Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНО-БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗ ПРЕСНОВОДНЫХ КОСТИСТЫХ РЫБ БАССЕЙНА РЫБИНСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНО-БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗ ПРЕСНОВОДНЫХ КОСТИСТЫХ РЫБ БАССЕЙНА РЫБИНСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА"

Л ЗЗУЯ?

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ИМ. И.М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ЧУЙКО ГРИГОРИЙ МИХАЙЛОВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНО-БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗ ПРЕСНОВОДНЫХ КОСТИСТЫХ РЫБ БАССЕЙНА РЫБИНСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 2004

Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им.И.Д.Папанина РАН, Борок

Научный консультант

Доктор биологических наук,

профессор М.Н.Маслова

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор В.Б. Долго-Сабуров

Доктор медицинских наук, профессор С.С. Михайлов

Доктор биологических наук, профессор ЕБ. Розенгарт

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный Университет (Кафедра биохимии), Университетская набережная, 7/8

Зашита состоится 2004 г. в 11 часов на заседании

специализированного диссертационного Совета Д 002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН

(194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44)

С диссертаций >;о>';:»!-. оік^.чвмяться м научі м лблиотеке Института эволюционнойфизм~--огии >і бї'.і. шч»: И.М. с*.-, чова

Автореферат .ж-ійі' " ___"і г.

Ученый секре "і ,,■¡.■і-рг.і! " ^Совел V?

доктор биологическим наук,; ";«сор /У ^ М.Н.Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение биоразнообразия и эволюции кинетических свойств ферментов и функций, выполняемых ими в организме - одна из основополагающих проблем современной биохимии и биологии в целом. Для решения этой проблемы необходимы сравнительные исследования ферментов у широкого круга живых организмов из разных филогенетических групп.

Холинэстеразы (ХЭ) - ферменты, широко распространенные в живой природе от микроорганизмов и простейших одноклеточных организмов до позвоночных, включая человека. Выделяют два основных типа ХЭ: ацетил х ол инэстераза (ацеталхолин ацетил пшролаза, АХЭ; К.Ф. ЗЛ.1.7) и холинэстераза (ацилхолин ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.8). К последнему типу относится наиболее часто встречаемая бутирилхолинэстераза (БуХЭ). ХЭ участвуют в различных физиологических процессах, но функциональное значение установлено только для АХЭ: она играет ведущую роль в механизме транедукции нервного импульса в холинергических синапсах животных, пшролизуя медиатор ацетилхолин (АХ). Роль БуХЭ до сих пор остается неясной. Особенностью ХЭ является их способность взаимодействовать с фосфорорганическими (ФОС) и карбаматными (КС) соединениями, что приводит к необратимому инпибированию их активности. Икгнбирование АХЭ нервной системы животных блокирует проведение нервного импульса и вызывает нарушение нормального функционирования организма, приводя в конечном итоге к его гибели (О'Брайи, I960; Голиков, Розенгарт, 1964). Этот феномен нашел широкое применение в практическом использовании ФОС и КС в качестве пестицидов, боевых отравляющих веществ и лекарственных препаратов (Розенгарт, Шерстобитов, 1978; Chambers, Levi, 1992), а также в использовании ХЭ как биомаркеров действия этих соединений на разные виды животных (Minneau, 1991; Huggett et al,, 1992), Наиболее полно к настоящему времени изучены АХЭ эритроцитов и мозга человека и крупного рогатого скота, а также БуХЭ сыворотки (плазмы) крови человека и лошади. Эти ферменты принято считать «типичными», ХЭ других организмов изучены недостаточно, хотя они могут заметно отличаться по свойствам от «типичных» АХЭ и БуХЭ (Бресткин и др., 1997).

Данные о ХЭ пресноводных костистых рыб носят ограниченный характер и получены в основном зарубежными исследователями на незначительном числе нехарактерных для ихтиофауны Европейской части России видов. Детальные исследования по идентификации типов ХЭ среди

