Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Субстратно-ингибиторная характеристика холинэстераз хлопковой совки Heliothis armigera Hbn

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Субстратно-ингибиторная характеристика холинэстераз хлопковой совки Heliothis armigera Hbn"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ТУРКМЕНИСТАНА ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

Р Г Б ОД На правах рукописи

11 СЕН 1005 УДК 577.153.4

ЧАРЫЕВА Огульнязик Байрамовна

СУБСТРАТНО-ИНГИБИТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХОЛИНЭСТЕРАЗ ХЛОПКОВОЙ совки Heliothis armígera Hbn

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АШГАБАТ - 1995

Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Туркменского государственного медицинского института.

Научный руководитель:

Кандидат медицинских наук, доцент КУЛИЕВА A.M. Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор В.И.Розенгарт

Официальные оппоненты:

1. Член АН Туркменистана, доктор биологических наук, профессор Х.Курбанов

2. Доктор ветеринарных наук, профессор Дурдыев С.

Ведущее учреждение: Институт зоологии АСХН Туркмениста-

часов на заседании Специализированного совета Института физиологии Академии медицинских наук Туркменистана. (744012, г. Ашгабат, ул. Островского, 30). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии Академии медицинских наук Туркменистана.

на им.Ниязова С.А., отдел молекуляр ной биологии, биохимии и биотехно логии

Защита диссертации состоится ".

/ - г. в /Г^

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

КАРАДЖАЕВА Г.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Защита растений от вредителей является необходимым элементом в технологии возделывания сельскохозяйственных культур. Среди комплекса мероприятий наибольший эффект дает химический метод борьбы с вредными организмами.

В последнее время значительно возросли требования к пестицидам. Радикальным путем решения проблемы создания эффективных и избирательных инсектицидов должны стать сравнительные исследования биохимических основ их токсичности и избирательности действия.

В современном ассортименте инсектицидов преобладают фос-форорганические (ФОИ), механизм действия которых основан на ингибировании ацетилхолинэстеразы (АХЭ) - фермента, участвующего в передаче нервных импульсов. Различная чувствительность АХЭ разных видов животных к ФОИ, основанная на различной степени соответствия структуры молекулы инсектицида строению активной поверхности фермента, является одним из важнейших механизмов, обеспечивающих избирательность их действия.

Так как холиэстеразы насекомых из различных отрядов значительно отличаются по своей чувствительности к ингибаторам, при поиске новых ФОИ необходимо сравнивать свойства АХЭ млекопитающих со свойствами АХЭ насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур.

Одним из наиболее опасных вредителей сельского хозяйства в Средней Азии являются гусеницы совок, в частности, хлопковая или коробочный червь хлопчатника НеНоМэ аптндега НЬп.

В последнее время массовое применение инсектицидов против хлопковой совки привело к появлению устойчивых популяций. В связи с большой актуалностью проблемы борьбы с этим вредителем мы выбрали гусениц хлопковой совки в качестве объекта исследования.

Цель работы. Задачей нашей работы была субстратно-инги-биторная характеристика строения активной поверхности холинэс-тераз хлопковой совки в сравнении с АХЭ эритроцитов человека и БуХЭ лошади, с целью получения данных, которые могут быть использованы при синтезе новых высокоактивных и избирательных инсектицидов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые в гомогенате гусениц хлопковой совки было доказано наличие двух ферментов гидролизующих холиновые эфиры - ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы и исследовано их взаимо-

действие с субстратами и большим количеством необратимых и обратимых ингибиторов.

АХЭ совки близка к АХЭ человека по субстарной спеиифичнос-ти и рН-зависимости, но имеет отличия в чувствительности к рядам необратимых ингибиторов, что свидетельствует об особенностях строения активной поверхности.

БуХЭ совки является обычным ферментом. Она характеризуется аномально высокими величинами константы Михаэлиса в реакции гидролиза тиохолиновых субстратов, чувствительностью к ингибиторам, специфичным в отношении карбоксилэстераз.

Данные об избирательности действия фосфорорганических соединений в отношении АХЭ совки и человека переданы в институт биоорганической химии Академии наук Узбекистана, для использования при синтезе новых инсектицидов избирательного действия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях Туркменского государственного медицинского института (Ашгабат, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994 гг.), на конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение и обсуждение экспериментальных данных, заключение и выводы. Список литературы содержит 205 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация документирована 22 рисунками и 15 таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Материалы и методы. В опытах использовали гусениц 5 возраста лабораторной популяции хлопковой совки Heliothis armígera. Для приготовления препарата АХЭ совки гусениц препарировали и извлекали нервные цепочки (2 цепочки на 1 мл 0,05 М Na-фocфáт-ного буфера рН - 7,5), центрифугировали при 1000 g в течении 10 минут и использовали надосадочную жидкость.

