Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование структуры и функционирования активного центра холинэстераз позвоночных и беспозвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование структуры и функционирования активного центра холинэстераз позвоночных и беспозвоночных"

На правах рукописи

УДК 577.153 4 МОРАЛЕЙ СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ХОЛИНЭСТЕРАЗ ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2005 г.

Работа выполнена в лаборатории функциональной биохимии беспозвоночных Института эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор Е.В.Розенгарт

Официальные оппоненты.

доктор биологических наук, профессор Е.Г.Скворцевнч

доктор медицинских наук, профессор С.С.Михайлов

доктор химических наук, профессор С.М.Рамш

Ведущая организация

Институт токсикологии МЗ РФ

Защита состоится 14 июня 2005 г в 11 часов на заседании специализированного диссертационного совета Д 002 127 01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им И М Сеченова РАН по адресу 194223, Санкт-Петербург, пр Мориса Тореза, д 44

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им И.М.Сеченова РАН.

Автореферат разослан

2**4. 2005г

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

¿С, м Н.Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Холинэстеразы (ХЭ) являются одной из наиболее глубоко и широко изучаемых групп ферментов В связи с тем, что ацетилхолинэстеразы (АХЭ) обеспечивают синаптическую передачу в нервной системе позвоночных и беспозвоночных животных, исследование механизмов модуляции активности АХЭ представляет большой интерес как с теоретической, так и с практической точки зрения - для создания новых эффективных лекарственных препаратов и средств защиты растений. С другой стороны, структура и каталитические свойства ХЭ весьма разнообразны у различных животных, что позволяет использовать их при изучении эволюции ферментных белков. С третьей стороны, холинэстеразы являются благодатным материлом для специалистов по ферментативной кинетике

За примерно полувековую историю исследования был накоплен огромный материал о взаимодействии ХЭ различного происхождения с эффекторами различного строения Весьма значителен также материал о структуре молекулы разных ХЭ, полученный за последние 10-15 лет. Однако до сих пор эти две группы данных использовались лишь порознь и лишь для качественной оценки сходства и различия ферментов, и являются в значительной степени "сырым материалом", требующим обобщения и углубленного анализа

Между тем известно, что методы статистической обработки многомерных данных позволяют охватить широкий спектр сторон и связей явления и одновременно выделить среди них базисные, узловые связи, не только систематизировать материал, но и вскрыть новые закономерности, не очевидные при рассмотрении исходных данных Мы предположили, что статистические методы могут быть применимы и в области биохимии - при исследовании структуры и функционирования активного центра ХЭ Цель работы.

Задачей нашей работы являлось сравнительное исследование строения активного центра ХЭ позвоночных и беспозвоночных путем многомерного (кластерного, факторного и дисперсионного) статистического анализа данных о скорости их взаимодействия с субстратами и необратимыми ингибиторами и данных о физико-химических характеристиках аминокислотных остатков активного центра, и последующая интерпретация полученных результатов с целью выяснения путей эволюции этих ферментов и выявления факторов, определяющих степень чувствительности ХЭ к ингибиторам

Положения, выносимые на защиту => Выявлены конкретные аминокислотные остатки в ацильном кармане активного центра, определяющие избирательность действия диалкилфосфатов на холинэстеразы различных животных. Многомерный статистический анализ факторов, определяющих чувс!вигельность ХЭ насекомых к ацилирующим ингибиторам, позволил выявить их связь с особенностями конкретных структур активного центра (ацильного кармана и периферического «анионного» пункта) Они отражаются также на взаимодействии ХЭ с субстратами и ингибиторами другого механизма действия. => "Чувствительность к ингибиторам" является характеристикой, мало связанной с природой и механизмом действия ингибиторов, и определяется главным образом природой фермента Результаты, полученные при факторном и кластерном анализе нескольких наборов констант взаимодействия ХЭ насекомых с ингибиторами, близки между собой и мало зависят от природы исследованных ингибиторов. => "Чувствительность ХЭ к ингибиторам" не является адаптивным признаком в природных условиях, а эволюция активного центра ХЭ происходит путем нейтральных мутаций, т.к получаемые дендро-граммы не соответствуют филогенетическому древу насекомых. => В результате анализа данных о полной аминокислотной последовательности 79 ХЭ различных животных выявлены три основные линии Сделан вывод, что современная номенклатура ферментов, различающая всего два класса ХЭ, должна быть перешщцена и дополнена

=> Комбинированное ингибирование активности ХЭ фосфорорганическими ингибиторами включает в себя стадию обратимого взаимодействия ингибитора с ацилированьтч ферментом Любые ФОИ ингибируют ХЭ по комбинированному типу, который в своих крайних вариантах принимает вид "чисто необратимого" и "псевдообратимого" ингибирования Научная новизна результатов

Впервые при сравнительном исследовании каталитических свойств и строения активного центра ХЭ использованы методы многомерного статистического анализа данных, что позволите придти к новым, неочевидным выводам.

■ кластерный и факторный анализ констант взаимодействия ХЭ различных насекомых с необратимыми ингибиторами показали, что характер получаемых дендрограмм и и ветачины экстрагируемых факторов мало зависит от природы ингибиторов, использованных разными авторами Таким образом, "чувствительность к ингибиторам" в основном определяется природой фермента.

■ Сопоставление этих данных с результатами кластерного и факторного анализа характеристик аминокислотных остатков, составляющих активный центр холинэстераз насекомых, позволило выявить «материальный субстрат» факторов, определяющих их чувствительность к необратимым ингибиторам Фактор А, характерный для БН-чувствительных холинэстераз насекомых, связан с природой остатков, образующих вход в активный центр Фактор В определяется строением ациль-ного кармана активного центра Фактор С определяется строением периферического «анионного» пункта Эти факторы отражаются также на взаимодействии холинэстераз с субстратами и обратимыми ингибиторами

■ Дендрограммы, полученные при кластерном анализе чувствительности ХЭ к необратимым ингибиторам и строения их активного центра, не соответствуют филогенетическому древу животных Сделан вывод что мутации гена ХЭ, относящиеся к периферии активного центра и отражающиеся на ее активности в реакции с синтетическими субстратами и различными ингибиторами, являются нейтральными Эволюция активного центра ХЭ, с одной стороны, не имеет адаптивного характера в природных условиях, а с другой - не коррелирует с эволюцией белка ХЭ в целом

■ Избирательность действия диалкилфосфатов на холинэстеразы различных животных определяется различиями в строении апильного кармана ферментов Выявлены конкретные аминокислотные остатки, критичные при взаимодействии активного центра с алкильными радикалами определенной длины

Впервые в схему комбинированного торможения активности ХЭ фосфорорганическими ингибиторами (ФОИ) включена стадия обратимого взаимодействия ингибитора с ацилированым ферментом Теоретический анализ кинетики этого процесса подтвержден экспериментальными данными Сделан вывод, что "чисто необратимое" и "псевдообратимое" ингибирование ХЭ под действием ФОИ являются крайними вариантами комбинированного торможения Теоретическое и практическое значение работы

Несомненное значение, как с теоретической, так и с практической точки зрения, имеет предлагаемый новый подход к исследованию взаимодействия ферментов с эффекторами - использование многомерных статистических методов обработки данных

Проведенные исследования позволили сделать выводы об эволюции активного центра ХЭ и о факторах, определяющих чувствительность ХЭ к необратимым ингибиторам, что ценно для сравнительной биохимии ХЭ и может быть использовано при создании высокоэффективных и избирательных лекарственных препаратов и средств защиты растений

На основании исследования кинетики взаимодействия ХЭ злаковой тли с ФОИ был уточнен механизм комбинированного ингибирования и были выведены новые кинетические уравнения, более полно отражающие взаимодействие фермента с ингибиторами и позволяющие более точно рассчитывать ингибиторные константы Сделанные выводы применимы ко всем гидролитическим ферментам и являются вкладом в ферментативную кинетику Апробация работы

Результаты работы были представлены на V Всесоюзном биохимическом съезде, Москва, 1986; I Конференции биохимиков Узбекистана, Ташкент, 1986; Third International Meeting on Cholmesterases, La Grande-Motte, France, 1990, VII International Conference on Pesticide Chemistry, Hamburg, 1990- V конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, Ташкент, 1991; 36th Oholo Conference "Mul-tidisciplinary Approach to Cholinesterase Functions", Eilat, Izrae!, 1992, Научной конференции профессорско-преподавательского состава ТуркмГМИ, Ашгабат, 1994, I (IX) Международном совещании по эволюционной физиологии, С-Петербург, 1996, XII Международном совещании и V школе по эволюционной физиологии, С-Петербург, 2001, Xlth International Symposium on Cholinergic Mechanisms Function and Dysfunction and 2nd Mtsrahi Symposium of Neurobiology, St Moritz, Switzerland, 2002, Конференции, посвященной 70-летию Всероссийского института защиты растений, С-Петерберг, 2004

Публикации По материалам диссертации опубликовано 37 статей в отечественной и зарубежной печати, из них 28 в реферируемых журналах, а также две монографии (в соавторстве, [23, 39])

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 экспериментальных глав с изложением результатов и их обсуждением, зактю-чения, выводов, списка цитируемой литературы (343 ссылки) и приложения В работе представлены 21 таблица и 30 рисунков Объем работы составляет 240 страниц машинописного текста

Современные методы исследования на молекулярном уровне позволили определить строение активного центра ХЭ различного происхождения и функциональную роль составляющих его аминокислотных остатков (Далее в работе номера аминокислотных остатков будет соответствовать последовательности АХЭ электрического ската Torpedo california!) Активный центр ХЭ состоит из следующих центров и областей (Рис 1)

Рис 1 Молекула АХ (в центре, показана в виде шариков) в активном центре АХЭ электрического ската Torpedo cahformca (стереоизображение) А —район «анионного» пункта, Б—район ацильного кармана

Эстеразвый пункт включает каталитическую триаду (S200, Н440 и Е327), осуществляющую нуклеофильную атаку на карбонильный углерод субстрата, и "оксианионную полость" (GII8, G119, А201), образующую водородные связи с карбонильным кислородом субстрата "Гидрофобные области, окружающие эстеразный пункт", называются ныне "ацилъным карманам" (Рис i ,Б) Петля

ВВЕДЕНИЕ

ацильного кармана (остатки 279^-290) - область, которая стерически определяет допустимый размер ацильной группы субстрата и ацилирующих ингибиторов Считается, что главную роль играют остатки 288 и 290 У АХЭ позвоночных это - два объемных фенилаланина. а у бутирилхолинэстераз СБХЭ) позвоночных в аналогичных позициях - остатки с меньшей боковой цепью ([ 288 и V290 или 1290), что позволяет связывать субстраты и ингибиторы с большей ацильной группой

Холин-связывающий («анионный») пункт W84. В настоящее время термин "анионный" пункт употребляется обычно в кавычках, так как было обнаружено, что на соответствующем месте не расположено ни одной амиинокислоты с отрицатезьно заряженной боковой цепью Молекула АХ в полностью вытянутой конфигурации располагается так, что ее четвертичная аминогруппа контактирует с индольным кольцом W84 (Рис 1 ,А) Считают, что происходит взаимодействие между п-электронами ароматического кольца и положительно заряженным азотом АХ У АХЭ позвоночных в состав "гидрофобного участка, окружающий анионный пункт", который сорбирует спиртовую част ь незаряженных субстратов и незаряженные обратимые ингибиторы, кроме W84, входят остатки F(Y)330 и F331 Следует отметить, что применяемое ранее топографирование "гидрофобных областей в районе анионного пункта" с помошью ФОИ с различным строением отщепляемой группы (Kabachnik et al, 1963) оказалось совершенно не адекватным, так как выяснилось, что ориентация молекулы ФОИ на активной поверхности ХЭ принципиально отличается от ориентации молекулы субстрата - отщепляемая часть ФОИ направлена к D72 у входа в ущелье активного центра Это связано с различиями в направлении атак карбоксильного углерода и атома фосфора в реакциях соответственно с субстратом и ФОИ

Периферический "анионный" пункт (ПАП). Периферический "анионный" (аллостерический) пункт, характерный для АХЭз, взаимодействует со специфическими для него лигандами (пропидиумом, d-тубокурарином, галламином, амбенониумом, змеиным токсином фасцикулином), и бисчетвертичны-ми ингибиторами, образующими мостики между активным центром и ПАП (декаметониумом, Е2020, BW284C51), что приводит неконкурентному ингибированию фермента, и с ацетилхолином при его высоких концентрациях, что вызывает «субстратное ингибирование» АХЭ Показано обратимое взаимодействие ПАП с некоторыми ФОИ ПАП АХЭ члекопитаюших и рыб имеет сложную структуру и состоит из некоторого числа связывающих пунктов возле начала ушелья активного центра, общим центром которых являются D72 и W279 В состав ПАП также включают Y70 Y121, Е278, Y334 Области связывания различных лигандов различны, но перекрываются

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Исследованные холннэстеразы В качестве объектов исследования при изучении каталитических свойств хотинэстераз и их чувствительности к ингибиторам были использованы частично очищенные препараты АХЭ и БуХЭ злаковой тчи Schizaphis gramma (Homoptera Aphidmea), препараты АХЭ и БуХЭ гусениц хлопковой совки Helwthis armígera (lepidoptera), гомогенаты целых особей мучнистого червеца Pseudococcus mantimwi (Homoptera Coccínea), чистоблошек (Homoptera Psyllinea)- яблоневой Psylla malí и вязовсй Psylla ulmi, тлей (Homoptera Aphidinea) - сосновой Cinara pinea, березовой Symydobim oblongus, кизиловой Anoecia corn вязово-смородинной Eriosoma ulmi, ивовой Pterocomma Salicis, капустной Brevicorine brassicae. крестоцветной Brevicorine crambae, гороховой Acyrthosiphon ptium, серой яблоневой Dysaphis devecta, персиковой Myzus persicae, хлопковой Aphis gossipii, черемуховой Rhopalonphon padi и Кавариеллы Cavariella sp , черной бобовой Aphis fabae; паутинного клеща Tetranychus urticae (Acari Tetranychoidea), готов мясных мух Calliphora erythrocephala и С vicina (Díptera Rhopalocerá) Свойства ХЭ млекопитающих были исследованы на частично очищенных промышленных препаратах АХЭ эритроцитов человека и БуХЭ сыворотки крови лошади производства Пермского НИИ вакцин и сывороток с удельной активностью 2,2 и 9,6 мкмоль АХ в минуту на мг белка, и на гомогенате мозга мыши,

Кроме собственных результатов, в статистическом анализе были использованы все доступные данные дру1 их авторов о параметрах взаимодействия холинэстераз различного происхождения с холиновыми и тиохолиновыми субстратами и необратимыми ингибиторами

Методы измерения каталитической активности холинэстераз и скорости их взаимодействия с субстратами и необратимыми ингибиторами Для измерения каталитической активности ХЭ использовали метод Эллмана (Ellman et al., 1961), основанный на измерении количества тиохолина, образовавшегося в результате ферментативного гидролиза тиохолиновых эфиров карбоновых кислот, с помощью реактива Эллмана (5,5'-дитио-бис(2-нитробензойная кислота), ДТНБ) Стандартными условиями опыта были среда 0,05 M Na-фосфатного буфера рН 7,5 (рН 7,0 для АХЭ злаковой тли) и 1,3 ■ 10'3 M концентрация ацетилтиохолина (АТХ) (2.6-10'3 M бутирилТХ для БуХЭ злаковой тли и гусениц хлопковой совки)

В том случае, если кинечика гидролиза субстрата подчинялась уравнению Михаэлиса-Мснтен'

F-Ы {к^+кЛ-к, L к. . , . . , к, - к,

v= „ . = t \ ■ v=t V £= ас ^ ■ aJK, = I (1).

*„+[$] кг{к2+кг) {кг+кУ с '' (*_,+*,)

где v - стационарная скорость реакции, V - максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом, [5] - концентрация субстрата, [£] - концентрация фермента. к\, /г.], fcj. Ъ " константы скоростей соответствующих ступеней реакции, Км - константа Михаэлиса, ас - активность каталитического центра, величины V и Км определяли графически в координатах 1/v от 1/[S] (Lme-weaver, Burk, 1934) Величина ac в определенной степени характеризует скорость ацилирования (Aj), а соотношение ас/К}д - "сродство" фермента к субстрату, то есть скорость образования фермент-субстратного комплекса (k\!k,\).

В случае «субстратного ингибирования» константы ферментативного гидролиза субстратов расчитывали в соответствии с модифицированным нами уравнением из работы Radie et al, 1995-

i -_и (2),

V v t к„) v [s] V K„ 1 J

где K& - константа, характеризующая субстратное ингибирование В координатах 1/v от 1/[S] точки при [S] < [S]opt ложится на прямую, отсекающую на оси ординат отрезок, равный (1 + Km/K,s) ¡V, а на оси абсцисс - равный —С 1 //См ^ 1/^ss) В координатах 1/v от fS] точки при [S] > [S]opt ложится на прямую, отсекающую на оси ординат отрезок, равный (1 + Km/Kss) IV, а на оси абсцисс - равный -(Км + Ksi) Отсюда путем алгебраических преобразований определяли величины V, К-и» Kss,

Бимолекулярную константу скорости взаимодействия ХЭ с необратимыми ингибиторами рассчитывали, как правило, по формуле. 2,303 [4 ... 2,303 lg(v0/v,)

где kij - псевдомономолекулярная константа скорости реакции (М"' мин"'), [£]0 и [Я][ - концентрация свободного фермента до реакции и после t (1-5) минут взаимодействия с ингибитором в концентрации [/], v0 и V( - соответствующие скорости ферментативного гидролиза субстрата (Яковлев, 1961) Величину (lg(vo/v,)//) определяли графически по наклону прямой в координатах lg(vo/v,) от ■t Методы расчета кинетических параметров комбинированного ингибирования ХЭ ФОС описаны ниже

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили на компьютере IBM PC с помощью статистических пакетов SYSTAT и STATISTICA Конкретные условия проведения анализа указаны при изложении результатов Были использованы следующие статистические процедуры и методы.

Стандартизация данных. Эзо процедура преобразования данных, имеющих нормальное распределение N(a,c2), где а - среднее значение, а - дисперсия, в данные с нормальным распределением

N(0,1) В результате удается снизить влияние различий в абсолютной величине сравниваемых переменных на изучаемые закономерности

Ранжирование данных В том случае, если абсолютные значения каких-либо показателей не известны или их вообще невозможно определить количественно, результаты наблюдений выражают в порядковой (ординальной) шкале При этом показатели ранжируют, то есть выстраивают по порядку возрастания их интенсивности

Корреляционный анализ проводится с целью исследования взаимозависимости двух переменных Количественной мерой зависимости служит коэффициент корреляции, который варьирует от +1 (прямая пропорциональная зависимость) до -1 (обратная пропорциональная зависимость) Ноль означает отсутствие зависимости Для переменных, выраженных в количественных показателях, наиболее часто используется коэффициент корреляции Пирсона (г) При статистической обработке данных, выраженных в порядковой шкале, мерой сродства служат коэффициент ранговой корреляции Спирмена и гамма коэффициент Гудмана-Крускала (у)

Кластерный анализ позволяет разбить изучаемую совокупность объектов на группы "схожих" объектов, называемых кластерами. Для этого используют набор показателей (переменных), характеризующих исследуемые объекты, которые могут быть или количественными, или качественными. Мерой "сходства" объектов служат или различные коэффициенты корреляции переменных (см выше), или расстояния между объектами, например Эвклидово расстояние (длина диагонали л-мерного гиперкуба, ребрами которого являются количественные переменные), или процент несовпадений (в случае качественных переменных) Кластерный анализ начинается с получения матрицы коэффициентов корреляции или расстояний для каждой пары исследуемых объектов На ее основе затем происходит или иерархическая группировка (кластеризация) с построением дендрограммы, которая выражает относительную близость объектов и состоящих из них кластеров друг к другу (с помощью различных алгоритмов), или непосредственое разбиение совокупности объектов на заданное число кластеров (метод ¿-средних).

Факторный анализ При исследовании сложных объектов и систем часто невозможно исследовать причины, определяющие свойства этих объектов, а чаще всего неизвестны и их число, соотношение и содержательный смысл Такие причины в статистике называются факторами Для измерения доступны лишь внешние проявления этих факторов Метод факторного анализа позволяет свести все разнообразие наблюдаемых переменных к заданному числу новых признаков (факторов), обобщенно отражающих свойства объекта, и оценить их относи[ечьное влияние на исследуемые объекты В результате процедуры факторного анализа определяются два показателя, называемые нагрузками и значениями факторов Нагрузки выявленных факторов являются количественной мерой их связи с анализируемыми характеристиками Величины нагрузок варьируют от -1 до +1, где ноль означает отсутствие связи Значения факторов отражают связь факторов с анализируемыми объектами Следующим этапом исследования является интерпретация результатов факторного анализа, для чего проводится оценка достоверности связи величин нагрузок и значений факторов с какими-либо другими количественными или качественными характеристиками объектов Среди методов факторного анализа, метод главных компонент является наиболее часто используемым при сокращении размерности пространства данных.

Многофакторный дисперсионный анализ В случае, если известна природа факторов и они могут принимать лишь некоторое конечное количество значений (уровней), используют многофакторный анализ изменчивости При этом оценивается достоверность изменения результата в зависимости от уровней фактора Рели наблюдаемые значения результатов принадлежат к семейству нормальных распределений, для обработки данных применяют метод многофакторного дисперсионного анализа (multy-way analysis of variance, MANOVA) Суть этого метода состоит в сравнении дисперсии результатов между различными группами (уровнями фактора) с дисперсией внутри групп В том случае, если соот-

ношение лих дисперсий (Р-отношение) велико относительно табличных значений, делается вывод о достоверности влияния фактора на результат В многофакторном дисперсионном анализе может быть исследовано также взаимовлияние различных факторов Для этого оценивается достоверность влияния на результат сочетания этих факторов (обозначается как Фактор 1 * Фактор2) Низкая степень достоверности этого влияния (высокие значения р) свидетельствуют о "гомогенности наклонов", то есть об отсутствии влияния уровня фактора ! на результат от действия фактора 2, и наоборот

НОВЫЕ ДАННЫЕ О МЕХАНИЗМЕ КОМБИНИРОВАННОГО ИНГИБИРОВАНИЯ ХОЛИНЭСТЕРАЗ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

В экспериментах с некоторыми ФОИ наблюдаются значительные отклонения от кинетики бимолекулярной реакции, описываемой уравнением (3) А.П Бресткин с соавторами (1971, 1978) назвали это явление "комбинированным торможением" и предположили, что ФОИ при взаимодействии с ферментом, помимо продуктивного комплекса (Е1), переходящего в фосфорилированный фермент, образуют обратимые непродуктивные комплексы, не способные к фосфорилированию, однако уменьшающие концентрацию свободного фермента Вследствие этого ФОИ выступают в качестве обратимого ингибитора сначала реакции фосфорилирования (схема 1), а затем реакции гидролиза субстрата (схема 2)

к\ ¿2 ¿2

Е + 1 5 Е1 - ЕР Е + 5 = Е8 - Е8' - Е + Р2,

+ \ + ч

I Р I Р1

¿Т г ХТ /м,5

Е1Г (схема 1) Е15 (схема 2)

где Е - фермент, I - ингибитор, Е1 - продуктивный фермент-ингибиторный комплекс, ЕГ- фосфорилированный фермент, Р - отщепляемая часть мочекулы ингибитора, Е1г - непродуктивный фермент-ингиби-торный комплекс, в - субстрат, Ев - сорбционный фермент-субстратный комплекс, Е8' - ацилированный фермент, Р] и Рз - продукты реакции гидролиза субстрата, Е15 - фермент-ингибиторный комплекс в присутствии субстрата, К1Г и К15 - соответственно равновесные константы диссоциации комплексов Е1Г и Е15.

Это предположение позволило авторам объяснить и количественно оценить два характерных признака комбинированного торможения Во-первых, экспериментальная прямая в координатах !§(ус/уг) от ? не проходит через начало координат, а отсекает на оси ординат некоторый отрезок Как следует из уравнения

этот отрезок, численно равный 1д(л), может быть использован для определения величины константы К1 5 Величина бимолекулярной константы к, не зависящей от времени преинкубации, определяется исходя из величины тангенса угла наклона экспериментальной прямой Во-вторых, вышеупомянутая константа к зависит от концентрации ингибитора [/], что описывается уравнением к„

к = т-'■-г (5),

Н'У*.,)

где ка - "истинная" бимолекулярная константа, не зависящая от концентрации ингибитора и времени преинкубапии Величины констант каи К1Т определяют, исследуя зависимость в координатах 1 /к от [/]

В ходе наших исследований оказалось, что некоторые экспериментальные данные, в частности кинетика комбинированного ингибирования АХЭ и БуХЭ злаковой тли рядом ФОИ, не соответствуют

этим схемам взаимодействия В частности, во многих случаях величина отрезка, отсекаемого экспериментальной прямой на оси ординат в координатах 1в(У0Л>() от (, практически не зависит от концентрации субстрата, что противоречит уравнению (4).