ЦНБ МСХА

широкого ряда видов пресноводных костистых рыб, изучению их кинетических свойств, межвидовых различий в активности и распределению в органах до сих пор не проводились. В связи с этим до последнего времени преобладает мнение, что в организме рыб доминирует АХЭ, а БуХЭ, если и присутствует, то в очень небольших количествах (Augustmsson, 1958, 1959, 1961; Hogan, 1971; Брик, 1969; Brestkin et al., 1973; Hobden, Klaverkamp, 1977; Бресткин и zip., 1997). Практически отсутствуют данные о сезонной динамике ХЭ, об их участии в таких биологически важных процессах, как питание, нерест, стресс. С момента обнаружения АХЭ в мозге рыб (Mendel, Rudney, 1943) исследования связаны, главным образом, с возможностью ее использования как биомаркера действия ФОС и КС (Weiss 1958, 1961, 1965; Coppage, Matthews, 1974; Гантверг, Перевозников, 1983; Zinkl et al., 1991). Тем не менее, до сих пор имеется мало данных о динамике восстановления активности ХЭ in vivo, особенно после хронического действия низких концентраций ангихолинэстеразных соединений. Единичны исследования роли ХЭ в механизмах межвидовых различий в устойчивости рыб к ФОС.

Цель и задачи исследования: идентификация типов ХЭ у пресноводных костистых рыб, изучение? их каталитических свойств, видоспецифюшостн органо-тканевого распределения и некоторых прикладных аспектов (роль в физиологических процессах и варьирование активности при действии биологических и антропогенных факторов окружающей среды).

Соответственно цели были определены задачи работы:

1. Охарактеризовать типы ХЭ у разных представителей пресноводных костистых рыб и сравнить нх по каталитическим свойствам с типичными ХЭ млекопитающих.

2. Исследовать межвидовые и межсемейственные особенности в органо-тканевом распределен«» разных типов ХЭ и в уровнях их активности у пресноводных костистых рыб.

3. Изучить изменения активности • АХЭ мозга при стрессе, индуцированном адреналином.

4. Установить пределы биологической вариабельности и определить уровни нормальной активности ХЭ в разные сезоны года.

5. Оценить участие холинергической нервной системы и роль АХЭ мозга в формировании пищевого поведения рыб в норме и при хроническом отравлении ФОС.

6. Выявить роль ХЭ и других физиолого-биохимических факторов в

межвидовых различиях устойчивости рыб к острому токсическому действию ФОС.

Научная новизна. Обобщены исследования ХЭ пресноводных костистых рыб. Впервые в плазме пресноводных костистых рыб сем, Cyprinidac обнаружена БуХЭ, описаны ее каталитические свойства и распределение в различных органах, показаны сходство и отличия от ЛХЭ рыб и ЛХЭ и БуХЭ млекопитающих. Выявлены различия между видами и семействами рыб по уровню активности БуХЭ в плазме и печени. Показано, что у лсша Abramis brama п отличии от других представителей сем. Cyprinidac БуХЭ в плазме присутствует лишь у 30% особей. Впервые установлены устойчивые различия в активности АХЭ мозга не только между отдельными видами, но и среди представителей разных семейств пресноводных костистых рыб, а также выявлена корреляция между активностью ЛХЭ в мозге и БуХЭ в плазме. Впервые определен нормальный диапазон варьирования активности ЛХЭ и БуХЭ в органах широкого ряда пресноводных костистых рыб, принадлежащих к нескольким семействам. Продемонстрировано, что сезонные изменения активности АХЭ мозга рыб связаны не только с температурой окружающей среды, как у других пойкилотермных животных, но и с их биологическим репродуктивным циклом. Впервые показано участие холннергической системы и АХЭ в мозге при формировании пищевого поведения у рыб и установлен один из механизмов действия антнхолиюстеразных соединений на пищевое поведение рыб при хронической интоксикации ФОС. Впервые для рыб выявлено увеличение активности ЛХЭ в мозге при остром стрессе. Показано, что динамика активности ЛХЭ в мозге рыб ш vivo при хроническом действии и после его прекращения веществ различной природы неантихолинэстеразного действия имеет стрессорный характер. Проанализирована взаимосвязь уровня активности АХЭ мозга и симптом о комплекса отравления и реабилитации при остром и хроническом действии ФОС на рыб. Впервые установлено, что чувствительность АХЭ и БуХЭ рыб к действию ФОС ш vitro не является фактором, определяющим межвидовые различия в токсикорезнстептности рыб; разная скорость проникновения ФОС в организм и интенсивность их детоксикации играют основную роль в этом процессе.

t h учи о-практическая значимость работы, На основании анализа и обобщения литературных данных и результатов собственных исследований ланы практические рекомендации по использованию ХЭ пресноводных

костистых рыб для оценки антропогенного загрязнения вол пых объектов ФОС к КС. При выполнении работы разработаны методы: энзиматического определения ФОС в воде (получено авторское свидетельство SU №1359741 от 15.08.87, ГК НО СССР); определения эффективных концентраций в токсикологических опытах; определения ДДВФ в крови и печени рыб с использованием ГЖХ с электропно-захпатиым детектором (ЭЗД); метод раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ в тканях рыб с . использованием селективного фосфорор ганического ингибитора ДДВФ, Материалы диссертации нашли практическое применение при обучении студентов в ряде Университетов в России и за рубежом d курсах «Экологическая физиология и биохимия», «Водная токсикология» и «Water Pollution and Fish Physiology».