Для приготовления препарата БуХЭ совки готовили гомогенат целых гусениц (1 г на 9 мл ф.б. 0,05 М рН - 7,5), центрифугировали при 3000 g в течении 10 минут и брали надосадочную жидкость. Для ингибирования присутствующей в гомогенате АХЭ совки, перед опытами по изучению каталитической активности БуХЭ совки, гомогенат инкубировали в течение 5-10 минут со специфическим инги-

битором АХЭ Гд-42 - метилсульфометилатом 0-этил-Э-(Р-этилмер-каптоэтил) метилтиофосфоната.

Для сравнения свойств ферментов гусениц хлопковой совки со свойствами холинэстераз млекопитающих использовали частично очищенные промышленные препараты, ацетилхолинэстеразы эритроцитов человека и бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади производства Пермского НИИ вакцин и сывороток с удельной активностью соответственно 2,2 и 9,6 мкмоль АХ в минуту на мг белка.

Субстраты и необратимые ингибиторы, приведенные в таблице 1 и 2, соед. 1-8 - производства различных отечественных и зарубежных фирм. Ряды фосфорорганических (табл 2., соед. 9-62) и обратимых (табл.3) ингибиторов синтезировали в Институте биоорганической химии АН Узбекистана.

Каталитическая активность холинэстераз исследовалась колориметрическим методом Эллмана (1961).

Кинетические параметры взаимодействия холинэстераз с субстратами ( V и Км) определяли по методу Лайнуивера-Берка (Line-weaver, Burk, 1934). Бимолекулярные константы скорости (км) взаимодействия холинэстераз с необратимыми ингибиторами рассчитывали по методу Бресткина с соавт. (1971). Константы обратимого

ингибирования К., К.', К. определяли по известным методам (Кор-ниш-Боуден, 1979).

Эксперименты проводили в 3-7 повторностях. Среднее значение величин (х) и ошибку среднего (5) рассчитывали на калькуляторе МК-51 по встроенной программе. Кластерный анализ данных проводили на ЭВМ IBM PC АТ-286 с помощью программы Statgrafics.

Исследование холинэстеразной активности различных тканей гусениц хлопковой совки.

Опыты с высокоспецифичным ингибитором АХЭ Гд-42 (табл. 2, соед. 8) показали, что холинэстеразная активность гомогената нервной цепочки гусениц совки практически полностью угнетается за 5 минут при концентрации ингибитора 10 4 М. В то же время в гемолимфе и в гомогенате кишечника скорость гидролиза бутирил-тиохолина в этих условиях практически не снижается.

Следует сделать вывод, что в организме гусениц совки содержатся две холинэстеразы. Первый фермент - ацетилхолинэстераза присутствует только в нервной системе, и как у других животных участвует в передаче нервных импульсов.

Второй фермент локализован в других тканях, в частности гемолимфе и кишечнике, и функция его не ясна.

Субстратная специфичность холинэстераз гусениц хлопковой совки.

Зависимость скорости гидролиза различных субстратов под действием холинэстераз совки от их концентрации представлен на рис. 1, а кинетические параметры- максимальные скорости при полном насыщении субстратом (V) и костанты Михаэлиса (Км) - табл.1.

Таблица 1.

Кинетические параметры гидролиза холиновых эфиров холинэстеразами хлопковой совки

Субстрат Ацетилхолинэстераза Бутирилхолинэстераза

V v max ( мкмоль ^ Км(М) V v шах ( мкмоль \ Км(М)

1мин-мг белка J 1мин-мг белка/

Ацетилтиохолин (АТХ) 2,МО-1 1,1-Ю"5 2,2-Ю"3 2,0-Ю-3

Пропионилтиохолин (ПрТХ) 9,4-Ю-2 1,3-Ю'4 2,7-Ю'3 1,1-Ю"3

Бутирилтиохолин (БуТХ) 9,1-Ю'3 2,8-Ю'4 7,2-Ю'3 2,0-Ю-3

Первая холинэстераза с наибольшей скоростью гидролизует АТХ, чувствительна к эзерину (см. табл.2), проявляет ингибирование высокими концентрациями субстратов, имеет рН оптимум 8,7 и может быть классифицирована как ацилгидролаза ацетилхолина (АХЭ, КФ 3.1.1.7).

Вторая холинэстераза гусениц хлопковой совки с наибольшей скоростью гидролизует БуТХ, чувствительна к эзерину (см. табл. 2) и может быть классифицирована как ацилгидролаза ацилхолинов (БуХЭ, КФ 3.1.1.8). Однако в отличие от "типичной" БуХЭ сыворотки крови лошади она имеет необычно высокие значения Км в реакции ферментативного гидролизов субстратов.

Чувствительность холинэстераз гусениц хлопковой совки к необратимым ингибиторам.

В табл. 2 приведены данные об ингибирующей активности в отношении холинэстераз хлопковой совки и млекопитающих 62 соединений - карбаматов и фосфороорганических (ФОИ) ингибиторов.

