Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность бутирилхолинэстеразы рыб как показатель загрязнения водной среды фосфорорганическими и карбаматными соединениями

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Желнин, Юрий Юрьевич, Борок

/

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ВНУТРЕННИХ ВОД ИМЕНИ И.Д.ПАПАНИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

АКТИВНОСТЬ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ РЫБ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДНОЙ СРЕДЫ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ И КАРБАМАТНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

(03.00.18 - гидробиология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЖЕЛНИН ЮРИЙ ЮРЬЕВИЧ

На правах рукописи УДК 574.64+574.632+597-11(28)

Научные руководители: профессор, д.б.н. Б.А.Флёров, ст. н. с., к. б. н. Г. М. Чуйко

Борок - 1999 г.

- 2 -ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Условные обозначения. ..,.........................................3

ВВЕДЕНИЕ....................................................... 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ХОЛИНЭСТЕРАЗ........................... 8

1.1. Типы холинэстераз, их свойства, функции, локализация и идентификация......................... 8

1.2. Холинэстеразы рыб.................................. 13

ГЛАВА 2. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА АКТИВНОСТЬ

ХОЛИНЭСТЕРАЗ РЫБ..................................... 23

2.1. Действие естественных экологических факторов и манипуляций с рыбой................................ 23

2.2. Действие неантихолинэстеразных соединений.......... 26

2. 3. Действие фосфорорганических и карбаматных

ингибиторов.(....................................... 32

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ............................... 39

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................ 42

3.3. Объекты............................................ 42

3. 2. Методы исследования................................ 45

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 4. АКТИВНОСТЬ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ

РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ РЫБ.................................. 52

ГЛАВА 5. СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ПЛОТВЫ

(Rutilus rutilus (L.))................................. 69

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ДДВФ И ПРОЗЕРИНА НА БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗУ

РЫБ В "ОПЫТАХ in vitro................................ 82

ГЛАВА 7. ДЕЙСТВИЕ ДДВФ НА БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗУ ТКАНЕЙ РЫБ

В ОПЫТАХ in vivo...............'...................... 91

ГЛАВА 8. ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ РЫБ......................... 107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................... 111

ВЫВОДЫ....................................................... 115

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.................................... 117

ЛИТЕРАТУРА................................................... 118

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ATX - ацетилтиохолин (иодид);

АХ - ацетилхолин;

АХЭ - ацетилхолинэстераза (ацетилгидролаза ацетилхолинов,

КФ 3.1.1.7); БзХ - бензоилхолин;

БуТХ - бутирилтиохолин (иодид); БуХ - бутирилхолин;

БуХЭ - бутирилхолинэстераза (ацилгидролаза ацилхолинов,

КФ 3.1.1.8); ВБ - водорастворимый белок;

ДДВФ - 0, 0-диметил-0-(2, 2-дихлорвинил)фосфат; ДТНБ - 5, 5-дитиобис-2-нитробензойная кислота; ИФА - индофенилацетат;

Карбаматы - соединения, производные карбаминовой кислоты; Km - константа Михаэлиса, М;

Kj i - бимолекулярная константа скорости ингибирования

фермента, моль"1 *л*мин~1; МеХ - ацетил-р-метилхолин;

ПАУ - полиароматические углеводороды;

Прозерин - М-(мета-диметилкарбамоилоксифенил)-триметиламмоний

метилсульфат; ПрТХ - пропионилтиохолин; ПрХ - пропионилхолин;

ТМ - тяжелые металлы;

ФОИ - фосфорорганические ингибиторы;

ФОС - фосфорорганические соединения;

ХОС - хлорорганические соединения;

ХЭ - холинэстераза;

pl50 - обратный десятичный логарифм концентрации

ингибитора, угнетающей активность фермента на 50%.

ВВЕДЕНИЕ

Сохранение качества водной среды - острая и актуальная проблема современности. Большой вклад в ее решение вносит как гидробиология в целом, так и водная токсикология в частности. В последние годы заметно усилилась прикладная направленность исследований в этих областях, связанная с разработкой и внедрением в природоохранную практику современных методов биологического контроля и нормирования качества природных и сточных вод.

Известно, что на начальных этапах воздействие пестицидов на организм животных проявляется на уровне нарушения отдельных звеньев метаболизма и, в частности, функционирования тех или иных ферментов, регулирующих протекание многочисленных реакций обмена веществ. Важной практической задачей современной гидробиологии является разработка экспрессных методов, позволяющих с высокой избирательностью и разрешающей способностью определять загрязнение водной среды различными соединениями в низких концентрациях, не вызывающих видимых симптомов отравления гидробионтов и не регистрируемых обычными химико-аналитическими методами.