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В плазме (сыворотке) крови и печени пресноводных костистых рыб id сем. Cyprinidae наряду с АХЭ (КФ 3.1.1.7) присутствует БуХЭ (КФ 3.1.1.8), удельная активность которой преобладает в обшей активиости ХЭ и ее уровень коррелирует с уровнем активности АХЭ в мозге.

2. ЛХЭ и БуХЭ рыб по ряду каталитических свойств отличаются от «типичных» АХЭ и БуХЭ млекошгтаютих.

3. Существуют закономерные сезонные, межвидовые и межсемейственные различия в активности ЛХЭ и БуХЭ в тканях пресноводных костистых рыб

4. Ннгибированис и восстановление активиости ЛХЭ и БуХЭ является важным симптомом токсического действия ФОС на рыб, однако устойчивость рыб к этим токсикантам связана не только с угнетением ХЭ, но обусловлена и другими биохимическими и физиологическими факторами (поступление ФОС в организм и мощностью детокс11кационных. ферментных систем печени).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты и положения работм доложены на: Всесоюзной конференции по водной токсикологии (Юрмала, 19S2); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы рыбохозяйственных исследований внутренних водоемов Северо-Запада Европейской части СССР» (Петрозаводск, 1984); Советско-американском симпозиуме «Проблемы водной токсикологии, бнотест кропания и управления качеством воды» (Борок, 1984); 1 Всесоюзном симпозиуме по чувствительности и устойчивости гидробионтов к токсикантам (Батуми, 1985); VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии и

биохимии рыб (Вильнюс, 1985); 9-ом совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986); USA-USSR Symposium <(Fate and effects of pollutants on aquatic organisms and ecosystems)-» (Athens, USA, 1987); 1-ом Всесоюзном симпозиуме «Методы ихтио-то ксиколо гичес ких исследований» (Ленинград, 1987); Всесоюзном'совещании «Поведение рыб» (Москва, 1989); VII Всесоюзной конференции «Экологическая физиология и биохимия рыб» (Ярославль, 1989); Международной конференции ((Методы исследования и использования гидроэкосистем» (Рига, 1991); II Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (С.-Петербург, 1991); VIII Научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992); VIII Confess of European Ichthyology Society «Fishes and their environment» (Ovideo, Spain, 1994); Международной конференции «Биологические ресурсы Вел ого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Петрозаподск, 1995); 17 SETAC Annual Meeting (Washington, USA, 1996); 18 SETAC Annual Meeting. (San Francisco, USA, 1997); Симпозиуме no иозраслюй и экологической физиологии рыб (Борох, 1998); Международной молодежной школе «Бнолндикацкя-98» (Петрозаводск, 199S); Конференции «Проблемы охраны здоровья рыб в ахвакультуре» (Москва, 2000); Конференции «Озера холодных регионов» (Якутск, 2000); Научно-практической конференции «Проблемы биологии, химии, экологии и э колот чес кого образования» (Ярославль, 2001); Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок,

2002); 111 (XXVI) Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Сыктывкар,

2003).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликованы 58 печатных работ (28 статей и 30 тезисов докладов)

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Дисссрта(шя изложена на 2Ä3страницам машинописного текста и состоит in введения, обзора литературы, опнезшю методов и материалов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ■f£0 отечественных и О.'Ь'Ь иностранных источников. Работа иллюстрирована з5"та®лииачи и З/З рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Исследование проведено'на 20 вшах из б наиболее распространенных семейств пресноводных костистых рыб (Тс1еоз1с1), обитающих в бассейне Рыбинского водохранилища (Табл. 1),

Таблица 1,

Классификация исследованных видов рыб

Отряд I. Salmoniformes - лососеобразные П/отр. Salmoidei — лососсвидиые Се.м. Coregonidae - сиговые

