Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование свойств карбоксилэстеразы тканей гусеницы хлопковой совки Heliothis armigera Hbn. и белой мыши

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование свойств карбоксилэстеразы тканей гусеницы хлопковой совки Heliothis armigera Hbn. и белой мыши"

РГ8

• н — -------------------------------------------------------------- --------------------

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ТУРКМЕНИСТАНА ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

удк 577.153.4

МУХАМОВА Гульбагт Тувакмамедовна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ ТКАНЕЙ ГУСЕНИЦЫ ХЛОПКОВОЙ СОВКИ Heliothis armígera Hbn. И БЕЛОЙ МЫШИ

03.00.04 — Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ашгабат - 1Ш

Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Туркменского государственного медицинского института.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Кулиева А. М. /научный консультант: доктор медицинских наук, профессор | В. И. Розенгарт

Официальные оппоненты:

академик АМ.НТ, доктор биологических наук Бабаева А. X. кандидат биологических наук Мамедов Ю. Д.

Ведущее учреждение: Отдел молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии АСХНТ им. Президента Туркменистана академика С. А. Ниязова.

Д.4А.023 при Институте физиологии МЗ и МП Туркменистана по адресу: 744012, ш. Ашгабат, ул. Островского, 30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии МЗ и МП Туркменистана.

в 4$ часов на заседании Специализированного совета

Защита диссертации состоится

1995 г.

Автореферат разослан « »

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

к

КАРАДЖАЕЁА Г. 6.

1 ___.___

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В настоящее время продолжается создание и совершенствование новых инсектицидов, которые удовлетворяли бы растущим требованиям безопасности для окружающей среды, .безвредности для организма человека -и полезных животных. Оптимальный путь поиска таких средств заключается в углубленном изучении механизмов избирательной токсичности. В связи с этим особый интерес представляет исследование ферментов, участвующих в метаболизме', инсектицидов. Одним из таких ферментов является карбоксилэстераза. (КБЭ. К.Ф. 3.1.1.1.). В организме животных КБЭ участвует в гидро-'" лизе инсектицидов, содержащих в своей структуре сложноэфирную • группу.

Известно, что избирательная токсичность пестицидов в отноие-; нии некоторых насекомых обусловленаменьшей активностью их КБЭ по ; сравнению с млекопитающими. С другой стороны, именно повышение ' активности КБЭ может быть ответственно за возникновение у вредных насекомых резистентности к пестицидам разного класса. Поэтому, ингибиторы КБЭ могут быть использованы в качестве сйнергистов пестицидов. ■ '■•■■.'

КБЭ млекопитающих достаточно широко исследовалась. У насекомых же аналогичный фермент изучен сравнительно мало и большинство работ посвящено изучению эстеразного состава в гомогенатах насекомых с применением электрофореза, а исследования по изучению субстратно-ингибиторной специфичности эстераз In vitro практичес-> ки отсутствуют. Особенно недостаточно работ, посвященных выяснению тканевой и видовой специфичности этого ферйеита. Исходя из этого, нами было проведено сравнительное биохимическое изучение каталитических свойств каре оке илэсте рабы тканей гусе нищ хлопковой совки Heliothls armlgera Hbn. и тканей белой мыши в опытах In vitro с рядами субстратов и ингибиторов с логически изменяющейся структурой.

Работа имеет кроме теоретического значения и практический интерес, так как хлопковая совка является одним из Ьпасиых вредит*-? леи сельского хозяйства в Средней Азии, в частности, в Туркменистане. Она наносит огромный вред более 250. видам плодово-овощных культур и хлопчатнику. В зависимости от зоны хлопкосеяния потери урожая колеблются от 10 до 50£ СЕей-Биенко Г.Я., 1980, Поспелов

С.М. , 1983, ToKraeB ;Ti., i 1992]. iB настоящее* время борьба с этим вредителем затруднена из-за приобретенной резистентности ко многий инсектицидам. Поэтому поиск высокоизбирательных ингибиторов карСоксилэстераз среди фосфорорганичееких соединений важен для использования их в качестве синергистов. ~ Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена сравнительному изучению взаимодействия КБЭ кишечника, жирового тела и гемолимфы гусеницы хлопковой совки Hellothis armigera Hbn. и КБЭ печени и плазмы крови белой мыши с субстратами и фосфорорганичес-•Kio.ui ингибиторами (ФОИ) разного строения в сопоставлении с лите-'ратурными данными об аналогичном ферменте других насекомых и млекопитающих.

; Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное изучение свойств КБЭ тканей гусеницы хлопковой совки и КБЭ тканей белой мыши в опытах in vitro.

Методом субстратно-ингибиторного анализа доказана гомогенность карбоксилэстеразных препаратов из кишечника, жирового тела

• и .гемолимфы гусенивд хлопковой совки, а также печени и плазмь/ крови мыши.

В то же время отмечены существенные межвидовые и межтканевые различия в субстратной и ингибиторной специфичности этого фермента. С. помощью субстратов разного строения удалось показать сходство в каталитической активности КБЭ кишечника и жирового тела гусеницы хлопковой совки и КБЭ печени мыши, с одной стороны, и КБЭ гемолимфы гусеницы.и КБЭ плазмы крови мыши, с другой.

При исследовании антиэстеразного действия двух рядов специально синтезированных фосфорорганичееких ингибиторов t'14-ти соединению была выявлена группа чрезвычайно высокоепецнфических ингибиторов для КБЭ по сравнению с ацетилхолинэстеразами (АХЭ). Было показано, что при удлинении О-алкильных радикалов ингибиторов ;

* возрастает их антикарбокоилэстеразное действие, особенно .в отно-иешш КБЭ кишечника и жирового, тела гусеницы хлопковой совки. ; БследстЕие. этого 0,0-дигексилыше производные в 5-14 раз сильнее ; ингибировали КБЭ хлопковой совки по сравнению с КБЭ мьиаи и в 10 миллионов раз по сравнению с АХЭ совки. .

При исследовании термосгабильности карбоксилэстеразы было установлено, что фермент тканей хлоиковой совки менее устойчив при повывении температуры, чем КБЭ тканей мыши.

Маучно-пр&аичеснос значение работ. Проведенные исследования

расширяют сведения о свойствах КБЭ хлопковой совки, экономмически ваглого вредителя сельского хозяйства.

