Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Холинэстеразы - биохимические механизмы адаптации гидробионтов

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Холинэстеразы - биохимические механизмы адаптации гидробионтов"



На правах рукописи

КОВАЛЕВ Николай Николаевич

ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ - БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ ГИДРОБИОНТОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток - 2003

Работа выполнена в лаборатории прикладной биохимии Федерального государственного унитарного предприятия «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» Госкомрыболовства РФ,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Костецкий Эдуард Яковлевич, доктор биологических наук, ст. науч. сотр. Лукьянова Ольга Николаевна, доктор биологических наук, ст. науч. сотр. Хогимченко Светлана Валентиновна

Ведущая организация - Тихоокеанский океанологический институт ДВО РАН.

Защита диссертации состоится " 27 " января 2004 г. в 10 часов на заседав и диссертационного совета Д 212.056.02 при Далььевосточгом гоеудаглт; г". )М университете МО РФ по адресу: 690600, Владивоег ■•*, . ' Лордовлсч-. м.

139.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дальнево>~ осу-

дзфственного университета МО РФ,

А втореферат разослан «_» декабря 200 •

"У ченый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.В. Поддубный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Адаптация - одно из наиболее общих и широко применяемых биологических понятий. Формы адаптации, как биологического явления, многообразны, как и многообразны подходы к ее изучению. Как правило, проблема адаптации решается методами классической биологии. Между тем любые изменения физиологии и морфологии организмов имеют биохимическую основу, а биохимические адаптации не менее разнообразны, чем внешние адаптивные признаки.

Известны работы по проблемам стратегии биохимической адаптации (Хочачка, Самеро, 1978, 1988), посвященные оценке влияния отдельных факторов среды в постановочных опытах {температура, pH, осмотическое давление и т.д.) на конкретные ферменты обмена и дыхания.

Другим направлением в современных экологических исследованиях являются работы, посвященные оценке влияния ухудшающихся условий существования на функционирование живых систем. Использование при этом биохимических маркеров (глутатион, металлотеонеины, каратиноиды, ферменты углеводного обмена и т.д.) позволяет оценить степень клеточного повреждения под влиянием неблагоприятных факторов среды (Лукьянова, 2001),

Современный уровень развития естествознания убедительно доказывает, что в основе всех приспособительных изменений биологических систем лежат молекулярные процессы (Davies, Kratzer, 1996), В первую очередь на флюктуации параметров внешней среды реагируют ферменты. Особое место среди ферментов занимают холинэстеразы (ХЭ), по важности выполняемых ими функций относящиеся к конспгтутивным ферментам, свойства которых не зависят от физиологического состояния особи (Ленинджер, 1976; Эпштейн, 1992). В связи с ключевой ролью холинэстераз в процессе передачи нервного импульса модуляция активности фермента под действием различных соединений издавна является предметом исследования фармакологов, токсикологов, биохимиков. Однако работы, посвященные холинэстеразам гидробионтов, касаются в основном свойств ферментов некоторых видов головоногих моллюсков и ограниченного количества рыб (Бресткин и др., 1997). В последние годы активно развивается направление использования холигостерзз при оценке степени загрязнения сре-

ды обитания гндробионтов пестицидами (Caraville, 2000), фосфорорганически-ми соединениями (Payenе et al„ 1996) и солями тяжелых металлов (Somero, 1997). В то же время до настоящего исследования проблема определения механизмов биохимической адаптации холннэстераз гидробионтов не изучалась.

В связи с указанным комплексное исследование холинэегераз гидробионтов (субстратной специфичности, субстратно-ингибиторных свойств и хрома-тографических характеристик) различных таксономических рангов (млекопитающих, рыб, беспозвоночных) является чрезвычайно актуальным. Установление закономерностей свойств ХЭ от таксономического положения и среды обитания животного представляет интерес для сравнительной биохимии и биохимической экологии, и позволяет определить механизмы биохимической адаптации холинэргических систем гидробионтов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы гяв и лось комплексное изучение свойств ХЭ гидробионтов, включая, во-первых, установление закономерностей распределения ХЭ в нервной ткани и гемолимфе различных таксономических групп гндробионтов; во-вторых, определение основных каталитических характеристик, субстратно-ингибиторных свойств и хроматографических характеристик ХЭ; в-третьих, обоснование применения метода субстрат-но-ингибиторного анализа для выяснения механизмов биохимической адаптации у гидробионтов; в-четвертых, обоснование использования констант холи-юстеразного катализа в целях биохимического мониторинга степени загрязне-няя акваторий; н, в-пятых, определение механизмов биохимической адаптации холинэргических систем у гидробионтов к различным факторам среды обитания. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- исследование субстратных характеристик ХЭ различных гидробионтов, включая удельную активность и основные кинетические параметры гидролиза различных субстратов;

- исследование ингибиторных свойств ХЭ гидробионтов, в том числе чувствительности ферментов к действию необратимых фосфорорганических ингибиторов и ингибиторов обратимого типа действия различной структуры;

- определение закономерности изменения каталитических свойств ферментов от условий существования видов;

- определение механизмов биохимической адаптации гндробионтов к условиям обитания видов;

- установление закономерностей и механизмов адаптации ХЭ морских животных различных таксонов к разным факторам среды.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование свойств ХЭ различных органов и тканей 45 видов морских организмов.

Показано, что кинетические параметры холннэсгеразного гидролиза являются индивидуальными характеристиками вида. Установлена гомогенность ферментативного состава различных органов и тканей гидробионтов. Обнаружена, теоретически обоснована и изучена зависимость свойств ХЭ от условий обитания различных видов морских организмов. Впервые показано, что ХЭ морских организмов характеризуются различной чувствительностью к действию фосфорорганических необратимых ингибиторов и ониевых обратимых ингибиторов различной структуры. Обосновано применение метода субстратно-ингибигорного анализа в определении механизмов биохимических адаптации ХЭ морских организмов. Показана возможность использования ХЭ как молекулярных маркеров при оценке степени загрязнения морских акваторий. Апробирован метод субстратно-ингибитор но го анализа с целью оценки конформаци-онных изменений ХЭ. Определены механизмы биохимической адаптации ХЭ у гидробионтов различных таксонов. Впервые выдвинута и подтверждена гипотеза о зависимости механизмов биохимической адаптации от таксономического ранга животного.

Практическая значимость работы. Впервые проведен скрининг ХЭ 45 видов гндробионтов для выявления высокоактивных источников фермента. Разработан и апробирован метод субстратно-иигибиторного анализа свойств ХЭ как инструмент определения механизма биохимической адаптации. На основании результатов изучения субстратно-ингибиторных свойств ХЭ гидробионтов разработан лабораторный метод выделения фермента как биохимического реактива для оценки степени загрязнения окружающей среды фосфорорганическими соединениями. Создана база данных по свойствам фермента гндробионтов из экологически благополучных районов, которая будет использована при мониторинге влияния загрязнений на морскую бноту. Полученные в работе данные используются в курсе лекций по микробиологии и токсикологии ДВГУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Кинетические параметры холинэстеразного гидролиза являются ввдоспе-цифическнмн характеристиками и могут быть использованы при оценке механизмов биохимической адаптации гидробионтов;

2. Свойства ХЭ и механизмы биохимической адаптации гидробионтов зависят от таксономического ранга животного;

3. Биохимическая адаптация у гидробионтов к давлению, температуре, нырянию и токсическим факторам среды реализуется через качественные и количественные механизмы;

4. Метод су бстрэтно-ингиб нторного анализа может быть использован в определении конформационного механизма стратегии биохимической адаптации.

Публикации. Основное содержание работы изложено в 39 публикациях, из которых 1 представляет собой авторское свидетельство на изобретение. Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзном совещании «Исследование и рациональное использование биоресурсов дальневосточных и северных морей СССР и перспективы создании технических средств для освоения неиспользуемых биоресурсов открытого океана» (Владивосток, 1985 г.), Девятом Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986 г.), конференции молодых ученых "Оценка и освоение биологических ресурсов океана" (Владивосток, 1988 г.), Международной конференции «Технология переработки гидробионтов» (Москва, 1994 г.), Twelfth International Malakotogical Congress (Vigo, Spain, 1995), юбилейной конференции «Рыбохо-зяйственные исследования океана» (Владивосток, 1996 г.), 3-й научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Новосибирск, 1999 г.); Международной конференции «Рациональное природопользование и управление морскими биоресурсами: экосистемный подход» (Владивосток, 2003 г.); коллоквиуме кафедры общей экологии Дальневосточного государственного университета (2003 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описания материалов и методов исследования, результаты работы и их обсуждение, изложенные в 8 главах, заключение и выводы. Список цитируемой литературы включает 332 наименования. Работа изло-

жена на 280 страницах текста, иллюстрированного 37 таблицами и 43 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор биологического материала. Для выделения и исследования ферментов использовали нервную ткань морских млекопитающих, рыб и беспозвоночных. Нервную ткань млекопитающих заготавливали на месте вылова и замораживали. Рыб и головоногих моллюсков в замороженном виде доставляли в ТИНРО-Центр, где после проведения биологического анализа извлекали головной мозг. Крабы и двустворчатые моллюски доставлялись в живом виде в лабораторию, где производился забор гемолимфы, брюшных ганглиев и сердец. Сырье хранили при температуре не менее минус 18 °С,

В качестве ацетилхолинэстеразы (АХЭ) эритроцитов человека и бутирил-холинэстеразы (БуХЭ) сыворотки крови лошади использовали очищенные препараты с удельной активностью 1,2 и 9,6 ед. (Пермский НИИ вакцин и сывороток).

Видовой состав объектов, взятых для изучения, включает представителей следующих основных групп гидробнонтов: моллюсков (двустворчатых, головоногих), ракообразных, рыб (хрящевых и костистых), млекопитающих (табл. 1).

Определение ферментативной активности проводили методом Эллмана (ЕПтап й а1., 1961) с использованием в качестве субстратов иодидов ацетил-(АТХ), пропионил- (ПТХ) и бутирилтиохолина (БТХ) производства 1СИ (США). Исследование субстратной специфичности осуществляли в широком интервале их концентраций - 0,2-0,00005 М. Величина удельной активности оценивалась по изменению концентрации гидролизованного субстрата (мкМ) за единицу времени на мг сырой ткани или на I мл гемолимфы. Кинетические параметры гидролиза субстратов Ут и Кт рассчитывали согласно методу Лайнуае-ра-Берк в координатах двойных обратных величин 1/У и 1/Э (Диксон, Уэбб, 1982).

О величине антихолннэстеразного действии фосфорорганических ингибиторов (ФОИ) судили по величине бимолекулярной константы кц реакции взаимодействия фермента с ингибитором (Яковлев, 1965). Гомогенность холи-нэстеразной активности определяли методом субстратно-ингабиторного аналн-

1а, основанном на исследовании скорости взаимодействия различных по структуре субстратов с ХЭ в присутствии различных по структуре и специфичности действия ФОН (Садыков и др., 1976).

Таблица 1

Перечень видов, использованных для оценки механизмов адаптации _к условиям существования ___

БЕСПОЗВОНОЧНЫЕ ПОЗВОНОЧНЫЕ

Двустворчатые моллюски: Хрящевые рыбы:

1. Мидия Грея 17. Сельдевая акула Lamnidae di trepsis

Crenomytilus grayanus 18. Скат Bathyiaja parmifera

2. Анадара Броутона 19. Скат Bathytaja aleutica

Anadara broughtoni Костистые рыбы:

3. Модиолусдлиннощетннистый 20. Калуга Huso dauricus

Modiolus difíicilis 21, Кижуч Oncorhynchus kisutch

Головоногие моллюски: 22. Нерка Oncorhynchus nerka

4. Кальмар Бартрама 23. Кета Oncorhynchus keta

Ommastrephes bartrami 24. Чавыча Oncorhynchus tschawytscha ;

5. Тихоокеанский кальмар 25. Горбуша Oncorhynchus gorbuscha

Todarodes pacificus 26. Семга Salmo solar

6. Командорский кальмар 27. Мальма Salvinus malma

Berryteuthis magister 28. Сельдь тихоокеанская Clupea pallasi

7. Кальмар-светлячок 29, Минтай Theragra chalcogramma

Watasenia scmtiilans 30, Треска Gadus macrocephalus

8. Кальмар Berryteuthis anonychus 31. Камбала желтоперая Limanda espera

9. Кальмар Gonatus feamtschaticus 32. Камбала сахалинская

10. Кальмар Gonatus tinro Limanda sakhalinensis

11. Кальмар Gonatopsis boreal is 33, Камбала дгшннорылая

12. Кальмар Gonatopsis okulanii Limanda punctatissima punctatissima

13. Осьминог Octopus dofleini 34. Камбала темная

Ракообразные; Pseudopleuronectes obscurus

14. Краб камчатский 35. Камбала Шреика

Paral iihodes camtschaticus Pseudopleuronectes Schrenki

15. Краб-стрижи онилио 36. Камбала двух линейная

Chioivoecetes op ¡lio Lepidopsetta polyxystra

16. Мохнаторукий краб 37. Камбала хоботная

Eriocheir japónica Myzopsetta proboscidea

38, Камбала палтусовкдная

Hippoglossoides dubius

39, Палтус черный

Reinhardtius hippoglosoides

40. Макрурус малоглазыи

Albatrossia pectoral is

41, Макрурус пепельный

Coryphaenoides cinereus

42, Карп Cyprinus carpió

43. Сазан Cyprinus carpió

Млекопитающие:

44. Бел)т£а Dclphinapterus leucas

45. Нерпа Pusa hispida

Об эффективности обратимых ингибиторов судили по величине обобщенной ингнбиторной константы и ее конкурентной (К)} и бесконкурентной (К'¡) составляющих (Бресткин и др., 1997). Величины ингибиторных констант (средние величины из 5-6 определений) вычисляли графически и выражали в виде = и т.д. По соотношению величин рК1 и рКЧ определяли тип торможения: конкурентный (рКЧ 0), смешанный (рК > рКЧ), неконкурентный (рК = рК']), бесконкурентный рКЧ ->■ 0>. В качестве обратимых ингибиторов изучено 57 соединений различной структуры: Ы+(И)4; ЯЗ+(СН3)Я; СН3С(0)М(К)С2Н<Ы<Р>)(СН3>1;

(СНзЬ51С3Н6Х+(СНз)з;

(СНзЬ51С2Н451(СНз)гСН3Х+(СН3)з; СН3С(0)0С2Н48+(СН3),К;

К(С6Н5)гР+(С2Н4)пР+(С6Н5№; (СН3)зЫ+СН151(СНз)2(СН2)1,31(СН3)дСНгЫ+(СН3)3;

0+/—ч+

ц N N 1>

(г V- сн,он

к —к—( I/—V // V

> У *

)—сн20с{0>-(снг|п-с(0)0си2-( Л

/—

^-' *-' ; 5е+(СНз)г; Те+(СНз):;

Х-СНг-ЗКОСН2СНг)3М; (СН3)25е+СН281(ОСгН5)зМ; [(СН3)2СНО]2Р(5)ЗСН2;

{СНз)зН+СНг[51(СНз)20]1п51(СН5)2СН2Н+(СНз)1;

(СНз)зН+[СН2]к51(СН3)ЛСН2]П181(СН})1[СНг]рЫ+(СН3)3.

Для обеспечения достоверности данных проводили статистическую обработку, определяя среднюю квадратичную ошибку с учетом доверительного интервала Д = ±10 % и надежности Р = 0,85-0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Адаптации к нырянию

Особый интерес у исследователей вызывает адаптация организмов, обитающих на границе двух сред обитания - воздух—вода. Метаболитические адаптации к нырянию заключаются в снижении интенсивности метаболизма, что способствует продлению времени пребывания под водой и сопровождается снижением потребности в кислороде; использовании более эффективных путей брожения. Физиологическая реакция «на ныряние» одинакова у всех морских

9

млекопитающих. Исследование кровотока отдельных тканей показало, что при нырянии и последующем выходе на поверхность не изменяется кровоснабжение только ЦНС, при этом существенно не изменяется потребность мозга в глюкозе.

В связи с этим интересно сравнение свойств ХЭ нервной ткани морских млекопитающих при кратковременном (на примере нерпы) и длительном нырянии (на примере белухи). ХЭ мозга белухи характеризуется в 8-26 раз большей величиной удельной активности и скорости гидролиза субстратов (табл. 2), При этом оба фермента характеризуются качественно сходной субстратной специфичностью и значениями оптимальных концентраций субстратов. Исключение составляет pS для АТХ у нерпы, который сдвинут в сторону меньших оптимальных показателей концентраций субстрата. Отмечается также существенное различие у двух ХЭ по величине сродства субстратов к ферменту (Vm/Km). АТХ наибольшим сродством обладает к ХЭ нерпы (различия в 7 раз) за счет низкого значения величины Km (в 235 раз). По ПТХ и БТХ наибольшая величина сродства характерна для ХЭ мозга белухи. По-видимому, кратковременное пребывание млекопитающих в воде (нерпа) приводит к выработке механизма поддержания функционально достаточной скорости гидролиза одного из субстратов за счет повышения его сродства к ферменту. В то время как при длительном нырянии высокая скорость холинэргнческих реакции обеспечивается увеличением сродства к другим субстратам за счет уменьшения величины Km.

Таблица 2

Кинетические параметры гидролиза субаратов под действием ХЭ мозга нерпы и белухи

Субстрат Параметры

pS,M Vm, мМ/мин Voth, % Km (10"*), М Vm/Km мин*1 Удельная активность, мкМ/мик/мг

Нерпа

АТХ 3,4 0,13 100 0,2 6,5 0,03

ПТХ 2,9 0,05 39 6,3 0,08 0,017

БТХ 2,9 0,03 23 26,0 0,01 0,012

Белуха

АТХ 2,9 4,2 100 47,0 0,9 0.8

ПТХ 2,9 1,59 38 2,6 6,1 0,4

БТХ 2,9 1,36 32 0,4 34,0 0,1

Примечание: pS =-lg[S].

Механизмы адаптации к физической нагрузке

ХЭ нервной ткани лососевых видов рыб. Объединяющим фактором существования всех мигрирующих рыб является адаптация к физическим нагруз-

кам — миграциям. Известно, что энергозатраты при локомоции, как правило, зависят от размеров тела, способа и быстроты передвижения.

Для выполнения очень быстрых, но кратковременных двигательных актов требуется большее усилие, чем для более медленных. Существует три основных способа биохимической адаптации к физическим нагрузкам: специализация мышц; преимущественное развитие в одних мышцах анаэробного метаболизма, а в других — аэробного; развитие тонких механизмов метаболитической адаптации (кратковременные, промежуточные и долговременные изменения).

Ранее ХЭ рыб были исследованы в электрическом органе угря, ската и гомогенате мозга миноги и боковой линии костистых пресноводных рыб (Титова, Аронова, 1964). Изученные ХЭ электрических органов рыб считаются типичными АХЭ. Для них характерны соотношения скоростей пиролиза АХ>ПХ>БХ и субстратное ингибирование. Высказывалось предположение, что такое соотношение скоростей гидролиза субстратов присуще всем хордовым. Скорость гидролиза ПХ/ПТХ составляет 20-50 % от таковой по AX/ATX, а скорость гидролиза БХ/БТХ — 9 % и менее. По мере изменения структуры субстратов снижается их сродство к активному центру фермента (Козловская и др., 1990; Моралев, Розенгарт, 2001).

К наиболее массовым видам тихоокеанских рыб, совершающих значительные миграции, относятся рыбы семейства лососевых.

Первое, что показывают данные по субстратной специфичности ХЭ лососевых (табл. 3), - это тот факт, что ферменты обладают слабо выраженной субстратной специфичностью: скорость гидролиза практически не зависит от структуры субстратов. Исключение составляет ХЭ мальмы, которая не гидро-лизует БТХ, и ХЭ чавычи, которая не гидролизует два субстрата - ПТХ и БТХ.

Межвидовые различия наблюдаются и по другим параметрам ферментативного гидролиза. Так, наибольшим значением величины Km по АТХ и БТХ характеризуется ХЭ мозга кижуча, а по ПТХ - семги, а среди рода Oricorhyn-chus - горбуша.

Необходимо также отметить, что вариабельность значений величины сродства существенно колеблется в зависимости от вида и субстрата. Так, максимальное значение величины сродства субстрата БТХ отмечалось для ХЭ мозга нерки (48,0), а наименьшее — для ХЭ кеты (0,7). При этом эти две ХЭ не

р;1злнчались по величине удельной активности по БТХ (табл. 3). Из данных табл. 3 видно, что сохранение постоянства величины активности происходит за счет изменения величины Кш.

Таблица 3

Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием ХЭ мозга рыб семейства

лососевых

Субстрат Параметры

pS,M Vm, м кМ/ми н VOTH, % Кш, М Ут/Кт, мин-1 Активность мкМ/мин/мг ткани

Горбуша Oncortiynchus govbuscha

ATX 2,3 0,28 ¡СЮ 1,010м 2,8 одэ

ПТХ 1,9 0,33 118 5,810"* 0,6 0,27

БТХ 1,6 0,21 79 2,0 10" ¡,1 0.20

Кета Oncortiynchus keta

ATX 3,2 0,11 100 1,8 Ю-1 0,6 0,27

ПТХ 3,4 0,13 118 0,510"** 2,6 0,23

БТХ 3,3 0,14 127 1,910" 0,7 0.27

Нерка Oncorhynchus легка

АТХ 2,4 0,24 100 4,71o"1 0,5 0,15

ПТХ 2,2 0,22 92 1,910" 1,2 0,19

БТХ 3,3 0,24 100 0,0510" 48,0 0.24

Кижуч Oncorhynchus kisutch

АТХ 2,2 1,24 100 12,310" 1,0 1,04

ПТХ 1,6 0,95 77 3,910" 2,4 0,91

БТХ 1,6 1,08 87 13,510" 0,8 1,04

Чавыча Oncorhynchus tschawytscha

АТХ 2,9 | 0,17 ( - | 3,1 10" I 0,6 I 0,01

ПТХ Нет пиролиза при [Б} — (ИГ4- 10° М)

БТХ Нет пиролиза при — (10"^- НГ^М)

Семга Salmo salar

АТХ 2,6 0,048 100 0,1910" 2,5 0,05

ПТХ 1,9 0,057 119 14,8 10" 0,04 0,04

БТХ 3,2 0,044 92 0,00410" 110,0 0,04

Мальма Salvitius malma

АТХ 3,4 0,22 100 0,4710"4 4,7 0,011

ПТХ 2,6 0,03 14 12,910" 0,022 0,002

Е.ТХ Нет гидролиза при [SI — (10~J- 10_i М)

Различия в значениях величины Кш на примере рода ОпсогЬупсЬиз по АТХ (в 5,6 раза - нерка/горбуша) и ПТХ (4,0 раза - кета/горбуша) не столь значительны, но и, как в случае ХЭ нерки, модуляция уровня удельной активности происходит за счет изменения величины Кш.

Не подтверждается и теория, характеризующая зависимость активности ферментов обмена от массы особи. Наиболее крупные рыбы (семга, чавыча) ха-

р{1ктеризуются невысокой активностью фермента.

12

Выявленные особенности скорости гидролиза субстратов позволили выдвинуть предположение о существовании нескольких форм фермента в нервной ткани мозга рыб семейства лососевых. С целью проверки гомогенности ХЭ-акгивности в мозге лососевых видов рыб была исследована антихолинэстеразная эффективность трех различных по структуре ФОН: 1) ДФФ- как специфический ингибитор БуХЭ, 2) Гд-42 - как специфический ингибитор АХЭ к 3) ЛГ-56 - ранее определенный как специфический ингибитор ХЭ тихоокеанского кальмара.

В целом следует отметить, что ДФФ оказался слабым ингибитором ХЭ мозга рыб семейства лососевых. Наибольшей чувствительностью к нему облазала ХЭ мозга семга(1,2'105), которая уступала БуХЭ в 125 раз. Специфический ингибитор АХЭ - Гд-42 — оказался высокоэффективным ингибитором ХЭ мозга большинства исследованных видов лососевых рыб. Так, его эффективность по отношению к ХЭ мозга кижуча на порядок выше, чем по отношению к АХЭ. Наименьшей чувствительностью к Гд-42 характеризуется ХЭ мозга горбуши.

ЛГ-56 является высокоспецифическим ингибитором ХЭ оптических ганглиев тихоокеанского кальмара, у которого различия в величине кц по сравнению с АХЭ и БуХЭ составляли соответственно 1500 и 550 раз. Неожиданным фактом явилась низкая чувствительность ХЭ мозга лососевых рыб к действию этого ФОН. Величины кц для ХЭ лососевых были практически на 4 порядка ниже, чем для ХЭ тихоокеанского кальмара. Отмечается и 2-кратное различие чувствительности к этому ФОН у ХЭ горбуши и кеты.