В целом АХЭ совки близка к АХЭ человека по чувствительности к необратимым ингибиторам или уступает ей. Исключение составля-

Рис.1 Субстратная специфичость холинэстераз хлопковой совки

ет инсектицид Гардона, который в 100 раз эффективнее ингибирует АХЭ совки. По-видимому, это является одной из причин избирательной токсичности Гардоны против чешуекрылых.

Исследование чувствительности к необратимым ингибиторам БуХЭ совки выявило два необычных факта. Во-первых, она практически не чувствительна к типичным заряженным ингибиторам холи-нэстераз - прозерину и Гд-42 (соед. 2 и 8), что позволяет предположить отсутствие в активном центре БуХЭ совки анионного пункта. Во-вторых, БуХЭ совки проявляет очень высокую чувствительность к ингибиторам, специфичным для карбоксилэстераз (Кугушева и др., 1990) - 0,0 диалкил-э-пропаргилтиофосфатам (ряд V) и О-алкилфе-нилфосфонатам (ряды VII-XI). Это свидетельствует о существенном своеобразии свойств этого фермента.

Для характеристики строения активной поверхности холинэсте-раз была исследована зависимость ингибирующей активности от длины и строения алкильных радикалов в нескольких рядах ФОИ.

Ряды I-VI использовались для изучения строения гидрофобных областей, сорбирующих фосфорильную часть молекулы ингибитора. АХЭ совки в большинстве рядов проявляет наибольшую чувствительность к соединениям с этильными (ряды III и VI) или пропильны-ми (ряды I и V) радикалами, а при дальнейшем удлинении алкилов ингибирующая активность снижается. Наблюдается также второй пик активности - у гомологов с амильными (ряд V) или гексильными радикалами (ряды II, III, IV). Для АХЭ человека характерен лишь один пик, как правило для амильных радикалов. БуХЭ совки в целом близка к БуХЭ лошади - наибольшая активность исследованных ФОИ наблюдается для гомологов с бутильными радикалами.

Попарное сравнение ФОИ, с нормальными алкилами и с алки-лами соответствующей длины с разветвлением в дистальной части позволяют оценить "ширину " гидрофобного участка в районе эсте-разного пункта холинэстераз. Из данных табл. 2, ряды I-VI видно, что направление ингибирующей активности при введении метиль-ной группировки зависит как от природы фермента, так и от строения радикала в отщепляемой части молекулы. В частности, в случае АХЭ совки в большинстве случаев нет разницы между активностью пропильных и изобутильных, а также бутильных и изоамиль-ных производных. Но в рядах II и V наблюдается существенное снижение активности при переходе от пропильного к изобутильному аналогу, а в рядах III и V - повышение при переходе от бутильного к изоамильному. Можно предположить, что гидрофобная область АХЭ совки, сорбирующая фосфорильную часть молекулы ФОИ, относительно узка вблизи эстеразного пункта, и в некоторых случаях

происходит стерическое затруднение при сорбции двух изобутиль-ных радикалов.

Полученные расхождения в закономерностях для разных рядов ФОИ следует объяснить тем, что в зависимости от строения отщепляемой части, сорбция на активной поверхности происходит несколько иным образом. Это приводит к смещению всей молекулы относительно гидроксила серина эстеразного пункта. Естественно, это отражается на общей комплементарности соединения. Если происходит пространственное разобщение атома фосфора и гидроксила серина, то происходит непродуктивная сорбция (Бресткин, Годовиков, 1978) и скорость фосфорилирования резко снижается.

Все вышеуказанное относится и к исследованным рядам ФОИ с разной длиной изоалкильных радикалов в отщепляемой части молекулы (ряды VII-IX). В то время как для АХЭ человека и БуХЭ лошади наблюдается повышение ингибирующей активности при удпиненнии изоалкильного радикала независимо от строения фос-форильной части, в случае АХЭ и БуХЭ совки положение максимума активности зависит от длины и строения второго алкила. По-видимому, гидрофобные области, сорбирующие отщепляемую часть молекулы, относительно узкие у ферментов совки, вследствие чего они особо чувствительны к общей структуре ингибитора.

Другим свидетельсвом относительно узости этих гидрофобных участков у АХЭ совки является ее различная чувствительность к конформерным рядам ФОИ - производным лупинина (ряды I, III) и эпилупинина (ряды II, IV). Из данных табл. 2 следует, что эпилупи-нино-

Таблица 2.

Чувствительность холинэстераз хлопковой совки и позвоночных к карбаматным и фосфорорганическим ингибиторам (Кп, М'.мин."1)

№ Ингибитор R АХЭ БуХЭ

совки человека совки лошади

1 2 3 4 5 6 7

1. Эзерин CHjHNC(0)0 СН, С^з dHj 5,7-Ю5 3,5-Ю5 3,4-105 4,0-Ю5

J_

2. 3.