Выявленные межвидовые и межтканевые особенности каталитических свойств КБЭ хлопковой совки и белой мыши являются ценными для сравнительной энзимологии насекомых и млекопитающих.

Выявленные особенности строения карбоксилэстерагы и обнаруженные избирательные ингибиторы КБЭ открывают перспективы.для изыскания новых высокоизбирательных ингибиторов карбсксшзстераз с целью применения их в качестве синергистов при борьбе с резистентностью вредных насекомых к инсектицидам.

Обнаруженные высокоспецифические ингибиторы карбоксилэстераз хлопковой совки рекомендованы для испытания их в качестве синергистов для увеличения эффективности ФОИ и преодоления резистентности хлопковой совки к инсектицидам.

Результаты исследования свойств КБЭ хлопковой совки и белой, мыши могут быть использованы в лекционном материале при характеристике ферментов метаболизма.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из "Введения", "СбсОра литературы", "Экспериментальной части", включашей разде- . лы "Материалы и методы" и "Результаты й их обсуждение" и завершаются "Заключением", "Выводами'" и "Литературой".

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 10 рисунков, 25 таблиц и библиографию из 166 работ.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на научных конференциях. Туркменского государственного медицинского института ('Ашг.абат, 1990, 1991, .1993, 1994 г.г.), на конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991 г.). ' ' . • ," . •

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных работ в виде статей и тезисов докладов,

Материалы и методы

Актами исследования были гусеницы хлопковой совки Hellte tau aimigera Hun. 5-'j возраста из лабораторной популяции, которых воспитывали на искусственной ■ среде по метолу Старца [Старц H.A.. Прант Н.Я., 19793 и половозрелые самцы нелинейных белых мышей. которых солераали в обычных условиях вивария. • ■

Б Ky-ieoTEe субстратов использовали иязс^нилэиетат iKTAi и

эфири'п-нитрофенола с логически изменяющейся структурой - ацетат 1П-ВШ, пропионат (п-КШ), бутират 1'п-НФЕ) и валерат (п-НФВ), синтезированных НПК "Синтакон", Санкт-Петербург.

•• В работе исследовалась антикарбоксилэстеразная активность стандартных фосфорорганических ингибиторов карбоксилэстераз - па-раоксона 0,О-диэтил-О-щ-нитрофеншп-фосфат) и арыина (О-этил-п-шдрофенилэтилфосфонат), а также двух специально синтезированных рядов ФСИ:

Таблица 1

1 . ■• ---1

1 Шифр • К Название 1 1

1 1 ЕД-1 1 О,0-Дизтил-З-пропаргилтиофосфат I

I ЕД-2 СзН? 0,0- дипропил- 3- пропарг шшюфосфат |

I ЕД-3 С4Н9 0, й-дибутил-3-пропаргилтиофосфат 1

1 БД-4 1-С4Н9 0,О-диигобутил-3-пропаргилтиофосфат I

1 БД-5 С5Н11 0,0-диамил-3-пропаргилтиофосфат |

1 БД-б 1-С5НЦ 0,0- диигоамил-З-пропаргилтиофосфат |

1 ЕДи7 | ' СбН1з 0,0-дигексил-3-пропаргилтиофосфат | 1

• , . Таблица 2

Г Шифр . 1 X 1 Название |

1 | М-16 С2Н5. э 0,0-диэтил-5-[(1-метил-2- |

1 ' 1 м-18 ^ этоксикарбонил)винил!тибфосфат |

Сзн? Б 0,0-дипропил-3-С(1-метил-2- |

1 * этокликарбонил) винил] тиофосфат |

| М-17 .1-Сз«7 а О.О-диизопропил-З-[(1-метил-2- |

1 этоксикарбонил.) винил] тиофосфат |

| Ы-1'3 1-С4Н9 5 0,0-диизобутил-3- [ М-метид-З-' |

1. этоксикарбоншпвинил]тиофосфат |

| и-71 • .' С4Н9 ■ Б 0,0-дибутил-5-Ш-метил-2- |

1 •' • . ' этоксикарбонил)винил]тиофосфат |

| М-74 С?Н5 • 0 ■ 0,Одиэтил-3-Ш-метил-2- (

1 • этоксикарбонил)винил]тиофосфат |

| М-75 . С3Н7 0 0,й-ДИпропил-3-[(1-метил-2- (

| | этоксикарбонил)винил]тиофосфат | I

5 _ __________________

._ 1. Соединения ацетиленового"ряда" - О, О- диалкил-3- пропаргилтио-фссфаты 1 шифр БД', общей формулы iRO>2-PiO)-CHc-CsH, синтезированных е Институте биоорганической химии им. O.A. Садыкова ан. у?-бекисгана, Ташкент »табл. ii,

2.Соединения ацетиленового ряда - 0,0-яиалкил-3-Ш-метил-2-этоксикарбошм'винилзтисфосфаты «шифр Mi, общей формулы ¡ROiV-P-- Си - х- с с сн 11 -СН-С (о) - ÖC2H5. синтезированных в Московской хишпсо-техиологическом институте им. Д.И. Менделеева, Москва »табл..2)..

О ферментативном ncpoiiüe а Iii А, н-НФП, п-И?? п-ПГВ по скорости накопления я-нитрофенола, оптическую плотность которого определяли на спектрофотометре при длине волны 412 нм. ¿Брик И.Л. и др., 19773. Скорость гидролиза PffiA определяли спектрофото-метрически по скорости образования индофенолят-иона при длине волны 625 нм [Krämer D.M. et al-., 19583.

Кинетические параметры взаимодействия карбоксилэстеразы ■ с. субстратами (Km и Vmax> определяли методом Ланнуивера-Берка [Llneweaver А:, Purk д., 19341.

Антигарбоксилэстеразную активность фг.сфорорганических ингибиторов оценивали по величине бимолекулярной константы ингибирова-ниг фермента - к и. [Годиков О.Н., Розейгарт В.й., 19643.

Конце41рацию белка определяли методом Лоури iLcwrv ö.H. »t з1., 1951]. Статистическую обработку излученных данных проводили методом 1/iVLr.epa [Müller К.Н., i960]. Для оценки статистической достоверности различий результатов использовали критерий Стьюден-та [рокшший П.Ф., 19611 для Q,G5X уровня значимости..