Приведенные в табл. 4 данные показывают, что величины км для горбуши и кеты существенно зависят от структуры субстрата. Это свидетельствует о присутствии в нервной ткани этих рыб двух ХЭ. В то же время величины кц, полученные для кижуча, не зависят от природы субстрата, что свидетельствует о гомогенности ХЭ-активности в нервной ткани этого вида рыб.

Данные по субстратной специфичности ХЭ мозга рыб рода Oncorhynchus свидетельствуют, что значение величины удельной активности в большей степени определяется величиной скорости протекания реакции гидролиза субстрата, а не значением сродства (исключение-ХЭ мозга нерки) (рис. 1).

Поскольку скорость гидролиза в большей степени определяется концентрацией субстрата, можно высказать предположение, что высокая подвижность

13

лососевых видов рыб обеспечивается за счет выработки формы фермента, обладающей относительной субстратной специфичностью, или нескольких форм ферментов. Таким образом, механизм адаптации ХЭ лососевых рыб к значительным миграциям реализуется через количественную стратегию.

Таблица 4

Антихолинэсгеразная эффективность ФОИ по отношению к ХЭ мозга рыб _семейства лососевых (кц, М"1 мин"')_;__

Вид Ингибитор Субстрат

АТХ ПТХ БТХ

Горбуша ДФФ 5,3 10^ зло' 3,910'1

ЛГ-56 2,0101 - -

Гд-42 8,3 Ю1 - _

Кета ДФФ 1,410' 3,3 10* 5,7 ТО1

ЛГ-56 5,4-10' 2,6101 -

Гд-42 7,5 ТО" - -

Кижуч ДФФ 4,610' 6,710* 5,910'

ЛГ-56 3,8 10' 4,910' -

Гд-42 и 10" - -

Семга ДФФ 1,2-10* - -

Мальма Гд-42 8,3-10* - -

АХЭ ДФФ 9,5 101 - _

ЛГ-56 1,610' - —

Гд-42 1,310" -

БуХЭ ДФФ 1,5-10' - -

Гд-42 3.710" - -

ЛГ-56 4,7103 - -

Тихоокеанский кальмар ЛГ-56 2,6 106

Примечание:' ДФФ - ((СНг)2СНО)гР(6)Р, Гд-42 - СгН^С^ЖО^СЛЗ^СН^СЛ; ЛГ-56 - Н50(СНз) Р(0)5С2Н1С(СН3)з,

Ж

I

Рис, I. Зависимость активности ХЭ мозга лососевых видов рыб от кинетических параметров гидролиза субстратов

ХЭ нервной ткани тресковых видов, рыб. Основные контуры географического распределения минтая известны давно (Андрияшев, 1954; Ade, 1967). В ареал полностью входят Берингово, Охотское и Японское моря. Условия обитания минтая в дальневосточных морях значительно различаются, что вполне объяснимо, поскольку его обширный ареал перекрывает несколько географических типов структур водных масс и циркуляции. Высокая степень морфологического полиморфизма минтая в каждом районе обитания носит в некоторой степени адаптационный характер, т.е. различные морфологические типы обладают свойством преимущественного выживания в меняющемся экологическом окружении (Шунтов, 1993).

Изученные ХЭ мозга минтая из четырех районов обитания (табл. 5) катализировали гидролиз всех трех изученных субстратов. Удельная активность фермента невысока и сопоставима с таковой (по АТХ) в оптических ганглиях командорского кальмара.

Таблица 5

Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием ХЭ мозга минтая

Субстрат Параметры

PS, М Vm, мМ/мин Vom, % Rm.M Vm/ Km, мин"1 Активность, мкМ/минУмг ткани

Охотское море

АТХ 3,2 0,043 100 8,610"* 0,5 0,036

ПТХ 3,3 0,027 63 2,710 1,0 0,022

БТХ 3,7 0,018 42 10,910"4 0,2 0,013

Камчатка

АТХ 3,2 0,012 100 0,71 10"^ 0.2 0,01

ПТХ 2,9 0,016 133 0,28 10"1 0,6 0,013

БТХ 4,4 0,023 192 0,15 10"^ 1,5 0,02

Курилы

АТХ 3,2 0,02 100 1,510"" 0,5 0,017

ПТХ 3,4 0.008 41 0,4! 0~* 0,8 0,015

БТХ 4,2 0,007 35 8,85 Ю-1 0.03 0,023

Берингово море

АТХ 3,6 0,015 100 1,15 Юн 1,3 0,013

ПТХ 2,9 0,0072 48 0,54? О"4 1,3 0,007

БТХ Активности кет в пределах [S1 = 2*10 2'10° М

Треска Gadtis macro cephal us

ATX 3,5 0,246 100 0,18 Ю*1 137 024

ПТХ 4,5 0,236 96 0,3810"' 62 0,20

БТХ 3,9 0,223 91 0,14 ТО"5 159 0,17

ХЭ минтая из разных районов обитания значительно различались по кинетическим параметрам гидролиза субстратов. Скорость гидролиза АТХ ХЭ рыб из Охотского моря протекала в 5,6 раза быстрее, чем под действием ХЭ особей из курильского района. Вместе с тем наименьшей скоростью гидролиза АТХ характеризуется ХЭ рыб из района западной Камчатки: скорость гидролиза под действием этой ХЭ составляла 16 % от таковой для ХЭ особей из района Курильских островов и 3 % по сравнению с ХЭ рыб из Охотского моря. Близкими оказались скорости гидролиза ПТХ под действием ХЭ минтая из Охотского моря и района Курильских островов, при этом скорость гидролиза этого субстрата ХЭ минтая из района западной Камчатки была почти в два раза ниже. Не выявлено достоверных различий между изученными ХЭ мозга минтая для процесса гидролиза БТХ.

Наибольшим сродством АТХ и ПТХ обладала ХЭ Берингова моря, в то время как наибольшим сродством по отношению к БТХ, по сравнению с другими субстратами, характеризуется ХЭ особей из района западной Камчатки,

Представляло интерес сравнение свойств ХЭ минтая с ферментом мозга представителя того же семейства - ХЭ трески, позволяющее выявить межвидовые адаптивные особенности ХЭ у видов, характеризующихся сходными условиями обитания (Берингово море).

Изученные ХЭ беринговоморских минтая и трески значительно различались по величине удельной активности. ХЭ мозга трески характеризуется значительно большими (по АТХ - в 40 раз, по ПТХ - в 50 раз) величинами удельной активности. Кроме того, в отличие от ХЭ минтая из Берингова моря, ХЭ трески катализировала гидролиз всех трех изученных субстратов. Следует также отметить, что скорость гидролиза субстратов под действием ХЭ мозга трески, в отличие от ХЭ минтая, практически не зависела от структуры субстрата {Vatx- Vrnx- Vetx= 100; 96; 91). Несмотря на меньшую скорость (Vm) гидролиза АТХ под действием ХЭ беринговоморского минтая значение константы Ми-хаэлиса для этой ХЭ больше таковой для ХЭ трески, что приводит к 10-кратному различию в величине сродства к АТХ.

Исходя из процентного соотношения величин удельной активности можно сделать вывод, что адаптивная роль ХЭ нервной ткани изученного семейства рыб заключается в формировании типа фермента, способного катализировать

гидролиз широкого спектра различных по структуре субстратов. На внутривидовом уровне (минтай из разных районов обитания) этот процесс имеет выражение в большей вариабельности величины удельной активности, связанной с процессом гидролиза АТХ и БТХ.

Факторный анализ констант ферментативного гидролиза субстратов показал, что наибольшие различия у исследованных ХЭ отмечаются по значениям величин Vm и удельной активности. Ферментативная активность мозга минтая из разных частей ареала в большей степени зависит от скорости гидролиза субстратов, а ХЭ мозга трески - от значений Vm/Km. Значительные различия в величине удельной активности и независимость удельной активности от значений сродства позволяют сделать вывод о количественной стратегии биохимической адаптации ХЭ мозга минтая из разных частей ареала к условиям обитания,

ХЭ мозга тихоокеанской сельди. Тихоокеанская сельдь (Clupea pallasi Val.) относится к многочисленным и флюктуирующим видам рыб, широко распространенным в северной части Тихого океана. Сельдь морской формы всю жизнь проводит в соленой морской и/или океанической воде, придерживаясь прибрежной шельфовой зоны и нередко совершая в ее пределах довольно протяженные нагульные, зимовальные и нерестовые миграции (Науменко, 2001).

Из трех изученных ХЭ сельди (табл. б) только фермент мозга сельди, выловленной в Охотском море, катализировал гидролиз всех трех изученных субстратов, ХЭ мозга сельди из Охотского моря по всем параметрам холинэстераз-ного катализа отличалась от других ХЭ сельди. Во-первых, эта ХЭ гидролизо-вала БТХ со скоростью в 2 раза большей, чем АТХ, Во-вторых, по сравнению с другими ХЭ сельди ХЭ мозга сельди из Охотского моря характеризовалась в 40 раз более низким значением Vm и большими (в 52-68 раз) значениями величины Km (сравнение по субстрату - АТХ). Тем не менее наибольшим значением величины сродства к АТХ характеризуется ХЭ мозга сельди из Татарского пролива, а к ПТХ - ХЭ мозга сельди из Берингова моря.

Основное выявленное отличие ХЭ мозга сельди из Охотского моря, по сравнению с ферментом мозга сельди из других районов, - в 2 раза большее содержание фермента в нервной ткани (величина удельной активности фермента).

ХЭ сельди из Татарского пролива и Берингова моря характеризуются качественно сходной субстратной специфичностью: оба фермента не гидролизуют БТХ и

17

по этому параметру схожи с типичной АХЭ. Равнозначными оказались также величины максимальной скорости гидролиза субстратов и удельной активности.

Таблица 6

Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием ХЭ мозга сельди __из разных районов обитания_

Субстрат Параметры

pS,M Vm, мкМ/мин Voth, % Кто, М Vm/Kra, мин"1 Активность, мкМ/мик/мг ткани

Охотское море

АТХ ! 2,9 1,2 100 1,610-1 8 0,064

ПТХ 1,3 0,2 17 2,9 ИГ1 23 0,013

БТХ 3,2 0,08 7 2,210-' 4 0,002

Татарский пролив

АТХ 3,2 0,67 100 3,410"1 20 0,033

ПТХ 3,3 0,11 16 5,910-' 2 0,006

БТХ Активности нет в пределах (S = ю'мсг м

Берингово море

АТХ 3,4 0,63 100 4,4 10"1 14 0,033

ПТХ 2,6 0,13 21 0,910"5 14 0,004

БТХ Активности нет в пределах [S - icrMtr1 м

Большая часть активности фермента мозга сельди из района Берингова моря и Татарского пролива обусловлена гидролизом АТХ (соответственно 89 и 85 %), в то время как активность ХЭ сельди из Охотского моря на 50 % обусловлена гидролизом ПТХ. В то же время проявление процесса гидролиза у ссльди из разных районов реализуется через различные механизмы. Так, для ХЭ мозга сельди из Берингова моря проявление активности фермента обеспечивается в большей степени высоким сродством к ней субстратов. Поскольку процесс адаптации сельди к различным районам обитания связан с изменением структуры субстратной специфичности, можно сделать вывод о количественном механизме стратегии биохимической адаптации к разным условиям обитания.

Таким образом, проведенное исследование свойств ХЭ сельди из разных районов обитания позволило выявить отличия по кинетическим параметрам гидролиза ХЭ мозга сельди из района Охотского моря от ХЭ сельди из других районов. В то же время ХЭ сельди из Татарского пролива и Берингова моря характеризуются качественно сходной субстратной специфичностью.

Адаптация к давлению. Холннэстеразы мозга донных видов рыб Морские глубины отличаются высоким гидростатическим давлением, слабой освещенностью и низкой температурой. В отличие от морских животных, обитающих в толще воды, донные виды гндробнонтов подвержены одновременному влиянию факторов разного рода - физических, химических и биологических. Каждый из указанных факторов влшет на биохимическую «организацию» животных. Адаптация ферментативных систем к давлению играет важнейшую роль в распределении морских жнвотных по вертикали. Давление может влиять на любые процессы только через изменения объема, поскольку большинство химических процессов в биологических системах протекает в водной среде. Второй по значению компонент, ответственный за изменение объема, - это белок, поскольку при каталитических конформацнонных изменениях может происходить реакция гидратации, благодаря чему катализ становится чувствительным к давлению. Постулируется, что каталитическая эффективность ферментов метаболизма глубоководных рыб значительно ниже, чем у мелководных (Хочачка, Самеро, 1988).

Представители семейства камбаловых по количеству видов, их численности и биомассе занимают одно из лидирующих мест в донной ихтиофауне шельфа дальневосточных морей.

Целый ряд специфических особенностей экологии камбал - наличие в дальневосточных морях множества локальных стад, многовозрастная структура популяций, медленный темп линейного роста, позднее наступление половозрелое™, незначительное колебание урожайности поколений, низкая величина естественной смертности и продуктивности в средневозрастных группах - предопределяет стратегию их адаптации к различным условиям обитания.

Наибольшая активность фермента обнаружена в нервной ткани хоботной камбалы (рис, 2), Близкие значения удельной активности выявлены для ХЭ мозга сахалинской и двухлинейной камбал. Изученные ХЭ рыб семейства Р1еи-гопесМае проявляют различную зависимость активности фермента от структуры субстрата. По структуре субстратной специфичности к АХЭ можно отнести фермент мозга желтоперой, длиннорылой камбал, камбалы Шренка и черного палтуса. Значительные различия в субстратной специфичности могут быть обусловлены гетерогенностью ферментативного состава нервной ткани. С целью

проверки гомогенности ХЭ-активности и изучения особенностей структуры активной поверхности ХЭ в районе эстеразного пункта было проведено исследование чувствительности ХЭ камбаловых к трем различным по структура ФОИ (табл. 7).

0,8

Рис. 2, Удельная активность (мкМ/мин/мг) ХЭ мозга рыб семейства камбаловых

Таблица 7

Ингибиторная специфичность ХЭ мозга камбал__

Вид камбалы СлН,<ХСН,)Р(0)5С,Д|3'<СНз;СгН, ПН2 «СН^О ДА 10),Р(0>Р >ф (С^НдаКПЗСУШСНаЬ ЛГ-56

АТХ ПТХ АТХ ПТХ АТХ ПТХ

Сахалинская 4,010* 5,310" 0,8101 0,810^ 1,01(Р 0,7105

Шренка 8,210" 13,110® 1,010' 1,1 10" з.ою? 1,5-10*

Темная 3,410"* 25,010"* 2,1 Ю* - 2,510? -

Двухлинейная 6.510* 4,9)0" 1,110* 1,010" 1.Г101 1.8Т05

Хоботная 2,210' 3,310" 0,9101 0,7105 1,11а1 1,5101

Патгусовидная 2,910" 1,610" 0,910" 0,81 (У 2,а ю1 2,0105

АХЭ 1.310" - 9.510" - 8.010^ -

БУХЭ 3,710" - 1,510' - 3,5103 -

Тихоокеанский кальмар 4,310' 6,910° 1,610'

* Различия достоверны (Р - 0,5),

Как видно из приведенных в табл. 11 данных, ХЭ мозга камбаловых проявляли высокую чувствительность к действию Гд-42. Эффективность действия данного ингибитора по отношению ХЭ камбаловых видов рыб превосходит даже эффективность по отношению к АХЭ. ДФФ проявлял практически равную эффективность к ХЭ камбал различных видов. В целом его эффективность к ХЭ камбал была невысока — величины констант кп были на 4 порядка ниже, чем дня БуХЭ.

Эффективность ЛГ-56 по отношению к ХЭ камбал не уступает таковой по отношению к ХЭ тихоокеанского кальмара. Данный ФОИ оказался и равно эффективным ингибитором ХЭ исследованных видов камбал. Следует отметить, что анти-ХЭ-эффективность исследованных ФОИ практически не зависела от структуры субстрата, что свидетельствует о гомогенности ХЭ-активности мозга камбал. Исключение составляет ХЭ мозга темной камбалы, для которой выявлены достоверные различия в величинах кц по Гд-42, измеренные с помощью двух субстратов, которые составили 7,4 раза.

С целью подтверждения гетерогенности ХЭ-активности проведен хрома-тографический анализ ХЭ темной камбалы. На хроматограмме видно присут-

Рис. 3. Гель-хроматография ХЭ мозга темной камбалы

На основании инги-биторного анализа .показана высокая чувствительность ХЭ камбал к кати о иным и гидрофобным ФОИ. Можно выдвинуть предположение об одинаковой организации эсте-разного пункта ХЭ изученных видов камбал. По-видимому, адаптация фермента нервной ткани камбаловых к условиям существования не затрагивает функционально важных участков молекулы фермента.

Исследование влияния давления на кинетические параметры гидролиза субстратов под действием ХЭ различных видов рыб позволило выявить ряд закономерностей. Во-первых, снижение активности ХЭ нервной ткани отмечается для всех исследованных видов рыб, обитающих на глубинах более 250 м, по мере увеличения глубины обитания. Во-вторых, для рыб семейства камбаловых, обитающих на глубинах 5-200 м, характерно увеличение удельной активности ХЭ у более глубоководных видов. В-третьих, закономерность изменения

ствие двух пиков активности фермента (рис. 3).

А2И0 Активность

величины максимальной скорости от глубины обитания видов аналогична таковой дня удельной активности. В-четвертых, для всех исследованных видов рыб отмечается повышение сродства субстратов к ХЭ по мере увеличения глубины их обитания.

Холинэстеразы хрящевых и косгкстых видов рыб: механизмы биохимической адаптации

Изучение механизмов адаптивных процессов эволюционно более древних видов позволяет оценить стратегию адаптации современных видов. В нашем исследовании представителями древней ихтиофауны из хрящевых видов рыб являются акулы и скаты, из костистых - калуга.

Как видно из данных табл. 8, наибольшей активностью по всем изученным субстратам характеризуется ХЭ мозга сельдевой акулы. Причем преимущество по сравнению с другими рыбами составляло no АТХ - 26-350 раз, по ПТХ - 10-1830 раз, по БТХ - 39-458 раз. Следует, однако, отметить, что с наибольшей скоростью (Vm) гидролиз субстратов протекал не под действием ХЭ акулы, а под действием ХЭ мозга ската Bathyraja parmifera. Причем отличие этой ХЭ от других ХЭ хрящевых рыб было по этому показателю также весьма значительным. Так, гидролиз АТХ протекал в 49-2210 раз, ПТХ - в 248-2800 раз, а БТХ — в 793-1070 раз быстрее, чем под действием других ХЭ. По-видимому, столь значительные различия связаны как с количественным содер-»знием фермента в нервной ткани, так и с особенностями реакционной способности исследованных ферментов.

Значительные различия на межвидовом уровне отмечаются и по величинам значений константы Михаэлиса (Km). Наибольшими значениями Km по АТХ и БТХ характеризуется ХЭ мозга ската Bathyraja parmifera,

Выявленные различия максимальной скорости гидролиза и константы Михаэлиса обусловливают разную величину сродства субстратов к ферментам. Отмечаются четко выраженные межвидовые различия по величинам Vm/Km по отношению к отдельным субстратам. Так, наибольшим сродством к АТХ (преимущество перед другими ХЭ в 4,5-145,0 раза) и БТХ (преимущество в 271063 раза) характеризуется ХЭ мозга калуги, а к ПТХ - ХЭ ската Bathyraja parmifera (преимущество в 154-2800 раз).

Сравнение ХЭ двух видов скатов позволило выявить ряд существенных различий в величинах кинетических констант ферментативного гидролиза. Во-

22

первых, ХЭ мозга ската В. parmifera, в отличие от ХЭ В. aleutica, катализировала гидролиз всех трех изученных субстратов. Во-вторых, в 3-6 раз различались изученные ХЭ по величинам удельной активности по АТХ и ПТХ, Различия в величинах максимальных скоростей гидролиза по АТХ и ПТХ составляли соответственно 2210 и 2800 раз, а по величине Km - 1-2 порядка. Различия в величинах сродства отмечаются только в 14 раз по АТХ, в то время как по БТХ ХЭ различаются в 2800 раз.

Таблица 8

Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием ХЭ различных видов _хрящевых рыб и калуги_

Субстрат Параметры

pS,M Voth, % рКга, M Vm/Km, мин"1 Удельная активность, мкМ/мин/мг

Скат Bathyraja parmi fora

АТХ 2,6 too 2,4 0,1 0,030

ПТХ 1,5 67 3,7 1,3 0,023

БТХ 2,9 SI 3,2 0,3 0,017

Скат Bathyraja aleutica

АТХ 2,9-3,7 100 4,6 7,0 0,009

ПТХ 2,6 53 3,7 0,5 0,005

БТХ Пег гидролиза

Тихоокеанская сельдевая акула Lamnidae ditropis

АТХ 2,9 100 4,2 3,1 0,31

ПТХ 2,4 105 4,5 9,1 0,33

БТХ 3,3 105 4,6 7,8 0,33

Калуга Huso dauricus

АТХ 2,9 100 4,7 45,0 0,12

ПТХ 2,6 13 3,5 0,15 0.08

БТХ 6,3 3 7,7 818.0 0,02

Согласно выдвинутой ранее теории (Augustin s son, 1959), ХЭ произошли от фермента алиэстераза, обладающего широким спектром субстратной специфичности. Генеральным направлением эволюции ХЭ, по этой теории, является их специализация в проявлении каталитических функций по отношению к меньшему количеству субстратов. Исходя из общепринятых представлений о холинэстеразном катализе фермент, характеризующийся более узким спектром субстратной специфичности (АХЭ), является более прогрессивным, чем ферменты с более широким спектром субстратной специфичности (ПрХЭ, БуХЭ).

ХЭ мозга исследованных видов рыб демонстрируют два основных вида зависимости значений относительных величин удельной активности по трем

субстратам. Хопннэстеразная активность у трех видов рыб - калуги, акулы и скатаВ. parmifera-в большей степени обусловлена гидролизом ПТХ и только в случае ската В. aleutica - ATX. Полученные данные, по-видимому, свидетельствуют о первичности в холинэргическом синапсе хрящевых видов рыб неспе-цифнческого гидролиза под действием фермента, обладающего слабо выраженной субстратной специфичностью.

Адаптация к условиям обитания

Головоногие моллюски - чемпионы по интенсивности длительной мышечной работы среди морских беспозвоночных. Интенсивность метаболизма у к;хльмаров может быть столь же высокой, как у рыб семейства лососевых: миграции кальмаров обеспечиваются за счет аминокислот и белков, и это сближает их с анадромнымн миграциями лососевых (Mommsen et at., 1981).

Как видно из представленных в табл. 9 данных, наибольшей активностью

ХЭ характеризуется нервная ткань кальмаров сем. Ommastrephidae (О. bartrami и Т. pad fi cus), При этом ХЭ тихоокеанского кальмара (Т. pacificus) характеризуется менее выраженной субстратной специфичностью. Для этой ХЭ соотношение скоростей гидролиза имеет следующий вид - Vat*: vrrrx: Vetx ~ 100: 103: 96, в то время как для ХЭ кальмара Бартрама (О. bartrami) - Удтх: Vnrx : VETX = 100: 53: 42. Значительно различаются изученные ХЭ и по величинам значений Vm: преимущество фермента тихоокеанского кальмара для процесса гидролиза АТХ — 4,1 раза, для ПТХ - 7,9 раза, а для БТХ - 9,3 раза. Различий в величинах Km при эггом не отмечено. Выявленные различия в величинах Vm отражаются и на величине сродства субстратов к ферментам. ХЭ тихоокеанского кальмара характеризуется в 5-13 раз большим сродством к изученным субстратам.

Наименьшим значением величины удельной активности характеризуются оптические ганглии осьминога. На фоне низких значений величины Кш этот фермент обладает наибольшим сродством к изученным субстратам.

Промежуточное положение по величине удельной активности ферментов занимают ХЭ командорского кальмара (В. magister) и кальмара-светлячка (W. sdntillans). Эти две ХЭ различаются по субстратной специфичности: для ХЭ W.

зсЫШапз скорость гидролиза субстратов уменьшается по мере изменения структуры субстрата (УАТх: Ущ^: УБТХ= 100: 78: 28), в то время как ХЭ В. ша-§151ег катализирует гидролиз ПТХ и БТХ практически с одинаковой скоростью (УАтх: угтгх: ^БТХ= 100: 54: 49). ХЭ оптических ганглиев командорского кальмара характеризуется также и наименьшими величинами сродства к изученным субстратам.

Таблица?

Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием ХЭ ганглиев __головоногих моллюсков разных видов_

Субстрат Параметры

pS,M Vm, мМ/мин pKm, M Vm/Km, MHH*1 Удельная активность, мкМ/мг ткани

Осьминог Octopus dotleini

ATX 2,6 7,64 4,46 222,1 0,18

ПТХ 2,9 2,57 4,35 57,9 0,21

БТХ 1,5 0,23 4,49 7,3 0,08

Кальмары Ommastrephes bartramî

ATX 1,3 0,38 3,37 0,64 1,04

ПТХ 1,5 0,20 3,90 U 0,79

БТХ 1,7 0,16 3,54 1,0 0,55

Todarçdes pact ficus

ATX 2,3 t,54 3,73 8,2 0,76

ПТХ 2,9 1,58 3,83 10,7 0,68

БТХ 1,9 1,48 3,55 .....5,2 __ 0,73

Berryteuthis maxister

ATX 2,1 0,41 2,90 2,0 0,36

ПТХ 2,1 0,22 1,99 2,0 0,15

БТХ 2,5 0,20 0,71 3,0 0,15

Watasenia scintiüans

ATX 2,6 0,32 4,16 4,3 0,40

ПТХ 2,6 0,25 4,51 8,1 0,25

БТХ 3,2 0,09 4,51 2,9 0,14

Обнаруженные различия в параметрах ферментативного катализа у головоногих моллюсков разных таксономических групп согласуются с различиями биологии изученных видов по распределению общей биомассы и численности, способам размножения, онтогенетическим перемещениям и суточным миграциям (Несис, 1977).

Формирование жизненных форм головоногих моллюсков, начиная с донных видов (осьминог) или видов, совершающих незначительные вертикальные

25

суточные миграции (командорский кальмар, кальмар-светлячок), к видам, для которых характерны значительные миграции (кальмары сем. Оттаз1херЫс1ае) и р;>зличная стратегия пищевого поведения, на биохимическом уровне отражается прежде всего на величине удельной активности ХЭ нервной ткани (рис. 4). Стратегия пищевого поведения кальмаров, как активных хищников, выражается в высокой скорости холинэргических реакций и высоком сродстве субстратов к ферменту. Для осьминогов, по-видимому, основной стратегией адаптации холинэртческой системы к проявлению единовременных (и кратковременных) реакций пищевого поведения служат более выраженная субстратная специфичность (УАТх: Ущх: уетх = 100: 34; 3) и высокая степень сродства субстратов к ферменту.

Рис. 4. Зависимость удельной активности ХЭ головоногих моллюсков от значсшш величин кинетических параметров пиролиза субстратов

Механизмы адаптации у близкородственных видов ХЭ кальмаров сем, вопа^ае, Выявленные ранее различия в свойствах ХЭ кальмаров, принадлежащих к различным семействам, оставляют открытым вопрос о различиях в свойствах ферментов на уровне одного семейства. Решение этого вопроса представляет интерес и с точки зрения биохимической экологии, так как дает возможность показать механизмы формирования адаптации у близкородственных видов, обитающих в одинаковых условиях.

Нами проведено исследование свойств ХЭ кальмаров сем. ОопаИдае, обитающих в Северной Пацифике (табл. 10).

Следует отметить, что значения величин кц по всем трем субстратам для

специфических ингибиторов АХЭ и БуХЭ (ДФФ и Гд-42) были практически

26

равны для каждого из исследованных видов кальмаров. На основании равенства величин бимолекулярной константы ингибирования можно сделать заключение, что в нервной ткани исследованных видов кальмаров семейства Оопапёае содержится одна ХЭ, которая катализировала гидролиз всех трех изученных субстратов. Кривые зависимости скорости гидролиза от концентрации субстратов имели колоколообразную форму, что указывает на угнетение активности

фермента избытком субстрата.

Таблица 10

Ингибиторная специфичностьОккп) ХЭ зрительных ганглиев кальмаров сем. Gonatidae

Суб- ФОИ

Вид страт ДФФ ГД- ЛГ- ЛГ- ЛГ- ЛГ- Гд-Ч ЛГ-56

42 56 64 63 65 ЛГ-56 ЛГ-63

ATX 2,95 4,38 2,59 2,00 2,12 3,00 60 3

В. magister ПТХ 2,78 4,08 2,36 1,78 2,17 3,11 50 2

БТХ 3,28 438 2,59 2,18 2,04 3.23 60 3

В.anonychus ATX 6,43 7,32 5,79 3,52 3,64 3,76 35 140

ПТХ 6,54 7,12 5,66 3,64 3,74 3,95 30 85

БТХ 6,49 7,11 5,85 3,21 3,96 3,84 45 80

G. kamtschatieus ATX 5,91 7,15 5,62 3,36 3T76 3,88 35 75

ПТХ 5,97 7,16 5,83 3,25 3,86 3,89 25 100

БТХ 6,11 6,98 5,91 3,41 4,06 3,96 15 70

ATX 5,60 6,14 4,43 3,41 3,36 3,03 50 10

G. tinro ПТХ 5,65 6,21 4f78 3,56 3,16 3,25 30 40

БТХ 5,69 6,30 4,76 3,61 3,57 3.54 30 15

ATX 5,45 6,39 4,55 3,79 3,74 4,00 45 7

G. boreatis ПТХ 5,40 6,30 4,53 3,64 3,83 3,78 60 5

БТХ 5.46 6,34 4,60 4,00 4,00 3,84 55 4

Изученные ХЭ существенно различались величинами удельной активности по каждому из трех исследованных субстратов (табл, 11). Так, наибольшая величина удельной активности по АТХ наблюдалась у G. okutanii, В. magister и В. anonychus, а у G. kamtschalieus была в 5-8 раз ниже. В то же время гидролиз ПТХ с наибольшей скоростью катализировали ХЭ G. okutanii, G. boreal is и В. anonychus, а с наименьшей — фермент G. tinro (в 3-10 раз ниже). ХЭ G. tinro также с наименьшей скоростью катализировала гидролиз БТХ. Наибольшей скоростью гидролиза БТХ характеризуются ХЭ В. anonychus и G. boreaHs. Очень существенными оказались межвидовые различия по величинам Km для каждого из субстратов. Так, для ферментов В. magister и В. anonychus эти различия в случае АТХ и ПТХ были 10-15-кратными, а для процесса гидролиза БТХ - 2,5 раза. Различия по Km у кальмаров рода Gonatus отмечаются только

по БТХ: значение Клп для ХЭ й. ппто было в 3,3 раза больше таковой для ХЭ в. капИБсЬа^сиБ. Для рода СопаСо^з выявлены различия в величине Кш при сравнении кальмаров в. Ьогеа1ю и в. окшапи для процесса гидролиза АТХ - в 2,6 раза, БТХ - в 7,5 раза.

Таблица 11

Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием ХЭ оптических ганглиев _кальмаров сем. Оопапс^е_

Параметр Субстрат Род Веггу(е««1и5 Род ОопаШ! РодОопа(орз15

В. та* Е151ег В. ИКту- СЙ!« О. кат-(зсЬайсиз в, 1тго О, Ьоге-аНз О, оки-1атш

Удельная активность, мкМ мгмин-1 АТХ 0,36 0,36 0,07 0,16 0,31 0,52

ПТХ 0,15 0,27 0,14 0,08 0,29 0,41

ЕТХ 0,15 0,27 0,12 0,04 0,39 0,18

Уш, мМмин-1 АТХ 533 5,36 1,01 2,41 4,65 6,00

ПТХ 2,17 4,00 2,11 1,26 4,29 4,20

БТХ 2,17 4,06 1,75 0,61 5,78 2,40

Уота, % АТХ 100 100 100 100 100 100

ПТХ 40 75 210 50 90 70

БТХ 40 75 175 25 125 40

рКш, мМ АТХ 2,90 0,20 0,82 1,09 0,27 0,71

ПТХ 1,19 0,12 1,81 1,68 0,49 0.32

БТХ 0,71 1,82 0,41 1,34 2,16 0,29

Ут/ Кш, мин"1 АТХ 2 25 1 2.0 15 8,4

ПТХ 2 35 1 0,5 10 13,0

БТХ 3 2 5 0,5 3 8,2

р5, М АТХ 3,5 0,5 0,3 2.8 0,9 2,3

ПТХ 1,5 4,4 3,8 3,5 0,8 2,4

БТХ 1,5 0,4 0,4 3,5 4,1 3,3

Таким образом, впервые обнаружены различия в параметрах субстратной специфичности ХЭ различных видов дальневосточных кальмаров, входящих в одно семейство и обитающих в акватории Северной Пацифики.

Было высказано предположение, что эволюция гонэтид идет от пелагиали к придонному образу жизни и исследованные виды кальмаров различаются степенью «эволюционной подвижности»: В. апопусЬиз, б. кагШБсИаИсиз и О. йпго считаются более древними, а В. та^ег и С. Ьогеа^з - более молодыми и в эволюционном плане более подвижными видами этого семейства (Эпштейн, 1992). По-видимому, обнаруженные межвидовые различия в свойствах ферментов связаны с тем, что гонатиды находятся в процессе эволюции на пути специализации и выработки жизненной формы «кальмара- хищника глубин» (Несис, 1973).

Как отмечалось выше, среди огромного количества синтезированных ФОИ имеются соединения, проявляющие наибольшую специфичность действия по отношению к ХЭ отдельных видов животных или тканей. По отношению к исследованным ХЭ кальмаров ДФФ проявлял эффективность, сравнимую с таковой по отношению к АХЭ (см. табл. 8). Исключение составляет ХЭ в. ЬогеаКз; ДФФ оказался в 170 раз более эффективным ингибитором АХЭ и на четыре порядка более эффективным ингибитором БуХЭ. Отличия ХЭ кальмаров родов Веггу1еиЛ15 и ОопаШз от ХЭ Сопа1орз15 достигали 340—1000 раз. Следует отметить, что различий в чувствительности к ДФФ у ХЭ кальмаров родов Вегт^еиЙш и Сопат з не выявлено.

Гд-42, оказался в 560-3300 раз менее эффективным ингибитором ХЭ кальмаров сем. Сопаис1ае (для АХЭ кл = 1,3*10®). Кроме того, это соединение оказалось более эффективным ингибитором БуХЭ (кд = 3,7*Ю6), Однако данное соединение проявляло определенную специфичность действия по отношению к изученным ХЭ кальмаров. Так, наибольшую чувствительность к Гд-42 проявляли ХЭ кальмаров рода бопатз: эффективность данного ФОИ по отношению к ХЭ в. кат-ЬсЬайсия и С. йпго была в 460-590 раз выше, чем у ХЭ ОопаЮр518 ЬогеаЬз. Различия в величинах к» между родами Вепг^еШЫз и СопаШз составили 9-29 раз.

По отношению к большинству исследованных ХЭ кальмаров семейства гонатид ЛГ-56 проявлял равную либо большую эффективность, чем к АХЭ и БуХЭ, Исключение составляет ХЭ й. ЬогеаЬз, обладающая на порядок меньшей чувствительностью по сравнению с АХЭ и БуХЭ. Следует отметить, что данный ФОИ оказался менее эффективным ингибитором ХЭ кальмаров сем, Оопа-Мае по сравнению с ХЭ тихоокеанского кальмара. По чувствительности к ЛГ-56 ХЭ кальмаров родов Веггу1еШ1ш и вопаШз практически не различались. В то же время отличие по величине кн ХЭ О. ЬотеаЬя от ХЭ кальмаров других родов было весьма значительным: ЛГ-56 в 15-54 раза был более эффективным ингибитором ХЭ кальмаров рода ВегтуТеиЙнз и в 69-87 раз ХЭ кальмаров рода СюшШб.

На изменение длины радикала в отщепляемой части молекулы у ФОИ серии ЛГ от п = 4 (ЛГ-64) до п = 6 (ЛГ-65) ХЭ исследованных видов кальмаров показывали два типа зависимости. Во-первых, при увеличении длины алкиль-ного радикала отмечалось увеличение величины к^ для кальмаров С. ЬотеаИз, В.та5151ег и С. Кпго: в случае ХЭ В.тадЫег увеличение было 10-кратным, а

для ХЭ й. йпго - 36-кратным, Второй тип зависимости демонстрируют ХЭ В.апопусЬиз и в, каптзсЬа^сиа: наибольший эффект отмечается для ХЭ О. к;иШ5с1Ш1си5 - активность уменьшалась более чем в 20 раз.

Оценить степень влияния 3,3-диметилбутильной группировки (ЛГ-56) на эффективность ингибитора по сравнению с ФОИ, имеющим радикал нормального строения (ЛГ-64), позволяет сравнение величин кц для ЛГ-56 и ЛГ-64. Введение в молекулу ФОИ 3,3-диметилбутильного радикала приводило к повышению его эффективности по отношению ко всем исследованным ХЭ кальмаров: для ХЭ В. в 19 раз, для ХЭ В, апопусЬиз, О. катти всИацсиа иО. 1тго - в 9-10 раз. Наименьшей чувствительностью к изменению структуры ингибитора характеризуется ХЭ С. ЬогеаНз,

Таким образом, проведенное исследование субстратно-ингибиторной специфичности позволило выявить ряд различий на межродовом и межвидовом уровне у представителей кальмаров сем. Сопа!г<1ае. Выявленные различия в ин-гибиторной специфичности ХЭ кальмаров сем, ОопаМае свидетельствуют о р;оной организации эстеразного пункта активной поверхности ферментов.

Оценка степени специализации, проведенная по результатам субстратного анализа, совпадает со схемой филогенетических родов и видов кальмаров сем. Оопапс1ае, преложенной К.Н.Несисом (1973).

ХЭ командорского кальмара. Механизмы внутривидовой адаптации. Типичным представителем сем. Сопа^с1ае является командорский кальмар — Вег-т>1еиЙ11з ша|151ег. Проведенный субстратно-ингнбиторный анализ, показал гомогенность ХЭ-активности оптических ганглиев командорского кальмара. ХЭ этого вида кальмаров, выловленных в районах, указанных в табл. 12, не различались ни по кинетическим параметрам гидролиза субстратов, ни по величинам к». Проведенный анализ свидетельствует об одинаковой организации эстеразного центра фермента у ХЭ кальмара из различных частей видового ареала.

Исследование чувствительности ХЭ командорского кальмара из разных частей видового ареала к 57 обратимым ингибиторам различной структуры позволило выявить ряд специфических ингибиторов ферментов кальмара из отдельных районов (табл. 10). Различия в чувствительности исследованных ХЭ носили не только количественный (по величинам констант обратимого торможения), но и качественный (по типу тормозящего действия) характер. Посколь-

ку местом сорбции обратимых ингибиторов на активной поверхности ХЭ является анионный пункт фермента, можно сделать вывод о различной организации этого пункта у фермента кальмаров из разных частей видового ареала.

Таблица 12

Специфические ингибиторы ХЭ командорского кальмара из разных районов обитания

Курильские острова Берингово море Японское море

Северные Центральные Южные Олюторско-наварннскмй район Прибылово-аляскинский район О. Попова

рК. \ тт Рк( [ тт 1 ТТ рК. ] ТТ рК. | ТТ рК. | ТТ

5+(С2Н5)СН3

- 1 3,77 | С - 1 2,98 | К 2,74 | К 1 - )

(СН, )зЫ+С2Н4«С(0)СН)

- | 2,46 | С - 1 3,51 1 С 2,98 I н - 1

- 1 2,42 | н - 1 1 2,18 | Н 3,38 | С - 1

сн4 С* )—'НгОИ

- ( 1 5,2! | С ' ~ I и, г- 5,32 | Н - 1

// V

- 1 1 4,68 1 с 1 - 1 1 4,08 1 С 4,37 | с 1 - 1

(С4Н»ЪР+СН,СН=СН2

- 1 1 4,11 н 1 - 1 4,23 | С 3,62 I с 1 - 1

С2Н;(СН))3+С5Н40С(0)СН)

- 1 1 3,91 1 н 1 - 1 1 4,75 | Н 1 4,28 | С 1 - 1

5+(СН,>!

- 1 1 3.85 1 н [ - 1 1 4,59 | С 1 4,24 | с ! - 1

8е+(СНэЬ

- I 1 4,92 | с - 1 4,45 | Б 1 4,90 1 с 1 - 1

Г(СНзЪСНОЪР(8)5СН^

- 1 1 4.26 | с 1 - 1 1 4,91 | С 1 4,03 | с 1 - 1

<СН ОзИ'СН^ГСЬШСН 2) гЭКСН О.СН ,Ы+(С Н3Ь

- 1 1 3,90 | С 1 - 1 1 5,19 | С 1 3,42 | С 1 - 1

{СНЛТГСКЬЗНСНзЫСНзЬадСНЛСН^ЧСНэ)

- 1 1 4,63 ! н 1 - 1 1 4,18 | С 1 3,86 1 с 1 - 1

(СНЖЫ'СЩЗНСН^ОЪЗ^СН^СН^ЧСНЛ

- 1 4,75 н 1 - 1 1 5,53 I С 1 5,10 | с 1 - 1

(СвН5)5Р+(СН2^Р+СС6Н5),

- 1 1 4,12 | Б 1 - 1 1 4,50 | С I 4,75 I н 1 - 1

С Н:ОС СО>—1С Н 2)п—С (ОК>СНг-/ с 5 ■а

__Окончание тайл. 12

К=Н, п=2 _____

Т.56 [ Н | 4,78 I К [ 4,56) Н | - | 1-1 I 3,97 ) Н

И=Н.п-3_____

5,261 Н | 5,90 | Н | 5,78 | Н | - | 1 - | | 5,22 | Н

Я=Н, п-7______

6,55) С | 5,04 ) К 15.87 | Н | | 1-1 I 6,46 | н"

п-8_'_____

6,36 | Н | 4,86 } Н | 5,21 | Н I - I I - ( I 4,98 | Н

К=С1Ъ, п=2 _

4,46 I С I 3,57 I К 14,38) Н | - | ' I - I I 5,23 | С

Р^СН,. п-3___

4,32| Н | 4,45 | Н 14,15 I Н 1 - | I - ) I 4,75 | Н

Я=СН], п=7 ___1_

5,82 I Н 1' 3,97 [ С [ 4,57 | Н 1 - I 1-1 1 4,72 | С

К=СНз, п=8 _

4,42 | Н ( 6,68 I К. | 4,63 | Н | - | | - I I 4,96 \

По-вндимому, изменения, возникающие в процессе адаптации ферментов кальмаров к изменяющимся условиям существования, не затрагивают функционально важные участки фермента (эстеразный пункт), а влияют на периферические участки фермента. Таким образом, механизм адаптации ХЭ командорского кальмара может быть определен как эксплуатативный.

Холинэстеразы различных тканей ракообразных. Проведенные исследования свойств ХЭ гидробионтов - обитателей дна — свидетельствуют о более низкой удельной активности фермента в их нервной ткани по сравнению с другими гидробионтами. Характерна ли эта зависимость для всех обитателей донного сообщества?

В гемолимфе крабов обнаружен высокоактивный фермент, не имеющий ч 5ТКО выраженной субстратной специфичности (рис. 5). Исключение составляет ХЭ гемолимфы камчатского краба, которую на основании величин относительных скоростей гидролиза субстратов можно отнести к классу БуХЭ (К.Ф, 3,1,1,8). ХЭ нервной ткани краба-стригуна опилно и мохнаторукого краба могут быть отнесены к классу АХЭ, а ХЭ нервной ткани камчатского краба— к нетипичным АХЭ. По-видимому, процесс адаптации крабов к условиям обитания при постоянно низких температурах придонного слоя приводит к появлению в нервной ткани ферментов с узким спектром субстратной специфичности, по типу АХЭ,

нервная ткань

| мохнаторукий

4

В разных тканях крабов механизмы адаптации фермента значительно различались. Так, модуляция активности ХЭ нервной ткани стригуна опилио определяется величиной сродства субстратов к ферменту и не зависит от скорости их гидролиза. ХЭ нервной ткани камчатского краба характеризуется наименьшей величиной удельной активности и сродства субстратов. Модуляция активности этой ХЭ зависит от эффективных концентраций субстрата, что подтверждается низкими значениями Кт. В то же время вы-

\ $ ■*.'■■: сокая удельная активность ХЭ нервной ткани

В чамчатекий ■

мохнаторукого краба обусловлена как высоким сродством субстратов к ферменту, так и высокой скоростью гидролиза. Данный факт имеет важное физиологическое значение для обеспечения выживания краба в приливно-отливной зоне, для которой характерна экстремальность условий обитания.

В ткани сердца крабов обнаружен фермент с наименьшей удельной активностью. Модуляция активности ХЭ сердца мохнаторукого краба подчиняется механизму, аналогичному для фермента нервной ткани. В то же время для ХЭ сердца камчатского краба и краба-стригуна опилио механизм адаптации прямо противоположный, чем для фермента нервной ткани. В гемолимфе исследованных видов крабов определена наибольшая по сравнению с другими тканями удельная активность ХЭ. Присутствие высокой холинэ-стеразной активности в гемолимфе крабов имеет важное физиологическое значение и объясняется особенностями морфологии животных. У беспозвоночных ин-

стригун хО

■ ^жу

гемолимфа

. М4ХН1Т0РУКНЙ - .

Ьтриг^н

" Т.;':-

Рис. 5. Зависимость величины удельной активности ХЭ нервной ткани, сердца и гемолимфы различных видов крабов от значений кинетических констант гидролиза субстратов

нервация ткани сердца происходит аналогично другим животным, однако в нервно-мышечном синапсе сердца отсутствует ХЭ, вследствие чего ацетилхслин диффундирует в гемолимфу, где и происходит процесс его ферментативного гидролиза.

В результате проведенных исследований установлено, что модуляция активности ХЭ гемолимфы не зависит от величины скорости гидролиза субстратов. Все три изученных вида крабов проявляют различные механизмы модуляции активности ХЭ гемолимфы. Так, высокая удельная активность ХЭ гемолимфы мохнаторукого краба обеспечивается высоким сродством субстратов к фгрменту и практически не зависит от значений Кш. В то же время для ХЭ камчатского краба отмечается противоположная зависимость: модуляция активности фермента определяется эффективными концентрациями субстратов и не зависит от их сродства к ферменту I Третий вариант зависимости демонстрирует ХЭ гемолимфы краба-стригуна опилио: модуляция активности данной ХЭ как величиной сродства субстратов к ферменту, так и значением их эффективных концентраций.

Таким образом, на примере ХЭ крабов показано, что механизмы адаптации ферментов различаются не только на межвидовом, но и на тканевом уровне.

Холинэстеразы гемолимфы двустворчатых моллюсков. В настоящее время накопились данные о корреляции между прогрессом общей организации моллюсков, степенью сложности их нервной системы и активностью ХЭ. Результаты ранее проведенных исследований свидетельствуют о различиях в механизмах холинэрги1ческой регуляции у трех классов моллюсков — двустворчатых, брюхоногих и головоногих (Турпаев и др., 1967; Хотимченко, 1989). Морские беспозвоночные представляют особый интерес как организмы-индикаторы загрязнения окружающей среды, так как способны накапливать в органах и тканях значительное количество тяжелых металлов (Христофорова и др., 1994). Помимо использования организмов-индикаторов загрязнения окружающей среды в настоящее время широко развивается направление с использованием биохимпче-ских маркеров, которые дают вполне адекватную информацию о нарушениях состояния гидробионтов в условиях загрязнения (Лукьянова, 1994, 2001). Использование ХЭ, как ключевого фермента холинэргической системы, вполне оправданно в связи с возможностью оценки как комплексного действия поллютантов,

так и индивидуальных химических агентов (Fishetson et al„ 1994; Payne et al., 1996; Galloway et al„ 2002).

Морские двустворчатые моллюски можно разделить на три большие группы видов: ведущие прикрепленный образ жизни, свободно живущие на субстрате и закапывающиеся в грунт. К первой группе относятся мидия Грея и модиолус, к третьей — анадара.

ХЭ гемолимфы анадары характеризуется наибольшими значениями величин максимальной скорости пиролиза по всем трем изученным субстратам (рис. 6). Так, различия в величинах Vm по сравнению с ХЭ мвдии и модиолуса составляли: для процесса гидролиза АТХ - 7 раз; для ПТХ - от 3 раз по сравнению с ХЭ мидии, до двух порядков по сравнению с ХЭ модиолуса. Несмотря на самую низкую активность фермента в гемолимфе, ХЭ модиолуса характеризуется наибольшим (в 4-5 раз) значением константы Михаэлиса по АТХ по сравнению с ХЭ других двустворчатых моллюсков. Наибольшим значением Km по ПТХ и БТХ характеризуется ХЭ гемолимфы мидии.

Рис. 6. Удельная активность (мкМ/мин/мл) ХЭ гемолимфы двустворчатых моллюсков при сравнении ХЭ анадары и мидии для процесса гидролиза БТХ

Выявленные значительные различия значений кинетических констант оказывают влияние на величину сродства субстратов к ферментам. Как и ожидалось, наибольшие значения величины сродства выявлены для ХЭ гемолимфы анадары. Значительными оказались и различия в величинах Vm/Km при сравнении ХЭ гемолимфы анадары и ХЭ других двустворчатых моллюсков: различия по АТХ составляли 8-39 раз; по ПТХ - 42-53 раза.

