Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительно-биохимическое исследование холинэстераз пресноводных костистых рыб бассейна Рыбинского водохранилища

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительно-биохимическое исследование холинэстераз пресноводных костистых рыб бассейна Рыбинского водохранилища"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ИМ. И.М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

СРАВНИТЕЛЬНО-БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗ ПРЕСНОВОДНЫХ КОСТИСТЫХ РЫБ БАССЕЙНА РЫБИНСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 2004

Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им.ИД.Папанина РАН, Борок

Научный консультант Доктор биологических наук,

профессор М.Н.Маслова

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор В.Б. Долго-Сабуров

Доктор медицинских наук, профессор С. С. Михайлов

Доктор биологических наук, профессор Е.В. Розенгарт

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный Университет (Кафедра биохимии), Университетская набережная, 7/8

Защита состоится _2004 г. в 11 часов на заседании

специализированного диссертационного Совета Д 002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН

(194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

Автореферат разослан " ОУСО^рЛ 200* г.

Ученый секретарь диссертационного Совету

доктор биологических наук, профессор ^ ^М.Н.Маслова

i 2004-4 26757

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение биоразнообразия и эволюции кинетических свойств ферментов и функций, выполняемых ими в организме - одна из основополагающих проблем современной биохимии и биологии в целом. Для решения этой проблемы необходимы сравнительные исследования ферментов у широкого круга живых организмов из разных филогенетических групп.

Холинэстеразы (ХЭ) - ферменты, широко распространенные в живой природе от микроорганизмов и простейших одноклеточных организмов до позвоночных, включая человека. Выделяют два основных типа ХЭ: ацетилхолинэстераза (ацетилхолин ацетилгидролаза, АХЭ; К.Ф. 3.1.1.7) и холинэстераза (ацилхолин ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.8). К последнему типу относится наиболее часто встречаемая бутирилхолинэстераза (БуХЭ). ХЭ участвуют в различных физиологических процессах, но функциональное значение установлено только для АХЭ: она играет ведущую роль в механизме трансдукции нервного импульса в холинергических синапсах животных, гидролизуя медиатор ацетилхолин (АХ). Роль БуХЭ до сих пор остается неясной. Особенностью ХЭ является их способность взаимодействовать с фосфорорганическими (ФОС) и карбаматными (КС) соединениями, что приводит к необратимому ингибированию их активности. Ингибирование АХЭ нервной системы животных блокирует проведение нервного импульса и вызывает нарушение нормального функционирования организма, приводя в конечном итоге к его гибели (О'БраЙн, 1960; Голиков, Розенгарт, 1964). Этот феномен нашел широкое применение в практическом использовании ФОС и КС в качестве пестицидов, боевых отравляющих веществ и лекарственных препаратов (Розенгарт, Шерстобитов, 1978; Chambers, Levi, 1992), а также в использовании ХЭ как биомаркеров действия этих соединений на разные виды животных (Minneau, 1991; Huggett et al., 1992). Наиболее полно к настоящему времени изучены - АХЭ эритроцитов и мозга человека и крупного рогатого скота, а также БуХЭ сыворотки - (плазмы) крови человека и лошади. Эти ферменты принято считать «типичными». ХЭ других организмов изучены недостаточно, хотя они могут заметно отличаться по свойствам от «типичных» АХЭ и БуХЭ (Бресткин и др., 1997).

Данные о ХЭ пресноводных костистых рыб носят ограниченный характер и получены в основном зарубежными исследователями на незначительном числе нехарактерных для ихтиофауны Европейской части

России видов. Детальные исследования по

пяфиищшИШ|&|среди

библиотека {

srstsf I

широкого ряда видов пресноводных костистых рыб, изучению их кинетических свойств, межвидовых различий в активности и распределению в органах до сих пор не проводились. В связи с этим до последнего времени преобладает мнение, что в организме рыб доминирует АХЭ, а БуХЭ, если и присутствует, то в очень небольших количествах (Augustinsson, 1958, 1959, 1961; Hogan, 1971; Брик, 1969; Brestkin et al., 1973; Hobden, Klaverkamp, 1977; Бресткин и др., 1997). Практически отсутствуют данные о сезонной динамике ХЭ, об их участии в таких биологически важных процессах, как питание, нерест, стресс. С момента обнаружения АХЭ в мозге рыб (Mendel, Rudney, 1943) исследования связаны, главным образом, с возможностью ее использования как биомаркера действия ФОС и КС (Weiss 1958, 1961, 1965; Coppage, Matthews, 1974; Гантверг, Перевозников, 1983; Zinkl et al., 1991). Тем не менее, до сих пор имеется мало данных о динамике восстановления активности ХЭ in vivo, особенно после хронического действия низких концентраций антихолинэстеразных соединений. Единичны исследования роли ХЭ в механизмах межвидовых различий в устойчивости рыб к ФОС.

Цель и задачи исследования: идентификация типов ХЭ у пресноводных костистых рыб, изучение их каталитических свойств, видоспецифичности органо-тканевого распределения и некоторых прикладных аспектов (роль в физиологических процессах и варьирование активности при действии биологических и антропогенных факторов окружающей среды).

Соответственно цели были определены задачи работы:

1. Охарактеризовать типы ХЭ у разных представителей пресноводных костистых рыб и сравнить их по каталитическим свойствам с типичными ХЭ млекопитающих.

2. Исследовать межвидовые и межсемейственные особенности, в органо-тканевом распределении разных типов ХЭ и в уровнях их активности у пресноводных костистых рыб.

3. Изучить изменения активности АХЭ мозга при стрессе, индуцированном адреналином.

4. Установить пределы биологической вариабельности и определить уровни нормальной активности ХЭ в разные сезоны года.

5. Оценить участие холинергической нервной системы и роль АХЭ мозга в формировании пищевого поведения рыб в норме и при хроническом отравлении ФОС.

6. Выявить роль ХЭ и, других физиолого-биохимических факторов в

межвидовых различиях устойчивости рыб к острому токсическому действию ФОС.

Научная новизна. Обобщены исследования ХЭ пресноводных костистых рыб. Впервые в плазме пресноводных костистых рыб сем. Cyprinidae обнаружена БуХЭ, описаны ее каталитические свойства и распределение в различных органах, показаны сходство и отличия от АХЭ рыб и АХЭ и БуХЭ млекопитающих. Выявлены различия между видами и семействами рыб по уровню активности БуХЭ в плазме и печени. Показано, что у леща Abramis brama в отличии от других представителей сем. Cyprinidae БуХЭ в плазме присутствует лишь у 30% особей. Впервые установлены устойчивые различия в активности АХЭ мозга не только между отдельными видами, но и среди представителей разных семейств пресноводных костистых рыб, а также выявлена корреляция между активностью АХЭ в мозге и БуХЭ в плазме. Впервые определен нормальный диапазон варьирования активности АХЭ и БуХЭ в органах широкого ряда пресноводных костистых рыб, принадлежащих к нескольким семействам. Продемонстрировано, что сезонные изменения активности АХЭ мозга рыб связаны не только с температурой окружающей среды, как у других пойкилотермных животных, но и с их биологическим репродуктивным циклом. Впервые показано участие холинергической системы и АХЭ в мозге при формировании пищевого поведения у рыб и установлен один из механизмов действия антихолинэстеразных соединений на пищевое поведение рыб при хронической интоксикации ФОС. Впервые для рыб выявлено увеличение активности АХЭ в мозге при остром стрессе. Показано, что динамика активности АХЭ в мозге рыб in vivo при хроническом действии и после его прекращения веществ различной природы неантихолинэстеразного действия имеет стрессорный характер. Проанализирована взаимосвязь уровня активности АХЭ мозга и симптомокомплекса отравления и реабилитации при остром и хроническом действии ФОС на рыб. Впервые установлено, что чувствительность АХЭ и БуХЭ рыб к действию ФОС in vitro не является фактором, определяющим межвидовые различия в токсикорезистентности рыб; разная скорость проникновения ФОС в организм и интенсивность их детоксикации играют основную роль в этом процессе.

Научно-практическая значимость работы. На основании анализа и обобщения литературных данных и результатов собственных исследований даны практические рекомендации по использованию ХЭ пресноводных

костистых рыб для оценки антропогенного загрязнения водных объектов ФОС и КС. При выполнении работы разработаны методы: энзиматического определения ФОС в воде (получено авторское свидетельство SU №1359741 от 15.08.87, ГК ИО СССР); определения эффективных концентраций в токсикологических опытах; определения ДДВФ в крови и печени рыб с использованием ГЖХ с электронно-захватным детектором (ЭЗД); метод раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ в тканях рыб с использованием селективного фосфорорганического ингибитора ДДВФ. Материалы диссертации нашли практическое применение при обучении студентов в ряде Университетов в России и за рубежом в курсах «Экологическая физиология и биохимия», «Водная токсикология» и «Water Pollution and Fish Physiology».

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В плазме (сыворотке) крови и печени пресноводных костистых рыб из сем. Cyprinidae наряду с АХЭ (КФ 3.1.1.7) присутствует БуХЭ (КФ 3.1.1.8), удельная активность которой преобладает в общей активности ХЭ и ее уровень коррелирует с уровнем активности АХЭ в мозге.

2. АХЭ и БуХЭ рыб по ряду каталитических свойств отличаются от «типичных» АХЭ и БуХЭ млекопитающих.

3. Существуют закономерные сезонные, межвидовые и межсемейственные различия в активности АХЭ и БуХЭ в тканях пресноводных костистых рыб

4. Ингибирование и восстановление активности АХЭ и БуХЭ является важным симптомом токсического действия ФОС на рыб, однако устойчивость рыб к этим токсикантам связана не только с угнетением ХЭ, но обусловлена и другими биохимическими и физиологическими факторами (поступление ФОС в организм и мощностью детоксикационных ферментных систем печени).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты и положения работы доложены на: Всесоюзной конференции по водной токсикологии (Юрмала, 1982); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы рыбохозяйственных исследований внутренних водоемов Северо-Запада Европейской части СССР» (Петрозаводск, 1984); Советско-американском симпозиуме «Проблемы водной токсикологии, биотестирования и управления качеством воды» (Борок, 1984); I Всесоюзном симпозиуме по чувствительности и устойчивости гидробионтов к токсикантам (Батуми, 1985); VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии и

биохимии рыб (Вильнюс, 1985); 9-ом совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986); USA-USSR Symposium «Fate and effects of pollutants on aquatic organisms and ecosystems» (Athens, USA, 1987); 1-ом Всесоюзном симпозиуме «Методы ихтио -токсикологических исследований» (Ленинград, 1987); Всесоюзном совещании «Поведение рыб» (Москва, 1989); VII Всесоюзной конференции «Экологическая физиология и биохимия рыб» (Ярославль, 1989); Международной конференции «Методы исследования и использования гидроэкосистем» (Рига, 1991); II Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (С.-Петербург, 1991); VIII Научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992); VIII Congress of European Ichthyology Society «Fishes and their environment» (Ovideo, Spain, 1994); Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Петрозаводск, 1995); 17 SETAC Annual Meeting (Washington, USA, 1996); 18 SETAC Annual Meeting. (San Francisco, USA, 1997); Симпозиуме по возрастной и экологической физиологии рыб (Борок, 1998); Международной молодежной школе «Биоиндикация-98» (Петрозаводск, 1998); Конференции «Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре» (Москва, 2000); Конференции «Озера холодных регионов» (Якутск, 2000); Научно-практической конференции «Проблемы биологии, химии, экологии и экологического образования» (Ярославль, 2001); Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок,

2002); III (XXVI) Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Сыктывкар,

2003).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликованы 58 печатных работ (28 статей и 30 тезисов докладов)

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация изложена на ¿ЭД^страницги машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего "f&Q отечественных и иностранных источников. Работа

иллюстрирована таблицами и ^^f у н к а м и .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Исследование проведено на 20 видах из 6 наиболее распространенных семейств пресноводных костистых рыб (Teleostei), обитающих в бассейне Рыбинского водохранилища (Табл. 1).

Таблица 1.

Классификация исследованных видов рыб

Отряд I. Salmoniformes - лососеобразные П/отр. Salmoidei - лососевидные Сем. Coregonidae - сиговые

Coregonus albula - европейская ряпушка П/отр. Esocoidei - щуковидные Сем. Esocidae - туковые

Esox lucius - обыкновенная щука Отряд И. Cyprinoformes - карпообразные Сем. Cyprinidae - карповые П/сем. Leuciscinae

Abramis ballerus - синец Abramis brama - лещ Alburaus alburnus - уклейка Aspius aspius - жерех Blicca bjoerkna - густера Leuciscus idus - язь Leuciscus leuciscus - елец Pelecus cultratus - чехонь Rutilus rutilus - плотва П/сем. Cyprininae

Carassius carassius - карась Cyprinus carpio - карп П/сем. Tincinae

Tinea tinea - линь Сем. Balitoridae - балиторовые

Barbatula barbatula - усатый голец ОТРЯД Ш. Gadiformes - трескообразные Сем. Lotldae - налимовые Lota lota - налим Отряд ГУ. Perciformes - окунеобразные Сем. Percidae - окуневые

Gyirnochephalus cernuus - обыкновенный ерш Регса fluviatilis - речной окунь Stisostedion lucioperca - обыкновенный судак Stisostedion volgense - волжский судак, берш

Рыб отлавливали круглогодично по всей акватории. Рыбинского водохранилище (58°30'С.Ш., 38°30'В.Д.) и его притоках ставными сетями, неводом, тралом или удочкой. Часть рыб выращивалась на экспериментальной прудовой базе ИБВВ РАН. Место и орудия лова, возраст и морфометрические характеристики варьировали в зависимости от вида рыбы и решаемых задач. Для работы брали визуально здоровых рыб без паразитов. После отлова их либо доставляли в лабораторию для проведения экспериментов in vivo, либо у них сразу брали кровь, мозг, печень и селезенку с целью последующей обработки в лаборатории и подготовки проб для биохимического анализа in vitro. Всего в различных экспериментах было исследовано более 5000 экземпляров.