РЕ&ЛЬТШ U ilX ОБСУШНИЕ

Исследование парботшстеразасй аАтпввости равлячвых тканей гусепкии хлопковой совпн н белой мши. Для выяснения распределения КЕЭ-активности в организме гусеницы хлопковой совки мы определили удельну» каталитическую' активность карбокеилзстэраэ нескольких тканей I кишечника, жирового тела, гемолимфы я нервной цепочки) в отношении трех субстратов - n-IffA, п-НГБ и ИГА. В нервной цепочке КЕЭ-актиБнрсть была на пределе определения, поэтому ллл дальнейшего изучения нами выбраны первые три ткани. Для сравнения свойств КБ? тканей ссеки и млекопитающих-мы выбрали КБЭ печени и плазмы кропи белой »лети, так как в плазме крови человека КБЭ-актнвнооть опасалась очень низка, а биопсийный материал пече-

ни человека труднодоступен.

Следующим этапом нашего исследования было установление гомогенности или гетерогенности ферментных препаратов.

Одним из методических подходов, широко применяемых для выяснения этого вопроса является метод субстратно-ингибиторного ана-'лиза. В основе этого метода лежит изучение взаимодействия ферментного препарата с несколькими субстратами и несколькими необратимыми ингибиторами. Так как обычно взаимодействие фермента с необратимыми ингибиторами проводят во время преинкубации до добавления субстрата, то остаточная активность Vt и, следовательно, 'величину константы кп в случае гомогенности фермента не должна зависеть от природы субстрата. Если же наблюдаются значительные различия в величинах кц, определенных в отношении реакции превращения различных субстратов, то следует делать вывод о гетерогенности ферментного препарата.

Как видно из табл. 3, в которой приведены результаты проведенного субстратно-ингибиторного анализа, независимо от используемого субстрата' константы скорости взаимодействия параоксона и армина с ферментными препаратами каждой из тканей гусениц хлопко-

Таблица 3

"Антикарбоксилэстеразнаа активность параоксона и армина . . . (кп-Ю6, М~\мин"1 , рН 8,0, ЗСР С, п-5)

i ■ ■' . ■ ■ " - ■' |Источник фермента Г • • i ИФА Субстраты п-®А 1 1 п-Н® |

1 1 ^ ■параоксон

| Кишечник гусеницы »' 4 0+0,7 9,1+0,6 . 9,4+1,4 |

| Жировое, тело гусеницы 52 0+2,0 52,0+6,0 30,0+3,0 |

I Гемолимфа гусеницы и 2+0,02 0,15+0,01 0,42+0,04 I

(Печень мыши . 41 0+4,0 . 22,0+2,0 24,0+4,0 |

(Плазма крови мши V ,4+0,3 2,4+0,2 2,1+0,2 |

1 армин

I Кишечник гусеницы' ' ' 1 3+0, 3,7+1,3 2,9+0,5 (

|Мировое тело гусеницы ■40 .0+2,0 53,0+2,0 36,0+3,0 (

|Гемолимфа гусеницы 2 ,6+0,5 2-, 0+0,3 1,8+0,3 |

|Печень пиши 23 ,0+3,0 12,0+1,5 7,7+0,5 |

(Плазма кропи мыши | 1 ,•3+0,2 '2,3+0,1 2,1+0,2 |

ЬОЙ совки и белой мыши имеют практически одппакоше великий. Наблюдаемые небольшие различия могут быть связаны с комбинированным. и не чисто необратимым характером лейетыш ингибиторов, • таг. как обратимый компонент комбинированного нигибирогашм является конкурент»!!« и. потом'7, должен гасч^еть от нрирсзы оуоотрата. Расхождения же в величинах' кц зля различнпх т;-:аней били 10-350-кратными. Это свидетельствует о том, что в каждой из.исс-

Д,"-> ЛОР-ЯНИЦУ V .-.лгч'м тт г- ,— ¿г"

Б связи с тем, что препараты ферментов в пределах каждой от- " дельно взятой ткани оказались гомогенными, то мы имели возможность исследовать кинетику взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами,: т.е. определять Кщ, Утах и кц.

Влияние рII иа карбопсилзстераэпую активпость. Б нашей работе КБЭ-активность кишечника гусеницы хлопковой совки и печени мыши определялась в диапазоне рН 5,5-8,7 в 0,067 М фосфатном'буфере при ,'0°:; с- п-Н-ГА, и-НТ'Е и ИМ. Более высокие лначения рН нпми не были' ИСПО.чкЗОБ'ЧПН кг-за ВЫСОКОЙ СКОрооТИ СПОКТаНЯ'Ч'О гилр*>лиза пр'Лмеченига субстратов.

по рис. 1 видно, что скорость пиролиза всех субстратов возрастала при увеличении рН о? 5',5 до 6,0. а затем снижалась.

Таким образом. рН-оптимум во всех случаях был равен а,О.

Гсряостабнльпост/) парбопсилостерав. Нами продлено сраЬни-тельное исследование териостабильности КЕЭ из ткэкей гусеницы хлопковой совки.и белой мыши при инкубации в течение 1, 10, 30 и 50 мин яри'температур? ;?0, 10. -15 ;т 50 °С.

Анализ результатов показал, что карбсксшрстер^а из тканей насекомого обладала сравнительно низкой термостабильностью (табл. 4). Из таблицу видно, что фермент жирбвого тела гусеницы хлопковой совки был более термостабиден, чем КБЗ кишечника. Снижение КЕ:.«-опгивнпсти хироеого тела га 50 чин при 4!зп0 составило 44'.. а пси гчЛ? - за это же время Фермент кишечника инаг.тивировался

при 4Н"П на 53%, а пг>» 50°п - на РРХ,

КГ* печени и плазмы кроЕИ мыии набл. 4) обладают более высокой гермостспкоотьй. Как видно из таблицы, при температуре 30, 40 оа 60 мин КБ'.?-активность печени сохранилась , полностью. Прогревание препарата печени при 45°0 в течение 60 мин-и при 50 °С в течение. 1-10 мин прио0лило к активации КБЭ-активности. К 60-й минуте тепл^ого воздействия при 5'? 0 наблюдалось снижение «ерментатив-

ь

Рис. 1. влияние рН на КБЭ-актиБнасть кшечкшш гусеницы хлопковой совки /а/ и печени мши /б/ /концентрация субстратов - 5 -10"^ М/

У

нон активности печени на 36?.. Возможно, пол воздействием темпера-------------------

туры разрушается какой-то фактор белковой природы, отрицательно влияющий на ферментативную активность.