Coregonus albula - европейская ряпушка П/отр, Esocoidei — щукошщиые -Сели Esocídae - щуновые

Esox lucios - обыкновенная щука Отряд II. Сvprinoformes — карпообразные Сем. Cyprinidae - карповые П/сем, Leuciscinae

Abramis ballerus - синец Abramis brama - лещ Albumus albumus - уклейка Aspíus aspius - жерех Blicca bjoerkna - густера Leuciscus idus - язь Leuciscus leuciscus - елец Pelecus cultntus - чехонь Rutilus rutilus- плотва П/сем. Cyprininae

Carassius carassius — карась Cyprinus carpió — карл П/сем, Tinciiiae

Tinca tinca - линь Ce.ib Balitorídae- балиторовые

Baibatula barbatitla - усатый голец Отряд Ш. Gasiformes - трескообразные Сем. Lotltiae- налимоше Lota lota-налим Отвяя ГУ. Periformes — окунеобразные Сем. Percldae — окуневые

GyrPnochephalus cemuus — обыкновенный ерш Perca fluviatilis - речной окунь Stisostedion lucioperca - обыкновенный судак Stisostedion volgense - волжский судак, берш

Рыб отлавливали круглогодично по всей акватории Рыбинского водохранилище (58о30'С.Ш., 38°30'В.Д,) и его притоках ставными сетями, не подом, тралом или удочкой. Часть рыб выращивалась на экспериментальной прудовой базе ИБВВ РАН. Место и орудия лова, возраст и морфометрические характеристики варьировали в зависимости от вида рыбы и решаемых задач. Для работы брали визуально здоровых рыб без паразитов. После отлова их либо доставляли в лабораторию для проведения экспериментов in vivo, либо у них сразу брали кровь, мозг, печень и селезенку с целью последующей обработки в лаборатории и полготовки проб для биохимического анализа in vitro. Всего в различных экспериметгтах было исследовано более 5000 экземпляров.

Из крови получали сыворотку и плазму, а органы отпрепаровывали и взвешивали. Подготовленные таким образом пробы помешали в герметично закрывающиеся пластиковые контейнеры объемом 1.5-5;мл и хранили при температуре -18-20°С до анализа. Перед анализом органы гомогенизировали и использовали суперкатант.. Ряд исследований выполнен на частично очнщенных комерческих препаратах АХЭ эритроцитов человека и БуХЭ сыворотки крови лошади.

Методы исследования

1. Спектрофотометрическое определение ХЭ тиохолиновым методом Эллмана (ЕНшап et al., 1961), содержания белка методом Лоурн (Lowry et al., 1951) или Брэдфорд (Bradford, 1976) и глюкозы стандартным о-юл>1шиновым методом.

2. Электрофоретнческое разделение белков в ПААГ (Гааль и др., 1982) с последующим выявлением ферментативной активности тиохолиновым матодом (Karnovsky, Roots, 1964).

3. Метод субстратно-ингибигорного анализа для идентификации типов эстераз и исследования их свойств (Бресткин и др., 1997).

4. Определение бимолекулярной константы скорости ингибпрования к: и обратного логарифма концентрации ингибитора, вызывающего снижение активности фермента на 50%, р!30 (Яковлев, 1965).

5. Раздельное определение активности АХЭ и БуХЭ с использованием селективных ингибиторов (Fairbrother et al., 1991; Чуйко и др., 2002),

6. Определение основных кинетических констант гидролиза субстратов (константы Михаэлиса Кщ, максимальной скорости V^, оптимальной концентрации субстрата S^ (Диксон, Уэбб, 1982).,

7. Метод газо-хроматографтпеского определения ДДВФ в крови и печени в собственной модификации (Чуйко, 1987).

S, Определение летальных концентраций/доз {ЛК5а/ЛДзо) в токсикологических экспериментах методом пробст-анализа (Беленький, 1963) и собственным методом "одной точки" (Frumin et al., 1992).

9. Проведение хронических токсикологических экспериментов в проточных условиях с использованием дилюторной установки для полдержания постоянной концентрации токсикантов в воде (Виноградов и Тагуиов, 1989).

10. Изучение пищевого поведения рыб с использованием оригинальной экспериментальной установки, имитирующей природные условия добычи корма (Pavlov et al., 1994; Gerasimov, 1996).