Из крови получали сыворотку и плазму, а органы отпрепаровывали и взвешивали. Подготовленные таким, образом пробы помещали в герметично закрывающиеся пластиковые контейнеры объемом 1.5-5 мл и хранили при температуре -18-20°С до анализа. Перед анализом органы гомогенизировали и использовали суперкатант.. Ряд исследований выполнен на частично очищенных комерческих препаратах АХЭ эритроцитов человека и БуХЭ сыворотки крови лошади.

Методы исследования

1. Спектрофотометрическое определение ХЭ тиохолиновым методом Эллмана (Ellman et al., 1961), содержания белка методом Лоури (Lowry et al., 1951) или Брэдфорд (Bradford, 1976) и глюкозы стандартным о-толуидиновым методом.

2. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ (Гааль и др., 1982) с последующим выявлением ферментативной активности тиохолиновым матодом (Karnovsky, Roots, 1964).

3. Метод субстратно-ингибиторного анализа для идентификации типов эстераз и исследования их свойств (Бресткин и др., 1997).

4. Определение бимолекулярной константы скорости ингибирования к2 и обратного логарифма концентрации ингибитора, вызывающего снижение активности фермента на 50%, plso (Яковлев, 1965).

5. Раздельное определение активности АХЭ и БуХЭ с использованием селективных ингибиторов (Fairbrother et al., 1991; Чуйко и др., 2002).

6. Определение основных кинетических констант гидролиза субстратов (константы Михаэлиса К^ максимальной скорости V_, оптимальной концентрации субстрата Sopt) (Диксон, Уэбб, 1982).

7. Метод газо-хроматографического определения ДДВФ в крови и печени в собственной модификации (Чуйко, 1987).

8. Определение летальных концентраций/доз (ЛК50/ЛД50) в токсикологических экспериментах методом пробит-анализа (Беленький, 1963) и собственным методом "одной точки" (Frumin et al., 1992).

9. Проведение хронических токсикологических экспериментов в проточных условиях с использованием дилюторной установки для поддержания постоянной концентрации токсикантов в воде (Виноградов и Тагунов, 1989).

10. Изучение пищевого поведения рыб с использованием оригинальной экспериментальной установки, имитирующей природные условия добычи корма (Pavlov et al., 1994; Gerasimov, 1996).

11. Инъекции фармакологически активных веществ: ингибитора ХЭ ДДВФ и их реактиватора ТМБ-4, холинолитика атропина, а также адреналина для индукции стресс-реакции (Pavlov et al., 1992).

Результаты обрабатывались статистически на ПК с использованием пакета прикладных программ STATGRAPHICS Plus 2.1 и Excell 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование скорости гидролиза АТХ и БуТХ в тканях рыб. Результаты представлены в табл.2. Активность в отношении АТХ, гидролизуемого обоими типами ХЭ, и БуТХ, гидролизуемого только БуХЭ, различается как между видами рыб, так и между исследованными органами. Наибольшей холинэстеразной активностью обладает мозг рыб, где скорость гидролиза АТХ у некоторых видов превышает 2000 мкмоль/г ткани/ч, в то время как гидролиз БуТХ практически отсутствует, не превышая 4% от уровня гидролиза АТХ. У карповых активность АХЭ в мозге достоверно выше, чем у щуковых, окуневых и налимовых. В плазме крови холинэстеразная активность несколько ниже, чем в мозге и достигает у карповых 1000 мкмоль/мл/ч при гидролизе БуТХ. Однако у ряда карповых (карп, карась, линь, чехонь) и всех представителей других изученных видов гидролиз этого субстрата не обнаруживается. Гидролиз АТХ хотя и выявляется, но по сравнению с БуТХ он идет менее интенсивно. В печени рыб холинэстеразная активность ниже, чем в плазме и не превышает 200 мкмоль/г ткани/ч при использовании АТХ. Гидролиз АТХ и БуТХ сопоставимы, хотя последний гидролизуется медленнее. У карповых холинэстеразная активность в целом выше, чем у представителей других семейств. В селезенке холинэстеразная активность самая низкая из исследованных органов и не достигает 50 мкмоль/г ткани/ч. Тенденции холинэстеразного гидролиза в печени такие же, как и в печени.

Таблица 2

Скорость гидролиза АТХ и БуТХ (мкмоль/ч на 1г ткани или 1 мл) гомогенатами мозга, печени, селезенки и плазмы крови исследованных видов рыб (x+mx)

Семейство, мозг печень селезенка плазма

вил АТХ АТХ БуТХ АТХ БуТХ АТХ БуТХ

Cyprinidae

Лещ» 11401626'" 69±7" 56±8rjt 16±1г <1 12±1*е 611"* 30±1г 2±0.4 8713Г <1

Синец 1054157®'* 61110" 1714"'г 20±1"'г 1812® 142117® 1083185"

Плотва 2011 ±87* 117±116,",г 4417"А" 2513®'" 16±3®'"'г 21916® 1074120"

Густера 990+96®'" 93±9Г 19±2Г 28±1в 13±Г 6117* 483189е

Язь 10781130®'* 4413° 2515"'г 1511" 9+[М 3715"'г 237142®

Уклейка 115б±876'* 2411' 39±26 8±1ж 29±1* 289120" 975126*

Жерех 1238147® 19019" 70±6" 3511" 611" 1414 2617

Чехонь 877162"'г 16318"-® 9±1л 4314" 4±1ж 611" <1

Карп 651±54гд 5±1 <1 - - 611" <1

Елец 661 ±26" 711е <1

Карась 704±8Л 19±1" 121И 1Э±1Л <1 3±1ж <1

Линь 856±9Г 21±2 1512" ЮН"" ' <1 411е* <1

Ггос^ае

Щука 691138" 1.3±0.1м <1 2б±26-' <1 511" <1

Регс1<1ае

Окунь 214110' 30±3Ж'' 14±2Г-Д 5±1' <1 311" <1

Судак 414133" 4±0 5" 2±1ж 711ж-' 1±1ж 111' <1

Берш 296±19ж 810.3" 2±1ж 2311" 2±1ж ги- <1

Ерш 256±17ж>1 134110е* 42±26 9±1°'ж. <1 ги" <1

1д>М(1ае

Налим 138±15к 52±8А,е,ж 3414®-" 7±1ж 3±1ж 211*'1 <1

Примечание: использованы иодиды соответствующих тиохолиновых эфиров; значения с одинаковыми буквенными индексами внутри колонок достоверно не различаются при р=0.05. * гидролиз БуТХ в печени и плазме наблюдается у 30 % особей.

Полученные данные позволяют предположить, что у всех видов исследованных рыб в тканях присутствует АХЭ, а у многих карповых еще и БуХЭ. Особенно ее присутствие высоко в плазме крови. Раннее факт гидролиза БуТХ был отмечен лишь у морских рыб в мышцах, в то время как у пресноводных видов - только гидролиз АТХ. Считалось, что ткани пресноводных рыб не содержат БуХЭ (Вге81кт й а1., 1973; Бресткин и др., 1997). Чтобы проверить высказанное предположение, было проведено электрофоретическое разделение белков сыворотки крови разных видов рыб и методом субстратно-ингибиторного анализа идентифицировать типы ХЭ, включая родственные эстеразы.

Электрофорез в ПААГ сыворотки крови рыб и идентификация типов ХЭ. Всего в сыворотке крови рыб выявлено 3 зоны эстеразной активности, обозначенные в соответствии с рекомендациями Международного биохимического союза по мере уменьшения их электрофоретической подвижности как эст1, эст2 и эстЗ (Рис.1).

А Б

Рис. 1. Электрофореграммы эстераз эфиров карбоновых кислот сыворотки крови синца, плотвы, леща, карпа, окуня, щуки и налима.

ОЭП - относительная электрофоретическая подвижность белковых фракций: эст 1, эст 2 и эст 3 - зоны эстеразной активности; А и Б -фенотипы.

Фракции зоны эст 1 у всех исследованных видов рыб активно проявляются в неспецифических субстратах (а-нафтилацетат, а-

нафтилпропионат, р-нафтилацетат, 5-бром-индоксилацетат), а в эфирах тиохолина лишь в следовых количествах. Наибольшее сродство отмечается к а-нафтилацетату и 5-бром-индоксилацетату (Табл.З).

Таблица 3

Субстратная специфичность эстераз эфиров карбоновых кислот сыворотки крови синца, плотвы, леща, карпа, окуня, щуки и налима

Субстрат Эстеразная зона

Эст 1 Эст 2 Эст 3

а-нафтилацетат + + -

5-бром-индоксилацетат ++ + -

ацетилтиохолин - ++ +++

пропионилтиохолин - +++ ++

бутирилтиохолин +/- 1-1-1 1 ТТТТ -

Примечание. Знак «+» указывает на наличие гидролиза субстрата, а число знаков - на его относительную скорость;«-» субстрат не гидролизуется;«+/-» гидролиз очень слабый.

Использованные ингибиторы оказывают различное действие на фракции зоны эст 1 (Табл.4).

Таблица 4

Чувствительность эстераз эфиров карбоновых кислот сыворотки крови синца, плотвы, леща, карпа и окуня к ингибиторам

Ингибитор Эстеразная зона

Эст 1 Эст 2 Эст 3

эзерин + ++

хлорофос ++ +++ ++

р-хлормеркурийбензоат ...

Примечание. Знак «+» указывает на наличие эффекта ингибирования и относительную интенсивность его проявления; «-» ингибирование отсутствует

Предварительное инкубирование гелей в растворах эзерина и р-хлормеркурийбензоата (ПХМБ) с концентрацией 10-4 10-5 М не снижает интенсивность окрашивания фракций в субстратах (Рис.2), а хлорофос заметно ослабляет степень окраски: при концентрации 10-3 М до 75 - 82% от уровня контроля, а при концентрации 10-2 А до 48-60% в зависимости от вида рыб (Рис. 3).

Рис. 2. Интенсивность окрашивания зон эстеразной активности сыворотки рыб после инкубиции с эзерином. а - синец, б - плотва, в -карп, г - лещ (фенотип А), д - окунь

На основании этих результатов, а также, принимая во внимание наиболее высокое из всех зон значение ОЭП, фракции зоны эст 1 отнесены к КЭ (К Ф. 3 1.1.1) Наличие КЭ в плазме и других органах костистых рыб отмечалось ранее многими авторами (Augustinsson, 1959, 1961; Ecobichon, Israel 1967, Hart, Cook 1976; Chm, Sudderuddin 1979, Straus, Chambers 1995)

100 м 100 100 а

10мМ 1 мМ 0.1 мМ 0,01 мМ 0.001 мМ

концентрация хлорофоса

Рис.3. Интенсивность окрашивания зон эстеразной активности сыворотки рыб после инкубации с хлорофосом. Обозначения, как на рис.2

Фракция зоны эст 2 обладает значительно большим сродством к эфирам холина. Причем наиболее интенсивно она проявляется в БуТХ, а затем, по мере снижения субстратного сродства - в ПрТХ и АТХ (Табл. 3). В растворах эфиров нафтола и индоксила степень ее окрашивания наиболее слабая из всех исследованных субстратов. Избыточное содержание субстратов (10-2 М) не снижает интенсивность ее окраски. Использованные ингибиторы оказывают различное действие на фракцию (Табл. 4). При концентрации ПХМБ 10 М ингибирующее действие на способность фракции гидролизовать субстраты отсутствует. Эзерин при концентрации 10-5 М не снижает интенсивность окрашивания, а при концентрации 10-4 М наблюдается незначительное снижение окраски: не более чем до 88 % от уровня контроля (Рис.2). Хлорофос оказывает самое выраженное ингибирующее действие: в зависимости от вида рыбы при его концентрации 10-6 М гидролизующая способность фракции снижается до 60-75 % от уровня контроля, при концентрации 10"5 М до 40-59% , а при концентрации 10-4 М ингибируется полностью (Рис.3.). Результаты субстратно-ингибиторного анализа и величина ОЭП дают основание предварительно идентифицировать фермент," выявленный в зоне эст 2, как БуХЭ. Однако в отличие от типичных ХЭ она менее чувствительна к эзерину. Наличие БуХЭ в сыворотке рыб ранее исследователями не обнаруживалось (Augustinsson 1948, 1959, 1961; Chin, Sudderuddin 1979; Gaal et al. 1980). Однако в мышцах у морских и солоноватоводных видах она присутствует, а у пресноводных - нет (Lundin 1962).