Е отличие от фермента печени КБЭ плазмы крови мыши не снижала свою активность датсе при прогревании при бсГс в течение 60 мин.

Сопоставление результатов, • полученных при «зрении термостабильности КБЭ хлопковой совки и мыши, приводит к выводу о том,

Таблица 4

Остаточная КБЭ-активность тканей гусеницы хлопковой и

миги ;з ~ от контроля") в зависимости от времени теплового воздействия (рН 7,0, субстрат п-НФА в концентрации МО"3 М, фер-' ментативная активность выражена в нмоль/мг ткани мин.д-9%, п-4-6")

1 1 Ткань 1 . . ( Время теплового воздействия, мин 1

1 1 1 1 10 •30 ■ 60 ■ ■ 1

1 Ггашйчник 30 100 . 93 87 75 |

I гусениц 40 уз • 78 60 . 43 !

1 45 90 • 57 47 35 |

1 1 50 '65 О О 18 ] {

1 |жировое тело СО 100 103 90 83 ' |

|гусениц 40 100 30 77 80 |

! 45 97 77 66 33 |

1 50 90 70 43 23 |

1 |печень мыши 30 100 • шо 96 . 97 |

1 1 40 103 .1*00 97 97 )

1 45 132 118 131 131 ' I

1 1 50 147 121 100 62 |

¡пл^еыа мшил 30 100 100 100 108 |

1 40 . 108 123 100 100 |

{ 45 100 100 100 100 |

1 \ ......... 50 100 100 108 115 1 ' <

Остаточную КБ;.'-активность после теплового воздействия определяли при ,ЮГ,0.

что КБЭ млекопитающего обладает большей устойчивостью к повышению температуры, чем фермент насекомого. Это различие в термостабильности, вероятно, связано с тем, что температура тела млекопитающих выше по сравнению с температурой насекомых.

Влияние теиператури на К,,, „ Уп,ах. Нами определено влияние температуры на Кт и У^ах для КБЭ кишечника и жирового тела гусеницы хлопковой совки и печени мыши (табл. 5). Из таблицы видно, что при увеличении температуры от 30 до 50°С величина Кщ для всех исследованных тканей не изменялась. Величина Кщ п-НФА для КБЭ кишечника -и жирового тела гусеницы Сила равна 3,0-10~4М, а для фермента печени мыши - 2,2»10~4 М.

Таблица 5

; Влияние температуры на кинетические параметры гидролиза п-НФА карбоксилзстеразами кишечника и жирового тела гусеницы хлопковой совки и печени мыши Гл-5)

1 ' (Источник 10 м, Утах. нмоль/мин мг белка(

|фермента 1 30° 40° 45° 50° 30° 40° 45° 50° |

1 |Кишечник совки . 3,1 2,9 3,1 3,3 598 870 1141 978 (

(Жировое тело соври 3,1 2,6 2,5 2,9 117 188 200 175 |

|Печень мыши • | 2,2 2,2 2,0 2,3 227 399 522 614 (

Максимальная скорость увеличивалась при повышении температуры от 30 до 45° С для КБЭ кишечника (598-1141 нмоль/мин мг белка) и жирового тбла (117-200 нмоль/мин мг белка) и понижалась при 50° С (978 и 175 нмоль/мин мг б&лка соответственно). Для фермента печени мыши снижения Ущах не. было.

Различная зависимость величин К,и и Ущак от температуры обусловлено тем, что. в состав этих констант входят различные индивидуальные константы. По-видимому, повышение температуры ускоряет I одни и замедляет другие, стадии ферментативного гидролиза, что | приводит к различиям во влиянии температуры на Кщ и Ушах-

Кииетичссшю параметры Кт и Ктах для карбо/ссилэстераз тканей гусеницы хлопковой совки. . Как видно из' табл. 6., величины Кт и Уп»ах для исследованных субстратов • могут сильно отличаться в зависимости о г источника фермента. Величины гидролиза п-НФА и ИФА для КЬН всех исследованных тканей совки близки друг другу. Для гидро-

лиза п-НФЕ обращает на себя внимание резкое отличие величина К. для гемолимфы.

Иг таблицы еидно, что КБЭ кишечника с наибольшей скоро,-tüv гндролизует п-НФБ (1,5 мкмоль/мг белка-мин), а скорость гидролиз.. п-НФА п Ид в 3,75 и 5 раза ниже (0,4 и 0,3 мкмоль/мг белка.мин соответственно |. Vinax гидролиза этих субстратов КБЭ жирового '¡ели отличалась незначительно. Худшим субстратом для аналогичного ментэ гемо.ш»!>«{« оказался п-НФБ, его Vmax била в 2.5 раза шоке, чем для п-Ш>А и ИФА.

Сродство фермента к субстрату более наглядно характеризует отношение Vnv3X/Km СБресткин А.П., 19663. Как видно из тапл. 6, КБЭ кишечника проявила значительно большее сродство к п-ШГ., чем к двум другим субстратам. Сродство карбоксилзстерагы жирового тела к п-НФА оказалось выше в 3 раза, чем к п-НФЕ и в 6. раз вше, чем к ИФА. Для КБЭ гемолимфы отношение Yn^/Km" практически де зависело от природы субстратов. ,

Таглм образом, препараты различных тканей гу..-\'ш:цы хл coeku имеют разную субстрзтную специфичность.

Кииьгичеснне иараие-гри К0! и yIlM> для капбокснлзеа е¡vs i ткаиек белен ишии. Е табл. 7 приведены значения К,;, и Vnii.:.: дл,; Fi'.« ж-ч*ыг и плазмы крови мыши в опытах с ИФА и рядом субатр jtji. эФщ-и п-нитрофенола общего строения - R-OCeHfHO;;, где к был равен: -CfOiCHj (П-НФА),'-СШ1С2Н5 (П-Ш11, -CiülCaH? (R-H-lEi, - чЧОм-'^Н* (п-НФВ).