Проведенный анализ показывает (рис. 7), что для моллюсков, ведущих прикрепленный образ жизни (мидия, модиолус), механизм адаптации к услови-

I

Лнадярь

ям существования не связан со скоростью гидролиза субстратов и их сродством к ферменту, а определяется способностью ХЭ гемолимфы катализировать гидролиз субстратов в широком пределе их концентраций.

Рис. 7. Зависимость удельной активности ХЭ гемолимфы двустворчатых моллюсков от значений кинетических параметров гидролиза субстратов

Нами проведено сравнение свойств ХЭ гемолимфы мидии Грея, выловленной в различающихся по степени загрязнения акваториях (в качестве контроля для сравнения выбраны моллюски, собранные в условно чистом районе -на акватории о. Рейне ке): в районе, подверженном хроническому антропогенному воздействию (акватория бухты Десантной - зона городской свалки промышленных и бытовых отходов); в районе о. Большой Пелис (бухта Восточная), акватория которого подвержена залповому действию высоких концентраций тяжелых металлов (апвеллинг); и район мыса Консервного (о. Итуруп), характеризующийся высокими фоновыми значениями концентраций тяжелых металлов (Шулькин и др„ 2002; Кауип ъ\ а!., 2002).

Для мидий, обитающих в акваториях, периодически подверженных воздействию токсикантов (о. Большой Пелис), характерно 4-кратное снижение величины удельной активности фермента (по АТХ). При этом происходит уменьшение как максимальной скорости гидролиза субстратов, так и величины сродства субстратов к ферменту. Однако воздействие неблагоприятных факторов внешней среды приводит к увеличению значений константы Михаэлиса. Особенно выражено увеличение Кт для процесса гидролиза БТХ и ПТХ (рис. 8).

Хроническое антропогенное воздействие (бухта Десантная) на среду обитания двустворчатых моллюсков приводит к изменению субстратной специфичности ХЭ их гемолимфы. ХЭ гемолимфы мидии из этой акватории не катализирует гидролиз БТХ. При этом происходит практически 8-крагное снижение активности фермента по сравнению с ХЭ гемолимфы мидии из ((контрольного»

района, а также снижение значений величин Ут и Ут/Кт. Компенсаторной «реакцией» ХЭ гемолимфы моллюсков из этого района является значительное увеличение Кт. По-видимому, именно изменение эффективных концентраций

субстрата, необходимых для проявления физиологической функции ХЭ, является механизмом адаптации фермента к хроническому воздействию токсикантов.

Рис. 8. Субстратная специфичность ХЭ гемолимфы мидии Грея из разных районов обитания

В качестве модели механизма возможной адаптации ХЭ гемолимфы моллюсков к повышенному (природному) фону токсикантов можно использовать сравнение свойств фермента мидии из акваторий о. Рейнеке - о. Большой Пе-лис — мыс Консервный. Как отмечалось выше, предадаптация к залповому воздействию токсикантов приводит к увеличению Кт и снижению удельной активности, величин Ут и Ут/Кт (сравнение о. Рейнеке - о. Большой Пели с). Результатом адаптации ферментов гемолимфы мидии к повышенному природному фону концентраций тяжелых металлов (сравнение о. Большой Пелис -мыс Консервный) является повышение (в два раза) не только удельной активности фермента, но также Кт и значений сродства субстратов к ферменту.

Таким образом, изучение свойств ХЭ гемолимфы различных видов моллюсков позволяет выдвинуть предположение, что основным направлением биохимической адаптации холииэргической системы к условиям обитания является регуляция величины удельной активности фермента (рис. 9). Основными кинетическими параметрами, оказывающими влияние на способность ХЭ к осуществлению физиологической функции, являются оптимальная концентрация субстрагга и значение величины Кт. Очевидно, особенности биологии двустворчатых моллюсков (неподвижный образ жизни, наличие активных хищников н тд.) приводят к выработке стратегии, требующей быстроты выполнения поведенческих реакций.

Быстрота выполнения этих реакций зависит от квантового выброса медиатора в концентрации, необходимой для осуществления физиологической функции. Выполнение холинэргических функций в гемолимфе мидии Грея в большей степени определяется величиной значений оптимальной концентрации субстратов, их сродством к ферменту, значением Ктп и в меньшей степени концентрацией фермента и значениями величин максимальной скорости их пиролиза. В целом эта стратегия адаптации характерна и для фермента моллюсков, обитающих в условиях временного воздействия загрязнения, за исключением одного момента. Для осуществления физиологических функций у моллюсков, обитающих в таких ус-

. Адаптация ХЭ гемолимфы моллюсков к хроническому антропогенному воздействию приводит к изменению субстратной специфичности ферментов.

Известно, что температура среды обитания влияет на скорость протекания ферментативных процессов и величину метаболитического потока. Эволюционные изменения, направленные на адаптацию к температуре, весьма широко распространены, так же как и фенотипические изменения у организмов, сталкивающихся с кратковременными колебаниями темпералуры. Считается, что у животных, адаптированных к холоду, каталитическая активность гомологичных ферментов выше, чем у животных, не адаптированных к холоду, и не зависит от места животного в филогенетической системе (Хочачка, Самеро, 1988).

С целью выяснения механизма адаптации ХЭ у животных различных таксономических рангов впервые была предпринята попытка сопоставления субстратной и субстратно-ингибиторной специфичности псевдотуберкулезного

аРиЪш «

ловиях (о. Большой Пелис), ХЭ приобретают способность катализировать гидролиз субстратов в широком пределе их концентраций, что выражается в отсутствии субстратного торможения.

Рис. 9. Зависимость активности ХЭ гемолимфы мкдкн от кинетических параметров гидролиза субстратов

Адаптация к температуре

микроба Yersenia pseudotuberculosis и Listeria monocytogenes, культивированных при 37 и 4 °С. Это дало возможность, с одной стороны, получить информацию о каталитических свойствах ХЭ Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes, а с другой стороны, выяснить, изменилась ли реакционная способность микро-биальных ХЭ при столь значительном снижении температуры культивирования (Бузолева, 2001). Отмечено, что понижение температуры культивирования Y. pseudotuberculosis сопровождалось существенным снижением не только каталитической активности фермента, но и величины сродства субстратов к ферменту. Механизм температурной адаптации микроорганизмов, по данным субстратно* ингибнторного анализа, определен как конформационный (Розенгарг и др., 2001).

Нами изучена способность ХЭ мозга карпа и сазана катализировать гидролиз АТХ, ПТХ и БТХ в широких пределах их концентрации. ХЭ изученных видов рыб катализировали гидролиз всех трех изученных субстратов. Кривые pS-зависимости имеют колоколообразную форму, что свидетельствует об угнетении активности ферментов большими концентрациями субстратов. Величины значений оптимальных концентраций субстратов (pS) для ХЭ каждого вида зависели от температуры обитания рыб (табл. 13). Так, значение оптимальной концентрации АТХ для сазана, обитающего при 26 "С, было более высоким, чем для ХЭ сазана, обитающего при 4 сС. Величины pS по ПТХ и БТХ у данного вида не различались. Для ХЭ карпа отмечается обратная картина: различий в величинах значений pS по АТХ у «летних» и «зимних» особей не отмечалось, в то время как различия в значениях pS по ПТХ и БТХ достигали одного порядка. По-видимому, для проявления каталитических функций фермента при понижении температуры обитания ХЭ карпа достаточно более низких концентраций субстрата.

Величина удельной активности ХЭ, измеренная по трем субстратам, выше у сазана. Это соотношение не зависит от сезона вылова рыб. Удельная активность ХЭ мозга сазана практически не зависит от температуры среды его обитания. Исключение составляет величена удельной активности по БТХ, которая имеет тенденцию к возрастанию при понижении температуры среды. Для ХЭ карпа наблюдается аналогичная закономерность.

Изученные ХЭ, независимо от вида и температуры обитания, характеризуются сходной субстратной специфичностью: скорость гидролиза субстратов снижалась по мере увеличения длины их ацильного радикала - VA1-x > УПтх >

39

Vetx. В то же время при адаптации к более холодным условиям обитания для ХЭ сазана отмечается изменение зависимости относительных скоростей гидролиза (Vom, %): для ХЭ сазана, обитающего при 26 °С, отмечается соотношение скоростей гидролиза субстратов - VATx: V^rx: VETx = 100: 57: 4, а для ХЭ сазана, обитающего при 4 "С, - VATX: Vjmt: Vetx = 100:20: 7. Для ХЭ карпа изменение структуры субстратной специфичности наблюдается только для одного субстрата-БТХ.

Таблица 13

Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием ХЭ сазана и карпа

Параметры

Субстрат pS,M Voth, % рКт.М Vm/Km. мин 1

Сазан (лето)

АТХ 3,5 IOO 3,5 2,4

ПТХ 3,4 57 3,0 0,4

БТХ 3,4 4 3,3 0,005

Сазан (зима)

АТХ 4,0 100 4,7 24

ПТХ 3,2 20 5,0 9

БТХ 3,2 7 6,0 30

Карп (лето)

АТХ 3,2 too 3,7 1.9

гггх 3,1 15 3.1 0,07

БТХ 3,0 3 4,0 0,27

Карп (зима)

АТХ 3,5 100 3,7 1,9

ГГТХ 4,0 13 4,1 0,54

БТХ 4,0 6,0 3,7 0,2

Примечания. pKm = -IgfCm.

Выявленные изменения структуры субстратной специфичности более наглядно выражаются в изменении абсолютных значений максимальных скоростей гидролиза субстратов. Как видно из данных, представленных в табл. 13, для ХЭ сазана снижение температуры обитания сопровождается уменьшением значений величин Vm по АТХ в 1,75 раза, по ПТХ в 4,4 раза, а по БТХ в 8,3 раза. В то же время снижение температуры обитания карпа не влияет на скорость гидролиза АТХ и ПТХ под действием его ХЭ и приводит к увеличению (в 1,5 раза) скорости гидролиза БТХ.

Таким образом, из полученных данных видно, что по изменению скорости гидролиза субстратов под действием ХЭ мозга карп и сазан демонстрируют различные варианты механизмов биохимической адаптации к температуре обитания.

Поскольку изменение температуры сопровождается изменением скорости биохимических реакций, представляло интерес оценить влияние температуры на начальный этап ферментативного гидролиза - образование комплекса фермент-ли-ганд.

Установлено, что понижение температуры обитания для ХЭ сазана сопровождается уменьшением значений Кш на 1,5—2,0 порядка для всех трех субстратов, В то же время для ХЭ карпа понижение температуры обитания приводит к снижению на порядок величины Кт только для ПТХ.

Общая тенденция уменьшения значений константы Михаэлиса при понижении температуры свидетельствует о снижении способности модуляции активности фермента посредством изменения оптимальных концентраций субстрата для ХЭ сазана. Модуляция активности фермента посредством уменьшения оптимальных концентраций субстратов для ХЭ карпа приводит к тому, что значения величин Кт по АТХ и БТХ не изменяются в процессе адаптации к низким температурам.

Поскольку каталитический акт сопровождается информационными изменениями в молекуле фермента, то изменение температуры должно оказывать

на этот процесс модулирующее влияние. Мерой, связывающей скорость гидролиза субстратов и степень комплиментарности их структуры активной поверхности фермента, является величина сродства - Ут/Кт (рис. 10).

Рис, 10. Зависимость величины удельной активности ХЭ мозга карпа и сазана от кинетических параметров гидролиза субстратов: л — лето, э — зима

Саазн(п)

Для ХЭ сазана снижение температуры обитания приводит к увеличению с|юдства субстратов к ферменту. Причем степень изменения величины сродства дтя каждого субстрата была различной. Так, степень сродства для АТХ увеличилась на порядок, для ПТХ в 22,5 раза, а для БТХ в 600 раз. Несколько иную картину зависимости сродства субстратов к ферменту демонстрирует ХЭ карпа. Снижение температуры обитания этого вида не сказывается на величине сродства АТХ к ферменту, а в случае БТХ даже приводит к некоторому уменьшению этой величины. В то же время снижение температуры обитания, как и для ХЭ сазана, приводит к увеличению сродства ПТХ к ферменту в 7,7 раза.

Таким образом, на основании изучения субстратных характеристик ХЭ мозга сазана и карпа, аклимированных к различным температурам обитания (в зависимости от сезона), можно сделать вывод о конформацнонном механизме адаптации ХЭ у этих видов рыб.

ВЫВОДЫ

1. Впервые с использованием набора тиохолнновых эф л ров карбоновых кислот определена субстратная специфичность холинэстераз 45 видов морских организмов.

2. Методом субстратао-ингибиторного и хроматографического анализа показано, что нервная ткань кальмаров семейства Gonatidae гомогенна по холинэстеразной активности, нервная ткань некоторых видов рыб семейства камбаловых (темная камбала) и лососевых (горбуша, кета) содержит несколько ферментов.

3. На примере холинэстераз кальмаров, рыб и микроорганизмов обосновано применение метода субстратно-ингибиторного анализа в исследовании свойств холинэстераз и определении кон форм анионного механизма адаптации фермента.

4. На основании изучения свойств холинэстераз различных органов и тканей 45 видов гидробионтов показано, что наибольшей активностью фермента характеризуются: а) нервная ткань белухи среди морских млекопитающих, сельдевой акулы - у рыб, осьминога — у головоногих моллюсков, мохнато-рукого краба - у ракообразных; б) гемолимфа мохнаторукого краба среди ракообразных, анадары - у двустворчатых моллюсков.

5, Адаптация морских млекопитающих к нырянию реализуется по компенсаторному механизму, кратковременное пребывание в воде (на примере нерпы) приводит к выработке механизма поддержания высокой скорости гидролиза одного субстрата; при длительном нырянии (на примере белухи) высокая скорость холинэртаческих реакций обусловлена увеличением сродства к ферменту нескольких субстратов за счет уменьшения величины константы Михаэлиса,

6. Адаптация кальмаров разных семейств к условиям существования на биохимическом уровне реализуется через количественный механизм: удельная активность холинэстераз оптических ганглиев зависит от особенностей биологии вида. В пределах одного семейства (СопаНс1ае) стратегия биохимической адаптации определяется как количественная: значение удельной активности холинэстераз определяется уровнем специализации вида к условиям существования. Адаптация холинэстераз кальмара одного вида к различным условиям существования реализуется через конформационный механизм: каталитическая эффективность ферментативного катализа зависит от сродства субстратов к ферменту,

7, Основным механизмом стратегии биохимической адаптации холинэстераз рыб является поддержание удельной активности фермента (количественная стратегия) и зависит от особенностей биологии видов: а) у рыб с высоким уровнем тканевого метаболизма (лососевые, тресковые, сельдевые) сохранение уровня активности ферментов определяется высокими значениями величины сродства к ним субстратов; б) у донных видов рыб адаптация к гидростатическому давлению сопровождается повышением скорости гидролиза субстратов и уменьшением величины константы Михаэлиса; в) у скатов адаптация холинэстераз реализуется через конформационный механизм: активность ферментов определяется сродством к ним субстратов, у акул - через количественный механизм: низкое сродство субстратов к ферменту компенсируется увеличением его концентрации в нервной ткани.

8. На примере ракообразных показано, что стратегия биохимической адаптации холинэстераз крабов к условиям существования в различных органах и тканях неодинакова: а) в нервной ткани и ткани сердца реализуется конформационный механизм адаптации фермента — модуляция активности фермента обусловлена изменением величины сродства к нему субстратов; б) в ге-

молимфе реализуется количественный механизм - повышение гидростатического давления сопровождается снижением удельной активности фермента.

9. Адаптация холинэстераз гемолимфы двустворчатых моллюсков к условиям существования видов реализуется через конформационный механизм: эффективность ферментативного катализа определяется сродством субстратов к ферменту и скоростью их гидролиза при постоянных значениях константы Михаэли са.

10. Адаптация холинэстераз гемолимфы мидии к действию неблагоприятных факторов внешней среды имеет фазный характер: а) временный апвеллинг сопровождается резким снижением активности фермента и повышением значений константы Михаэлиса; б) адаптация к хроническому воздействию неблагоприятных факторов внешней среды компенсируется изменением значений величин оптимальных концентраций субстратов, необходимых для поддержания эффективного уровня холинэргического процесса; хроническое антропогенное воздействие характеризуется изменением структуры субстратной специфичности холинэстераз, а снижение каталитической эффективности холинэргического процесса компенсируется увеличением значений константы Михаэлиса.

11. Стратегия адаптации к температуре не зависит от таксономического ранга животного. Адаптация к низким температурам сопровождается изменением субстратной специфичности холинэстераз и увеличением сродства субстратов к ферментам. Методом субстратно-ингибиторного анализа показано, что адаптация холинэстераз микроорганизмов к низким температурам реализуется через конформационный механизм.

Основные положения диссертации отражены в публикациях;

1. 1,Эпшгейн Л,М, Акулнн В,НКовалев H.H. Современные принципы безотходной технологии переработки рыб и беспозвоночных // Тезисы докл. Всесоюз. совеш. «Исследование и рациональное использование биоресурсов дальневосточных и северных морей СССР и перспективы создания технических средств для освоения неиспользуемых биоресурсов открытого океана». Владивосток: ТИН ТО, 1985. С. 186-187.

2. Бреспсин А.П, Ковалев H.H., Роэенгарт ЕВ, и др, Субстратнсипнгнбчторная специфичность холинэстеразы нервной ткани командорского кальмара// Нейрохимия. 1986, № 3. С. 264-269,

3. Ковалев H.H., Розенгарт E.B., Хованских А.Е. Различие в свойствах холинэстеразы командорского кальмара из разных районов обитания // Тез. сообщ. Девятого Всесоюз. совет. по эволюционной физиологии. Л., 1986. С. 126-127.

4. Розенгарт В.И., Балашова Е.К., Бресткнн А.П„ Шерстобитов O.E., Морапев С.Н., Ковалев H.H. Сравнительная чувствительность холинэстераз разных животных {млекопитающих, членистоногих, моялюсков) к ацетиленовым фосфорорганическим соединениям // Тез. докл. 5-го Всесоюз. бнохнм, съезда. Киев, 1986. Т, 3, С. 175,

5. Ковалев H.H., Розенгарт Е.В. Взаимодействие обратимых ингибиторов с холинэстеразой кальмара Berryteuthis magfsier из разных районов Берингова моря И Журн. эволюц. био-хим. ифизиол. 1987.Т.23,№4. С. 548-550,

6. Мирза баев Э.А., Иминов М.Т., Ковалев H.H. н др. Холинэргическая активность трнал-килсульфониевьи ионов//ДАН УзССР. 1987, A'i 1, С, 39-41,

7. Элштейн J1.M., Шевцов Г.А., Ковалев H.H., Розенгарт Е.В. Субстратная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров как показатель ценности сырья I! Технология гидробионтов. Владивосток: ТИНРО, 1987. С. 37-46.

8. Ковалев H.H., Розенгарт Е.В., Хованских А.Е и др. Ингибиторная специфичность холи-юстеразы зрительных ганглиев командорского и тихоокеанского кальмаров Н Технология гидробионтов. Владивосток: ТИНРО, 1987, С, 46-54.

9. Ковалев H.H., Розенгарт Е.В,, Абдувахабов А,А, К механизму обратимого торможения холинэстераз тионфосфонатами // Изв, АН СССР. Сер, биол. 1988. № 6, С. 926-928.

10. Возный И В., Ковалев H.H., Кузнецов ЫА. и др. 1-Фталемкдоазимины - электронейтральные обратимые ингибиторы холинэстераз, содержащие полиазотистую 1,3-днполяриую группировку// ДАН СССР, 1988. Т. 299, №4. С, 1012-1015,

П. Розенгарт Е.В,, Виияр Т.Н., Ковалев H.H., Хованских А.Е. Специфичность взаимодействия холинэстераз дальневосточных кальмаров и некоторых позвоночных с обратимыми ингибиторами//Журн. эволюц. Бшхим. и физнол, 1988. Т, 24, № 5. С. 679-685.

12. Абдувахабов A.A., Верба Г.Г., Мнрзабаев Э.А., Иминов М.Т., Ковалев H.H. и да. Сравнительное исследование холинэргнческой активности алкнлиро ванных сульфониевых и аммониевых ионов!! Химико-фармацевтический журнал. 1988. № 8, С. 966-969.

13. Ковалев H.H. Чувствительность холинэстераз командорского кальмара к гетероциклическим обратимым ингибиторам // Тез. докл. конф. молод, ученых "Оценка и освоение биологических ресурсов океана". Владивосток: ТИНРО, 1988. С. 54-55.

14. Ковалев H.H., Розенгарт Е.В. Свойства холинэстераз командорского кальмара из разных частей видового ареала // Тез. докл. Всесоюз. совещ. «Биологически активные вещества шдро-бионгов при комплексной утилизации ресурсов океана». Владивосток: ТИНРО, 1988. С. 27-29.

15. Розенгарт ЕВ,, Ковалев H.H., Хованских А.Е. н др. Силатраны - обратимые ингибиторы холинэстераз//Химико-фармацевтический журнал. 1989. №2. С. 170-172.

16. Хакимов Ю.Р., Исраилов Д.И., Ковалев H.H. и др. Алкалоидные и гетероциклические производные - обратимые ингибиторы холинэстераз // Структура и функции химии природных и физиологически активных соединений. Нукус, 1990. С, 68-71.

17. Ковалев H.H., Розенгарт ЕВ., Хакимов Ю.Р. и др. Обратимое торможение гетероциклическими и алкалоидными производными холинэстераз командорского кальмара из разных зон обитания // Структура и функции химии природных и физиологически активных соединений. Нукус, 1990, С. 72-77.

18. Розенгарт Е.В., Вквяр Т.Н., Ковалев H.H. и др. Новые элемеиторганнческне ониевые обратимые ингибиторы холинэстераз // Химия и применение элементоргаиическях соединений, Л., 1990. С. 92-97.

19. Ковалев H.H., Эпштейн Л.М,, Федорец Ю.А. и др. Способ определения популяционной принадлежности командорских кальмаров: A.c. № 1535503 от 15.01.1990. Бюл. изобретений. 1990, №3, С, 19,

20. Розенгарт Б.В., Ковалев H.H., Федорец Ю.А. и др. Обратимые ингибиторы холинэстсразы зрительных ганглиев командорского кальмара: сидатра новые производные элементорга-ннчесюн соединений //Нейролимия, 1991,Т. 10, № 1. С. 32-37.

21. Эпштейн Л.М., Аюшин Н.Б., Боровская Г.А., Касьлненко Ю.И., Ковалев H.H. и др. Изучение биологически активных веществ гидробионтов Тихоокеанского бассейна // Тез. докл, Меадунар, конф. Технология переработки гидробионтов". М.: Изд-во ВНИРО,

1994. С, 97-99.

22. Розенгарт ЕВ., Державин Д.К., Ковалев H.H. и др. Видовые различия в субстратной специфичности холинэстераз дальневосточных кальмаров семейства Gonatidae // Докл. РАН.

1995. Т. 342, № 5. С. 703-704.

23. Розенгарт Е.В., Шестакова H.H., Хованских А.Е., Прокатор С.О., Ковалев H.H., Эпштейн Л.М. Взаимодействие кремпийорганических бнсаммониевых соединений с холинэстера-зами дальневосточных кальмаров и некоторых позвоночных. Сравнительно-этимологические, кинетические и конформационные аспекты // Журн. эволюц, биохим, ифизиол. 1995. Т. 31, №5-6. С. 546-555.

24. Розенгарт Е.В., Шестакова H.H., Прокатор С.О., Хованских А.Е., Ковалев H.H., Эпштейн Л.М. Взаимодействие производных гексаметония с холинэстеразами некоторых позвоночных и беспозвоночных. Физико-химические н конформационные аспекты // Журн. эволюц. фтиол, и биохим. 1991 Т. 31,№ 4. С. 387-394.

2f. Kovalev N.N, Systematica of the family Gonaddae {Cephalopoda; Teuthoidea ): A biochemical approach //Twelfth International Malakological Congress, Vigo, Spain, 1995. P. 353.

26. Ковалев H.H. Холинэстеразы головоногих моллюсков: выделение и практическое применение // Материалы юбилейной конференции «Ры (^хозяйственные исследования океана». Владивосток: Дальрыбвтуз, 1996. С. 12-13.

27. Розенгарт ЕВ., Суворов A.A., Хованских А.Е., Ковалев H.H., Эпштейн Л. М. Енслупи-ниновые производные - обратимые ингибиторы холинэстераз // Хнмико-фармацевтический журнал, 1996. Т. 30, № 8. С, 20-21.