Фракции, локализующиеся в зоне эст 3, наиболее интенсивно выявляются при инкубации с АТХ, несколько слабее - с ПрТХ и совсем не обнаруживаются с БуТХ (Табл. 3). Избыток субстратов (102 М) снижает степень проявления окраски фракций. При инкубации с неспецифическими субстратами фракции не выявляются. Использованные ингибиторы по-разному действуют на зону эст 3 (Табл. 4). ПХМБ при концентрации 10-4 М не влияет на способность фракции гидролизовать субстраты. Эзерин при концентрации 10"5 М снижает эффективность гидролиза АТХ до 58-75% от уровня контроля, а при концентрации 10-4 М до 38-45% (Рис.2). Хлорофос оказывает чуть менее выраженное ингибирующее действие (Рис.3). В зависимости от вида рыбы при его концентрации 10-4 М гидролизующая способность фракции не снижается и даже немного активируется, а при концентрации 10-5 М остается неизменной или составляет 88 % от уровня контроля. При концентрации 10-4 М она составляет 66-85% от контроля, при 10-3 М - 40-53%, а при 10-2 М ингибируется полностью' Результаты субстратно-ингибиторного анализа и величина ОЭП дают основание предварительно идентифицировать фермент, выявленный в зоне эст 3 как

АХЭ. Предполагается, что неспецифическая КЭ относится к более раннему этапу биохимической эволюции эстераз в ряду позвоночных, чем БуХЭ. В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что КЭ встречается в высоких концентрациях у всех низших позвоночных, а у высших позвоночных в сыворотке крови в основном присутствует БуХЭ. Согласно данной гипотезе, эти два типа эстераз филогенетически связаны и БуХЭ является более специализированной формой КЭ. Считается, что их разделение произошло у рептилий, так как в плазме черепахи обнаружен фермент, обладающий свойствами КЭ и БуХЭ, являющийся промежуточным между этими эстеразами (Augustinsson, 1961, 1972). Присутствие фермента типа БуХЭ в сыворотке крови синца, плотвы и леща дает основание думать, что эволюционное разделение КЭ и ХЭ произошло еще раньше: по крайней мере у костистых рыб.

Таким образом, в крови пресноводных костистых рыб установлено присутствие трех типов эстераз: неспецифическая КЭ и более специализированные АХЭ и БуХЭ. Однако эстеразный спектр у исследованных видов имеет различия. Все га них имеют КЭ и АХЭ, а БуХЭ выявлена лишь у трех представителей сем. Cyprinidae: плотвы, синца и леща, хотя у последнего только .30-40% обладают этим типом ХЭ. На основании гетерогенности ХЭ выделено два фенотипа леща: фенотип Б, в сыворотке которого присутствует АХЭ и БуХЭ, и фенотип А, для которого характерно наличие только АХЭ. У карпа (сем. Cyprinidae), окуня (ceM.Percidae), щуки (сем. Esocidae) и налима (сем. Lotidae) БуХЭ не обнаружена.

Чувствительность ХЭ рыб к ингибирующему действию ДДВФ in vitro. Оценка чувствительности ХЭ к действию in vitro различных ингибиторов, и в первую очередь ФОС, играет важную роль при сравнительной характеристике ферментов различного происхождения и локализации. При идентификации эстераз в сыворотке крови рыб было выявлено, что АХЭ и БуХЭ различаются по чувствительности к ФОС хлорофосу. Однако известно, что хлорофос сам по себе практически не способен ингибировать ХЭ и его антихолинэстеразное действие связано исключительно с продуктом спонтанного гидролиза - ДДВФ (Розенгарт и др. 1978). В связи с этим была исследована чувствительность АХЭ и БуХЭ мозга и сыворотки рыб к ингибирующему действию ДДВФ (Табл.5).

Величины констант скорости ингибирования ¿i для АХЭ мозга и сыворотки у всех исследованных видов имеют порядок 103 моль"1 л минл. При этом большинство значений не различаются достоверно или эти различия незначительны. Несколько более высокая чувствительность

отмечена для язя, уклейки (ceM.Cyprinidae), щуки (ceM.Esocidae) и ряпушки (ceM.Coregonidae). Величины ki для них варьируют в пределах от 1.4x104 до 5.2х104 моль"1 л мин"'. Различия между видами, наиболее отстоящими по величине кц друг от друга (язь и густера) были лишь 17-кратными. В сыворотке и мозге чувствительность АХЭ к ДДВФ была одинаковой.

Таблица 5.

Бимолекулярные константы скорости ингибирования k¡ и значения piso при действии ДДВФ in vitro на АХЭ мозга и БуХЭ сыворотки пресноводных костистых рыб

Семейство, вид АХЭ, 103 моль "'л мин"1 БуХЭ, 107 моль'1 л мин

Мозг Сыворотка Сыворотка

Согееошс1ае

Ряпушка 16±1а* (6.0) - - - -

Суопшс1ае

Синец 5± 1" (5.4) - - 2.0 + 0.2' (9.1)

Плотва 6. ± 1ъ* (5.5) - - 1.1 +0.1J (8.8)

Уклейка 27±5С (6.2) - - 2.5 + 0.1' (9.2)

Лещ 4 ± 1ь-е (5.4) - - 1.8 +0.3,J (9.0)

Язь 52 ±7" (6.5) - - 1.0±0.1J (8.8)

Густера 3±Г (5.3) - - 2.2 + 0.1' (9.1)

Карп 9 ± lf (5.7) 8 ± lf>h (5.7) отс отс

РегсМае

Окунь 6± 1* (5.5) 7±lb (5.6) отс отс

Судак 8 ± lf (5.7) - - отс отс

Е$ос1(1ае

Щука 14± Ia (5.9) 18 + 1' (6.0) отс отс

*представлены средние и ошибки средних (х ± тх); число использованных рыб N=8; в скобках представлены значения pIjo> рассчитанные из уравнения plso^log (0.695/A:?/t), где t - время ингибирования, принятое за 40 мин.; во всей таблице значения с одинаковыми буквенными индексами не различаются достоверно (р<0.05, ANOVA, LSD-тест); «-» величина к; не определена; «отс» БуХЭ отсутствует.

Полученные нами данные и результаты исследования других авторов свидетельствуют, что АХЭ, локализованная в мозгу и сыворотке (плазме)

крови каждого вида, практически идентична по чувствительности к ингибиторам in vitro. Межвидовые различия в чувствительности также незначительны.

Чувствительность БуХЭ к ДДВФ была нами изучена на примере рыб из сем. Cyprinidae, у которых этот фермент присутствует в плазме и его активность значительно преобладает над активностью АХЭ (Табл.5). Значения £2 БуХЭ для ДДВФ у этих видов варьировали в очень узком диапазоне от l.OxlO7 до 2.5х107 моль"'л мин"'. Из этого следует, что чувствительность БуХЭ сыворотки (плазмы) крови более чем в 1000 раз выше по сравнению с АХЭ мозга и сыворотки крови рыб.

Сравнение чувствительности к ДДВФ холинэстераз рыб и млекопитающих показывает, что АХЭ у этих животных по данному показателю очень близки, в то время как чувствительность БуХЭ рыб на два порядка выше, чем БуХЭ млекопитающих. Так, значения к2 для АХЭ из эритроцитов человека, мозга мыши, быка и крысы варьируют от 3.5x103 до 4.5х103, а БуХЭ сыворотки лошади равняются 3.9хЮ4 моль-1 л мин-1 (Розенгарт и др., 1978). Факт высокой чувствительности БуХЭ рыб к ДДВФ использован нами при разработка метода энзиматического определения ФОС в воде (Автор, свид. SU №1359741 А1. 1987; Козловская и др., 1996), а ДДВФ предложен в качестве селективного ингибитора для раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ в тканях рыб, где они присутствуют совместно (Чуйко и др., 2002).

Таким образом, при изучении ингибирования ХЭ мозга и крови рыб ДДВФ установлено, что чувствительность аналогичных ферментов в этих тканях одинакова. Показано, что АХЭ по чувствительности к этому ингибитору практически мало отличается от чувствительности АХЭ млекопитающих. В то же время чувствительность БуХЭ рыб более чем в 1000 раз выше по сравнению с АХЭ и более чем в 100 раз - по сравнению с БуХЭ млекопитающих.

ДДВФ как избирательный ингибитор для раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ рыб

Учитывая неодинаковую функциональную значимость разных типов ХЭ, часто возникает необходимость раздельного определения их активности. Не смотря на различия между ними, это не всегда представляется легким, особенно при работе с неочищенными ферментами, когда приходится иметь дело со смесью обоих типов ХЭ, присутствующих в биологических тканях одновременно, например в плазме. Высокая чувствительность БуХЭ карповых рыб к ДДВФ предполагает его селективность по отношению к данному ферменту. Было

проведено более детальное сравнительное исследование степени ингибирования АХЭ и БуХЭ плотвы в зависимости от концентрации ДДВФ (Рис. 4)

Рис.4. Зависимость степени ингибирования активности АХЭ мозга и БуХЭ сыворотки крови плотвы от концентрации ДДВФ.

1 - АХЭ, 2 - БуХЭ;-график «активность-концентрация»,-

график «степень ингибирования - концентрация».

Полученные результаты показывают, что активность АХЭ плотвы угнеталась на 100% при концентрации ДДВФ 5Х10*4 М (р1 3.6), а при концентрации 10"7 М (р1 7.0) - она не отличалась от контроля. При этой же концентрации ингибитора гидролизующая способность БуХЭ составляла 3%, а при концентрации 2.5x10'10 М (р1 9.6) инактивации фермента не наблюдалось. Из графиков следует, что диапазоны эффективных концентраций ДДВФ - для АХЭ и БуХЭ плотвы не перекрываются и концентрации ингибитора 10^-10"7 М могут быть рекомендованы для раздельного определения их активности в тканях плотвы. Рассчитанные из графиков «степень ингибирования - концентрация ингибитора» значения рЬо ДДВФ и соответствующие им величины к? для АХЭ и БуХЭ равнялись соответственно 4.9 и 8.2, и 2 и 3700 хЮ~ моль*' л мин"1, а степень избирательности составила 1850 раз. Значения к; для БуХЭ плотвы оказались чуть выше тех, что показаны в табл.4. Однако выявленные различия' не противоречат друг другу и объясняются качественной разницей ингибитора. В первом случае ДДВФ получен методом активации

хлорофоса, а во втором - использован коммерческий препарат. Вместе с тем известно, что антихолинэстеразное действие активированного ДДВФ на порядок выше, чем у синтезированного промышленным методом. Возможная причина - образование при активировании хлорофоса побочного продукта дипропил-2.2-дихлорвинил фосфата, который по антихолинэстеразному действию в 100 раз эффективнее ДДВФ (Бресткин и др., 1997).

Поскольку ХЭ плотвы и других исследованных видов рыб по чувствительности к ДДВФ практически не отличаются (табл. 4), можно говорить в целом о селективности этого ингибитора для БуХЭ пресноводных костистых рыб.

Соотношение доли БуХЭ и АХЭ в общей'активности ХЭ плазмы крови карповых рыб. Принимая во внимание высокую селективность ДДВФ для БуХЭ рыб, с его использованием проведено раздельное определение активности АХЭ и БуХЭ в плазме у видов, где они присутствуют совместно: леще, синце, плотве, густере, язе, уклейке и жерехе (Табл.2). Установлено, что доля БуХЭ у этих рыб составляет 8396% от общей активности ХЭ при использовании в качестве субстрата АТХ (Табл. 6).

Таблица 6.

Соотношение доли активности БуХЭ и АХЭ (%) в общей активности ХЭ плазмы крови некоторых видов карповых рыб

Основные кинетические свойства АХЭ

рыб. Скорость

гидролиза субстратов АХЭ мозга всех исследованных видов рыб и быка уменьшалась в ряду Соотношение скоростей

их гидролиза варьировало между видами незначительно, равняясь в среднем 100:68:20:<1. У быка оно было несколько другим: 100:71:49:0 (Табл.7).

Таблица 7.

Соотношение скоростей гидролиза различных тиохолиновых эфиров АХЭ мозга рыб и эритроцитов быка.