Как видно из таблицы, для КБЭ печени величина Кт уменьшалась при переходе от п-НФА к п-КФВ fl,Б-Ю-4- М, 1,4«10""* }.!, !,?-10"4 М и 0,4* 10 Mi. Km ИФА била выше (3, б • Ю-4 Ш, чем для друг кг. суб стратов. При удлинении ацильной части субстратов величина Km я л» КБЭ плазмы крови мыши уменьшалась от п-НФА до п-НФБ (16,0-Ю"^ Ы. 9,5'Ю-'*Li, 2,3*lö~%t. Кщ ИФА, аналога п-НФА с одинаковой кислотной частью, оказалась в 2,5 раза ниже, йз таблицы видно, что всех субстратов величина К» для КБЗ плазмы крови выше, чем для ККЭ печени. Так, Кп, для п-ЖА отличается г? lö раз.

Удлинение радикала субстратов влияло на Vniax для 'фермента обеих тканей мыши. КБЭ печени с наибольшей скорость» гидродизова-ла п-НФВ (7,9 мкмоль/'мг белка-мин), а с наименьшей - п-ИФА (1,1 мкмоль/мг белка*мин). ИФА г ил ревизовался этим ферментом в 2 раза медленнее, чем ИФА. Для КБЭ плазмы крови мыши наблюдалась другая зависимость: самая высокая Vrax проявлялась с п-НФА. Удлинение

Таблица б

Кинетические параметры гидролиза ■ разных субстратов карбоксилэстеразой тканей гусеницы хлопковой совки (рН 8,0: 30°С; п=4-6).

: '.)■'. СТраТ К а ю-4, н икмоль/мг белка.мин. .Ю"3. -1 -1 мг «мин

ки'вечник яировсГе. гемолимфа кишечник жировое • гемолимфа кишечник нировое гемолимфа

тело тело тело

П-Н-ЭЙ г. 5 4 0,2 2.810,06 1.4*0,2 0,4110.1 0.11*0,03 0,6510.11 . .1.64 3.93 4,64

я-НОБ 1.810,1 1,110,05 ?.е*1,о 1.50*0.05 0.14*0,03 0,3410,04 8.33 1.27 4,47

ИГй 1.9*0.1 1.210.1 1.4*0.1 0,34*0.03 0,08*0,005 0.71*0.08 ' 1.79 0,66 5,07

Таблица 7

Кинетические параметры гидролиза разных субстратов карбоксилэстеразой тканер белой киви, (рН 8.0: 30°С: п=5-6).

Субстрат К • 1 а -4,И и . нкмоль/мг белка-мин и /К оах а . мМ ■

печень плазма печень плазма печень плазма

п-НФй 1.6*0,1 16,0*3.0= 1,110,2 0,7*0.1 6.3 0.44

п-НФП 1.4*0,1 9.510,8 1,4*0.1 0,5*0,1 10,0 0.54

п-НФБ 1,2*0,1 2,810.5 3,310.5 0.4Ю.01 27,5 1.43

п-НФБ : 0,4*0,1 7.8*0.2 7,9*0,5 0.2Ю,05 /197,5 0,26

ИФЙ 3.6*0,2 6,2*1,0 0,6*0,1 0.3*0,04 1,66 0,48

раликала субстратов приводило к снижению V^, которая наименьшую Г 'личшг/ имела в опытах с п-НФВ.

Для характеристики сродства фермента к субстрату для тканей м гаи мы также воспользовались отношением Ymax/Km- По этой величине самое высокое сродство.КБЭ печени мыши проявила к п-НФВ (197,5-10"3 ыг-Ч-ышН ), самое низкое - к ИМ ti,7-10-3 мг~1.мин~1).

Для фермента плазмы крови наибольшее сродство было обнаружено : п-HíE (Vnax/bVn - 1,4-10~3 мг~1-м1ш-1), а для остальных субстратов величина этого отношения отличалась друг от друга незначительно ¡0,3 *10""3 - О.б'Ю-З мг-1 .мин~1"1.

Таким образом, КБЭ тканей мыши обладают разной субстратной специфичностью.

В табл. 8 приведены относительные величины скорости гидролиза исследованных субстратов ®БЭ тканей гусеницы хлопковой совки и белой мыши. Величина V^x для гидролиза п-ЮА была принята нами óa 100.

Таблица 8

Отношение максимальных скоростей гидролиза субстратов карбоксилзстеразамя разного происхождения (га 100 принята скорость гидролиза п-НФА)

i----:-:-1

|Источник фермента

Субстраты п-Ш п-НФП п-Ш-Б п-Н'Х'В

ИФА

(кишечник гусеницы Iжировое тело гусеницы-Iгемолимфа гусеница. | печень каши I плазма крови мыши

100 : - : 366 - 33

100 : : 127 - 73

100 : - : 52 - 109-

100 : 127 : 300 7ie 55

100 : . 71 : 57 29 43

Эта таблица очень, наглядно показывает межвидовые и межтканевые различия в субстратной специфичности КБЭ различных тканей гусеницы хлопковой совки и мыши.

Отмечается сходство в субстратной специфичности между КБЭ гемолимфы гусенццы совки и КБЭ плазмы крови мыши, с одной стороны, и между КБЭ кишечника насекомого и печени мн;ии, с другой, что позволяет сделать предположение о том. что Ферменты тканей., ьы-П0ЛШМ8ИЯ охознч" ичункшш. обладают и сходной субстратной сп-:ии-

Фичноетью---------- ----------------------------------------- •

Взаимодействие карбокснлэсгсраз с фосфороргаиипесшти ингидн-торачн. Для дальнейшего изучения свойств - КЬ& различных тканей совкн и мыши были исследованы их взаимодействия с КИ. Бее исследованные нами ФОИ для КБ'З тканей гусеницы хлопковой совки и белой мыши оказались ингибиторами необратимого типа действия. Аитифер ментную активность изученных ингибиторов выралали в виде бимолекулярной константы скорости взаимодействия ингибитора с данным ферментом tkn. М-1-мин-1).