11. Инъекции фармакологически активных веществ: ингнбигора ХЭ ДДВФ и их рсактиватора ТМБ-4, холннолитика атропина, а также адреналина для индукции стресс-реашти (Pavlov et al„ 1992).

Результаты обрабатывались статистически на ПК с использованием пакета прикладных программ STATGRAPHÏCS Plus 2.1 и Excell 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

И с следование скорости гидролиза АТХ и BvTX в тканях рыб. Результаты представлены в табл.2. Активность в отношении АТХ, гндролизуемого обоими типами ХЭ, и БуТХ, гндролизуемого только БуХЭ, различается как между вилами рыб, так и между исследованными органами. Наибольшей холинэстеразной активностью обладает мозг рыб, где скорость гидролиза АТХ у некоторых видов превышает 2000 мкмоль/г ткали/ч, в то время как гидролиз БуТХ практически отсутствует, не превышая 4% от уровня гидролиза АТХ. У карповых активность АХЭ в мозге достоверно выше, чем у щуковых, окуневых и нал им о вых. В плазме крови холинэстеразная активность несколько ниже, чем в мозге и достигает у карповых 1000 мкмоль/мл/ч при гидролизе БуТХ. Однако у ряда карповых (карп, карась, линь, чехонь) и всех представителей других изученных видов гидролиз этого субстрата не обнаруживается. Гидролиз АТХ хотя и выявляется, но по сравнению с БуТХ он идет менее интенсивно. В печени рыб холинэстеразная активность ниже, чем в плазме и не превышает 200 мкмоль/г ткани/ч при использовании АТХ. Гидролиз АТХ и БуТХ сопоставимы, хотя последний гидролизуется медленнее. У карповых холинэстеразная активность в целом выше, чем у представителей других семейств. В селезенке холинэстеразная активность самая низкая из исследованных органов и не достигает 50 мкмоль/г ткани/ч. Тенденции холинэстеразного гидролиза в печени такие же, как и в печени.

Таблица 2

Скорость гидролиза ЛТХ и БуТХ (мкмодь/ч на 1г ткани или 1 мл) гомогснатами мозга, печени, селезенки н плазмы крови исследованных видов рыб (х±шх)

ОмИПИП. РИД МО)Г печень селезенка плазма

ЛТХ АТХ БуТХ АТХ БуТХ АТХ БуТХ

Г'іпгіпіііае

Леи* 1140162®"* 69±7* 16ЇГ 12±1А* 6*1"" 3011г 8713г

56±3г"* <1 210.4 <1

Снмц 1054+57®* • 61*10" 1714" 20±1*г 18±2в ' 142117* 1083185*

ІІлоіва 2011187* 117±11®,г 4417*^* 2513®1 ІбіЗ®" 21916* 1074І20*

Гусята <ж±эь'í• 93±9Г 19±2' 28±1® 1311* 61 ±7* 483189®

Я»ь 10781130®* 44±3* 25±5*-г !5іГл 3715" 237142е

Уклейка 1156*87®* 24£1' 39±2® 811" 29*1* 289120* 975±26*

Жерех 1238447е 19019* 7016* 35±1* 6±1* 1414 26±7

Чсчокь 877162*'' 16313** 9ИД 43±4* 4±1* "і 6±1* <1

Карг 651*54" 511 <1 - бїі* <1

ІІЛЄЦ 661 ±26' 7±1* <1

Кэрзсь 70413А 12±1* 1311» <1 * 3±Г <1

Линь 8і6і9г 21±2 1512" 10±1ад <1 4±1** <1

}Чпгі[)ае

ІЦіка 691 ±38'-1 1,3±0.1" <1 26і2®* <1 511« <1

ІЧгсіїІае

Ок)Иь 214110* ЗОіЗ*-' 14і2гд ЗіГ <1 311* <1

С}зак 414133* 4Ю.51 2±1* 7±>" Ш» 1±1' <1

Еерш 2961І9' 8±0,3* 2*1" 23±1* 2x1* 211* <1

Ррга 256117"-1 134110®-' 42*2* 9±1***. <1 21.1* <1

1 ЩІ1І9Є

Нпич 138115" 5215^*-* 34±46-' 7±1* 311" 2±1"-] <1

Примечание: использованы иодиды соответствиютих тиохолиновых эфироп; значения с одинаковыми буквенными индексами внутри колонок достоверно не различаются при р=0.05, * гидролиз БуТХ в печени и плазме наблюдается у 30 % особей.