Семейство, вид АТХ* ПрТХ БуТХ МеТХ

Суппп1с1ае

Лещ 100 22 ± 1.0 0.9 ±0.2 62 ± 2.3

Синец 100 24 ± 1.1 1.1 ±0.2 61 ± 1.6

Плотва 100 20 ± 0.6 0.3 ± 0.2 63 ± 2.2

Густера 100 25 ±2.1 2 ±0.2 65 ± 2.7

Карп 100 26 ± 1.3 0.2 ±0.1 66 ± 4.4

Елец 100: - 1 ±06 74 ± 4.5

Карась 100 18 ±0.6 0.9 ± 0.3 58 ± 0.9

Линь 100 25 ± 0.7 1 ± 0.4 69 ± 2.6

Регс1(1ае

Окунь 100 18 ±1.5 1.6± 0.4 73 ± 1.3

Судак 100 13 ± 1.3 0.6 ±0.3 67 ± 3.9

Берш 100 11 ± 1.2 0 74 ± 1.5

ЬоМае

Налим 100 - 0 65

Бык 100 49 0.5 71

Примечание: АТХ - ацетилтихолин, ПрТХ - пропионилтиохолин, БуТХ - бутирилтиохолин, МеТХ - ацетил-Р-метилтиохолин; соотношение скоростей гидролиза рассчитано при концентрации субстратов 4.3 х 10"4 М

Заметны различия при гидролизе ПрТХ. У рыб увеличение длины ацильной части субстрата при переходе от АТХ к ПрТХ вызывает примерно в 2 раза более выраженное снижение активности АХЭ, чем у фермента быка. Структурное изменение в тиохолиновой части субстрата (наличие ß-метальной группы в МеТХ) снижает активность обеих АХЭ почти одинаково и в меньшей степени, чем при изменении в ацильной: относительные скорости гидролиза МеТХ у них различались мало. Полученные результаты предполагают, что активный центр АХЭ мозга рыб по сравнению с АХЭ быка менее приспособлен конформационно для гидролиза субстрата с более длинной ацильной частью, чем у АТХ. Причина таких различий по современным представлениям может быть в вариабельности аминокислотных остатков, формирующих активный центр холинэстераз (Harel et al., 1992; Hosea et al., 1995; Ordentlich et al., 1995). В целом полученные результаты соответствует данным других исследователей (Habig et al., 1988; Бресткин и др., 1997).

Исследование зависимости скорости гидролиза тиохолиновых субстратов от их концентрации и расчета основных кинетических параметров проведены на АХЭ мозга густеры (АХЭГ) и для сравнения для АХЭ эритроцитов быка (АХЭБ) (Рис.5).

0.35 1

5 0, 3 -

"3

I 0,25-

sc

о 1з

х 2

< i 0, 15 -

¡£ Ä I

§ 0,1 -j

n

| 0. 05 -

<o.

0 i-Г-^П

5,0

Рис. 5. Зависимость скорости гидролиза тгохолиновых эфиров от их концентрации под действием АХЭ мозга густеры

Ацетилтиохолин (♦), ацетил-ß-метилтиохолин (■), пропионилтиохолин ( А)„ бутирилтиохолин (•).

У АХЭГ со всеми исследованными субст. атами, за исключением БуТХ, скорость гидролиза возрастает с увеличением их концентрации до 2 мМ. Эта концентрация оказалась оптимальной со всеми исследованными субстратами (табл. 8). Дальнейшее повышение приводит к снижению активности ферментов, т.е. наблюдается эффект субстратного торможения.

Таблица 8

Кинетические характеристики гидролиза тиохолиновых эфиров различной структуры ацетилхолинэстеразой мозга густеры (АХЭГ) и эритроцитов быка (АХЭБ)

Сравнение величин Кт и в большей степени Vmax/Кщ показывает, что у АХЭГ и АХЭБ практически одинаковое сродство к АТХ. Значения V,^ также достаточно близкие. Однако применить этот показатель для сравнения общей гидролитической способности исследуемых холинэстераз не представляется возможным, т.к. в работе использованы с одной стороны частично очищенная АХЭБ, а с другой - неочищенный препарат из смеси субклеточных фракций мозга АХЭГ. Тем не менее, полученные данные с большой долей уверенности позволяют предположить, что после частичной очистки АХЭГ величина у нее будет существенно выше, чем у АХЭБ. Анализ величин Ут^/К-т И V,^ показывает, что АХЭГ и АХЭБ неодинаково реагируют на структурные изменения в молекуле субстрата на разных стадиях его гидролиза. Наибольшие различия у них

проявляются на сорбционной стадии реакции при изменениях в ацильной части субстрата. Как следует из данных таблицы 8, у АХЭГ при переходе от АТХ к ПрТХ сродство к субстрату (Vn^/K,,,) уменьшается в среднем в 8 раз, а у АХЭБ лишь в 3 раза. В тоже время скорость распада фермент-субстратного комплекса (Vnux) снижается соответственно в 3 и 2 раза. При изменениях в алкильной части молекулы субстрата (АТХ и МеТХ) АХЭГ и АХЭБ ведут себя почти одинаково: сродство к субстрату уменьшается в 1.4 раза, а скорость распада фермент-субстратного комплекса - примерно в 2 раза.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что АХЭ мозга рыб, наряду с общими чертами, характерными для «типичной» АХЭБ, имеет свои отличительные особенности, связанные с гидролизом субстратов. АХЭГ является более специализированным ферментом в субстратном отношении, чем «типичная» АХЭБ. Эта специфичность выражена, главным образом, в отношении ацильной части субстрата.

Активность АХЭ и БуХЭ в мозге и плазме пресноводных костистых рыб: межвидовые и межсемейственные различия.

Активность ХЭ и их состав может значительно варьировать не только у животных, относящихся к разным филогенетическим группам, но и среди близкородственных организмов (Лейбсон 1963; Вержбинская, Лейбсон 1963; Вержбинская и др., 1969; Hill 1988; Westlake et al.,1983). Исследование на рыбах показало, что имеются значительные качественные межвидовые различия спектра ХЭ в тканях (Рис.1) и количественные различия в способности гидролизовать АТХ и БуТХ (Табл. 2). Эти результаты предполагают возможность существования различий в холинергическом статусе среди пресноводных костистых рыб и требуют более детального исследования проблемы. Использование селективного ингибитора БуХЭ позволило раздельно определить уровень нормальный активности АХЭ и БуХЭ в мозге и плазме рыб и исследовать степень межвидовых и межсемейственных различий.

Результаты исследования показывают, что активность АХЭ мозга рыб варьирует как среди видов, так и семейств (Табл. 9). Максимальные 15 кратные различия выявлены между представителем ceM.Lotidae (налим) и Cyprinidae (плотва). Различия среди представителей семейств были достоверны (р<0.05) и активности АХЭ в среднем уменьшались в ряду: Вариабельность

активности АХЭ внутри семейств были меньше и не превышали 3 раз среди представителей сем. Cyprinidae (плотва и карп) и 2 раз среди Percidae (судак и окунь). Среди большинства исследованных карповых

активность АХЭ не различалась достоверно (р>0.05). У карася и карпа она была чуть ниже, чем у остальных представителей семейства и была такой же, как у щуки (Е80с1ёае).

Таблица 9.

Активность АХЭ в мозге и плазме (мкмоль АТХИ/г ткани или мл плазмы/ч) и БуХЭ в плазме (мкмоль БТХИ/мл плазмы/ч) разных видов пресноводных костистых рыб

Семейство, Мозг Плазма

вид АХЭ АХЭ БуХЭ

Стогш1(1ае

Плотва 2011 ±87* 18.6 ±0.7* 1048 ±124*

Уклейка 1156 ± 860-' 11.6±0.8бд 975 ± 26*

Лещ 1140 ± 62ь,> 4.2 ± 0.2* 87 ± 13ь

Язь 1078 ± 1306-' 1.9 ± 0.2Г 237 ±42'

Синец 1054 ± 57е'" 17.0 ± 2.1*-6 1083 ± 85*

Густера 990 ± 96°' 4.9 ± 0.5м 483 ± 86*

Жерех 1238 + 47° 2.4 ± 0.6Г,Ж 26 ± Г

Чехонь 877 ± 62" 5.8 ± 0.7*е н/о

Карась 704+ 8Г 10.6±0.5Д н/о

Карп 651 ±45г 6.3 ± 0.3е н/о

ЕзосИае •

Щука 691 ± 38г 4.9 ± 0.4*,е н/о

Регаёае

Судак 414 ±33" 1.2 ± 0.1* н/о

Берш 296 ± 19е 2.2 ± 0.4Г,Ж н/о

Ерш 256 ± 17е,ж 1.6±0.1гж н/о

Окунь 214 ±10* 2.8 ± 0.5*,г,ж н/о

Ьо^ёае

Налим 138 + 15' 1.5 ± 0.2Г,Ж н/о

Примечание: средние значения + ошибки средних (х ± Шх); N=12; средние в одинаковых колонках с одинаковыми буквенными индексами не отличаются достоверно при р<0.05 (А1>ЮУА, ЬБО-тест); н/о - скорость гидролиза БТХИ ниже предела обнаружения 0.01 мкмоль/мл/ч и не может быть измерена при данных условиях.

На биохимическом уровне эти различия могут быть связаны с активностю каталитического центра (число оборотов и/или в

содержании ХЭ в организме. Ранее было продемонстрировано, что acat АХЭ мозга и эритроцитов даже в таких эволюционно удаленных группах как насекомые, круглоротые, амфибии, птицы и млекопитающие варьирует в незначительных пределах 0.8-6.2xl0s мин"1. (Брик, Яковлев 1962; Grigor'eva, Konitcheva 1993; Григорьева и др., 1987; Бресткин и др., 1974; Яковлев, Волкова 1962; Marchot et al., 1993; Taylor et al., 1995). У карпа acat АХЭ мозга равен З.Зх105 мин-1 (Брик, 1969). Эти данные позволяют предположить, что различия в активности каталитического центра АХЭ не являются ведущим фактором, определяющим межвидовые и межсемейственные различия в ее удельной активности в мозге. Более вероятно, что неодинаковое содержание фермента в нервной ткани разных видов основная причина этого феномена. В пользу последнего свидетельствуют гистохимические и биохимические данные, полученные на нескольких пресноводных и морских видах рыб (Contestabile, 1975, 1978; Contestabile, Zannoni, 1975).

Среди всех исследованных видов рыб была отмечена положительная достоверная (р<0.05) корреляция между активностью разных типов АХЭ и БуХЭ в мозге и плазме (рис.6). Наиболее вероятно предположить, что существуют физиологическая основа этого феномена. Как известно, избыток АХ ингибирует активность АХЭ и активирует БуХЭ (O'Brien, 1960; Silver, 1974; Бресткин и др., 1997). Следовательно, если содержание АХ в ткани по какой-то причине достигает избыточного уровня, то БуХЭ в этот момент более эффективна для его гидролиза. Эта посылка лежит в основе одного из предположений о физиологической роли БуХЭ в организме, как «мусорщике» удаляющем избыток АХ из

организма. В этой связи обращает на себя внимание полученный в нашем исследовании факт скоррелированности уровчей активности обоих типов ХЭ в мозге и плазме рыб: только виды с высоким уровнем активности АХЭ в мозгу и плазме (большинство карповых) имеют в плазме БуХЭ. Это предполагает, что присутствие БуХЭ в плазме указывает на более высокую интенсивность метаболизма АХ и более высокий холинергический статус организма карповых по сравнению со щукой, налимом и окуневыми.

Изменения активности АХЭ в мозге рыб при остром стрессе, индуцированном введением адреналина. Выявленные межвидовые и межсемейственные различия в уровнях активности ХЭ в тканях рыб наблюдаются при стабильных условиях окружающей среды. Однако можно предположить, что различные стрессорные факторы могут влиять на ферментативную активность. Чтобы выяснить возможное влияние стресса на активность ХЭ рыб и их участие в стресс-ответе, было

0 4 8 12 16 20

активность АХЭ в плазме, мкмоль/мл/ч

0 200 400 600 800 1000 активность БХЭ в плазме, мкмоль/мл/ч

О 200 400 600 800 1000 активность БХЭ в плазме, мкмоль/мл/ч

Рис 6. Корреляция между активностью АХЭ в мозге и плазме и БУХЭ в плазме рыб

г - коэффициент корреляции, F - критерий Фишера, р<0.05. Виды рыб: 1-налим, 2-окунь, 3-ерш, 4-берш, 5-судак, 6-щука, 7-карп, 8-карась, 9-чехонь, 10-жерех, 11-густера, 12-синец, 13-язь, 14-лещ, 15-уклейка, 16-плотва.

проведено исследование динамики активности АХЭ в мозге окуня при инъекции адреналина (1.5 мг/кг), одного из известных стресс-гормонов (Панин 1983; Смит 1986). Выявленные изменения активности АХЭ носят двухфазный характер: краткосрочное (0.5ч) снижение с последующим продолжительным (72 ч) достоверным увеличением активности АХЭ на 4060% относительно контроля (Табл.10). Содержание ВБ в течение всего периода наблюдений варьировало в пределах контроля, за исключением 24 ч, когда его уровень был превышен.

Таблица 10.

