |}-ГФ ФФ [ъ-га

I 2 3 4 5 6 7

Беспозвоночные

Кальмар командорский

Гонады 39,0 8,0 16,0 354 72 145

Печень 9,0 2,0 4,0 53 II 24

Ганглии 5,0 1,0 2,0 50 10 20

Кальмар новозеландский

Гонады 22,0 8,0 13,0 157 57 92

Печень 19,0 5,0 10,0 112 29 59

Ганглии 9,0 3,0 5,0 64 21 36

Кальмар Бартрама

Гонады 13,2 6,0 12,2 94,0 43,0 87,0

Ганглии 2,1 0,83 1,5 11,0 4,2 7,8

Голожаберный моллюск

Печень 18,5 8,0 17,0 196,8 35,0 180,8

Гонады 7,5 1,8 4,5 61,5 14,8 36,9

Почки 6,8 1,4 2,9 49,6 I 21,2

Краб синий

Гонады 10,0 5,0 10,0 217,4 108,7 217,4

Печень 9,0 1,5 1,3 76,3 12,7 11,0

Ганглии 0,5 0,4 0,2 8,1 8,5 3,2

Краб стригун

Гонады 10,1 1,2 1,2 157 18,8

Печень 4,0 0,9 2,2 58,8 32,4

Ганглии 2,0 0,2 0,5 20,4 5,1

Рыбы

Липарис

Печень 18,0 5,2 10,5 209,3 0,5 122,1

10

продолжение Табл I.

I 2 3. 4 5 6 7

Пилорические придатки 13,0 4,6 9,0 110,2 39,0 76,3

Гонады 10,0 2,3 5,8 105,3 24,2 61,0

Желудок 6,6 2,0 9,4 70,2 26,7 125, с

Мышцы с л е д ы

Головастиковый бычок

Печень 9,8 6,2 10,4 188,5 100,0 200

Гонады 4,8 2,8 1,3 34,1 19,8 9,2

Желудок 1,7 0,1 0,3 15,5 0,91 2,7

Мышцы с л е ! д ы

Серебрянка

Внутренности (целиком) 2,2 0,3 0,7 24,0 3,3 7,6

Мышцы 0,4 0,3 0,4 4,0 3,0 4,0

Целиком 1Д 0,5 0,9 7,0 4,1 5,5

Стихея Назова

Желудок 4,9 1,0 1,7 37,7 7,7 13,0

Печень 11,6 2,5 5,5 129,0 27,8 61,0

Гонады 8,5 3,0 7,0 74,6 26,3 61,4

Мышцы с л е д ы

Терпуг Стеллера

Печень 17,0 4,4 9,4 215,0 55,7 119, С

Пилорические придатки 9,0 2,0 3,6 82,5 18,3 33,0

Гонады 19,0 5,2 10,8 188,1 51,5 107, С

Желудок 2,7 0,7 3,3 25,5 6,6 31,0

Мышцы с л е д ы

Камбала палтусовидная

Печень 14,4 4,5 5,6 160 50 60

Гонады 6,9 1,6 2,5 53 12 19

Мышцы 0,5 0,1 0,1 4 I I

Камбала желтоперая

Печень 13,7 5,2 7,4 124 47 67

Гонады 4,7 1,5 2,2 36 12 17

Мышцы 0,8 0,4 0,8 5,7 2,8 5,7

продолжение Табл. I

I 2 3 4 5 6 .7

Терпуг

Печень 11,0 5,3 7,5 74 35,3 50

Гонады 5,2 0,8 2,1 37 5,7 15

• Мышцы 1,0 0,0 0,0 8,3 0,0 0,0

Минтай

Печень 2,7 1,6 2,6 90,0 53,0 87,0

Молоки 0,Н 0,7 0,10 1,0 6,4 9,0

Икра 1,3 0,05 0,08 16,0- 0,62 1,0

Аргентина

Печень 3,4 1,4 3,0 29,0 11,0 25,0

Гонады 1,2 0,2 0,3 53,0 9,8 14,0

Лосось

Пилорические придатки 1,1 0,21 1,1 10,0 2,0 10,0

Молоки 0,90 0,03 0,39 1,25 0,04 0,54

МойЕа

Внутренности (целиком) 5,0 0,9 2,4 41 7,4 20

Мышцы 1,0 0,0 0,4 7,0 0,0 3,0

Млекопитающие:

Морской котик

Гонады 2,3 0,34 0,54 18,0 3,5 4,3

Мозги Г,4 0,26 0,64 9,2 1,7 4,2

Сердце 1,1 0,13 0,57 5,8 0,71 3,1

Почки 0,83 - 0,052 6,1 - 0,33

Язык 0,44 0,026 0,13 4,6 0,27 0,13

Щитовидная железа 0,44 0,026 а,34 3,1 0,18 2,4

Пищевод 0,49 - - 2,8 - -

Жир 0,54 0,026 0,026 2,4 0,12 0,12

Легкие 0,26 0,026 0,026 2,1 0,21 0,21

Мясо - - - — — -

Субстратная специфичность КФ. Фермент хорошо гидролизуег стандарные эфиры в следующей последовательности: ФФ, _р-ГФ им -ГФ При этом, кинетические параметры их гидролиза под действием 'ЁФ новозеландского и командорского кальмаров отличаются друг от дру га и в некоторых случаях, например для<*-ГФ по v ганглиев значительно - почти в 3 раза (табл. 2). Имеются, хотя и меньшие, различия е величинах кинетических параметров КФ очищенного препарата и гомогената. Из табл, 3 еидно, что самый сильный ингибитор для КФ гонад - №, а для КФ ганглиев - HaF. Вце более наглядно различия свойств ферментов проявляются из анализа данных табл. 4 во-первых, как в гонадах, так и в ганглиях обоих видов кальмаров фермент гетерогенен, а Ео-вторых, КФ ганглиев одного вида кальма ра значительно отличается от фермента гонад.

Трансфераэншг активность свойственна КФ наряду с гидролитичес кой (Morton, 1950). В случае препарата КФ гидробионтов наибольнга . V трансферазшй . реакции наблюдается с ФФ в качестве субстра та, а из всех исследованных акцепторов (этиленгликоль, глицерин, этиловый спирт, метилцеллозольв) только первые даа оказались эффективными.

Молекулярная масса ЩФ кальмара, равная 300 кД и определенна, гель- и ультрафильтрацией, в 2 раза превышает таковую Есех извес ных ранее наземных источников фермента ( Nakasa&i et-, ai , 1979 что говорит о своеобразии свойств этого фермента гидробионтов. Э1 данные следует учитывать при разработке технологии выделения и очистки №.

Изоферментный состав КФ и ЩФ определяли прибором для изо-электрофокусировки в слое геля сефадекса Т-200 с горизонтальным положением охлаждающей пластины. Величина pl для КФ равна 5,0-5,. что совпадает с литературными данными для других животных ( нагг nden, raucedo , 1971), а ® кальмара содержит 3 изофорш фермента с pl= 5,3; 6,0; 6,7. Эти данные также учитывали при выборе pH экстракции, которая во всех случаях была выше pl.

Для КФ и для ЩФ кальмаров кривая термостабильности имеет точку излома, положение которой определяет степень диссоциации белка до установления нового положения равновесия системы в выбранном температурном режиме. То есть процесс инактивации предста: ляет собой двухстадийный процесс (рис.1) - в растворе в состояв; динамического равновесия находятся тетрамеры и димеры. Энергия активации диссоциации активной высокомолекулярной формы составля

Таблица 2.

Кинетические параметры гидролиза некоторых субстратов под действием КФ ганглиев и гонад, командорского и новозеландского кальмаров

Ткань Вид Константа Михаэлнса, (Кй , мМ) Максимальная Относитель-скоростъ гидро- ная скоро-лиза о .т ИГ17Т1. сть гидро-V • 10* т моль лиза, ч'мг ткани 7 , %

ФФ £-ТФ <<-ГФ ФФ ^-ГФ оС-ГФ ФФ £-ГФ К-ГФ

Ганглии командорский II 25 26 6 2,4 .1,2 100 40 20

новозеландский 10 22 40 10 5,8 3,5 100 58 35

Гонада командорский 23 24 26 70 28 14 100 40 20

новозеландский 17 16 16 30 17,5 10,5 100 58 35

Препарат командорский 35 56 28 15,5 8,2 3,1 100 52 19

гонад

Таблица 3.

Взаимодействие ингибиторов с КФ ганглиев и гонад командорского и новозеландского кальмаров ( [ФФ| = 3 ' 1СГ^ М)

-:-;— Р Шбо—~~

ИНГИБИТОР новозеландский командорский

гонады ганглии гонады ганглии

Диизопропил фторфосфат 5,4 3,9 4,8 4,5

Фторид натрия 4,6 4,6 4,6 4,6

Калий-натрий виннокислый 4,4 4,4 4,7 4,6

Уксуснокислая ртуть 4,1 - 4,4 -

Однозамещенный Фосфорнокис- 2,25 3,43 3,19 4,09

лый калий

р-хлормеркурий бензоат - 3,43 - 3,66

Таблица 4.

Биомолекулярные константы взаимодействия ДФФ с КФ для различных субстратов (кд* ГО-3, моль"^» мин--*; [б] = 3 • Ю-2 М)

командорский новозеландский

СУБСТРАТ ---

.. ------------ганглот....гонады .твнгдии гонады

Фенилфо'сфат 0,7 3,1 0,35 10,0

л-глицерофосфат 3,1 0,2 0,7 0,12

^-глицерофосфат 1,5 0,1 0,5 0,1

ет 16 нкал/моль, то есть эта форма значительно менее устойчива, чем соответствующий ассовдат ЩФ из кишечника цыпленка и теленка, для которых Е = 32 ккал/моль. Но низкомолекулярная форма ЩФ командорского кальмара отличается более высокой стабильностью: вплоть до 55° в течении 2 час активность не менялась и только при 60° после достижения 0,9 удалось измерить константу скорости инактивации (2,9 * 10 сек-*).