2ii, Розенгарт Е В., Басова Н.Е., Хованских А.Е., Ковалев H.H., Эпштейн Л.М. Взаимодействие холинэстеразы особей командорского кальмара Berryteuthis magister из разных зон

ареала обитания с ониеаыми обратимыми ингибиторами // Жури, эволюц. биохим. и фи-зиол. 1997. Т. 33, № 3. С. 371-382.

29. Бузолева J1.C,, Ковалев Н.Н,, Сомов Г.П. Конформационный механизм адаптации Yersinia pseudotuberculosis к низкой температуре окружающей среды // Тез, докл. 3-й науч.-практ. конф. «Инфекционная патология в Приморском крае». Новосибирск, 1999, С. 6-7.

30. Сомов Г.Г),, Зайцева Е.А., Бузолева Л.С., Терехова В.Е., Ковалев Н.Н. Мировой океан как среда обитания патогенных бактерий И Тез. докл, 3-Й науч.-практ, конф. «Инфекционная патология в Приморском краев. Новосибирск, 1999. С. 22-23.

31. Розенгарт Е.В., Ковалев Н.Н., Басова Н.Е., Эпштейн J1.M. Ингибиторная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров семейства Gonalidae // Докл. РАН, 2000, Т, 370, №5. С. 693-695.

32. Розенгарт Е.В., Ковалев Н.Н., Эпштейн Л.М. и др. Изменения в субстратно-ингибиторной специфичности холинэстеразы псевдотуберкулезного микроба Yersenia pseudotuberculosis как показатель температурной адаптации И Докл. РАН, 2001. Т. 378, Кг 1. С. 111-113.

33. Ковалев Н.Н., Чепкасова А.И. Холинэстеразы нервной ткани некоторых видов рыб // Изв. ТИНРО. 2001, Т. 129, С. 82-85.

34. Ковалев Н.Н. Холинэстеразы двустворчатых моллюсков // Изв. ТИНРО. 2003. Т. 133. С. 264- 270.

35. Михеев Е.В., Ковалев Н.Н. Холинэстеразы мозга рыб семейства камбаловых — индикатор загрязнения акваторий фосфорорганическими соединениями // Тез. докл. Между нар. конф. «Рациональное природопользование и управление морскими биоресурсами: экоси-стемный подход». Владивосток: ТИНРО, 2003. С. 144-145.

36. Ковалев Н.Н., Кавун К.В, Температурные адаптации холинэстераз мозга сазана И Тез. докл. Межцуиар. конф. «Рациональное природопользование и управление морскими биоресурсами: экосистемный подход». Владивосток: ТИНРО, 2003. С. 234-235.

37. Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Чепкасова А.И. Холинэсгеразная активность мозга тихоокеанских лососевых рыб семейства Salmonidae. Субстратно-ингибнторная специфичность // Докл. РАН. 2003. Т. 390, № 2. С. 260-263.

38. Ковалев Н.Н., Розенгарт RB., Михеев Е.В. Холинэстеразная активность ткани головного мозга особей северотмхоокеансккх камбал, принадлежащий к разным видам и родам семейства Pteu-ronectidae. Субстратная специфичность//Докл, РАН, 2003.Т. 391, № 4. С, 553-555,

39. Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Чепкасова А.И. Субстратная специфичность холинэстераз-ной активности ткани головного мозга особей различных популяций морской тихоокеанской сельди Clupea pallasi Val. И Докл. РАН. 2003, Т. 392, № 3. С, 402-405.

Подписано в печать I5.1Z.2D03 г. Формат 60*90/16. Уч.-иадл, 2. Тираж 100. Заказ №26. Типография ТННРО-Центра

flu-

I. - 11 5

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ковалев, Николай Николаевич

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Основные принципы адаптации биологических систем.

1.2. Структура и функция холинэстераз.

1.3. Молекулярные формы холинэстераз

1.4. Холинэстеразы гидробионтов.

1.5. Характеристика района обитания объектов исследования.

2. Материалы и методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы определения кинетических констант ферментативного гидролиза

2.3. Метод определения константы необратимого действия фосфор-органических ингибиторов

2.4. Метод определения констант обратимого ингибирования

2.5. Гель-хроматография холинэстераз.

2.6. Статистическая обработка результатов.

3. Холинэстеразы мозга млекопитающих. Адаптация к нырянию.

4. Адаптация к локомоции

4.1. Холинэстеразы мозга лососевых.

4.2. Холинэстеразы мозга тресковых.

4.3. Холинэстеразы мозга тихоокеанской сельди.

5. Адаптация к гидростатическому давлению. Холинэстеразы мозга донных видов рыб

6. Механизмы адаптации эволюциоино древних видов. Холинэстеразы мозга хрящевых и костистых рыб

7. Адаптация к условиям существования

7.1. Холинэстеразы кальмаров семейства Ommastrcphidae.

7.2. Холинэстеразы тихоокеанских головоногих моллюсков

7.2.1. Холинэстеразы кальмаров семейства Gonatidae.

7.2.2. Холинэстеразы командорского кальмара. Механизмы внутривидовой адаптации.

7.3. Адаптация холинэстераз ракообразных

7.4. Адаптация холинэстераз гемолимфы двустворчатых моллюсков . 200 8. Адаптация к температуре.

8.1. Холинэстеразы микроорганизмов.

8.2. Холинэстеразы мозга рыб семейства карповых

Введение Диссертация по биологии, на тему "Холинэстеразы - биохимические механизмы адаптации гидробионтов"

Адаптация - одно из наиболее общих и широко применяемых биологических ионятий. Именно благодаря своей широте и многоплановости проблема адаптации утратила четкие границы. Между тем общие закономерности адаптивных процессов, очевидно есть.

Построение общей теории адаптации потребует установления общих закономерностей адаптивных процессов на всех уровнях биологической организации. Если такие закономерности будут установлены, то пути становления и развития биологической организации получат новое освещение, расширятся возможности прогнозирования эволюции отдельных видов и экосистем.

Формы адаптаций, как биологического явления, многообразны, как и многообразны подходы к ее изучению. В современной биологии накоплено огромное количество материала, посвященного описанию адаптаций организмов к различным условиям обитания. Как правило, проблема адаптации решается методами классической, «описательной», биологии. Между тем любые изменения физиологии и морфологии организмов имеют биохимическую основу, а биохимические адаптации не менее разнообразны, чем внешние адаптивные признаки.

Известны работы по проблемам стратегии биохимической адаптации (Хочачка, Самеро, 1977, 1988), посвященные оценке влияния отдельных факторов среды в постановочных опытах (температура, рН, осмотическое давление и т.д.) на конкретные ферменты обмена и дыхания. Выбор биохимических объектов для экологических исследований не всегда оправдан, так как их свойства могут зависеть от физиологического состояния животного.

Другим направлением в современных экологических исследованиях являются работы, посвященные оценке влияния ухудшающихся условий существования на функционирование живых систем. Использование при этом биохимических маркеров (глутатион, мсталлотсонеины, каратиноиды, ферменты углеводного обмена и т.д.) позволяет оценить степень клеточного повреждения под влиянием неблагоприятных факторов среды (Лукьянова, 2001).

Современный уровень развития естествознания убедительно доказывает, что в основе всех приспособительных изменений биологических систем лежат молекулярные процессы (Davies, Kratzer, 1996). В первую очередь на флюктуации параметров внешней среды реагируют ферменты. Особое место среди ферментов занимают холинэстеразы (ХЭ), которые по важности выполняемых ими функций относятся к конститутивным ферментам, а их свойства не зависят от физиологического состояния особи (Ленинджер, 1976; Эпштейн, 1992). В связи с ключевой ролью холинэстераз в процессе передачи нервного импульса модуляция активности фермента под действием различных соединений издавна является предметом исследования фармакологов, токсикологов, биохимиков. Однако работы, посвященные холинэстера-зам гидробионтов, касаются в основном свойств фермента некоторых видов головоногих моллюсков и ограниченного количества рыб (Бресткин и др., 1997). В последние годы активно развивается направление использования холинэстераз при оценке степени загрязнения среды обитания гидробионтов пестицидами (Caraville, 2000), фосфорорганическими соединениями (Рауепе et al., 1996) и солями тяжелых металлов (Somero, 1997). В то же время до настоящего исследования проблема определения механизмов биохимической адаптации холинэстераз гидробионтов не исследовалась.

В связи с указанным комплексное исследование свойств холинэстераз гидробионтов (субстратной специфичности, субстратно-ингибиторных свойств и хроматографических характеристик) различных таксономических рангов (млекопитающих, рыб, беспозвоночных) является актуальным. Установление закономерностей свойств холинэстераз от таксономического положения и среды обитания животного представляет интерес для науки и позволяет определить стратегию биохимической адаптации холинэргических систем у гидробионтов.

Целью исследования — комплексное изучение свойств холинэстераз и использование кинетических характеристик ферментативного катализа для определения стратегии биохимической адаптации у гидробионтов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Экология", Ковалев, Николай Николаевич

245 ВЫВОДЫ

1. Впервые с использованием набора тиохолиновых эфиров карбоновых кислот определена субстратная специфичность холинэстераз 45 видов морских организмов.

2. Методом субстратно-ингибиторного и хроматографического анализа показано, что нервная ткань кальмаров сем. Gonatidae - гомогенна по холинэстеразной активности, нервная ткань некоторых видов рыб семейства камбаловых (темная камбала) и лососевых (горбуша, кета) со* держит несколько ферментов.

3. На примере холинэстераз кальмаров, рыб и микроорганизмов обосновано применение метода субстратно-ингибиторного анализа в исследовании свойств холинэстераз и определении конформационного механизма адаптации фермента.

4. На основании изучения свойств холинэстераз различных органов и тканей 45 видов гидробионтов показано, что наибольшей активностью фермента характеризуются: а) нервная ткань морских млекопитающих - белуха, рыб - сельдевая акула, головоногих моллюсков - осьминог, крабов — мохнаторукий краб; б) в гемолимфе крабов — мохнаторукий краб, двустворчатых моллюсков - анадара.

5. Адаптация морских млекопитающих к нырянию реализуется по компенсаторному механизму: кратковременное пребывание в воде (на примере нерпы) приводит к выработке механизма поддержания высокой скорости гидролиза одного субстрата; при длительном нырянии (на примере белухи) высокая скорость холинэргических реакций обусловлена увеличением сродства к ферменту нескольких субстратов, за счет уменьшения величины константы Михаэлиса.

6. Адаптация кальмаров разных семейств к условиям существования, на биохимическом уровне реализуется через количественный механизм: удельная активность холинэстераз оптических ганглиев зависит от особенностей биологии вида. В пределах одного семейства (Gonatidae) стратегия биохимической адаптации определяется как количественная - значение удельной активности холинэстераз определяется уровнем специализации вида к условиям существования. Адаптация холинэстераз кальмара одного вида к различным условиям существования реализуется через конформационный механизм: каталитическая эффективность ферментативного катализа зависит от сродства субстратов к ферменту.

7. Основным направлением стратегии биохимической адаптации холинэстераз рыб является поддержание удельной активности фермента (количественная стратегия), которая зависит от особенностей биологии видов: а) у рыб с высоким уровнем тканевого метаболизма (лососевые, тресковые, сельдевые виды рыб) сохранение уровня активности ферментов определяется высокими значениями величины сродства к ним субстратов; б) у донных видов рыб адаптация к гидростатическому давлению сопровождается повышением скорости гидролиза субстратов и уменьшением величины константы Михаэлиса; в) у скатов адаптация холинэстераз реализуется через конформационный механизм — активность ферментов определяется сродством к ним субстратов, у акул — через количественный механизм: низкое сродство субстратов к ферменту компенсируется увеличением его концентрации в нервной ткани.

8. На примере ракообразных показано, что стратегия биохимической адаптации холинэстераз крабов к условиям существования в различных органах и тканях неодинакова: а) в нервной ткани и ткани сердца реализуется конформационный механизм адаптации фермента — модуляция активности фермента обусловлена изменением величины сродства к нему субстратов; б) в гемолимфе крабов реализуется количественный механизм - повышение гидростатического давления сопровождается снижением удельной активности фермента.

9. Адаптация холинэстераз гемолимфы двустворчатых моллюсков к условиям существования видов реализуется через конформационный механизм - эффективность ферментативного катализа определяется сродством субстратов к ферменту и скоростью их гидролиза при постоянных значениях константы Михаэлиса.

10. Адаптация холинэстераз гемолимфы мидии к действию неблагоприятных факторов внешней среды имеет фазный характер: а) временный апвсллинг сопровождается резким снижением активности фермента и повышением значений константы Михаэлиса; б) адаптация к хроническому воздействию неблагоприятных факторов внешней среды компенсируется изменением значений величин оптимальных концентраций субстратов необходимых для поддержания эффективного уровня холинэргического процесса; хроническое антропогенное воздействие характеризуется изменением структуры субстратной специфичности холинэстераз, а снижение каталитической эффективности холинэргического процесса компенсируется увеличением значений константы Михаэлиса.

11. Стратегия адаптации к температуре не зависит от таксономического ранга животного. Адаптация к низким температурам сопровождается изменением субстратной специфичности холинэстераз и увеличением сродства субстратов к ферментам. Методом субстратно-ингибиторного анализа показано, что адаптация холинэстераз микроорганизмов к низким температурам реализуется через конформационный механизм.

248

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение адаптационных процессов привело к накоплению огромного количества данных о феноменологии и механизмах приспособлений к отдельным экологическим факторам и различным типам природной среды на разных уровнях организации: от молекулярно-биологического и биохимического до биоценотического и экосистемно-го (Тимофеев-Ресовский и др., 1977; Хочачка, Самеро, 1988; Озернюк, 2000; Озернюк, Нечаев, 2002). Подобный интерес к данной проблеме связан прежде всего с тем, что способность к адаптации рассматривается как одно из основных свойств живых систем на всех уровнях организации. Классификация адаптаций была осуществлена Платэ (Plate, 1913). Огромное количество исследований адаптационных процессов привело к необходимости приведения в единую систему подходов к иерархии адаптационных механизмов, фазности процессов приспособления, продолжительности воздействия различных экологических факторов и анализу адаптационных механизмов (Шкорбатов, 1982).

Общепринятое деление адаптаций на фенотипичсскис и генотипи-ческие реализуется при помощи нескольких конкретных биохимических и молскулярно-генетических процессов. Эти процессы можно рассматривать как элементарные адаптационные механизмы, лежащие в основе всей последующей иерархии адаптаций. Биохимические или метаболи-тические адаптации проявляются в изменении скорости физиологических и обменных процессов, напрямую не связанных с экспрессией генов. Можно выделить несколько механизмов реализации биохимических адаптаций: изменение скорости биосинтеза и деградации белков, взаимодействие белков с лигандами и изменение вязкости мембранных ли-пидов, влияющее на скорость мстаболитических процессов.

Особый интерес вызывает фенотипичсский механизм реагирования пойкилотермных животных на изменение температуры среды, связанный с синтезом новых ферментов. Этот механизм был установлен, в частности, для ацетилхолинэстеразы из мозга радужной форели (Baldwin, Hochachka, 1970), эстсраз из печени зеленого солнечника Le-pomis cyanellus (Shakelee et al., 1977), цитоплазматичсской формы ма-латдегидрогеназы гиллихта Gillichthys mirabilis (Somero, 1995), Ca++-зависимой миозиновой АТФазы карпа Cyprinus carpio (Hwang et al., 1990). Данный механизм адаптации протекает по тину «экспрессия новых генов», хотя формально речь идет об экспрессии новых белков (изоформ).

Хорошо известна роль холинэстераз в обеспечении процесса нервной проводимости. Холинэстеразы относятся к типу ферментов, количественные и качественные характеристики которого не зависят от физиологического состояния особи. Такие ферменты относят к типу конститутивных. Именно это свойство холинэстераз позволило использовать его характеристики в целях разработки биохимических подходов систематики некоторых видов головоногих моллюсков (Шевцова, 1983; Ковалев, 1991).

Известно, что теснейшее взаимоотношение между организмом и средой обитания осуществляется через нервную систему (Орбсли, 1979). Развитие в становлении более прогрессивной жизненной формы должно сопровождаться изменением скорости нервных процессов, в частности скорости синаптического проведения импульсов, т.е. совершенствованием их медиаторных систем. Зрительные ганглии головоногих являются наиболее массивными нервными образованиями, не только обеспечивающими зрительную функцию, но и являющимися высшими интегральными центрами их поведенческих реакций и локомоций. Система передачи нервного импульса в зрительных ганглиях является практически чисто холинэргичсской, в них обнаружены большое количество аце-тилхолина и высокая активность холинэстеразы.

Основным направлением прогрессивной эволюции кальмаров является формирование организации активного нектера — пловца поверхностных вод океана. Эта жизненная форма кальмаров характеризуется мощной мускулатурой, активным хищническим образом жизни, высокой интенсивностью обмена, сложным поведением. Прогресс организации океанических кальмаров происходил в тесной связи с изменениями экологии видов, их постепенным перемещением от прибрежных шельфо-вых зон в открытый океан (Зуев, Несис, 1971; Несис, 1973а; Нигматулин, 1979). Однако в пределах каждого семейства головоногих встречаются относительно примитивные, более развитые и высокоорганизованные виды.

Анализ собственных и литературных данных о способности холи-нэстсраз различных видов головоногих моллюсков катализировать гидролиз разных субстратов, их чувствительности к необратимым фосфо-рорганическим ингибиторам и ингибиторам обратимого типа действия позволил выявить закономерности адаптации их холинэргических систем. Характерной чертой холинэстераз головоногих моллюсков является широкая субстратная специфичность - способность фермента катализировать большой набор различных по структуре субстратов. Проявление каталитической активности ферментов в большей степени определяется значениями величины максимальной скорости гидролиза (Vm) и его удельной активностью (концентрацией фермента в нервной ткани). Увеличение удельной активности ферментов и скорости протекания каталитических процессов является тем механизмом адаптации ферментов, которые способствовали выработке жизненной формы - «кальмар - хищник глубин».

На основании анализа экологии оммастрсфид и филогенетических отношений внутри семейства выделены главные этапы его прогрессин-ной эволюции, которые представлены тремя подсемействами - Ommas-trephinae, Todarodinae и Illicinae. Эти этапы включают постепенное усложнение организации видов, увеличение их подвижности и жизненной энергии в связи с переходом из прибрежных зон к более активному образу жизни в открытом океане. У кальмаров представленных подсемейств выработалась принципиально сходная стратегия адаптации ферментов нервной ткани к иному образу жизни. В данном случае характерным для всех головоногих является количественный механизм биохимической адаптации. Нервная ткань кальмаров семейства оммастре-фид характеризуется наивысшей (среди кальмаров) концентрацией фермента. Кроме того, осуществление более сложных физиологических реакций приводит к повышению сродства (Vm/Km) субстратов к ферменту. Следует отметить, что проведенное сравнение свойств холинэстераз кальмара О. Bartrami, выловленного в районе Курильских островов (север Тихого океана) и в южной части Тихого океана (Новая Зеландия), демонстрирует нам еще один пример количественного механизма адаптации. Холинэстеразы зрительных ганглиев кальмаров из южного района характеризуются более низкими значениями величин удельной активности, но более высокими значениями величин Km, по сравнению с представителями того же вида, обитающими в северных широтах. Представленные данные однозначно свидетельствуют об адаптивных изменениях ферментов, направленных на компенсацию температурных эффектов сдвигами каталитической эффективности. Поскольку топография активных центров ферментов одного вида обычно одинакова, то механизм адаптации холинэстераз связан с их способностью менять конфор-мацию молекулы в процессе катализа.

Гибкость структуры фермента является обязательным условием обеспечения связывания лиганда, так как каталитическая эффективность энзимов может лимитироваться структурными факторами. Эти два процесса (конформационная гибкость молекулы фермента и образование фермент-субстратного комплекса) имеет большее значение для эволюции ферментов, чем достижение максимально возможных значений Vm (Хочачка, Самеро, 1988).

Исследование свойств холинэстераз кальмара Todarodes angolansis (сем. Ommastrephidae) из двух районов обитания (Новая Зеландия и юг Атлантического океана), характеризующихся приблизительно сходными условиями обитания (в первую очередь схожесть температурного фона), показывает, что определяющими показателями адаптации ферментов являются значения величин сродства фермента к субстратам (Vm/Km) и значение величины его удельной активности. По-видимому, обитание животных в экологически равных условиях формирует иной механизм адаптации ферментов: увеличение концентрации фермента и зависимость эффективности ферментативного катализа от стадии сорбции субстрата — стратегия адаптации холинэстераз южных форм кальмаров.

Обнаруженные нами изменения величин кинетических параметров для холинэстераз зрительных ганглиев в ряду исследованных видов хорошо коррелируют с общим уровнем организации последних. Увеличение активности холинэстераз и сродства к субстрату в процессе адаптации кальмаров сем. Ommastrephidae указывает на то, что фермент, как важный компонент синаптической передачи нервного импульса, играет адаптивную роль при переходе видов к более подвижному образу жизни в условиях открытого океана.

Кальмары сем. Gonatidae широко распространены в северной части Тихого и Северного Ледовитого океанов. Именно в северной Паци-фике находится центр таксономического разнообразия гонатид. Кальмары этого семейства хорошо приспособились к холодным водам северо-бореальных районов. Гонатиды эволюционно более примитивны, чем оммастрефиды: их жизненный цикл связан с шельфом и склоном; совершаемые ими миграции носят в основном батичсский характер; ткани, особенно мантийные, насыщены водой, что существенно затрудняет быстроту движений; дряблые мышечные ткани и большой размер печени значительно уменьшают удельный все и способствуют повышению пассивной плавучести.

Следует отмстить, что холинэстеразы оптических ганглиев кальмаров сем. Gonatidae характеризуются наименьшим значением величины удельной активности среди других исследованных видов кальмаров. Тем не менее стратегия биохимической адаптации кальмаров этого семейства в первую очередь связана именно с концентрацией фермента в нервной ткани (его удельной активности) и скоростью проявления каталитического процесса (Vm). Скорость протекания холинэргической реакции для гонатид практически не зависит от сродства субстратов к ферменту (Vm/Km), что находит свое отражение в слабо выраженной субстратной специфичности ферментов. С потерей способности двигаться быстрыми рывками кальмарам стали особенно нужны высокая маневренность и возможность дотянуться до ускользающей добычи. На морфологическом уровне это привело к образованию ромбического плавника и щупальца в форме багра. На биохимическом уровне процесс адаптации, направленный на увеличение удельной активности ферментов, приводит к зависимости Vm от величины Km. Для восполнения энергетических затрат кальмарам требуется временное проявление физической активности, обеспечить которую фермент может только в пределах физиологических значений концентраций субстрата. Показателем физиологических значений pSoiiT в определенной мере является величина Km.

Проведенный субстратно-игибиторный анализ холинэстераз опи-ческих ганглиев кальмаров семейства гонатид показал, что в нервной ткани кальмаров содержится один фермент. Выявленные межвидовые различия в чувствительности ферментов к действию фосфорорганиче-ских необратимых ингибиторов, свидетельствуют различной организации эстеразного пункта активной поверхности ферментов, о возможных различиях конформационных способностей ферментов в процессе их адаптации.

Следует также отмстить, что ферменты кальмаров трех родов (Berryteuthis, Gonatus, Gonatopsis) независимо от таксономического уровня и степени специализации характеризуются принципиально сходной стратегией биохимической адаптации.

Таким образом, стратегия биохимической адаптации холинэстераз на уровне кальмаров семейства гонатид реализуется на количественном уровне (концентрация фермента в нервной ткани) и качественном - способности поддерживать величину Km для субстратов в пределах, соответствующих нужной эффективности катализа.

Проведенные исследования свойств холинэстераз типичного представителя сем. Gonatidae кальмара Berryteuthis magister из разных, значительно удаленных друг от друга районов видового ареала (олюторско-наваринский, прибыловско-аляскинский, центральные Курильские острова) показали идентичность субстратных характеристик ферментов. Также не были выявлены различия в чувствительности холинэстераз к действию 18 разных по структуре фосфорорганических ингибиторов (Ковалев, 1991). Поскольку местом сорбции субстратов и необратимых фосфорорганических ингибиторов на активной поверхности фермента является его эстеразный пункт, можно выдвинуть предположение о его одинаковой организации у холинэстераз командорского кальмара из разных частей видового ареала.

Анализ данных по кинетике обратимого торможения активности холинэстераз командорского кальмара из разный частей видового ареала (олюторско-наваринский, шельф и склон Олюторского залива, прибыловско-аляскинский, северные и центральные Курильские острова, Японское морс) под действием 57 ониевых обратимых ингибиторов различной структуры позволил выявить ряд эффекторов, специфически тормозивших активность фермента кальмара из определенного района.