Динамика активности АХЭ и содержания водорастворимых белков в мозгу, концентрация глюкозы в крови окуня после

инъекции адреналина

Показатель Вариант эксперимента

Контроль Рингер Адреналин

0.5 АХЭ1 433.3+29.8Г 423.8+52.1 183.5+27.0*

Белок6 46.6+1.7 44.5+3.0 37.5+4.0

Глюкоза" 43.1+2.9 90.9+8.9* 91.4+7.2*

4 АХЭ - 327.6+21.7 694.0+16.2*

Белок - 31.8+1.2 47.8+0.8

Глюкоза - 49.3+5.8 98.6+7.0*

12 АХЭ - 478.2+18.6 630.0+43.6*

Белок - 43.8+3.5 48.0+4.1

Глюкоза - 57.5+4.9* 115.7+20.8*

24 АХЭ 382.6+32.1 581.7+19.7* 366.0+53.2

Белок 39.2+2.0 44.6+1.7* 53.6+2.3*

Глюкоза 32.2+3.0 33.4+1.9 61.2+8.0*'

48 АХЭ - 412.7+31.8 646.4+42.0*

Белок - 35.2+0.6 44.6+1.9

Глюкоза - 45.8+6.2 38.3+2.2

72 АХЭ 331.8+34.4 338.8+19.4 680.4+45.6*

Белок 31.7+2.2 34.9+1.3 44.7+3.7

Глюкоза 21.3+3.0 32.7+1.0 62.5+5.0*'

а - активность АХЭ, мкмоль АТХИ/г ткани/ч; - содержание водорастворимых белков (ВБ), мг/г ткани; " - концентрация глюкозы, мг%; г - средняя ± ошибка средней, п=10 рыб/определение; * - достоверно отличается от контроля при р=0.05

О стрессорном характере изменений свидетельствует стойкая гиперкликемия, наблюдавшаяся у рыб уже в первые 30 мин после инъекции и сохраняющаяся в течение всего периода наблюдения. Общая направленность индуцированных адреналином изменений активности АХЭ в мозге окуня сходна с той, что обнаружена у млекопитающих (Сибуль 1966; Маслова, Резник 1971; Алексидзе, Балавадзе 1977).

Влияние адреналина на активность АХЭ может быть как прямое, так и опосредованное. На млекопитающих установлено, что при прямом действии in vitro адреналин вызывает снижение активности АХЭ (Сибуль 1966), причем эффект зависит от концентрации гормона. Это может служить причиной снижения активности АХЭ в мозге окуня, наблюдаемые через 30 мин после инъекции адреналина. При опосредованном влиянии адреналина активность АХЭ может повышаться за счет индуктивного синтеза молекул фермента de novo, что было продемонстрировано на крысах (Алексидзе, Балавадзе 1977; Елаев 1985). Следовательно, наблюдаемое у окуня повышение активности АХЭ в мозге связано, вероятнее всего, именно с синтезом дополнительного количества фермента de novo и механизм этого синтеза, видимо, такой же, как и млекопитающих.

Таким образом, проведенное исследование показало, что адреналин оказывает влияние на активность АХЭ в мозге рыб. Из этого следует, что любой стрессирующий фактор, повышающий уровень адреналина способен приводить к изменениям активности АХЭ в мозге рыб. Видимо, изменения активности АХЭ в мозге рыб являются одним из элементов вторичного ответа рыб при стрессе.

Сезонная динамика активности АХЭ мозга окуня. В жизни рыб существенное значение имеют взаимоотношения со средой их обитания, которая характеризуется постоянной изменчивостью. Изменения большинства природных факторов окружающей среды имеют сезонную циклическую периодичность, что особенно ярко проявляется в средних и северных широтах. Приспособление рыб к жизни в условиях циклических изменений среды осуществляется путем синхронизации их биологических ритмов с природными циклами. Считается, что сезонные биологические ритмы обусловлены либо влиянием факторов окружающей среды, либо эндогенными ритмами (феномен «биологических часов»), а чаще всего независимым совокупным влиянием того и другого. Двумя наиболее значимыми внешними факторами, регулирующими годовые ритмы, являются температура и фотопериод (Лав 1973; Шульман 1972). Для рыб, как пойкилотермных животных, температура среды обитания - один из наиболее существенных внешних факторов, оказывающих значительное

влияние на интенсивность метаболизма и протекание биохимических и физиологических процессов (Хочачка, Сомеро 1977; Хлебович 1981). В связи с этим представляло интерес исследовать сезонную динамику ХЭ в тканях рыб. Было установлено, что активность АХЭ в среднем и промежуточном мозге окуня изменяется в течение года и имеет четко выраженную сезонную периодичность (Рис. 7).

Рис. 7. Сезонные изменения активности АХЭ (столбики) в среднем и промежуточном мозге окуня (Perca fluviatilis L) и температуры воды (линия) в месте его обитания в Рыбинском водохранилище в период 19801982гг.

Динамика активности АХЭ не зависит от пола, но имеет обратно пропорциональную зависимость от длины тела и веса мозга. В целом, летом она выше, чем зимой и следует сезонным изменениям температуры воды. Положительная корреляции активности АХЭ и температуры воды, полученная при температурой адаптации окуня в лабораторных условиях подтверждает это заключение. Вместе с тем обращают на себя внимание следующие факты:

а) заметное увеличение активности АХЭ начинается в феврале, когда температура воды находится все еще на минимальном годовом уровне; б)

наибольшая активность фермента наблюдается в апреле - мае, а максимальные среднемесячные значения температуры воды приходятся на июль-август. Наиболее вероятно предположить, что изменение фотопериода выполняет тригтерную роль и запускает целый комплекс биохимических и физиологических перестроек в организме рыб, включая и метаболизм АХЭ (Baslow, Nigrelly 1964). Наивысший уровень активности АХЭ в апреле-мае приходится на период нереста рыб. Связь изменений активности АХЭ в мозге рыб с нерестом недавно была подтверждена экспериментальным путем в лабораторных условиях (Pavlov 1994a). Поскольку известно, что нерест - это черезвычайно стрессирующий период в биологическом цикле рыб (Лав 1973; Шульман 1972), то причина увеличения активности АХЭ в мозге вероятнее всего имеет стрессорную природу, что обсуждается выше. Сходные сезонные изменения активности АХЭ в мозге и БуХЭ в плазме и печени отмечены нами у плотвы. Таким образом, в основе сезонных изменений активности АХЭ мозга рыб лежат как эндогенные причины, так и факторы окружающей среды.

Роль ингибирования АХЭ мозга ДДВФ в нарушении пищевого поведение рыб. Известно, что пищевое поведение рыб нарушается при действии сублетальных концентраций ФОС (Little et al., 1989). При этом наиболее обычным типом нарушения является уменьшение количества потребляемой пищи и/или прекращение питания (Sandheinrich, Atchison, 1990). Относительно ФОС известно, что основной мишенью их действия в организме является АХЭ, один из важных компонентов холинергической нервной системы, как ее центральных, так и периферических отделов (O'Brien, 1960; 1967). Ингибирование АХЭ ведет к нарушению проведения нервного импульса и этот феномен хорошо известен не только у млекопитающих, но и у рыб (Weiss, 1961; Weiss, Gakstatter, 1964; Coppage, 1972). Эти факты позволяют предположить, что основной механизм подавления поведения рыб при сублетальном токсическом действии ФОС - есть на самом деле блокирование проведения нервного импульса в соответствующих отделах ЦНС, которое может приводить к нарушению холинергической регуляции поведения рыб. Однако значение этих эффектов для токсикогенной патологии поведения рыб до сих пор оставалось неясной.

В результате проведенного исследования было показано, что 96 ч экспозиция рыб к ДДВФ в сублетальной концентрации привела к достоверному снижению активности АХЭ в их мозге (Табл. 11).

Таблица 11.

Влияние экспозиции к ДДВФ (1.87 мг/л, 1/15 JIK50 за 48 ч) и инъекции ТМБ-4 на активность АХЭ мозга годовиков леща (Abramis brama L.).

Примечание: * представлены средние значения активности АХЭ и ошибки средней (х±тх; мкмоль АТХИ/ г ткани/ чЫ ) 10;1 - различия с контролем достоверны при р=0.01

Результаты исследования пищевого поведения леща показывают, что уже спустя 24 ч после начала действия ДДВФ на рыб у них также достоверно снижается количество потребляемого корма (Табл.12).

Таблица 12.

Количество потребляемого корма при разных вариантах экспозиции годовиков леща (Abramis brama L.) к ДДВФ

Примечание: * представлены средние значения количества съеденных хирономид и ошибки средней = число наблюдений; - различия

с контролем достоверны при р=0.01

В результате различных вариантов реабилитационных процедур, включая инъекции фармакологических препаратов, обладающих антидотным действием, активность АХЭ и количество потребляемого корма после прекращения действия токсиканта менялся в различной степени. Ни при замене токсиканта на чистую воду, ни после инъекции раствора Рингера как активность АХЭ, так и пищевое поведение не восстанавливались до нормы до конца эксперимента.

В противоположность этому рыбы, инъецированные ТМВ-4, за такое же время реабилитации демонстрируют почти полное восстановление активности, АХЭ почти до нормы и одновременно пищевого поведения до контрольного уровня. Как известно из исследований на млекопитающих, реактивирующий эффект ТМБ-4 связан со значительным ускорением процесса дефосфорилирования активного центра АХЭ после его фосфорилирования в процессе взаимодействия с ФОС. Однако у млекопитающих этот реактиватор очень слабо проникает через гематоэнцефалический барьер. Поэтому его обычно используют как антидот периферического действия (Голиков, Заугольников, 1970). Как следует из полученных данных, у рыб, в отличие от млекопитающих, ТМБ-4 хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер и оказывает антидотный эффект центрального действия. Восстановление нормального пищевого поведения наблюдается и при инъекции другого антидота, известного как блокатора м-холинорецепторов центрального действия. Полученные результаты представленные здесь наглядно демонстрируют функциональную связь между восстановлением активности АХЭ и нормального функционирования холинергических синапсов в мозге рыб и эффективностью их пищевого поведения.

Роль ХЭ в избирательной устойчивости различных видов рыб к летальному действию ДДВФ in vivo. Известно, что животные, в том числе и рыбы, могут значительно различаться по устойчивости к острому действию ФОС (Markng, Mauck, 1975; Розенгарт, Шерстобитов, 1978). Для рыб вопрос о причинах селективности остается открытым. Вместе с тем, исходя из данных, полученных на млекопитающих и насекомых, предполагается, что основные возможные причины этого следующие: а) различная чувствительность АХЭ мозга рыб к действию ФОС; б) неодинаковая скорость их поступления в организм у разных видов рыб; в) различия в скорости детоксикации токсикантов в организме рыб и г) защитная функция БХЭ плазмы. Исследование показало, что различия между окунем и карпом в устойчивости к острому действию ДДВФ достигают около 40 раз (Табл.13).

Таблица 13.

Значения JIKjo ДДВФ для карпа и окуня при экспозиции 48 часов

Вид Количество рыб, шт. ЛК5о, мг/л Границы доверительного интервала ЛК50 мг/л

Карп 36 21.9 20.2-23.8

Окунь 42 0.59 0.54 - 0.64

различия достоверны между окунем и карпом при р=0.01

Как продемонстрировано выше, по чувствительности к ингибированию ДДВФ in vitro АХЭ мозга рыб, включая окуня и карпа, фактически не различается (табл.5), что указывает на низкую значимость этого фактора в формировании межвидовых различий в их устойчивости к действию токсиканта. Вместе с тем, уровень удельной активности АХЭ в мозге у карпа примерно в 3 раза выше, чем у окуня (табл. 9), что может быть одной из причин более высокой устойчивости карпа к ДДВФ. В пользу этого свидетельствует ранее установленный факт, что более устойчивая к ФОС популяция рыбы гамбузии обладает и более высоким уровнем активности АХЭ в периферическом отделе нервной системы (Chambers, 1976). Кроме того, собственные данные и результаты других исследователей показывают, что в целом представители сем. Cyprinidae обладают большей устойчивостью к токсическому действию ФОС, чем виды из других семейств, включая Percidae (Markng, Mauck, 1975; Гантверг, 1985; Чуйко, 1987; Frnmin et al., 1992). Наряду с этим, они имеют и более высокую активность АХЭ в мозге (табл. 9). Можно предположить, что чем выше активность АХЭ, тем требуется большая доза ингибитора, чтобы снизить ее уровень до летального. Однако это не позволяет полностью объяснить существующие между окунем и карпом различия в устойчивости к ДДВФ.

Исследование детоксикационной способности печени у этих видов выявило, что у окуня она в 7 раз ниже, чем у карпа. Причем выявленные различия связаны как с более высокой удельной скоростью ферментативной детоксикации ДДВФ, так и с большей массой печени у карпа (Табл. 14).

Кроме того, анализ динамики содержания ДДВФ в крови этих видов в начальный период их контакта с токсикантом свидетельствует и о межвидовых различиях в скорости его поступления в организм рыб: у окуня она примерно в 4 раза выше, чем у карпа (рис. 8).

Таблица 14.

Скорость ферментативного разрушения ДДВФ гомогенатами печени in vitro и ее масса у одноразмерных карпа и окуня.

Вид Масса печени* Скорость ферментативного разрушения, мкг/г/час

абсолютная относительная

Карп 1290 ±77 21.6 ± 1.5 38.8 + 5.1

Окунь 745 ± 12 9.9 + 0.7 12.7 + 1.4

абсолютная масса печени выражена в мг, относительная - в мг/г и рассчитана относительно массы тела; различия достоверны между окунем карпом при р=0. 0 5.