Поэтому мы проанализировали схему, в которой ФОИ после добавления субстрата могут образовывать обратимые комплексы как со свободным, так и с ацилированным ферментом к\ к2

Е + в ¡5 ЕБ -» ЕБ' -1 Е + Р2 (схема 3)

+ ¿-14 +

I Р] I

Я

Е1 ЕБ'Ц

В этом случае уравнение (4) превращается в уравнение 2.3 , V, 2 3 К_ 2.3 ,(. Кл/к,,+[8]/К;, м,

где К11 = ((<:2 + к3) [Я5'] [/] / "») / [к2 [£57,]),"!- степень разбавления реакционной смеси раствором субстрата

Результаты опытов по ингибированию АХЭ и БХЭ злаковой тли исследованными ФОИ были нанесены на график в координатах от г, и были расчитаны величины пик, соответствующие

каждой прямой линии Величины констанг ка и К1 г были определены по точкам пересечения прямой соответственно с осями ординат и абсцисс на графике в координатах 1/4 от [/], соответствующих уравнению (5)

Для определения величин констант и мы предложили следующий метод, основанный на исследовании зависимости величины и от концентрации ингибитора и субстрата Для нахождения величины К1 8 экспериментально полученные величины п, наносили на график в координатах п>'ч0 от [Г\1т, соответствующих уравнению

+ М , г/Ь; П)

Абсцисса точки пересечения прямых для разных концентрациях субстрата [Б] равна (~К1 8), ордината - т( 1 - 1/а)!У Для нахождения величины /Г1>5 экспериментально полученные величины и наносили на график в координатах п от [Т\!т, соответствующих уравнению

у0 а.[*]./» а, [£]0/ш м

Абсцисса точки пересечения прямых для разных концентрациях субстрата [Б] равна ( 1С, 5), а ордината - Ку[ т-( 1 - 1/а)/К

Уравнения, определяющие величины абсцисс и ординат точек пересечения, не содержат концентрации субстрата [5], поэтому, если кинетика ингибирования соответствует уравнению (6), прямые для любых концентраций субстрата в указанных координатах пересекаются в одной точке

Результаты расчетов констант комбинированного ингибирования АХЭ и БХЭ злаковой тли ФОИ общей формулы СпН2п+10(СНз)Р(0)ЗСН28СН2С(0)0СНз представлены в Таблице 1. Видно, чю ингибирование как АХЭ, так и БХЭ тли происходит по комбинированному типу В случае БХЭ тли комбинированное ингибирование имеет больший обратимый компонент, чем в случае АХЭ тли Это совпадает с данными, полученными в опытах с ферментами млекопитающих - БХЭ лошади также имеет большую "склонность" к проявлению комбинированного ингибирования по сравнению с АХЭ эритроцитов человека В большинстве случаев обратимое ингибирование АХЭ тли осуществляется по

типу, близкому к конкурентному (величина АГ1 5 много меньше К?х 3) а ингибирование БХЭ - по типу, близкому к неконкурентному (величины Кх 5 и 1СХ $ примерно равны)

Таблица 1 Константы комбинированного ингибирования АХЭ и БХЭ злаковой тли фосфорорганическими ингибиторами общей формулы СпН2п+]О(СНз)Р(0)ЗСН28СН2С(0)ОСНз

n АХЭ БХЭ

& . M .мин r.M M M М^мин'1 *l>r, M M JTI>S, M

2 6 5-Ю6 4.4-10"7 3 3-10"7 2 MO"6 9.1-103 3.8-10-5 5 5-10"® 2 5-10-5

2 8-107 4 5-10"8 2.0-10-8 7 1-10"7 3 8-104 1 1-10-5 7 5-10-7 7.0-10-6

4 1.2-107 6.0-10-8 9 4-10"8 1.9-10"® 1.9-104 1 7-10-5 9 0-10"6 2.1-10-5

5 6,2« 107 1.3-10"7 6.7-10-8 1 3-10"7 7.8-105 1.2-10"7 1 3-10"7 2 9-Ю"7

6 5 0-108 2 4-10-9 1 5-10-8 5 0-Ю"8 3 0-Ю6 1.1-10-7 2 3-Ю'8 2 7-10-8

7 9. MO7 1 7-10"8 1 3-10-8 7 8-10"7 91-105 2 7-10"7 1.6-10"7 3 2-10-7

8 3.6-107 3.2-10"» 1 3-10-8 2 5-10"6 1 0-106 1 1-10"7 2.1-10"7 4.6-10-7

9 6.7-107 6.0-10-9 4 8-10-8 9 3-Ю"7 6.6-105 5.0-10-7 1.5-10-7 1.9-10-7

10 3.6-107 1.7*10-8 4 5-Ю"8 1 4-10"6 2 5-106 1.3-10"7 1.6-10"6 2.3-10-6

Большой интерес представляет исследование изменения величин констант ингибирования в исследованном гомологическом ряду ФОИ Полученные данные могут быть использованы для оценки относительной близости строения областей активной поверхности АХЭ и БХЭ тли, участвующих в образовании комплексов EI, Elr, EIS и ES'Is С этой целью был проведен кластерный анализ величин логарифмов соответствующих констант ингибирования (lg ka, -lg Kl T, -lg K1 s, -lg Результаты

показаны на рис.2.

Рис 2 Дендрограммы, отражающие различия зависимости величин констант комбинированного ингибирования от длины О-алкильного радикала в ряду ФОИ общей формулы CnH2n+10(CH3)P(0)SCH2SCH2C(0)0CH3 А - АХЭ, Б - БХЭ злаковой тли Слияние методом минимальной дисперсии Уорда, мера расстояния - 1 -г (г -коэффициент корреляции Пирсона)

Видно, что в случае БХЭ тли зависимости величин логарифмов констант и fls практически не различаются между собой По-видимому, ингибитор связывается с ферментом в комплексах EIS и ES'I на одном и том же участке, не изменяющем своей конформации в процессе ферментативного гидролиза В случае же АХЭ тли константа s значительно отличается от других констант по зависимости от строения ФОИ Следует сделать вывод, что участки, на которых сорбируется ингибитор, значительно различаются в случае свободной и ацилированной АХЭ, как по скорости связывания ингибитора (Табл 1), так и по своему строению Как уже отмечалось выше, в опытах с АХЭ мозга крысы была показана способность некоторых ФОИ образовывать обратимые комплексы вне активного центра - с ПАП Как у АХЭ, так и у ЬХЭ тли практически одинаковы требования к структуре ингибитора, предъявляемые участками связывания в продуктивном комплексе EI и непродуктивном Е1г

11

Расстояние О 05

igl-a

4*1«

1 о

I

а

I

"I

-№„ J

lg k - lg К

Кроме того, анализ уравнения (6) приводит к важным теоретическим выводам Каталитическую активность фермента в отношении субстрата, добавленного через ( минут взаимодействия с ингибитором, можно определить исходя из уравнения

Из этого уравнения следует, что экспериментально наблюдаемая картина ингибирования зависит от соотношения величин констант ка с одной стороны и A", r, Kl s, Кх s с другой, то есть от соотношения концентраций продуктивного и непродуктивных фермент-ингибиторных комплексов При высокой скорости фосфорилирования (высоких значениях кй) и низкой способности соединений образовывать непродуктивные комплексы (высоких значениях Ki r, A", s, Kl s) эксперименты по определению антиХЭ активности ФОИ могут проводиться только при [/] « Ki r, К\ s, /Г, s, те концентрация непродуктивных фермент-ингибиторных комплексов пренебрежительно мала, и в эксперименте наблюдается «чистое» необратимое ингибирование В случае соединений с относительно меньшей скоростью фосфорилирования (fca) для получения достаточной степени ингибирования (vq/vj) эксперименты проводятся при концентрациях [/], сопоставимых с величинами К, r, К\ s, А"\ s и наблюдается комбинированный тип ингибирования В другом крайнем варианте, когда в реакционной среде преобладают непродуктивные фер-мент-ингибиторный комплексы (низкие значения кг и низкие значения К\ г, К\ s. К", s), степень ингибирования должна в основном определяться величиной второго члена уравнения, lg(и), и практически не зависеть от времени преинкубации I Прямая в координатах lg(v0/vt) от ' будет проходит горизонтально, то есть экспериментально наблюдаемое ингибирование будет по внешним признакам обратимым

Анализ уравнения (9) показывает, что отсутствует принципиальная разница между необратимым и комбинированным типами ингибирования Можно утверждать, что при взаимодействии с холин-эстеразами любые ФОИ образуют и продуктивные, и непродуктивные фермент-ингибиторные комплексы, то есть осуществляют комбинированное ингибирование, которое в зависимости от соотношения величин констант ка и г, Ki s, JC1 s может в крайних вариантах принимать вид "чисто необратимого" и "псевдообратимого" ингибирования.

Таким образом, проведенные исследования кинетики взаимодействия ХЭ злаковой тли с ФОИ позволили уточнить механизм комбинированного ингибирования, а выведенные кине1ические уравнения позволяют более точно рассчитывыть соответствующие константы ингибирования

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ДАННЫХ О СУБСТРАТНО-ИНГИБИТОРНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Субстратная специфичность

Субстратную специфичность ХЭ исследована у многих животных, стоящих на разных ступенях эволюционного развития Результаты были обобщены и анализированы с точки зрения зависимости относительной скорости гидролиза различных субстратов от их структуры в нескольких обзорах Однако никогда не анализировали в сравнительно-эволюционном плане такие аспекты субстратной специфичности ХЭ, как зависимость величины констант "субстратного ингибирования" (К„) и "сродства" субстрата к активному центру фермента (V/Кч) от структуры субстрата.

Мы постарались обобщить все доступные данные о скорости гидролиза, "сродстве" субстрата к активному ценгру (VIКм) и константы "субстратного ингибирования" (К„) при гидролизе холиновых (АХ, ПрХ, БуХ, МеХ) и тиохолиновых (АТХ, ПрТХ, БуТХ, МеТХ) субстратов холинэстеразами различных животных Были расчитаны относительные величины этих параметров (в процентах к параметрам для АХ или АТХ) Во-первых, именно эти отношения и являются количественной мерой субстратной специфичности Во-вторых, в большинстве использованных работ концентрацию активных центров ХЭ в препарате не определяли, и рассчитывали максимальную скорость (V) холинэстеразного гидролиза, а

не активность одного каталитического центра (ас) Так как степень очистки препаратов была весьма различной сравнение разных ХЭ по абсолютным значениям V и У/Км невозможно

В данном разделе проанализирована зависимость характера субстратной специфичности ХЭ от таксономической принадлежности животных и исследованных тканей (всего 81 фермент 65 животных) В целом анализ показал, что свойства как синаптической, так и несинаптической ХЭ не одинаковы у животных различных типов и, часто, даже различных отрядов В филогенетических рядах как позвоночных, так и беспозвоночных (насекомых и моллюсков) не прослеживается никакой достоверной зависимости изменения субстратной специфичности ХЭ соотношений скоростей гидролиза различных субстратов и их относительного сродства к активному центру и ПАП Более подробно результаты анализа изложены в нашем обзоре [29]

Специфичность взаимодействии с шестью стандартными необратимыми ингибиторами В этом разделе мы рассматриваем избирательность действия карбамата эзерина и 5-ти ФОИ (диизопропилфторфосфат (ДФФ) [(СНз)2СН0]2Р(0)Р; 0-этил-8-(р-этил,метилсульфониоэтил)-метил-тиофосфонат сульфометилат (Гд-42) С2Н50(СНз)РГО)5(СН2)25+(СН3)С2Н5 СЬ^О^ ; О-этил-Э-ф-этилмеркаптоэтил)метилтиофосфонат (Гд-7) С2Н50(СНз)Р(0)8(СН2)2$С2Н5; 0,0-диэтил-8-(|3-этил, метилсульфониоэтил)тиофосфат сульфометилат (МИС) (С2Н50)2Р(0)5(СН2)254"(СНз)С2Н5 СНзЗО^; 0,0-диэтил-8-(3-этилмеркаптоэтил)тиофосфат (изосистокс, ИС) (С2Н5<Э)2Р(0)8(СН2)23С2Н5) в отношении 90 ХЭ разных органов и тканей 67 различных животных, стоящих на разных уровнях эволюции-онного развития (всего 553 константы)

Эти соединения наиболее широко использовались отечественными исследователями при сравнительном исследовании ингибиторной специфичности ХЭ различных животных Их выбор обусловлен следующими причинами Считается, что высокая чувствительность к эзерину является свидетельством принадлежности фермента к семейству ХЭ Диизопропилфторфосфат (ДФФ) - один из первых синтезированных и один из наиболее исследованных ФОИ. Он рассматривается в энзимологии как ингибитор, специфичный в отношении ссриновых гидролаз, хотя наиболее активен в отношении БХЭ. Остальные ФОИ представляют собой 2 пары производных метилтиофосфоновой (Гд-42 и Гд-7) и тиофосфорной кислот (МИС и ИС) В каждой паре - ФОИ с сульфидным (Б) атомом в отщепляющейся группе (Гд-7 и ИС) и соответствующий ему сульфониевый (Б*') сульфометилат (Гд-42 и МИС) Соотношение эффективности Гд-42 к Гд-7, МИС к ИС отражает чувствительность фермента строению отщепляемой группы ФОИ (хотя введение в молекулу катионной группы снижает также прочность сложноэфирной связи, т е увеличивает фосфорилирующую способность ФОИ). С другой стороны, соотношение эффективности Гд-42 к МИС, Гд-7 к ИС отражает чувствительность фермента к строению фосфорильной части ФОИ и дает определенную информацию для классификации ХЭ Известно, что у млекопитающих ферменты типа АХЭ проявляют большую чувствительность к тиофосфочовым производным (Гд-42 и Гд-7), а фермент ы типа БХЭ или ПХЭ - к тиофосфорным производным (МИС и ИС), что определяется различиями в строении ацильного кармана их активного центра

Гомогенность и гетерогенность холинэстеразного препарата Исследованы данные по величинам 4ц для одной и той же ХЭ, определенным с использованием разных субстратов В том случае, если они различаются не в 1 5-2 раза, а на несколько порядков, можно с уверенностью сделать вывод о наличии в ферментном препарате нескольких ХЭ, специфичных в отношении различных субстратов и имеющих разную чувствительность к дачному ФОИ И наоборот, близкие величины кц, определенные с помощью разных субстратов, могут свидетельствовать о гомогенности препарата ХЭ Достоверность того или иного вывода мноюкратно повышается при использовании нескольких ингибиторов, значительно различающихся по структуре. Этот метод, названный методом субстратно-ингибиторного анализа, широко используется при оценке гомогенности или гетерогенности холинэстеразных препаратов Таким образом установлена гомогенность препаратов ХЭ сыворотки крови курицы и голубя, ганглиев

таракана Nauphoeta cinerea, перелетной саранчи Locusta migratoria и прудовика Limnaea stagnalis, голов весенней капустной мухи Delia brassicae, ткани зрительных ганглиев различных кальмаров Наряду с этим в организме некоторых животных показано присутствие по крайней мере 2-х ХЭ1 тлей, гусениц и имаго совок, личинок и имаго наездника Apanteles glomeratus, имаго американского таракана Предполагается присутствие смеси по крайней мере двух ферментов в гомогенатах зрительных ганглиев каракатицы и некоторых кальмаров, а также в гомогенате мышц морской полихеты

Сравнительная чувствительность различных ХЭ к изученным ингибиторам и к изменению структуры фосфорильной и отщепляемой грунпп ФОН Как и в случае субстратной специфичности, были выявлены как разнообразие ингибиторной специфичности у животных различных групп, так и ее сходство у близкородственных видов Не прослеживается достоверной зависимости ингибиторной специфичности ХЭ в филогенетических рядах как позвоночных, так и беспозвоночных (насекомых и моллюсков) животных Подробно результаты анализа изложены в нашем обзоре [35]

Специфичность взаимодействии с диалкилфосфатами. имеющими алкильные радикалы различной длины и разветвленное™

Самой обширной группой исследованных ФОИ являются производные диалкилфосфорных кислот с различивши по структуре заместителями в отщепляемой части молекулы Были проанализированы собственные и литературные данные о скорости взаимодействия (Ац, М'1 мин"') ХЭ различных млекопитающих и членистоногих с ФОИ общей формулы (А1кО)2Р(0)Х, где Alk = Me, Et, Pr, Bu, Pen, Hex, í-Pr, i-Bu, i-Pen (263 соединений 57 рядов, от 2 до 10 исследованных ферментов, всего 879 констант)

Чтобы облегчить анализ этого огромного массива данных, мы предложили рассчитывать «усредненную» зависимость антихолинэстеразной активности от строения алкильных радикалов Для того чтобы учитывать также неполные ряды соединений, использовали не абсолютные значения констант, а градиент их изменения при переходе от одного соединения к другому (логарифм отношения ингибиру-ющей константы для второго соединения к константе для первою) При этом положетельное значение югарифча означает увеличение антихолинэстеразной активности, отрицательное - ее уменьшение, смена знака с положительного на отрицательный - переход через максимальное значение активности, а смена знака с отрицательного на положительный - переход через миниальное значение

Полученные результаты представлены на Рис 3 Видно, что несмотря на некоторые индивидуальные особенности, в каждой из групп ферментов наблюдается свой характер зависимости чувствительности от длины алкильных радикалов ФОИ Существует значительное отличие между ХЭ млекопитающих и большинством других ХЭ В первом случае (Рис 3, А-Г) активность возрастает при удлинении нормальных алкильных радикалов вплоть до дибутила или диамила и затем снижается, во втором (Рис 3, Д-К), как правило, наибольшей эффективностью обладают диэтильные производные Третий вариант представлен БХЭ хлопковой совки (Рис 3, И), где дибугильные или диамильные производные более чем на порядок превышают по эффективности своих ближайших соседей Несомненно, это обусловлено различиями в строении активного центра исследованных ХЭ

Исследование влияния структуры ФОИ общей формулы (п-А1Ю)2Р(0)Х на их ингибирующую активность в отношении различных ХЭ было продолжено с использованием многофакторного дисперсионного анализа Так как эта статистическая процедура требует матрицы данных с минимальным количеством пустых клеток, ферменты были объединены в две группы (ХЭ млекопитающих и АХЭ насекомых), было сокращено количество рядов ингибиторов и количество различных алкилов - были использованы данные о чувствительности различных ХЭ к соединениям общей формулы (n-AlkO)2PÍO)SX, где Alk = Et Hex, X = лупинил, эпилупинил, лупинил иодметилат, эпилупинил иодметилат, пропаргил, 4-пиперидилбут-2-инил

Рис 3 Градиент (Д lg кц) изменения ингибирующей активности ФОИ общей формулы (А!кО)2Р(0)Х при последовательном удлинении алкильных радикалов и изменении их разветвленности (среднее ± ошибка среднего)

А - АХЭ эритроцитов человека,

Б - АХЭ мозга мыши, В - АХЭ эритроцитов кролика,

Г - БХЭ сыворотки крови лошади, Д-ХЭ мух, Е - АХЭ тлей, Ж - АХЭ гусениц хлопковой совки, 3 - ХЭ мучнистого червеца,

И - ХЭ паутинного клеща,

К - БХЭ злаковой тли, Л - БХЭ гусениц хлопковой совки

a—Me -»Et, б—El -> Рг, в—Pr -»Bu, г—Bu -> Реп, ó—Реп -» Не.х, e-i-Pr-> i-Bu, ж—i-Bu —► i-Pen, з—Et —* i-Pr, и—Pr —* i-Bu, к—Bu —> i-Реп, Jl—Рг —* i-Pr, м—Bu —► i-Bu, н—Реп i-Реп.

Цифры под столбиками означают число наблюдений.

Многофакторный дисперсионный анализ этой сокращенной базы данных показал, что антиХЭ активность соединений достоверно зависит от группы ферментов ("группа", р«0,001), от структуры отщепляемой части X ("X",/><0,001 ) и ог сочетания этих факторов ("группа * Х",р=0,002), что свидетельствует об избирательности действия ФОИ с различной отщепляемой частью в отношении различных групп ХЭ Влияние длины алкилов на антихолинэстеразную активность ФОИ в целом не достоверно ("Alk", 107), что связано с разнонаправленностью изменения активности при удлинении алкила в разных группах ферментов (рис 3) В то же время группы ферментов достоверно различаются по зависимости чувствительности к ФОИ от длины алкилов ("группа * Alk", 0,026) Совершенно недостоверным было влияние сочетания факторов "Alk х X" (р=0,987) Это свидетельствует о том, что в исследованных рядах соединений и группах ферментов структура отщепляемой части молекулы ФОИ (X) не отражается на зависимости антихолинэстеразной активности от структуры фосфорильной части (Alk), и наоборот

МНОГОМЕРНЫЙ СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СТРОЕНИЯ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ХОЛИНЭСТЕРАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Исследование вариабельности строения «каталитической машины» активного центра холииэстераз

С этой целью было проанализировано взаимное расположение остатков «анионного» пункта (W84), каталитической триады (S200, Н440, Е327) и оксианионной полости (Gl 18, Gl 19, А201) в 15 трехмерных структурах — АХЭ электрического ската Torpedo califormca 2АСЕ (со встроенной молекулой АХ), 1ЕА5, 1AMN (комплекс с аналогом переходного состояния от-ГМ,М,М-триметиламино)три-фторацетофеноном (NAF)); АХЭ электрического угря Electrophorus electncus - цепи А, В, С и D тетрамера 1С20, АХЭ мыши Mus musculus - цепи А, В, С и D тетрамера 1МАА, АХЭ мухи Drosophila melanogaster. нативная (1Q09) и в комплексе с 9-(3-фенилметиламино)-1,2,3,4-тетрагидроакридином (1D4X) и 9-(3-иодобензиламино)-1,2,3,4- тетрагидроакридином (1QON) , а также гомологичная модель АХЭ человека 2CLJ В Таблице 2 приведены расстояния между С0-атомами этих остатков

Таблица 2 Взаимные расстояния между С0-атомами аминокислотных остатков активного центра различных холииэстераз (А, средние значения ± стандартное отклонение, и=15)

Остаток W84 Gl 18 Gl 19 S200 А201 Е327 Н440

W84 0 8 46±0 29 И 86*0 29 12 72*0 36 13.63±0 27 16 16±0 20 11 93±0 21

Gl 18 8 46±0 29 0 3.79±0 02 6.64±0 15 5.87±0.16 13.72±0.18 10.76±0.24

Gl 19 11 86±0 29 3 79±0 02 0 6 91±0 17 5.21 ±0.28 13.54±0.22 11 76±0 21

S200 12.72±0.36 6 64±0.15 6.91*0 17 0 3 82±0 02 10.05±0.11 8.07±0 17

А201 13 63±0 27 5.87±0 16 5 21±0 28 3 82±0 02 0 13 34±0.14 11 55±0.]4

Е327 16.16±0 20 13 72±0 18 13 54±0 22 10 05±0 11 13 34±0 14 0 4.60±0 22

Н440 11 93±0 21 10.76±0 24 11 76±0 21 8 07±0 17 11.55±0.14 4 60±0 22 0

Видно, что структура активного центра достаточно консервативна В большинстве случаев стандартные отклонения не превышают 1-3% от средних величин Наибольшую вариабельность положения проявляет "анионный" пункт - \У84

Следующим этапом было проведение пространственного совмещения структур с помощью программы написанной к х н А А Суворовым Исходя из данных, приведенных в Таблице 2, в качестве начала координат при пространственном совмещении был выбран атом Са (8200), затем совмещение проводилось по линии, проходящей через атом Са (Е327) и далее в плоскости, проходящей через атом Сц (Ш84) Результаты совмещения представлены на Рис 4

16

Рис.4 Стереоизображение пространственно совмещенных активных центров различных АХЭ Молекула апетилхолина ориентирована относительно АХЭ ската 2АСЕ Пунктиром показаны водородные связи

Видно, что структуры всех исследованных АХЭ практически совпадают Резкие отклонения наблюдаются только для натив-ной АХЭ мухи 1 <309 (в отличие от всех других ферментов бицикл триптофана повернут, на рисунке, горизонтально и имидазол гистидина смещен кверху) и для гомологичной модели АХЭ человека (в отличие от других АХЭ гидроксил серина направлен от зрителя и развернута карбоксшрунпа боковой цепи глушминовой кислоты)

Таблица 3 Расстояния между функциональными группировками и лигандами в активном цен гре различных холинэстераз (А, средние значения ± стандартное отклонение)

Расстояния АХЭ ската 2АСЕ АХЭ ската 1AMN АХЭ ската (л=3) АХЭ мыши (и=4) АХЭ угря (л=4) АХЭ мухи (й=3) АХЭ человека («=1) Все АХЭ (л=15)

n(0118) _ Q?(AX) 2 96 3 10 ± 0 12 3.29 ±0 03 3.51 ±0 00 3 05 ±0.11 3 17 3.25 ±0 19

n(GI19)_07<AX) 2 72 2 88 ±0 16 2 90 ±0 01 2 93 ± 0 00 2 86 ±0.16 2.82 2 89 ± 0 09

¡^А201) _ Q7(AX) 2 86 3 00 ±0 21 3 36 ± 0 06 3 40 ± 0 00 3 34 ±0 15 3 10 3 28 ± 0 19

q (S200) _ C,(AX) 1 48 1 42 ± 0 08 1 1 26 ± 0 03 1 20 ± 0 00 1 57 ±0 13 2.77 1 34± 0 162

C7(W84>-Ni(AX) 5 10 5 08 ± 0 03 4 66 ±0 14 4 55 ± 0 00 5 22 ± 0.093 5 01 4 82 ± 0 28"

n(G118)_0i(NAF) 3 08 291 ±0 19 3 19±0 16 3 54 ± 0 00 j 2.95 ± 0 09 3 04 3 17 ±0.28

j^icm) _ ol'NAF) 3 32 3 12 ±0 18 3 26*002 3 27 ± 0 00 3 19±0 12 3 11 3 21 ±0 10

n(A201)_Q (NAF) 3 97 3 74 ± 0 20 I 4 И ± 0 07 4 17 ±0 00 3 98 ± 0.05 3 83 401 ±0 19

oß200,_C|WAF) 1 965 1 94 ± 0 03 ' 1 82 ± 0 04 1 79 ± 0 00 2 08 ±0 31 2 74 1.89 ± 0 17 2

C^(W84) ^ N (NAF) 3.96 4 05 ± 0 08 3.51 ±0.13 3 43 ± 0.00 4 17 ± 0 043 3.99 3 73 *0 33 4

O^-Ne/"440' 2 70 2 83 ±0 18 1 2 99 ± 0 07 2 80 ± 0 00 3 08 ± 0 69 3 84 2 99 ± 0 39 2

NM^-OÜ03"' 2 52 2 65 2 58 ±0 07 2.74 ± 0 06 2 86 ± 0.00 3 20 ± 0 79 3.12 2 86 ±0 38

n (S200) r (W84) Cß L.r 10 49 10 15 10.37 ± 0 19 961 ±0.10 9 69 ± 0 00 10 39 ± 0 163 10 37 9 96 ± 0 38 4

Примечания '- п—2, без АХЭ ската 1АМ1М, 2 - «=13, без АХЭ ската 1АМЫ и АХЭ человека, 3 - и=2, без АХЭ мухи 1(309, 4 - л=14, без АХЭ мухи 1009,5 - приведено расстояние Ср<5200) - 02(*АП, так как От(5200) перемещен к атому С] молекулы ЫАР и стал 02(МАГ)

В Таблице 3 приведены расстояния между функциональными группировками АХЭ различного происхождения и атомами молекул АХ и NAF, встроенных в активный центр АХЭ ската (структуры 2АСЕ и 1AMN соответственно) АХЭ мухи 1Q09 и АХЭ человека в некоторых случаях исключены из расчета из-за упомянутого несовершенства структуры Видно, что несмотря на то, что на рисунке 4 положение остатков оксианионной потости (GU8, Gl 19, А201) в различных АХЭ несколько варьирует, расстояния от них до карбонильного кислорода О7 АХ, а также до его аналога Oi в NAF, близки между

собой Также близки в различных АХЭ расстояния от гидроксила серина до карбонильного углерода С5 (С1 в ЫАР) и от триметиламмониевых групп лигандов до "анионного" пункта Это подтверждает достаточно точное совмещение структур Полученные данные свидетельствуют о высоком консерватизме строения "каталитической машины" активного центра АХЭ Следовательно, различия в скорости взаимодействия ХЭ с субстратами и ингибиторами определяются различиями в строении областей, окружающих активный центр

Исследование строения ацильного кармана холинэстераз

Для идентификации аминокислотных остатков, участвующих во взаимодействии ФОИ с активным центром ХЭ, мы использовали рассчитанные ранее (см рис 3) градиенты изменения антихолинэс-теразной активности (Д^ кп) диалкилфосфатов общей формулы (А1к0)гР(0)Х при последовательном удлинении алкильных радикалов и изменении их разветвленное™ Полученные величины были сопоставлены с 4 физико-химическими характеристиками 14 вариабельных аминокислотных остатков, составляющих ацильный и алкоксильный карманы ХЭз с известной последовательностью (Таблица 4) -с их гидрофобностью (Е^епЬе^ е1 а1, 1984), полярностью (\Voese е1 а1, 1966), изоэлектрической точкой (Уайт и др, 1981) и объемом (СгещМоп, 1992) Эти показатели характеризуют "реакционноспособ-ность" активного центра и связаны с различными аспектами взаимодействия фермента с лигандами гидрофобными взаимодействиями (гидрофобность остатка), способностью образовывать водородные связи (его полярность), ион-ионные взаимодействиями (изоэлектрическая точка) и стерическими препятствиями при сорбции лиганда (объем)

Таблица 4 Аминокислотные остатки ацильного и алкоксильного карманов, вариабельные в исследованных холинэстеразах

Фермент Номер остатка в аминокислотной последовательности АХЭ электрического ската Torpedo cahfornica

0 г- CN <ч 00 ÍN чо 00 (Ч Г..... эс сч оо 00 ся сл 00 (Ч о сл ÍN о» сч fl о г*-) гЛ Cl ÍN ) ^ ГЛ 1 ГЛ f! irt m rn

АХЭ человека W L S V F R F S Y F L V G

АХЭ мыши W L S 1 ' F R F S Y F L V G

АХЭ кролика W L S I F R F Т Y F L V G

БХЭ лошади V V Т L L S V Т А F L V G

АХЭ злаковой тли W V А I с F F Y Y S 1 F Y

АХЭ хлопковой совки W Y G 1 L G F Т Y F L L D

АХЭ комнатной мухи W Y G I L S F ' Т Y F L L D

ПХЭ паутинного клеща Е Т G V V Е F | Т V 1 L V H

На первом этапе методом корреляционного анализа были отобраны для каждого случая наиболее значимые зависимости, далее с помощью метода регрессионного анализа быти выявлены и исключены "выпадающие наблюдения", которыми считали точки, отстоящие далее чем на 2ст от линии регрессии (на Рис 5 помечены стрелками) На Рис 5 представлены окончательные результаты - графики, отражающие зависимость величин градиента кп при удлинении алкильных радикалов и изменении их разветвленное™ от физико-химических характеристик конкретных аминокислотных остатков Следует отметать, что представленные зависимости относятся только к исследованным ферментам и не могут быть достоверно экстраполированы на другие ХЭ

Видно, что остаток 290 критичен при взаимодействии ФОИ, имеющих короткие алкильные радикалы (этильные и изопропильные), с ацильным карманом ХЭ (Рис 5, А,С,Х). Так как этот остаток существует лишь в двух вариантах (V или И), значимость одинакова для всех 4 параметров, отличается лишь направление изменения (увеличение или уменьшение) величины градиента кп при возрастании

и

Т 1

и

I

Л® О —1

<

А

- _ ---_---,-- ---'----

! 1 1 _1_^__!_ 1*1 I г

"ТГ"Г

1 1 ! 1 1; ' 1

г 1 1 ^ I * ■ ! 1 |

1 ^-, | [п-Ю Р = 0 027 | А '

1 ' ! | II-Г 1 1 ! 1 1 1

I |У| II 1.111, ]--+- -1 -+ ~т - Г г г 4 1 ;

Объем остатка 290

Объем остатка 335

Гидрофобноетъ остатка 282

Объем остатка 335

^ Е г

СО

1

£ 05

а 00

во

< 05

1,0

-1 5

II'1 I —^------

- - —г—41--1----

и-ЬЧ:* !

|пМ0 р = 0 0018 |

АЭ

Объем остатка 286

Объем остатка 287

Ж!