6.

7.

8.

9.

10. 11. 12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

Прозерин

(CH3),NC(0)0-|/^Y N+(CH3)3'CH3S04"-

0Ï0I

Севин

CH3HNC(0)0

Байгон

CH3HNC(0)07-s-OCH(CH3),

J7—^

Гардона

(CH30),P(0)0-Ç>CHC1 CI

с,Of ддвф

(CH30),P(0)0CH=CHC12

Параоксон (C2H50),P(0)0-^O^-N0:

Гд-42

C2H5(CH3)P(0)SC2H4S+(CH3)C2H5CH3S04"

Ряд

(R0),P(0)SCH~/ 4 -

C2H5 C3H7

C4H9 C5H11

СбНо i=C4H9 i=C5Hu

10

4

1.07-105 1,1-104 9,5104

1.9-104

7.8-Ю3

4,3-104

1,5-107

5,08-Ю3 3,41-Ю3 3,67-Ю3 1,5-103 5,87-102

5.10-103 4.15-103

9.4-Ю4 1.6-104

4.2-104 3,7-Ю2

2.3-Ю4

5.7-Ю5

7.8-Ю7

2,2-Ю4

1.5-Ю5

1.4-106 5,8-Ю5 6,48-Ю4

1.6-Ю5

4.7-Ю6

1,2-Ю1

2.7-Ю5 1,62-Ю4 4,39-Ю4

4.8-Ю3

9.9-Ю3

« 102

3,66-Ю5 2,41-Ю5 5,43-Ю4 2,77-Ю4 3,15-Ю5 2,51-Ю5 2,70-Ю5

*)

*)

з,о-ю4*)

2,5-Ю5*)

1.2-Ю6*)

8,4-Ю5*)

2,4-Ю7*> 3,0-Ю7*) 5,9108*>

1.3-108*) _ *)

1.2-Ю7*)

3.3-Ю8*>

Ряд II

<R0),P(0)SCH2|

С2Н5 С3Н7

С4Н9

С5Нц C6Hi3

4,42-Ю3 3,52-Ю4 4,22-Ю3 9,12-Ю2 4,78-Ю4

2,0-Ю4

3.8-Ю5

1.9-106 1,8-Ю6

2,79-Ю4 2,77-Ю4 3,14-Ю4 2,51-Ю6 5,19-Ю4

4,8-Ю6*)

6,о-ю6*) 6,0-ю7*)

1,0-Ю8*)

1 2 3 4 5 6 7

21. i=C4Hg 6,48-103 5,4-Ю6 2,68-Ю4 7,1-Ю6*5

22. i=C5Htl 4,84-Ю4 7,1-Ю6 2,69-Ю4 4,7-Ю7*3

23. Ряд III с2н5 2.39103 6,3-Ю5 3,66-Ю5 4,2-Ю7*'

24. C3H7 1,12-Ю3 5,2-Ю5 5,19-Ю5 8,4-Ю7*'

25. (R0),P(0)SCH2-/ ^ ^-сь з-Г С4Н9 1,31-Ю3 82-Ю5 3,46-Ю4 90-Ю7 *'

26. о С5Н11 5,59102 14-Ю5 2,79-Ю6 49-Ю7

27. CóHi3 3,42-Ю3 2.92-Ю3 2,23-Ю5 —

28. i=C4Hg 1.35-103 4,9-Ю5 3,22-Ю4 2,8-Ю7*'

29. i=C5Hn 4,76-Ю3 15-Ю5 2,67-Ю5 60-Ю7 *'

30. Ряд IV C2H5 З,76-103 0,16-Ю6 6,1-Ю4 1,3-Ю7*'

31. C3H7 4,1М03 2,8-Ю6 2,6-Ю5 1,8-Ю7*'

32. (R0),P(0)SCH2>/ 4 ч-с: ,,.г C4H9 3,75-Ю4 10,0-Ю6 1,96-Ю4 71-Ю7 *'

33. G С5Нц 3,03-Ю2 23,0-Ю6 4,39-Ю5 34-Ю7 *'

34. C6Hi3 3,02-Ю5 — 3,08-Ю4 _ *)

35. i=C4H9 4,24-Ю3 13,0-Ю6 3,22-104 1,1-Ю7 *'

36. 1=С5Нц 4,14-Ю4 16,0-Ю6 4,04-Ю4 10,0-Ю7*'

37. Ряд V C2H5 4,94-Ю2 2,1-Ю4 3,66-Ю4 3,72-Ю6*'

38. (R0),P(0)SCH;CeCH C3H7 1,12-Ю3 1,17-Ю5 1,55-104 3,20-Ю6*'

39. C4H9 3,06-Ю1 4,44-Ю5 8,53-Ю6 2,91-Ю6*'

40. с5н,1 1,21-Ю2 1,38-Ю5 6,28-Ю5 1,89-10е*'