Лглодорбишилзст-срааная активность плрлоксона u аршш<1. ¿id общеизвестных ФОИ карбоксилэстераз. мы использовали параокеон и армии. Из табл. 3 видно, что оба ингибитора обладают высокой ан-тиэстерагной активностью. Из всех исследованных тканей гусеницы хлопковой совки КЕЗ жирового тела оказалась наиболее чувствительной к армину и параоксону. В опытах с этим ферментом, в зависимости от используемого субстрата, значения кц для параоксонд били в 3-13 раз выше, чем в опытах с ферментом'кишечника н ь 70-260 paz вы»?, чем в опытах о -ьерыентом г«молимой. 'Значения м: ал л аршта были ь 5-30 pas выше в опытах с КЕЗ жирового тела. ч>.-м к опытах с ферментом кишечника и в 8-40 pas выше, чем в omtrax с КБЭ гемолимфы.

Из тканей мыши фермент печени оказался более чувствительным к обоим ингибиторам, чем КБЭ плазмы крови. Б зависимости от применяемого субстрата чувствительность КЬ'З печени к параоксону в 10-17 pas, а к армину - в 4-2Q раз выше, чем КБЭ плазмы кроьи.

Taiaai образом, при исследовании антикарбоксилзстеразной активности параоксона и армина; отчетливо проявилось как ъидовсе, так и тканевое различие в свойствах карбоксилэстераз из разных источников.

Антняарбонсилэстсризная активность О, О-диалкил-S-лронлргилтн-офосфатов. Антикарбоксилэстеразную активность ФОИ этого ряда (табл. у и 10» определяли по отношению к КБЗ тканей гусеницы хлопковой совки и белой мыши. Эти исследования проводились с использованием разных субстратов и полученные данные подтверждают сделанный нами еывол о гомогенности ферментного препарата иг этих тканей. Для сравнения в этих же таблицах приведены данные оо- ан-тихолинэстеразной активности ингибиторов этого ряда по отношению к АХЗ нервной цепочки гусеницы хлопковой совки ('полученные О.ЕЛзриевой в нашей лаборатории! и АХЭ мозга мыши. Все исследо-

Таблица 9

Антиэстеразная активность соединений общей формулы IРЮ)гР(0)БСНгСгСН для ферментов тканей гусеницы хлопковой совки (кп, М"1-мин~1, рН 8,0, 30°С, п-5-8)

1 ...... ! Шифр км 1 R п-НФА П-НФБ ИФА ... ( ATX I

I ! КБЭ кишечника АХЭ нервной |

1 цепочки I

¡БЦ-1 , с£н5 9,6-104 8,6-104 4,0 104 4,9«102 |

IЕП-2 С3Н7 5,9.;105 4,4-Ю5 1,4 105 1,1-Ю3 |

1ЕД-3 О4Н0 3,1-107 2,8-107 1.1 Ю7 3,i-101 |

1БД-5 С5Н11 6,8-Ю7 7,1 «107 5,9 Ю7 1,2-102 |

1ЕЯ-7 СбН1Э здчо8 . 1,5'ICP 1,1 108 2.5-101 |

! БД- 4 i-C4Hg 2,6-106 2,3-Ю6 1,3 106 3,4-Ю1 |

1БД-6 i-CgHii 3,8-Ю7 3,0-107 1,4 107 1,7-103 |

1 КБЭ жирового тела

1 БД-1 С2Н5 2,2-Ю5 2,2-105 1,6 101-

1 БД-2 С3Н7 9.4-105 6.9-105 1,0 10

1БД-3 С4Н9 5,4'107 3,7 «10 7 4,6 ю7

1БД-5 C5Hxi 8.5Ч07 5,2-107 6,8 ю7

1БД-7 CeHi3 2,9'10а 1.9-108 2,2 108

1ЕД-4 i-C4Hg 4.5-106 3,4'10б 4,6 10

S БД-б | I-C5H11 4,0'107 4,3•107 3,1 107 |

ванные соединения оказались высокоизбирательными ингибиторами КБЭ по сравнению с АХЭ. Особенно сильное различие в антизстеразной активности наблюдалось для ферментов .гусеницы хлопковой совки. Так, соединение с этилъкым радикалом угнетало активность КБЭ кишечника гусеницы в 200 раз, а КБЭ жирового тела в 450 раз. сильнее, чем АХЭ нервной цепочки, а ингибитор с гексильным радикалом оказался для КБЭ сильнее.на 7 порядков. Соединение с этильным радикалом угнетало активность АХЭ мозга мыши в 80 и 13 раз слабее, чем КБЭ-активность печени и плазмы крови мыши соответственно, а ингибитор с' гексильным радикалом оказался слабее на три порядка.

Соединения с изоалкильнымй радикалами показали практически ео Есех случаях меньшую антикарбоксилэстеразную активность, чем соединения е аналогичными нормальными радикалами. . . '

Таблица 10

Антиэстеразиая активность соединений общей формулы

(Кл^Рш^'НгСэНН для ферментов тканей белой мши <кц, М~1'МИН~1 , рН 8,0, 30°С, п-5-8)

1 | Шифр 2011 1 К п-НФА п-НФБ ИФА АТХ

1 Г КЕЭ печени АХЗ ыОиГа

(БД-1 О2Н5 2,0-105 г 7,0- 10'1

1БД-2 С3Н7 1.2.106 2,1'Ю 1,0-106 2,0-104

1БД-3 С4Н9 2,1-Ю7 1,3-107 2,3-Ю7 1,4-Ю^

1БД-5 С5Нц 5,5-Ю7 1.1*10® 8,2-Ю7 1,6-10^

1БЛ-7 СбН13 4,0-Ю7 . 2,9-Ю7 8,0 «Ю3

1БД-4 1-С4Нд 2,1 -106 3,8«10б 2,1•106 и 3,7-10*

1БД-6 1-С5Н11 2.3-107 2,9-Ю7 1,0-Ш6

1 КЕЭ плазмы крови "