Полученные данные позволяют предположить, '(ТО у вссх видов исследованных рыб в тканях присутствует ЛХЭ, а у многих карповых еще н БуХЭ. Особенно ее присутствие высоко в плазме крови. Раннее факт гидролиза БуТХ был отмечен лишь у морских рыб в мышцах, в то время как у пресноводных видов - только гидролиз АТХ. Считалось, что ткани пресноводных рыб не содержат БуХЭ (Brestkin et al.t 1973; Бресткнн и др., 1997). Чтобы проверить высказанное предположение, было проведено электрофорстическое разделение белков сыворотки крови разных видов рыб и методом субстрат]ю-ингибиторного анализа идентифицировать типы ХЭ, включая родственные эстеразы.

Электрофорез в ПААГ сыворотку крови рыб и идентшЬикания типов ХЭ. Всего в сыворотке крови рыб выявлено 3 зоны эстеразной активности, обозначенные в соответствии с рекомендациями Международного биохимического союза по мере уменьшения их электрофоретичсской подвижности как эст1, эст2 и эсгЗ (Рис.1).

ОЭП

— Син«ц

0.07 1 __ _

оав

0.29 0.33

:

Плопц

Леш

Карп Окунь Щука Налим

ЭСтЗ

эст 2 ост 1

Рис. 1. Электрофореграммы эстераз эфиров карбоновых кислот сыворотки крови синца, плотвы, леща, карпа, окуня, щуки и налима.

ОЭИ - относительная электрофоретическая подвижность белковых фракций: эст 1, эст 2 и эст 3 - зоны эстеразной активности; А и Б — фенотипы.

Фракции зоны эст 1 у всех исследованных видов рыб активно проявляются в неспе пифических субстратах (а-нафтиланетат, а-

нафшллропнонат, Р-нафтил ацетат, 5-Сром - индо ксил ацетат), а в эфирах тиохолина лить в следовых количествах. Наибольшее сродство отмечается к а-наф I ил ацетату и 5-бром-шщоксилацетату ^Табл.З).

Таблица 3

Субстратная специфичность эстераз эфиров карбоповых кислот сыворотки крови сннца, плотвы, леща, карпа, окуня, щуки и налима

Субстрат Эстеразная зона

Эст 1 | Эст 2 ЭстЗ

ос-нафт ил ацетат + + -

5-бром-нндоксилаиетат -н- + -

анетилтиохолнн - -н- +++

ИрОШЮНІІЛТНО.ХОЛИН - ++

бут ир ИЛТИОХ 0 л и и +/- ++++ -

Примечание. Знак «4-» указывает на наличие гидролиза субстрата, а число знаков — на его относительную скорость;«-» субстрат не гидролтуется;«+/-» гидролиз очень слабый,

Использованные ингибиторы оказывают различное действие на фракшш зоны эст 1 (Табл.4).

Таблица 4

Чувствительность эстераз эфиров карбонових кислот сыворотки крови синца, плотвы, леща, карпа и окуня к ингибиторам

Ингибитор Эстеразнаязона

Эст 1 Эст 2 | Эст 3

эзерин хлорофос р-хлормеркурийбензоат -н- + ++ +++ ++'

Примечание. Знак «+» указывает на наличие эффекта ингнбирования и о і носі цельную интенсивность его проявления; «-» ингибирование отсутствует

Предварительное инкубирование гелей в растворах эзернна и р-хлормеркурийбензоата (ПХМБ) с концентрацией 10"4- 10"5 М не снижает интенсивность окрашивания фракций в субстратах (Рис.2), а хлорофос заметно ослабляет степень окраски: при концентрации 10"* М до 75 - 82% от уровня контроля, а при концентрации 10'1 М до 48-60% в зависимости от вила рыб (Рис. 3).

Рис. 2, Интенсивность окрашивания зон эстеразноп активности сыворотки рыб после инкубнцин с эзерином. а — синен, б — плотва, в — карп, г—лещ (фенотип Л), д- окунь

На основании этих результатов, а также, принимая во вниманне наиболее высокое m всех зон значенне ОЭП, фракции зоны эст 1 отнесены к КЭ (К.Ф. 3.1.1.1). Наличие КЭ в плазме и других органах костистых рыб отмечалось ранее многими авторами (Augustinsson, 1959, 1961; Ecobíchon, Israel 1967; Hart, Cook 1976; Chin, Sudderuddin 1979; Straus, Chambers 1995). "'* .