41. cóHi3 2,45-Ю1 3,82-Ю5 6,26-Ю5 1,18-Ю5

42. i—C4H9 3,4-Ю1 1,19-Ю5 2,22-Ю5 2,53-Ю6

43. i—C5H11 1,69-Ю1 4,54-Ю5 1,75-Ю6 7,23-Ю6*'

44. Ряд VI C2H5 5,27-Ю5 6,38-Ю5 2,29-Ю5 5,6-Ю6*'

45. c3H7 5,56-Ю4 2,05-Ю5 2,24-Ю5 5,4-Ю7*'

46. (R0)2P(0)SCH;CÏCCH2N^ 8,87-Ю4 5,07-Ю6 1,67-Ю6 2,1-Ю7*'

47. i—C4H9 3,27-Ю4 2,79-Ю6 2,57-Ю5 2,8-Ю6*'

1 2 3 4 5 6 7

48. Ряд VII n=0 <4-10°+) 2,2-M1 4,32-Ю5 3,7-102+)

49. C6H5(C5H„0)P(0)S(CH:)nCH(CI n=l <4-10° 3,3-ю2 4,78-Ю6 1,6Ю3*}

50. n=2 <4-10°+) 8,0-102 4,03-Ю5 1,7-Ю3**

51. Ряд VIII n=0 4,81-Ю2 2,8-Ю2 1,25-105 1,7-103*}

52. 53. C6H5(,C5H110)P{0)S(CH2)uCH(C Н;): n=l n=2 3,6-103 2,39-102 1,6-103 2,9-Ю3 3,57-Ю5 3,96104 1.7-103 7.8-103+)

54. Ряд IX n=0 — — — 5,1-Ю2

55. адс^цОжсадсн^сжс bh n=l <4-10°+) 4-Ю2 3,06-М4 1,8-103*}

56. n=2 1,37-Ю2 5,9-Ю2 1,32-Ю5 4,5-Ю3**

57. Ряд X C5H11 3,95-Ю3 4,9-Ю4 1,38-Ю7 4,4-Ю4*)

58. C6H5(R0)P(0)SCH2CsCH СбН}з <4-10°+) 8,3-103 1,93-Ю3 2,3-104*}

59. i- -C5H11 — — — 1,2-Ю5

50. Ряд XI С5Нц 6,74-Ю2 3,2-Ю3 4,93-Ю6 5,9-Ю3**

61. C6H5(RO)P(0)SCH2CH=CH2 СбНв 2,61-Ю2 1,8-Ю3 4,21-Ю6 6,6-Ю3*)

62. i- -C5H11 3,92-M4 1,2-Ю4 2,95-Ю5 2,0-Ю4

+) не наблюдалось угнетения за 5 минут при концентрации ингибитора 5•103 М.

*) величина ки для исследованых ферментов достоверно (р<0,05) отличались друг от друга.

вые аналоги являются более сильными ингибиторами АХЭ совки, чем соответствующие лупиновые производные, причем расхождение увеличивается с удлинением алкильных радикалов в фосфорильной части молекулы ФОИ. В случае же АХЭ человека и БуХЭ лошади различия не столь существенны.

Важной характеристикой холинэстераз является соотношение ингибирующей активности аналогичных катион-содержащих и беска-тионных ФОИ, которое считается мерой "выраженности" анионного пункта фермента. В нашем случае это сравнение может быть проведено на примере ФОИ - производных алкалоидов (ряды I и II) и их йодметилированных аналогов (соответственно ряды III и IV). Данные табл. 2 свидетельствуют, что в опытах с АХЭ человека и БуХЭ лошади активность ингибиторов возрастает после введения

заряда в соединение, в то время как в опытах с АХЭ совки остается практически той же, или даже снижается. Полученные данные позволяют предположить, что анионный пункт АХЭ совки более замаскирован, чем у ферментов млекопитающих. Об этом свидетельствует и более низкая ингибирующая активность Гд-42 (соед. 8).

Чувствительность холинэстераз гусениц хлопковой совки к обратимым ингибиторам.

В табл. 3 представлены отрицательные логарифмы величин обобщенных констант обратимого ингибирования (К ), реакция ферментативного гидролиза субстрата под действием АХЭ совки, а также АХЭ человека, БуХЭ лошади, холинэстераз злаковой тли и мясной мухи.

Оказалось, что АХЭ совки менее чувствительна к йодметилатам эфедрина, псевдоэфедрина и лупинина (соед. 11-13), холинэстера-зы млекопитающих. Не удалось достичь ингибирования вплоть до концентрации алкаидов 1,2-103М. То же относится к Ы-р-оксипро-пильным производным морфолина и пиперидина (соед. 7, 8).