-1,0

-3,0

80 ъ,мин рис# Термоинактивацяя ЩФ почек командорского кальмара М

(0,05 М !;ЬС£о; 0,05 М ТГЙС-НС2 ? pH 10IО

__Е = 0,33 мг/мл при различ-

----ных температурах:

1-45°С; 2-50°С; 3-55°С;

4-60°С.

v Аналогичная картина

4 наблюдается при изучении

термоинактивации ЩФ из кальмароЕ Бартрама и новозеландского, но при этом активная тетраыерная структура и низкомолекулярная форма этих видов является значительно более стабильными к воздействию высоких температур (К^ыеньше почти на порядок) чем командорских кальмаров, а тем более цыпленка и теленка. Таким образом, различия в физико-химических свойствах фермента внутри одного вида беспозвоночных - (кальмаров) - меньше, чем между наземными и гид-робионтами, но эти различия не затрагивают химического механизма реакции, а сказываются лишь на организации олигомерной структуры белка.

Холжнэстераза. Объекты и методы исследования. Изучали многочисленных представителей трех основных групп гидробионтов: рыб, беспозвоночных, млекопитающих. Для приготовления«гомогената ткани обладающей холинэстеразной активностью, использовались, как правило, нервные ткани животных.

Активность ХЭ определяли потенциометрически (Яковлев, 1965) или колориметрически по Эллману (1961). Активность фермента выражали в международных единицах (Е). За одну Е принято такое количество ХЭ, которое катализирует превращение I микромоля соот-ветг.хзз-ащего су':трата (для-ХЭ-АХ, для других видов ХЭ-БуХ) в минуту при pH * 7,5; to= 25°С; 0,1 И KCl .

О величине антихолинэсгеразного действия необратимых фосфор-

органических ингибиторов (ФОН) судили по величине биомолекулярной константы Кд реакции взаимодействия фермента с ингибитором по формуле для псевдомолекулярных реакций (Яковлев, 1965). Эффективность обратимых ингибиторов оценивали по величине обобщенной ингнбитор-ной константы (pKj_ ).

Для биологического анализа на соответствующее систематическое положение исследовали ХЗ таксонов 4 семейств: Ommastrephidae, Gonatidae, Onychoteuthidae, Thysanoteuthidae . Выбор

семейстЕ предопределен большими различиями этих видов кальмаров в экологии и эволюции, обоснованными систематиками по условиям обитания, морфологическим и другим признакам. Такой выбор таксонов дагал возможность ответить на вопрос, будут ли получены различия в биохимических признаках прежде Есего на таком высоком систематическом уровне как семейства. После анализа этих данных изучали более низкие таксономические уровни: род, вид, вплоть до подвида и популяций.

Результаты. Содержание ХЭ, в основном, у промысловых гидроби-онтов Тихоокеанского бассейна представлены в табл. 5, из которой ейдно, что органов, соизмеримых по холлнэстеразной активности с оптическими ганглиями кальмаров (ХЭК), нет среди всех классов гидро-бионтов. У рыб и водных млекопитающих наибольшей активностью обладает мозг, а из отделов мозга - хвостатое ядро.

Как показано в табл. 6, для подавляющего числа исследованных видов кальмаров (Эпшгейн и др., 1987) АХ гидролизуется выше всех других субстратов подобно АХЭ. Однако, с соизмеримой скоростью ХЭК гидролизует и другие изученные холиновые эфиры, что либо связано с гетерогенностью холинэстеразной активности, либо со своеобразием свойств этого фермента у кальмаров. Кальмары всех четырех семейств различаются по уд. акт. АХ, при этом самой высокой (0,5-1 Е/мг) обладают Оммастрефиды, а самой низкой - гонатиды (0,25 Е/мг). В первом семействе также отмечаются значительные различия по этому показателю, при этом самой большой, превышающей даже I Е/мг, обладают Т. angoiensis и Е. luminosa . Генеральное направление эволюции кальмаров подотряда Oegopsida гектокотилиза-вдя, а на вершине этого процесса находятся представители семейства Ommastrephidae (Нигматулин, 1979). Как правило, виды этого семейства -"более активные плоецы. Вероятно, увеличение физиологической активности, подвижности и быстроты реакции на внешние раздражители способствовали появлению еысокой концентрации ХЭ. По-види-.

Таблица 5

Холинэстеразная активность некоторых органов и тканей - гидробионтов

Вид животного Орган, ткань Удельная активность Е/мг исх. ткани АХ БуХ

Кальмар новозеландские Ганглии оптические 0,5 0,4

Кальмар Бартрама 0,57-0,77 0,32-0,5

Беспозвоночные Кальмар командорский Кальмар тихоокеанский - 0,24 0,56 0,145 0,39

звездчатые 0,16 0,07

сердца жаберные 0,04 0,04

сердце центральное 0,056 0,056

Краб волосатик ганглии брюшные 0,034

стригун и 0,016 0,002

камчатский _Т1_ 0,015 0,002

Криль целиком 0 0

Кижуч Мозг 0,02 0,02

сердце 0,001 0,0006

Рыбы Мавроликус целиком 0,017 0

мясо 0,02 0

Тюлень Мозг

хвостатое ядро 0,045 0

Млекопита- мозжечок 0,012 0

ющие червь мозж. 0,008 0

серое в-во 0,003 -0

к - по Эпштейну и др.,1987. ш - по Бресткину, Розенгарту, Эпштейну,1970.

Кинетические параметры гидролиза эфиров холинэстеразаш ткани зрительных ганглиев различных видов кальмаров

емейство Тодсе-яейство Род Вид Подвид, район вылова Удельная активность Ин^ при И опт.

АХ ПХ БуХ МеХ пЭМ

Еис1ео-Е.1ит1-tвutis пова 1,05 0,76 0,67 0,45 0,5

северный Тихий ок-н (Курилы) 0,77 0,60 0,54 0,27 0,22

о 03 с X « о X о. 0} и а я Е -н с га 1. и и га Х> Тихий ок-н Ш.Зеландия)0,57 0,4 0,32 ' 0,19

0) 01 ■о Щ 14-> о ш северный (Атлантика) 0,66 0,44 0,42 0,21

Е О О О южный ■(Атлантика) 0.56 0.38 0.34 0.18

X а ^иг^3'гоои1кжныЙ (Аглан-геигьчз горизика_ТрОШШ!)0-147 0>39 0,38 0,43

о и м СО со Т.зпдо-1епз1э Тихий ок-н (Н.Зеландия) 1,41 1,1 южный (Атлантика) 1,41 1,1 1,06 1Д 1,32 1,28

га Е о а с ■о о и о ". •н осенняя популяция 0,56 0,45 0,34 0,27 0,21

Е О ■н ■а о и <о ■о о ь •К • о 1- о а зимняя популяция 0,56 0,5 (Курилы) 0,39 0,30 0,23

п о 1- N010-Гос1а-гиз N.310-ап! Тихий ок-н (Н.Зеландия) 0,50 0,40' 0,40 0,26 0,21

таНсЗае - Ввггу гвиг- 1"11з -В.ша- д1з1ег Тихий ок-н (Берингово море) 0,24 0,15 0,145 0,145 0,13

'сЬогеи-)1с)ае ОпусИо-О.Ьа-ГетЫэ пкз! (Курилы) 0,45 0,90 0,63 0,22 0,27

/эаг^еи--)1с1ае ТЬуза-поГеи-«:Ь1з Т.гИош-.Ьиэ Атлантика 0,8 0,66 0,64 0,71 -

Таблица 6

Оптимальная концентрация субстрата о опт. • КГЧУ! Относительная ско- Константа рость по уд. акт. Михаэлиса отн.. % Кт ' 10"

АХ ПХ БуХ НеХ ИЭМ АХ ПХ БуХ МеХ ИЭМ АХ ПХ БуХ МеХ ИЭМ

2 12 10 10 100.72,5 65 43 47,5 0,8 0,9 1,0 20 3

I I 2 20 2 100 78 70 34 32 0,6 0,9 1,1 9,9 I

I I I 10 100 68 59 33 30 0,75 0,89 0,91 9,1

I I I 10 100 67 64 32 31 0,74 0,87 0,92 9,3

I I I 10 100 70 60 33 32 0.78 0.83 0,87 9.7

I 2 I 10 100 83 81 91 0,66 0,91 0,86 9,2

I 2 I 10 100 78 75 94 0,7 0,91 1,08 10,8

I 2 I 10 . 100 78 78 91 0,78 1,02 1,10 10,1

2 2 10 50 10 100 80 60 49 37 0,5 1,0 2,0 30 0,9

2 2 10 50 10 100 90 70 53 40 0,5 1,0 2,0 30 0,9

3 2 3 20 40 100 80 81 52 42 1,4 0,8 0,9 20 1,8

3 50 50 50 30 100 62 60 60 53 1,0 3 0,8 30 4

- tU..." .4 . - 'Т. *

2 2 2 30 5 Г00 200 140 50 60 0,3 I 0,8 10 2

I 2 I 5 ТОО 82 80 89 •0,9 0,84 0,85 1,6 -

мому, низкая активность ХЭ командорских кальмаров связана с особенностями их биологии. Как известно, это семейство стоит в начале эволюционного древа кальмаров. К тому же гонатиды относятся к нерито-океаническим или примитивным видам, которые связаны с дном или склоном, так как имеют донную кладку (Несис, 1977). Этот кальмар является среднеглубиннда видом и совершает суточные вер, тикальные миграции. Отличной от других субстратной специфичностью обладали представители семейства ОпусЬс^еи-ьыаае , ХЭ которых с наибольшей скоростью разлагает пропионилхолин (ПХ) и поэтому может быть отнесена к пропионилхолинэсгеразам (ПХЭ). Что касается ПХЭ, то на основании сопоставления семейств различных эстераз плазмы крови •Аугустинсон ( АиЕ-из-Ыпзоп , 1949) пришел к заключению, что в ходе эволюции ПХЭ, гидролизующая с наибольшей скоростью ПХ, и бутирил-холинэстераза (БуХЭ) произошли от алиэстераз, причем ПХЭ является более примитивной ХЭ. Филлиппова и Бизиков (1983) при изучении скелетов-гладиусов современных кальмаров пришли к выводу, что наиболее примитивными следует считать гладиусы семейства ОпусЬо^е-игмйае Все это может рассматриваться как свидетельство наибольшей близости онихотеутид к ископаемым белемнитам, что. подтверждает их относительную древность. Наш данные по наибольшей скорости гидролиза ПХ у О.ЪогеаН ,)ароп1сгвс учетом гипотезы Аугустинсона подтверждают этот выеод.