Одними из наиболее широко используемых во всем мире и часто попадающими в водоемы пестицидов являются фосфорорганические соединения (ФОС). Все более широкое применение в сельском хозяйстве находят и карбаматы (Мартыненко и др., 1992). Показано, что эти соединения обладают специфическим антихолинэстеразным действием (О'Брайн, 1964; Олдридж, 1972).

Молекулярные механизмы воздействия ФОС и карбаматов на холин-эстеразы (ХЭ) изучены достаточно полно. Активность этих ферментов давно используется в качестве показателя отравления млекопитающих и человека антихолинэстеразными веществами (О'Брайн, 1964; Франке, 1973). Для оценки загрязнения воды и отравления рыб данными

токсикантами в подавляющем большинстве случаев в настоящее время используется, предложенная рядом авторов, активность ацетилхолин-эстеразы (АХЭ) их мозга (Weiss, 1965; Coppage, 1971 и др.).

Вместе с тем, в сыворотке крови некоторых представителей сем. Карповых (Cyprinidae): плотвы, синца и части особей леща наряду с АХЭ обнаружен фермент, обладающий свойствами бутирилхолинэсте-разы (БуХЭ) (Козловская, Чуйко, 1979; Чуйко и др., 1985), по чувствительности к некоторым ФОС намного превышающий АХЭ рыб (Чуйко, 1987). В связи с этим активность БуХЭ рыб была предложена для биотестирования загрязнения воды ФОС (Козловская и др., 1987а; Тон-копий и др., 1993). Однако использование активности БуХЭ рыб в качестве биотеста невозможно без знаний о распространении фермента в тканях разных видов рыб, сезонных изменениях активности и межвидовых различиях его чувствительности к различным ФОС и кар-баматам, динамике активности этого фермента в тканях рыб при действии антихолинэстеразных токсикантов in vivo и т.д. Помимо того, активность ХЗ рыб различные авторы выражают либо на мг белка, либо на г(мл) ткани, что часто не позволяет сравнить такие данные.

Изучение БуХЭ рыб представляет также и большой теоретический интерес, поскольку способствует лучшему пониманию роли ферментативных систем в адаптации животных к загрязнению среды обитания.

Целью работы явилось изучение активности БуХЭ в тканях различных видов пресноводных костистых рыб для использования ее в качестве теста на загрязнение водной среды ФОС и карбаматами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать локализацию и уровень активности БуХЭ в тканях различных видов пресноводных костистых рыб. Выявить виды с высокой активностью фермента.

2. Изучить изменения активности БуХЭ в различных органах и

тканях рыб в течение годового цикла.

i f

3. Определить чувствительность БуХЭ плазмы крови различных видов рыб к действию in vitro типичного ФОС - ДДВФ и карбамата -прозерина. Сравнить чувствительность БуХЗ плазмы крови рыб с чувствительностью их АХЭ и типичных ХЭ к этим токсикантам.

4. Изучить влияние ДДВФ на активность БуХЗ в различных тканях рыб in vivo. Сравнить динамику активности фермента при действии токсиканта с изменениями общей активности ХЭ и активности АХЭ.

5. Разработать методические рекомендации по использованию активности БуХЭ рыб для выявления загрязнения водной среды антихо-линэстеразными соединениями в природных условиях.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование распространения БуХЗ в органах и тканях пресноводных рыб. Показано, что активность фермента обнаруживается в плазме крови, печени и селезенке, причем наивысшая из них чаще всего встречается в плазме. Установлено, что активность БуХЭ в плазме крови максимальна у карповых рыб и превышает 83% от общей активности ее ХЭ.

Впервые изучена сезонная динамика активности БуХЭ в плазме крови, печени и селезенке пресноводных костистых рыб. Показано, что активность фермента закономерно изменяется в течение года: в весенне-летний период она высокая, зимой - низкая. Во время нереста происходит увеличение активности БуХЭ в тканях рыб. Динамика показателя в плазме крови'аналогична изменениям содержания в ней водорастворимого белка. Удельная активность БуХЭ в печени обратно коррелирует с массой органа.

Впервые исследована чувствительность БуХЭ крови ряда видов пресноводных костистых рыб к действию in vitro ФОС ДДВФ и карбамата прозерина. Показано, что чувствительность фермента к ДДВФ на 3-4 порядка выше, чем у АХЭ млекопитающих и рыб. По чувствитель-

ности к прозерину БуХЭ рыб уступает АХЭ в 100 раз.