. I

£ о .1 т

а

-2

<

*

¡г>» 77 р»ООрГ}

Объем остатка 290

Гидрофобноеть остатка 335

ю

I !

£ "Г 1!

Л

! I

| !'п 3 а1 Р* 00001]

Изоэтактрическая точка остатка 279

Объем остатка 290

25 г

1

15

Ага) 1 0

1

05

В

00

<

-05

•1 0

-1 5

I -

М-

« *

■ ! ,

+ I I

|п»40 г2- 0 26 г• 0 53 р»00006 У--241 ♦ 233*х!

! I I .¡II

Изоэлектрическая точка остатка 279

Гидрофобноотъ оотатка 287

Рис 5 Зависимость величины Alg кц (по оси ординат) при удлинении алкильных радикалов и изменении их разветвленное™ в рядах ФОИ общей формулы ГА]к0)2Р(0)Х от величины различных параметров аминокислотных остатков анильного кармана ХЭ (по оси абсцисс, стандартизированные единицы, соответствующие остатки помечены буквами) / ПХЭ паутинного клеща, II—АХЭ тлей, III— АХЭ хлопковой совки, IV— АХЭ мух, V—АХЭ мыши, VI—АХЭ кролика, VII— БХЭ лошади, VIII—АХЭ человека, IX—отброшенные точки, X— 95%-ный доверительный интервал А—Me —> Et, Б—fct ~> Рг, В -Рг -~> Ви, Г—Ви -> Реп, Д—Pen -» Hex, Е ;-Рт i-Bu, Ж—Et -> i-Pr, 3—Рт i-Bu, И— Ви ->■ i-Pen, К—Рг —» i-Pr, Л—Ви —► i-Bu, М—Реп —> (-Pen. п - число исследованных пар ингибиторов, г— коэффициент корреляции Пирсона, р—уровень его значимости

интенсивности параметра Чтобы выбрать адекватный параметр, руководствовались следующими соображениями 1) алкильный радикал (кроме метильного) представляет собой достаточно гидрофобную структуру, поэтому при возрастании гидрофобности остатка градиент lg кц должен возрастать, а при возрастании полярности - снижаться, 2) в случае экстремальных значений изоэлектрических точек, характерных для заряженных остатков, сорбция радикала должна ухудшагься, при эюм градиент lg кц должен понижаться, 3) остатки расположены на поверхности молекулы фермента, поэтому при увеличении объема остатка градиент lg кц должен понижаться В соответствии с этими критериями, был сделан вывод, что при взаимодействии с ФОИ критичен объем остатка 290

Некоторые другие остатки также стерически препятствую! сорбции алкильных радикалов ФОИ в ацильном кармане ХЭ. остаток 335 (Et —> Рг, Рис. 5, В, Ви —> Реп, Рис 5, D), остаток 286 (Реп —» Hex, Рис 5, Е) и остаток 287 (¡-Рг —» /-Ви, Рис 5, F) В некоторых случаях градиент lg kn прямо пропорционален гидрофобности остатков, которая способствует сорбции радикалов Это остатки 282 (Рг —> Ви, Рис 5, С), 287 (Реп —> /-Реп, Рис 5, L) и 335 (Рг —» i-Bu, Рис 5, Н) ПХЭ паутинного клеща имеет заряженный остаток (Е) в позиции 279 вместо валина в БХЭ лошади и триптофана во всех остальных исследованных ХЭ По-видимому, этот заряд препятствует связыванию гидрофобных алкильных радикалов в ацильном кармане ПХЭ паутинного клеща (Ви —♦ /-Реп, Рис 5,1, Ви —► <-Ви, Рис 5, К) Чтобы подтвердить это предположение, следует исследовать большее число рядов ФОИ в реакции с этим ферментом

В настоящее время общепринято, что размеры ацильного кармана фермента определяют допустимый объем как фосфорильной части ФОИ, так и ацильной части субстратов Это положение подтверждается данными, представленными на Рис 6 Существует достоверная (р < 0 05) корреляция между изменением антихолинэстеразной активности при увеличении фосфорильной части ФОИ и вменением скорости холинэстсразного гидролиза при увеличении ацильной части холиновых субстратов

""-1 Рис 6 Зависимость меж-

г ' ду отношением скоростей А ферменативного гидроли-// [ за ПТХ и БТХ (абсцисса),

и отношением антихоли-

1 нэстеразной эффективности двух пар ФОИ, производных О-этилметилтио-фосфорной и 0,0-диэтил-тиофосфорной кислот

(ординаты). I—БХЭ сыворотки лошади, 2— АХЭ капустной мухи, 3—ПХЭ

-04 "02

00

02

10 12

41* 412 00 02 04 00 00 10

2 14 сыворотки кур, 4—АХЭ

18(vm,rrDi/vm,STX)

vm, БТХ)

быка, 5— АХЭ злаковой тли.

Полученные данные позволяют сделать следующие общие выводы

1 Несмотря на то, что структура отщепляемой части в исследованных рядах диалкилфосфатов варьирует в очень широких пределах, существует статистически достоверная (в большинстве случаев) связь между характером изменения ингибируюшей активности при изменении алкильных радикалов и физико-химическими характеристиками определенных аминокислотных остатков ацильного кармана В то же время относительно невысокие величины коэффициента корреляции свидетельствуют о влиянии структуры отщепляемой части ФОИ на зависимость ингибирующей активности от структуры фосфо-рильной части, что неоднократно подчеркивалось ранее

2 Как правило, по мере удлинения алкильных радикалов достоверность полученных регрессионных уравнений снижается Это, по-видимому, связано с увеличением числа возможных конформацион-ных состояний молекулы, что приводит к увеличению числа центров связывания радикалов

Выявление участков активного пентра холинэстераз насекомых, определяющих различия

в их чувствительности к необратимым ингибиторам

Выявленные значительные различия в субстратно-ингибиторной специфичности холинэстераз, связанные с таксономическим положением животных, навели на мысль использовать ее для их объективного сравнения и классификации Характер зависимости антихолинэстеразной активности от структуры ингибиторов достаточно специфичен для ХЭ из разных источников и может быть использован для оценки их сродства.

Хотя данные, полученные различными авторами, значительно варьируют по составу исследованных ферментов и ингибиторов, их можно сгруппировать в несколько таблиц Три набора данных были использованы для статистического анализа 1) константы скорости взаимодействия четырех стандартных ингибиторов - эзерина, ДФФ, Гд-42 и Гд-7 с АХЭ 29 различных насекомых, БХЭ трех видов тлей, карбоксилэстераз (КЭ) саранчи и таракана и "типичных" ХЭ млекопитающих- АХЭ эритроцитов человека и быка и БХЭ сыворотки крови лошади, преобразованные нами в логарифмическую форму, 2) величины Ьо для ингибирования ХЭ пяти видов насекомых и АХЭ мозга крысы шестью различными ингибиторами (время преинкубации не указано) (Pilz, 1980), преобразованные нами в отрицательную логарифмическую форму, 3) кривые автоанализатора, показывающие снижение активности холинэстераз в гомогенатах голов шести видов насекомых и АХЭ бычьих эритроцитов под действием шести ингибиторов (преинкубация 1 мин, степень ингибирования не выражена в цифрах) (Voss, 1981), преобразованные нами в таблицу порядковых значений соответственно возрастанию их ингибирующей активности

Иерархический кластерный анализ, то есть построение дендрограммы, отражающей сходство исследуемых объектов (ферментов) в соответствии с исследованными характеристиками (чувствительностью к определенным ингибиторам), был проведен с помощью программы Statistica Мерой расстояния между объектами были выбраны Эвклидово расстояние для количественных данных наборов 1 и 2, и величины 1-у (где у - гамма коэффициент Гудмана-Крускала) для порядковых данных набора 3 Слияние кластеров проведено методом наиболее удаленного соседа

Результат кластерного анализа данных набора 1 представлен на рис.7,А Видно, что БХЭ трех видов тлей образуют кластер, близкий к кластеру КЭз таракана и саранчи Это подтверждает высказанное нами [1,2] предположение, что БХЭ злаковой тли является ферментом, сочетающим в себе признаки ХЭ и КЭ По-видимому, сказанное относится и к БХЭ других насекомых. Было показано [9], что БХЭ гусениц хлопковой совки, также как и БХЭ тлей, нечувствительна к катионсодержащим ингибиторам, что является свойством, характерным для карбоксилэстераз

Cinara pmea -

Anoeaa comí — Rhopaíosiphon padi • Pterocomma sahcis -

Myzus persicae -

Symydobius oblongus-

Acyrthowphon ptsum -

Aphis gossipii -

Lnosoma ulna -

Schizaphls gramina —

Cavariella sp -

Brevicorme crambae -Brevlcortne brassicae •

Dysaphis devecta -

Musca domestica -

Delta brassicae -

Deba antiqua -

Delia floralis

Равнокрылые Тли ' Hотпорtera Aphidtdae

Locusta migratoria -

Pocfysus maculrventris ——■ Pertplaneta americana — Coccinella septempunclata

Cycíoneda lumbifer-

Chrysopa carnea Chrysopa sínica

h

Pseudococcus maritimus

Psylla иШ ■— ■ —.....

Psylla malí -

Apanteles glomeratus —

human -

cattle -

Schizaphls gramina — Acyrthosiphon pisum -

Myzus persicae -

Locusta migratoria — Pertplaneta americana

3-

Двукрылые Мухи ' Díptera Brachycera

Прямокрылые Orthoptera Полужесткокрылые Hemiptera Таракановые Blattodea

• Жесткокрылые Coleóptera

Сетчатокрылые Neuroptera

Равнокрылые без тлей Homoptera Coccínea Psyllinea

- Перепончатокрылые Hymenoptera ■ Млекопитающие

- БуХЭ тлей Карбоксилэстеразы насекомых

30 25 20 15 10 Расстояние

4uscu _Двукрылые Мухи

domestica Díptera. Brach tcera

_ Перепончатокрылые Hymenoptera

Чсш\екры luc Lepidoptera

Lepti notaría _ Жесткокрылые decemUneata Coleóptera

Pertplaneta_ Тврякатвые

americana Blattodea

крыса ■ 1 1 1 Млекопитающие

2 1 0 Расстояние

Mu ica _Двукрылы« N lv\n

domestica Díptera Brachicera

Spodoptera_Чеш\ скрытые

üttoralis Lepidoptera

Tenebrto_Жесгкокрылые

nuiútor Coleóptera

Fórmica

rufa Перепончатокрылы«

Apis _J Н)'пеп0РСег" rneUi/era

Blxatella

germánica

Таракановым ~Blattodea

■ Млекопитающие

1 0

Расстояние

Рис 7 Дендрограммы, отражающие сходство в чувствительности ХЭ к ингибиторам А - по данным набора 1, Б - по данным набора 2, В - по данным набора 3.

Анализ кластера АХЭз показывает, что наблюдается значительное сходство ферментов у насекомых внутри отдечьных отрядов Однако на более высоком уровне полученная дендрограмма не отражает филогенетические отношения отрядов в классе насекомых, представленные на рис 8 В частности, совершенно обособленные кластеры образованы АХЭ тлей (Homopiera, Aphidinea) и мух (Díptera). В каждом из двух других больших кластеров находятся ферменты насекомых, далеко отстоящих друг от друга на филогенетическом древе В частности, один кластер содержит АХЭ насекомых как с полным (Neuroptera и Coleóptera), так и с неполным метаморфозом (Blattodea, Hemiptera, Orthoptera), другой - соответственно Hymenoptera и Homoptera

_Геологический период_

Нижний Средний Верхний Нижний Камеино Камонно- Клмснно- Пермский угольный угольный угольный

Двукрычые Díptera Чеш>екрылые Lepidoptera Сетчатокрылые Neuroptera Жесткокрылые Coleóptera Перепончатокрылые Hymenoptera Равнокрылые Homoptera Полужеспсокрытые Hemtptera Таракановые Blattodea Прямокрылые Orthoptera

Рис 8. Схема филогенетических отношений отрядов насекомых, рассматриваемых в настоящей работе (по Родендорф и Расницын, 1980, стр 28,59, адаптировано)

Кластерный анализ данных других наборов выявил весьма интересный факт На полученных дендрограммах (рис 7,Б и 7,В) наблюдается та же картина взаимно-

го расположения ферментов насекомых различных отрядов, что и на первой дендрограмме (рис 7,А) Существенные отклонения наблюдаются только в положении ХЭ представителей отряда перепончатокрылых (Нутепор1ега), что, возможно, связано с тем, что данные набора 3 являются не количественными, а ранговыми показателями Более того, кластерный анализ данных о чувствительности АХЭ 10 насекомых к 18 обратимым ингибиторам, проведенный недавно английскими исследователями Оауеё е1 а1, 2003), показал сходный порядок расположения ферментов на дендрограмме Таким образом, химическая природа соединений оказывает относи гельно небольшое влияние на "чувствительность ХЭ к ингибиторам", и это понятие является прежде всего характеристикой самого фермента

Для выяснения природы и соотношения факторов, определяющих разнообразие чувствительности АХЭ насекомых к необратимым ингибиторам, был проведен факторный анализ этих данных, и оценена достоверность связи выявленных факторов с различными особенностями каталитических свойств ХЭ, с таксономическим положением насекомых и с палеонтологическим "возрастом" отрядов, к которым принадлежат исследованные насекомые Были использованы данные только о АХЭ насекомых

На рис 9,А видно, что по значениям фактора А все исследованные ферменты распадаются на две большие группы, одну из которых составляют исключительно АХЭ тлей (Нотор1ега, АрИкИпеа) Дисперсионный анализ показывает, что величины значений фактора А, выявленного при исследовании чувствительности ферментов к необратимым ингибиторам, достоверно связаны с наличием или отсутствием чувствительности фермента к БН-реагентам (р«0 001) и "субстратного торможения" (р<<0 001).

Дальнейший, более подробный факторный анализ был проведен с использованием всех трех наборов ферментов и ингибиторов. При этом, для сопоставимости результатов, АХЭ тлей были исключены из набора 1, так как они отсутствуют в наборах 2 и 3 (набор 1'). Во всех случаях выделяли два фактора, обозначенные В и С Их значения представлены на рис 9,Б Прежде всего, можно заключить, что фактор В в сокращенном наборе 1' идентичен фактору В в полном наборе 1, так как наблюдается статистически достоверная корреляция (г=0.93, р<< 0 001) величин их значений

^ фактор А Фактор с

Рис.9 Значения факторов, определяющих чувствительность холинэстераз насекомых различных отрядов к необратимым ингибиторам Л—факторы А и В (без вращения), набор 1; Б—факторы В и С (вращение Квартимакс), /—набор !П—набор 2, Ш—набор 3; 1—двукрылые Díptera, 2— перепончатокрылае Hymenoptera, 3—сетчатокрылые Neuroptera, 4—равнокрылые Homoptera без тлей, 5—таракановые Blattodea, 6—полужесткокрылые Hemiptera, 7—прямокрылые Orthoptera, 8—жесткокрылые Coleóptera, 9—тли Homoptera Aphidinea, 10—чешуекрылые Lepidoptera

Для выяснения природы факторов В и С был проведен многофакторный дисперсионный анализ достоверности связи величины их значений с различными характеристиками ферментов

Во-первых оказалось, что выявленные факторы В и С одинаковы во всех исследованных наборах ферментов и ингибиторов. На Рис 9,Б исследованные виды насекомых сгруппированы согласно их таксономической принадлежности. Видно, что родственные виды насекомых расположены близко друг к другу независимо от источника данных Об этом же свидетельствуют высокие величины р (0 841 и 0 720 соответственно) при проверке достоверности взаимодействия категорий "отряд х набор ингибиторов" в отрядах Blattodea Lepidoptera, Díptera Hymenoptera и Coleóptera, которые представлены по крайней мере в двух наборах

Во-вторых, величины значений факторов В и Г достоверно зависят от отряда, к которому принадлежат исследуемые насекомые (^=0.024 и 0 002 соответственно) Наблюдаются также достоверные различия между величинами значений факторов В и С у ХЭ насекомых с полным и с /> неполным превращением В связи с тем, что эти различия носят разнонаправленный характер (Табл 4),

метод кластерного анализа, оценивающий "суммарную" чувствительность ХЭ к ингибиторам, не выявил такой зависимости

* Таблица 4 Зависимость значений факторов В и С, определяющих чувствительность ХЭ насекомых к

необратимым ингибиторам, от типа метаморфоза (среднее ± ошибка среднего)

Фактор Тип метамофоза Уровень значимости различий, р

неполный полный

В -0 65 ±0.09 0 28 ± 0.24 0.0007

С 0.65 ±0.35 -0.29 ± 0.20 0.023

В то же время, внутри групп насекомых как с полным, так и с неполным превращением, или не наблюдается зависимости величин факторных значений от палеонтологического "возраста" (Рис 8) соответствующих отрядов насекомых (фактор В), или эта зависимость статистически недостоверна (фактор С)

Таким образом, подтверждается сделанный в результате кластерного анализа вывод, что "чувствительность к необратимым ингибиторам" является характеристикой, в основном определяющейся природой фермента, а не природой ингибитора. Можно ожидать, что существует взаимосвязь между ингибиторной специфичностью и субстратной специфичностью ферментов.

Фактор А характерен только для АХЭ тлей и тесно связан с такими характеристиками этих ферментов как отсутствие ингибирования избытком субстратов и БН-чувствительность Наиболее достоверные корреляции между значениями факторов В и С, определяющих чувствительность АХЭ насекомых (кроме АХЭ тлей) к необратимым ингибиторам, и параметрами их субстратной специфичности представлены на Рис 10.

Фактор В

Фактор С

Рис 10 Корреляция между значениями факторов, определяющих чувствительность АХЭ насекомых к необратимым ингибиторам и параметрами их субстратной специфичности Стрелками указаны отброшенные точки.

Видно, что значения фактора В наиболее достоверно коррелируют с величинами логарифма отношения скоростей гидролиза БТХ и ПТХ Высоко достоверны также их корреляции с с величинами (Ут,Бта / У^атх) (р = о 00004), (Уш/Км,етх / Ут/Км,птх) (р = 0 004) и 18 (УЛСм^тх / Ут/Кмлта) (р = 0 008). Все эти параметры описывают взаимодействие субстратов с центром продуктивного связывания, и фактор В определяется, вероятно, структурой ацильного кармана Корреляции величин фактора С с параметрами гидролиза субстратов значительно менее достоверны (р = 0 06 для корреляции с ^ (Км бтх ! К.вптх), Рис 10,Б) Этот параметр описывает процесс ингибирования избытком субстрата, и фактор С определяется, вероятно, структурой ПАП

Для выяснения «материального субстрата» выявленных факторов следует сравнить полученные результаты с данными о строении активного центра холинэстераз различных насекомых (Таблица 5, № 28-31, 33-38, 40-43, 45, 47-52) Для этого мы провели выравнивание их аминокислотной последовательности с помощью программы СЬШТАЬХУ

На Рис 11 представлены результаты кластерного анализа В качестве меры расстояния принят процент несовпадений, т.е число замен остатков Видно, что взаимное расположение представителей различных отрядов насекомых на дендрограмме очень близко к картине, полученной при кластерном анализе данных о чувствительности АХЭ насекомых к необратимым ингибиторам (Рис 7, А, Б, В), и опять, дендрограмма не соответствует филогенетическому древу насекомых

Таблица 5 Остатки, образующие активный центр различных холинэстераз, выравнивание проведено нами

№ Вид животного Фермент Номе ра остатков в аминокислотной последовательности АХЭ ската Torpedo californita

69-74 81-86 114-125 130 199202 226 233 279-290 327-335 440 448

1 Нематода Caenorhabditis elegans АХЭ-1 QSEDTYF STMWNA WVYGGGFWSGTA Y ESAG s W WAPV—REFGDF ESIYFLTYQ HGYEINFIF

2 АХЭ-2 LTIDSAF AEMWNP WIvGGGFb SGTP Y ESAG s w NISGDIGPPMTF EGTYWLPYY 4GYEIEYAF

3 4 АХЭ-Í QGRDSYD SFMWNA WLFGGGFWYGS P Y ESAG s w WNVG--1NFLEF EGNFWNIYN HGYEIEYVF

АХЭ-4 QTRDNYN SEMWNA WFFGGGFYSGSP Y OSAG s w WNIS—LTYLEF EGNYWNIYQ HGYFIEYVF

5 Нематода Caenorhabditis bnggsae АХЭ-1 QSEDTYF STMWNP WVYGGGFWSGTS Y ESAG s w WAPV--REFGDF ESIYFI TYQ HGYEINFIF

6 АХЭ-2 LTIDSAb AEMWNP WIYGGGFFSGTP Y ESAG s w NISGDIGPPMTF EGTYWLPYY 4GYEIEYAF

7 АХЭ-3 OGRDS YD SEMWNA WLFGGGFWYGSP Y FSAG s w WNVG--LNFI.EF EGNFWNIYN HGYEIFYVF

8 АХЭ-4 QTRDNYN SEMWNA WFFGGGFYSGSP Y QSAG s w WNIS — LTYLEF EGNYWNIYQ HGYEIEYVF

9 Нематода Meloidogyne javamca АХЭ-1 QSPDTYF ATMWNS WIYGGGFWSGTA Y ESAG s w WbPV—MEFADF EAIYF1VYQ FGYEINFIF

10 Нематода Meloidogyne incognita АХЭ-1 QSPDTYF ATMWNS WÍYGGGFWSG1A Y ESAG я w WSPV--MEFADE EAIYFIVYQ HGYEINFIF

11 АХЭ-2 F3RDTMF AEMWNP WIYCGGFYSGSP Y ESAG s w AVSQSLSLPMDF CGTYWI PYC HGYEIEYVF

12 Нематода Dictyocaulus viviparus АХЭ LTPDTNF SEMWNP WirGGGFFSGSP Y FSAG s w YAMFGLE=PMSF EG5FWLFYY HGYEIEYMF

13 АХЭ LTKDFSF SEMWNP WIFGGGFFSGSP Y ESAG w SAKFDLEPPMSF EGT="WLPYY HGYE1EYMF

14 Нематода Nippostrongylus brasiliensis АХЭ-А QTPDGYF SEMWNA Wli GGGFFSGSP Y ESAG s w 1 DTMYEHMRPMEW EGTFWLPYY HGYEIEYEF

15 АХЭ-В QTKDETY AEMWNP WIYGGGFFSGSP Y FSAG s w DAIYAECLPMEW EGTFW1DYY HGYEIEYEF

16 АХЭ-С QSKDETY AEMWNP WIYGGGFFSGSP Y ESAG s w DAIYENyLPMEW EGTFWLPYY HGYEIEYEF

17 Нематода Necator americanus АХЭ HFPDSKF SEMWNP WIFGGGF<TGSP Y EASG G w WSYQIGLVLTF EATFFLPYY HGYEIEYEF

18 Шнстосома Schistosoma haematobium АХЭ QPKDTMF ARMWVP WIYGGSFYMGTA Y ESAG s w DTMYDPASYFSV EGS^FLLYA HGYEIEYVF

19 Шнстосома Schistosoma mansom АХЭ QPKDTMF ARMWVP WIYGGSFYMGTA Y LSAG s w DTMYDPASYFSV EGSYFLLYA HGYEIEYVF

20 Шнстосома Schistosoma bovts АХЭ QPKDTMF ARMWVP WIYGGSFYMGTS Y ESAG s w DTMYDPASYFSV EGSYFLLYA HGYEIEYV"

21 Кровососущий клещ Rhip appendicular АХЭ QVLDTLY SVMWNA WllGGGFYSGTS Y ESAG 3 w TNSG---GVJDF EGSWFLQYF HGEEVPFVF

22 Кровососущий клещ Rhipicephalus sanguineus АХЭ QVLDTQY SVMWNA WIYGGGFYSGTS Y ESAC w TNSG---GWDF EGSWFLQYF HGEEVPFVF

23 Кровососущий клещ Dermacenior variabilis АХЭ QLLDTLY SVMWNA WIYGGGFYSGTS Y ESAG s w PCSG---GWDF EGSWFLQYF HGEEVAFVF

24 25 Кровососущий клещ Boophilus microplus АХЭ-1 QVLDTLY STMWNA WIYGGGFYSGTS Y FSAG s w TNSG---GWDF EGSWFLQYF HGEEVPFVF

АХЭ-2 предпол QGNVFSP --LWLP WIHGGGFQEGSA D WSAG G ATFF---GSGSG EGSNILYTT HGDELPLVF

26 Кровососущий клещ Boophilus decolorants АХЭ QVLDTLY STMWNA WIYGGGFYSGTS Y FSAG s w TNSG---GWDF EGSWFLQYF HGEEVPFVF

27 Паутинный клещ Tetranychus urticae АХЭ QVNDTFF ATEWKP WIY-GSFWSGSS Y FSAG s w ETTT---GWFF EGTVI1.VYH HGEFTKFVL