Определение, индивидуальности ХЭ. В голоеном мозгу млекопитающих помимо АХЭ, играющей ключевую роль в синаптической передаче, обнаружена также и БуХЭ, роль которой остается до конца не выясненной. Гетерогенной оказалась также по отношению к ХЭ нервная ткань некоторых еидов кальмаров (Григорьева, 1983). Из зрительных ганглиев Т. БаваЛа-ьиБ выделена БуХЭ, однако доказательства гомогенности препарата не приводятся (Григорьева, 1981). По субстратной специфичности эта ХЭ напоминает ХЭ кальмара Т. рас^Псиз , которая гомогенна (Турпаев в др., 1968). То есть отЕет на вопрос, сколько ХЭ содержит ткань ЗГК зависит от вида и не имеет заранее однозначного ответа. Решение этого вопроса может иметь отношение к разгадке различных этапов .эволюции семейств.

Изучали 7 видов представителей 6 родов 4 подсемейств принадлежащих к 3 семействам промысловых кальмаров (табл. 7). Суть кине-—гического метода анализа индивидуальности ХЭ в гкатпгьаключена' в использовании различных специфических субстратов и большого набора избирательных ингибиторов самой различной структуры (Кабачник

и др., 1970; Балашова и др., 1983; Садиков и др., 1976). Анализ данных показывает, что из всех семейств только для одного Тос1а-госИпае ткань ЗГК по отношению к ХЭ гомогенна: все кп для любого из ингибиторов по всем субстратам равны между собой. В то же время, для Оттав-ьгерЫпае (например, для 0. ЪагЬгаи! всех 4 ареалов по ДФФ различия в 100 и более раз), а также для тьуБгто-ьеиъмаае ткань ЗГК по отношению к ХЭ гетерогенна. Интересно сопоставить данные субстратной специфичности и индивидуальности. Первые говорят о том, что наиболее прогрессивными являются оммастрефиды, а вторые уточняют этот вид: наиболее прогрессивно подсемейство тос1а-гос11пае)а с учетом Есех характеристик (уд. акт. и т.д.) - вид Т. апво1епз5-й . Эти данные следует учитывать при выборе сырья как источника для лекарственных средств и особо чистых биохимреактивов, так как наличие только индивидуальной ХЭ значительно упрощает способ ее очистки и способов стандартизации препарата.

В связи с гетерогенностью ХЭ 0. ЬагЬгаш. всех 4 ареалов обитания: северо- и южно- тихоокеанские, северо- и южно-атлантические, - необходимо было еыяснить: являются ли отличия в ХЭ свойствах ткани ЗГК лишь различным количественным соотношением "одинаковых" индивидуальных • ХЭ (например» типа АХЭ и БуХЭ) или эти фермент имеют качественные отличия в каталитических параметрах каждого из ферментов гомогената для соответствующего ареала вида. Мы предположили, что различиям на подвидоеом и ниже уровне таксона должны соответствовать и различия качественные, а не количественные, в индивидуальных ХЭ.

. Действительно, как показали исследования с помощью ДМ индивидуальности по методу, впервые предложенному Григорьевой (1979) и модифицированному наш, в исходной ткани обнаружены две ХЭ: одна типа АХЭ, другая типа БуХЭ. Причем, сравнение кинетических параметров субстратного гидролиза до к после действия ДОФ (табл. 8) и биомолекулярных констант Кд- для ФОН по каждому из трех субстратов (табл. 7) показало равенство индивидуальных ферментов юга Тихого и Атлантики (южные особи), но принципиальное различие в свойствах как типа АХЭ, так и БуХЭ для трех ареалов: южные, северо-атлантические и северо-тихоокеанские, то есть, различия, как и предполагалось, имеются качественные. Одновременно, статистичес кая обработка экспериментальных данных показала независимость все: исследуемых кинетических параметров от пола и стадии зрелости осо би для любого из видов. Такая же статистическая обработка проводи

Таблица 7.

Бимолекулярные константы ингибирования ( Кп ) холинэстеразы зрительных генглиев некоторых видов кальмаров с различными ФОИ,

М-"'", шн"^

Семейство Подсемейство РОД Вид, район Д Ф Ф

популяция АХ БуХ МеХ

O.bartrami Северный, Тихого ок-на 1,7-Ю4 2,1-Ю7 2,7-Ю4

ш < (Л ш X Южный, Тихого ок-на (Н.Зелан- с дая) I,8*10 1,7-Ю7 4 6,6-Ю

н X а. а. ш се н Северный, Атлантики 7,5.104 3,9-Ю7 4,3-Ю4

ш а: к о Юяный, Атлантики (тропики) 1,6-ГО5 1,6-Ю7 6,6-Ю4

ш < о м х (О < г г: о 1 э ш и о Z Ш со X н ь г со н- 3.р1ерогиз Ю.Атлантика Экватор По'пуляц. 1,8-Ю6 8,7.10® 2,9-Ю6

а. ш о: ш < 2 Т.апдо1еп81з Ю.Пацифика Н.Зеландия 3,8-Ю6 4,5*10® 4,6 *Ю6

н (Л Ы со Щ Ю.Атлантика 4,0-10Ь 4,0-Ю6 3,8*106

< X £ О к < □ о о: < о о н T.pacificus осенняя популяц. 7Д-106 7,2'Ю6 7,7*10®

О а о зимняя популяц. 7,0*106 3,9-Ю6

1- Nototo-darus N.sloani sloant Ю.Пацифика Н.Зеландия 7,5*10° 8,5-10® 7,9-Ю6

ТНуза-го1еи- - Thysa-noteu-this Атлантика Т,rhombus 4,0 -I06 8,4'Ю7 5,1-I06

Таблица 7.

Г д - 4 2 Л Г - 6 2

АХ БуХ МеХ АХ БуХ МеХ

1,4-Ю8 4,7-Ю7 1,2*10® 4,6-Ю4 8,3-Ю5 6,2-ГО4

1,5*10® 4,5-Ю7 1,7-Ю8 5,7-Ю4 5,3-Ю5 5,4-Ю4 ч

I,I-I08 ' 4,2-Ю7 I.I-I08 3,5-Ю4 ' 4,4-Ю5 5,2-Ю4

I,3*I0a 4,2-Ю7 1,7-Ю8 5,6-Ю4 5,7*105 5,4-Ю4

1,7-Ю7 1,4*107 2,0-Ю7 6,0-ю5 6,4'Ю5 3,4-Ю5

8,4*I07 8.5-I07 8,4-Ю7 3,0-ю5 3,2-Ю5 3,3*Ю5

8,0-Ю7 7,9-Ю7 8,0-Ю7 3,6'Ю0 2,8*Ю& 4,0-Ю0

4,3*I07 3,6-Ю7 3,Г*107 4,7*105 6,2-Ю5 4,2-Ю5

4Д-107 4,8*105

I,6*IÚe ! 5,9'Ю7 1,9'Ю8

I,7*I08 4,1-Ю7 1,3-Ю8 2,9*104. 1,7-Ю5 ЗД-1С

Таблица 8.

Кинетические параметры гидролиза субстратов для холинэстеразы ткани оптических ганглиев о.Ьапгвш1 разных частей ареалов до и после действия ДФФ.

Исходный гомогенат

ДФФ - малочувствитель- ДФФ - чувствительная ная холинэстераза холинэстераза

Е-1 Я} Оч Ем О

ЧЭ >»

и

ей и к

Ен

Я §

Е-1

ч:

к

<х> и а> о

+ I

о Я

: о

о; й!

ОЯ ПЗ О со

13«

J Ч N Кой ЙЙ О

ей Я

я ф

ч и я о

ёо

£0 ¡5?

I е-«

о

о<д

0) Е-<

Я о

О) СЙ

О V

3

к

ь к

Ен

к

СИ

Ш

д <в о

I

+ ЗЯ

ей § К сб Я Р, Ен Е* К О

са я й

3

о со

§

КОЙ О

а я

св ф

К О

[о ГРн

га Я I Н о

о, л

(В н

я о

св яЗ О Р

к

Ен

к §

Ем

к

Он ©

и ©

о

АХ ПХ БуХ МеХ

0,66 0,44 0,42 0,21

0,57 0,39 0,335 0,185

0,77 0,60 0,54 0,27

0,55 0,28 0

0,17

0,49 0,235 0

0,135

0,71 0,36 0

0,20

0,11 0,16 0,42 0,04

0,08 0,155 0,335 0,05

0,06 0,24 0,54 0,07

>

* м . ПХ 100 100 100 100 100 100 100 100 100

67 68 78 51 48 51 145 194 400

> БуХ 64 59 70 0 0 0 382 420 900

МеХ 32 32,5 35 31 27,5 28 36,5 62,5 116

АХ 0,74 0,76 0,77 •0,94 0,84 0,79

ПХ 0,87 0,86 0,95 0,99 0,99 0,90

БуХ 0,92 0,89 0,91 0 0 0

МеХ 9,3 9,4 9,9 10,2 10,8 9,8

ПРИМЕЧАНИЕ : доверительный интервал для ДФФ - малочувствительной холинэстеразы по V и К т 0,05 и 0,09 соответственно.