Впервые изучена динамика активности БуХЭ плазмы крови и печени рыб в острых и ..хронических экспериментах с ДДВФ in vivo. Выявлено, что в первую очередь снижение активности фермента регистрируется в крови и происходит при очень низких концентрациях токсиканта за непродолжительный промежуток времени. Активность АХЭ мозга при этом практически не изменяется.

Практическое значение. В результате исследования дополнен список видов и тканей рыб, пригодных для выявления антихолинэстераз-ных соединений в воде с использованием активности БуХЭ. Полученные данные позволяют расширить область применения показателя и, наряду с биотестированием, использовать для биоиндикации загрязнения водной среды ФОС и карбаматами в естественных условиях.

'' • »

Предложены методические рекомендации по определению активности БуХЭ в плазме крови рыб методом Эллмана.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1 и 2), описания материала и методов исследования (глава 3), изложения полученных результатов и их обсуждения (главы 4-8), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, включая 24 таблицы и 24 рисунка. Библиография содержит 357 наименований, из них 139 на русском и 218 на иностранных языках.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ХОЛИНЭСТЕРАЗ.

1.1. Типы холинэстераз, их свойства, функции, локализация и идентификация.

• I

Медиаторная роль ацетилхолина (АХ) в процессе передачи нервного импульса открыта в 1921 г.(Loewi, 1921). Через 5 лет был обнаружен фермент, расщепляющий АХ на холин и уксусную кислоту (Loewi, Nawratil, 1926), названный "холинэстераза" (Stedman, Easson, 1932). Позднее исследования показали, что у млекопитающих присутствуют 2 типа холинэстераз (ХЭ), которые по свойствам и распространению в организме животных существенно отличаются друг от друга. Для их обозначения ввели термины "истинная ХЭ" и "псевдо-ХЭ". (Alles, Hawes, 1940; Mendel, Rudney, 1943; Augustinsson, 1948; 1949; August insson, Nachmanson, 1949; Голиков, Розенгарт, 1964; О'Брайн, 1964; Розенгарт 1973; 1974; Silver, 1974 и др.).

В настоящее время, согласно номенклатуре ферментов, эти две группы ферментов отнесены к классу гидролаз, подклассу эстераз, подподклассу эстераз эфиров карбоновых кислот и соответствуют двум типам: ацетилхолинэстеразе, номенклатурное название "ацетил-гидролаза ацетилхолинов", КФ 3.1.1.7, и холинэстеразе, номенклатурное название "ацилгидролаза ацилхолинов", КФ 3.1.1.8 (Номенклатура ферментов, 1979). Поскольку исторически "холинэстеразами" называют все ферменты, относящиеся к обоим типам, термин "холинэстераза" предложено использовать как групповой, а "ацетилхолин-эстераза" (АХЭ) и "бутирилхолинэстераза" (БуХЭ) - для обозначения ферментов КФ 3.1.1.7 и КФ 3.1.1.8 соответственно (Silver, 1974; Розенгарт, Шерстобитов, 1978). В дальнейшем изложении мы будем придерживаться данной рекомендации.

АХЭ и БуХЭ значительно отличаются друг от друга по многим при-

Таблица 1.

Основные свойства АХЭ и БуХЭ (Голиков, Розенгарт, 1964; О'Брайн, 1964; Silver, 1974; Розенгарт, Шерстобитов, 1978).

Критерии сравнения: АХЭ Бу X 3

Наиболее быстро гид-ролизуемый субстрат Ацетилхолин Бутирил-, бензоил- или пропионилхолин (ПрХ)

Избирательный субстрат Ацетил-р-метил-холин (МеХ) Бутирилхолин (БуХ)

Негидролизуемый субстрат Бутирил- и бензоилхолин (БзХ) Ацетил-р-метилхолин

Избыток субстрата Угнетает активность Не угнетает активность

Активность каталитического центра 7*105 - 9*105 молекул АХ/ мин 5*104 - 9*104 молекул АХ/ мин

Орган или ткань, наиболее богатая ферментом Мозг, эритроциты, симпатические ганглий Сыворотка крови, печень, слизистая оболочка кишечника

Избирательные ингибиторы Бис-четвертичные аммониевые соединения, 3116СТ, ГД-42, ВДО284С51 ФОС, особенно с изо-пропильными группами: ДФФ, изо-ОМПА, мипа-фокс; некоторые производные фенотиазина: лизиван, АСТРА1397

знакам, благодаря чему их не трудно раздельно выявлять и количественно определять. Основные свойства этих ХЭ приведены в табл.1.