Константы ингибирования, полученные для других исследованных соединений, показывают, что в основном они проявляют конкурентный тип ингибирования (кроме соед.2 и 6). Соединения 11, 1,2 и 12,3 представляют собой ряды с изменениями алкильных радикалов при атоме азота. Видно, что в этих рядах активность веществ возрастает в отношении ХЭ млекопитающих. Это свидетельствует о различном строении гидрофобного окружения анионных пунктов этих ферментов.

В целом данные таблицы 3 свидетельствуют о существенной разнице в чувствительности исследованных холинэстераз к тем или иным производным алкалоидов. Эти отличия в распределении активности различных ингибиторов в отношении разных холинэстераз позволяют использовать эти данные для качественной оценки дивергенции свойств исследованных ферментов.

Статистическая обработка данных о чувствительности холинэстераз к обратимым ингибитроам.

Путем кластерного анализа данных табл.3 была получена матрица эвклидовых расстояний (табл. 4) и построена схема дивергенции холинэстераз на основании их чувствительности к обратимым ингибиторам (рис. 2).

Из этой схемы следует, что АХЭ совки по чувствительности к обратимым ингибиторам наиболее близка к АХЭ человека. Это совпадает с результатами исследования ее субстратной специфичное-

Таблица 3

Чувствительность холинэстераз к йодметилатам некоторых алкалоидов (рК.=-^К.; т/т-тип торможения: К-конкурентное, С-смешанное, Н-неконкурентное).

АХЭ АХЭ БуХЭ АХЭ АХЭ

Соединения совки человека лошади тли мухи

№

рК! т/т рК1 т/т рК; т/т рК; рК1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1. ¡М-Р-оксиэтилэфедрин 2,4 к 2,7 к 3,5 с 3,3 3,3

2. Ы-Р-оксипропилэфедрин 2,4 н 2,6 к 3,4 к 2,4 4,0

3. Ы-р-оксиэтил-псевдоэфедрин 2,9 к 3,3 к 3,6 к 3,6 3,9

4. N - Р - ОКСИ ЭТИЛЦИТИЗИ11 3,5 к 2,4 к 2,1 к 3,3 3,4

5. Ы- Р - оксипропилцитизин 2,5 к 3,3 к 2,4 к 3,9 3,6

6. Ы-Р-оксиэтилморфолин 2,9 н 2,1 к 1,9 к 3,3 3,4

7. IV- Р - оксипропилморфолин <2,9 - 2,3 к 2,5 к - -

8. Ы- Р-оксипропил-пипередин <2,9 3,3 к 3,6 к — —

9. N - Р -окси этилсаль соли дин 2,9 к 3,3 к 3,6 к 3,3 4,4

10. Ы-Р-оксипропилсаль-солидин 2,4 к 2,2 к 3,8 к 3,5 3,6

И. М-метилэфедрин <2,9 - 3,2 к 4,0 к - -

12. N - метилпсев до эфедрин <2,9 - 3,4 к 4,3 к - -

13. Лупинин <2,9 - 4,1 к 3,8 к - -

14. Эпилупинин <2,9 2,9 к 3,1 к

ти. Как известно из литературных данных, "типичная" АХЭ обнаружена даже у инфузорий. Следовательно, АХЭ совки близка к древнейшему типу холинэстераз, от которого в результате мутаций произошли другие разновидности этого фермента. Из схемы видно, что АХЭ человека и совки попадают в один кластер, ХЭ других насекомых - в другой, и БуХЭ лошади - в третий. Так как АХЭ тли и ХЭ мухи имеют субстратную специфичность, отличную и от "типичной" АХЭ человека, и от "типичной" БуХЭ лошади, следует предположить, что мутации, приведшие к их возникновению, отразились как на субстратной, так и ингибиторной специфичности.

Влияние температуры на взаимодействие АХЭ хлопковой

совки с субстратами и необратимыми ингибиторами.

Показано, что прогревание гомогената нервных цепочек совки в течении одного часа не отражалось на активности АХЭ совки вплоть до 40°. Тепловая денатурация наступала лишь при повышении температуры свыше 45°. Константа скорости тепловой денатурации при 50°составляет 0,146 мин'1.

Как видно из рис. 3, каталитическая активность АХЭ совки значительно зависит как от концентрации субстрата, так и от температуры, причем 30р1 повышается с увеличением температуры. Для обычно используемой в опытах концентрации субстрата 0,001 М наибольшая активность АХЭ совки наблюдалась при 30°. Тот же температурный оптимум наблюдался и для величины \/тах на графике в координатах Вант-Гоффа. В то время величина Км постепенно возрастала с увеличением температуры, вплоть до 45°. Исследование зависимости от температуры константы К,, скорости взаимодействия холинэстераз с необратимыми ингибиторами показало значительные различия между ферментами человека и совки. Как видно из рис.4а это зависимость в случае АХЭ человека в целом подчиняется закону Вант-Гоффа вплоть до температуры равной 40°, а в опытах с севином, гардоной и ДДВФ - вплоть до 50°. Наклон прямых для всех исследованных ингибиторов примерно равен, что свидетельствует о примерно одинаковых значениях энергии активации реакции взаимодействия АХЭ человека с этими ингибиторами.