лась и данных по определению зависимости Кд от длительности хранения замороженных при минус 18°С тканей ЗГК. Показано, что такой способ хранения не приводит к изменению в течение года кинетически параметров.

С целью поиска оптимального способа хранения ферментного преп рата изучали кинетику инактивации ХЭ в течение 4 лет хранения в же тяных консервных банках и ампулах при различных условиях :вакуум, аз и прессование. Опыты проводили в трех повторностях, дисперсии воспроизводимости коэффициентов регрессии рассчитывали для 95 % довер: тельного интервала (Налимов, Чернов, 1965). Для количественной оце ки влияния факторов использовали схему полного факторного эксперимента с учетом коэффициентов регрессии и теории надежности (Берзин Варфоломеева, 1979). По этим расчетам макисмальное время сохранен нативных свойств фермента в неблагоприятных условиях (при 22°С) с тавляет 6 лет при прессовании.

Таксономия на основе фосфатаз и ХЭ. Своеобразие ХЭК предопред лило повышенный интерес к этому ферменту как отечественных,, так и зарубежных ученых.

Таксономия на основе субстратной специфичности. По кинетическ параметрам (табл. 6) видны очевидные различия на уровне семейств оммастрефид, гонатид, онихотеутид ( угАХ» УД. акт. и др.). Внутри семейств имеются и другие различия, например по Мех: уптт„ более

. ид 1 •

90 % для анголензис, но около 30 % для Бартрама; по Кт - имеются различия в 30 раз. Несмотря на то, что фосфатаза также дает опреде ленные различия на уровне семейств, использование ее для целей так сономии более затруднительно, чем ХЭ, из-за зависимости ее уд. акт от физиологического состояния особи.

Таксономия на основе ингибиторной специфичности. По необратимым ФОН. Таксономия по субстратному анализу как фосфатаз, так и ХЕ не позволила спуститься до уровня вида. С целью углубления метода использовали ингибиторную специфичность. Дня выбора наиболее чувса Еительных соединений провели ингибиторный анализ на основе сравнительного ХЭ изучения двух видов кальмаров: тихоокеанского Т. Рас1-:Гз.сиз и командорского В. magisteг, принадлежащих к различным семействам: первый - к оммастрефидам, второй - гонатидам. Даже среда эволюционноголодых оммастрефид тодародесы, по-видимому, стоят на вершине эволюционного развития этого семейства, в то время как го-натусы - одни из самых древних кальмаров. Для командорских кальма-

ров наблюдаются сезонные скопления этого промыслового вида в Беринговом море, в частности, в районах: Курильских островов (южные особи), между мысами Олюторский и Наварин (западные) и в Наварино-Аляс-кинском (северные).. Более того, высказывается мнение, что такие скопления можно рассматривать как внутривидовые группировки (Несис,1977). Наиболее близок к тихоокеанскому кальмару ареал обитания у,"южных" особей, в связи с этим отбор специфических ингибиторов проводится по анализу ХЭ именно у, особей этих видов головоногих. В табл. 9 сопоставлены данные по чувствительности к семи ФОИ обоих видов кальмаров. Самым результативным ингибитором ХЭК оказался ЛГ-56, который был активнее по сравнению с реперными не менее, чем в 150 раз. Такая зависимость не оказалась неожиданной, гак как аналогичная высокая эффективность ФОИ с тиобутильной группой отмечалась ранее для ХЭ тихоокеанского кальмара (Турпаев и др., 1968; Розенгарт, 1967). На этом основании высказано предположение о комплементарности 3,3-ди-метилбутильного радикала активной поверхности ХЭ не только, тихоокеанского кальмара. Самое большое различие между ХЭ тихоокеанского и командорского кальмаров выявилось при сравнении ЛГ-56 и его изомера л. строения ЛГ-63: в первом случае снижение 10-кратное, ео втором -90-кратное.

Таблица 9.

т т

Антихолинэстеразная эффективность необратимых ФОИ (кд М~А*мин ) для холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров

ИНГИБИТОР кп л л я

командорского тихоокеанского

[(CH3)2CH0l2Р(0)Г 1Д-то7, 6,9 • 10ь

CgHgOiCHjgPio) s CgH4s (cayc^ 1,6-Ю7 4,3 • I07 Гурпаев и др.,1968

С2Н50(СН3)Р(0) S С^ sCgHg 1,4-Ю5 2,8 - I05 Турпаев и др., 1968

С2Н50(СН3)Р(0)S C^H4C(CHg>3 6,3-Ю5 2,6 • ТО6 Розенгарт, 1967

C2H50(CH3)P(0)S C6HI3 7,0-Ю3 2,4 • Ю5 Розенгарт, 1967

(C2H50)2P(0) s c^4c«H3)3 Т,7~104 1,6 • ТО5 Абашкина, 1968

ед)2Р(0)вс6н13 1,5 -Ю3 8,4 • Ю3 Абашкина, 1968

В таб. 7 приведены данные дая наиболее "характерных" ФОН по кальмару Бартрама из четырех частей ареала Тихого и Атлантическое океанов. Анализ каталитических свойств ХЭ показал, что особи Бартрама из Ккной Атлантики и Большого. Австралийского залива (БАЗ) Югг Тихого обладают одинаковыми кинетическими параметрами по всем исследованным ингибиторам, а это позволяет предположить, что кальма] этих районов не обособлены и составляют единую "южную форму" даннс вида« Ареал этой формы циркумполярный и ограничен двумя течениям! Юкным Пассатным на севере и течениями западных ветров на юге. Вида мо, кальмары с течениями проникают из Шгой Атлантики в Индийский океан, а затем в БАЗ, который может служить местом нагула этих осс бей. По мере роста и созревания кальмары вновь возвращаются в Индийский океан для размножения. Отличия "южных" форм от северных з* чительнее дая тихоокеанских, чем атлантических. Этот вывод коррели ет с историей формирования видового ареала. Кальмары из Окной часа ареала могли проникать в северо-атлантическую и северо-тихоокеанс-куа> в эпоху оледенения через восточные районы соответственно Атлаи тики и Тихого (Зуев и др., 1975) во время отсутствия экваториально барьера высоких температур. Однако,в восточной части Тихого обширное пространство между районами обитания северной и южной форм Бах рада занимает гигантский перуано-чшшйский кальмар Dosidígus diga; в пределы ареала которого практически не проникают другие ommastn dae. Вероятно, Д. digas - активный хищник и мощный конкурент - "не допускает" существования других экономически близких видов этого с мейства внутри своего ареала. Следовательно, ареалн северо-тихооке кой и южной форм Бартрама могли соединиться лишь в еще более ранки период максимального похолодания, когда теплолюбивый Д. digas бы вынужден покидать Восточную Пацифику. йадимо, последнее разъединен северо-атлантической и шной форм произошло позже, чем северо-тихо океанской и южной, поэтому степень дивергенции свойств ХЭ первой п ры ниже чем второй.

На основании отличий в величинах по всем ингибиторам, а га же биологического анализа <3уев и др., 1985) следует, что совокупность особей 0. bartrami четырех ареалов обитания можно рассматривать как суперпопуляцию по Беклемишеву или популяционную систему п Коновалову (1980) и представляет собой только три подвида по Шварц (1973), то есть три географические формы: южные, североатлантические и северотихоокеанские. Иначе, три географических изолята по Майеру, в трактовке которого каждый изолят преотавляет собой зарож дающийся вид.

Таксономия по обратимым ингибиторам« Известно, что обратимые соединения сорбируются в районе анионного центра, что должно обусловить гораздо более высокую чувствительность последних ко всем самым незначительным изменениям структурной поверхности фермента. Предложенное А.П. Бресткиным (1981) универсальная мера эффективности в виде обобщенной ингибиторной константы % делает возможным сравнение эффекторов с разным характером тормозящего действия. В качестве обратимых ингибиторов изучены несколько групп различных по структуре ониевых соединений: соли тетраалкиламмония; производные амидного аналога АХ; бистримегиламмониевые силоксановые производные; лупинин и его производные; триалкилсульфониевые ионы и др. С учетом всех количественных и качественных показателей доя более тонких хемотаксо-номических исследований на уровне группировок были выбраны (табл.10) пять специфических обратимых ингибиторов. Достоверные количественные различия в свойствах ХЭ особей трех районов командорского кальмара В.■magisterпo многим величинам констант ингибирования, а также качественные отличия в типе торможения говорят о существовании грех внутривидовых группировок этого вида кальмара в Северо-западной части Тихого океана: Центральные Курилы, Олюторо-Наваринский, При-былово-Аляскинский.

ПРОТЕАЗЫ

Объекты и методы исследований. Многие свойства протеаз исследовали по аналогии с ХЭ. Из протеаз изучали общий протеолитический комплекс, индивидуальные ферменты: трипсин, химотрипсин, а также амино- и карбоксипептидазную и эласгазную активности.

Для выбора наиболее перспективных источников заготавливали внутренние органы промысловых объектов Тихоокеанского бассейна: рыб, беспозвоночных, млекопитающих. Из рыб наиболее подробно изучено семейство лососевах ( За1топ1йае ) рода тихоокеанских лососей ( Оп-согупсЬиз ) _ пять видов и род гольцов ( Ба^оИнив ) - два вида. Из внутренних органов, в основном, исследовались пищеварительные ткани: для рыб - пилорические придатки, для беспозвоночных - гепато-панкреас, для млекопитающих - поджелудочная железа, которые тщательно отделяли от других органов, замораживали и хранили при минус 18°с. В случае необходимости длительного хранения ткань лиофилизировали на установке ТГ-15 в режиме, разработанном наш для сушки лабильных БАВ морского происхождения. Сублимированный порошок закатывали в жестяные банки под вакуумом и хранили при О +5°С.

• Таблица ю.