Указанные свойства ХЗ изучены на примере ферментов, которые принято считать типичными. Это АХЗ .эритроцитов человека и крупного рогатого скота, мозга млекопитающих, электрического органа рыб

и БуХЗ плазмы крови человека и лошади. В большинстве случаев ХЭ другого происхождения на основании изучения их свойств могут быть отнесены к одному из этих двух типов. Каждый из типов ХЗ включает в себя множество молекулярных форм ферментов, специфичных для каждого вида животного. Вместе с тем, у некоторых животных встречаются такие формы ферментов, которые не могут быть с достаточной определенностью отнесены к АХЗ или БуХЗ. Примером могут служить ХЭ мозга и сыворотки крови птиц, плазмы черепахи, мышц камбалы (Augustinsson, 1961; Lundin, 1967; Августинссон, 1972).

Строение и функциональная роль ХЭ в настоящее время изучены достаточно подробно. Основное функциональное значение всех ферментов этой группы заключается в расщеплении молекул холиновых эфиров до физиологически неактивных: холина и карбоновых кислот.

Молекула всех типов ХЗ является простым белком, по структурным характеристикам которого выделяется два основных типа молекул: глобулярные и асимметричные (Schumacher et al., 1986; Pezzementi et al., 1988; 1989). Активный центр фермента состоит из двух функционально важных и пространственно разделенных участков: анионного и эстеразного. Анионный ориентирует молекулы субстрата относительно активного центра фермента, эстеразный осуществляет гид-

• t

ролиз эфирной связи. Помимо названных двух участков, большая роль в формировании и функционировании активного центра ХЭ принадлежит гидрофобным областям. В частности, они обеспечивают высокую анти-холинэстеразную активность гидрофобных ингибиторов ХЭ. Нередко эти области являются главным фактором, определяющим различия в свойствах ХЭ разного происхождения (Кабачник и др., 1970; Kabach-nicetal., 1970; Bracha, O'Brien, 1970). Молекулы ХЭ, относящиеся к разным типам, имеют определенные различия. Так, на каждый эстеразный участок у АХЭ имеется два анионных, а у БуХЗ - один (Bergman, Segal, 1954). АХЗ имеет три гидрофобные области в райо-

- и -

не активного центра: по одной вблизи зстеразного и анионного участков и одну, непосредственно окружающую анионный участок. У БуХЭ - четыре области: по две в районе зстеразного и анионного участков. При этом, их структура у обоих типов ХЭ существенно различается (Кабачник и др., 1970; Kabachnic et al., 1970; Bra-cha, O'Brien, 1970). Более детально представления по этому вопросу даны в ряде монографий, обзоров и статей (Augustinsson, 1948; 1963; Koelle, 1963; Голиков, Розенгарт, 1964; 0'Брайн, 1964; Ми-хельсон, Зеймаль, 1970; Silver, 1974; Розенгарт, Шерстобитов, 1978; My сил и др. i 1981; Чернышевская, 1983; Leibel, 1988а, b; Abramson et al., 1989; Nemcsok et al., 1990).

Активность ХЭ, в частности АХЭ, проявляется на ранних стадиях развития животных. Активность ферментов выявлена в различных тканях разных классов животных. Это свидетельствует о том, что ХЭ выполняют большое число функций в организме (Uesugi, Yamazoe, 1964; Чернышевская, 1983; Бузников, 1987 и др.).

Наиболее полно на современном этапе изучена физиологическая функция АХЭ нервной ткани животных. Основной функцией синаптичес-кой АХЭ является гидролиз ацетилхолина - нейромедиатора холинэр-гических синапсов (Михельсон, Зеймаль, 1970). Следовательно, АХЭ выполняет одну из ключевых функций , нормальной работы нервной системы. Это продемонстрировано в большом числе экспериментальных работ на животных различных классов, включая рыб (Koelle, 1969; Schneider, Weber, 1975; Bone, 1978; Contestabile, 1978; Desai, 1978 и др.). Показана важная роль холинэргических структур в функционировании сенсорных систем животных, в частности зрения, обоняния и осязания (Иванова, Назарова, 1971; Reutter, 1974; Contestabile, 1978; Migani et al., 1980; Contestabile et al., 1986). В работах на высших позвоночных выявлено важное значение АХЭ, как нейрохимического агента в интегративной деятельности головного

мозга в процессах'запоминания, выработке условных рефлексов и прочих видах ВНД (Алексидзе, Балавадзе, 1977; Розенгарт, 1974; Селиванова, Голиков, 1975; Barchas et al., 1978; Коштоянц и др., 1981 и др.). Имеются данные, свидетельствующие о непосредственном участии системы АХ-АХЭ в регуляции активного или пассивного переноса ионов через мембраны (плацента, эритроциты, кожа) (Bull et al., 1961; Cuthbert, Wilson, 1981), регуляции зародышевого развития (Бузников, 1967), активации кальциевых каналов в гладких м