Рис.3. Интенсивность окрашивания зон эстеразной активности сыворотки рыб после инкубации с хлорофосом. Обозначения, как на рис,2

Фракция зоны эст 2 обладает значительно большим сродством к эфира м холи на. Причем наиболее интенсивно ока проявляется в БуТХ, а затем, по мере снижения субстратного сродства - в ПрТХ и АТХ (Табл. 3). В растворах эфнров нафтола и нндоксила степень ее окрзшивания наиболее 'слабая из всех исследованных субстратов. Избыточное содержание субстратов (101 М) не снижает интенсивность ее окраски. Использованные ингибиторы оказывают различное действие на фракцию (Табл. 4). При концентрации ПХМБ 10 М ннгнбируюшее действие на способность фракции гидролизовать субстраты отсутствует. Эзерин при концентрации 10 s М не снижает интенсивность окрашивания, а при концентрации 104 М наблюдается незначительное снижение окраски: не более чем до 88 % от уровня контроля (Рис.2). Хлорофос оказывает самое выраженное ингибируюшее действие: в зависимости от вида рыбы при его концентрации 10"6 М гилролизующая способность фракции снижается до 60-75 % от уровня контроля, при концентрации 10 М до 40-59% , а при концентрации 10"4 М ннгибируется полиостью (Рис.3.). Результаты субстратно-ингибиторного а нал i па и величина ОЭП дают основание предварительно идентифицировать фермент,'выявленный в зоне эст 2, как БуХЭ. Однако в отличие от типичных ХЭ она менее чувствительна к эзерину. Наличие БуХЭ в сыворотке рыб ранее исследователями не обнаруживалось (Augustinsson 1948, 1959, 1961; Chin, Suddeniddin 1979; Gaal et al. 1980). Однако в мышцах у морских и солоиоватоводных видах она присутствует, а у пресноводных - нет (Lundin 1962).

Фракции, локализующиеся в зоне эст 3, наиболее интенсивно выявляются при инкубации с АТХ, несколько слабее - с ПрТХ и совсем не обнаруживаются с БуТХ (Табл. 3). Избыток субстратов (10'1 М) снижает степень проявления окраски фракций. При инкубации с неснсцнфичсскими субстратами фракции не выявляются. Использованные ингибиторы по-разному действуют на зону эст 3 (Табл. 4). ПХМБ при концентрации 1 О*4 М не влияет на способность фракции гидролизовать субстраты. Эзерин при концентрации 10'5 М снижает эффективность гидролиза АТХ до 58-75% от уровня контроля, а при концентрации 10"* М 'до 38-45% (Рис,2). Хлорофос оказывает чуть менее выраженное ннгибируюшее действие (Рнс.З). В зависимости от вида рыбы при его концентрации 10"* М гидролизующая способность фракции не снижается и даже немного активируется, а при коннентрашш ЗО'5 М остается неизменной или составляет 88 % от уровня контроля. При концентрации 10'4 М она составляет 66-85% от контроля, при 10"J М - 40-53%, а при Ю'г М ннгибируется полностью; Результаты субстратно-ингибиторного анализа п величина ОЭП дают основание предварительно идентифицировать фермент, выявленный в зоне эст 3 как

ЛХЭ. Предполагается, что неспепифическая КЭ относится к более раннему этаиу биохимической эволюции эстераз в ряду позвоночных, чем БуХЭ, В пользу данного предположения свидетельствует тот факт, что КЭ встречается в высоких концентрациях у всех низших позвоночных, а у высших позвоночных в сыворотке крови в основном присутствует БуХЭ. Согласно данной гипотезе, эти два типа эстераз филогенетически связаны и БуХЭ является более специализированной формой КЭ. Считается, что их разделение произошло у рептилий, так как в плазме черепахи обнаружен фермент, обладающий свойствами КЭ и БуХЭ, являющийся промежуточным между этими эстеразамн (Augustinsson, 1961, 1972). Присутствие фермента типа БуХЭ в сыворотке крови синца, плотвы и леша даст основание думать, что эволюционное разделение КЭ и ХЭ произошло еше раньте: по крайней мере у костистых рыб.