Константы обратимого торможения <,М мин скорости взаимодействия обратимых ингибиторов с холинэстеразами оптических ганглиев командорского кальмара из различных частей ареала с-з части Тихого океана

Формула' ингибитора

Центральные Курилы Олюторо-Наваринский Прибылово-Аляскинский (южная группировка.) (западная группировка) Xсеверная группировка)

рК1 рк± Т/Т рК1 РК1 рк£ Т/Т РК1 рКх рк! Т/Т

I

■сн2й(сн3)3

II(СН3)С(0)МНСН2СН2Ы(СН3)30 .сн„-сн,

ТТТ ' ^ г\ +

° • > ри г»и • "Э

сн_-сьц сн_он

о

У Н5С2 С2Н5 СН^О"

сн,

)2- 4,75 4,57 4,28 С 5,53 5,46 4,72 С. 5,1 5,01 4,38 С

2,46 2,33 1,88 С 3,51 3,37 2,93 С 2,96 2,26 2,86 Н-Б

2,42 1,75 2,31 Н-Б '2,18 1,43 2,09 Н-Б 3,38 3,22 2,88 С

5,25 5,16 4,23 С 3,07 3,07 К 5,32 5,09 4,94 н

3,77 3,73. 2,65 С-К 2,98 2,98 К 2,74 2,74 — К

ПРИМЕЧАНИЕ : рК1 =-1дК1 и т.д., Т/Т - тип торможения

го

На стадиях очистки определяли протеолитическую активность кислых (pH 3,0) и нейтральных (pH 6,0) протеаз по методу Ансона (Anson, 1938) в модификации Каверзневой (1971), используя в качестве субстрата гемоглобин. Активность щелочных протеаз определяли по методу Кунитца (Kunitz , 1947) в этой же модификации, используя в качестве субстрата 2$ казеин. Эстеразную активность определяли по методу Шверта и Такинаки (Schwert,Takenaka, 1955) в модификации Хаммеля (Hammel , 1955) с использованием в качестве субстратов: для Тр -метиловые эфиры N-то луенсульфонил-ь-аргинина (ТАЮ) или n-бензоил-аргинина (БАМЭ); для ХТр - метиловый (этиловый) эфир N-бензоил- х,-тирозина (БГМЗ) или N-ацегил- ^тирозина фирмы "Reanal" (Венгрия). Сйределние пептидазной активности проводили по методу Ли и Такахаша (Lee, Takahasi , 1966) используя в качестве субстратов: для ашно-пептидазной - лейцил-глицил-глицил; для карбоксипептидазной - карбо-бенз окси-глнцил-фенил-аланин.

Результаты. Среди исследованных видов (табл. II) наибольшей активностью щелочных протеаз обладают лососевые, несколько ниже - камбала, сельдь, терпуг. Беспозвоночные уступают лососевым, из них наиболее близок к активностям рыб - камчатский краб. Водные млекопитающие по активности не уступают лососю. Примерно такое же соотношение среди исследованных видов по Тр и ХГр-подобным активностям. В связи с этими данными для исследований свойств и разработки промышленного метода выделения протеаз попользовали лосось, камбалу, терпуг; из беспозвоночных - краб; из млекопитающих - киты. Самое высокое содержание амино- и карбоксипептвдаз обнаружено в гепатопанкреасе краба»

Межвидовые различия в активности протеаз для всех 7 видов лососей выражены слабо, что коррелирует с одинаковыми пищевыми потребностями и условиями обитания. Изменение физиологического состояния лососей соответствует шести стадиям зрелости. Различия в уд. акт. отмечены на всех стадиях, но резкое ее падение наблюдалось при переходе от 4 к 5-6 стадиям. Полученные данные хорошо согласуются с литературными сведениями о физиологии вида.

В случае рыбных протеаз классический прием кислотной экстракции не приемлем, так как при pH « 3,5 происходит необратимая инактивация ферментов гидробионтов. В связи с этим для изученных биообъектов нами подобраны оптимальные pH экстракции (выше 6,0)„ стабилизирующие агенты (соли кальция), органические растворители для осаждения (изопропанол, ацетон), в результате чего получен препарат с комплекс-

Таблица II.

Прогеолитические и эстеразные активности пищеварительных органов морских организмов

cö И

Й

£

Объект

Удельная активность /10' по субстратам

Е/мг белка/,

казеин Гемоглобин pH 7,8 pH 3,0 pH 6,0

"тр.10~3ХТр. 10~3 БАЭЭ БТМЭ

а

хэ

я

Он

Нерка 1,00 - - 200,0 2 75 (О.легка)

Камбала 0,550 0,065 0,150 108,1 126,1 (Hypoglosscidas dubius)

Сельдь тихоокеанская 0,415 0,125 0,345 87,2 124,9

(Clupee pallassi)

Терпуг 0,300 0,100 0,080 100,3 110,49 (Pleurogramrnus azonus)

Стихея 0,150 0,03 0,055 49,89 41,57 (Stächaus nozawac)

Бычок 0,115 0,050 0,005 26,17 52,33 (Myoxocephalus brandti)

Навага дальневосточная 0,100 0,08 0,005 21,19 15,89 (Kleginus gracilis)

Маслюк 0,045 0,470 0,015 11,56 8,68 (Pholis fascietus)

Берике 0,011 0,250 0 7,21 24,30

(Beryx spleurideus)_

cd 3

о и о n со о о о

cd

ю

Краб камчатский 0,245

(Paralitoides camtchaticus)

Краб волосатый 0,09

(Cancer pagurus)

Криль антарктический . 0,09 (Euphsusia superba)

Кальмар командорский 0,06 (Berryteuthis magietar) Кальмар тихоокеанский 0,035 (Todarodes pacificus) Осьминог 0,030

(Octipus conispediceus)

0,055 0,335 78,35 55,14

0,02 0,17 42,27 39,25

0,065 0,250 следы

0,32 0,09 следы

0,110 0,145 следы

0,150 0,105 1,89 6,80

э cd

о S . w В

cd о äl

Кит усатый 0,915

(Ralacnopterc acutorostratr)"-

48,50 119,49

ной протеолитической активностью в 35 раз превышающей активность коммерческих препаратов (из быка) со степенью очистки - 50, а в случае аффинной хроматографии - до 500. Препараты, полученные из пилорических придатков лососевых, являются комплексными, так как в них присутствуют Тр, ХТр, амино- и карбоксипептидазн.эластаза, Есе вместе которые обеспечивают глубокий гидролиз белка.

рН0ПТ Все ранее известные протеазы высших наземных млекопитающих проявляют максимальную активность при pH = 8,0 ( Wong, Liener, • I960) На рис. 2 для протеаз лосося имеются два пика активности: слабовыраженный при pH = 8,0 и сильно - при pH = 9,5. Как показано . (нижний график Б по Тр и Б по ХТр), первый пик обусловлен совместными действиями Тр и ХТр, но более - ХТр, второй - только Тр. При этом, Тр-подобная протеаза лосося проявляет свою активность в более широком диапазоне pH (от 7 до 10), чем бычий (pH 8,0). Полученные нами данные для оптимального действия Тр лосося близки, но все-таки отличаются для других гидробионтов( Keller, 1961; uschida , 1984). Аналогичный для лосося рНопг получен нами для протеазы терпуга, камбалы, а также для их Тр и ХТр.

С целью изучения свойств проводили разделение протеолитичес-кого комплекса вначале на ДЭЛЭ- и КМ-сефадексах, в результате чего определили четыре изоформы каждого из ферментов Тр и ХТр, из которых три являются анионными и одна катионная. Это значительно больше, чем у млекопитающих, где лишь одна-две. Возможно, что больший набор изоформ протеаз рыб обеспечивает стабильное проведение процессов жизнедеятельности в изменяющихся температурных условиях.

Молекулярная масса, определенная электрофорезом, для всех изоформ ферментного препарата из терпуга была примерно одинаковой и равна 30 кДа. Эта величина значительно огличаетоя от ранее исследованных для "классических" препарата: быка - 23-26 кДа (Баск, 1962) человека - 26 тыс. ( Coan, 1972), карпа - 25 тыс. ( Cohen, I98I).B то же время определение изоформ Тр и ХТр камбалы и лососевых (на примере кеты) показало, что их значение равно 23-25 тыс. (рис. 3), что подтверждается данными и других авторов (uchida et ai, 1984) и близка для Тр быка.

Задача получения индивидуальных протеаз решилась методом аффинной хроматографии. Исследовано более чем 20 сорбентов различной структуры, содержаще з .-качестве нерастворимых матриц акриловые полимеры, целлюлозу (в форме бумаги и ее модифицированные акриловыми мономерами производныеi, сефарозу . В качестве лиганда для

Активность, %

паратов:

1-й? пилорических придатков лососе вше;

2 - панкреатина

3 - протос^бтилина по субстратам: казеин (А), ТАМЭ (Б),

БГМЭ (В)

Мольмасеа, хЮООО

5,0 4,0 3,0

2,0

1,0

0,2 0,4 0,6

К£

Рис.3 По луло гарифмическиЯ

график зависимости молекулярной массы белков от их подвижности в электрическом поле. Белки: <

1 - сывороточный альбумин чело-

века (69 кДа)

2 - яичньтЧ альбумин (43 кДа)

3 - пепсин свиньи (35 кДа)

4 - трипсин и химотрипсин терпу-

га

5 - трипсиноген бычий (25,7 кДа)

6 - трипсин и химотрипсин кеты —*■

7 - лиэошм (17,5 кДа)

8 - рибонуклеаяа (13,5 кДа)

первоначальных опытов использовали белковый ингибтор из сои, ово-мукоид, а затем для большинства сорбентов гексаметилендиамин (1МДА). В растворимом состоянии ВИДА одинаково тормозит активность как исследуемых ферментов, так и бычьего Тр, но после иммобилизации проявил биоспецифическое сродство только к анионным формам трипсиновых протеаз.