28 Белокрылха Trialeurodes vaporanorum АХЭ QERLEYF EEMWNP WIVGGGYMTGTS Y FSAG 3 w WSSY—FGILGF EG1YK LLYD HGDEVFYVF

29 Белокрылка Bemisia tabaci АХЭ QERLEYF EEMWNP WIYGGGYMTGTS Y ESAG s w WSSY—FGILGF EGT1FLLY3 HGDKVEYVF

30 Цикадка Nephotettix cmcticeps АХЭ QERYEYF EFMWNP WIYGGGYMSGTA Y ESAG 4 w WÍ.SY--FGILGF EGTYFILYD HGDEIEYVF

Я 42 Персиковая тля Myzus persicae АХЭ-b QERYEYF EEMWNP WIYGGGYMSGTS Y ESAG S w WNNY—SGILGF EGTYFLLYD HGDLMQYVF

АХЭ-m * WIFGGGFYSGSA Y ESAG S w WDHV---AICFF EGYYSIt YY

33 Хлопковая тля Aphis gossypii АХЭ-1 QIFDTLF ATMWNP WIFGGGt YSGSA Y ESAG S W WDhV---AMCFF EGYYFIFYY HGDF1SYVF

34 АХЭ-2 QERYEYF EEMWSP WIYGGGYMSGTS Y FSAG S w WNSY—SGILGF bGTYb LLYD HGDEMQYVF

35 Злаковая тля Schizaphis graminum АХЭ QIFDTLF ATMWNP WIFGGGFYSGSA Y ESAG S w WDHV---AICFF EGYYSTFYY HGDFISYVF

36 Колорадский жук Leptmotarsa decemhneata АХЭ OERYEYF EEMWNP »IYGGGYMSGTA Y ESAG s w WNSY—SGILGF EGTYFILYD HGDEVEYVF

37 Моль Plutella xylostella AX3 QERYEYF EEMWNP WIYGGGYMSGTA Y ESAG s w WNSY -TGILGF EGTYtLLYD HGDEMEYVF

38 Хлопковая совка Hehcoverpa armígera АХЭ QERYEYF EEMWNP KIYGGGYMSGTA Y ESAG s w WNSY—TGILGF EGli FLLYD HGDFMEYVF

19 Пчела Apis mellifera АХЭ* QERYEYF EEMWNP WIYGGGFMSGTA Y ESAG s w WNSY—WGILGF EGTYEILYD

40 Комар Anopheles gambiae АХЭ-1 QIVDTVF ATMWNP WIFGGGFYSGTA Y ESAG s w WGTL---GICEF EGYYFIIYY HGDEINYVF

41 АХЭ-2 QERYEYF EEMWNP WIYGGGFMSGTS Y ESAG s w WNSY—SGILGF EGTYFLLYD HGDEVEYIF

42 Комар Anopheles stephensi АХЭ QERYEYF EEMWNP WIYGGGFMSGTS Y ESAG s w WNSY--SGILGF EGTYFLLYD HGDEVEYIF

43 Комар Aedes aegypti АХЭ QERYEYF EEMWNP WIYGGGFMSGTS Y ESAG s w WNSY—SGILGF EGTYFLLYD HGDEVEYIF

44 АХЭ * HGDEINYVF

45 Комар Culex pipiens АХЭ-1 QIVDTVF ATMWNP WIFGGGFYSGTA Y ESAG s w WGTL---GICEF EG1YFIIYY HGDEINYVF

46 АХЭ-2 * FFRYEYF EEMWNP WIYGGGFMSGTS Y ESAG s w WNSY—SGILGF EG

47 Комар Culex tritaemorhynchus АХЭ-1 QIVDTVF ATMWNP WIFGGGFYSGTA Y ESAG s w WGTL---GICEF EGYYFtIYY HGDEINYVF

48 АХЭ-2 OERYEYF EEMWNP WIYGGGFMSGTS Y ESAG s w WNSY--SGILGF EGTYFLLYD HGDEVEYIF

49 Комнатная муха Musca domestica АХЭ QERYEYF EEIWNP WIYGGGFMTGSA Y ESAG s w WNSY—SGILSF EGTYtLLYD HGDEIEYFF

50 Муха Lucilla cuprina АХЭ QERYEYF EEIWNP WIYGGGFMTGSA Y ESAG s w WNSY—SGILSF EGTYFLLYD HGDEIEYFF

51 Фруктовая муха Bactrocera oleae АХЭ QERYEYF EEIWNP WIYGGGFWTGTA Y ESAG s w WNSY—SGILSF EGTYFLLYD HGDEIEYFF

52 Дрозофила Drosophila melanogaster АХЭ. QERYEYF EEIWNP WIYGGGFMTGSA Y ESAG s w WNSY—SGILSF EGTYFLLYD HGDEIEYFF

53 Кальмар Loligo opalescens АХЭ-1 QGFDRIF ETMWHA WIYGGGFYSGTS Y ESAG s w WWVI—QGISQF F.GTYFLTYF HAAETDFVF

54 Асцидия Сюпа savignyi АХЭ QEDDLVF SQMWNS WIYGGSYYSGTS Y ESAG s w WIT---KEIFDF EGSYFTIYT HGYEIELME

55 " 56 Асцидня Сюпа intestinalis АХЭ-1 Q1DDEVF SQMWNA WIYGGS FYSGTT Y ESAG s w WIT---QEIFDF EGSYFTLYT HGYEIELMF

АХЭ-2 QSPQQCS T----- WIHGGAFFAGSG Y NSAG s F KVMAKAALRRNI ELEFINWF HGSEPRYVF

57 Ген ciOl-00143324 GMRLMCS Q----- WFHGGAFWFGAG Y ESAG s F KVMMGNMASGDF ELYLVSAM- HSSELRYVW

58 Ланцетник Branchiostoma lanceolatum ХЭ-1 * WIYGGGFFSGTS Y ESAG s w WNWD-LSDAHF EGNFWLVYG H

59 ХЭ-2 * WIYGGGFMSGTA Y ESAG s w WW---WGLCQF EGVYE LLYG

60 61 Ланцетник Branchiostoma flondae ХЭ-1 SAPDEAF AFMWNP WIYGGGFFSGTS Y ESAG s w WNWD-LTGAHF EGNFWLVYG HGYEIEFIF

ХЭ-2 QLPDTTF AEMWNP WIYGGGFMSGTS Y ESAG s w WW---WGLCQF EGVYFLLYG HGYECEFVF

62 Миксина Myxine glutinosa АХЭ WIFGGGFAYGTS Y ESAG s w GDWIFPSIFRF EGSFFIjIYG

63 Скат Torpedo cahfornica АХЭ QYVDEQE SEMWNP WIYGGGFYSGSS Y ESAG s w WNVLP FDSIFRF EGSFFLLYG HGYEIEFVF

64 Скат Torpedo marmorata АХЭ QYVDEQE SEMWNP WIYGGGFYSGSS Y ESAG s w WNVLPFDSI FRF EGSFFLLYG HGYEIEFVF

65 Рыба фугу Fugu rubripes АХЭ QWDTSF SEMWNP WIYGGGFYSGSS Y FSAG S w FhVLPWAS I FRF EGTYFLLYG HGYEIEFVF

66 АХЭ-В QMPDTKF AEMWNP WIYGGGFTTGTS Y F SAG S w YGVLTEDGLGGY EGSYFMAYG HGYEIEFVF

67 АХЭ-С QLKDTTF AETWNP WIYGGGFTTGTS Y «■SAG S w FGVLT--GLGTS EGSYFLVYS HGYEIEFVF

68 АХЭ-D * QLADMTF AEMWNP WIYGGGFTTGTS Y F SAC S w

69 АХЭ-Е OA---CS AE -- WIHGGDFIAGSA Y ESAG S - HGAET PFVF

70 Рыба Oryztas latipes АХЭ* Y ESAC s w YDIITEPPLLNF EGTCFLVYG

71 Угорь Electrophorus electricus АХЭ QYVDTSY TEMWNP WIYGGGFYSGSS Y FSAG s w WLVLPFSGLFRF EGSYFLIYG HGYFIEFVF

12 Рыба данио Danio reno АХЭ QFVDTSY IFMWNP WIYGGGFYSGSS Y ESAG s w WQVLPWSSLFRF EGSYFLLYG HGYEIEFVF

73 Змея Bungarus fasciatus АХЭ QMVDTSY TEMWNP WIYGGGFYSGAA Y ESAG s w WSVLPYKSIFRF EGSYFLIYG HGYEIEFVF

74 Курица Gallus gallus АХЭ QMVDTTF SEMWNP WIYGCGFTGGSV Y ESAG s w GWMPPQSVFRF EGSYFLVYG HGYEIEFVF

75 БХЭ QLIDTTY TEMWNP WIYGGSFETGST Y FSAG s w VYWKYFSLIHI EGTSFLVYG HGYEIEFVF

76 Крыса Rattus norvegicus АХЭ QYVDTLY TEMWNP WIYGGGFYSGAS Y FSAG ь w WHVLPQESIFRF "GSYF1VYG HGYEJEFIF

77 БХЭ QNIDQAF SEMWNP WVYGGGFQTG1S Y ï- SAG s w KLVLPSD4IR4I FGTAFLVYG HGYEIEFVF

78 Мыщь Mus musculus АХЭ QYVDTLY TEMWNP WIYGGGFYSGAA Y ESAG s w WhVLI'QE. IFRF EGSYFIVYG HGYEIEFIF

79 БХЭ QNIDQAF SEMWNP WIYGGGFQTGTS Y FSAG s w RFVLPSDSILSI EGTA5LVYG HGYEIEFVF

80 Кролик Oryctolagus cuniculus АХЭ QYVDTLY TEMWNP WIYGGGFYSGAS Y LSAG s w WRVLPQEbIFRF EGSYFLVYG HCYEIEFIF

81 БХЭ QNIDQSF SEMWNP WIYGGGFQTGTS Y ESAG s w VFWPFDSLLSV EGTAFLVYG HGYEIEFVF

82 Кошка Fehs catus АХЭ QYVDTLY TEMWNP WIYGGGFYSGAS Y ESAG s и WHVLPQESVFRF EGSYFLVYG HGYEIEFT F

83 БХЭ QNADQb* SEMWNP WIYGGGFQTGTS Y FSAG s w LIWPSDTLLSV EGTAFLVYG HGYEIEFVF

84 Тигр Panthera ngris tigris БХЭ QNADQSF SEMWNP WIYGGGFQTGTS Y ESAG s w LIWPSDTLLSV EGTAFLVYG HGYEIEFVF

85 Собака ('anís familiaris БХЭ* NTDQSF SEMWNP WIYGGGFQTGTS Y ESAG

86 Свинья Sus scrofa БХЭ * IYGGGFQTGTS Y ESAG s w VFWPNHMLLSV EGTAFSVYG HGYEIEFVF

87 Овца Ovis oríes БХЭ * NTDQSF SEMWNP WIÎGGSFQTGTS Y ESAG

88 Бык Bos laurus АХЭ QYVDTLY TEMWNP WIYGGGFYSGAS Y ESAG s w WRVLFQFIÍVFRF EGSYFIVYG HGYEIEFIF

89 БХЭ* NTDQSF SEMWNP WIIGGSFQTGTS Y FSAG

90 Лошадь Equus caballus БХЭ QNTDQSF SEMWNP WIYGGGFQTGTS Y ESAG s w VFWPYDTLLSV EGTAFIVYG HGYEIEFVF

91 Резус Macaca mulatto БХЭ* NIDQSF SEMWNP WIYGGGFQTGTS Y ESAG

92 Человек Homo sapiens АХЭ QYVDTLY TEMWNP WIYGGGFYSGAS Y rSAG s w WHVLPQESVFRF EGSYFIVYG HGYEIEFIF

93 БХЭ QNIDQSF SEMWNP WIYGGGFQTGTS Y ESAG s w AFWPYGTPLSV EGTAFLVYu HGYEIEFVF

Примечание Пустые места означают отсутствующие остатки в неполных последовательностях (помеченных звездочками), черточки - делеции.

ч

Culex mtaemorhynchui AX3-1

Culex pipiéis AX3-1 -

Anopheles gambiae AX3 1 —

Schizaphls graminum --—

Aphis gossypn AX3-2 -

Bactrocera oleae -

{Drosophla melanogaster-

Musca domestica -

Lucilla cuprina -

Culex tritaemorhynchus AX3-2

r Aedes aegypti -

4 Anopheles gambiae AX3-2 —

^ Anopheles stephensl -

Kiyzus persicae AX3-b -

Aphis gossypn AX3-1 -

{,Hehcoverpa armígera -

Plutello xylostella--

tepfínotarsa decemlineata —

Nephotetta cincticeps -

r Trialeurodes vaporariorum • Betmsia tabaci -

э-

Двукрылые Комары Díptera Nematocera

Раюокрытме Тли Homoptera Aphtdidae

Двукрылые Мухи Díptera Brackycera

Двукрылые Коиары Díptera Nematocera

Равнокрылые Тли Homoptera Aphididae Чешуекрылые Lepidoptera . Жесгхогрылье Coleóptera Равнокрылые без тлей Homoptera

SH-чувст-

ВИ тельные

АХЭ

SH-вечувст-V витальные

АХЭ

Рис. 11. Дендро-грамма, отражающая сходство структуры активного центра АХЭ насекомых (мера расстояний - процент несовпадений, кластеризация методом наиболее удаленного соседа).

Для проведения факторного анализа аминокислотные остатки были охарактеризованы величинами четырех физико-химических параметров - гидрофобности, полярности, изоэлектической точки и объема Так же как в случае первого набора ферментов и ингибиторов, сначала были проанализированы все ферменты, а затем были исключены БН-чувствительные ферменты тлей и комаров В обоих случаях изолировали два фактора Результаты представлены на Рис 12 и в Таблице 6

I

S 00

:А

• t-2 ¿-lLJ-

, ñ ' 'Б '

i i

i 1 i j i i

i -É+- I 1 i i : i

10 05 00 05 1 0 1 5 20 1 5 1 0 05 00 05 1 0 1 5 20 25

Фактор А Фактор с

Рис 12. Значения факторов, определяющих вариабельность активного центра холинэстераз насекомых различных отрядов (метод главных компонент, вращение Квартимакс) А—факторы А и В, все ХЭ; В факторы В и С, SH-нечувствительные ХЭ, 1—ХЭ мух (Díptera Brachycera Cyclorhapha, Таблица 5, № 49-52); 2—SH-нечувствительные ХЭ комаров (Díptera Nematocera, № 41-43,48); 3—ХЭ колорадского жука (Coleóptera, № 36), 4—ХЭ бабочек (Leptdoptera, № 37,38); 5—ХЭ равнокрылых кроме тлей (Homoptera,, № 28-30), б—SH-нечувствительные ХЭ тлей (Homoptera. Aphidinea, № 31,34); 7—SH-чувстви-тельные АХЭ тлей (Homoptera Aphidinea, № 33,35); 8—SH-чувствительные ХЭ комаров (Díptera Nematocera, Ni 40,45,48).

Таблица 6 Нагрузки факторов, определяющих вариабельность активного центра холинэстераз насекомых (метод главных компонент, вращение Квартимакс)

Параметр

Ферменты Факторы Номер остатка Объем Гидро-фобность Полярность Изоэлект-рическая точка

70 -1 00 -1 00 -1 00 -1.00

72 0.97 0 92 1 00 0.99

73 1 00 -1 00 -1 00 -1 00

74 0 92 -1 00 -1.00

81 1 00 -1 00 -1 00 -1 00

116 1 00 -1.00 -1.00 -1.00

121 -1 00 1.00 1.00 1.00

А 282 0.95 -1.00 -1.00

Все АХЭ насекомых 285 0 79 -0 73

288 1 00 1.00 -1.00 1.00

289 -0 93

329 -1 00 -1.00 -1 00 1 00

332 0.90 -0 90 0.90 -0 90

333 -0.89

335 -1 00 -1 00 -1 00 -1.00

83 -0 80 -0 80 -0.80 -0 80

В 122 -0 80 -0.80 -0 80 -0 80

124 0 88 0 88 0 88 0 88

447 -0 74

83 -0.97 -0.97 -0 97 -0 97

122 -0 97 -0.97 -0.97 -0.97

В' 124 0 87 0.87 0.87 0 87

БН-нечувстви- 125 0 71 -0.71 -0 71 -0 71

тельные АХЭ 289 -0 97 0 97 -0 97 0 97

насекомых 447 -0 81

120 -0 76 0 76 0 76 0.76

с 285 -0 78 -0.73 -0.80

447 0 86 0.80 0.82

Видпо, что общая картина распределения факторных значений для различных отрядов насекомых совпадает с картиной, полученной при анализе данных о чувствительности АХЭ насекомых к ингибиторам (Рис. 10). Можно сделать вывод, что эти факторы имеют одинаковую природу

Анализ факторных нагрузок позволяет установить «материальный субстрат» этих факторов Из данных Таблицы 6 следует, что фактор А, определяющий различия в строении активного центра БН-чувствительных и БН-нечувствительных ХЭ насекомых, связан с 15 аминокислотными остатками. ЭИ-чувствительность обусловлена присутствием цистеина в позиции 288 Отсутствие ингибирования АХЭ тлей высокими концентрациями субстратов обусловлена присутствием серина 8331 вблизи «анионного» пункта. Набор остатков, обусловливающих фактор В, практически одинаков в полном и сокращенном наборе ферментов Исключение составляет остаток 289, который является глутаматом в 8Н-чувст-вительных АХЭ насекомых, серином в АХЭ мух и глицином в других вН-нечувствительных АХЭ насекомых По этой причине остаток 289 присутствует как в составляющих фактора А, так и фактора В' Наиболее вероятно, именно остаток 289, расположенный в в ацильном кармане, и является «материальным субстратом» фактора В Его эффект модифицируется влиянием остатков 122, 124 и 125, расположенных вдоль центра связывания субстрата Единственным остатком среди составляющих фактора С,

31

который связан с ПАП и может быть его «материальным субстратом», является остаток 120 Возможно, он изменяет ориентацию близлежащих остатков ПАП - Y121, Е278, W279 Его эффект может быть модифицирован влиянием каких-либо остатков, расположенных внутри молекулы АХЭ, и поэтому не включенными в анализ

Полученные результаты подтверждают, что вариабельность каталитических свойств ХЭ, в частности их чувствительность к необратимым ингибиторам, определяется вариабельностью структуры определенных участков их активного центра Как структура активного центра, так и чувствительность к ингибиторам связаны с таксономическим положением насекомых, что обусловливает тот факт, что среди инсектииидов существуют группы соединений, избирательных в отношении тлей, мух, жуков и тд Данные об относительной близости АХЭ различных насекомых, и о связи "чувствительности к ингибиторам" с субстратной специфичностью могут быть полезны для оценки возможной широты спектра действия новых соединений

Отсутствие корретяции полученных дендрограмм с филогенетическим древом насекомых следует объяснить тем, что изменения структуры активного центра ХЭ в процессе мутации гена ХЭ имеют нерегулярный характер и могут приводить как дивергенции, так и конвергенции каталитических свойств ХЭ Наглядный пример выраженной дивергенции представляют собой АХЭ мух

ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗИ МЕЖДУ СТРОЕНИЕМ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ХОЛИНЭСТЕРАЗ И ФИЛОГЕНИЕЙ ЖИВОТНЫХ

Итак, статистический анализ выявил две главные группы и несколько подгрупп среди АХЭ насекомых Представляло интерес расширить список исследованных ферментов Сколько групп будет при этом выявлено'' Каково их отношение к «типичным» АХЭ и БХЭ позвоночных? Существует ли соответствие между декдрограммой, построенной на основании структуры активного центра АХЭ и филогенетическим древом на более высоком уровне, на уровне типов животных7

Чтобы ответить на эти вопросы, кластерный и факторный анализ данных о вариабельности активного центра был повторен с всеми ХЭ, для которых на момент анализа был известен состав активного центра (Таблица 5) Всего исследовано 75 ферментов В качестве характеристик аминокислотных остатков были использованы их гидрофобность, изоэлектрическая точка, полярнойсть и объем Для делеций объем был принят равным нулю, изоэлектрическая точка - 7 0, гидрофобность и полярность -соответствующим характеристикам глицина

Факторный анализ ферментов, за исключением белков, которые, по-видимому, не являются каталитическими ^АХЭ-2 клеща Boophilus microplus, гена ciOl 00143324 аспидии Сюпа intestinalis, AChE-E рыбы Fugu rubripei), был проведен методом главных компонент с вращением Квартимакс В соответствии с «критерием осыпи» (scree fest) число выделяемых факторов было принято равным 8 Они ответственны за 65% наблюдаемой изменчивости.

Интерпретация факторов были произведена на основании их нагрузок (Таблица 7) и значений (Рис 13). Данные Рис 13 свидетельствуют, что по значениям факторов наблюдается разделение ферментов на основную, смешанную, группу и отдельно стоящую гомогенную группу (в случае факторов 3 и 6 - один фермент) Достоверность этого разделения в случае всех факторов подтверждается кластерным анализом величин факторных значений методом ¿-средних Эти гомогенные группы позволили дать названия выявленным факторам, приведенные в Таблице 7 и на Рис 13

Анализ Таблицы 7, в которой суммированы характеристики аминокислотных остатков, достоверно (нагрузки более 0,7 по абсолютной величине) связанные с выявленными факторами, позволяет выявить их "материальный субстрат".

Фактор 1, ответственный за отличие SH-нечувствительных АХЭ насекомых от всех других ХЭ

(Рис 13,А), связан со строением участка при входе в "ущелье" активного центра ХЭ (остатки 70, 72, 73, 81), и с остатками остатков 120, 289 и 335 вбтизи "ацильного кармана" (см Рис 1) Как видно, остатки 70, 71, 81 и 335 в АХЭ насекомых статистически достоверно отличаются от аналогичных остатков в других ХЭ только по изоэлектрической точке и полярности, а остаток 289 - по объему Таким образом, предложенный метод анализа позволяет не только выявить аминокислотные остатки, характерные только для данной группы ХЭ, но и конкретизировать отличительные физико-химические параметры этих остатков "Материальным субстратом" фактора 2, характерного для АХЭ-3 и АХЭ-4 нематод (Рис 13^4), являются остаток 75 вблизи "анионного" пункта (Р или N вместо ароматических, Р или У, в других ХЭ), к остатки N329 и N332 в районе каталитической триады АХЭ-4 нематод отличается также оста!ком 0199 вместо Е199 во всех остальных ХЭ Фактор 3, ответственный за отличие АХЭ паутинного клеща от всех дру!их ХЭ (Рис 13,£), определяется отрицательно заряженным остатком Е83 возле «анионного» пункта, делецией остатка 117 и остатком Ь448 вместо Р448 во всех остальных ХЭ Фактор 4, выявленный для АХЭ-2. АХЭ-А, АХЭ-В и АХЭ-С нематод (Рис 13,6), связан со строением петли ацильного кармана (остатки 283 и 287) и остатком 447 на дне «ущелья» К той же группе принадлежит АХЭ нематоды ЫесМог атепсапш, поблизости располагаются АХЭ-1 ланцетника и АХЭ плоского червя - шистосомы Фактор 5, характерный для БХЭ млекопитающих (Рис 13,5), определяется приро-

I -з

Фактор 1 (5Н-и*ку«стаит«пьим* АХЭ гасеком«*)

Фактор 3 (ПХЭ паугютюго кп*ща)

В

г

-1—

!А , „! __-К—- ' ! {а 1 Рис 13 Значения

факторов, опреде-ляших различия в структуре активного центра холинэс-тераз

А—факторы 1 и 2, Б—факторы 3 и 4, В—факторы 5 и 6, Г—факторы 7 и 8 1—АХЭ-1 нематод (№ 1, 5, 9, 10 в Таблице 5), II- АХЭ-2, А,В,С нематод (№ 2, 4, 14-16) и АХЭ нематоды ИессЧог атепсапш (№ 17), III—АХЭ-3 нематод (№ 3, 7), IV— АХЭ-4 нематод (№ 4, 8), V— АХЭ шистосомы (№18),

VI— АХЭ-1 кровососущих клещей (№ 21-24, 26),

VII—АХЭ паутинного клеща (№ 27),

VIII—5Н-нечувст-вительные АХЭ

насекомых (№ 28-31, 34, 36-38, 41-43, 48-52), IX—БН-чувствительные АХЭ насекомых (№ 33, 35, 40, 45, 47), X—АХЭ кальмара (№ 53), XI—АХЭ-1 асцидии (№ 55), XII— АХЭ-1 ланцетника (№ 60), XIII— АХЭ-2 ланцетника (№ 61), XIV—АХЭ позвоночных (№ 63-65, 71-74, 76, 78, 80, 82, 88, 92), XI'-АХЭ-В,С рыбы Ии^ гиЬпрея (№ 66, 67),XVI—БХЭ позвоночных (№ 75, 77, 81, 83, 84, 90,93)

лСПет«р«т / •ат I

I/

7 Т//

I ч V-!