О 4--,-,--,-,-,---,

О 10 20 30 40 50 60 70 время, мин

Рис. 8. Динамика содержания ДДВФ в крови карпа и окуня при концентрации токсиканта в окружающей воде 21.9 мг/л

Учитывая высокий уровень активности БуХЭ в крови карповых рыб (табл.9) и ее высокую чувствительность к ДДВФ (табл. 5) была исследована ее защитная роль при остром отравлении рыб ФОС. Поскольку напрямую это измерить не представлялось возможным, были проведено сравнение острой токсичности ДДВФ для двух фенотипов леща: содержащего в крови БуХЭ и не имеющего ее. Результаты показали, что при экспозиции 48 ч значения ЛК50 у двух фенотипов леща достоверно не отличаются, составляя соответственно 133.9 и 135.2 мг/л. Полученные данные позволяют заключить, что по крайней мере при остром действии ДДВФ на леша, наличие БуХЭ в крови не защищает его от отравления.

ВЫВОДЫ

1. У пресноводных костистых рыб присутствуют ХЭ, которые по субстратной специфичности, чувствительности к ингибиторам и кинетическим свойствам могут быть отнесены к двум основным типам: АХЭ (К.Ф. 3.1.1.7) и БуХЭ (К.Ф. 3.1.1.8.). Однако они имеют свои особенности, отличающие их от типичных ХЭ млекопитающих.

2. Активность АХЭ обнаружена во всех проанализированных органах и плазме крови у всех исследованных видов рыб, а БуХЭ - только в плазме, печени и селезенке у представителей ceM.Cyprmidae. Независимо от вида наибольшая активность АХЭ выявляется в мозге, а БуХЭ - в плазме, где ее доля в общей активности ХЭ составляет 83-95%. Уровень активности БуХЭ в плазме коррелирует с активностью АХЭ в мозге и плазме.

3. Активность ХЭ у рыб не зависит от пола и циклически изменяется в течение года, следуя сезонным изменениям температуры воды: летом она в 2-3 раза выше, чем зимой. Однако наивысшие ее значения наблюдаются во время нереста, что отражает стрессорный характер и общую направленность изменений метаболизма в этот период.

4. При остром стрессе, индуцированном инъекцией адреналина, активность АХЭ в мозге рыб изменяется. Выявленные изменения носят двухфазный характер: в первые минуты происходит снижение, а в последующие часы - повышение активности фермента. Повышенный уровень активности АХЭ сохраняется не менее трех суток после инъекции.

5. АХЭ в мозге играет роль в формировании пищевого поведения рыб. Снижение ее активности при хроническом действии ФОС на рыб вызывает дискоординацию пищевого поведения и приводит к снижению количества потребляемого корма. Реактивация АХЭ восстанавливает нормальный уровень питания. Снижение активности в процессе экспозиции к токсиканту происходит значительно быстрее (несколько часов), чем ее восстановление до нормы после прекращения контакта с токсикантом.

6. Чувствительность ХЭ к ФОС и уровень их активности в тканях вносит незначительный вклад в избирательность токсического действия на рыб. Основные причины избирательности - межвидовые различия в скорости проникновения токсиканта в организм рыб и эффективности его детоксикации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Козловская ВИ, Чуйко ГМ. Холинэстеразы сыворотки крови рыб ceM.Cyprinidae с различной устойчивостью к хлорофосу// В кн. Физиология и паразитология пресноводных животных. Тр. ИБВВ РАН (Флеров БА, ред). 1979. Л. Наука. №38(41). С. 32-41.

2. Чуйко ГМ, Козловская ВИ, Степанова ВМ. Эстеразы эфиров карбоновых кислот сыворотки крови синца (Abramis ballerus), плотвы (Rutilus rutilus), леща (Abramis brama) и окуня (Регса fluviatilis)// Рук. деп. в ВИНИТИ22.11.1983. 1983. 6193-83деп. 10с.

3. Козловская ВИ, Степанова ВМ, Чуйко ГМ. Обратимость интоксикации карпа карбофосом// В кн. Реакция гидробионтов на загрязнение. Ред. НС Строганов. 1983, М. Наука. С. 191-198.

4. Козловская ВИ, Чуйко ГМ. Изменения ацетилхолинэстеразы мозга окуня (Регса fluviatilis L.) под воздействием хлорофоса// Гидроб. ж. 1985. Т. 21. №5. С. 49-53.

5. Чуйко ГМ. Чувствительность ацетилхолинэстеразы мозга к хлорофосу и его токсичность для плотвы, леща, карпа и окуня// Биология внутренних вод. Информ. бюлл. 1985. № 66. С. 55-59.

6. Чуйко ГМ. Устойчивость карпа и окуня к хлорофосу и ДДВФ// Биология внутренних вод. Информ. бюлл. 1986. №69. С. 51-55.

7. Козловская ВИ, Чуйко ГМ, Мензикова ОВ, Петухова ВА. Способ определения фосфорорганических пестицидов в воде// Автор, свидет. SU №1359741 А1. 1987.

8. Чуйко ГМ. Биохимические и физиологические механизмы различной устойчивости пресноводных костистых рыб к действию хлорофоса и ДДВФ// Автореф. на соиск. уч. степ к.б.н. 1987. Л. ИЭФиБ. 22с. .

9. Чуйко ГМ. Холинэстераза сыворотки крови леща и его устойчивость хлорофосу// Биология внутренних вод. Информ. бюлл. 1987. №74. С. 55-57.

10. Чуйко ГМ, Козловская ВИ. Сезонные изменения активности ацетилхолинэстеразы мозга окуня (Регса fluviatilis L.)// В кн. Физиология и токсикология гидробионтов (Сабуров ГЕ, ред). 1989. Ярославль. ЯрГУ. С. 27-38.

П.Козловская ВИ, Мензикова ОВ, Чуйко ГМ, Майер ФЛ. Холинэстеразы водных животных// В кн. Физиология, биохимия и токсикология пресноводных животных (Флеров Б А, ред). 1990. Ленинград. Наука. №57(60). С. 42-66.

12. Козловская ВИ, Павлов ДФ, Чуйко ГМ, Халько ВВ, Винников ЮЯ, Анохин СВ. Влияние загрязняющих веществ на состояние рыбы в Шекснинском плесе Рыбинского водохранилища// Влияние стоков Череповецкого промышленного узла на эколлогическое состояние Рыбинского водохранилища (БА Флеров, ред.). 1990. Рыбинск. ИБВВ РАН.С.123-143.

13. Павлов ДФ, Чуйко ГМ, Герасимов ЮВ. Содержание белка и активность ацетилхолинэстеразы в мозгу леща при хроническом действии кадмия// Биология внутренних вод. Информ.бюлл. 1990. №89. С.72-77.

14. Козловская ВИ, Чуйко ГМ, Мегаикова ОВ, Подгорная ВА. Энзиматический метод определения в воде фосфорорганических пестицидов и их метаболитов// Биология внутренних вод. Информ.бюлл. 1996. №100. С. 65-72.

15. Желнин ЮЮ, Чуйко ГМ, Подгорная ВА. Активность холинэстераз плазмы крови различных видов пресноводных костистых рыб//Биол. внутр. вод. 1998. №. 1.С. 74-79.

16. Чуйко ГМ, Павлов ДФ, Подгорная В А, Степанова ВМ. Изменение активности ацетилхолинэстеразы и содержания водорастворимого белка в мозге мозамбикской тиляпии (Oreochromis mossambicus Peters) при хроническом действии кадмия, нафталина и дихлофоса// Биол. внутр. вод.

2001. №3. С. 72-79.

17. Чуйко ГМ, Подгорная В А. Холинэстеразы пресноводных костистых рыб// В кн. Современные проблемы биологии, химии, экологии и экологического образования.(Казин ВН, Сибриков СГ, Тихонов СИ, Тятенкова НН, ред.). 2001. Ярославль. ЯрГУ. С. 233-236.

18. Чуйко ГМ, Подгорная ВА, Лаврикова ИВ. Фосфорорганическое соединение 0,0-диметил-0-(2,2-дихлорвинил)фосфат как избирательный ингибитор для раздельного определения активности ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы плотвы Rutilus rutilus// Ж. эвол. биохим. физиол.

2002. Т.38. №3. С. 203-207.

19. Kozlovskaya VI, Chuyko GM, Lapkina LN, Nepomnyashchikh VA. Resistance of aquatic animals to organophosphorus pesticides and its mechanisms// In Problems of Aquatic Toxicology, Biotesting and Water Quality Management: Proceedings of USA-USSR Symposium, Borok, Yaroslavl Oblast, July 30-August 1, 1984. (In: Ryans RC, ed). 1986. Athens, GA. EPA Research Laboratory. P. 37-54.

20. Chuyko GM. Various resistance mechanisms of carp (Cyprinus carpio L.) and perch (Perca fluviatilis L.) to DDVF organophosphorus compounas// In Fate and Effects of Pollutants in Aquatic Organisms and Ecosystems:

Proceedings of USA-USSR Symposium, Athens, Georgia, October 19-21, 1987 (In: Ryans RC, ed). 1988. Athens. EPA. P.78-89.

21. Pavlov DF, Chuiko GM, Gerassimov YV, Tonkopiy VD. Feeding behavior and brain acetylcholinesterase activity in bream (Abramis brama L.) as affected by DDVP, an organophosphoras insecticide//Comp. Biochem. Physiol. 1992. V.103C.N3. P. 563-568.

22. Frumin GT, Chuiko GM, Pavlov DF, Menzykova OV. New rapid method to evaluate the median effect concentration of xenobiotics in hydrobionts// Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1992. V. 49. P. 361-367.

23. Kozlovskaya VI, Mayer FL, Menzikova OV, Chuyko GM. Cholinesterases of aquatic animals// Rev. Environ. Contam. Toxicol. 1993. V. 132. P. 117-142.

24. Pavlov DF, Chuiko GM, Shabrova AG. Adrenaline induced changes of acetylcholinesterase activity in the brain of perch (Perca fluviatilis L.)// Сотр. Biochem. Physiol. 1994. V. 108C. N1. P. 113-115.

25. Chuiko GM, Slynko YV. Relation of allozyme genotype to survivorship of juvenile bream, Abramis brama L.,. acutely exposed to DDVP, an organophosphoras pesticide// Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1995. V. 55. N5. P. 738-745

26. Chuiko GM, Zhelnin Y, Pod'gornaya VA Seasonal fluctuations in brain acetyilcholinesterase activity and soluble protein content in roach (Rutilus rutilus L.): a freshwater fish from Northwest Russia// Сотр. Biochem. Physiol. 1997. V. 117C. N3. P. 251-257.

27. Chuiko GM. Comparative study of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in brain and serum of several freshwater fish: specific activities and in vitro inhibition by DDVP, an organophosphorus pesticide// Сотр. Biochem. Physiol. 2000. V. 127C. N 3. P. 233-242.

28. Chuiko GM, Podgornaya VA, Zhelnin YY. Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase Activities in Brain and Plasma of Several Freshwater Teleosts: Cross-species and Cross-family Differences// Сотр. Biochem. Physiol.. 2003. V.135B. No l.P.55-61.

Лицензия ПД 00661. Заказ 2357. Тираж 120. Отпечатано в типографии Ярославского государственного технического университета г. Ярославль, ул. Советская, 14 а, тел. 30-56-63.

и.-908

РНБ Русский фонд

2004-4 26757

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Чуйко, Григорий Михайлович

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХОЛИНЭСТЕРАЗ (ХЭ).

1.1.1. История открытия и этапы изучения.

1.1.2. Типы, их свойства, функции, локализация и идентификация.

1.1.3. Молекулярное строение и структура.

1.2. ХОЛИНЭСТЕР АЗЫ РЫБ.

1.2.1. Типы, локализация и свойства.

1.2.2. Участие ХЭ в физиологических процессах.

1.2.3. Действие естественных экологических факторов и физиологических состояний.

1.2.4. Действие ФОС и КС на ХЭ рыб в условиях in vivo.

1.2.5. Влияние соединений, не обладающих прямым антихолинэстеразным действием.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Исследуемые рыбы.

2.2. Исследуемые химические соединения.

2.3. Методы исследования.

2.4. Культивирование экспериментальных рыб.

2.5. Постановка экспериментов.

2.6. Статистическая обработка.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование скорости гидролиза ацетил- и бутирилтиохолина в тканях

3.2. Электрофоретическое разделение и идентификация типов ХЭ в сыворотке крови рыб.

3.3. Чувствительность ХЭ рыб к ингибирующему действию ДЦВФ in vitro.

3.4. ДЦВФ как избирательный ингибитор для раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ рыб.

3.5. Соотношение доли БуХЭ и АХЭ в общей активности ХЭ плазмы крови рыб из сем Cyprinidae.

3.6. Основные кинетические свойства АХЭ и БуХЭ рыб: сравнение с типичными ХЭ.

3.7. Активность АХЭ и БуХЭ в мозге и плазме пресноводных костистых рыб: межвидовые и межсемейственные различия.