Однако, не все полученные сорбенты, содержащие в качестве ли-ганда ПЩ.» оказались высокоэффективными. Акриловые полимеры обладают низкой сорбционной емкостью и специфичностью разделения. Наилучшими оказались сорбенты на основе целлюлозы, общая сорбионная. емкость которых определяется кооперативным эффектом ионных, гидрофобных и биоспецифических взаимодействий. Ее суммарная величина зависит от рН и ионной силы.

Оптимальными условиями для взаимодействия аффинных сорбентов с комплексными протеазами лососей при сорбции является слабо щелочная среда (рН 7,5-8,0) при величине ионной силы 0,125. Эффективная элюция осуществляется растворами с высокой концентрацией солей и органических растворителей. Полученная фракция содержит практически Еесь сорбировавшийся Тр и небольшое количество ХТр, количество которого значительно зависит от природы сорбента. Профили элюдаи белков в процессе хроматографии имеют общий характер при использовании всех сорбентов (рис. 4). Уд. акт. по Тр увеличивается за один цикл в 600 раз.

При дробной десорбции были разделены белковые фракции, имеющие различную степень сродства к аффинным сорбентам. На рис. 5 представлены профили злющи, которые аналогичны для Есех исследуемых сорбентов. Биоспецифическая сорбвдонная емкость слабо зависит от значений ионной силы для каждого из сорбентов, но наиболее широк диапазон ионной силы (0,1-1,5) для ГМДА - целлюлозы, специфичность которой по отношению к Тр лосося наиболее высока. Самым эффективным в биоспецифической фракции при испытании серии растворимых лигандов, способных к взаимодействию с активным центом Тр (1 -аргинин, t-аминокапроновая кислота и др.), оказался ь-лизин, позволяющий получить электрофоретически индивидуальный Тр со степенью очистки 625 и выходом 40 %,

Для получения препарата ХТр, не содержащего Тр, применяли последовательную хроматографию на двух сорбентах: овомукоид - сефа-роза и ГВДДА-целлкдоза. При этом сначала на I сорбенте получали смесь Тр и ХТр, освобожденную от балласта, из которой затем вто-

рой избирательно сорбировал Тр, а ХТр на этом носителе не заде! живался (рис. 6). Выход фермента - 50 %, степень очистки -102.

Электрофореграммы, представленные на рис. 6, свидетельств} о том, что полученные фракции при суммарной и биоспецифической сорбции свободны от балластных белков. Гомогенность суммарной фракции объясняется тем, что Тр и ХТр, входящие' в ее состав, ш ют практически одинаковую молекулярную массу. Однако, они могуч быть разделены изоэлектрофокусированием. В градиенте рН (3-6), создаваемом амфолинами на платинках ПААГ, получены 4 компонент; суммарной фракции, их р1 составляют: '3,2; 3,4; 3,65 . ; 4,0. БeJ с р1 3,2'Д и 3,65 представлены следовыми количествами. В биосш фической фракции при тех же условиях обнаружен только один беле с р1 4,0.

Исследованы свойства Тр и ХТр сравнительно с аналогичными ферментами теплокровных (быка). Молекулярный вес Тр лосося (22,5 кДа), определенный электрофорезом в ПААГ (рис. 3), субст; ная специфичность по белковым (гемоглобин, казеин, альбумин),'; эфирными (ТАМЭ,.БАМЭ) субстратам, влияние кальциевых ионов на < бильность, взаимодействие с высокомолекулярными природными инг: биторама (оЕОмукоид, контрикал, грилсиновые из семян сои, ячме: кукурузы) сходны с "классическими", что позволяет считать выде, ный фермент типичной Тр'прогеазой. •

В то же время определены существенные различия между этими ферментами. Прежде всего, это существование Тр лососей анионной форме. Определение аминокислотного состава позволило предположить, что это сеойство протеаз рыб является следствием низкого содержания лизина (табл. 12), которое делает поверхнос ную структуру Тр подобной структуре бычьего ацетилтрипсина - ф мента с блокированием £-аминогруппами лизина (Мосолов и др. ,1

Таблица 12.

Сравнительный аминокислотный состав трипсиновых протеаз (число остатков на молекулу)

Трипсин • а м и н 0 к и с л 0 т а

■Ы" "Ь" § 3 £? « ш В' 1 и "и11 " М" Й ^ ы ш а щ 03 ©

лососей 9 4 21 14 14 26 4 18 14 9 2 5 14 15 14 5

быка 14 2 27 10 14 25 4 16 16 16 2 3 10 32 9 7

Активность,% i

Остаточная активность,%

80 ' to

40

20

2 4 б 8 10

'pH

Рис.8 Зависимость стабильности трипсина кеты (I) и трипсина быка (2) от р? после инкубации в течение 20 часог.

Это подтверждается одинак вши изменениями свойств, выраженными, однако, для лосося в значительно боль шей степени: сдвиг pHoim щелочную зону - 9,5 (рис. повышенная устойчивость в действию солей, органичес ких растворителей и детер гентов, изменение стабильности при различных значениях pH (рис.

Анионные форш ферментов - Тр лосося и бычий ацетил Тр - не обратимо инактивируются в кислой среде, но стабильны в оптимальн для катализа (pH 7,0). Катионный бычий в тех же условиях почти и ностыо теряет активность. Сохранение активности Тр лососей в noj ных условиях позволяет предположить существование дополнительных наиболее вероятно гидрофобных группировок, поддерживающих активную конформацию фермента.рНопт> эстеразной активности ХТр кеты х АТЭЭ равен 7,9, а для БТМЭ - 7,5 и практически не отличается от рНопг = 7,8 ДЛЯ ХТр быка ПО двум субстратам ( Schwert .Takenaka, 1955). Установлено"что ХТр~кеты при pH = 7,8 стабилен, но при уменьшении pH ниже 5,0 его устойчивость снижается.

Рис.7 Зависимость активности

трипсина кеты (I) и трипсина бь-ка (2) от рН

А - субстрат казеин Б - субстрат ТАМЭ

Все вышеприведенные данные по рН0Ш, и стабильности Тр и ХТр лососей были использоЕаны при выборе параметров технологического промышленного способа выделения, очистки и хранения препаратов прогеаз.

ВЫВОДЫ

1. На примере трех видов гидролаз: фосфатаз, холинэстераз, протеиназ обосновано применение метода субстратно-ингибиторного анализа для исследования свойств ферментов гидробионтов.

2. В результате изучения свойств кислой и щелочной фосфатаз, лротеолитического комплекса, трипсина и хомотршсина органов и тканей более 50 морских гидробионтов, в основном, Тихоокеанского бассейна (рыбы, беспозвоночные, млекопитающие)- показано, что

а) самая Еысокая активность кислой фосфатазы в сепии и гонадах головоногих моллюсков, а щелочной - в почках, печени и жабрах;

б) самая высокая активность холинэстеразы - в зрительных ганглиях кальмаров;

в) наибольшей протеолитической активностью обладают лососевые (пи-лорические придатки) и морские млекопитающие (поджелудочная железа).

3. Показано, что процесс термоинактивации гидролаз гидробионтов, как и наземных животных, представляет собой двухстадайный процесс, что дает на кривой термостабильности точку излома.

4. Показано, что свойства гидролаз гидробионтов и наземных теплокровных существенно отличаются:

а) рН___ = 3,5 кислой фосфтазы гонад и ганглиев кальмара ниже

Ulli *

pHQnT = 5,0 фермента печени быка, простаты человека;

б) субстратная и ингибиторная специфичности холинэстеразы зрительных ганглиев кальмара отличаются от реперных ферментов: как аце-тилхолинэстераз эритроцитов быка, человека, так и бутирилхолин-эстеразы сыворотки крови лошади;

в) по pH-,-- = 9,5 и 8,0, количественному (4 и I) и качественному

Ulli •

(анионные и катионные) составу изоформ,большей стабильности при нейтральных и щелочных pH соответственно протеазы лосооя и быка отличаются значительно.

5.Показвногчго по не зависимости субстратной и ингибигорной специфичностей от физиологического состояния особи,гидролазы гидробионтов относятся к конститутивным ферментам.

6. Установлено, что удельная активность холинэстеразы нервной ткани не зависит от пола и стадии зрелости особи в отличие от гидролаз других органов и тканей, концентрация которых изменяется е процессе развития вида. Эти данные необходимо особенно учитывать при промышленной заготовке сырья как источников гидролаз.

7. ПоК£зана:,что.-:посгсянсгва - уделънойлактлвноети ■ холинэсте разы нервной системы (в отличие от фосфатаз и протеаз других тканей) хорошо согласуется с теорией академика Е.М. Крепса примените^ но к серыновым гидролазам: те из ферментов, которые играют наиболе важную жизненную функцию, наиболее защищены от влияния внешней сре

8. Проведено уточнение таксономии кальмаров методом субстрат-но-ингибиторного анализа с помощью обратимых ФОН и показано, что совокупность особей ОргааэЪгерЬеБ Ъа:г"Ьгат1 4 раЙОНОВ ОбИТЭНИЯ (север Атлантики, северо-запад Тихого, юг Атлантики и Большой Авса ралийский залив юга Тихого) можно рассматривать как суперпопуля-щш, представляющую собой только 3 подвида (южные, североатлантические и сеЕерогихоокеанские), что согласуется с выводами, полученными на основе морфологических различий.

9. Доказано на основе сравнения величин констант обратимого торможения холинэстеразы существование 3 видовых группировок вегг; Ъеи-ЬМБ таваэЪег в трех районах (Центральные Курилы» Олюторо-Наваринский, Прибылово-Аляскинский) северо-западной части Тихого океана.

10. Установлено, что гидролазы морских гидробионтов отличаются; высокой стабильностью при хранении в замороженном (при -18°С) и лиофилизированном состоянии .