2» го 15 1Л -0$ 00 05 1.0 Фактор 5 (БХЭ пожвночад)

•2.0 15 10 -0Л 0 Фапор 7 (АХЭ ировососуии* кпащвИ)

10 15 20

Таблица 7 Связь факторов, определяющих вариабельность строения активного центра ХЭз, с характеристиками аминокислотных остатков (нагрузки, большие чем 0 7 по абсолютной величине)

Факторы Номер остатка Характе ристика

Объем Гидрофобность Полярность Изоэлект-рическая точка

Фактор 1 (БН-нечувствительные АХЭ насекомых) 70 -0.90 -0.91

72 0.95 0 95 0.96 0.96

73 -0.81 -0 76

81 -0 94 -0 94

120 0.72 -0.72 -0.72 -0 72

282 -0.75

289 -0.74

335 -0.84 -0.94

Фактор 2 (АХЭ-3,4 нематод) 75 0 94 0.76 0.92 0.73

199 -0.71 0 71 -0 71 -0 71

329 0.77

332 0 91 0 95 0 96 0.80

Фактор 3 (АХЭ паутинного клеща) 83 0 95 0 90

117 0 96 0.96 -0.96 -0.96

448 0 96 0 96 -0 96 0 96

Фактор 4 (АХЭ-2 нематод) 283 0 76

287 0.72 0.76 0.79

447 0.83 0.77 0.72

Фактор 5 (БХЭ позвоночных) 121 081

122 -0 80

290 0.81

330 0.81 0.80

Фактор 6 (АХЭ-1 кальмара) 85 0.77 0,90

441 0.85 0.85 0 85 0.85

Фактор 7 (АХЭ-1 кровососущих клещей) 289 0.76

Фактор 8 (5Н-чувствительные АХЭ насекомых) 116 -0 78 0 78 0 78 0 78

329 0.76 |

дой остатков 121 и 122 вблизи центра связывания субстрата, а также тем, что остаток 290 в ацильном кармане и остаток 330 вблизи "анионного" пункта являются алифатическими, а не ароматическими, как у всех АХЭ К той же группе ферментов относятся АХЭ-В и АХЭ-С рыбы тЬпреа, хотя несколько отличаются от БХЭ млекопитающих по природе упомянутых остатков "Материальным субстратом" фактора 6, отличающего АХЭ-1 кальмара 1оЬ%о орсйе^сет (Рис 13,Д), являются остаток 85 (Н вместо N у других ХЭ) вблизи "анионного" пункта и остаток 441 (А вместо в) вблизи каталитического Н440 Подчеркнутое в оригинальной статье [310] отличие АХЭ кальмара от других ХЭ по полярности остатка Э288 статистически не достоверно Фактор 7, отличающий АХЭ кровососущих клещей от остальных ХЭ (Рис 13/), связан с характеристикой остатка 289, однако, в отличие от фактора 1 (8Н-нечувстви-тельных АХЭ насекомых), не с его объемом, а с изоэлектрической точкой Характеристики, связанные с фактором 8, отличающем ЗН-чувствительные АХЭ насекомых, имеют низкую достоверность Это остатки И! 16 и У329 Р116 присутствует также в АХЭ некоторых нематод 8Н-чувствительный остаток, С288, не является статистически достоверной особенностью Более того, АХЭ-2 ланцетника, также имеющая цистеин в позиции 288, не родственна этой группе АХЭ насекомых и расположена далеко от

них на графике факторных значений СРис 13,Г) По-видимому, это случай конвергенции

Таким образом, факторный анализ позволил систематизировать обширный материал, выделить 8 групп ХЭ, конкретизировать области активного центра, отличающие их друг от друга, и установить природу Ггидрофобность, полярность и др ) этих отличий

Следующим этапом работы быпо исследование сходства и различия строения активного центра ХЭ методом иерархического кластерного анализа Было использовано два алгоритма слияния кластеров, считающиеся наиболее точно отражающими структуру данных - меюд наиболее удаленного соседа и метод Уорда (наименьшей дисперсии), и различные меры расстояния - эвклидово расстояние, процент несовпадений (т е число замен остатков в активном центре), 1 -г (т.е. сходство в общей реакционноспо-собности активного центра, выраженную через 4 физико-химических характеристики остатков) Последний показатель представляется более точным, так как некоторые остатки являются взаимозаменяемыми

По современным представлениям (Valentine, 1997, Adoutte et al, 2000) основанным на исследовании рибосомальной ДНК, линия билатеральных животных Bilateralia делится на ветвь вторичноротых (Deuterostomata), включающую тип хордовых (Chordata), и ветвь первичноротых (Protostomata) (Рис 14)

CHORDATA UROCHORDATA

hemichordata

ECrflNOOERMATA

PHIAPULIOA

■ KINORHYNCHA NEMATOMORPHA ARTHROPOOA

■ TARDlGRAOA ONYCHOPhORA NEVATODA

8RY0Z0A BRACHIOPODA

■ PHORONIDA ROT1FERA

■ GASTROTRICHA

. PLATYHEIMINTHES

■ MOLLUSCA

■ POGONOPHORA

■ ANNEUDA

■ S!PUNCL'IA

■ ECHIURA

■ NEMERT1NA

• ENTOPROCTA

■ CN1DARIA

. PORI^cRA

Рис 14 «Древо жизни» многоклеточных животных, построенное на основании исследования рибосомальной РНК (Valentine, 1997, Fig.l). Буквами обозначен тип дробления яйца R -радиальный, S - спиральный, I - идеосинкра-тический

Ветвь первичноротых в свою очередь делится на ветви Ecdisozoa, включающую тип нематод Nematoda, тип членистоногих Arthropoda (куда входят насекомые Infecta и клещи Arachm-da Acari) и др , и ветвь Lophotrochozoa, включающую тип моллюсков Mollusca, тип плоских червей Platyhelminthes и др

Кластерный анализ строения активного центра показал, что группы ферментов, выявленные в результате факторного анализа, в основном остаются группами и на построенных дендрограм-мах, но их взаимная близость значительно зависит от алгоритма кластеризации и меры расстояния Однако наши исследования выявили одну общую черту, присущую всем вариантам дендрограмм - НИ ОДНА из них не воспроизводила филогенетические отношения исследованных нами животных

На обеих дендрограммах, представленных на Рис.15, изолированное положение занимают весьма своеобразные белки (АХЭ-2 клеща Boophilus mtcroplus, АХЭ-2 и продукт гена с10100143324 асцидии Ciona intestinalis, АХЭ-Е рыбы Fugu rubripes), которые бьии исключены при проведении факторного анализа

При кластеризации с использованием процента несовпадений в качестве меры расстояния (Рис 15А) следующее разветвление отделяет АХЭ-2 нематод от остальных ХЭ, а следующее - разделяет

35

АХЭ вторичноротых и первичноротых животных Однако в первую группу попадают АХЭ паутинного клеша (Аг1кгоро(1а) и шистосомы (Р1аф}ге1т1п(Иез), а во вторую - АХЭ-1 асцидии и АХЭ-1 ланцетника АХЭ-1 кальмара не изолирована от ферментов представителей Есйкогоа (нематод и членистоногих)

Сюпа irOtsünaiis ген 143324 — Ciona irüesdnaUs АХЭ-2 ■ -Fugu rutrtpa АХЭ-Е 1

Btophiüu micropiui АХЗ-2-----

Ntcator amencanui АХЭ -

Mppcetron&bu ЬгсиШепяз АХЭ-С Mppostrmgylus brasihensis АХЭ-В Ntppostrongylus brasikemti АХЭ-A

Dtctyocaulus »'«para» АХЭ-

DuSyocauiui mipana АХЭ w 2 -r Caenorhabdiüs elegans АХЭ-2— ^ Caenortiabdita briggfae АХЭ 2 —

Tetranychus urücae АХЭ .......

Homo sapiens БуХЭ-

/ .РвяУилх fi^ra1 ВуХЭ ■ - .....

""«(¿r cafltí ВуХЭ-

Equiís cabatha ВуХЭ ——— Oryctotagus cantadas БуХЭ 1 Mus musculus БуХЭ faltosnonteglcus ВуХЭ - ■■■■■

Gallas gaitas БуX3-

Gaitas galhü АХЭ ■■— Bostaurus АХЭ - ■■' ■ ----

J-

("UtodiírdaíaJ РЫВ» fVírtííftííe; кроеососупДО мил (Arthropoda Mari)

(Nematoda)

Oryctolagus сия'сШш АХЭ-

Musmuscutus АХЭ — ■-— 1 1 Rattus nonegicus АХЭ ———— Bungarusfasciatus АХЭ ■ " Darttoreno АХЭ —■- "■'■ Ekctrophorus tlectncus АХЭ — Fugu rubnpts АХЭ 1 Torpedo californita АХЭ 1 1' ■ Torpedo marmorata АХЭ ■ —

Fugu rutnpes АХЭ-В-

n¿t>npeí АХЭ-С —— Snnchiostoma florida* АХЭ-2 — Schistosoma haematobaun АХЭ -Bactmcera oíeae

r Drotophíla mkmogtuUr АХЭ -

1 iíiciiw сирппа АХЭ-

Musca domestica АХЭ -—" r Cutex tritaeniorhynchuj АХЭ 2 -

•i Aedesaegyptí АХЭ-

Anopnela ttephtrui АХЭ-

'•¿«рЛеЙУЯотЬ«» АХЭ-2 —

gaaypu АХЭ l-—

tíyzus persicae АХЭ-Ъ —■ —■■

Hehcoverpa arm'gero АХЭ-

РЫ&14 xyiasteUo АХЭ-

Lepünotana decemkneata АХЭ -Nephotetta cincticepi АХЭ ——-

Brarrhiostoma flondne АХЭ-1 • / Caencrhabditís elegans АХЭ-4 СагяогЛвЬЛй» briggsae АХЭ-4 / Caenorhabddts siegan АХЭ-3 ^ Catnorftabdios onggsae АХЭ-3 Lcí¡$o opalescens АХЭ-1 —

Demacentor vaHabíiti АХЭ-

Rhiptcephalus sangwneus АХЭ -г Bocphilus microphu АХЭ-1 —— 1 BoophiUu decoloraos АХЭ-

Rhipicepkaba appendtculatus АХЭ —'

,Cuiexpipíen» AX3-1 -...... ....1

"i tntaen íorh/nchui АХЭ 1 -Anophelet gombtae АХЭ-1 -—

Schizaph is gra mtn ufí АХЭ-

Apkugooyph АХЭ-2 -■--■ —

CVorta inlestinaLs АХЭ 1-

/ Meloídogyng incógnita АХЭ-1 Meloidogyne javamca АХЭ-1 Caenarhabdttt* tíegans АХЭ-1 Coenorhabditis bnggsae АХЭ-1

тутиоьЛюнад

(Arthropoda Man)

БуХЭ позвоночных

(Chordata Vertebróla)

АХЭ полон ОЧНЫХ

(Chordata fertebrata)

рыб« (yertetreto; шщмк (Hemichordata) ансгосот (Platyheimínthes)

SH' нечувствительные АХЭ насекомых

/Arthropoda Insecto)

лкдоннк <Htmi'-horda*a) нештоды (Nematoda) ÍMoüuxa)

|фоеососув*к юиши

(Arthropoda Acarij

ьн чувстмгкг&ные АХЭ mcacoiuc

f'Arthropoda Insecto)

•синдня (Urochordata) немгоды (ílemctoda)

Рис 15 Дендрограммы, отражающие сходство строения активного центра холиюстераз Кластеризация методом наиболее удаленного соседа, мера расстояния* А - процент несовпадений, Б — 1—г (г — коэффициент корреляции Пирсона)

Ciona mtesbnaüs г«и 143324 -Gana tnUxürtaüS АХЭ-2 — Fugu rubnpes АХЭ-Е 1 Boophiktí mtcrcpiuj АХЭ 2 — Homo sapiens BVX3 ■" ■— Pantnera Ugris вуХЭ ' 1 ■

Orydotagus cunlcuüu ЕуХЭ -MwmuKuiitf БуХЭ -

i (Vrochordata) рыб* (Vertebraba) кровососущий клад (Arthropoda Acort)

ВуХЭ поаоночил

(Choráata Vertebraba)

рыОа (Vtrtebrata)

Bungenufosctato АХЭ-

Danta re río АХЭ 1 ■■■■■— EléOrophonis eifXñcus АХЭ • Fugu rubnpes АХЭ ■ Bot tau/ш AX3 —

WUÍ mtiKtiiar АХЭ -

cu/tiai&f АХЭ -Homo sapiens АХЭ " ■ ■■ ■■

ли*саш* ахэ-

Rathu norveelcus АХЭ -— - Torpedc caujonuca АХЭ — 1 Torpedo marmarata АХЭ —

FUgu. rubnnes АХЭ С-

Bronchiostoma flondae АХЭ-1 -Branchlo&oma Jlorídae АХЭ 2 -iSfc/iuíoaoma haematcbmm AX5 -Mppostron&ius brasiUensií ДХЭ-С — Mppoibvfjgylux braglttensií АХЭВ — Mppcatrongyius brasihenxs АХЭ-А — Afecatoramericanas АХЭ ■ ■■■—■■ CKtyocauiuj vtiiparus АХЭ —— ¿kcyoceuiitfwvipanu АХЭwí-r Catnorhabdttu elegani АХЭ-2—— ^ Catnorhübdtüs briggtae АХЭ-2 —

Badrocera oteae АХЭ -r ¡>oaophi¡a melanogaster АХЭ -i Lunilla atprtna АХЭ —■ 1 ■ ^ А&до donustíca АХЭ - ■ Aphis gossyptt АХЭ-1 -

bepanotaria dectuuneata АХЭ -CWex fri taemorhynchus АХЭ-2 -

. flígyptí АХЭ ......... ■■

. AnopAeíei ЛерНепя АХЭ----

• Anophelesganbtae АХЭ-2-—— htyñu ретсае АХЭ b ■ NephoUBiX anctUxps АХЭ -

BemisiQ tabea АХЭ -

Lotlgo opaiescens AX3-1-

/ Сийя piptent АХЭ-1 ■"——-1 Cukxtntaentorhyndw АХЭ ! -

l Aiopfteiej gombio« АХЭ-1-

Schaap Hls gromtnum АХЭ ¿pAtfgossypi АХЭ 2 - " Tetra nychus urtíCüt АХЭ -

АХЭ «шонэтных

(Chordata Vertebróte;

рыб& (Vertebrata¡

к (Hemichordata) шистосоыа (PiatfhtMnthes)

немкпыы (Ntmaioda)

SH- жчувстылслыш« АХЭ наежоиьк (Arthropoda Jhsecta)

Rhtpicephatus appendiculatia АХЭ -

BoophiLs mcropUa АХЭ 1--

Boophikadecoloraba АХЭ ■— '

Caenorhabdítu elegans АХЭ-4-

Caenorhabdtta bnggsae АХЭ-4 —

r Caenorhabdtta riegan* АХЭ 3-

1 Caenorhabdita bnggsae АХЭ 3 ——

Clona mtestinala АХЭ-l-

/ Meioidosyne incógnita АХЭ 1 1- Utbtdogfne javantCQ АХЭ-1 Caenorhabdtta e^egans АХЭ 1 Caenorhabdtta bnggsae АХЭ-1

кялыпр (MoÜUiCC) SB< чуяствкгсмь» АХЭнюкомьк

(Arthropoda Instda) паутинный

-- Í4ftftr0

- poda Aren;

UH

"Tí

геущие | '

иматоды (Nmatoda) асшаня (Urtxhortíata) нешпош (ШтаЫа)

Об 04 02 Расстояние

Рис 15 (продолжение)

Немногим лучше картина распределения ферментов, если использовать в качестве меры сходства общую реакционную способность активного центра (Рис 15^). На обоих дендрограммах наблюдаются отклонения от филогенетического древа позвоночных и насекомых Наблюдающиеся отличия полученных дендрограмм от филогенетического древа следует объяснить тем, что анализировалась не полная аминокислотная последовательность Дендрограмма, построенная на основе структуры активного центра и его "суммарной" реакционноспособности, отражает близость и отличие ферментов именно по этому признаку Известно, например, что АХЭ мух (Díptera Brachicera), занимающая обособленное положение на Рис 15, отличается от АХЭ своих ближайших родственников - комаров (Díptera Nematocerá) как по субстратной, так и по ингибиторной специфичности.

Поэтому представляет интерес сравнить полученные дендрограммы с древом холинэстераз, построенном на основании их полной аминокислотной последовательности Древо, представленное на Рис 16, построено методом экономии (parsimony) с использованием программ PROTPARS и DRAWTREE из пакета PHYLIP

Рис 16 Филогенетическое древо хотинэстераз, построенное на основе их полной аминокислотной последовательности за исключением неподдающихся выравниванию М- и С-концов Ферменты пронумерованы в соответствии с Таблицей 5.

Видно что на древе три главные ветви На ветвях, образованных ХЭ хордовых и БН-нечувстви-тельными АХЭ чтенистоногих, расположение ферментов близко к «правильному» филогенетическому древу животных Исключение АХЭ-1 асцидий Третья ветвь является смешанной, включающей типы, относящиеся как к Ес(1иогоа, так и к ЬорЬМгосИохоа Пока это трудно объяснить Вероятно, картина прояснится после открытия аминокисчотной последовательности новых групп ферментов, о существовании которых известно из данных кинетических исследований БХЭ насекомых, ДФФ-чувствитель-ной БуХЭ кальмаров, ПХЭ брюхоногих моллюсков, а также ХЭ более примитивных организмов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В свое время, классификация ХЭ была основана на субстратной специфичности ферментов млекопитающих - выделяются ацетилхочинэстераза (НФ 3 1 1 7) и холинэстераза (НФ 3 118), включающая БуХЭ и пропионилХЭ (ПХЭ) В настоящее время в западной литературе повсеместно используют термины АХЭ и БуХЭ Но БуХЭ означает не "фермент, гидролизуюший БуХ с наибольшей скорост ыо», а «вторая ХЭ позвоночных», и, например, ПХЭ сыворотки крови крыс и кур называют «БуХЭ» Еще более запутана ситуация с АХЭ Ныне это означает как «ХЭ мозга, эри гроцитов и электрического органа позвоночных», так и «любая ХЭ беспозвоночных независимо от ее субстратной специфичности»

В то же время, как показали наши исследования, на древе ХЭ присутствуют три главных ветви, т е уже сейчас выявлены три линии этих ферментов При этом АХЭ и «БуХЭ» позвоночных относятся к одной ветви, вторая ветвь образована ХЭ кровососущих клещей и БН-нечувствительными ХЭ насекомых, кодируемых геном асе2, а третья - ферментами животных различных типов, в том числе 8Н-чувст вительнлми АХЭ насекомых, кодируемых геном асе! Поэтому нам кажется, что номенклатура ХЭз должна быть пересмотрена и дополнена

Показано, что в отличие от многих адаптивных ферментов, ХЭ не проявляют четкой зависимости их каталитических свойств (субстратной и ингибиторной специфичности) от среды обитания, образа жизни животного, и даже от функциональной роли в организме Например, в организме млекопитающих ферментом нервной системы явтяется АХЭ, а ферментом сыворотки крови - БХЭ или пропионилХЭ, а в организме брюхоногих моллюсков в нервной системе содержится пропионилХЭ, а в гемолимфе - АХЭ

Отсюда можно сделать вывод, что эволюция активного центра ХЭ, с одной стороны, не имеет постепенного и закономерного характера, а с другой - не коррелирует с эволюцией белка ХЭ в целом Как следует из Таблицы 5 и Рис 1, вариабельные остатки лежит на периферии активного центра, вдали от линии, соединяющей каталитически важные пункты - эстеразный (8200) и "анионный" (\У84) (как известно, ацетилхолин располагается в активном центре ХЭ в полностью вытянутой транс-конфш урании) Именно вариабельность этих остатков свидетельствует о том, что они малозначимы для осуществления основной функции АХЭ - гидролиза ацетилхолина в синапсе

Мутации гена ХЭ, относящиеся к периферии активного центра и отражающиеся на ее активности в реакции с синтетическими субстратами и различными ингибиторами, видимо, являются нейтральными, и приводят как к дивергенции, и конвергенции в субстратно-ингибиторной специфичности ХЭ По-видимому, этот признак не подвергается отбору в природных условиях Известно лишь несколько природных соединений, являющихся избирательными ингибиторами ХЭ Хотя большинство алкалоидов в той или иной степени способны ингибировать активность ХЭ, их преимущественной мишенью действия на организм являются различные рецепторы в центральной и периферической нервной системе Адаптивным признаком чувствительность ХЭ к ингибиторам стала только после широкого внедрения в практику химических средств защиты растений, что привело к возникновению многочисленных резистентных популяций вредителей

выводы

1 В результате анализа данных о полной аминокислотной последовательности ХЭ 79 различных животных выявлены три основные линии Следовательно, современная номенклатура ферментов, различающая всего два класса ХЭ, должна быть пересмотрена и дополнена

2 Дендрограммы, полученные при кластерном анализе как чувствительности холинэстераз к необратимым ингибиторам, так и строения их активного центра, не соответствуют филогенетическому древу животных Следовательно, эволюция активного центра ХЭ не коррелирует с эволюцией белка ХЭ в целом

3 Кластерный и факторный анализ констант взаимодействия ХЭ различных насекомых с необратимыми ингибиторами показали, что характер получаемых дендрограмм и величины значений экстрагируемых факторов мало зависит от природы ингибиторов, использованных разными авторами Таким образом, "чувствительность к ингибиторам" определяется прежде всего природой фермента

4 "Чувствительность ХЭ к ингибиторам" не является адаптивным признаком в природных условиях, и эволюция активного центра ХЭ происходит путем нейтральных мутаций

5 Выявлен «материальный субстрат» факторов, определяющих чувствительность ХЭ насекомых к необратимым ингибиторам Фактор А, характерный для SH-чувствительных холинэстераз насекомых, связан с природой остатков, образующих вход в активный центр Фактор В определяется строением ацильного кармана активного центра Фактор С определяется строением периферического «анионного» пункта Эти факторы отражаются также на взаимодействии холинэстераз с субстратами и обратимыми ингибиторами.

6 Избирательность действия диалкилфосфатов на холинэстеразы различных животных определяя-ется различиями в строении ацильного кармана ферментов Выявлены конкретные аминокислотные остатки, критичные при взаимодействии активного центра с алкильными радикалами определенной длины

7 Комбинированное ингибирование активности ХЭ фосфорорганическими ингибиторами включает в себя стадию обратимого взаимодействия ингибитора с аиилированым ферментом Любые ФОИ ингибируют ХЭ по комбинированному типу, который в своих крайних вариантах прини-маег вид "чисто необратимого" и "псевдообратимого" ингибирования

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Brestkin А Р , Maizel Е В , Moralev S.N., Novozhilov К V , Sazonova I N Cholinesterases of aphids -I Isolation, partial purification and some properties of cholinesterases from spring gram aphid Schiza-phis gramma Rond // Insect Biochemistry, 1985, V 15, N 2, P 309-314

2. Brestkin A P , Khovanskikh A E , Maizel E В , Moralev S.N., Novozhilov К V , Sazonova I N , Abduvakhabov A A Godovikov N N , Kabachnik MI, Khaskin B.A , Mastrykova T A , Shipov A.E. Cholinesterases of aphids - II Anticholinesterase potency and toxicity of different organophosphorus inhibitors for spring grain aphid Schizaphis gramna Rond // Insect Biochemistry, 1986, V 16, N 4, P.701-707

3 Годовиков H H , Вихрева JI.A , Балашова Е.К , Бресткин А П , Моралев С.Н., Розенгарт В И., Шерстобитов О Е., Кабачник M И Синтез и антихолинэстеразная активность S-алкиниловых эфиров диэтилфосфорной кислоты, содержащих гидрофобную или ониевую группировки в алктиольном радикале // Изв АН СССР, сер хим., 1986, № 8, С.1864-1868

4. Бресткин А.П, Майзель Е.Б., Моралев С.Н., Сазонова И Н., Мастрюкова Т А., Шипов А.Э., Жданова Г.В., Кабачник М.И Антихолинэстеразная активность и токсичность для злаковой тли 0-алкил-5-(карбметоксиметилмеркаптометил)метилтиофосфонатов / Химия и применение фосфорорганических соединений, // Л , "Наука", 1987, С 207-212

5 Годовиков Н Н , Вихрева Л А , Даришева Е К , Балашова Е К , Моралев С.Н., Бресткин А П , Розенгарт В И , Шерстобитов О Е , Кабачиик М И Синтез и антихолинэстеразная активность S-этинильных эфиров диалкилтиофосфорных кислот с циклическими радикалами у ацетиленовой связи // Изв АН СССР, сер хим , 1987, № 1, С 170-176.

6. Бресткин А П , Вихрева Л А , Годовиков Н Н , Горбатюк В С., Моралев С.Н., Кабачник М.И Замещенные этинилфосфонаты и их антихолинэстеразная активность // Известия АН СССР, сер хим, 1988, №9, С 2118-2123

7 Novozhilov К V , Brestkin А Р , Khovanskikh А Е , Maizel Е В , Moralev S.N., Nikanorova Е V , Sazonova I.N. Cholinesterases of aphids - III Sensitivity of acetylcholinesterases to several inhibitors as a possible phylogenetical character // Insect Biochemistry, 1989, V. 19, N 1, P. 15-18.

8 Кугушева Л И , Далимов Д Н , Моралев С.Н., Прохоренко Н К , Бабаев Б Н , Абдувахабов А А. Взаимодействие холинэстераз и карбоксилэстераз млекопитающих и членистоногих с 0,0- диал-кил-8-пропаргитгиофосфатами // Узбек хим ж, 1990, № 3, С 40-43

9 Чарыева О.Б., Кулиева А М , Моралев С.Н., Розенгарт В И Холинэстеразы хлопковой совки (Hehothis armígera Hbn.) // Изв АН ТуркмССР, сер.биол наук, 1991, № 3, С.78-80

10 Бресткин А.П , Вихрева Л А , Годовиков Н Н., Жуковский Ю Г , Кабачник М И , Моралев С.Н., Розенгарт В И , Шерстобитов О Е S-алкиниловые эфиры тиокислот фосфора как ингибиторы холинэстераз и перспективные физиологически активные вещества /' Успехи химии, 1991, Т 60, №8, С 1744-1776.

11 Бресткин А.П , Жуковский Ю Г , Моралев С.Н., Розенгарт В И , Сочилина Е F , Ягодина О В , Вихрева Л А , Годовиков Н Н , Кабачник М И К вопросу о механизме антихолинэстеразного действия ацетиленовых фосфорорганических ингибиторов // Биоорг химия, 1992, Т 18, № 8, С.1067-1072.

12 Моралев С.Н., Нестеров В П , Розенгарт В И Модуляция активности хотинэстераз теоретические и практические аспекты проблемы//Биол.мембраны, 1992,Т9,№ 10-11,С Í030-1031

13 Балема В.П , Рис Е Г . Сочилина Е Е , Ягодина О.Е , Моралев С.Н., Жуковский Ю Г., Годовиков Н.Н , Кабачник М И Антихолинэстеразная активность некоторых карборанил-содержащих тио-и селеноэфиров пятивалентных кислот фосфора//Биоорг химия, 1993, Т. 19, № 11, С 1077-1080

14 Кулиева А М , Доренская Г М , Чарыева О Б , Розенгарт В И , Кугушева Л И , Моралев С.Н., Абдувахабов А А , Далимов Д Н , Бабаев Б Н Чувствительность холинэстераз и карбоксилэстераз хлопковой совки Heliothis armígera к 0,0-диалкил-8-пропаргилтиофосфатам // Хим. природ соед - 1994, № 1,С. 125-129

15. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В., Шестакова Н Н., Луцык МА, Софронов ГА К механизму действия холинэргически активных тионовых фосфорорганических соединений Конформаци-онные аспекты и влияние ионной силы // Хим -фарм журн , 1994, № 10, С 18-20

16 Кулиева AM, Моралев С.Н., Розенгарт ЕВ Особенности ингибиторной специфичности холинэстераз гусениц хлопковой совки Heliothis armígera Hbn // Журн. эволюц биохим физиол , 1995, Т 31, №2, С. 270-276.

17 Бресткин А П , Кормилицын Б Н , Кугушева Л И , Майзель F Б , Моралев С.Н., Муканова К Д , Хованских А Е , Абдувахабов А А , Бабаев Б.Н , Далимов Д Н Сравнительное исследование чувствительности холинэстераз и карбоксилэстераз некоторых млекопитающих и членистоногих к новым фениловьтм и глицидиловым эфирам диалкилтиофосфорной кислоты // Журн эволюц биохим. физиол , 1996, Т 32, № 4, С.377-383

18. Моралев С.Н., Нестеров В.П, Ягодина О.В Структура и механизм действия ингибиторов ферментов метаболизма нейромедиаторов // Нейрохимия,1996, Т 13, № 3, С.168-178

19 Моралев С.Н., Механизм комбинированного ингибирования холинэстераз злковой тли фосфор-органическими соединениями//Журн эвол биохим физиол , 1997, Т 33, N»3, С 280-287

20 Моралев С.Н., Базюкин А Б Исследование дивергенции холинэстераз насекомых путем кластерного анализа величин констант их взаимодействия с ингибиторами // Журн эвол. биохим физиол., 1997, Т 33, № 3, С. 288-295.

21 Моралев С.Н., Базюкин А Б Факторный анализ чувствительности холинэстераз насекомых к необратимым ингибиторам// Журн эвол биохим физиол., 1997, Т. 33, № 3, С 296-301

22 Моралев С.Н., Базюкин А Б Использование многомерного статистического анализа в исследовании зависимости антихолинэстеразной эффективности фосфорорганических ингибиторов от их строения //Журн. эвол. биохим. физиол., 1997, Т 33, Л"» 3, С.302-306.

23. Бресткин А.П., Кузнецова Л П , Моралев С.Н., Розенгарт Е В , Эпштейн Л.М Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов Владивосток. ТИНРО-центр, 1997. 466 с.

24 Моралев С.Н., Розенгарт Е В Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз позвоночных и беспозвоночных // Журн эвол биохим физиол, 1999,Т35, 1, С.3-14.