Причем выявленные различия носили как количественный, по величине констант обратимого торможения, так и качественный, но типу торможения, характер. Поскольку местом сорбции обратимых ингибиторов на активной поверхности холинэстераз является анионный пункт фермента, можно предположить, что эффективность тормозящего действия эффекторов определяется способностью фермента к изменению конформации. Так как определяющим типом взаимодействий при сорбции обратимых ингибиторов являются гидрофобные, то процесс образования фермент-ингибиторного комплекса неизбежно должен сопровождаться изменением конформации холинэстераз. Вклад гидрофобных взаимодействий в стабилизацию третичной и четвертичной структуры белков весьма значителен: в случае третичной структуры на их долю приходится, по-видимому, более половины стабилизирующей силы. Гидрофобные реакции играют ключевую роль в агрегации субъединиц многомерных белков.

Проведенный - субстратно-ингибиторный анализ холинэстераз ганглиев командорского кальмара, обитающего в различных условиях, позволяет предположить принципиально одинаковую структурную организацию ферментов нервной ткани. Биохимический механизм адаптации фермента к различным условиям обитания вида носит компенсаторный характер и объясняется способностью белковой молекулы к кон-формационным изменения, необходимым для проявления физиологической функции.

Как отмечалось выше, основным направлением адаптивной стратегии холинэстераз нервной ткани океанических кальмаров является сохранение постоянства Km. Возникает вопрос: какие механизмы биохимической адаптации включаются у океанических рыб, которые в течение жизненного цикла совершают значительные миграции, подвергаясь воздействию постоянно меняющихся факторов окружающей среды?

Для ответа на этот вопрос нами исследованы свойства холинэстераз мозга лососевых (7 видов), тресковых (2 вида) и сельди.

Особенности биологии лососевых позволяют характеризовать этот вид рыб как высокоорганизованных и высокоспециализированных животных. Такие черты биологии, как выраженность путей миграции, хоминг, построение и защита нерестовых гнезд, подразумевают наличие холинэргических механизмов регуляции сложного поведения. Как уже отмечалось, холинэстеразы исследованных лососевых рыб значительно различались по величинам значений удельной активности. Например, удельная активность фермента в мозге семги была в 20 раз ниже, чем в мозге кижуча. Однако из всех экспериментально определенных кинетических параметров гидролиза субстратов наибольшее значение в стратегии биохимической адаптации имеют сродство субстрата к ферменту (Vm/Km) и концентрация фермента в нервной ткани. По-видимому, биохимическая стратегия адаптации к активному плаванию и формированию жизненной формы хищника сопровождается изменением количества фермента в ткани и его сродства к субстрату, так как стратегия увеличения количества медиатора для повышения эффективности холинэрги-ческого процесса, может иметь катастрофические последствия для животного. По-видимому, именно этим объясняется довольно высокие значения величин Km и гетерогенность холинэстсразной активности нервной ткани некоторых видов лососевых (горбуша, кета). Высокая же специализация фермента к гидролизу одного типа субстрата, как у чавычи, приводит к уменьшению величины удельной активности.

Для минтая, как характерного представителя семейства тресковых тихоокеанского бассейна, достаточно полно описана функциональная структура ареалов обитания, поиуляциопная структура и основные черты биологии (Шунтов и др., 1993).

Исследование свойств холинэстераз минтая из разных районов обитания (Охотскос и Берингово море, северные Курильские острова) позволило выявить существенные различия в кинетических параметрах гидролиза субстратов. Наибольшие различия по величинам удельной активности и сродства субстратов к ферменту выявлены для холинэстераз мозга охотоморского и беринговоморского минтая. В то же время определяющими критериями адаптации к обитанию минтая в районе Курильских островов являются скорость гидролиза субстратов (Vm) и величина Km. По-видимому, способность холинэстеразы мозга минтая из района Курильских островов проявлять достаточный уровень активности при невысоких концентрациях субстрата является определяющим для выживания вида в данных экологических условиях.

Суммируя данные, полученные при анализе свойств холинэстераз минтая из разных районов обитания и свойств холинэстеразы трески, можно прийти к заключению, что адаптация холинэстераз тресковых видов рыб тихоокеанского бассейна определяется способностью фермента поддерживать значения Km в пределах, способствующих проявлению активности холинэстераз при физиологических значениях субстрата.

Аналогичную тресковым видам рыб стратегию ферментативной адаптации демонстрируют и холинэстеразы мозга тихоокеанской сельди. Однако данная стратегия в полной мере реализуется только для фермента олюторской сельди и сельди, выловленной в Татарском проливе. В то время как определяющими факторами адаптации для холинэстеразы охотоморской сельди, является удельная активность фермента и концентрация субстратов, необходимая для ее максимального проявления.

На обитателей донных сообществ одновременно влияют факторы разного рода - физические, химические и биологические, оказывающие комбинированное влияние. Основными факторами, оказывающими влияние на организацию биохимических систем, являются - гидростатическое давление и температура. Считается, что влияние гидростатического давления на биохимические процессы осуществляется через измепение объема молекулы фермента. Уменьшение объема молекулы фермента происходит за счет изменения количества связанной (структурированной) воды. При каталитических конформационных изменениях могут происходить реакции гидратации, благодаря которым катализ становится чувствительным к давлению.

П.Хочачка и Д.Самсро (1988) отмечают, что в метаболитическом отношении глубоководные рыбы характеризуются более низкой эффективностью ферментов. Проведенные нами исследования свойств холинэстераз мозга камбаловых свидетельствуют об обратном. Так, средняя величина значения удельной активности фермента для рыб семейства камбаловых выше таковой для лососевых, тресковых и сельдевых видов рыб. Еще более значительные различия отмечаются ио величинам скорости гидролиза субстратов и их сродства к ферменту.

Как отмечалось выше, одной из ключевых кинетических характеристик ферментов, «чувствительных» к изменяющимся факторам окружающей среды, является величина Km. При сравнении средних значений величин Km для пелагических и донных видов рыб видно, что величина константы Михаэлиса для рыб семейства камбаловых на порядок ниже. Смещение величины константы Km в сторону меньших значений, а следовательно, и уменьшение концентрации субстрата, при которой скорость ферментативного процесса равна половине максимальной, способствует максимальному проявлению каталитической эффективности.

Таким образом, основным направлением в адаптации холинэстераз донных видов рыб является сохранение низких значений Km, при которых скорость протекания холинэргических процессов соответствует проявлению важных физиологических процессов.

Являются ли выявленные типы адаптаций холинэстераз головоногих и рыб характерными для всех гидробионтов? В этой связи представляло интерес провести сравнение костистых и хрящевых видов рыб. Наиболее эволюционно древним видом из исследованных нами видов рыб является сельдевая акула. Холинэстераза этого вида хрящевых рыб обладает весьма своеобразной субстратной специфичностью: скорость гидролиза субстратов не зависит от их структуры. По сравнению с ХЭ других видов рыб, холинэстераза мозга акулы характеризуется высокой удельной активностью и невысоким значением сродства субстратов к ферменту. По-видимому, эволюционно значимым типом адаптации у акул являются низкая субстратная специфичность фермента, поддержание уровня низких значений Km, а низкое сродство субстратов к ферменту компенсируется увеличением концентрации фермента в нервной ткани.

Однако данный тип адаптации холинэргической системы характерен не для всех видов хрящевых и костистых рыб. Так, холинэстеразы калуги и скатов имеют более четко выраженную субстратную специфичность, которую по соотношению скоростей гидролиза субстратов (Ут(отн)) можно отнести к более прогрессивному типу ацетилхолинэ-стераз. Холинэстеразы мозга калуги и ската В. parmifera характеризуются значительно большим сродством субстратов к ферменту и более высокими скоростями их гидролиза по сравнению с ферментом акулы. При этом активность холинэстераз мозга калуги и ската В. parmifera во много раз ниже, чем в мозге акулы. Еще более разительные отличия от ХЭ акулы демонстрирует фермент ската В. aleutica. Утрата способности гидролизовать один из субстратов, низкий уровень удельной активности - цена адаптации фермента у ската В. aleutica. Механизм, обеспечивающий достаточный уровень проявления каталитической активности, связан с поддержанием высокой скорости гидролиза субстрата и его сродства к ферменту. Конформационный механизм адаптации фермента может способствовать проявлению активности в широком нрйдслс концентраций субстрата.

Таким образом, на примере хрящевых видов рыб мы видим проявление двух типов адаптивной стратегии холинэстераз: количественную — у акул и качественную (конформационную) — для скатов и калуги.

Следует заметить, что ферменты не всех видов донного сообщества имеют пути адаптации, аналогичные адаптации холинэстераз камбаловых.

На примере холинэстераз трех видов крабов можно проследить стратегию адаптации к глубинам. Мохнаторукий краб - типичный представитель членистоногих обитающих в литорали, в отличие от камчатского краба и краба-стригуна, жизненный цикл которых связан с большими глубинами. Сравнение свойств холинэстераз нервной ткани прибрежного (мохнаторукий) и более глубоководных (камчатский, стригун) видов крабов показывает, что в целом стратегия биохимической адаптации соответствует описанной П.Хочачкой и Д.Сомеро (1988). Более глубоководные виды характеризуются более низкими значениями величины удельной активности, максимальной скорости гидролиза (Vm) и величины сродства субстратов к ферменту (Vm/Km).

Тем не менее, «подчиняясь» общему правилу биохимической адаптации к гидростатическому давлению, холинэстеразы нервной ткани крабов регулируют каталитическую эффективность не путем сохранения величины кажущейся Km, а увеличивая ее значение. Полностью подчиняются стратегии адаптации, предложенной ранее, холинэстеразы сердца крабов. На фоне снижения каталитической эффективности средние значения величин Km равны для разных видов крабов.

Если проследить данную стратегию адаптации на различных «тканевых» уровнях тех же видов животных, то можно увидеть, что она не универсальна.

Как отмечалось ранее (Турпаев и др., 1967), холинэстеразы гемолимфы беспозвоночных выполняют ту же функцию, что и ферменты хо-линэргического синапса. Холинэстераза мохнаторукого краба значитсльно отличается от фермента других видов крабов по величине Km. Значительное увеличение Km, при равенстве сродства субстратов к ферменту, сопровождается снижением максимальной скорости гидролиза субстратов. Реакция организма на снижение каталитической активности фермента подчиняется количественной стратегии адаптации — удельная активность фермента в гемолимфе мохнаторукого краба в 250 раз выше, чем в гемолимфе других видов крабов.

Таким образом, на примере холинэстераз крабов мы видим два возможных механизма адаптации ферментов к батическим изменениям: количественная стратегия — увеличение удельной активности — и кон-формационная (компенсаторная) стратегия - модуляция активности фермента путем изменения величины сродства к нему субстратов.

Исследование свойств двустворчатых моллюсков позволило выявить ряд существенных различий в свойствах холинэстераз их гемолимфы. Все три изученных вида моллюсков различались по субстратной специфичности: фермент модиолуса не катализировал гидролиз бути-рилтиохолина; фермент мидии Грея с наибольшей скоростью гидроли-зовал ацетилтиохолин; а фермент анадары - пропионилтиохолин.

Прослеживается тенденция зависимости образа жизни моллюсков и кинетических параметров гидролиза субстратов. Как известно, мидия и модиолус образуют друзы и ведут прикрепленный образ жизни. Анадара обитает в илисто-песчаном грунте, зарываясь в него на 10-25 см. Холинэстераза гемолимфы анадары, по сравнению с другими двустворчатыми моллюсками, характеризуется значительно более высокой величиной удельной активности, скорости гидролиза субстратов, их сродства к ферменту. Энергетические затраты связанные с более активным образом жизни анадары компенсируются, на биохимическом уровне, более низкими значениями константы Михаэлиса (Km) и оптимальных концентраций субстратов. Следует отметить, что значения оптимальных концентраций субстратов, для всех исследованных двустворчатых моллюсков, сдвинуты в область их невысоких значений, либо, холинэстеразы моллюсков не обладают четко выраженной зависимостью скорости гидролиза субстратов от их концентрации. Это положение имеет важное значение для адаптации видов к условиям обитания, так как позволяют поддерживать необходимый уровень каталитической эффективности фермента в широком диапазоне концентраций субстратов.

Двустворчатые моллюски хорошо известны как тест-объекты при оценке степени загрязнения окружающей среды. Однако оценка влияния обитания моллюсков в различных экологических условиях (по содержанию солей тяжелых металлов) на холинэстеразы их гемолимфы ранее не проводилась.

Холинэстеразы мидии из экологически благополучного района (акватория о. Рейнеке) характеризуются высокой активностью. Стратегия адаптации фермента мидии к таким условиям обитания такая же, как и для всех двустворчатых моллюсков: обеспечение высокой каталитической активности ферментов поддерживается постоянством величины Km при не высоких концентрациях субстрата, что обеспечивает высокую скорость образования фермент-субстратного комплекса (Vm/Km).

В районе о. Большой Пелис с флюктуирующими показателями состава внешней среды (апвеллинг) удельная активность фермента гемолимфы резко (в 4 раза) снижается. При этом максимальная скорость гидролиза субстратов (Vm) сохраняется в их широком диапазоне (насыщающие концентрации). Стратегия предадаптации ферментов в данном случае выражается в увеличении кажущихся значений Km, что приводит к поддержанию высокого сродства субстратов к ферменту.

Район, характеризующийся естественным повышенным фоном солей тяжелых металлов (о. Итуруп), можно рассматривать как место обитания моллюсков, полностью адаптированных к условиям окружающей среды. Холинэстсраза гемолимфы мидии из этого района по величине удельной активности отличается от фермента «контрольного» района (о.

Рсйнеке) уже только в 2 раза, при практически равных скоростях гидролиза субстратов. Возникает вопрос, какими биохимическими механизмами обеспечивается поддержание достаточного, с точки зрения существования вида, уровня холинэргичсских процессов? Оказывается, стратегия биохимической адаптации к условиям постоянного обитания в среде с высоким фоновым содержанием металлов практически такая же, как и для ферментов из района предадаптации (о. Большой Пелис). Функциональная эффективность фермента поддерживается благодаря повышению Km для некоторых, очевидно физиологически важных, субстратов. Но в отличие от холинэстераз гемолимфы мидии из акватории о. Большой Пелис фермент мидии из акватории о. Итуруп имеет четко выраженные значения оптимальных концентраций субстратов, значения которых ниже таковых для контрольного района.

Постоянное обитание мидий в акваториях, подверженных хроническому антропогенному воздействию (бухта Десантная), приводит не только к 7-кратному снижению удельной активности холинэстераз, по сравнению с контрольным районом, но и к изменению их субстратной специфичности. Пятикратное снижение скорости гидролиза субстратов сопровождается и резким уменьшением величины их сродства к ферменту. Модуляция активности холинэстераз мидий из данного района обеспечивается за счет повышения значений оптимальных концентраций гидролизусмых субстратов и величин Km.

Таким образом, на основании изучения свойств холинэстераз мидий, обитающих в различных экологических условиях, можно сделать заключение, что основным механизмом биохимической адаптации этого вида моллюсков, как и всех исследованных видов двустворчатых, является конформационная стратегия адаптивного процесса. Данный тип стратегии объясняется модуляцией активности ферментов посредством регулирования соответствия оптимальных концентраций субстратов и скорости образования фермент-субстратного комплекса.

Постулируется, что процесс адаптации организмов к низким температурам сопровождается снижением уровня каталитической эффективности ферментов и сохранением величины Km. Это положение было подтверждено нами на примере холинэстераз кальмаров обитающих в разных климатических условиях. С целью проверки данного положения нами проведен анализ влияния температуры (при прочих равных условиях) на свойства холинэстераз двух штаммов микроорганизмов, значительно различающихся по морфо-биохимичсским показателям. Из полученных нами данных видно, что для грамположительных микроорганизмов (К pseudotuberculosis) процесс адаптации к низким температурам приводит к снижению сродства субстратов к ферменту (Vm/Km). Однако процесс адаптации к низким температурам характеризуется увеличением значений максимальной скорости гидролиза (Vm) и Km. В то же время грамотрицательные микроорганизмы (L. monocytogenes) при адаптации к низким температурам существенно меняют свою субстратную специфичность: холинэстераза L. Monocytogenes, адаптированная к низким температурам, не гидролизует бутирилтиохолин. В целом, процесс адаптации к низким температурам у грамотрицатсльных микроорганизмов сопровождался снижением каталитической эффективности ферментов и значений константы Михаэлиса. Величиной, определяющей стабильность проявления ферментативной функции, является сродство субстрата к ферменту. Величина Vm/Km в определенной мерс является в сравнительных исследованиях отражением конформационной гибкости молекулы фермента. Именно изменение конформации молекул холинэстераз приводит к потере ее способности гидролизовать один из субстратов. Конформационный механизм адаптации к существованию при низких температурах был подтвержден и для холинэстераз Y. pseudotuberculosis методом субстратно-ингибиторного анализа.

Таким образом, биохимические адаптации, одно из основных, наиболее общих свойств живой материи, присущи всем биологическим системам. Ферментативные системы гидробионтов не являются исключением. Сущность адаптации холинэстераз у гидробионтов состоит в поддержании функциональной устойчивости систем при изменении условий окружающей среды. Биохимические адаптивные процессы реализуются на уровне филогенетических, онтогенетических (в том числе су-борганизменных) систем. В процессе адаптации к условиям обитания гидробионты реализуют весь спектр механизмов (конформационные, регуляторные, компенсаторные) приспособления к жизни в воде.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ковалев, Николай Николаевич, Владивосток

1. А.с. № 1535503 Способ определения нопуляционной принадлежности командорских кальмаров // Н.Н.Ковалев, Л.М.Эпштейн, Ю.А.Фсдорец, Г.А.Шевцов, А.П. Брссткин, Е.В. Розенгарт, А.Е. Хованских. 1990. Бюл. № 2.

2. А.с. № 1142079 Способ определения таксономической принадлежности кальмаров // Л.М. Эпштейн, С.П. Шевцова, Ю.И. Касьяненко. 1985. Бюлл.№8.

3. Абашкина Л.И. Сравнительная чувствительность холинэстераз различного происхождения к действию фосфорорганических ингибиторов: Автореф. дис. . канд. хим. наук. Л., 1968. 24 с.

4. Абрамович Т.Д., Борзунина A.M., Голуб Т.Л. О каталитических свойствах ацетилхолинэстеразы из эритроцитов человека // Биохимия. 1973. Т. 38, №6. С. 1137-1143.

5. Андрияшев А.П. Рыбы северных морей СССР. М.; Л.: Изд. АН СССР. 1954. 566 с.

6. Бирнштейн Я.А. Подтип жабернодышащие (Branchiata). Класс ракообразные (Crustacea) // В кн.: Жизнь животных. М.: Просвещение. 1968. Т.2. С. 377-529.

7. Борец Л.А. Донные ихтиоцены российского шельфа дальневосточных морей: состав, структура, элементы функционирования и промысловое значение. Владивосток. Изд-во ТИНРО-Центр. 1997. 216 с.

8. Брссткин А.П., Виняр Т.Н., Розенгарт Е.В. Взаимодействие холинэстеразы мозга лягушки с некоторыми обратимыми аммониевыми ингибиторами // Нейрохимия. 1981. Т. 46, № 6. С. 1042-1048.

9. Бресткин А.П., Виняр Т.Н., Розенгарт Е.В., Торможение активности холинэстераз нервной ткани лягушки и тихоокеанского кальмара кремнийорганическими аммониевыми соединениями // Нейрохимия. 1983. Т. 2. С. 212-216.

10. Бресткин А.П., Вихрева JI.A., Годовиков Н.Н. и др. S- алкинило-вые эфиры тиокислот фосфора как ингибиторы холинэстераз и перспективные физиологически активные вещества //Успехи химии. 1991. Т. 60. С.1744-1776.

11. Бресткин А.П., Григорьева Г.М., Еремеева A.M. Ацстилхолинэсте-раза электрического органа Torpedo mormorata // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1975. Т. 11, № 3. С. 250-257.

12. Бресткин А.П., Жуковский Ю.Г., Моралев С.Н., Розенгарт В.И., Розенгарт Е.В. О механизме антихолинэстеразного действия ацетиленовых фосфорорганических ингибиторов // Биоорган, химия. 1992. Т. 18, № 8. С. 1067-1072.

13. Брссткин А.П., Жуковский Ю.Г., Розенгарт Е.В. Метод определения ингибиторных констант при обратимом торможении ферментативного гидролиза субстрата // Украин. биохим. журн. 1987. Т. 59, № 5. С. 77-81.

14. Бресткин А.П., Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Субстратно-ингибиторная специфичность холинэстераз нервной ткани командорского кальмара // Нейрохимия. 1986. Т. 5, № 3. С. 264-270.

15. Брссткин А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.Н., Розенгарт Е.В., Энштсйн Л.М. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов. Владивосток: изд-во ТИНРО. 1997. С. 466.

16. Бресткин А.П., Розснгарт Е.В., Эпштсйн JI.M. О свойствах холинэстеразы из хвостатого ядра мозга тюленя Phoca hispida ladogensis // Жури, эволюц. физиол. и биохим. 1971. Т. 7, № 5. С. 474-477.

17. Бресткин А.П., Умецкая М.Н. Об оценке точности определения холинэстеразной активности // Биохимия. 1970. Т. 35, № 3. С. 589-594.

18. Брик И.Л. Свойства ацетилхолинэстеразы мозга карпа // Биохимия. 1969. Т. 34, вып. 1.С. 33-41.

19. Брик И.Л., Яковлев В.А. Сравнительное исследование свойств холинэстераз нервной системы позвоночных и насекомых // Биохимия. 1962. Т. 27, вып. 6. С. 32-44.

20. Бузолева Л.С., Бурцева Т.И., Сомов Г.П. Влияние температуры культивирования на содержание нуклеиновых кислот у бактерий Yersinia pseudotuberculosis и Listeria monocytogenes // Журн. микробиол.2000. № 6. С. 22-25.

21. Бузолева Л.С., Исаченко А.С. Патогенность для белых мышей почвенного штамма Listeria monocytogenes при разных температурных режимах роста // Тез. науч.-практ. копф. «Инфекционная патология в Приморском крае». Владивосток, 1999. С. 4-6.

22. Бузолева Л.С., Ковалев Н.Н., Сомов Г.П. Конформационный механизм адаптации Yersinia pseudotuberculosis к температуре окружающей среды // Тез. докл. науч.-практ. конф. «Инфекционная патология в Приморском крае». Владивосток, 1999. С. 6-7.

23. Бузолева Л.С., Сидоренко М.Л. Влияние органических веществ гуминовых кислот на размножение энтеробактерий // Журн. микробиол.2001. №2. С. 89-91.

24. Бузолева Л.С., Сомов Г.П. Выживание и размножение патогенных бактерий в условиях голодания // Тез. науч.-практ. конф. по инфекционной патологии. Новосибирск, 1998. С. 31.

25. Бузолева Л.С., Сомов Г.П., Дзазиева М.Ф. Изменчивость пссвдо-туберкулезного микроба при длительном обитании в почве // Сб. науч. трудов «Проблеммы инфекционной патологии в Сибири, на Дальнем Востоке и Крайнем Севере». Новосибирск. 1996. С. 4-5.

26. Бузолева Л.С., Сомов Г.П., Тришин Ю.И. Особенности размножения пссвдотубсркулезного микроба при высокой и низкой температуре // Сборник научных трудов НИИ ЭМ СО РАМН «Экология патогенных бактерий». Новосибирск. 1994. С.144-151.

27. Бурцева Т.И., Бузолева Л.С., Сомов Г.П. Биохимическая характеристика жизнедеятельности Yersinia pseudotuberculosis в зависимости от температуры культивирования // Журн. микробиол. 1997. № 5. С. 29-33.

28. Виноградов М.Е. Вертикальное распределение океанического зоопланктона. М.: Изд-во Наука. 1961. 320 с.

29. Виняр Т.Н. Взаимодействие четвертичных аммониевых соединений с холинэстеразой и никотиновым рецептором одного и того же вида животного: Автореф. дис. канд. биол. наук. Л., 1986. 22 с.

30. Гейнрих А.К. Сезонные явления в планктоне Мирового океана. I. Сезонные явления в планктоне средних и высоких широт // Тр. ИО АН СССР. 1961. Т. 51. С. 57-81.

31. Гершанович Д.Е. О принципах классификации шельфовой зоны // Тр. ВНИРО. 1966. Т. 60. С. 79-87.

32. Глубоковский М.К. Популяционная организация вида у рыб // По-пуляционная структура, динамика численности и экология минтая. Владивосток: ТИНРО, 1987. С. 48-57.

33. Глубоковский М.К. Эволюционная биология лососевых рыб: Автореф. дис. .докт. биол. наук. Владивосток, 1990. 46 с.

34. Голиков С.Н., Розенгарт В.И. Холинэстеразы и антихолинэстераз-ные вещества. Л.: Медицина, 1964. 382 с.