1ЕД-1 с£н5 1,0-Ш6 - 1,6 -\Ф

1БД-2 О'зН? 1,2-10б 1,4-106 -

1 ЕЛ- 3 С4Нд 3,3 - Ю6 3,6- юб 3,4 '10ь

1ЕД-5 с5н11 9,0 • Юб 1 Л-10 7 1,0' 1С7

1 БД-7 С'бН1з 2,2-107 - 2,4-107

1 БД- 4 ЬС^Нд 2,7. Ю6 2,1•10 6 ■?,5 • 106

1 БД-6 ЬСбНц 2,0-107 - 1,8' 1С7

Из таблиц видно, что при удлинении алкильиого радикала увеличивалась антикарбоксилэстеразная активность ингибиторов во вое случаях до амильного и только соединение с гексильным радикалом обладало большей антикарбокеилэстеразной активность» для фермента тканей гусеницы хлопковой совки, чем для КБЭ тканей мыши, что говорит о более выраженной сорбции н-гексильных радикалоь на активной поверхности КБЭ совки. Факт усиления антикарбокеилэстеразной активности при увеличении длины 'углеводородного радикала в Фссйю-рильной части молекулы ингибитора хорошо согласуется с литературными данными о наличии в районе эстеразного участка активной поверхности КБЭ гидрофобных областей, с которыми углеводородные радикалы ингибиторов могут вступать в гидрофобное взаимодействие,

Антихарбоксилэсгеразпая активность 0,0-диалхил-3-Г(1-метил-2~ отоксикар6онил)яитМтиофосфатов (яшшлфосфаты). Все исследован-

нвю ЗОИ этого ряда обладали высокой антикарбоксилэстеразной активностью (табл. 11). Удлинение н-алкильного радикала от этильно-го до бутидьного сопровождалось усилением ингибирования фермента. Величина кц повышалась в 13 раз для КБЭ кишечника, в 9 раз - для КЕЯ жирового тела гусеницы хлопковой совки, в 2 раза - для КБЭ печени и в 20 раз - для КБЭ плазмы крови мыши.

Увеличение антиферментной активности отмечалось и при удлинении изоалкильных радикалов от 1-СзН? до 1-С4Н9 во всех случаях.

Таблица 11

Антикарбоксилэстеразная активность соединений общей формулы !ПО')2Р(0)-Х-С(СНз)-СНС(О)0С2Н5 для карбоксилэстераз тканей гусеницы хлопковой совки и белой мыши (кц, М-1'мин-1, рН 8,0, 30° С,

п-5-8)

1 1 Шифр X кишечник жировое тело 1 печень плазма крови I

|ФШ ' 1 гусеницы гусеницы мыши мыши |

I 1М-16 С2Н5 5 8,1 106 1,8 107 •1,9 107 4.2 10б I

[ М-18 СэН? Б 4,4 107 5,5 107 6,2 Ю7 2,8 107 I

1М-71 С4Н9 Б 1.1 108 1,6 108 4,0 107 8,2 107 I

1Ы-17 1-СЗН7 Б 1,5 107 2,1 107 1,2 107 2,8 10б I

1М-19 1-С4Н9 3 1,1 108 1,8 108 3,0 10? 1,4 108 I

1И-74 С2Н5 0 8.9 10б 1,2 107 3.1 106 8,0 106 I

1М-75 1 СэН? 0 3,3 107 3,0 107 6.1 106 2,7 Ю7 1 )

Замена в отщепляемой части молекулы ингибитора тиоловой серы , на кислород вызывало разные эффекты для карбоксилэстераз. Так. : для КБЭ кишечника и жирового тела гусеницы хлопковой совки различия в антиферментном действии не было обнаружено для соединений с этильным радикалом, а для соединений с пропильным радикалом кислородный аналог был в 3-5 раз слабее. Более слабая Гв 6-10 раз' антиферментная активность кислородных аналогов отмечалась и для КБЭ печени мыши. •

Общая закономерность, вытекающая из изложенных данных для фосфорорганических ингибиторов изученных рядов, сводится к тому, что при удлинении алкильных радикалов фосфорильнои части молекулы ТоИ антикарбоксилэстеразная активность по отношению к исследованным карбоксилэстеразам, как правило, увеличивается. Избпратель-ноотв анти:-сте| а-ного действия проявляется наиболее значительно у

______________________________________________________ _______________________________________________

более гидрофобных соединений.

Таким образом, на основании вышеизложенных результатов пп исследованию кинетических параметров взаимодействия КБ'.» с су..-тратами и ингибиторами, выявлены отчетливые межвидовые и ыеллки í невые различия в каталитических свойствах карбоксилзетераз.

Обнаружены высокоспецифические ингибиторы юфСоксшистср-иы. Эти ингибиторы рекомендованы для испытания их в качестве синер-гистов для преодоления резистентности хлспковсй совка к иопильоу-емым пестицидам.

виводи

1. Карбоксилэстеразная активность обнаружена в кишечнике, жировом теле и гемолимфе гусеницы хлопкоеой совки и печени и плазме крови белой мыши и была на пределе определения в нервной цепочке гусениц хлопковой совки и плазме крови человека. Р^уль-таты субстратно-ингибиторного анализа с использгч -дшп-м нескольких субстратов и необратимых ингибиторов /К№ы?.&»уг нч г; могенность ферментного препарата в пределах каждой иоол-.д ц-ш ной ткани.

2. Выявлено, что карбоксилэстераси тканей гусеншш хлснксьои с- ¡ -ки и белой мыши имеют разную субстратную специфичность. макеи мальная скорость гидролиза субстратов возрастали I. ел-ауш»-« порядке: для фермента кишечника и жирового тела гуссшшы - ин-дофенмацетаг^а-нитрофенилацетат' п-нитрофенилбутират, для кар-боксилэстеразы гемолимфы соеки - п-ннтрофенилбутират-п-нитро-фенилацетат'индофенилацетат, для фермента печени мыши - инцо-фенилацетат- а-нлтрофенилацетат'- п-нитрофенклпропионат< п-нитро -фенилбутират<п-нитрофенилвалерат и для карбоксилзстеразы плазмы крови мыши - п-нитрофенилвалерат<индофенилацетат<п-ннтрофе-нилбутират< п-нитроф0!шлпропионат<п-китрофенилацетат.

3. Обнаружено сходство е относительных скоростях гидролиза суос-тратов, производных п-нитрофенола, между карбоксилчстерззаык кишечника гусеницы хлопковой совки и печени мыши, с одной стороны, и между ферментами гемолимфы соеки и плазмы крови мыши, с другой. Выявлены существенные различия в субстратной специфичности карбоксилэстераз печени и плазмы крови мыши.