25. Моралев С.Н. Новые данные о строении ацильного кармана холинэстераз // Докл. РАН, 2000, Т.375, N° 1-6, С.215-217.

26 Моралев СЛ. Исследование вариабельности строения активного центра холинэстераз методом факторного анализа // Докл. РАН, 2000, Т 373, № 5, С 698-700.

27 Моралев С.Н. Активный центр холинэстераз. Статистический анализ вариабельности структуры //Журн эвол биохим. физиол 2001, Т 37, №1, С 21-27.

28. Моралев С.Н. Ацильный карман активного центра холинэстераз и диалкилфосфаты Исследование взаимодействия статистическими методами // Журн. эвол. биохим. физиол, 2001, Т.37, №2, С.92-100.

29 Моралев С.Н., Розенгарт Е В "Субстратное ингибирование" - один из аспектов субстратной специфичности холинэстераз позвоночных и беспозвоночных // Журн эвол. биохим физиол., 2001, Т.37, №5, С.358-373.

30. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В., Суворов А.А. "Каталитическая машина" холинэстераз разных животных устроена одинаково//Докл. РАН, 2001, Т.381, № 1, С. 123-125.

31 Розенгарт Е.В , Хованских А.Е, Басова Н Е. Моралев С.Н., Сравнительно-энзимологическое исследование каталитических свойств холинэстеразы сыворотки крови норки, Mustela vison Schr //Журн эвол. биохим физиол., 2002, Т 38, №4, С.311-315.

32 Розенгарт Е В , Хованских А Е , Басова Н Е , Моралев С.Н., Сравнительно-энзимологическое исследование каталитических свойств холинэстеразы мозга норки, Mustela vison Schr. '/ Журн. эвол. биохим. физиол., 2003, Т.39, №3, С.237-243.

33. Кормилицын Б Н, Моралев С.Н., Хованских А.Е, Далимов Д Н. Чувствительность холинэстераз различного происхождения к фосфорорганическим ингибиторам с S-алкильными радикалами разной длины // Журн. эвол биохим физиол , 2003, Т.39, № 5, С 406-409

34 Моралев С.Н., Есаулова А И , Курапов А.А , Розенгарт Е В , Хованских А Е Исследование холинэстеразной активности печени некоторых рыб Каспийского моря // Докл. РАН, 2003, Т.392, № 4, С 549-551.

35 Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Сравнительная чувствительность холинэстераз различного происхождения к некоторым необратимым ингибиторам // Журн эвол биохим физиол , 2004, Т 40, № 1, С.3-15.

36. Moralev S.N. New essential residues in the chohnesterase acyl pocket / Cholinergic Mechanisms: Function and Dysfunction /' Silman I, Soreq H, Anglister L, Michaelson D M, Fisher A, eds; London; Taylor & Francis Group, 2004, P. 645-648.

37. Moralev S.N., Rozengart E V Variability of substrate specificity in cholmesterases of vertebrates and invertebrates / Ibid, P 685-686

38 Моралев C.H., Розенгарт E В Исследование холинэстераз различного происхождения методом ингибиторного анализа I. Варьирование структуры отщепляемой группировки фосфорорганических ингибиторов //Журн. эвол. биохим. физиол., 2005, Т 41, № 3, С.201-216.

39 Moralev S.N., Rozengart Е V Comparative study of cholmesterases substrate-inhibitor specificity La Jolla, CA: International University Line, Biotechnology Series, 2005 (m press, manuscript 418 pp.)

(С) Представленные рисунки и таблицы подготовлены к публикации в книгр [39] и воспроизводятся в

диссертации с разрешения издательства.

Подписано в печать 21.04.2005. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/2104. П. л. 2.5. Уч.-изд. л. 2.5. Тираж 100 экз

ЗАО «КопиСервис» Адрес юр.: 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16. Адрес факт.: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 5. тел.: (812) 327 5098

P - 8 5 5 1

PHB PyCCKHH (j)OHA

2006-4 7877

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Моралев, Сергей Николаевич

Оглавление.

Принятые сокращения и химические названия соединений.

Актуальность темы.

Цель работы.

Положения, выносимые на защиту

Научная новизна результатов

Теоретическое и практическое значение работы

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. РАЗНООБРАЗИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ХОЛИНЭСТЕРАЗ

У РАЗЛИЧНЫХ ЖИВОТНЫХ

1.1.1. ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ПОЗВОНОЧНЫХ (Chordata: Vertebrata).

1.1.2. ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ НАСЕКОМЫХ {Arthropoda: Insecta)

1.1.3. ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ МОЛЛЮСКОВ СMollusca)^

1.2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА ХОЛИНЭСТЕРАЗ.

1.2.1. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА.

1.2.2. ВТОРИЧНАЯ И ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРЫ

1.2.3. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА

1.2.4. ТОПОГРАФИЯ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ХОЛИНЭСТЕРАЗ.

1.2.5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ, РАСПОЛОЖЕННЫХ В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ.

1.3. МЕХАНИЗМ И КИНЕТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ХОЛИНЭСТЕРАЗ

С СУБСТРАТАМИ И ИНГИБИТОРАМИ.

1.3.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С СУБСТРАТАМИ.

1.3.2. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ АКТИВНОСТИ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗ. "СУБСТРАТНОЕ ТОРМОЖЕНИЕ"

1.3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ОБРАТИМЫМИ ИНГИБИТОРАМИ

1.3.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ И КАРБАМАТНЫМИ ИНГИБИТОРАМИ

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

II. 1. ИССЛЕДОВАННЫЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ.

II.2. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗ И СКОРОСТИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С

НЕОБРАТИМЫМИ ИНГИБИТОРАМИ:

И.З. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ

И.3.1. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ДАННЫХ

11.3.2. РАНЖИРОВАНИЕ ДАННЫХ

11.3.3. КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ

11.3.4. КЛАСТЕРНЫЙ АНАЛИЗ.

11.3.5. ФАКТОРНЫЙ АНАЛИЗ

11.3.6. МНОГОФАКТОРНЫЙ ДИСПЕРСИОННЫЙ АНАЛИЗ.

ГЛАВА III. НОВЫЕ ДАННЫЕ О МЕХАНИЗМЕ КОМБИНИРОВАННОГО

ИНГИБИРОВАНИЯ ХОЛИНЭСТЕРАЗ

ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

ГЛАВА IV. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ДАННЫХ О СУБСТРАТНО-ИНГИБИТОРНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

IV. 1. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ

IV.2. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ШЕСТЬЮ СТАНДАРТНЫМИ НЕОБРАТИМЫМИ ИНГИБИТОРАМИ

IV.3. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ДИАЛКИЛФОСФАТАМИ, ИМЕЮЩИМИ АЛКИЛЬНЫЕ РАДИКАЛЫ РАЗЛИЧНОЙ ДЛИНЫ И РАЗВЕТВ ЛЕННОСТИ

ГЛАВА V. МНОГОМЕРНЫЙ СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СТРОЕНИЯ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ХОЛИНЭСТЕРАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

V.I. ИССЛЕДОВАНИЕ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ СТРОЕНИЯ «КАТАЛИТИЧЕСКОЙ МАШИНЫ» АКТИВНОГО ЦЕНТРА ХОЛИНЭСТЕРАЗ

V.2. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ АЦИЛЬНОГО КАРМАНА

ХОЛИНЭСТЕРАЗ

V.3. ВЫЯВЛЕНИЕ УЧАСТКОВ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ХОЛИНЭСТЕРАЗ

НАСЕКОМЫХ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ РАЗЛИЧИЯ В ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

К НЕОБРАТИМЫМ ИНГИБИТОРАМ

ГЛАВА VI. ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗИ МЕЖДУ СТРОЕНИЕМ АКТИВНОГО

ЦЕНТРА ХОЛИНЭСТЕРАЗ И ФИЛОГЕНИЕЙ ЖИВОТНЫХ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное исследование структуры и функционирования активного центра холинэстераз позвоночных и беспозвоночных"

Актуальность темы

Холинэстеразы (ХЭ) являются одной из наиболее глубоко и широко изучаемых групп ферментов. В связи с тем, что ацетилхолинэстеразы (АХЭ) обеспечивают синапти-ческую передачу в нервной системе позвоночных и беспозвоночных животных, исследование механизмов модуляции активности АХЭ представляет большой интерес как с теоретической, так и с практической точки зрения - для создания новых эффективных лекарственных препаратов и средств защиты растений. С другой стороны, структура и каталитические свойства ХЭ весьма разнообразны у различных животных, что позволяет использовать их при изучении эволюции ферментных белков. С третьей стороны, холинэстеразы являются благодатным материлом для специалистов по ферментативной кинетике.

За примерно полувековую историю исследования был накоплен огромный материал о взаимодействии ХЭ различного происхождения с эффекторами различного строения. Весьма значителен также материал о структуре молекулы разных ХЭ, полученный за последние 10-15 лет. Однако до сих пор эти две группы данных использовались лишь порознь и лишь для качественной оценки сходства и различия ферментов, и являются в значительной степени "сырым материалом", требующим обобщения и углубленного анализа.

Между тем известно, что методы статистической обработки многомерных данных, широко используемые в экономике, демографии, психологии и многих других областях, позволяют охватить широкий спектр сторон и связей явления и одновременно выделить среди них базисные, узловые связи, не только систематизировать материал, но и вскрыть новые закономерности, не очевидные при рассмотрении исходных данных. Мы предположили, что статистические методы могут быть применимы и полезны и в области биохимии, в частности при исследовании структуры и функционирования активного центра ХЭ.

Цель работы.

Задачей нашей работы являлось сравнительное исследование строения активного центра ХЭ позвоночных и беспозвоночных путем многомерного (кластерного, факторного и дисперсионного) статистического анализа данных о скорости их взаимодействия с субстратами и необратимыми ингибиторами и данных о физико-химических характеристиках аминокислотных остатков активного центра, и последующая интерпретация полученных результатов с целью выяснения путей, эволюции этих ферментов и выявления факторов, определяющих степень чувствительности ХЭ к ингибиторам.

Положения, выносимые па защиту => Выявлены конкретные аминокислотные остатки в ацильном кармане активного центра, определяющие избирательность действия диалкилфосфатов на холинэстеразы различных животных. Многомерный статистический анализ факторов, определяющих чувствительность ХЭ насекомых к ацилирующим ингибиторам, позволил выявить их связь с особенностями конкретных структур активного центра (ацильного кармана и периферического «анионного» пункта). Они отражаются также на взаимодействии ХЭ с субстратами и ингибиторами другого механизма действия. => "Чувствительность к ингибиторам" является характеристикой, мало связанной с природой и механизмом действия ингибиторов, и определяется главным образом природой фермента. Результаты, полученные при факторном и кластерном анализе нескольких наборов констант взаимодействия ХЭ насекомых с ингибиторами, близки между собой и мало зависят от природы исследованных ингибиторов. => "Чувствительность ХЭ к ингибиторам" не является адаптивным признаком в природных условиях, а эволюция активного центра ХЭ происходит путем нейтральных мутаций, т.к. получаемые дендрограммы не соответствуют филогенетическому древу насекомых. В результате анализа данных о полной аминокислотной последовательности 79 ХЭ различных животных выявлены три основные линии. Сделан вывод, что современная номенклатура ферментов, различающая всего два класса ХЭ, должна быть пересмотрена и дополнена. Комбинированное ингибирование активности ХЭ фосфорорганическими ингибиторами включает в себя стадию обратимого взаимодействия ингибитора с ацилированым ферментом. Любые ФОИ ингибируют ХЭ по комбинированному типу, который в своих крайних вариантах принимает вид "чисто необратимого" и "псевдообратимого" ингибирования.

Научная новизна результатов

Впервые при сравнительном исследовании каталитических свойств и строения активного центра ХЭ использованы методы многомерного статистического анализа данных, что позволило придти к новым, неочевидным выводам: кластерный и факторный анализ констант взаимодействия ХЭ различных насекомых с необратимыми ингибиторами показали, что характер получаемых дендрограмм и и величины экстрагируемых факторов мало зависит от природы ингибиторов, использованных разными авторами. Таким образом, "чувствительность к ингибиторам" в основном определяется природой фермента.

Сопоставление этих данных с результатами кластерного и факторного анализа характеристик аминокислотных остатков, составляющих активный центр холинэстераз насекомых, позволило выявить «материальный субстрат» факторов, определяющих их чувствительность к необратимым ингибиторам. Фактор А, характерный для SH-чувствительных холинэстераз насекомых, связан с природой остатков, образующих вход в активный центр. Фактор В определяется строением ацильного кармана активного центра. Фактор С определяется строением периферического «анионного» пункта. Эти факторы отражаются также на взаимодействии холинэстераз с субстратами и обратимыми ингибиторами.

Дендрограммы, полученные при кластерном анализе чувствительности ХЭ к необратимым ингибиторам и строения их активного центра, не соответствуют филогенетическому древу животных. Сделан вывод, что мутации гена ХЭ, относящиеся к периферии активного центра и отражающиеся на ее активности в реакции с синтетическими субстратами и различными ингибиторами, являются нейтральными. Эволюция активного центра ХЭ, с одной стороны, не имеет адаптивного характера в природных условиях, а с другой - не коррелирует с эволюцией белка ХЭ в целом.

Избирательность действия диалкилфосфатов на холинэстеразы различных животных определяется различиями в строении ацильного кармана ферментов. Выявлены конкретные аминокислотные остатки, критичные при взаимодействии активного центра с алкильными радикалами определенной длины.

Впервые в схему комбинированного торможения активности ХЭ фосфороргани-ческими ингибиторами (ФОИ) включена стадия обратимого взаимодействия ингибитора с ацилированым ферментом. Теоретический анализ кинетики этого процесса подтвержден экспериментальными данными. Сделан вывод, что "чисто необратимое" и "псевдообратимое" ингибирование ХЭ под действием ФОИ являются крайними вариантами комбинированного торможения.

Теоретическое и практическое значение работы.

Несомненное значение, как с теоретической, так и с практической точки зрения, имеет предлагаемый новый подход к исследованию взаимодействия ферментов с эффекторами - использование многомерных статистических методов обработки данных.

Проведенные исследования позволили сделать выводы об эволюции активного центра ХЭ и о факторах, определяющих чувствительность ХЭ к необратимым ингибиторам, что ценно для сравнительной биохимии ХЭ и может быть использовано при создании высокоэффективных и избирательных лекарственных препаратов и средств защиты растений.

На основании исследования кинетики взаимодействия ХЭ злаковой тли с ФОИ был уточнен механизм комбинированного ингибирования и были выведены новые кинетические уравнения, более полно отражающие взаимодействие фермента с ингибиторами и позволяющие более точно рассчитывать ингибиторные константы. Сделанные выводы применимы ко всем гидролитическим ферментам и являются вкладом в ферментативную кинетику.

ВВЕДЕНИЕ

ХЭ, особенно АХЭ, издавна являются одним из наиболее интенсивно изучаемых ферментов. Этот интерес связан не только с их значимостью для фармакологии [87], военной токсикологии [86] и поиска избирательных средств защиты растений [89], но и с такими замечательными свойствами, как исключительно высокая скорость катализа и специфичность в отношении различных субстратов и ингибиторов.

Накоплен огромный сравнительный материал о скорости взаимодействия г ХЭ разных животных с различными эффекторами, который был изложен в нескольких монографиях и обзорах [I, 2, 17, 19, 24, 29, 62, 98, 152, 219, 221, 299, 320]; Конформационный анализ, выполненный на основе этих данных, позволил получить новые сведения о молекулярной механике взаимодействия АХЭ человека и БуХЭ лошади с субстратами, обратимыми и необратимыми ингибиторами [93, 117-119, 342].

Новый виток развития:исследований ХЭ начался после определения; в 1986 году первичной структуры [292] и выяснения в 1991 году кристаллической структуры АХЭ электрического ската Torpedo californica [306].

Современные методы исследования (рентгеноструктурный анализ белка, определение аимнокислотной последовательности, направленный мутагенез, "выравнивание" (alignment) аминокислотной последовательности различных белков, компьютерная "стыковка" (docking) молекулы эффектора с активным центром фермента) позволили определить строение активного центра ХЭ различного происхождения и функциональную роль составляющих его аминокислотных остатков. В последние годы значительно расширились знания о молекулярном механизме взаимодействия ХЭ с субстратами и ингибиторами.

Однако большая часть данных, полученных ранее методом субстратно-ингибитор-ного анализа, особенно о ХЭ беспозвоночных, не была пересмотрена в свете новых сведений о строении и механизме действия ХЭ.

Нам представляется перспективным привлечение к этой работе современных статистических методов. В частности, такое понятие, как "чувствительность к ингибиторам", как и многие другие биологические показатели, является многомерной характеристикой, которая, не может быть подвергнута прямому измерению. Измерена может быть только скорость взаимодействия фермента с отдельными ингибиторами.

В таких случаях весьма полезными являются методы статистической обработки многомерных данных. Они позволяют охватить широкий спектр сторон и связей явления и одновременно выделить среди них базисные, узловые связи. Такое сокращенное пространство параметров легче поддается содержательному восприятию и дальнейшему анализу, чем многомерное пространство исходных признаков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Моралев, Сергей Николаевич

ВЫ КОДЫ

1. В результате анализа данных о полной аминокислотной последовательности ХЭ 79 различных животных выявлены три основные линии. Следовательно, современная номенклатура ферментов, различающая всего два класса ХЭ, должна быть пересмотрена и дополнена.

2. Дендрограммы, полученные при кластерном анализе как чувствительности холинэстераз к необратимым ингибиторам, так и строения их активного центра, не соответствуют филогенетическому древу животных. Следовательно, эволюция активного центра ХЭ не коррелирует с эволюцией белка ХЭ в целом.

3. Кластерный и факторный анализ констант взаимодействия ХЭ различных насекомых с необратимыми ингибиторами показали, что характер получаемых дендрограмм и величины экстрагируемых факторов мало зависит от природы ингибиторов, использованных разными авторами. Таким образом, "чувствительность к ингибиторам" определяется прежде всего природой фермента.

4. "Чувствительность ХЭ к ингибиторам" не является адаптивным признаком в природных условиях, и эволюция активного центра ХЭ происходит путем нейтральных мутаций

5. Выявлен «материальный субстрат» факторов, определяющих чувствительность ХЭ насекомых к необратимым ингибиторам. Фактор А, характерный для SH-чувствитель-ных холинэстераз насекомых, связан с природой остатков, образующих вход в активный центр. Фактор В определяется строением ацильного кармана активного центра. Фактор С определяется строением периферического «анионного» пункта. Эти факторы отражаются также на взаимодействии холинэстераз с субстратами и обратимыми ингибиторами.

6. Избирательность действия диалкилфосфатов на холинэстеразы различных животных определяется различиями в строении ацильного кармана ферментов. Выявлены конкретные аминокислотные остатки, критичные при взаимодействии активного центра с алкильными радикалами определенной длины.

7. Комбинированное ингибирование активности ХЭ фосфорорганическими ингибиторами включает в себя стадию обратимого взаимодействия ингибитора с ацилированым ферментом. Любые ФОИ ингибируют ХЭ по комбинированному типу, который в своих крайних вариантах принимает вид "чисто необратимого" и "псевдообратимого" ингибирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ t

В свое время, классификация ХЭ была основана; на субстратной специфичности ферментов млекопитающих - были выделены ацетилхолинэстераза (НФ 3.1.1.7) и холин-эстераза (НФ 3.1.1.8), включающая БуХЭ и;ПХЭ; В настоящее время в;западной литературе повсеместно используют термины; АХЭ; и БуХЭ. Но БуХЭ означает не «фермент, гидролизующий БуХс наибольшей скоростью», а «вторая ХЭ позвоночных», и, например, пропионилхолинэстеразу сыворотки крови крыс и кур называют «БуХЭ». Еще более запутана ситуация с АХЭ. Ныне это означает как «ХЭ мозга, эритроцитов, и электрического органа позвоночных», так и«любая ХЭ беспозвоночных независимо от ее субстратной специфичности».

В то же время, как это видно на Рис. 26, на древе ХЭ присутствуют три; главных ветви, т.е. уже сейчас выявлены три линии этих: ферментов. При этом АХЭ и «БуХЭ»

Ф( позвоночных относятся к одной ветви, вторая ветвь образована ХЭ кровососущих клещейи SH-нечувствительными ХЭ насекомых, кодируемых геном асе2, а третья - ферментами животных различных типов, в том числе SH-чувствительными АХЭ насекомых, кодируемых геном acel. Поэтому нам кажется, что номенклатура ХЭ должна быть пересмотрена и дополнена.

Наши исследования показали, что многие особенности субстратно- ингибиторной специфичности связаны с конкретными участками активного центра. Исследовав скорость взаимодействия различных ХЭ с рядами эффекторов закономерно меняющегося строения, можно на основании данных об известной первичной структуре других ХЭ в общих чертах сделать заключение о топографии активной поверхности исследованных ферментов.

Как было показано, в отличие от многих адаптивных ферментов ХЭ не проявляют четкой зависимости их каталитических свойств (субстратной и ингибиторной специфичности) от среды; обитания, образа жизни животного, и даже от функциональной роли в организме. Например, в организме млекопитающих ферментом нервной системы является

АХЭ, а ферментом сыворотки крови - БХЭ или ПХЭ, а в организме брюхоногих моллюсков в нервной системе содержится ПХЭ, а в гемолимфе - АХЭ (см. Таблицу 3).

При этом разнообразие каталитических свойств ХЭ не определяется: филогенетическим положением животных.

Отсюда можно сделать вывод, что эволюция активного центра ХЭ, с одной стороны, не имеет постепенного и;закономерного характера, а с другой - не коррелирует с: эволюцией белка ХЭ в целом. Как следует из Таблицы 1 и; Рис.6, вариабельные остатки ; лежит на периферии активного центра, вдали от линии, соединяющей каталитически; важные пункты;- эстеразный (S200) и "анионный" (W84) (как известно, ацетилхолин располагается в активном центре ХЭ в полностью вытянутой транс-конфигурации). Именно вариабельность этих остатков свидетельствует о том, что они малозначимы для осуществления основной функции АХЭ — гидролиза ацетилхолина в синапсе.

Мутации гена ХЭ, относящиеся к периферии активного центра и отражающиеся на ее активности; в реакции s с синтетическими ? субстратами и различными ингибиторами, видимо, являются нейтральными, и приводят как к дивергенции, и конвергенции в субст-ратно-ингибиторной специфичности ХЭ.

По-видимому, этот признак не подвергается отбору в природных условиях. Известно лишь несколько природных соединений, являющихся избирательными ингибиторами ХЭ. Хотя большинство алкалоидов в той или иной степени способны ингибировать активность ХЭ, их преимущественной мишенью действия на организм являются различные рецепторы в центральной и периферической нервной системе. Адаптивным; признаком чувствительность ХЭ к ингибиторам стала только после широкого внедрения в практику химических средств защиты растений, что привело к возникновению многочисленных резистентных популяций вредителей.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Моралев, Сергей Николаевич, Санкт-Петербург

1. Абдувахабов А.А., Михайлов С.С., Садыков А.С., Щербак И.Г. Антиферментноедействие и детоксикания фосфорорганических ингибиторов холинэстераз. Ташкент: Фан, 1989.- 180 с.

2. Абдувахабов А.А., Садыков А.С., Далимов Д.Н., Асланов Х.А. Алкалоиды и их производные как инструмент для изучения холинэргической системы. Ташкент: ФАН, 1984.-288 с.

3. Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ. Подход с использованием ЭВМ. М.: Мир, 1982.-488 с.9 5. Балашова Е.К., Бресткин А.П., Жуковский Ю.Г., Розенгарт В.И., Шерстобитов О.Е.,

4. Васильева Т.Н., Савченко К.Н., Абдувахабов А.А., Далимов Д.Н. Действие фосфорорганических ингибиторов, производных лупинина и эпилупинина, на холинэстеразы млекопитающих и членистоногих // Ж. эвол. биохим. физиол. 1980. - Т. 16, № 3. - С. 244-250.

5. Басова Н.Е., Розенгарт Е.В., Хованских А.Е. Кинетический анализ "защитного эф

6. Ф фекта субстрата" для холинэстераз разного происхождения // Ж. эвол. биохим.физиол. 2000. - Т. 36. - С. 97-102.

7. Бресткин А.П., Брик И.Л. Активирующее влияние ионов тетраметиламмония и ацетилхолина на холинэстеразу лошадиной сыворотки // Биохимия. 1967. - Т.32, №1.-С. 3-12.

8. Бресткин А.П., Брик И.Л., Волкова Р.И., Годовиков Н.Н., Кабачник М.И;, Теплов Н.Е. Антихолинэстеразные свойства 0,0-диэтил-8-(р-арилметиламино)этил.-ме-тилтиофосфонатов и их метилсульфометилатов // ДАН СССР. 1965. - Т.163, № 2. -С.365-368.

9. J 10. Бресткин А.П., Брик ПЛ., Волкова Р.И., Годовиков Н.Н., Гурдалиев Х.Х., Кабачник

10. J М.И:, Карданов Н.А. Комбинированное торможение холинэстеразы из сыворотки;крови лошади эфирами дифенилфосфорной и дифенилтиофосфорной кислот // ДАН СССР. 1971. - Т. 200. - С. 103-106.

11. Бресткин А.П., Брик И.Л., Волкова Р.И., Розенгарт Е.В., Сагал А.А. О взаимодействии фосфорорганических ингибиторов с холинэстеразой / Химия и применение фос-форорганических соединений. М.: Наука, 1972. С.431-437.

12. Бресткин А.П., Брик И.Л., Годовиков Н.Н., Кабачник М.И., Свидрицкая Н.И., Смусин Я.С., Трифонова С.А. Ингибирование холинэстераз 0,0-дипропил-8-(Р-арилметиламиноэтил) тиофосфатами и их иодметилатами // Изв.АН СССР, сер.хим.1974.-№ 12.-С. 2811-2815.

13. Бресткин А.П., Брик И.Л., Годовиков Н.Н., Кабачник М.И., Киреева Е.Г., Трифонова С.А. Антихолинэстеразные свойства 0,0-диизопропил-5-((3-Ы,М-арилметиламино-этил)тиофосфатов и их иодметилатов // Изв.АН СССР, сер.хим. 1976. - № 2. - С. 429-431.

14. Бресткин А.П., Виняр Т.Н., Розенгарт Е.В. Взаимодействие холинэстераз зрительных ганглиев командорского кальмара с некоторыми обратимыми ингибиторами // Нейрохимия. 1982. - Т. 1, № 1. - С. 28-35.

15. Бресткин А.П., Григорьева Г.М., Еремеева A.M., Жуковский Ю.Г., Кузнецова Л.П., Ракич Л. Ацетилхолинэстераза электрического органа Torpedo marmorata // Ж. эвол. биохим. физиол. 1975. - Т. 11, № 3. - С. 250-257.

16. Бресткин А.П., Годовиков Н.Н. Комбинированный вид ингибирования холинэстераз фосфорорганическими соединениями // Успехи химии. 1978. - Т.47, № 9. - С. 16091627.

17. Бресткин А.П., Жуковский Ю.Г., Сипенкова Т.М. Гидролиз холиновых и тиохолино-вых эфиров под действием холинэстераз // Биохимия. 1974. - Т.39, № 1. - С. 13-18.

18. Бресткин А.П., Жуковский Ю.Г., Фарцейгер Н.Л. Каталитические свойства холинэстераз мозга и сыворотки крови голубя Columba livia И Ж. эвол. биохим. физиол, 1983.-Т.19,№2.-С. 138-143.