11. Показано экспериментально, что ферменты водных организмов, обитающих в более теплых водах, значительнее термостабильнее ферментов гидробионтов хладоводных районов, что согласуется с широким исследованиями В. Я. Александрова о меньшей чувствительности белков теплолюбивых особей к повышению температур.

12. Разработан технологичный режим сублимации ферментных препаратов с сохранением от 80 до 100 % первоначальной гидролазной активности.

13. Показано методом полного факторного эксперимента, что процесс инактивации гидролаз в процессе длительного до 4 лет храненш сублимированного сырья является ферментативным.

14. Найден экспериментально наилучший способ хранения лиофили-зироЕанного полуфабриката - (прессование под давлением 20 атм в жестяные консервные банки), который рекомендован во все еиды науч-

но-технической документации на сырье при его длительном хранении и транспортировке при плюсовых температурах.

15. Разработаны и защищены авторскими свидетельствами промышленные способы выделения и очистки

а) кислой фосфатазы из гонад и ганглиев и щелочной фосфатазы из почек и печени кальмаров;

б) холинэстеразы из зрительных ганглиев кальмаров, ацетилхолинэс-тераз млекопитающих;

в) протеиназ - высокоактивных комплексных препаратов из отходов -пилорических придатков лососевых, окуня--терпуга, камбалы, поджелудочной железы кита;

г) трипсина и химотрипсина (высокоочищенной смеси) из кита и лососевых;

д) трипсина - электрофоретически чистого гомогенного препарата из протеолитического комплекса лососевых и поджелудочной железы китообразных;

е) химотрипсина- электрофоретически гомогенного препарата лососевых на основе физико-химических характеристик и каталитических свойств гидролаз.

16. Показано, что полученные препараты по удельной активности

■ не уступают известным коммерческим отечественных и зарубежных фирм.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Бресткин А.П., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. О свойствах холинэстеразы из хвостатого ядра мозга тюленя/А.эволюцбиохимии и физиологии, 1971, т. УП, Л 5, С. 474-477.

2. Абрамович Т.Д., Борзунина А.М., Эпштейн Л.М. 0 каталитических свойствах ацетилхолинэстеразы из эритроцитов человеках/Биохимия. 1973, т. 38, М 6. С. 1118-1122.

3. Абрамович Т_Д., Богомолова Л.Г., Эпштейн Л.М. Ацетилхолин-эстераза эритроцитов человека/Д.Проблемы гемотологии и перелив, крови, 1975, § 7. С. 43-45.

4. Бресткин А.П., Одоева Г.А., ЩеЕцоЕа Г.А., Эпштейн Л.М. Хо-линэстераза зрительных ганглиев кальмара как видоспецифичный приз-нак//Симп."Новые мегоды исследования моллюсков", 1975,Л.,ЗИН АН СССР.

5. Бресткин А.П., Одоева Г.А., ШеЕЦОЕа Г.А., Эпштейн л.М.Холин-эстераза зрительных ганглиев кальмара как признак вида//Тез.Всес. совещ.: Биологические ресурсы морей Дальнего Востока,1975, Владивосток, ТИНРО. С. 76-77.

6. Шевцова С.П., Розеетарт Е.В., Эпштейн Л.М. Свойства холинэс-тераз ганглиев кальмаров//Тез.Всес.научн.конф.по иссл.пром.'бесп. СССР, ИнБШ Академия ..наутс_;,УССР-,- .. .,1977. С.76-77.

7. Шевцова С7П., Эпштейн Л.М. Свойства фермента холинэстеразы -зрительных ганглиев новозеландского кэльмара//Сб.Исследования по

технологии рыбных продуктов,Владивосток,ТИНРО,еып.7,1977. С.21-28.

8. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Изменение холинэстеразной активности лиофилизированных ганглиеЕ кальмара при сублимации и хранении// Сб. Исследования по технологии рыбных продуктов, 1979, Владивосток, ТИНРО, вып. 9. С. 10-17.

9. Касьяненко Ю.И., Федорец Ю.А., Эпштейн Л.М. Фосфатаза тканз зрительных ганглиев и гонад командорского кальмара//Со. Исследов; ния по технологии рыбных продуктов,1979,Владивосток.ТИНРО.С. 3-Г.

10. Силкин В.А., Гонтарева О.Ю., Колчанова H.A., Эпштейн Л.М. Изменение холинэстеразнои активности лиофилизированных ганглиев i хранении//Сб. Исследования по технологии рыбных продуктов, 1980, Владивосток, ТИНРО. С.18-26.

11. Касьяненко Ю.И., Эпштейн Л.М.,Фосфагазная активность оргаш и тканей командорского кальмара/уСб. Исследования по технологии j беспозвоночных и водорослей ДВ морей,1981,Вйадивосток,ТИНР0.С.8-.

12. ШЕненко Т.Н., Кудинов С.А., Колодзейская М.В.,Эпштейн Л.М, Панкреатические протеазы пилорических придатков ДВ лососей//Сб.И( по технол.рыб.беспозвоночных и водорослей ДВ.морей, 1981, Владив< ток. ТИНРО. С. 77-81.

13. Шевцова Г.А., Несис E.H., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. Об идентичности каталитических свойств холинэстеразы оптических ганз лиев кальмара экваториальной и периферической популяций//Тез,Второй Всес.конф.по морской биологии Биология шельфовых зон МИрОЕОГ! океана,1982,Владивосток,Инст.биолоиш моря ДВНЦ АН СССР,ч.2.С.12'

14. Пивненко Т.Н., Колодзейская Н.В., Кудинов С.А., Эпштейн Л.] Панкреатические протеазы лососевых и их выделение/Дез.1У Всес.к< Методы получения и анализа биохим.препаратов, 1982,Рига,ВНИИПБ, НИИТЭХИМ, ч. I. С. 102.

15. Акулин В.Н., Кудинов С,А., Эпштейн Л.М. Перспективы получе; биологически активных Ееществ из морских организмов/Дез. 1У Всес конф. Методы получения и анализа биохим.препаратов,1982, Рига, ШИИПБ, ШШТЭХИМ, ч. I. С. II5-II6.

16. Касьяненко Ю.И., Бресткин А.П., Розенгарт Е.В., Майзель Е.. Эпштейн Л.М. Перспективы получения кислой и шелочной фосфатазы и: органов и тканей промысловых видов калЕмара/ДезЛУ Всес.конф. Метода получения и анализа биохим.препаратов,1982, Рига, ВНИИПБ, ШШЖИМ, ч. I. С. 142-143.

17. Касьяненко Ю.И., Майзель Е.Б., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М Свойства и распределение фосфатаз в тканях и органах некоторых м ких гидробЕОнтов//Сб. Известия ТИНРО "Основы теории и практики п изводства новых видов продуктов из океанических объектов", 1983,

= Владивосток, ТИНРО, т. 108. С. 3-6.

18. Тугай В.А., Сахненко И.В., Акулин В.Н. Эпштейн Л.М. Ш> -■аминогидролазная активность и содержание адениннуклеотидов в мыш (Г*5^1 545Р*0И0ХИ1'ШЯ И мик1)0би0^' Д983,М. ,АН СССР, т.XIX, вып. 4

*19. Бресткин А.П., Касьяненко Ю.И., Майзель Е.Б., Розенгарт Е. Эпштейн Л.М. Кислая фосфатаза гонад и зрительных ганглиев командорского кальмара/Дез.З-е Всес.совещ.по промысл.бесп. и 7-е Все совещ.по изучению моллюсков "Систематика и экология головоногих моллюсков", 1983, Л., ЗИН АН СССР. С. 140.

20. Гонтарева О.Ю., Силкин В.А., Колчанова H.A., Эпштейн Л.М. Изменение холинэстеразной активности лиофилизированных зрительны ганглиев кальмара при хранении//Сб. Исследования по технологии п лагических рыб и нерыбных юбъекгов,1984,Влад-к,ТИНРО. С. 3-14.

21. Колодзейская М.В., Маленьких Л.Е., Аюшин Н.Б., Эпштейн Л.М Сравнительное изучение прогеиназ ■ -морских животных//ж.эволюц. биохимии и физиологии, 1Э84, Л., Наука, т. XX, № 5. С. 467-473.

22. Акулин В.Н., Эпштейн Л.Ы. Современные принципы безотходной технологии переработки рыб и беспозвоночных/Дез.Зсес.совещ.:Ис-следование и рациональное использование биоресурсов ДВ и северны морей, 1985, Владивосток, ШНРО. С. 186-187.

23. Пивненко Т.Н., Кудинов O.A., Колодзейская М.В..Эпштейн Л.М Протеолитические ферменты рыб/Дез. Всес. Совещ. Исследование и ра щональное использование биоресурсов ДВ морей и северных морей СССР, 1985, Владивосток, ТИНРО. С. 187-188.

24. Ad шин Н.Б., Эпштейн Л.М. .Свойства щелочных протеаз дальневосточного терпуга// Сб. Исследования по технологии гидробионтов ДВ морей, 1986, Владивосток, ТШРО. С. 21-30.

25. Бресткин A.D., Ковалев H.H.,. Розенгарт Б.В., Хованских А.Е., Федорец Ю.А., Эпштейн Л.М. Субстратно-ингибиторная специфичность холинэстеразы нервной ткани командорского кальмара// Нейрохимия,

1986, М., т. 5. % 3. С. 264-270.

26. Шевцова Г.АС, Ковалев H.H., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. Субстратная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров как показатель ценности сырья//Сб. Технология гидробионтов,

1987, Владивосток, ТШРОч С. 37-46.

27. Ковалев H.H., Розенгарт В.В., Хованских А.Е., Эпштейн Л.М. Ингибиторная специфичность, холинэстеразы зрительных ганглиев командорского и тихоокеанского кальмаров//Сб. Технология гиробион-тов, 1987, Владивосток, ТИНРО. С. 46-54.