35. Григорьева Г.М. Свойства холинэстераз кальмара Ommastrephes sloani pacificus // Журн. эволюц. физиол. и биохим. 1981. № 2. С. 181186.

36. Григорьева Г.М. Характеристика специфичности холинэстераз сердечной мышцы и гемолимфы моллюсков // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1967. Т. 23. С. 67-71.

37. Григорьева Г.М. Холинэстеразы зрительного ганглия кальмара II-lex illecebrosus, каракатицы Sepia officinalis и эледоны Eledona sp // Сравнительная физиология и нсйрохимия / Под ред. Е.М.Крепса. Л.: Наука, 1976. С. 3-13.

38. Григорьева Г.М. Холинэстеразы зрительного ганглия кальмаров Ommastrephes sloani pacificus // Систематика и экология головоногих моллюсков. Л.: ЗИН АН СССР, 1983. С. 137-139.

39. Григорьева Г.М., Конычсва Н. Кинетические свойства холинэстераз зрительного ганглия кальмаров // Физиология и биохимия морских и пресноводных животных / Под ред. Е.М.Крепса. Л.: Наука, 1979. С. 194204.

40. Давыдов И.В. О сопряженности развития океанологических условий в основных рыбопромысловых районах дальневосточных морей // Изв. ТИНРО. 1984. Т. 109. С. 3-16.

41. Данилов А.Ф., Виняр Т.Н., Лаврентьева В.В., Розенгарт Е.В. Сравнение свойств холинореценторов и холинэстераз лягушки и кальмара // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1985. Т. 21, № 2. С. 139-143.

42. Дзазиева М.Ф., Бузолева Л.С., Попков А.Л. Влияние трофических и температурных условий культивирования на синтез липидов Yersinia pseudotuberculosis // Журн. микробиол. 1999. № 6. С. 17-20.

43. Добровольский А.Д., Залогин Б.С. Моря СССР. М.: Изд-во МГУ, 1982. 192 с.

44. Елкин Е.Я. Пособие но поиску охотской сельди с использованием декадных карт частоты встречаемости се скоплений. Владивосток: ТИНРО, 1988. 65 с.

45. Жуковский Ю.Г. Об установлении индивидуальности фермента холинэстеразы в исследуемом препарате // Журн. эволюц. биохим. и фи-зиол. 2003. Т. 39, № 3. С. 218-225.

46. Зуев Г.В. Функциональные основы внешнего строения головоногих моллюсков. Киев: Изд-во Наукова думка. 1966. 140 С.

47. Зуев Г.В., Несис К.Н. Кальмары. Биология и промысел. М.: Пищ. пром-сть, 1971. 360 с.

48. Зуев Г.В., Несис К.Н., Нигматулин Ч.М. Система эволюции родов Ommastrcphes Symplectoteuthis // Зоол. журн. 1975. Т. 54, вып. 10. С. 1468-1479.

49. Зуев Г.В., Нигматулин Ч.М., Никольский В.Н. Некоторые океанические кальмары. М.: Агроиромиздат, 1985. 274 с.

50. Имшенсцкий А.А., Попова Л.С., Кирилова Н.Ф. О микроорганизмах, разлагающих ацетилхолин // Микробиология. 1974 Т. 43, вып. 6. С. 986-990.

51. Истошин Ю.В. Температура вод Японского моря и возможности ее прогноза // Тр. Океанограф, комис. 1960. Т. 8. С. 52-97.

52. Истошин Ю.В. Японское море. М.: Географгиз, 1959. 76 с.

53. Кабачник М.И. Фосфорорганические физиологически активные вещества // Вест. АН СССР. 1964. № 40. С. 60-68.

54. Катугин О.Н. Внутривидовая генетическая изменчивость и попу-ляционная подразделенпость командорского кальмара Berryteuthis magister северной части Тихого океана // Биол. моря. 1999. Т. 25, № 1. С. 35-46.

55. Кафанов А.И. Двустворчатые моллюски и фаунистическая биогеография северной Пацифики: Автореф. дис. докт. биол. наук. Владивосток, 1990. 48 с.

56. Качина Т.Ф. Сельдь западной части Берингова моря. М.: Лег. и пищ. пром-сть, 1981. 121 с.

57. Ковалев Н.Н. Свойства холинэстераз командорского кальмара из разных частей видового ареала: Автореф. дис. канд. биол. наук. Л., 1991.24 с.

58. Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В. Взаимодействие обратимых ингибиторов с холииэстеразой командорского кальмара Berrytuhtis magister из разных частей Берингова моря // Ж. эволюц. биох. и физиол. 1987. Т.23, № 4. С. 548-550.

59. Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Гафуров М.Б., Далимов Д.Н., Абду-вахабов А.А. Механизм обратимого торможения холинэстераз тинфос-фонатами // Известия АН СССР. Серия биологическая. 1988. С. 926-929.

60. Козловская В.И., Меизикова О.В., Чуйко Г.М., Майср Ф.Л. Холинэстеразы водных животных // В кн: Физиология, биохимия и токсикология пресноводных животных. Л. Наука. 1990. С.42-66.

61. Козловская В.И., Флеров Б.А. Фосфорорганические пестициды и их опасность для водных животных // Теоретические вопросы водной токсикологии. Л. 1981. С 55-72.

62. Козловская В.И., Чуйко Г.М. Холинэстеразы сыворотки крови рыб сем. Cyprinidae с различной устойчивостью к хлорофосу // Физиология и паразитология пресноводных животных. Л. 1979. С. 77-85.

63. Корниш-Боудсн Э. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир. 1979. 237 с.

64. Кулиева A.M., Розенгарт В.И., Шмелева В.Г. Некоторые особенности структуры активной поверхности холинэстеразы зрительного ганглия кальмара // Биохимия 1971. Т. 36, № 3. С. 568-571.

65. Лейбсон Н.Л. Ацетилхолинэстераза мозга в филогенезе позвоночных//ДАН СССР. 1963. Т. 153, №6. С.1112-1127.

66. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир. 1976. 957 с.

67. Леонов А.К. Региональная океанография. Л. Гидрометиоиздат. 1960. 765 с.

68. Лукьянова О.Н. Молекулярные биомаркеры. Владивосток. Изд-во: ДВГАУ, 2001. 191 с.

69. Лукьянова О.Н. Некоторые биохимические параметры у морских беспозвоночных из района антропогенного загрязнения // Экология. 1994. №6. С. 43-48.

70. Максименко В.В. Дифференциация молоди сельди (Clupea pallasi pallasi Val.) Берингова моря // Исслед. по биол. рыб и промысл, океанографии. Владивосток: ТИНРО, 1979. Вып. 10. С. 111-118.

71. Маляревская А.Я. Обмен веществ у рыб в условиях антропогенного евтрофирования водоемов. Киев, 1979. 164 с.

72. Мстслев В.В., Тростина В.И. Энзиматичсские методы индикации ФОС в рыбе и воде // Бюл. Всесоюз. ин-та эксперим. ветеринарии. 1969. Вып. 6. С. 72-83.

73. Мирзабаев Э.А., Иминов М.Т., Ковалев Н.Н., Лаврентьева В.В., Розенгарт Е.В. Холинэргическая активность триалкилсульфониевых ионов // Докл. АН УзССР. 1987. № 1. С. 39-41.

74. Мирзабаев Э.А., Иминов М.Т., Ковалев Н.Н., Лаврентьева В.В., Розенгарт Е.В. Холинэргическая активность триалкилсульфониевых ионов//Докл. АН УзССР. 1987. № 1.С. 39-41.

75. Михкиева B.C., Богдан В.В. К вопросу об определении активности холинэстеразы в мышцах и нервной тканях пресноводных рыб // Экологическая биохимия животных. Петрозаводск. 1978. С. 61-79.

76. Моисеев П.А. Треска и камбалы дальневосточных морей // Изв. ТИНРО. 1952. Т. 40. С. 1-288.

77. Моралев С.Н., Базюкин А.Б. Факторный анализ чувствительности холинэстераз к необратимым ингибиторам // Ж. эволюц. биох. и физиол. 1997а. Т. 33. С. 296-301.

78. Моралев С.Н., Базюкин А.Б. Использование многомерного статистического анализа в исследовании зависимости антихолинэстеразной эффективности фосфорорганических ингибиторов от их строения // Ж. эволюц. биох. и физиол. 19976. Т. 33. С. 302-306.

79. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. «Субстратное ингибирование» — один из аспектов субстратной специфичности холинэстераз позвоночных и беспозвоночных // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 2001. Т. 37, № 5. С. 358-372.

80. Морошкин К.В. Водные массы Охотского моря. М., 1966. 67 с.

81. Науменко Н.И. Биология и промысел морских сельдей Дальнего Востока // Петропавловск-Камчатский. 2001. 322 с.

82. Науменко Н.И. Особенности роста молоди восточноберингово-морской сельди (Clupea pallasi pallasi Val.) // Вопросы ихтиологии. 1979. Т. 19, выи. 6. С. 1129- 1132.

83. Несис К.Н. Головоногие моллюски восточноэкваториальной и юго-восточной частей Тихого океана // Тр. Ин-та океанологии АН СССР. 1973а. Т.94. С. 187-241.

84. Несис К.Н. Система, филогения и эволюция кальмаров семейства Gonatidae//Зоологический журнал. 19736. Т. 52. С. 1626-1637.

85. Несис К.Н. Вертикальное распределение пелагических моллюсков // Журн. общ. биол. 1977а. Т. 38, выи. 4. С. 547-558.

86. Несис К.Н. Внутривидовые группировки у кальмаров // Всесоюзная конференция по использованию промышленных беспозвоночных. М., 19776. С. 53-54.

87. Несис К.Н. Два новых вида кальмаров семейства Gonatidae из Северной Пацифики // Зоол. журнал. 1972. Т. 59, № 9. С. 1300-1307.

88. Несис К.Н. Кальмар Gonatus fabricii в центре Арктического бассейна// Гидробиол. журнал. 1971а. Т. 7, № 1. С. 93-96.

89. Несис К.Н. Семейство Gonatidae массовые кальмары Северной Пацифики (распространение, биология система и филогения) // Сб.: Моллюски. Пути, методы и итоги их изучения. JI. Изд-во Наука. 19716. С. 63-65.

90. Несис К.Н. Океанические головоногие моллюски. М.: Наука. 1985.286 с.

91. Несис К.Н. Распределение и питание молоди кальмара Gonatus fabricii в Лабрадорском и Норвежском морях // Океанология. 1965. Т. 5, № 1.С. 134-141.

92. Нигматулин Ч.М. Основные этапы эволюции кальмаров семейства Ommastrephidae // Вопросы эволюционной физиологии животных. Казань. Изд-во Казанского ун-та. 1979. С. 210-219.

93. Никольский Г.В. Теория динамики стада рыб. М.: Наука. 1974. 447

94. Новиков Н.П. Промысловые виды материкового склона северной части Тихого океана. М.: Пищ. пром-ть. 1974. 740 с.

95. Озернюк Н.Д. Механизмы адаптаций. М.: Изд-во МГУ. 2000. 205с.

96. Озернюк Н.Д., Булгакова Ю.В., Демин В.И. Механизмы эволюционных и онтогенетичснских адаптаций метаболизма у пойкилотсрмных // Изв. РАН. Сер. биол. 1993. № 5. С. 703-713.

97. Озернюк Н.Д., Нечаев С.К. Анализ механизмов адаптационных процессов // Известия АН. Сер. биол. 2002. № 4. С. 457-462.

98. Орбели JI.A. Основные задачи и методы эволюционной физиологии // Эволюционная физиология, ч. 1. JI.: Наука, 1979. С. 12-23.

99. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.536 с.

100. Певзнер Д.Л. Выделение, частичная очистка и некоторые свойства ацетилхолинэстсразы // Биохимия. 1965. Т. 30, № 5. С. 980-985.

101. Перцева-Остроумова Т.А. Размножение и развитие дальневосточных камбал. М.: Изд-во АН СССР, 1961. 484 с.

102. Радченко В.И., Глебов И.И. Состояние запасов и перспективы промысла охотской сельди // Рыб. хоз-во. 1995. № 3. С. 23-27.

103. Рачков В.И. Сезонные изменения химико-гидрологических условий верхней зоны шельфа в северной части Японского моря / ТИНРО. Владивосток, 1989. 19 с. Дсп. во ВНИИЭРХ. № 1048-рх89.

104. Розенгарт Е.В. Каталитические свойства холинэстераз мозга и сыворотки крови норки, Mustclla vision Bris //Докл. РАН. 2002. Т. 382, № 2. С.270-272.

105. Розенгарт Е.В. Субстратно-ингнбиторный анализ холинэстеразы гемолимфы тихоокеанского брюхоногого моллюска Neptunea eulimata // Журнал эволюц. биохим. и физиол. 2001. Т. 37, № 5. С. 401-405.

106. Розенгарт Е.В., Басова Н.Е., Хованских А.Е., Эпштейн JI.M. Различные аспекты субстратной специфичности холинэстеразы зрительных ганглиев тихоокеанского кальмара Todarodes pacificus // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1996. Т. 32, №4. С. 384-391.

107. Розенгарт Е.В., Виняр Т.Н., Ковалев Н.Н., Хованских А.Е. Специфичность взаимодействия холинэстераз дальневосточных кальмаров и некоторых позвоночных с обратимыми ингибиторами // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1988. Т. 24. С. 679-685.

108. Розенгарт Е.В., Державин Д.К., Ковалев Н.Н., Эпштейн JI.M., Басова Н.Е., Хованских А.Е. Видовые различия субстратной специфичности холинэстераз дальневосточных кальмаров семейства Gonatidae // Докл. РАН. 1995а. Т. 342, № 5. С. 703-704.

109. Розенгарт Е.В., Жоров Б.С., Хованских А.Е. Конформационные аспекты взаимодействия холинэстераз тихоокеанского кальмара и некоторых позвоночных с производными полиметилен-бис(триметиламмония) // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1994а. Т. 30. С. 168-176.

110. Розенгарт Е.В., Хованских А.Е., Эпштейн Л.М. Исследование гомогенности холинэстераз нервной ткани кальмаров методом субстратно-ингибиторного анализа // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 19946. Т. 30. С. 15-22.

111. Розенгарт Е.В., Ковалев Н.Н., Басова Н.Е., Эпштейн JI.M. Ингиби-торная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров семейства Gonatidae // Докл. РАН. 2000. Т. 370, № 5. С. 693-695.

112. Розенгарт Е.В., Ковалев Н.Н., Сорокин М.С. Силатраны обратимые ингибиторы холинэстераз // Химико-фармацевтический журн. 1989. №2. С. 170-172.

113. Розенгарт Е.В., Шестакова Н.Н. Конформационные аспекты взаимодействия аммониевых и сульфониевых субстратов с ацетилхолинэ-стеразой нервной ткани // Нейрохимия. 1990. Т. 9. С. 417-426.

114. Розенгарт Е.В., Шестакова Н.Н. Конформационные различия при сорбции холиновых лигандов в активном центре ацетилхолинэстеразы // Биоорган, химия. 1995. Т. 21. С. 323-329.

115. Садыков А.С., Розенгарт Е.В., Абдувахабов А.Д., Асланов Х.А. Холинэстеразы. Активный центр и механизм действия. Ташкент: Изд-во «ФАН», 1976.206 с.

116. Северцов А.Н. Главные направления эволюционного процесса. Морфобиологичсская теория эволюции. // M.-J1. Изд-во Биомедгиз. 1934. 151 с.

117. Симпсон Дж. Темпы и формы эволюции. // Изд-во иностр. лит. 1948. 128 с.

118. Скарлато О.А. Биогеографическое районирование шельфа советских дальневосточных морей на основании анализа фауны двустворчатых моллюсков // Гидробиология и биогеография шельфовых холодных и умеренных вод Мирового океана. JI. 1974. С. 18-19.

119. Слизкин А.Г., Сафронов С.Г. Промысловые крабы прикамчатских вод. Петропавловск-Камчатский: Северная Пацифика, 2000. 180 с.

120. Сомов Г.П., Бузолева JI.C. Об особенностях метаболизма возбудителей сапронозов // Тез. докл. Научн. нракт. конф. «Инфекционная патология в Приморском крае». Владивосток. 1994. С. 22-24.

121. Сомов Г.П., Бузолева JI.C., Зайцева Е.А., Терехова В.Е. Две позиции по вопросу о возможности существования патогенных бактерий в окружающей среде // Вестник ДВО РАН. 2000. № 3. С. 3-9.

122. Сомов Г.П., Бурцева Т.И., Бузолева J1.C. Биохимические механизмы энергообеспечения клеток Yersinia pseudotuberculosis при низкой температуре культивирования //Журн. микробиол. 2000. № 1. С. 3-5.

123. Тимофеев-Ресовский Н.В., Воронцов Н.Н., Яблоков А.В. Краткий очерк теории эволюции.//М.: Наука. 1977. 301 с.

124. Титова JI.K., Аронова М.З. Холинэстераза в органах боковой линии костистых рыб // ДАН СССР. 1964. Т. 155, № 4. С. 974-977.

125. Тихонов В.И. Рост желтоперой камбалы западного побережья Камчатки // Изв. ТИНРО. 1977. Т. 73. С. 127-140.

126. Турпаев Т.М., Нистратова С.Н., Сахаров Д.А. Эволюция холинэр-гической регуляции сердечной деятельности у моллюсков // Журн. общ. биол. 1967. Т. 28, № 5. С. 618-626.

127. Удинцев Г.Б. Рельеф дна Охотского моря // Тр. ИОАН СССР. 1957. Т. 22. С. 3-76.

128. Ушаков Б.П. Проблемы цитоэкологии. М.: Изд-во АН СССР, 1963. С. 5-19.

129. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М.: Мир, 1966.127 с.

130. Фадеев Н.С. Биология и промысел тихоокеанских камбал. Владивосток. Дальиздат, 1971. 100 с.

131. Фадеев Н.С. Северотихоокеанские камбалы: распространение и биология. М.: Агропромиздат, 1987. 175 с.

132. Федоров В.В. Глубоководные рыбы Берингова моря и их происхождение: Автореф. дис.канд. биол. наук. ПЛ. 1978. 22 с.

133. Хайлов К.М. Философская энциклопедия. // М. 1967. Т. 4. 369 с.

134. Хен Г.В. Сезонная и межгодовая изменчивость вод Берингова моря и ее влияние на распределение и численность гидробионтов // Автореф. дис. канд. геогр. наук. М.: ВНИРО, 1988. 24 с.

135. Хотимченко Ю.С. Моноаминэргическая и холинэргическая регуляция размножения у иглокожих и двустворчатых моллюсков: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Владивосток, 1989. 44 с.

136. Хочачка П., Самсро Д. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988.567 с.

137. Хочачка П., Самеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир, 1977. 398 с.

138. Христофорова Н.К., Шулькин В.М., Кавун В.Я., Чернова Е.Н. Тяжелые металлы в промысловых и культивируемых моллюсках залива Петра Великого. Владивосток: Дальнаука, 1994. 296 с.

139. Хромов-Борисов Н.В., Данилов А.Ф., Бровцина Н.Б., Александрова JI.H., Инденбом МЛ. Конформация ацетилхолина и его амидных аналогов при их взаимодействии с никотиновыми холинорецепторами // ДАН СССР. 1976. Т. 230, №5. С. 1250-1253.

140. Чернявский В.И. Влияние теплого состояния Охотского моря на биоиродуктивность и возможности его прогнозирования // Пробл. рыбо-промысл. прогнозир. Калининград, 1991. С. 127-128.

141. Чуйко Г.М. Биохимические и физиологические механизмы различной устойчивости пресноводных костистых рыб к действию хлорофоса и дихлофоса: Автореф. дис. . канд. биол. наук. JI., 1987. 24 с.

142. Швецов Ф.Г. К вопросу о локальности стад двухлинейной камбалы в районе Северных Курильских островов // Изв. ТИНРО. 1973. Т. 91. С. 97-99.

143. Шевцова С.П. Субстратно-ингибиторный анализ холинэстеразы оптических ганглиев кальмаров семейства Ommastrephidae как биохимический признак вида: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Киев, 1983. 24 с.

144. Шевцова С.П., Бресткин А.П., Несис К.Н., Розенгарт Е.В. Об идентичности свойств холинэстераз зрительных ганглиев кальмара Бартрама из южной Атлантики и Большого Австралийского залива // Океанология. 1977. № 17, вып. 6. С. 1102-1105.

145. Шестакова Н.Н., Розенгарт Е.В. Конформационные различия при сорбции холиновых лигандов в активном центре ацетилхолинэстеразы // Биоорган, химия. 1995. Т. 21. С. 323-329.

146. Шестакова Н.Н., Розенгарт Е.В. Коформационно-функциональные отношения холиновых эфиров карбоновых кислот как субстратов ацетилхолинэстеразы //Докл. РАН. 1996. Т. 346. С. 266-267.

147. Шестакова Н.Н., Розенгарт Е.В. Конформационные аспекты аце-тилхолинэстсразного гидролиза лактоилхолина и его аналогов // Докл. РАН. 1997. Т. 353. С. 118-120.

148. Шестакова Н.Н., Розенгарт Е.В., Жоров Б.С. Зависимость антихо-линэстеразной эффективности фосфорорганических ингибиторов от доступности атома фосфора // Биоорган, химия. 1992. Т. 18. С. 596-603.

149. Шестакова Н.Н., Розенгарт Е.В., Хованских А.Е. и др. Определение продуктивных конформаций субстрата ацетилхолинэстеразы с помощью теоретического конформационного анализа // Биоорган, химия. 1989. Т. 15. С. 335-344.

150. Шкорбатов Г.Л. К построению общей теории адаптации // Журн. общ. биол. 1982. Т. 43, № 6. С. 775-787.

151. Шкорбатов Г.Л. Основные черты адаптации биологических систем //Журн. общ. биол. 1971. Т. 32,№2. С. 131-142.

152. Шкорбатов Г.Л. Реферат доклада на 3-м Всесоюзном совещании по экол. физиол., биохим. и морфол. Сиб. отд. АН СССР // Зоол. журн. 1967. Т. 47. С. 916-931.

153. Шмальгаузен И.И. Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отд. биол. 1961. № 66. С. 104-134.

154. Шунтов В.П., Волков А.Ф., Темных О.С., Дулепова Е.П. Минтай в экосистемах дальневосточных морей. Владивосток: ТИНРО, 1993. 426 с.

155. Эпштейн Л.М. Сравнительное исследование сериновых гидролаз гидробионтов. Каталитические свойства, выделение, использование в таксономии: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Санкт-Петербург, 1992. 43 с.

156. Яблоков А.В. Популяционная биология. М.: Высш. шк., 1987. 304с.

157. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. М.: Наука, 1965.248 с.

158. Якунин Л.П. Количество льда и затраты тепла на его таяние в дальневосточных морях СССР // Проблемы Арктики и Антарктики. 1986. №2. С. 93-96.

159. Abe Т. Further records of boreal species of fishes from the southern piscifaunal region of Japan // Jap. J. Ichtiol. 1967. Vol. 14. P. 207-208.

160. Antosiewicz J., Wlodek S.T., McCammon J.A. Acetylcholinesterase: role of the enzyme4s charge distribution in steering charged ligands toward the active site// Biochemistry. 1996. Vol. 4. P. 67-74.

161. Antosiewicz J., McCammon J.A., Wlodek S.T., Gilson M.K. Simulation of charge-mutant acetylcholinesterases // Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 4211-4219.

162. Ashani Y., Radic Z. et al. Amino acid residues controlling reactivation of organophosphonyl conjugates of acetylcholinesterase by mono- and bis-quaternary oximes // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 6370-6380.

163. Augustinson K.B. Cholinesterases. A study in comparative enzymology // Acta Physiol. Scand. 1948. Vol. 15, Suppl. 52. P. 1-182.

164. Augustinson K.B. Electrophoresis studies of blood plasma esterases: 2. Avian, amphibian, reptilian and piscine plasma // Acta Chem. Scand. 1959. Vol. 13, №6. P. 1081-1096.

165. Augustinsson K.B. The evolution of esterases in vertebrates // Homologous enzymes and biochemical evolution. N.Y.: Gordon and Breach., 1968. P. 299-311.

166. Bakkala R., Maeda Т., McFarlane G. Distribution and stock structure of Pollock (Theragra chalcogramma) in the North Pacific Ocean // Bull.INPFC. 1986.№ 45. P. 3-20.

167. Baldwin J. Adaptation of enzymes to temperature: acetylcholinesterase in the central nervous system of fishes // Сотр. Biochem. Physiol. 1971. Vol. 40,№. l.P. 321-329.

168. Baldwin L., Hochachka P.W. Functional significans of isoenzymes in thermal acclimatization: Acetylcholinesterase from trout brain // Biochem. J. 1970. Vol. 116. P. 883-887.