19. Бресткин А.П., Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Хованских А.Е., Федорец Ю.А., Эпштейн Л.М. Субстратно-ингибиторная специфичность холинэстеразы нервной ткани командорского кальмара // Нейрохимия. 1986. - №5. - С.264-270.

20. Бресткин: А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.Н., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов. Владивосток: ТИНРО-Центр, 1997. -466 с.

21. Бресткин А.П., Пархоменко Т.В. Субстратная специфичность частично очищенной холинэстеразы сыворотки крови кур // Биохимия. 1971. - Т.36, № 5. - С. 950-955.

22. Бресткин А.П., Пархоменко Т.В. Особенности строения активного центра пропионилхолинэстеразы сыворотки крови кур // Биохимия. 1973. - Т.38; № 3. - С. 467-470.

23. Бресткин А.П., Певзнер Д.Л. О свойствах ацетилхолинэстеразы мозга и эритроцитов быка//Биохимия. 1971. - Т.36, № 1.-С. 81-86.

24. Бресткин А.П., Розенгарт Е.В., Абдувахабов А.А., Садыков А.А. Эфиры карбоновых кислот как субстраты холинэстераз // Успехи химии. 1983. - Т.52, Вып. 10. - С. 1624-1647.

25. Бресткин А.П., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. О свойствах холинэстеразы из хвостатого ядра мозга тюленя Phoca hispida ladogensis // Ж. эвол. биохим. физиол. 1971. -Т.7, № 5. - С. 474-477.

26. Брик И.Л. Свойства ацетилхолинэстеразы мозга карпа // Биохимия. 1969. - Т.34. — С.90-95.

27. Брик И.Л. Холинэстеразы мышц морских червей Physcosoma japonicum и Lumbriconereis impatiens / Биохимическая эволюция. Под ред Е.М.Крепса. Л.: Наука, 1973.-С. 55-66,

28. Брик И.Л., Мандельштам; Ю.Е. Свойства холинэстеразынервной системы саранчи Locusta migratoria // Ж. эвол. биохим. физиол. 1973. - Т.9, № 2. - С. 138-143.

29. Брик И.Л., Мандельштам Ю.Е., Федин А.Н. Холинэргические системы насекомых. / Сравнительная фармакология синаптических рецепторов. Под ред. Е.М.Крепса. Л.: Наука, 1977.-С. 143-151.

30. Брик И.Л., Яковлев В.А. Сравнительное изучение свойств холинэстераз нервной системы позвоночных и насекомых // Биохимия. 1962. - Т.27, № 6. - С. 993-1003.

31. Волкова Р.И., Титова Э.В., Кабачник М.И., Мастрюкова Т.А., Шипов А.Э., Жданова Г.В. Использование новых фосфорорганических ингибиторов, содержащих карбме-токсильную группу, для идентификации карбокилэстераз насекомых // ДАН СССР. -Т.270. С.470-473.

32. Голиков С.Н., Розенгарт В.И. Холинэстеразы и антихолинэстеразные вещества. Л.: Медицина, 1964. 382 с.

33. Григорьева Г.М. Холинэстераза зрительного ганглия осьминога Octopus sp. и кальмара Ommatostrephes sloanei-paciflcus II Ферменты в эволюции животных / Под ред.

34. Е.М.Крепса. Л.: Наука, 1969. С. 177-183.

35. Григорьева Г.М. Каталитические свойства и чувствительность к различным ингибиторам холинэстеразы из слюнных желез моллюска Murex trunculus (Gastropoda) // Биохимия. 1973. -Т.38, № 6. - С. 1126-1135.

36. Григорьева Г.М. О каталитических свойствах холинэстеразы нервной ткани и гемолимфы моллюска Lymnaea stagnalis // Ж. эвол. биохим. физиол. 1974. - Т. 10. - С. 104-107.

37. Григорьева Г.М. Холинэстеразы зрительного ганглия кальмара Illex illecebrosus, каракатицы Sepia officinalis и эледоны Eledone sp. // Сравнительная нейрофизиология и нейрохимия / Под ред. Е.М.Крепса. JL: Наука, 1976. С. 3-13.

38. Григорьева Г.М. Сравнительное исследование холинэстераз нервной ткани головоногих и брюхоногих моллюсков // Сравнительная фармакология синаптических рецепторов / Под ред. Е.М.Крепса. Л.: Наука, 1977. С. 137-143.

39. Григорьева Г.М. Пропионилхолинэстеразы мозга брюхоногих моллюсков.* Взаимодействие с субстратами и ингибиторами 7/ Биохимия. 1980. - Т.45, Вып. 12.-С. 2176-2188.

40. Григорьева Г.М., Краснова Т.И., Хованских А.Е., Гусев Г.В., Лежнева И. П. Выделение и каталитические свойства растворимой и мембранной холинэстеразы мозга капустной мухи Delia brassicae II Биохимия. 1987. - Т.52, Вып.7. - С. 1192-1200.

41. Григорьева Г.М., Краснова Т.И., Хованских А.Е., Лежнева И.Л. Субстратная и ингибиторная специфичность холинэстеразы мозга мух (Diptera: Anthomiidae, Muscidae). К проблеме типа фермента // Ж. эвол. биохим. физиол. 1997. - Т. 33, № 4-5.-С. 431-442.

42. Григорьева Г.М., Розенгарт Е.В., Турпаев Т.М. Характеристика специфичности холинэстераз сердечной мышцы и гемолимфы моллюсков // Физиология и биохимиябеспозвоночных / Под ред. Е.М.Крепса. Л.: Наука, 1968. С. 166-175.

43. Григорьева Г.М., Ткаченко С.С. Холинэстеразы гемолимфы брюхоногих моллюсков // Ж. эвол. биохим. физиол. 1971. - Т. 7, № 3. - С. 254-261.

44. Далимов Д.Н. Антихолинэстеразные свойства N- р -(диалкоксифосфинил) меркапто-этилцитизинов и их иодметилатов // ДАН УзбССР. 1978. - № 9. - С.39-43.

45. Далимов: Д.Н., Абдувахабов А.А., Асланов X.А., Годовиков Н.Н., Садыков А.С. Антихолинэстеразные свойства 1Ч-Р-(диалкоксифосфинил)меркаптоэтил. декагид-рохинолинов и их иодметилатов // Изв.АН CCCPj сер.хим. 1978. - № 11. - С.2600-2604.

46. Демиденко Е.В; Линейная и нелинейная регрессии. М.: Финансы и статистика, 1981. 302 с.

47. Енюков И.С. Методы, алгоритмы, программы многомерного статистического анализа. М.: Финансы и статистика, 1986.

48. Журавская С.А., Бобырева Т.В. Физиолого-биохимические основы действия инсектицидов на насекомых вредителей хлопчатника. Ташкент: Фан, 1970. С.3-52.

49. Журавская С.А., Бобырева Т.В., Сабирова Д.У., Собчак М.Н. Основы применения химических средств защиты хлопчатника от вредителей. Ташкент: Фан, 1976. С.1-102.

50. Иберла К. Факторный анализ. М.: Статистика, 1980. 398 с.

51. Кабачник М.И., Абдувахабов А.А., Агабекова И.И., Бресткин А.П., Волкова Р.И., Годовиков Н.Н., Годына Е.И., Михайлов С.С., Михельсон М.Я., Розенгарт В.И.,

52. Розенгарт Е.В., Ситкевич Р.В. Гидрофобные области активной поверхности холинэстераз // Успехи химии. 1970:- Т.39, № 6. - C.1050-I073.

53. Краснова Т.И. Холинэстераза мозга капустной мухи Delia brassicae // Канд. Дисс., С-Петербург, 1989.

54. Кугушева Л.И., Далимов Д.Н., Моралев С.Н., Прохоренко Н.К., Бабаев Б.Н., Абдувахабов А.А. Взаимодействие холинэстераз и карбоксилэстераз млекопитающих и членистоногих с О,О-диалкил-Б-пропаргилтиофосфатами // Узб. хим. журн. -1990.-№3.-С. 40-43;

55. Кушиев Х.Х. Исследование свойств холинэстераз и карбоксилэстераз озимой (Agrotis segetum Schiff.) и малой наземной (Spodoptera exiqua Hbn.) совок // Канд. Дисс., Ташкент, 1995.г

56. Мастрюкова Т.А., Агабекян Р.С., Урюпин А.Б., Кабачник М.И. Синтез и антихолин-эстеразные свойства некоторых S-бензгидриловых эфиров монотиокислот фосфора // Изв. АН СССР, сер. хим,- 1977. -№ 10. С. 2317-2322.

57. Махаева Г.Ф., Малыгин В.В., Якубов Ш.М., Горбунов С.М. Исследование связи структура-антихолинэстеразная активность в ряду О-фосфорилированных оксимов. И. Диалкилфосфаты и метилфосфонаты // Хим.-Фарм. Ж.урн. 1994. - Т. 28. - С.14ш 18.

58. Махаева Г.Ф., Фетисов В.И., Соколов В.Б., Янковская B.JI., Горева Т.В., Малыгин

59. B.В., Безноско Б.К., Галенко Т.Г., Коломиец А.Ф., Мартынов И.В. Взаимодействие диалкил(а-карбметокси-(3,р,(3-трифторэтил)фосфатов с эстеразами млекопитающих // Биоорг. Химия. 1987. - Т. 13. - С.33-37.

60. Махаева Г.Ф., Шатаева Г.А., Янковская В.Л., Фетисов В.И., Лошадкин Н1А., Мартынов И.В., Хаскин Б.А., Шелученко О.Д: Взаимодействие бисфосфорилированных ме-танов с эстеразами млекопитающих // Биоорг. Химия. 1984. - Т.10. - С.1347-1352.

61. Моралев С.Н. Активный центр холинэстераз. Статистический анализ вариабельности структуры // Ж. эвол. биохим. физиол. 2001. - Т.37, №11 - С.21-27.

62. Моралев С.Н. Ацильный карман активного центра холинэстераз и диалкилфосфаты. Исследование: взаимодействия статистическими методами // Ж. эвол. биохим. физиол. 2001. - Т.37, №2. - С.92-100.

63. Моралев ^ С.Н., Базюкин А.Б. Исследование: дивергенции холинэстераз насекомых путем: кластерного анализа величин констант их взаимодействия с ингибиторами // Ж. эвол. биохим. физиол. 1997. - Т. 33, №3. - С. 288-295.

64. Моралев С.Н., Базюкин А.Б. Факторный анализ чувствительности холинэстераз насекомых к необратимым ингибиторам // Ж. эвол. биохим. физиол. 1997. - Т.ЗЗ, №3.1. C. 296-301.

65. Моралев С.Н., Базюкин А.Б. Использование многомерного статистического анализа в исследовании зависимости антихолинэстеразной эффективности фосфорорганических ингибиторов от их строения // Ж. эвол. биохим. физиол. 1997. - Т.ЗЗ, №3. - С. 302-306.

66. Моралев С.Н., Есаулова А.В., Розенгарт Е.В., Хованских А.Е. Исследование холинэстеразной активности в печени некоторых рыб Каспийского моря // Доклады РАН. 2003. - Т.392, №4. - С.549-551.

67. Моралев С.Н., Майзель Е.Б. Отличительные особенности холинэстераз злаковой тли Schizaphis gramina Rond. // ДАН СССР — 1981. — Т.259, №1. С.235-238.

68. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз позвоночных и беспозвоночных // Ж. эвол. биохим. физиол. 1999J- Т.35, № 3i - С. 3-15.

69. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. "Субстратное ингибирование" один из аспектов субстратной специфичности холинэстераз позвоночных и беспозвоночных// Ж. эвол. биохим. физиол. - 2001. - Т.37, № 5. - С. 358-373:

70. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Сравнительная чувствительность холинэстераз различного происхождения к некоторым необратимым ингибиторам // Ж. эвол. биохим. физиол. 2004. - Т.40, №1. - С.3-15.

71. Моралев С.Н;, Розенгарт Е.В., Суворов А.А. "Каталитическая машина" холинэстераз разных животных устроена одинаково // Доклады Академии наук 2001. Т.381, № 1. - С.123-125.

72. Никанорова Е.В.! Новые данные о свойствах холинэстеразы гороховой тли (Acyrthosiphon pisum Нагг.) // Бюлл. ВНИИ защ. раст. 1980. - Т. 49. - С. 31-32. 64

73. Номенклатура ферментов: Рекомендации Международного биохимического союза по номенклатуре и классификации ферментов, а также по единицам ферментов и символам кинетики ферментативных реакций. М.: ВИНИТИ. 1979. -С.321.

74. Новожилов К.В., Сазонова И.НМ Андреева Н.А., Агеенко О.И. Некоторые характеристики холинэстеразы Apanteles glomeratus L., паразита капустной белянки Pieris brassicae L. // Бюлл. ВНИИ защ. раст. 1976. - Т. 36. - С. 58-64.

75. О'Брайн Р.Д. Токсичные эфиры кислот фосфора. М.: Мир, 1963.

76. Родендорф Б.Б., Расницин А.П. (ред.) Историческое развитие класса насекомых // Труды Палеонтологического института, Т. 178. М.: Наука, 1980.- 256 с.

77. Розенгарт В.И., Шерстобитов О.Е. Избирательная токсичность фосфорорганических инсектоакарицидов. Л.: Наука, 1978. 174 с.

78. Розенгарт Е.В. Субстратно-ингибиторный анализ холинэстеразы гемолимфы тихоокеанского брюхоногого моллюска Neptunea eulimata II Ж. эвол. биохим. физиол. 2001. - Т. 37. - С.219-224.

79. Розенгарт Е.В., Басова Н.Е. Видовые различия в субстратно-ингибиторной специфичности холинэстераз оптического ганглия кальмаров семейства Gonatidae I/ Ж. эвол. биохим. физиол. 2000: Т. 36. - С. 249-253.

80. Розенгарт Е.В., Басова Н.Е., Суворов А.А., Хованских А.Е. Индофениловые ; хромогенные субстраты холинэстераз различного происхождения // Ж. эвол. биохим.физиол. 2002. - Т. 38. - С. 14-19.

81. Розенгарт Е.В., Жоров Б.С. Расстояние между аммониевыми группами полиметилен-бис(триметиламмониевых) соединений по данным теоретического конформацион-ного анализа//ДАН СССР. 1983. - Т. 273. - С.505-508.

82. Розенгарт Е.В., Хованских А.Е., Басова Н.Е., Моралев С.Н. Сравнительно-энзимологическое исследование каталитических свойств холинэстеразы сыворотки крови норки, Mustela vison И Ж. эвол. биохим. физиол. 2002. - Т. 38. - С. 311-315.

83. Розенгарт Е.В., Хованских А.Е.,. Басова Н.Е., Моралев С.Н. Сравнительно-энзимологическое исследование каталитических свойств холинэстеразы мозга норки, Mustela vison И Ж. эвол. биохим. физиол. 2003. - Т. 39. - С. 237-243.

84. Розенгарт Е.В., Хованских А.Е., Эпштейн Л.М. Особенности ингибиторной специфичности холинэстеразы тихоокеанского кальмара Todarodes pacificus II Ж. эвол. биохим. физиол. 1993. - Т. 29. - С. 475-481.

85. Розенгарт Е.В., Хованских А.Е., Эпштейн JI.M. Исследование гомогенности холинэстераз нервной ткани кальмаров методом субстратно-ингибиторного анализа // Ж. эвол. биохим. физиол. 1994. - Т.ЗО, № 1. - С. 15-22.

86. Садыков А.С., Розенгарт Е.В., Абдувахабов * А. А., Асланов А.Х. Холинэстеразы. Активный центр и механизм действия. Ташкент: ФАН. 1976. 206с.

87. Сазонова И.Н., Никанорова Е.В. Пример экологического подхода к синтезу селективных афицидов // Экологические основы применения инсектоакарицидов. Сб.науч.трудов. Л.: Изд.ВИЗР, 1991. С.15-26

88. Справочник по прикладной статистике. В 2-х т., под.ред. Э.Ллойда, У.Лидермана, Ю.Н.Тюрина. М.: Финансы и статистика, 1989,1990.

89. Тилябаев 3. Свойства холинэстеразы и карбоксилэстеразы нервной ткани саранчи Locusta migratoria II Ж. эвол. биохим. физиол. 1978. - Т. 14, № 4. - С. 405-407.

90. Тилябаев 3. Свойства холинэстераз и карбоксилэстераз ганглиев саранчи // Биохимия 1979. - T.44, вып.11. - С. 2083-2093.

91. Тюрин Ю.Н., Макаров А.А. Анализ данных на компьютере. М.: Финансы и статистика, 1995.-384 с.

92. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии, T.l. М.: Мир, 1981. С.102-106.

93. Факторный, дискриминантный и кластерный анализы. М.: Финансы и статистика, 1986.-215 с.

94. Хартман Г. Современный факторный анализ. Mi: Статистика, 1972;

95. Хеттсманпергер Т. Статистические выводы, основанные на рангах. М.: Финансы и статистика, 1987. 334 с.

96. Холлендер М., Вульф Д. Непараметрические методы статистики. М.: Финансы и статистика, 1987. 334 с.

97. Чарыева О.Б. Субстратно-ингибиторная характеристика холинэстераз хлопковой совки Heliothis armigera Hbn., Автореф. канд. дисс. Ашгабат, 1995. 34

98. Чарыева О.Б., Кулиева А.М;, Моралев С.Н., Розенгарт В.И. Холинэстеразы хлопковой совки (Heliothis armigera Hbn.) II Изв. АН ТуркмССР, сер. биол. наук. 1991. -№. 3. - С. 78-80. 44

99. Швец Е.К. Ацетилхолинэстераза персиковой тли Myzus persicae Sulz. тест-фермент для выявления антихолинэстеразного механизма действия фосфорорганических и карбаматных афицидов. // Автореферат канд.дисс. Санкт-Петербург, 1996.

100. Шевцова С.П. Субстратно-ингибиторный анализ холинэстеразы зрительного ганглия кальмаров семейства Ommatostrephidae и биохимический критерий вида // Канд. Дисс. Киев, 1983.

101. Шевцова С.П., Бресткин А.П., Несис К.Н., Розенгарт Е.В. Об идентичности свойств холинэстераз зрительного ганглия кальмара Ommatostrephes bartrami из Южной Атлантики и Большого Австралийского залива // Океанология . 1977. - Т. 17. - С. 1102-1105.

102. Шестакова Н.Н., Розенгарт Е.В. Конформационо-функциональные отношения холиновых эфиров карбоновых кислот как субстратов ацетилхолинэстеразы // Доклады Академии наук 1996. - Т. 346. - С. 266-267.

103. Шестакова Н.Н., Розенгарт Е.В., Жоров Б.С. Зависимость антиацетилхолинэстераз-ной эффективности фосфорорганических ингибиторов от доступности атома фосфора // Биоорг. химия. 1992. - Т. 18, № 4. - С. 596-603.

104. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. М.: Наука, 1965. 248 с.

105. Adoutte A., Balavolne G., Lartillo N., Lespinet О., Prud'homme В., de Rosa R. The new animal phylogeny: reliability and implifications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 4453-4456.

106. Anazawa Y., Tomita Т., Aiki Y., Kozaki Т., Kono Y. Sequence of a cDNA encoding acetylcholinesterase from susceptible and resistant two-spotted spider mite, Tetranychus urticae II Insect Biochem. Mol. Biol. 2003. - V. 33. - P. 509

107. Andrews M.C., Callaghan A., Field L.M., Williamson M.S., Moores G.D. Identification of mutations conferring insecticide-insensitive AChE in the cotton-melon aphid, Aphis gos-sypii Glover // Insect Mol. Biol. 2004. - V. 13. - P. 555

108. Anthony N.,Rocheleau Т., Mocelin G., Lee H.J., Ffrench-Constant R. Cloning, sequencing and functional expression of an acetylcholinesterase gene from the yellow fever mosquito Aedes aegyptill FEBS Letters. 1995. - V. 368. - P. 461

109. Antosiewicz J., McCammon J.A., Wlodek S.T., Gilson M.K. Simulation of charge-mutant acetylcholinesterases // Biochemistry. 1995. - V. 34, N 13. - P. 4211-4219.

110. Antosiewicz J J, Wlodek S.Т., McCammon J. A. Acetylcholinesterase: role of; the enzyme's charge distribution in; steering charged ligands toward the active site // Biopolymers. -1996.-V. 39, N1.-P. 85-94.

111. Augustinsson K.-B. Substrate concentration and specificity of cholin ester-splitting enzymes//Archs. Biochem. 1949.-V. 23.-P. 111-126.

112. Augustinsson K.-B. The evolution of esterases in vertebrates / Homologous enzymes and biochemical evolution // N.Y.: Gordon and Breach. 1968. - P. 299-311.

113. Augustinsson K.-B., Nachmansohn D.; Distinction between acetylcholine-esterase and other choline ester-splitting enzymes // Science. 1949. - V. 110, N 2847. - P. 98-99.

114. Baxter G.D., Barker S.C. Acetylcholinesterase cDNA of the cattle tick, Boophilus micro-plus: characterisation and role in organophosphate resistance // Insect Biochem. Mol. Biol;- 1998. V. 28. P.581-589.

115. Baxter G.D., Barker S.C. Comparison of acetylcholinesterase genes from cattle ticks // Int. J. Parasitol. 1999. -V. 29. - P. 1765-1774.

116. Baxter G.D., Barker S.C. Analysis of the sequence and expression of a second putative acetylcholinesterase cDNA from organophosphate-susceptible and organophosphate-resis-tant cattle ticks // Insect. Biochem. Mol. Biol. 2002. - V. 32. - P.815-820.

117. Bartolucci С., Perola E., Cellai L., Brufani M., Lamba D. "Back door" opening implied by the crystal structure of a carbamoylated acetylcholinesterase // Biochemistry. 1999. - V. 38, N 18.-P. 5714-5719.

118. Bentley G.N., Jones A.K., Agnew A. Mapping and sequencing of acetylcholinesterase genes from the platyhelminth blood fluke Schistosoma // Gene. 2003. - V. 314. - P. 103

119. Berman H.A., Decker M.M. Kinetic, equilibrium, and spectroscopic studies on dealkylation ("aging") of alkyl organophosphonyl acetylcholinesterase. Electrostatic control of enzyme topography//J. Biol. Chem. 1986. -V. 261, N 23, N 23. - P. 10646-10652

120. Berman H.A., Decker M.Mi Chiral nature of covalent methylphosphonyl conjugates of acetylcholinesterase // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264, N 7. - P. 3951-3956.

121. Berman H.A., Leonard K. Chiral reactions of acetylcholinesterase probed with; enantiomeric methylphosphonothioates. Noncovalent determinants of enzyme chirality // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 3942-3950.

122. Bocquene G., Roig A., Foumier D. Cholinesterases from the common oyster (Crassostrea gigas). Evidence for the presence of a soluble acetylcholinesterase insensitive to organo-phosphate and carbamate inhibitors // FEBS Lett. 1997. - V.407. - P.261-266.

123. Воеск А.Т., Schopfer L.M., Lockridge О. DNA sequence of butyrylcholinesterase from the rat: expression of the protein and characterization of the properties of rat butyrylcholinesterase // Biochem. Pharmacol. 2002. - V.63. - P.2101-2110.

124. Botti S.A., Felder C.E., Lifson S., Sussman J.L., Silman 1: A modular treatment of molecular traffic through the active site of cholinesterase // Biophys. J. 1999. - V. 77, N 5. - P. 2430-2450.

125. Bourguet D., Pasteur N., Bisset J., Raymond M. Determination of Ace.l genotypes in single mosquitoes: toward an ecumenical biochemical test // Pestic. Biochem. Physiol. 1996. - V.55. -P.122-128.

126. Bratkowski T.A., Knowles C.O. Properties of an acetylcholinesterase from the face fly, Musca autumnalis И Ann.Entom.Soc.Amer. 1968. - V.61, N 2. - P.397-402.

127. Brestkin A.P., Brick I.L., Grigor'eva G.M. Comparative pharmacology of cholinesterases // Intern. Encycl. Pharmacol. Therap. Sect.85, N.l / Ed. M.J. Michelson. Oxford-N.Y.: Per-gamon Press, 1973. P. 241-344.

128. Brestkin A.P., Rozengart E.V. Cholinesterase catalysis // Nature. 1965. - V.205, N 4969. -P. 388-389.

129. Brick I.L., Brestkin A.P., Mandelstam Yu.E. Properties of cholinesterase and carboxyles-terase of nervous tissue of Periplaneta americana II Insect Biochem. 1979. - V.9, N 4. -P. 397-401;

130. Cauet G., Friboulet A., Thomas D. Substrate activation and thermal denaturation kinetics of the tetrameric and the trypsin-generated monomelic forms of horse serum butyrylcholi-nesterase// Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V. 912, N 3. - P. 338-342.

131. Chen Z., NewcombR;, Forbes E., McKenzie J., Batterham P. The acetylcholinesterase gene and organophosphorous resistance in the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina ll Insect Biochem. Mol. Biol. 2001. - V. 31. - P. 805

132. Cousin X., Hotelier Т., Giles K., Toutant J.P., Chatonnet A. aCHEdb: the database system for ESTHER, the alpha/beta fold family of proteins and the Cholinesterase gene server// Nucl. Acids. Res. 1998. - V. 26, N 1. - P. 226-228.

133. Creighton Т.Е. Proteins. Structural and molecular properties. New York: Freeman, 1992. P. 143.

134. Dauterman W.C., O'Brien R.D. Cholinesterase variation as a factor in organophosphate selectivity in insects // J.Agric. Food Chem. 1964. - V. 12, N 4. - P.318-319.

135. Dauterman W.C., Talens A., van Asperen K. Partial purification and properties of fly head cholinesterase // J.Insect Physiol. 1962. - V.8, N 1. - P. 1-14.

136. Duran R., Cervenansky C., Dajas F., Tipton K.F. Fasciculin inhibition of acetylcholinesterase is prevented by chemical modification of the enzyme at a peripheral site // Biochim. Biophys. Acta. 1994.-V. 1201, N 3. - P. 381-388.

137. Eichler J., Anselment A., Sussman J.L., Massoulie J., Silman I. Differential effects of "peripheral" site ligands on Torpedo and chicken acetylcholinesterase // Mol. Pharmacol. ~ 1994. V. 45, N 2. - P. 335-340.

138. Eisenberg D., Schwarz E., Komaromy M., Wall R. Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot // J. Mol. Biol. 1984. - V. 179. - P. 125-142.

139. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.Jr., Featherstone R.M. Anew and rapid colorimet-ric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol; 1961. - V. 7, N 1. - P.88-95;

140. Faerman C., Ripoll D., Bon S., Le Feuvre Y., Morel N., Massoulie J., Sussman J.L., Silman I. Site-directed; mutants designed to test back-door hypotheses of acetylcholinesterase function//FEBS Lett.- 1996.-V. 386, N 1. P. 65-71.

141. Fontain A., Zerba E. Integumental esteratic activity in Triatoma infestans and its contribution to the degradation of organophosphorus insecticides // Сотр. Biochem. Physiol. -1984.-V. С 79, N l.-P. 183-188.

142. Forsberg A., Puu G. Kinetics for the inhibition of acetylcholinesterase from the electric eel by some organophosphates and carbamates // Eur. J. Biochem. 1984. - V. 140, N I. - P. 153-156.

143. Friboulet A., Rieger F., Goudou D., Amitai G., Taylor P. Interaction of an organophosphate with a peripheral site on acetylcholinesterase // Biochemistry. 1990. - V. 29, N 4; - P. 914-920.