Аналогичные прямые для АХЭ совки (рис. 46) имеют направление, обратное направлению в случае АХЭ человека, кроме опытов с севином и параоксоном. Следует отметить, что ингибирование в опытах с АХЭ совки имеет выраженный комбинированный характер, т.е. кроме развивающегося во времени необратимого процесса, отмечается заметный обратимый компонент, который значительно ниже в случае АХЭ человека. Этот обратимый компонент возрастает

Таблица 4

Матрица эвклидовых расстояний данных о чувствительности различных холинэстераз к обратимым ингибиторам

АХЭ человека БуХЭ лошади ХЭ мухи АХЭ тли АХЭ совки

АХЭ человека 0 3,81 3,7 3,37 3,60

БуХЭ лошади 3,81 0 3,82 4,36 5,007

ХЭ мухи 3,70 3,82 0 2,38 4,51

<\ХЭ тли 3,37 4,36 2,38 0 4,71

АХЭ совки 3,60 5,07 4,51 4,71 0

АХЭ

человека

АХЭ

совки

АХЭ

тли

хэ

мухи

БуХЭ

лошади

Рис.2. Схема дивергенции холинэстераз, построенная на основании кластерного анализа их чувствительности к обратимым ингибиторам.

с увеличением температуры, а необратимый (определяемый из тангенса угла наклона) - уменьшается, кроме опытов с севином и па-раоксоном. Таким образом, обратимое конкурентное связывание ингибитора снижает активность фермента как в реакции гидролиза субстрата, так и в реакции необратимого фосфорилирования.

Величины \/тах, Кт и ( являются функциями многих элементарных констант многостадийной реакции, которые зависят от при-

Рис.3 Зависимость каталитической активности АХЭ совки от концентрации субстрата при различных температурах. 1-20°, 2-30°, 3-40°, 4-45°.

Рис. 4 Зависимость биомолекулярной константы Ки (М*1 • мин-1) ско-скорости взаимодействия необратимых ингибиторов с АХЭ эритроцитов человека (А) и АХЭ нервной цепочки совки (Б) от температуры. 1 - параоксон (2,5- 10б М), 2 - севин (5-10' 6 М), 3 - гардона (1 -10'4 М), 4 - ДЦВФ (3-Ю'4 М), 5 - байгон (5-Ю'4 М).

роды фермента, субстрата или ингибитора. Поэтому величина температурного оптимума не является постоянной величиной. Действительно, оптимум для реакции АХЭ совки значительно различается в опытах с разными ингибиторами и составляет для параоксона 30°, для севина 40°, для ДДФ, байгона и гардона 20°.

Таким образом, опыты с влиянием температуры на ингибиро-вание ферментов показали значительно меньшую термоустойчивость АХЭ совки по сравнению с АХЭ человека.

ВЫВОДЫ

1. В гомогенате гусениц хлопковой совки Heliothis armigera Hbn обнаружены две холинэстеразы, гидролизующие холиновые эфиры -ацетилхолинэстераза и бутирилхолинэстераза. Ацетилхолинэстера-за обнаружена в нервной системе хлопковой совки, бутирилхолинэстераза - в гемолимфе и кишечнике.

2. По субстратной специфичности АХЭ хлопковой совки, была близка к АХЭ эритроцитов человека, но обладала более низкой чувствительностью по отношению ко всем исследованным фосфорорга-ническим ингибиторам, а также к йодметилатам производных алкалоидов.

3. Установлена более низкая термостабильность АХЭ нервной системы хлопковой совки по сравнению с АХЭ эритроцитов человека.

4. Своеобразие каталитических свойств АХЭ гусениц хлопковой совки и ее отличие от АХЭ эритроцитов человека и БуХЭ лошади, а также от холинэстераз других насекомых подтвердил проведенный кластерный анализ констант обратимого ингибирования.

5. БуХЭ совки по субстратно-ингибиторным характеристикам резко отличается от БуХЭ млекопитающих и занимает промежуточное положение между "типичными" холинэстеразами и карбокси-лэстеразами.

6. Наиболее эффективным избирательным действием среди многочисленных вновь синтезированных ФОС против АХЭ хлопковой совки Heliothis armigera Hbn являются производные диэтилтио-фосфорной кислоты с тиорадикалами, не имеющими разветвления вблизи атома фосфора.

Перечень работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Чарыева Н.Б. Оценка субстратной специфичности холинэстеразы из нервной цепочки хлопковой совки Дезисы научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава ТГМИ, 1990. - С. 326-327.