4. При определении антиферментного действия армина и параоксона показана различная чувствительность исследованных карбоксилэс-

те раз к этим ингибиторам. Величина угнетения t'no кц) для кар-боксил.эстераз кишечника и жирового тела гусеницы и печени мыши была в 4-40 раз выше, чем для карбоксидэстеразы гемолимфы гусеницы хлопковой совки и плазмы крови мыши. При исследовании антиэстеразного действия 14-ти фосфороргани-ческих ингибиторов этиленового и ацетиленового рядов была выявлена группа высокоспецифических ингибиторов карбоксилэстераз хлопковой совки. 0,0-дигексильные производные в 5-14 раз сильнее ингибировали. карбоксилэстеразу хлопковой совки по сравнению с карбоксилэстеразой мыши и в 10 миллионов раз - по сравнению с ацетилхолинэстеразой хлопковой совки. Сравнительное исследование термостабильности карбоксилэстераз показало, что фермент хлопковой совки менее устойчив к повыше-, нию температуры, чем карбоксилэстераза белой мыши.

Значение температурного оптимума для карбоксилэстеразы хлопковой совки ниже, чем для карбоксилэстеразы белой мыши.

Список работ, ооубмковаввчх по т&*е дмссертаит

Лоренская Г.М., Кулиева A.M. Изучение влияния различных температур на активность карбоксилэстеразы хлопковой совки/'/Тезисы доклада 50-й научно-практической конференции проф.-преп. состава ТГМИ. Ашхабад, 1990. С. 313-314.

Лоренская Г.М., Кулиева А.М. Исследование каталитических свойств карбоксилэстеразы гемолимфы хлопковой совки с использованием различных субстратов/'/Тезисы доклада 51-й научно-практической конференции проф.-преп. состава ТГМИ. Ашхабад, 1991. С. 21-22.

Лоренская Г.М., Кулиева A.M., КугушеваЛ.И. Сравнительное изучение влияния температуры на активность карбоксилэстеразы кишечника гусениц хлопковой совки и печени мыши/'/Тезисы доклада У-й конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана. Ташкент. 1991. С. 39. 1

Лоренская Г.М., Кулиева A.M., Кугушева Л. И.. Розенгарт Е.И. Влияние температуры на активность карбокснлэетераги кишечника гусениц хлопковой совки и печени мыши/ 'ИзЕеетия АН Туркменистана. 1992. N 1. С. 60-63. .

Лоренская Г.М.. Кулиева A.M. Чувствительность кагбоксилэстера-а) хлопковой -удаги и белой мыши-к 0.0-аисик;и:г-пропчргилтио-

1

4

фосфатам//Тезиен доклада 53-й научно-практической конференции проф.-преп. состава ТГШ. Ашхабад, 1993. О. 265-266. - "

6. Кулиева A.M., Далимов Д.II., Дсренская Г.М., Чарыева О.Б.,'Ро-" генгарт B.I1. и др. Чувстеительность хсшщэстераэ и карбоксил-эстераз к О.С-диалкм-з-пропарпмтиофосфатак/Глимия природных соединений. 1994. Ml. С. 12о-130.

7. Мухамова Г. Т., Кулиева A.U., Кугупева Л.И. Исследование блвд-uua офпроь ¿инилфоофошой кисдотн «а активность квобокскоэст?-* раьи гганей гусеницы хлопковой совки//Тезисы доклада научно- практической конференции проф.-преп. состава ТГЫИ. Аптабат,.' 1994. С. 180. . ' :

3. Кугушева Л.й., Нестеров В.П., Розенгарт В.И., Доренская Г.Ы. ,' Кулиева A.M. Сравнительное исследование карбоксилэстеразы белой ивяи и . гусеницы хлопковой совки//1урпал эволюционной биохимии и физиологии. 1994. Т. 30. N 5. С. 650-655.

9. мухзчора Г. Т., Кугушева Л.й., Кулиева Л.М. Орзвнитёлаяте течение свойств кзрбоксилзстеразы плазмы крови и печени мьеп:// Здравоохранение Туркменистана. 1925. II 5. С. )9-2Г>.

10.Кулиева A.M., Мухамова Г.Т., Чэрыева О.Е. Сравнительное исследование влияния - 0,С~диалклл-5-пр>опарпптнсФссФатсв на аоткв-ность эстораз мяекоплтаядопе и хлопковой сов"и//Научны<? труз.ч сотрудников !1нститута химии АН Туркменистана. Ашгабат, .1994. Вып. 3. С. £61-264.

Stuutiry

Comparative 'investigation of properties cf carboxylesterase from tissues of cotton worm larvae and white :r,ouoe.

Substrate-inhibitor analysis by means of Inhibitors the specific substrates and Inhibitors revealed the homogenlty of carbo-

xylesterase (CaE) preparations in various tissues of cottcn иопг; larvae (intestine, fat body and haemolirrph) arid of white mouse (liver and blood plasma1).

The intertlssue a*; veil as the interspecies difference cf cotton worm larvae CaE as well as white mouse CaE in substrate and inhibitor specificity were shown.

The group of ccttoii worm larvae specific.Inhibitors different from white mouse ones were- found which can be recommended for testing selective'synergists of pesticides.

22 1ШМУШ1

• Дурли хшш езуне шхсус болан хаеиетди субстратлары ве инги-биторлари пейдадаимак билен ерине етирилен субстрат-ингибитор ..'анализк пагта совкасы гурчугынын дурли хшш докуыаларындакы: иче-гедэки, яг у/.окмлершщэки, геыодимфадакы ве ак сычаныц докуыала-:рындакы: багырдакы ве гашч плазмасындакы карбоксилэстераза (КБЭ) пре парат ларыящ гоыогенлиги геркезилди.

Субстратларыц ве ингибиторларцц езболушлы хасиетлерине герэ .пагта со'вкасыныц ве ак сычанш; КБЗ-ьш» доку чара ве гернушара тапа-вутлылыклары геркезилди.

Сычаныц КЕЗ-сына герэ пагта совкасиныц КБЗ-ыц езболушлы хэси-етли ингибиторлар топары тапылды ве олар сайдавл$1 инсектицидлериц . синергистлери хекмунде уланмаклыга хедурленидди.

Зи;,и Л'-1 <Й4Д

Тираж Р0

Индивидуальное предприятие «ГАРЛАВАЧ»

744012 I. Ашгабат, ул. Советских пограничники), 92а,