3.8. Изменение активности АХЭ в мозге окуня при остром стрессе, индуцированном введением адреналина.

3.9. Сезонная динамика активности АХЭ и БуХЭ в тканях окуня и плотвы.

3.10. Роль ингибирования АХЭ мозга в нарушении пищевого поведения леща при действии ДЦВФ in vitro.

3.11 Изменения АХЭ мозга окуня (Perca fluviatilis L.) при остром действии хлорофоса in vivo.

3.12. Изменение активности АХЭ в мозге карпа и динамика ее восстановления при действии in vivo различных концентраций карбофоса.

3.13. Динамика изменения активности ХЭ в тканях плотвы приодноразовом сублетальном действии ДДВФ in vivo.

3.13 Роль ХЭ и других причин в межвидовой избирательности летального действия ФОС на рыб.

3.13.1. Сравнительная устойчивость рыб к действию хлорофоса и ДДВФ в острых опытах.

3.13.2. Чувствительность АХЭ рыб к ингибированию ДДВФ in vitro.

3.13.3. Скорость поступления ДДВФ в организм карпа и окуня.

3.13.4. Интенсивность метаболического разрушения ДДВФ в печени окуня и карпа в условиях in vitro.

3.13.5. Роль БуХЭ плазмы в устойчивости леща к летальному действию хлорофоса и ДДВФ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительно-биохимическое исследование холинэстераз пресноводных костистых рыб бассейна Рыбинского водохранилища"

Актуальность проблемы. Изучение биоразнообразия и эволюции кинетических свойств ферментов и функций, выполняемых ими в организме - одна из основополагающих проблем современной биохимии и биологии в целом. Для решения этой проблемы необходимы сравнительные исследования ферментов у широкого круга живых организмов из разных филогенетических групп.

Холинэстеразы (ХЭ) - ферменты, широко распространенные в живой природе от микроорганизмов и простейших одноклеточных организмов до позвоночных, включая человека. Выделяют два основных типа ХЭ: ацетилхолинэстераза (ацетилхолин ацетилгидролаза, АХЭ; К.Ф. 3.1.1.7) и холинэстераза (ацилхолин ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.8), представленная рядом ферментов. К последнему типу относится наиболее известная и часто встречаемая среди животных бутирилхолинэстераза (БуХЭ). ХЭ участвуют в различных физиологических процессах, но функциональное значение установлено только для АХЭ: она играет ведущую роль в механизме трансдукции нервного импульса в холинергических синапсах животных, гидролизуя медиатор ацетилхолин (АХ). Роль БуХЭ до сих пор остается неясной (Silver, 1954; Taylor, 1991; Бресткин и др., 1997). Особенностью ХЭ является их способность взаимодействовать с фосфорорганическими (ФОС) и карбаматными (КС) соединениями, что приводит к необратимому ингибированию их активности. Ингибирование АХЭ нервной системы животных блокирует проведение нервного импульса и вызывает нарушение нормального функционирования организма, приводя в конечном итоге к его гибели (О'Брайн, 1960; Голиков, Розенгарт, 1964). Этот феномен нашел широкое применение в практическом использовании ФОС и КС в качестве пестицидов, боевых отравляющих веществ и лекарственных препаратов (Розенгарт, Шерстобитов, 1978; Chambers, Levi, 1992), а также в использовании ХЭ как биомаркеров действия этих соединений на разные виды животных (Minneau, 1991; Huggett et al., 1992). Наиболее полно к настоящему времени изучены АХЭ эритроцитов и мозга человека и крупного рогатого скота, а также БуХЭ сыворотки (плазмы) крови человека и лошади. Эти ферменты принято считать «типичными». ХЭ других организмов изучены недостаточно, хотя они могут заметно отличаться по свойствам от «типичных» АХЭ и БуХЭ (Бресткин и др., 1997).

Данные о ХЭ пресноводных костистых рыб носят ограниченный характер и получены в основном зарубежными исследователями на незначительном числе нехарактерных для ихтиофауны Европейской части России видов. Детальные исследования по идентификации типов ХЭ среди широкого ряда видов пресноводных костистых рыб, изучению их кинетических свойств, межвидовых различий в активности и распределению в органах до сих пор не проводились. В связи с этим до последнего времени преобладает мнение, что в организме рыб доминирует АХЭ, а БуХЭ, если и присутствует, то в очень небольших количествах (Augustinsson, 1958, 1959, 1961; Hogan, 1971а,b; Брик, 1969; Brestkin et al., 1973; Hobden, Klaverkamp, 1977; Бресткин и др., 1997). Практически отсутствуют данные о сезонной динамике ХЭ, об их участии в таких биологически важных процессах, как питание, нерест, стресс. С момента обнаружения АХЭ в мозге рыб (Mendel, Rudney, 1943) исследования связаны, главным образом, с возможностью ее использования как биомаркера действия ФОС и КС (Weiss 1958, 1961, 1965; Coppage, Matthews, 1974; Гантверг, Перевозников, 1983; Zinkl et al., 1991). Тем не менее, до сих пор имеется мало данных о динамике восстановления активности ХЭ in vivo, особенно после хронического действия низких концентраций антихолинэстеразных соединений. Единичны исследования роли ХЭ в механизмах межвидовых различий в устойчивости рыб к ФОС.

Цель и задачи исследования: идентификация типов ХЭ у пресноводных костистых рыб, изучение их каталитических свойств, видоспецифичности органо-тканевого распределения и некоторых прикладных аспектов (роль в физиологических процессах и варьирование активности при действии биологических и антропогенных факторов окружающей среды).

Соответственно цели были определены задачи работы:

1. Охарактеризовать типы ХЭ у разных представителей пресноводных костистых рыб и сравнить их по каталитическим свойствам с типичными ХЭ млекопитающих.

2. Исследовать межвидовые и межсемейственные особенности в органо-тканевом распределении разных типов ХЭ и в уровнях их активности у пресноводных костистых рыб.

3. Изучить изменения активности АХЭ мозга при стрессе, индуцированном адреналином.

4. Установить пределы биологической вариабельности и определить уровни нормальной активности ХЭ в разные сезоны года.

5. Оценить участие холинергической нервной системы и роль АХЭ мозга в формировании пищевого поведения рыб в норме и при хроническом отравлении ФОС.

6. Выявить роль ХЭ и других физиолого-биохимических факторов в межвидовых различиях устойчивости рыб к острому токсическому действию ФОС.

Научная новизна. Обобщены исследования ХЭ пресноводных костистых рыб. Впервые в плазме пресноводных костистых рыб сем. Сурпшёае обнаружена БуХЭ, описаны ее каталитические свойства и распределение в различных органах, показаны сходство и отличия от АХЭ рыб и АХЭ и БуХЭ млекопитающих. Выявлены различия между видами и семействами рыб по уровню активности БуХЭ в плазме и печени. Показано, что у леща Abramis brama в отличии от других представителей сем. Cyprinidae БуХЭ в плазме присутствует лишь у 30% особей. Впервые установлены устойчивые различия в активности АХЭ мозга не только между отдельными видами, но и среди представителей разных семейств пресноводных костистых рыб, а также выявлена корреляция между активностью АХЭ в мозге и БуХЭ в плазме. Впервые определен нормальный диапазон варьирования активности АХЭ и БуХЭ в органах широкого ряда пресноводных костистых рыб, принадлежащих к нескольким семействам. Продемонстрировано, что сезонные изменения активности АХЭ мозга рыб связаны не только с температурой окружающей среды, как у других пойкилотермных животных, но и с их биологическим репродуктивным циклом. Впервые показано участие холинергической системы и АХЭ в мозге при формировании пищевого поведения у рыб и установлен один из механизмов действия антихолинэстеразных соединений на пищевое поведение рыб при хронической интоксикации ФОС. Впервые для рыб выявлено увеличение активности АХЭ в мозге при остром стрессе. Показано, что динамика активности АХЭ в мозге рыб in vivo при хроническом действии и после его прекращения веществ различной природы неантихолинэстеразного действия имеет стрессорный характер. Проанализирована взаимосвязь уровня активности АХЭ мозга и симптомокомплекса отравления и реабилитации при остром и хроническом действии ФОС на рыб. Впервые установлено, что чувствительность АХЭ и БуХЭ рыб к действию ФОС in vitro не является фактором, определяющим межвидовые различия в токсикорезистентности рыб; разная скорость проникновения ФОС в организм и интенсивность их детоксикации играют основную роль в этом процессе.

Научно-практическая значимость работы. На основании анализа и обобщения литературных данных и результатов собственных исследований даны практические рекомендации по использованию ХЭ пресноводных костистых рыб для оценки антропогенного загрязнения водных объектов ФОС и КС. При выполнении работы разработаны методы: энзиматического определения ФОС в воде (получено авторское свидетельство SU №1359741 от 15.08.87, ГК ИО СССР); определения эффективных концентраций в токсикологических опытах; определения ДДВФ в крови и печени рыб с использованием ГЖХ с электронно-захватным детектором (ЭЗД); метод раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ в тканях рыб с использованием селективного фосфорорганического ингибитора ДЦВФ. Материалы диссертации нашли практическое применение при обучении студентов в ряде Университетов в России и за рубежом в курсах «Экологическая физиология и биохимия», «Водная токсикология» и «Water Pollution and Fish Physiology».

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В плазме (сьюоротке) крови и печени пресноводных костистых рыб из сем. Cyprinidae наряду с АХЭ (КФ 3.1.1.7) присутствует БуХЭ (КФ 3.1.1.8), удельная активность которой преобладает в общей активности ХЭ и ее уровень коррелирует с уровнем активности АХЭ в мозге.

2. АХЭ и БуХЭ рыб по ряду каталитических свойств отличаются от «типичных» АХЭ и БуХЭ млекопитающих.

3. Существуют закономерные сезонные, межвидовые и межсемейственные различия в активности АХЭ и БуХЭ в тканях пресноводных костистых рыб

4. Ингибирование и восстановление активности АХЭ и БуХЭ является важным симптомом токсического действия ФОС на рыб, однако устойчивость рыб к этим токсикантам связана не только с угнетением ХЭ, но обусловлена и другими биохимическими и физиологическими факторами (поступление ФОС в организм и мощностью детоксикационных ферментных систем печени).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты и положения работы доложены на: Всесоюзной конференции по водной токсикологии (Юрмала, 1982); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы рыбохозяйственных исследований внутренних водоемов Северо-Запада Европейской части СССР» (Петрозаводск, 1984); Советско-американском симпозиуме «Проблемы водной токсикологии, биотестирования и управления качеством воды» (Борок, 1984); I Всесоюзном симпозиуме по чувствительности и устойчивости гидробионтов к токсикантам (Батуми, 1985); VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Вильнюс, 1985); 9-ом совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986); USA-USSR Symposium «Fate and effects of pollutants on aquatic organisms and ecosystems» (Athens, USA, 1987); 1-ом Всесоюзном симпозиуме «Методы ихтио-токсикологических исследований» (Ленинград, 1987); Всесоюзном совещании «Поведение рыб» (Москва, 1989); VII Всесоюзной конференции «Экологическая физиология и биохимия рыб» (Ярославль, 1989); Международной конференции «Методы исследования и использования гидроэкосистем» (Рига, 1991); II Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (С.-Петербург, 1991); VIII Научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992); VIII Congress of European Ichthyology Society «Fishes and their environment» (Ovideo, Spain,1994); Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Петрозаводск, 1995); 17 SETAC Annual Meeting (Washington, USA, 1996); 18 SETAC

Annual Meeting. (San Francisco, USA, 1997); Симпозиуме по возрастной и экологической физиологии рыб (Борок, 1998); Международной молодежной школе «Биоиндикация-98» (Петрозаводск, 1998); Конференции «Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре» (Москва, 2000); Конференции «Озера холодных регионов» (Якутск, 2000); Научно-практической конференции «Проблемы биологии, химии, экологии и экологического образования» (Ярославль, 2001); Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002); III (XXVI) Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Сыктывкар, 2003).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликованы 58 печатных работ (28 статей и 30 тезисов докладов)

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертация изложена на 305 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 218 отечественных и 338 иностранных источников. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 36 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чуйко, Григорий Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенной работы обобщены результаты различных исследователей, накопленные за 60 летний период изучения ХЭ рыб в целом, и получены новые оригинальные данные о различных аспектах функционирования этих ферментах у пресноводных костистых рыб (Teleostei), представляющих 19 видов из 5 наиболее распространенных семейств, обитающих и Рыбинском водохранилище и имеющих широкое распространение в водоемах Северо-запада европейской части России.

Основное внимание было направлено на идентификацию типов ХЭ у пресноводных костистых рыб, изучение их каталитических свойств, видоспецифичности органо-тканевого распределения и некоторые прикладные аспекты. В результате были установлены типы ХЭ у разных представителей пресноводных костистых рыб и проведено сравнение их по каталитическим свойствам с типичными ХЭ млекопитающих; исследованы межвидовые и межсемейственные особенности в органо-тканевом распределении разных типов ХЭ и в уровнях их активности; изучены изменения активности АХЭ мозга при стрессе, индуцированном адреналином; установлены пределы биологической вариабельности и определены уровни нормальной активности ХЭ в разные сезоны годового цикла; оценено участие холинергической нервной системы и роль АХЭ мозга в формировании пищевого поведения рыб в норме и при хроническом отравлении ФОС; показана роль ХЭ и других физиолого-биохимических факторов в различной видовой устойчивости рыб к острому токсическому действию ФОС.