144. Frobert Y., Creminon C., Cousin X., Remy M.H., Chatel J.M., Bon S., Bon C., Grassi J. Acetylcholinesterases from Elapidae snake venoms: biochemical, immunological and enzymatic characterization // Biochim. Biophys. Acta. 1997. - V. 1339. - P.253-267.

145. Gao J.R., Kambhampati S., Zhu K.Y. Molecular cloning and characterization of a greenbug {Schizaphis graminum) cDNA encoding acetylcholinesterase possibly evolved from a duplicate gene lineage II Insect Biochem. Mol. Biol. 2002. - V. 32. - P. 765

146. Gao J.R., Zhu K.Y. An acetylcholinesterase purified from the greenbug (Schizaphis graminum) with some unique enzymological and pharmacological characteristics // Insect Biochem. Mol; Biol. 2001. - V.31. - P. 1095-1104:

147. Gentry M.K., Saxena A., Ashani Y., Doctor B.P. Immunochemical characterization of anti-J 9> acetylcholinesterase inhibitory monoclonal antibodies // Chem. Biol; Interact. 1993. - V.87, N1-3.-P. 227-231.

148. Gibney G., Camp S., Dionne M., MacPhee-Quigley K., Taylor P. Mutagenesis of essential functional residues in acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. - V. 87, N 19.-P. 7546-7550.

149. Gilson M.K., Straatsma T.P., McCammon J.A., Ripoll D.R., Faerman C.H., Axelsen P.H., Silman I., Sussman J.L. Open "back door" in a molecular dynamics simulation of acetylcholinesterase // Science. 1994. - V. 263, N 5151. - P. 1276-1278.

150. Gnatt A., Loewenstein Y., Yaron A., Schwarz M., Soreq H. Site-directed mutagenesis of active site residues reveals plasticity of human butyrylcholinesterase in substrate and inhibitor interactions // J. Neurochem. 1994. - V. 62, N 2. - P. 749-755.

151. Grauso Ml, Culetto E., Combes D., Fedon Y., Toutant J.P., Arpagaus Mi Existence of four acetylcholinesterase genes in the nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae И FEBS Letters. 1998. - V. 424. - P. 279

152. Gray P.J., Dawson R.M. Kinetic constants for the inhibition of eel and rabbit brain acetylcholinesterase by some organophosphates and carbamates of military significance // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1987. - V. 91, No 1. - P. 140-144.

153. Guilbaut G. G., Huan S. S., Sadar M. H. Purification and properties of cholinesterases from honey bee Apis mellifera Linnaeus and boll weeviels Anthonomus grandis Boheman // J. Agric. Food Chem. 1970. - V. 18, N 4. - P. 692. 36

154. Guzman-Varon R., Monroe R. J., Guthrie F. E. Evaluation of cholinesterases in strains of Heliothis virescens with widely differing responses to insecticides // J. Econ. Entomol. -1974. — V.67, N 2. P. 187-189.

155. Hall L.M., Malcolm C.A. The acetylcholinesterase gene of Anopheles stephensi II Cell. Mol. Neurobiol. 1991. - V. 11. - P. 131.

156. Hall L.M., Spierer P. The Ace locus of Drosophila melanogaster: structural gene for acetylcholinesterase with an unusual 5' leader // EMBO Journal. 1986. - V. 5. - P. 2949.

157. Hama H; Preliminary report on the existence of butyrylcholinesterase-like enzyme in the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps Uhler (Hemiptera: Cicadellidae) II Appl. Entomol. Zool. 1978. - V. 13, N 4. - P. 324-325.

158. Harel M., Sussman J.L., Krejci E., Bon S., Chanal P., Massoulie J., and Silman I. Conversion of acetylcholinesterase to butyrylcholinesterase: modeling and mutagenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. - V. 89, N 22. - P. 10827-10831.

159. Hasan F.B., Cohen S.G., Cohen J.B. Hydrolysis by acetylcholinesterase. Apparent molal volumes and trimethyl and methyl subsites // J. Biol. Chem. 1980. - V. 255, N 9. - P. 3898-3904.

160. Hellenbrand K., Krupka R.M. Kinetic studies on the mechanism of insect acetylcholinesterase // Biochemistry 1970. - V.9, N 21. - P.4665-4671.

161. Hirashima A., Kuwano E., Eto M. Docking study of enantiomeric fonofos oxon bound to the active site of Torpedo californica acetylcholinesterase // Bioorg. Med. Chem. 2000. -V. 8, N 3. - P. 653-656.

162. Hodge A.S., Humphrey D.R., Rosenberry T.L. Ambenonium is a rapidly reversible noncovalent inhibitor of acetylcholinesterase, with one of the highest known affinities // Mol. Pharmacol. 1992. - V. 41, N 5. - P. 937-942.

163. Hollingworth R.M., Fukuto; T.R., Metcalf R.L. Selectivity of sumithion compared with methyl parathion. Influence of structure on anticholinesterase activity // J.Agric.Food Chem. 1967. - V. 15, N 2. - P.235-241.

164. Hosea N.A., Berman H.A., Taylor P. Specificity and orientation of trigonal carboxyl esters and tetrahedral alkylphosphonyl esters in cholinesterases // Biochemistry. 1995. - V. 34, N36.-P. 11528-11536.

165. Hosea N.A., Radic Z., Tsigelny I., Berman H.A., Quinn D.M., Taylor P. Aspartate 74 as a primary determinant in acetylcholinesterase governing specificity to cationic organophos-phonates // Biochemistry. 1996. - V. 35, N 33. - P. 10995-11004.

166. Huang C.T., Dauterman W.C., Hastings F.L. Inhibition of flyhead acetylcholinesterase by dimethoxon analogs // Pestic. Biochem. Physiol. 1974. - V.4, N 3. - P. 249-253.

167. Hussein A.S., Smith A.M., Chacon M.R., Selkirk M.E. Determinants of substrate specificity of a second non-neuronal secreted acetylcholinesterase from the parasitic nematode Nippostrongylus brasiliensis // Eur. J. Biochem. 2000. - V. 267. - P. 2276.

168. Huang Y, Qiao C, Williamson MS, Devonshire AL. Characterization of the acetylcholinesterase gene from insecticide-resistant houseflies (Musca domestica) // Chin J Biotechnol. 1997.--V. 13. -P. 177

169. Jbilo O., Chatonnet A. Complete sequence of rabbit butyrylcholinesterase // Nucleic Acids Research. 1990. - V. 18.-P. 3990

170. Jbilo O., L'Hermite Y., Talesa V., Toutant J.P., Chatonnet A. Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase expression in adult rabbit tissues and during development // Eur. J. Biochem. 1994. - V. 225, N 1. - P. 115-124.

171. Kabachnik M.I., Brestkin A.P., Godovikov N.N., Michelson M.J., Rozengart E.V., Rozengart V.I. Hydrophobic areas on active surface of cholinesterases // Pharmacol. Rev. -1970. V.22, N 3. - P. 335-388.

172. Knowles C.O., Casida J.E. Mode of action of organophosphate antihelmintics: cholinesterase inhibition in Ascaris lumbricoides // J. Agric. Food Chem. 1966. - V.14. P.566-572.

173. Koelle G.B. (Ed.) Cholinesterases and anticholinesterase agents // Handbuch der experim. Pharmakologie, Bd.15. / Ed. Koelle G.B. Berlin, Goettingen, Heidelberg: Springer-Verlag,

174. Koellner G., Kryger G., Millard C.B., Silman I., Sussman J.L., Steiner T. Active-site gorge and buried water molecules in crystal structures of acetylcholinesterase from Torpedo californica И J. Mol. Biol. 2000. - V. 296, N 2. - P. 713-735.

175. Kronman C., Ordentlich A., Barak DM Velan В., Shafferman A. The "back door" hypothesis for product clearance in acetylcholinesterase challenged by site-directed mutagenesis // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269, N 45. - P. 27819-27822.

176. Kryger G , Silman I., Sussman J.L. Three-dimensional structure of a complex of E2020 with acetylcholinesterase from Torpedo californica // J. Physiol. Paris. 1998. - V.92, N 3-4. -P. 181-194.

177. Kunkee R.E., Zweig G. Substrate specificity studies on bee acetylcholinesterase purified by gradient centrifugation // J. Insect Physiol. 1963. - V. 9, N 4. - P. 495-507.

178. Laffaire J.B., Jaubert S., Abad P., Rosso M.N. Molecular cloning and life stage expression pattern of a new acetylcholinesterase gene from the plant parasitic nematode Meloidogyne incognita // Nematology. 2003. - V. 5. - P. 213

179. Legay C., Bon S., Vernier P., Coussen F., Massoulie J. Cloning and expression of a rat acetylcholinesterase subunit: generation of multiple molecular forms and complementarity with a Torpedo collagenic subunit // J. Neurochem. 1993. - V. 60. - P. 337

180. Lee A.-H., Metcalf R.L., Keams C.W. Purification and some properties of house cricket (Acheta domesticus) acetylcholinesterase // Insect Biochem. 1974. - V. 4. - P. 267-280.

181. Li F., Han Z. Mutations in acetylcholinesterase associated with insecticide resistance in the cotton aphid, Aphis gossypii Glover // Insect Biochem. Mol. Biol. 2004. - V. 34. - P. 397

182. Lockridge O. Genetic variants of human serum cholinesterase influence metabolism of the muscle relaxant succinylcholine // Pharmacol. Ther. 1990. - V. 47, N 1. - P. 35-60.

183. MacPhee-Quigley K, Taylor P., Taylor S. Primary structure of the catalytic subunits from two molecular forms of acetylcholinesterase // J; Biol. Chem. 1985. - V. 260, N 22. - P. 12185-12189.

184. Mallender W.D., Szegletes Т., Rosenberry T.L. Acetylthiocholine binds to asp74 at the peripheral site of human acetylcholinesterase as the first step in the catalytic pathway // Biochemistry. 2000. - V. 39, N 26. - P. 7753-7763.

185. Manulis S., Ishaaya J;, Perry A.S. Acetylcholinesterase of Aphis citricola: Properties and significance in determining toxicity of systemic carbamate compounds // Pestic.Biochem. Physiol. 1981. - V.15, N 3. - P.267-274.

186. Marcel V., Palacios L. G., Pertuy C., Masson P., Foumier D. Two invertebrate acetylcholinesterase show activation followed by inhibition with substrate concentration // Biochem. J. 1998. - V. 329, N 2. - P. 329-334.

187. Marchot P., Khelif A., Ji Y.H., Mansuelle P., Bougis P.E. Binding of I25I-fasciculin to rat brain acetylcholinesterase. The complex still binds diisopropyl fluorophosphate // J. Biol. Chem. 1993. -V. 268, N 17.-P. 12458-12467.

188. Masson P., Froment M.Т., Bartels C.F., Lockridge O. Importance of aspartate-70 in organophosphate inhibition, oxime reactivation and aging of human butyrylcholinesterase // Biochem. J. 1997. - V. 325, N 1. - P. 53-61.

189. Masson P., Xie W., Froment M.-T., Levitsky V., Fortier P.L., Albaret C., LockridgeO. *1 Interaction between; the periferal site residues of human ? butyrylcholinesterase,. D70 and:

190. Y332, in binding and hydrolysis of substrates // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1433, N1-2. -P. 281-293.

191. Massoulie J., Sussman J. L., Doctor B. P. Recommendations for nomenclature in cholinesterases / Multidisciplinary Approaches to Cholinesterase Functions. Eds. Shafferman A. and Velan B. Plenum Press, New York: 1992,- P. 285-288.

192. Matthews J.В., Davidson A.J., Freeman K.L., French N.P. Immunisation of cattle with s recombinant acetylcholinesterase from Dictyocaulus viviparus and with adult worm ES products // Intern. J. Parasitol. 2001. - V. 31. - P. 307

193. Metcalf R.L., March R.B. Properties of acetylcholine esterases from the bee, the fly and the mouse and their relation to insecticide action // J. Econ. Entomol. 1950. - V. 43, N 5. - P. 670-677.

194. Metcalf R.L., March R.B., Maxon M.G. Substrate preferences of insect cholinesterases // Ann. Entom. Soc. Amer. 1955. - V. 48, N 4. - P. 222-228. 40

195. Millard C.B., Lockridge O., Broomfield C.A. Design and expression of organophosphorus acid anhydride hydrolase activity in human butyrylcholinesterase // Biochemistry. 1995. -V. 34, N49.-P. 15925-15933.

196. Morel N., Bon S., Greenblatt H.M., Van Belle D., Wodak S.J., Sussman J.L., Massoulie J., Silman I. Effect of mutations within the peripheral anionic site on the stability of acetylcholinesterase // Mol. Pharmacol. 1999. - V. 55, N 6. - P. 982-992.

197. Morel N., Massoulie J. Expression and processing of vertebrate acetylcholinesterase in the yeast Pichia pastoris И Biochem. J. 1997. - V. 328, N 1. - P. 121-129.

198. Myers D.K. Studies on cholinesterase. 9. Species variation in the specificity pattern of the pseudocholinesterase // Biochem. J. 1953. - V.55, N 1. - P. 67-79.

199. Nabeshima Т., Kozaki Т., Tomita Т., Kono Y. An amino acid substitution on the second ^ acetylcholinesterase in the pirimicarb-resistant strains of the peach potato aphid, Myzuspersicae II Biochem. Biophys. Res. Comm. 2003. - V. 307. - P. 15 .

200. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., Dijkstra В., Frolow F., Franken S.M., Harel M., Remington S.J., Silman I., Schrag J. The alpha/beta hydrolase fold // Protein Engineering. -1992. V. 5, No 3. - P. 197-211.

201. Pezzementi L., Johnson K., Tsigelny I., Cotney J., Manning E., Barker A., Merritt S. Amino acids defining the acyl pocket of an invertebrate cholinesterase // Сотр. Biochem. Physiol. 2003. - V.136B. - P.813-832.

202. Pilz R. Vergleichende Untersuchungen zur Hemmbarkeit von Acetylcholinesterasen ver-schiedener Herkunft mit insectiziden Wirkstoffen// Arch. Phytopathol. u. Pflanzenschutz. 1980. - Bd. 16, N 1. - S.51-57.

203. Piotte C., Arthaud L., Abad P., Rosso M.N. Molecular cloning of an acetylcholinesterase gene from the plant parasitic nematodes, Meloidogyne incognita and Meloidogyne javanica // Mol.Biochem.Parasitol. 1999. - V. 99. - P. 247

204. Polyzou A., Debras J.F., Belzunces L.P. Changes in acetylcholinesterase during pupal development of Apis mellifera queen // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1997. - V. 36, N 2. - P. 69-84.

205. Pomponi M., Sacchi S., Colella A., Patamia M., Marta M. The role of TRP84 in catalytic power and the specificity of AChE // Biophys. Chem. 1998. - V. 72. - P. 239-246.

206. Prody C.A., Zevin-Sonkin D., Gnatt A., Goldberg O., Soreq H. Isolation and characterization of full-length cDNA clones coding for cholinesterase from fetal human tissues // Proc. Natl. Acad. Sci. ESA. 1987. - V. 84. - P. 3555 .

207. Rachinsky T.L., Camp S., Li Y., Ekstrom T.J., Newton M., Taylor P. Molecular cloning of mouse acetylcholinesterase: tissue distribution of alternatively spliced mRNA species // Neuron. 1990.-V. 5.-P. 317

208. Radic Z., Duran R., Vellom D.C., Cervenansky C., Taylor P. Site of fasciculin interaction with acetylcholinesterase // Ji Biol. Chem. 1994; - V. 269, N 15. - P. 11233-11239.

209. Radic Z., Quinn D.MM Vellom D.C., Camp S., Taylor P. Allosteric control of acetylcholinesterase catalysis by fasciculin // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270, N 35. - P. 2039120399.

210. Radic Z., Reiner E., Taylor P. Role of the peripheral anionic site on acetylcholinesterase: inhibition by substrates and coumarin derivatives // Mol. Pharmacol. 1991. - V. 39, N 1. -P. 98-104.

211. Radic Z., Taylor P. Interaction kinetics of reversible inhibitors and substrates with acetylcholinesterase and its fasciculin 2 complex // J. Biol. Chem. 2001. - V.276. -P.4622-4633.

212. Randall W.R., Rimer M., Gough N.R. Cloning and analysis of chicken acetylcholinesterase transcripts from muscle and brain // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - V. 1218. - P. 453

213. Reiner E. Esterases in Schistosomes: reaction with substrates and inhibitors // Acta Pharm. Toxicol. 1981. - V.49. - P.72-78.

214. Ren X., Han Z., Wang Y. Mechanisms of monocrotophos resistance in cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner) // Arch. Insect Biochem. Physiol. 2002. - V. 51. - P. 103-110;

215. Ripoll D.R., Faerman C.H., Axelsen P.H., Silman I., Sussman J.L. An electrostatic mechanism for substrate guidance down the aromatic gorge of acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. - V. 90, N 11. - P. 5128-5132.

216. Roan C.C., Maeda S. The cholinesterase of the oriental fruit fly and its in vitro reactions with various insecticides compounds // J. Econ. Entomol. 1953. - V.46, N 5. - P. 755779.

217. Roan C.C., Maeda S. The cholinesterase systems of three species of fruit flies and the eff > .fects of certain insecticidal compounds on these enzymes // J.Econ.Entomol. 1954. 1. V.47, N3. P. 507-514.

218. Rosenberry T.L. Catalysis by acetylcholinesterase: evidence that the rate-limiting step for acylation with certain substrates precedes general acid-base catalysis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1975. - V. 72, N 10. - P. 3834-3838.

219. Salih E. Catalysis by acetylcholinesterase in two-hydronic-reactive states. Integrity of deuterium oxide effects and hydron inventories // Biochem. J. 1992. - V. 285, N 2. - P. 451-460.

220. Sanders M:, Mathews В., Sutherland D., Soong W., Giles H., Pezzementi L. Biochemicals and molecular characterization of acetylcholinesterase from the hagfish Myxine glutinosa // Сотр. Biochem. Physiol. 1996. - V. 115B. - P. 97.

221. Saxena A., Hur R., Doctor B.P. Allosteric control of acetylcholinesterase activity by monoclonal antibodies // Biochemistry. -1998. V. 37, N 1. - P. 145-154.

222. Saxena A., Redman A.M., Jiang X., Lockridge O., Doctor B.P. Differences in active-site gorge dimensions of cholinesterases revealed by binding of inhibitors to human butyrylcholinesterase // Chem. Biol. Interact. 1999. - V. 119-120. - P. 61 -69.

223. Schellekens R.C.A. Electrostatic properties of Torpedo californica acetylcholinesterase. Comparison with human butyrylcholinesterase // Graduation Research Project, University of California, San Diego, 1994.

224. Schumacher M., Camp S., Maulet Y., Newton M., MacPhee-Quigley K., Taylor S.S., Friedmann Т., Taylor P. Primary structure of Torpedo californica acetylcholinesterase deduced from its cDNA sequence // Nature. 1986. - V. 319, N 6052. - P. 407-409.

225. Selwood Т., Shawn R.F., States M.J. et al. Parallel mechanisms in acetylcholinesterase-catalyzed hydrolysis of cholinesters // J. Amer. Chem, Soc. — 1993. — V. 115. P. 1047710482.

226. Shafferman A., Ordentlich A., Barak D., Stein D., Ariel N., Velan В. Aging of phosphy-lated human acetylcholinesterase: catalytic processes mediated by aromatic and polar residues of the active centre // Biochem. J. 1996. - V. 318, N 3. - P. 833-840.

227. Shapira M., Thompson C.K., Soreq H., Robinson G.E. Changes in neuronal acetylcholinesterase gene expression and division of labor in honey bee colonies // J. Mol. Neurosci. -2001.-V. 17.-P. 1

228. Silver A. The biology of cholinesterases. Amsterdam: North Holland Publishing Co., 1974. 574 p.

229. Sikorav J.L., Krejci E., Massoulie J. cDNA sequences of Torpedo marmorata acetylcholinesterase: primary structure of the precursor of a catalytic subunit; existence of multiple 5'-untranslated regions// EMBO Journal. 1987. - V. 6. - P. 1865

230. Simon S., Massoulie J. Cloning and expression of acetylcholinesterase from Electrophorus. Splicing pattern of the 39 exons in vivo and in transfected mammalian cells // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272, N 52. - P. 33045-33055.

231. Singh A.K. Quantitative structure-activity relationships for phosphoramidothioate toxicity in housefly// Comp Biochem. Physiol C. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1999. - V. 123, N3.-P. 241-255.

232. Stojan J., Marcel V., Estrada-Mondaca S., Klaebe A., Masson P., Foumier D. A putative kinetic model for substrate metabolisation by Drosophila acetylcholinesterase // FEBS Lett. 1998.-V. 440, N 1-2.-P. 85-88.

233. Sussman J.L., Harel M., FroIow F., Oefner C., Goldman A., Toker L., Silman I. Atomic: structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: A prototypic acetylcholine-binding protein// Science. 1991. - V.253, N 5022: - P. 872-879.

234. Sussman J.L., Harel M., Silman I. Three-dimensional structure of acetylcholinesterase and of its complexes with anticholinesterase drugs // Chem. Biol. Interact. 1993. - V. 87, N 1-3.-P. 187-197.

235. Sutherland D., McClellan J.S., Milner D„ Soong W., Axon N., Sanders M., Hester A., Kao Y.H., Poczatek Т., Routt S., Pezzementi L. Two cholinesterase activities and genes are present in amphioxus // J. Exp. Zool. 1997. - V. 277. - P. 213.

236. Tan R.C., Truong T.N., McCammon J.A., Sussman J.L. Acetylcholinesterase: electrostatic steering increases the rate of ligand binding // Biochemistry. 1993. - V. 32, N 2. - P. 410403.

237. Тага S., Helms V., Straatsma T.P., McCammon J.A. Molecular dynamics of mouse acetylcholinesterase complexed with huperzine A // Biopolymers. 1999; - V. 50, N 4. - P. 347359.

238. Тага S., Straatsma T.P., McCammon J.A. Mouse acetylcholinesterase unliganded and in-complex with huperzine A: a comparison of molecular dynamics simulations // Biopolymers. 1999. - V. 50, N 1. - P. 35-43.

239. Taylor P., Jones J.W., Jacobs N.M. Acetylcholinesterase from Torpedo: characterization of an enzyme species isolated by lytic procedures // Mol. Pharmacol. 1974. - V. 10, N I . .-P. 78-92.

240. Taylor J.L., Mayer R.T., Himel C.M. Conformers of acetylcholinesterase: a mechanism of allosteric control // Mol. Pharmacol. 1994. V. 45. P. 74-83.

241. Tomita Т., Hidoh О., Kono Y. Absence of protein polymorphism attributable to insecticide-insensitivity of acetylcholinesterase in the green rice leafhopper, Nephotettix cinc-ticeps И Insect Biochem. Mol. Biol. 2000. - V. 30. - P. 325

242. Turpaev T.M., Abashkina L.I., Brestkin A.P., Brick I.L., Grigor'eva G.M., Pevzner D.L., Rozengart V.I., Sakharov D.A. Cholinesterase of squid optical ganglia // Eur. J. Biochem. -1968.-V. 6,N l;-P. 55-59.

243. Vaughan A., Rocheleau Т., ffrench-Constant R. Site-directed mutagenesis of an acetylcholinesterase, gene from the yellow fever mosquito Aedes aegypti confers insecticide insensi-tivity // Exp. Parasitol. 1997. - V. 87, N 3. - P. 237-244.

244. Vellom^ D.C., Radic Z:, Li Y., Camp S., Taylor P. Amino acid residues controlling acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase specificity// Biochemistry. 1993. - V. 32, N l.-P. 12-17.

245. Villatte F., Ziliani P., Marcel V., Menozzi P., Foumier D. A high number of mutations in insect acetylcholinesterase may provide insecticide resistance // Pestic. Biochem. Physiol. — 2000. -V. 67, N 2.-P: 95-102.

246. Vontas J.G., Hejazi M.J., Hawkes N.J., Cosmidis N., Loukas; M., Hemingway J. Resistance-associated point mutations of organophosphate insensitive acetylcholinesterase, in the olive fruit fly Bactrocera oleae И Insect Mol. Biol. 2002. - V. 11. - P. 329

247. Voss G. Cholinesterase autoanalysis: a rapid method for biochemical studies on susceptible and resistant insects // J. Econ. Entomol. 1980. - V. 73, N 2. - P. 189-192.

248. Voss G. Taxonomy-related cholinesterase pattern in insects // J. Econ. Entomol; 1981. -V.74. - P. 555-557.

249. Warshel A., Naray-Szabo G., Sussman F., Hwang J.K. How do serine proteases really work? // Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 3629-3637.

250. Weill M., Lutfalla G., Mogensen K., Chandre F., Berthomieu A., Berticat C., Pasteur N., Philips A., Fort P., Raymond M. Comparative genomics: Insecticide resistance in mosquito vectors // Nature. 2003. - V. 423. - P. 136.

251. Wierdl M., Morton C.L., Danks M.K., Potter P.M. Isolation and characterization of а cDNA encoding a horse liver butyrylcholinesterase: evidence for CPT-11 drug activation // Biochem. Pharmacol. 2000. - V. 59. - P. 773

252. Wlodek S.T., Shen Т., McCammon J.A. Electrostatic steering of substrate to acetylcholinesterase: analysis of field fluctuations // Biopolymers. 2000. - V. 53, N 3. - P. 265-271.

253. Woese C.R, Dugre D.H, Dugre S.A., Kondo M., Saxinger W.C. On the fundamental nature and evolution of the genetic code // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1966. - V. 31.-P. 723-736.

254. Wood E., Zerba E., Picollo M., de Licastro S. Partial purification and characterization of Triatoma infestans head cholinesterase // Insect Biochem. 1979. - V. 9, N 6. - P. 595601.

255. Yerushalmi N,, Cohen E. Acetylcholinesterase of the California red scale Aonidiella auran-tii Mask.: Catalysis, inhibition, and reactivation // Pestic. Biochem. Physiol. 2002. -V.72. - P.133-141.

256. Zahavi M., Tahori A.S., Klimer F. Insensitivity of acetylcholinesterases to organophosphorous compounds as related to size of esteratic site // Mol.Pharmacol. 1971. - V.7, N 6. -P.611-619.

257. Zahavi M., Tahori A.S., Klimer F. An acetylcholinesterase sensitive to sulfhydryl inhibitors // Biochim.Biophys.Acta 1972. - V.276. - P.577-583.

258. Zhang A.G., Dunn J.B., Clark J.M. An efficient strategy for validation of a point mutation associated with acetylcholinesterase sensitivity to azinphosmethyl in Colorado potato beetle // Pestic. Biochem. Physiol. 1999. - V. 65, N 1. - P. 25-35.

259. Zhorov B.S., Shestakova N.N., Rozengart E.V. Determination of productive conformation of acetylcholinesterase substrates using molecular mechanics // Quantitative Structure-Activity Relationship. 1991. - V. 10. - P.1 205-210.

260. Zhu K.Y., Clark J.M. Cloning and sequencing of a cDNA encoding acetylcholinesterase in Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) // Insect Biochem. Mol. Biol. -1995.-V. 25.-P. 1129.

261. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Statistica®. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. М.: Информационно-издательский дом «Филинъ», 1998. -608 с.

262. Боровиков В.П.Популярное введение в программу Statistica. М.: КомпьютерПресс, 1998, 237 с.