26. Пивненко Т.Н., Колодзейская М.В., Эпштейн Л.М. Разделение панкреатических протеаз тихоокеанских лососей методом аффинной хроматографии//Тез.1 Всес. сиш.: ПреиаратиЕн&я хроматографическая Физиологически активных ве-ств на полимерн.сорбентах, 1988, Л., Йаука, ИБС АН СССР. С. 24-25.

29. Пугач A.B., Эпштейн Л.М. Содержание и термостабильность щелочной фосфатазы кальмаров//Тез. Всес.совещ."Биологически активные Жа при^комплексной утилизации гидробионтов", 1988, Владивосток,

30.'Пивненко Т.Н., Колодзейская М.В., Буданов С.А., Эпштейн Л.М. Получение и свойства трипсина из пилорических придатков тихоокеанских лососей// Прикл.биохимия и микробиология, 1Э89, М., АН СССР,

т. Ш, вып. 4. С. 490-497.

31. Касьяненко Ю.И., Пугач A.B., Эпштейн Л.М. Сравнительное исследование кислой и щелочной фосфатаз из гонад и почек кальмара// Сб. Проблемы технологии переработки нетрадиционного сырья из объектов ДВ промысла, 1989, Владивосток, ТИНРО. С. 4-16.

32. Пивненко Т.Н., Аюшин Н.Б., 1данюк В.М., Эпштейн Л.М. Очистка протеолитических ферментов из рыбного сырья методом ступенчатой ульграфильтрацки//Гез. 6-ой Всес.конф. Методы получения, анализа и применения ферментов, 1990, Рига, НПО "Билар". С» 24.

33.' Султанов 3.3., Эпштейн Л.М. Использование протеолитических ферментов из рыбного сырья для производства питательных сред//Тез. 6-ой Всес.конф. Методы получения, анализа и применения ферментов, 1990, Рига, НПО "Биолар". С. 169.

34. ПиЕненко Т.Н., Аюшин Н.Б., Марковцев В.Г., Эпштейн Л.М. Возможность использования рыбных протеаз в лососеводстве//Тез.Всес. конф.:Научно-технические проблемы марикультуры,1990, Владивосток, ТИНРО. С. 19—20.

35. Эпштейн Л.М. Биологически активные вещества гидробионтов при действии ионизирующего излучения//Тез.Всес.совещ,:БАЕГгидробионтов-новые лекарственные, лечебно-профилакт.и технич.препараты, 1991, Владивосток, ТШРО. С. 3-4.

36. Султанов 3.3., Степанова Э.Д., Меджидов М.М., Пивненко Т.Н., Дцанюк В.М., Эпштейн Л.М. Отходы переработки гидробионтов в производстве сухих питательных сред//Тез.Всес.совещ.:БАВ гидробионтов-новые лек..лечебно-профил.и технич. препараты, 1991,Ваадив-к,ТИНРО. С. 13-14.

37. Мишунин И.Ф., Галич И.П., Пивненко Т.Н., Акулин В.Н., Эпштейн Л-.М. Кормовая-добавка из-отходов морепродуктов//1ез,Всес.совещ.-: БАВ гидробионтоЕ - новые лек.,лечебно-профилакт.и технические препараты, 1991, Владивосток, ТИНРО. С.17-18.

. 38„ Григоренко А.Г., Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Протеолитичесю комплекс гшцюбионтов: опыт применения в местном лечении инфицированных ран//Тез.Бсес.совет.:БдВ гидробионтов - новые лек.,лечебно-профилшсТоИ технич. препараты, 1991, Владивосток, ТИНРО. С. 14-15,

39. Ковалев H.H., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. Холинэстеразы Kaj маров: получвние и применение/Дез.Всес.конф.:Рациональное исполь; вание биоресурсов Тихого океана,1991,Владивосток,ТИНРО. С.50-51.

по авторским свидетельствам "

40. БресткШ' А<,П„, Яеьзнер Д.Л., Афанасьев-Озеров В.Г., Чуковский Ю.Г., Шкоимова Г.И., Эпштейн Л.М. Способ Еыделения АХЭ (ацетилхо-линэстеравы) из ткани мозга//А.с.267815.Оп. 02.04.1970,бюл..К? 13.

il, Абрамович Т.Д., Бресткин А.П., Борзунина A.M., дембо М.'А., 2<гко:нскии Ю.Г.» Кузнецова Л.П., Райхер И.И., Старкова Г.А., Тата-сова Н.Ио„ Эшптейн Л.М. Способ получения ацегилхолинэстеразы// A.c. 507582, опубл. 25.03.1976, бюл. £ II.

42. Володзейсная М.В., Кудинов С.А., Акулин В.Н., Эпштейн Л.М. Способ получения комплекса прогеолитических ферментов//А.с.898643,

43. Кудинов С.А., Колодзейская М.В., АкулинВ.Н., Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Способ получения комплекса прогеолитических ферменто: A.c. 933097, опубл. 07.06.1982, бюл. Jè 23.

44. Акулин В.Н., Колодзейская М.В., Кудинов С.А., Лосева А.Л., Эпштейн Л.М, Способ выделения комплекса прогеолитических ферменто: из по,джелудочной железы китов//А.с.981360,опубл. 15.12.1982,бюл.М'

45. Шзвцова C.II., Касьяненко D.H., Иевлев Г.А., Рэзенгарг Е.В., Майзель Е.Б., Бресткин А.П., Эпштейн Л.М. Способ определения видо вой принадлежности водных организмоЕ//А.с.1001898,опубл.07.03.198; бюл. В 9.

46.Колодзейская М.В., Кудинов С.А., -Акулин В.Н., Эпштейн Л.М. Способ выделения комплекса прогеолитических ферментов из морепродукт ов//А. с. 1030409,опубл. 23.07.1983, бюл. 27.

47. Певцова С.П., Касьяненко Ю.И., Шевцов Г.А., Майзель Е.Б., Розенгарт Е.В.. Бресткин А.Н., Эпштейн Л.М. Способ определения таксономической принадлежности кальмароЕ//А.с.II42079,опубл. 28.02.1985, бюл. S 8.

48. Берзиня-Берзитте Р.В., Кирсис В.Х., Акулин В.Н., Клодзейска М.В., Пивненко Т.Н., Кудинов С.А,, Неймане1 М.А., Диденко А.П., Эпштейн Л.М. ;Способ получения протеолитического кошлекса//А.с.11

49. Пивненко Т.Н., Колодзейская М.В., Кудинов С.А., Мелешевич А Маленьких Л.Б., Федорова И.П., Акулин В.Н., Эпштейн Л.М. Способ очистки трипсина//А.с. I20S229, опубл. 07.02.1986, бюл. № 5.

50. Кудинов O.A., Маленьких Л.Б., Колодзейская М.В.,- Коноплиг Л Аюшин Н.Б., Акулин В.Н., Арен А.К., Берзиня-Берзитте Р.В.. Шпрунк И.К., Эпштейн л.М. Способ выделения химотрипсина// A.c. I2I37B2.

51.- Кудинов С.А., Колодзейская М.В., ПиЕненко Т.Н.,,Мелешевич А Федорова И.Ц., Акулин В.Н., Морозова Н.Д.. Эшптейн Л.М. Способ оч ки трипсина//А.с. 1273392,опубл. 30.11.1986, бюл. № 44.

52. КУдинов С.А., Колодзейская М.В., Веревка C.B., Носкова Н.Ю. Акулин В.Н., Эпштейн Л.М. Способ очистки тщпсина/Д.с. 1370840.

53. Берзиня-Берзитте Р.В., Кирсис В.Х., Вина И.А., Колодзейская М.В., Пивненко Т.Н., Кудинов С.А., Акулин В.Н., Неймане М.А., Диденко А.П., Эпштейн Л.М. Способ получения комплекса протеолитичес ких ферментов//А.с. 1378384.

54. Колодзейская М.В., Кудинов С.А., Веревка C.B., Носкова Н.Ю. Акулнн.В.Н., Эпштейн Л.М.'-&0»об очистки протеолитиче скогод-яомп-лекеа// A.c. I38I986.

55. Колодзейская M.B., Кудинов С.А., НижинкоЕская Т.Н., НоскоЕа Н.Ю., Акулин В.Н., Алексеенко И.О., Эпштейн Л.М. Спосб получения протеолитического кошлекса, содержащего трипсин и химотрипсин из пилорических придатков лососевых// А.с.1445191.

56. Когалев H.H., Федорец Ю.А., Шевцова Г.А., Бресткин А.П., Розенгарт Е.В., Хоеэнских А.Е., Эпштейн Л.М. Способ определения популяционной принадлежности командорских кальмаров// A.c. 1535503, опубл. 15.01.1990, бш. й 2.

57. Ашин Н.Б., Колодзейская М.В., Кудинов O.A., Маленьких Л.Б., Акулин В.Н., Арен В.Н., Берзиня-Берзитте Р.В., Шпрунка И.К., Эпштейн Л.М. Способ очистки протеолитического кошлекса// A.c. I2I9645, опубл. 23.03.1986, бюл. Js II.

58. Рахимов М.М., Хасанов Х.Т., Якубов И.Т., Латышев H.A., Акулин В.Н., Касьянов С.П., Эпштейн JI.M. Способ получения сорбента для иммобилизации липолитических ферментов//А.с.I5I0859.

59. Мишунин И.О., Галич И.П., Бакай С.М., Чирков А.Г., Химич В.В., Колодий Т.Н., Довгань- И.Я., Добрянскиы И.З., Акулин В.Н., Эпштейн Л.М. Кормовая добаЕка из отходов морепродуктов (на основе ферментов гидролаз)// Положительное решение Госкомитета от 23.04.1991.

60. Таран Л.Д., Кудинов С.А., Шевченко А.Р., Эпштейн Л.М. Способ очистки трипсина// A.c. 1742329, опубл. в бюл. й 23, 1992.

Отпечатано в ТИНРО, тираж 100 экз.,

Подписано к печати 28.04.92.

Владиросток, Западная,10.