169. Barak D., Kronman C., Ordentlich A. et al. Acetylcholinesterase perep-heral anionic site degeneracy conferred by amino acid arrays sharing a common core // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 6296-6305.

170. Barak D., Ordentlich A. et al. Allosteric modulation of acetylcholinesterase activity by peripheral ligands involves a conformational transition of the anionic subsite // Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 15444-15452.

171. Baslow M.H., Nigrelli R.F. Muscule acetylcholinesterase levels as an index of general activity in fishes//Copeia. 1961. № l.P. 65-71.

172. Baslow M.H., Nigrelli R.F. Muscule acetylcholinesterase levels as an index of general activity in fishes//Copeia. 1961. №. l.P. 65-71.

173. Berman H.A., Decker M.M. Chiral nature of covalent metylphosphonyl conjugates of acetylcholinestyerases // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 3951-3956.

174. Berman H.A., Leonard K. Chiral reactions of acetylcholinesterase probed with enantiomeric methylphosphonoyhionates. Noncovalent determinants of enzyme chirality // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 3942-3950.

175. Bon S., Lemounier M., Reiger F., Massoulie J. Molecular forms of Electroforus acetylcholinesterase. Molecular weight and composition // Eur. J. Biochem. 1977. Vol. 68, № 2. P. 523-530.

176. Bon S., Reiger F., Massoulie J. Proprietis des formes allongees de l'acetylcholinesterase en solution // Eur. J. Biochem. 1973. Vol. 35, № 35. P. 372-379.

177. Bourne Y., Taylor P., Marchot P. Acetylcholinesterase inhibition by fasciculin crystal structure of the complex // Cell. 1995. Vol. 83. P. 503-512.

178. Brestkin A.P., Brick I.L., Grigoreva G.M. Comparative pharmacology of cholinesterases // International Encycl. Pharmacol. Therap. Sec. 85, No 1, Oxford, N.Y., 1973. P. 241-344.

179. Brestkin A.P., Rozengart E.V. Cholinesterase catalisis // Nature. 1965. Vol. 205. P. 388-389.

180. Brett J. R., Groves T.D.D. Physiological energetics // In: Fish Physiology, ed. Hoar W.A., Randall D.J., Brett J.R. N.Y. Acadamy Press. 1979. Vol. 7. P. 279-352.

181. Brodbeck U., Gentinetta R., Lundin S.J. Multiple forms of a cholinesterase from body muscules of plaice (Pleuronectes platessa) and possible role of a salic acid in cholinesterase reaction specificity // Acta Chem. Scand. 1972. Vol. 27, № 2. P. 125-134.

182. Bull D.L., Lindquist D.A. Cholinestsrae of boll weevils. Anthonomus grandis Boheman. Distribution and some properties of the bool enzyme // Сотр. Biochem. Physiol. 1968. Vol. 25. P. 639-649.

183. Bullock Т.Н., Nachmansohn D. Cholinesterase in primitive nervous systems // J. Cell. Сотр. Physiol. 1942. № 20. P. 239-242.

184. Butler P.J., Jones D.R. The comparative physiology of diving in vertebrates // Сотр. Physiol. Biochem. 1982. Vol. 8. P. 179-364.

185. Cannon W. Wisdom of the body. Norton. N.Y. 1932. 215 P.

186. Castellini M.A., Somero G.N. Buffering capacity of vertebrate muscle: correlations with potentials for anaerobic function // J. Сотр. Physiol. 1981. Vol. 143. P. 191-198.

187. Chan S.L., Shirachi D.Y., Hargava H.N., Sardner E., Trevor A.J. Purification and properties of multiple forms of brain acetylcholinesterase // J. Neurochem. 1972. Vol. 19, № 12. P. 2747-2758.

188. Clarke M.R. A review of the systematics and ecology of oceanic squids // Adv. Mar. Biol. 1966. Vol. 4. P. 91-300.

189. Cygler M., Schrag J.D., Sussman J.L., et al. Relationship between sequence coservation and three-dimentional structure in a large family of ests-rases, lipase and related proteins // Protein Science. 1993. Vol. 2. P. 366-382.

190. Das P.K., Liddle J., Purification and properties of human serum cholin-esterase // J. Biochem. 1970. Vol. 116. P. 875-881.

191. De Zwan A. Carbohedrate catabolism in bivalves // In: The Mollusca. Ed by P. W. Hochachka. N.Y. Academy Press. 1983. Vol. 1. P. 138-175.

192. Desai A.K. Diatribution of cholinesterase in the liver and stomach of the migratory fish Hilsa ilisha and non-migratory Hilsa toil // J. Anim. Mor-phol. Physiol. 1978. Vol. 25, №. 1-2. P. 24-33.

193. Detbam W.D. Hidrolisis of cholinesters by invertebrate nerve fibers // Biochem. Biophis. Acta. 1963. № 77. P. 430-435.

194. Devies J. F., Kratzer T.W. Fate of environmental pollutants // Water Eviron. Res. 1996. Vol. 68, № 4. P. 737-755.

195. Dimitrina A., Grof P., Michel N., Minko В., Palmer P. Roman spectroscopic study on the conformation of 11S acetylcholinesterase from Torpedo californica // FEBS Lett. 1987. Vol. 219, № 1. P. 202-206.

196. Dudai Y., Herzberg M., Silman J. Molecular structure of acetylcho-lineserase from electric eel // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. № 9. P. 24732476.

197. Dudai Y., Silman J. The effects of solubilization procedure on the release and molecular state of acetylcholinesterase from organ tissue // J. Neu-rochem. 1974. Vol. 23, № 6. P. 1117-1137.

198. Duran R., Cervenansky C., Dajas F., Tipton K.F. Fasciculin inhibition of acetylcholinesterase is prevented by chamical modification of the enzyme at a periferal site// Biochim. Biophis. Acta. 1994. Vol. 1201. P. 381-388.

199. Duran R., Cervenansky C., Karlsson E. Effect of fasciculin on hydrolysis of neutral and cholin esters by bytirilcholinesterase, cobra venom and chicken acetylcholinesterases//Toxicol. 1996. Vol. 34. P. 959-963.

200. Duval N., Bon S., Silman I. et al. Site-directed mutagenesis of active-site-related residues in Torpedo acetylcholinesterase // FEBS Lett. 1992. Vol. 309. P. 421-423.

201. Echlier J., Anselment A., Sussman J.L. Differential effects of "peripheral" site ligands on Torpedo and chicken acetylcholinesterase // Mol. Pharmacol. 1994. Vol. 45. P. 335-340.

202. Ellman G. L., Courtney K.D., Andres V.J., Featerstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterare activity // Bio-chem. Pharmacol. 1961. Vol. 7, № 1. P. 88-95.

203. Faerman C., Ripoll D., Bon S. et al. Site-derected mutants designed to test back-door hypotheses of acetylcholinesterase function // FEBS Lett. 1996. Vol. 368. P. 65-71.

204. Fishelson L., Yawets A., Perry A.S., Zuk-Rimon Z., Manelis R., Dotan A. The environmental health profil (EHP) for the Acre Valley (Israel): xeno-biotics in animals and physiological evedance of stress // Sci. Total Environ. 1994. Vol. 144. P. 33-45.

205. Flammarion P., Noyry P., Garric J. The measurement of cholinesyerase activities as biomarker in chub (Leuciscus cephalus): the fish length should not be ignored // Environmental Pollution. 2002. Vol. 120, № 2. P. 325-330.

206. Fournier D., Mutero A., Pralavorio M., Bride J.M. Drosophila acetylcholinesterase: mechanism of resistance to organophosphates // Chem. Biol. Interact. 1993. Vol. 87. P. 233-238.

207. Frenkel E.J., Roelofsen В., Brodbeck U., Deenen L., Ott P. Lipid-protein interactions in human erythrocyte-membrane acetylcholinesterase: modulation of enzyme activity by lipids // Eur. J. Biochem. 1980. Vol. 109, № 2. P. 377-382.

208. Friboulet A., Rieger F., Goudou D. et al. Interaction of an organophos-phate with a peripheral site on acetylcholinesterase // Biochemistry. 1990. Vol. 29. P. 914-920.

209. Gentry M.K., Saxena A., Ashani Y., Doctor B.P. Immuno-chemical characterization of anti-acetylcholinestwrase inhibitory monoclonal antibodies // Chem. Biol. Interact. 1993. Vol. 87. P. 277-231.

210. Gibney G., Camp S., Dionne M., et al. Mutagenesis of essential functional residues in acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 7546-7550.

211. Gilson M.K., Straatsma T.P., McCammon J.A. et al. Open «back door» in a molecular dynamics simulation on acetylcholinesterase // Science. 1994. Vol. 263. P. 1276-1278.

212. Gnatt A., Loewenstein Y.,Yaron A. et al. Site-directed mutagenesis of active site residues reveals plasticity of human butyrylcholinesterase in sub-stract and inhibitor interactions //J. Neurochem. 1994. Vol. 62. P. 749-755.

213. Grosfeld H., Barak D., Ordentlich A. Interactions of oxime reactivators with diethylphosphoryl adducts of human acetylcholinesterase and its mutant derivatives // Mol. Pharmacol. 1996. Vol. 50. P. 639-649.

214. Haas R., Braudt P.T., Knigt J., Rosenbery T.L. Identification of amino components in a glicolipid membrane-binding domain at the C-terminus of human erythrocyte acetylcholinesterase // Biochemistry. 1986. Vol. 25, №11. P. 3098-3105.

215. Harel M., Schalk I., Ehrel Sabatier L. et al. Quaternary ligand binding to aromatic residues in the active-site gorge of acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 9031-9035.

216. Harel M., Sussman J. LM Krejci E. et al. Conversion of acetylcholinesterase to butyrylcholinesterase: modeling and nutagenesis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Vol.89. P. 10821-10831.

217. Hart J.L. Pacific Fishes of Canada: Fish. Res. Board of Canada // Bull. 180. Ottawa, 1973.740 P.

218. Ho I.K., Ellman G.L. Triton solubilized acetylcholinesterase of brain // J. Neurochem. 1969. Vol. 16, № 11. P. 1505-1513.

219. Hochachka P.W., Somero G.N. Biochemical adaptation: mechanism and process in physiological evolution. Oxford University Press. 2002. P. 466.

220. Hodge A.S., Humphrey D.R., Rosenberry T.L. Ambebonium is a rapidly reversible noncovalent inhibitor of acetylcholinesterase, with one of the highest known affinities // Mol. Pharmacol. 1992. Vol. 41. P. 937-942.

221. Hosea N.A., Berman H.A., Taylor P. Specificity and orientation of trigonal carboxyl esters and tetrahedral alkylphosphonyl esters in cholinestera-ses // Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 11528-11536.

222. Hosea N.A., Radic Z., Tsigelny I. et al. Aspartate 74 as a primary determinant in acetylcholinesterase gaveling specificity to cationic organophos-phates // Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 10995-11004.

223. Hoskin F.C.G., Krenzner D., Rozenberg P. Interaction of organophosphorous inhibitors with acetylcholinesterase from squid gigant axon // Biochem. Pharmacol. 1959. № 18. P. 1697-1727.

224. Hwang G.C., Watabe S., Hashimoto K. Changes in carp myosin AT-Fase induced by temperature acclimation // J. Сотр. Physiol. 1990. Vol. 160. P. 233-239.

225. Jackson P., Whittaker M. Some characteristics of acetylcholinesterase extracted from human erythrocyte by three different detergents // Enzymolo-gia. 1972. Vol. 43, № 6. P. 659-371.

226. Jbilo О., L?Hermite Y., Talesa Vol., et al. Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase expression in adult rabbit tissues and during development // Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 225. P. 115-124.

227. Jonson C.D., Smith S.P., Russel R.L. Electroforus electricus acetylcholinesterase: separation and selective modification by collagenase // J. Neuro-chem. 1977. Vol. 28, № 3. P. 617-624.

228. Kabachhik Vol. G., Brestkin A. Pt., Godovikov N.N. et al. Hydrophobic areas on active surface of cholinesterases // Pharmacol. Rev. 1970. Vol. 22. P. 335-388.

229. Kavun V. Ya., Shulkin V.M., Kchristoforova N.K. Metal accumulation in mussels of the Kuril Islans, north-west Pacific Ocean // Marine Environ. Res. 2002. Vol. 53. P. 219-226.

230. Koell G.B., Koell W.A., Smyrl G., Davis R., Nagle A. Histochemical and pharmacological evidens of the function of butyrylcholinesterase // Adv. Behav. Biol. 1977. Vol. 24. P. 125-137.

231. Kremzner L.T., Wilson I.B. A patial characterization of acetylcholinesterase // Biochem. 1964. Vol. 3, № 12. P. 1902-1905.

232. Kronman C., Ordentlich A., Barak D. et al. The "back door" hypothesis for product clearence in acetylcholinesterase challenged by site-directed mutagenesis // Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 27819-27822.

233. MacPhee-Quigley K., Taylor P., Taylor S. Primary structure of the catalytic subunits from two molecular forms of acetylcholinesterase // J. Biol. Chem. 1985. Vol.260. P. 12185-12189.

234. Mangum C.P., Towle D.W. Physiological adaptation to unstableenvi-roments // Amer. Sci. 1977. Vol. 65. P. 67-75.

235. Marchot P., Khelif A., Ji Y.H., et al. binding of 1251-fasciculin to rat brain acetylcholinesterase. The complex still binds diisopropilfluorophosphate // Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 12458-12467.

236. Massoultre J., Sussman J.L., Doctor B.P., et al. Recomendation for nomenclature in cholinesterases // Multidisciplinary approaches to Cholinesterase Functions // Eds. A. Schafferman and B. Velan. N.Y.: Plenum Press, 1992. P. 285-288.

237. Mays C., Rosenbery T.L. Characterization of pepsin resistant collagenlike tail subunit fragment os 18S and 14S acetylcholinesterase from Electrofo-nis electricus // Biochem. 1981. Vol. 20, № 10. P. 2810-2817.

238. Mercer M.C. A synopsis of the recent Cephalopoda of Canada // Proc. Symp. Mollusca. 1968. Vol. 1. P. 265-276.

239. Mommsen T.P., Ballantine J., MacDonald D., Gosline J., Hochachka P.W. Analoguesof red and white museule in squid mantle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 3274-3278.

240. Mommsen T.P., French C.J., Hochachka P.W. Sites and patterns of protein and amino acid utilization during the spawning migration of salmon // Can. J. Zool. 1980. Vol. 58. P. 1785-1799.

241. Nachmansohn D., Meyerhof B. Relation between electrical changes during nerve activity and concentration of choline estsrase // J. Neurophysiol. 1941. P. 348-361.

242. Nachmansohn D., Rothenberg M.A. Studies on cholinesterase. I. On the specificity of the enzyme in nerve tissue // J. Biol. Chem. 1945. Vol. 158. P. 635-667.

243. Niday E., Wang C.S., Alopovic P. Stadies on characterisation of human erythrocite acetylcholinesrerase and its reaction with antibodies // Biochem. Biophys. Acta. 1977. Vol. 469, № 3. P. 180-193.

244. Novozhilov K.V., Brestkin A.P., Khovanskikh A.E. et al. Cholinesterase of aphids. 111. Sensetivity of cholinesterases to several inhibitors as a possible phylogenetic character // Insect Biochem. 1989. Vol. 19. P. 15-18.

245. Okutani Т., Nemoto T. Squids as a food of sperm whales in the Bering sea and Alaskan Gulf// Sci. Repts Whales Res. Inst. 1964. Vol. 18. P. 111122.

246. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., et al. The alfa/beta hydrolase fold // Protein Engineering. 1992. Vol. 5. P. 197-211.

247. Ordentlich A., Barak D., Kronman C. et al. The architecture of human acetylcholinesterase active center probed interactions with selected with orga-nophosphate inhibitors//J. Biol. Chemistry. 1996. Vol. 271. P. 11953-11962.

248. Ordentlich A., Kronman C., Barak D. et al. Engineering resistance to "aging" of phosphylated human acetylcholinesterase. Role of hydrogen bond network in the active center // FEBS Lett. 1993a. Vol. 334. P. 215-220.

249. Ott P., Jenny В., Brodbeck U. Multiple moleculare forms of purified human erythrocyte acetylcholinesterase // Eur. J. Biochem. 1975. Vol. 57, № 2. P. 469-480.

250. Payene J.F., Mathieu A., Melwin W., Fancey L.L. Acetylcholinesterase, an Old Biomarker with a New Future? Field Trials in Accociation with Two Urban River and a Paper Mill in Newfoundland // Marine Pollution Bulletin. 1996. Vol. 32, N 2. P. 225-231.

251. Pearcy W.G. Species composition and distribution of pelagic cephalo-pods from the Pacific ocean of Oregon // Pacif. Sci. 1965. Vol. 19. P. 261266.

252. Pearcy W.G., Voss G.L. A new species of gonatid squid from the northeastern Pacific // Proc. Biol. Soc. Washington. 1963. Vol. 76. P. 105112.

253. Plate L. Selectionsprincip und Problem der Artbildung // Leipzig. 1913.167 P.

254. Precht H., Christophensen J., Hensel H., Larcher W. Temperature and life // Springer-Verlag, N.Y. 1973. 779.

255. Radic Z., Duran R., Vellom D.C. ct al. Site of fasciculin interaction with acetylcholinesterase // J. Biol. Chemistry. 1994. Vol. 269. P. 1123311239.

256. Radic ZM Gibney G., Kawanoto S. et al. Expression of recombinant acetylcholinesterase in a baculovirus system: kinetic properties of glutamate 199 mutants // Biochemistry. 1992. Vol. 31. P. 9760-9767.

257. Radic Z., Pickering N.A., Vellom D.C. ct al. Three distincdomains in the cholinesterase molecule confer selectivity for acetyl- and butyrylcholines-rerase inhibitors // Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 12074-12084.

258. Radic Z., Quinn D.M., Vellom D.C. et al. Allosteric control of acetylcholinesterase catalysis by fasciculin // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 10391-10399.

259. Radic Z., Reiner E., Taylor P. Role of the peripheral anionic site on acetycholinesterase: inhibition by substrates and coumarin derivatives // Mol. Pharmacol. 1991. Vol. 39. P. 98-104.

260. Rath S., Misra B.N. Toxicological effects of dichlorvos (DDVP) on brain and liver acetylcholinesterase (AChE) activity of Tilapia mossambica // Toxycology. 1981. Vol. 19. P. 321-354.

261. Reiger F., Bon S., Massoulie J. Phospholipids in "native" Electrophorus acetylcholinesterase // FEBS Lett. 1973. - Vol. 36. - 1. - P. 12-16.

262. Ripoll D.R., Faerman C.H., Axelsen P. H. et al. An electrostatic mechanism for substrate down the aromatic gorge of acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 5128-5132.

263. Romer-Luthi C.R., Hajdu J., Brodbeck U. Molecular forms of purified human erythrocyte membrabe acetylcholinesterase investigated by cros-linking with diimidates // J. Physiol. Chem. 1979. Vol. 360. P. 929-934.

264. Roper C.F.E. Systematics and zoogeography of worldwide bathy-pelagic squid Bathyteuthis (Cephalopoda: Oegopsida) // Bull. U.S. Nat. Mus. 1969. Vol. 291. P. 210.

265. Rosenberry T.L., Richardson J.M. Structure of 18S and 14S acetylcholinesterase. Identification of collageb-like subunits that are linked by disulfide bonds to catalitic subunits // Bichem. 1977. Vol. 16, № 16. P. 3550-3558.

266. Rosenbery T.L., Chen Y., Bock E. Structure of 1 IS acetylcholinesterase. Subunits composition // Biochem. 1974. Vol. 13, № 13. P. 3068-3079.

267. Rowell K.A. Feasibility of using scale patterns to describe growth and identify stocks of Pacific herring (Clupea harengus pallasi) from four spawning locations in the eastern Bering Sea: M. Sc. thesis. Univ. of Alaska. Juneau. AK, 1990. 89 p.

268. Schellekens R.C.A. Electrostatic properties of Torpedo californica acetylcholinesterase. Comparison with human butyrylcholinesterase // Graduation research project. University of California, San Diego, 1994.

269. Selwood Т., Shawn R.F., States M.J. et al. Parallel mechanisms in ace-tylcholinesterase-catalyzed hydrolysis of cholinesters // J. Amer. Chem. Soc. 1993. Vol. 115. P. 10477-10482.

270. Shafer N.K. Amino acid sequence in the region of the reactive serine residue of cell acetylcholinesterase // Biochem. 1973. Vol. 12, № 2. P. 29462951.

271. Shafferman A., Ordentlich A., Barak D. et al. Aging of phosphylated human acetylcholinesterase: catalytic processes mediated by aromatic and polar resides of the active center // Biochem. J. 1996. Vol. 318. P. 833-840.

272. Shafferman A., Velan В., Ordentlich A. et al. Substrate inhibition of acetylcholinesterase: residues affecting signal transduction from the surface to the catalytic center //.EMBO J. 1992. Vol. 11. P. 3561-3568.

273. Shulkin V.M., Kavun V.Ya., Kchristoforova N.K. Metal accumulation in mollusk muscles in Kuril Hands of North-West Pacific 11 Mar. Environ/ Res. 2002. Vol. 53. P. 219-226.

274. Silver A. The biology of cholinesterases. Amsterdam: North Holland Publishing Co, 1974. 367 p.

275. Smissaert H.R. Reactivity of a chiral suldhydryl group of the acetylcholinesterase from aphids // Pestic. Biochem. Physiol. 1976. Vol. 6. P. 215222.

276. Somero G.N. Proteins and temperature // Ann. Rev. Physiol. 1995. Vol. 57. P. 43-68.

277. Somero G.N. Temperature relationships: from molecules to biogeogra-phy // Handbook of physiology. Sec. 13. Comparative physiology. 2002. Vol. 11. P. 1391-1444.

278. Somov G.P., Buzolyova L.S. Ecology of Out-organizm Populations of Pathogenic Bacteria // The 2nd international symposium of Japan-Russia "Medical exchange foundation and the nea region". Vladivostok, 1994. P. 8283.

279. Steel R.W., Smallman B.N. Acetylcholinesterase of the house fly herd. Affinity purification and subunit composition // Biochem. Biophys. Acta. 1976. Vol. 445, № 1. P. 147-157.

280. Sussman J.L., Harel M., Frolow F. et al. Atomic structure of acetylcholinesterase fron Torpedo californica: A prototypic acetylcholine-binding protein // Science. 1991. Vol. 253. P. 872-879.

281. Sussman J.L., Harel M., Silman I. Three-dementional structure of acetylcholinesterase and of its complex with anticholinesterase drugs // Chem. Biol. Interact. 1993. Vol. 87. P. 187-197.

282. Tan R.C., Truong T.N., McCammon J.A., Sussman J.L. Acetylcholinesterase: electrostatic steering increases the rate of ligand binding // Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 410-413.

283. Taylor J.L., Mayer R.T., Himel C.M. Conformers of acetylcholinesterase: a mechanism of allosteric control // Mol. Pharmacol. 1994. Vol. 45. P. 74-83.

284. Tripathi R.K., Telford J.N., OBrein R.D. Molecular and structural characteristics of house fly brain acetylcholinesterase // Biochem. Biophys. Acta. 1978. Vol. 525, № l.P. 103-111.

285. Turpaev T.M., Abashkina L.I., Brestkin A.P., Brick I.L., Grigorjeva G.M., Pevzner D.L., Rozengart V.I., Rozengart E.V. Cholinesterase of squid optical ganglia//Eur. J. Biochem. 1968. Vol. 6. P. 55-59.

286. Vellom D.C., Radic ZM Li Y. et al. Amino acid residue controlling acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase specificity // Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 12-17.

287. Voss G.L. The biology and bathymetric distrebution of deep-sea cephalopods // Stud. Trop. Oceanogr. 1967. Vol. 5. P. 511-535.

288. Warshel A., Naray-Szabo G., Sussman F., Hwang J.K. How do serine proteases really work? // Biochemistry. 1989. Vol. 28. P. 3629-3637.

289. Weingand-Ziad J.A., Renault F., Masson F. Differential effect of pressure and temperature on the catalityc behaviour of wild-type human butyrylcholinesterase and its D70G mutant // Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 246. P. 327-335.

290. Weingand-Ziad J.A., Ribes A., Renault F., Masson F. Pressue- and heart-induced in activation of butyrylcholinestsrase: evidance for multiple intermediates and the remnant inactivation process // Biochemical Journ. 2001. Vol. 1. P. 356-442.

291. Zhorov B.S., Shestakova N.N., Rozengart E.V. Determination of productive conformation of acetylcholinesterase substrates using molecular mechanics // Quantitative Structure-Activity Relationship. 1991. Vol. 10. P. 205-210.