В результате работы установлено, что гомогенаты мозга всех исследованных рыб не зависимо от семейства и вида способны гидролизовать АТХ и практически не разрушают БуТХ, что подтверждает полученные ранее данные о существенном преобладании в мозгу рыб АХЭ. В печени, селезенке и плазме активность в отношении этих субстратов зависит как от вида, так и от семейства. У представителей большинства исследованных видов с различной интенсивностью гидролизуются оба субстрата. У карпа и 70% особей леща (ceM.Cyprinidae) в печени, у щуки (ceM.Esocidae) в печени и селезенке, у карася и линя (ceM.Cyprinidae) и всех видов ceM.Percidae в селезенке БуТХ практически не разрушается или разрушается с очень низкой скоростью. В плазме оба субстрата гидролизуются лишь у части представителей ceM.Cyprinidae, а у другой части видов этого семейства и представителей остальных исследованных семейств - только АТХ. Гидролиз обоих субстратов предполагает наличие в исследованных тканях у этих видов рыб либо АХЭ и БуХЭ, либо одной нетипичной ХЭ.

Более детальное исследование ферментов плазмы крови пресноводных костистых рыб с использование методов электрофореза в ПААГ и субстратно-ингибиторного анализа позволило выявить присутствие в ней трех типов эстераз: неспецифическая КЭ и более специализированные АХЭ и БуХЭ. Наличие БуХЭ в сыворотке пресноводных костистых рыб описано впервые. Ранее считалось, что в эволюционном ряду позвоночных он появляется у представителей пресмыкающихся. Вместе с тем показано, что эстеразный спектр у исследованных видов рыб имеет различия. Все из них обнаруживают КЭ и АХЭ, а БуХЭ выявлена лишь у трех представителей сем. Cyprinidae: плотвы, синца и леща, хотя у последнего только 30-40% обладают этим типом ХЭ. На основании гетерогенности ХЭ выделено два фенотипа леща: фенотип Б, в сыворотке которого присутствует АХЭ и БуХЭ, и фенотип А, для которого характерно наличие только АХЭ. У карпа (сем. Cyprinidae), окуня (ceM.Percidae), щуки (сем. Esocidae) и налима (сем. Lotidae) БуХЭ не обнаружена.

Изучение ингибирования ХЭ мозга и плазмы (сыворотки) крови рыб при действии ДДВФ in vitro показало, что чувствительность аналогичных типов ферментов в этих тканях одинакова. Обнаружено, что АХЭ по чувствительности к этому ингибитору практически мало отличается от чувствительности АХЭ млекопитающих. В то же время, чувствительность БуХЭ рыб выше более чем в 1000 раз по сравнению с АХЭ и более чем в 100 раз - по сравнению с БуХЭ млекопитающих.

На основании выявленных различий проведено сравнение селективности ДЦВФ и другого ФОС изо-ОМФА, широко известного своей избирательностью к типичной БуХЭ из сыворотки лошади. Установлено, что оба ингибитора избирательно действуют как на БуХЭ плотвы, так и лошади по сравнению с АХЭ плотвы и эритроцитов быка. Степень избирательности для них соответственно составляет 2000 и 80 раз. При этом диапазоны эффективных концентраций ДЦВФ для АХЭ быка и БуХЭ лошади перекрываются, а для ферментов плотвы нет. Аналогичная закономерность выявлена при действии изо-ОМФА. Однако ДЦВФ обладает большей ингибирующей способностью и избирательностью в отношении БуХЭ плотвы, чем изо-ОМФА. Это дает возможность использовать ДЦВФ как новый селективный ингибитор для раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ в тканях рыб.

Использование ДЦВФ позволило обнаружить, что в плазме (сыворотке) крови рыб из сем. Сурпшс1ае, у которых методом электрофореза установлено наличие двух типов ХЭ, активность БуХЭ преобладает над активностью АХЭ и ее доля в общей активности ХЭ составляет в зависимости от вида 83-96%.

В результате кинетического анализа показано, что АХЭ и БуХЭ исследованных рыб наряду с общими свойствами, характерным для типичных ХЭ, имеют и отличительные особенности. Для АХЭ рыб это - более высокая относительная скорость гидролиза и повышенное сродство к ПрТХ, для БуХЭ - к МеТХ по сравнению с типичными ХЭ. Последнее указывает на необходимость более осторожной трактовки результатов, получаемых при использовании МеТХ, как специфического субстрата для идентификации АХЭ рыб и выявления ее локализации при гистохимическом определении.

Сравнительное исследование 16 видов пресноводных костистых рыб, принадлежащих к четырем семействам (Сурпшс1ае, Регс1(1ае, Езос1ёае, Ьойёае), выявило между ними межвидовые и межсемейственные различия в активности АХЭ и БуХЭ в мозге и плазме. Активность АХЭ в мозге варьирует между видами 15-кратно от 138 до 2011 мкмоль/г/ч. Все исследованные представители сем. Сурпшёае имеют более высокую активность АХЭ в мозге, чем представители трех других семейств: Евоаёае, Реплёае и Ьойёае . В плазме рыб активность АХЭ в среднем в 100 раз ниже, чем в мозге и варьирует среди видов от 1.2 1о 18.6 мкмоль/мл/ч. Активность БуХЭ в плазме присутствует только у видов, представляющих сем. Сурпшёае, за исключением карпа, карася, линя и чехони. У остальных представителей этого семейства ее значения лежат в пределах от 26 1:о 1083 мкмол/мл/ч. В целом уровень активности БуХЭ в плазме прямо коррелирует с активностью АХЭ в мозге и плазме рыб, что вероятнее всего связано с общим холинергическим статусом организма.

Показано, что повышение уровня адреналина в организме рыб, известного стресс-гормона, оказывает влияние на активность АХЭ в мозге рыб. Изменения активности АХЭ происходит на фоне гипергликемии, свидетельствующей о стрессорной природе этих изменений. Выявленные изменения активности АХЭ наблюдаются в среднем и промежуточном отделах мозга и носят двухфазный характер: первоначальное краткосрочное снижение и последующее стойкое увеличении относительно контрольного уровня, сохраняющееся не менее 3 суток. Из этого следует, что любой стрессирующий фактор, повышающий уровень адреналина, способен приводить к изменениям активности АХЭ в мозге рыб. Следует считать, что изменения активности АХЭ в мозге рыб являются одним из элементов вторичного стресс-ответа у рыб.

Исследование активности АХЭ в среднем и промежуточном отделах мозга окуня в течение нескольких лет выявило закономерную сезонную цикличность ее изменений в течение года, связанную в целом с цикличностью изменений температуры окружающей воды: летом активность фермента выше, чем зимой. Связь активности фермента с температурой подтверждается в лабораторных условиях при длительной адаптации рыб к разным температурам. Однако в природных условиях максимальный уровень активности АХЭ не связан с наивысшими значениями температуры воды в водоеме, а наблюдается в конце весны в период нереста рыб и отличается от минимального, наблюдаемого зимой, в 2 раза. Выявленный подъем активности АХЭ в этот период обусловлен, скорее всего, изменением гормонального статуса рыб и носит стрессорный характер. Величина активности фермента не зависит от пола, но имеет слабую обратно пропорциональную зависимость от длины тела и веса мозга. В основе сезонных изменений активности АХЭ мозга окуня лежат как эндогенные причины, так и температурный фактор окружающей среды.

Сходный сезонный характер цикличности изменений активности обнаружен для АХЭ в целом мозге, плазме, селезенке и печени плотвы, а также для БуХЭ в этих органах. Низкие значения показателей наблюдаются зимой, высокие - летом. Полученные данные позволяют косвенно заключить, что в плазме и печени в летне-осенний и зимне-весенний периоды происходит перераспределение доли активности БуХЭ и АХЭ в общей активности ХЭ, в селезенке - нет. В период созревания половых продуктов и подготовки рыб к нересту во всех рассмотренных органах наблюдается увеличение активности ХЭ.

Сезонные колебания удельной активности ХЭ в плазме плотвы связаны с динамикой содержания в ней белка и, вероятно, обусловлены изменениями объема самой плазмы. Между удельной активностью ХЭ печени в течение годового цикла и массой органа существует достоверная обратная корреляция. Однако достоверной связи между удельной активностью ХЭ и массой селезенки не обнаружено. Активность АХЭ в мозге плотвы в течение года прямо пропорциональна содержанию в нем водорастворимого белка. Пол, и размер рыб не оказывают заметного влияния на сезонную динамику активности ХЭ в рассмотренных тканях плотвы.

При сублетальном хроническом действии ДДВФ на молодь леща снижается количество потребляемого ею корма и подавляется активность АХЭ мозга. Внутрибрюшинное введение холинергических препаратов с антидотным действием, атропина и ТНБ-4, приводит к восстановлению количества потребляемого корма, что свидетельствует об участии холинергической системы в процессе, контролирующем питание рыб. В основе нарушения пищевого поведения леща лежит ингибирование активности АХЭ в мозге, что подтверждается реактивацией активности АХЭ при введении ТНБ-4. В отличие от млекопитающих у леща ТНБ-4 хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер и оказывает центральное действие.

При интоксикации хлорофосом независимо от силы токсического воздействия (острая интоксикация, периодическое воздействие МПК) массовая гибель окуня наступает при снижении активности АХЭ на 60-80% от уровня контроля. Единичные особи погибают при уровне активности фермента 50%. Хлорофос обладает суммирующимся эффектом действия. При периодическом воздействии МПК гибель рыб наступает при суммарном количестве, меньшем, чем в остром опыте. При определении активности АХЭ в токсикологических исследованиях, необходимо стандартизировать условия отбора, хранения и анализа проб, так как у рыб, остающихся после гибели в токсической среде, активность фермента продолжает снижаться. Кроме того, во время хранения гомогенатов возможна частичная реактивация или дополнительное угнетение активности АХЭ.

Симптомокомплекс острого отравления рыб ФОС независимо от силы токсического воздействия включает в себя следующие стадии: состояние повышенной возбудимости, нарушение координации движения, потеря рефлекса равновесия, потеря чувствительности, гибель рыб. Начальные этапы интоксикации вплоть до стадии потери рефлекса равновесия высоко обратимы. На стадии потери чувствительности обратимость составляет 50%. Интоксикация рыб ФОС сопровождается угнетением активности АХЭ мозга, степень которого зависит от силы и продолжительности токсического воздействия. Снижение активности АХЭ в мозге при контакте рыб с ФОС происходит значительно быстрее, чем ее восстановления после перемещения рыб в чистую воду. Продолжительность восстановления активности АХЭ прямо пропорциональна степени ее снижения. В процессе восстановления активности АХЭ мозга рыб выделяется два этапа. Первый этап, сразу после прекращения контакта с токсикантом, характеризуется высокой скоростью восстановления активности фермента и продолжается несколько часов. На втором этапе, который наступает через сутки и может длиться 10-20 дней, скорость восстановления активности АХЭ в десятки раз ниже. В процессе реабилитации рыб в чистой воде после прекращения действия ФОС внешние симптомы отравления исчезают значительно раньше, чем восстанавливается активность АХЭ. К моменту исчезновения внешних симптомов отравления активность АХЭ мозга составляет в среднем 45% от контрольного уровня не зависимо от концентрации токсиканта и продолжительности токсического действия.

При сублетальном одноразовом воздействии сверхмалых концентраций ДЦВФ (1/100 ЛК50 за 48ч) на плотву происходит снижение активности ХЭ в ее органах. Наиболее существенно снижение БуХЭ в плазме, менее - АХЭ в мозге. В плазме активность БуХ остается пониженной не менее 45 суток, тогда как ее уровень в печени, а также активность АХЭ в остальных исследованных органах достаточно быстро восстанавливается до контрольных значений и даже превышает его, демонстрируя компенсаторную реакцию. Активность БуХЭ в плазме рыб является более чувствительным показателем присутствия в воде ДЦВФ, чем активность АХЭ в мозге.

Установлено, что окунь и карп различаются по устойчивости к острому летальному действию ДДВФ в несколько десятков раз. При этом чувствительность АХЭ в мозге рыб к действию ингибитора in vitro не играет заметной роли в механизмах формирования видовой избирательности токсиканта. Некоторое значение, видимо, имеет более высокая активность АХЭ в мозге карпа по сравнению с окунем. Однако основные причины этого феномена - межвидовые различия в скорости поступления ФОС в организм рыб и эффективности их детоксикации в печени. Последняя определяется как более высокой скоростью разрушения ДДВФ в печени карпа, так и большей относительной массой самого органа. Наличие БуХЭ или ее отсутствие в крови леща не приводит к изменению его устойчивости к острому летальному действию ДДВФ, что указывает на низкую значимость этого фермента в повышенной устотйчивости рыб при данных условиях экспозиции.