2. Чарыева О.Б., Криворотова Л.С., Кулиева A.M., Кешикова Э.Д. Чувствительность холинэстераз человека и хлопковой совки к фосфорорганическим и карбаматным ингибиторам /Тезисы 51-й научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава ТГМИ, посвященной 60-летию института, 1991. - С. 10-11.

3. Чарыева О.Б., Кулиева A.M., Моралев С.Н., Розенгарт В.И. Холи-нэстеразы хлопковой совки Heliothis armigera Hbn /Из-вестия АН ТССР, сер. биол. наук. 1991. - №3 - С. 78-80.

4. Чарыева О.Б., Кулиева A.M., Моралев С.Н. Изучение чувствительности ацетилхолинэстеразы нервных цепочек и карбоксилэстера-зы кишечника гусениц хлопковой совки к диалкокситиоалкинил-фосфатам Дезисы докладов V конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, 1991, Ташкент. - С. 120.

5. Чарыева О.Б., Кулиева A.M., Моралев С.Н., Розенгарт В.И. Влияние температуры на взаимодействие ацетилхолинэстеразы нервной цепочки гусениц хлопковой совки с субстратом и необратимыми ингибиторами /Известия АН ТССР, сер. биол. наук. 1992. - С. 72-76.

6. Чарыева О.Б., Кулиева A.M. Исследование действия 0,0-диал-кил-Б-пропаргилтиофосфатов на холинэстеразы хлопковой совки и млекопитающих /Материалы 53-й научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава ТГМИ, 1993. -С. 279-280.

7. Кулиева A.M., Доренская Г.М., Чарыева О.Б., Розенгарт В.И., Кугушева Л.И., Моралев С.Н. и др. Чувствительность холинэстераз и карбоксилэстеразы хлопковой совки Heliothis armigera Hbn к О.О-диалкил-Б-пропаргилтиофосфатам /Химия природных соединений. Ташкент, 1994. - №1. - С. 125-129.

8. Чарыева О.Б., Кулиева A.M., Моралев С.Н. Чувствительность ацетилхолинэстерах хлопковой совки и человека к обратимым ингибиторам Дезисы научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава ТГМИ, 1994. - С. 184.

§. Кулиева A.M., Мухамова Г.Т., Чарыева О.Б. Сравнительное исследование влияния О.О-диалкил-Б-пропаргилтиофосфатов на активность эстераз млекопитающих и хлопковой совки Друды института химии АН Туркменистана. Выпуск 3, 1994. - С. 261-264.

Summary

The presence of two cholinester-splitting enzymes in cotton-worm larvae homogenates was shown and catalytic properties were separately investigated. The first enzyme, acetylcholinesterase (AChE) is similar to human erythrocyte AChE in substrate specificity differs from the latter and other insect AChE's in sensitivity to several reversible and irreversible inhibitors& The second enzyme hydrolyzes butyrylthiocholine with higher rate" but differs from typical horse serum BuChE in abnormal high values of Michaelis constants, lower sensitivities to cation-containing irreversible innibitors and higher sensitivity to carboxylesterase-specific inhibitors. The peculiarities of the catalytic properties cotton worm enzymes and their differences from other Cholinesterase are confirmed by cluster analysis of reversible inhibition constants. The data obtained can be used in the search for selective insecticides.

Мазмуны

Пагта совкасы гурчугунын, гомогенатында холин эфирлерини гидролизлешдирйэн ики саны ферментин бардыгы субут эдилди ве айратынлыкда оларык каталитики хэсиетлери евренилди. Биринди ферментин, ягны ацетилхолинэстеразанын,, субстрат махсуслыгы боюнча адам ганыныц эритроцитлеринин ацетилхолинэстеразасы билен мензешлиги, эмма ондан ве бейлики мер-ме>кеклерин аце-тилхолинэстеразасындан дурли хили еврулишикли ве еврулишиксиз хэсиети болан ингибиторлара герэ дуйгурлыгы боюнча тапавутла-нянлыгы субут эдилди. Икинди фермент болан бутирилхолинэстера-занын, болса улы тизлик билен бутирилтиохолини гидролизлешдирй-энлиги, эмма онун атын ганынын, сывороткасындакы бутирилхоли-нэстеразадан Михаэлсин константасынын бахасынын, аномал ёкары-дыгы, катион саклайж;ы еврулишикли хэсиети болмадык ингибиторлара герэ пес дуйгурлыгы, карбоксилэстераза учин хэсиетли болан ингибиторлара герэ-де дуйгурлыгынын ёкарыдыгы билен тапавутла-нянлыгы геркезилди. Пагта совкасынык ферментлеринин каталитики хэсиетлериниц айратынлыклары ве бейлеки холинэстеразапардан тапавутлыклары оларьщ еврулишикли хэсиети болан ингибиторлар билен тэсир эдишмеклигинин константасы кластер анализи аркалы тассыкланылды. Ишин нетидесинде алнан маглуматлар селдериди инсектицидлерик гезлегинде пейдаланылып билинер.