Таким образом, в крови пресноводных костистых рыб установлено присутствие трех типов эстераз: неспецифическая КЭ и более специализированные АХЭ и БуХЭ. Однако эстеразный спектр у исследованных видов имеет различия. Все из них имеют КЭ и АХЭ, а БуХЭ выявлена лишь у трех представителей сем. Cyprinidae; плотвы, синца и лсша, хотя у последнего только 30-40% обладают этим типом ХЭ. На основании гетерогенности ХЭ выделено два фенотипа леща: фенотип Б, в сыворотке которого присутствует АХЭ и БуХЭ, и фенотип А, для которого характерно наличие* только АХЭ. У карпа (сем. Cyprinidae), окуня (ccM.Pcrcidae), щуки (сем. Esocidae) и налима (сем. Lotidae) БуХЭ не обнаружена.

Чувствительность ХЭ рыб к ингибируюшему действию ДДВФ in vitro. Опенка чувствительности ХЭ к действию in vitro различных ингибиторов, и в первую очередь ФОС, играет важную роль при сравнительной характеристике ферментов различного происхождения и локализации. При идентификации эстераз в сыворотке крови рыб бшю выявлено, что АХЭ и БуХЭ различаются по чувствительности к ФОС хлорофосу. Однако известно, что хлорофос сам по себе практически не способен ингмбнровать ХЭ и его антихолинэстеразное действие связано исключительно с продуктом слопанного гидролиза - ДДВФ (Розенгарт и др. 1978). В связи с этим была исследована чувствительность ЛХЭ и БуХЭ мозга и сыворотки рыб к ингибируюшему действию ДДВФ (Табл.5).

Величины констант скорости ингибирования к: для АХЭ мозга и сыворотки у всех исследованных видов имеют порядок 105 моль*1 л мин При этом большинство значений к2 не различаются достоверно или эти различия незначительны. Несколько более высокая чувствительность

отмечена для язя, уклейки (ccM.Cyprinidae), щуки (ccM.Esocidae) и ряпушки (ceM.Coregonidae). Величины кг для них варьируют п пределах ог 1.4x10* до 5.2х104 моль'1 л мин*1. Различия между видами, наиболее отстоящими но величине ки друг от друга (язь и густера) были лишь 17-кратными. В сыворотке и мозге чувствительность АХЭ к ДДВФ была одинаковой.

Таблица 5.

Бимолекулярные константы скорости ингибирования к? и значения pljo при действии ДДВФ in vitro на АХЭ мозга и БуХЭ сыворотки пресноводных костистых рыб

Семейство, вид АХЭ, 10 3 моль*1 л мин'1 БуХЭ, 107 моль"' л мин 1

Мозг Сыворотка Сыпоротка

СогееопМае

Ряпушка 16 ±1'* (6.0) - -

СурНпЕйае

Синец 5 ± Iй (5.4) - - 2.0 ±0.2' (9.1)

Плотва 6. ± 1Ъь (5.5) - - 1.1+0.1' (8.8)

Уклейка 27±51 (6.2) - - 2.5 ±0.1" (9.2)

Леш 4± (5.4) - - 1.8+ 0.3и (9.0)

Язь 52±7J (6.5) - - 1.0 ±0.1' (8.8)

Густера 3± 1' (5.3) - - 2.2 + 0. Г (9.1)

Карп 9± ]' (5.7) 8 ± Iй (5.7) отс отс

Регс{(1яе

Окунь б± 1« (5.5) 7 ± I" (5.6) ore отс

Судак 8± 1* (5.7) - - отс отс

Щука 14 ± I4 (5.9) 18 ±1' (6.0) отс отс

* представлены средние н ошибки средних (х ± ш„); число использованных рыб N=8; п скобках представлены значения р!;о, рассчитанные из уравнения (0.695/А/0. где ( - время

ингибирования, принятое за 40 мин.; во всей таблице значения с одинаковыми буквенными индексами не различаются достоверно (р<0.05, ЛКОУА, ЬЗО-тест); «-» величина к; не определена; «отс» БуХЭ отсутствует.

Полученные нами данные и результаты исследования других авторов свидетельствуют, что ЛХЭ, локализованная в мозгу и сыворотке (плазме)

крови каждого вида, практически идентична по чувствительности к ингибиторам iii vitro. Межвидовые различия в чувствительности также незначительны.

Чувствительность БуХЭ к ДДВФ была нами изучена на примере рыб m ссм. Cyprinidae, у которых этот фермент присутствует в плазме и его активность значительно преобладает над активностью АХЭ (Табл.5). Значения А* БуХЭ для ДДВФ у этих видов варьировали в очень узком диапазоне от 1 .Ох 107 до 2.5х107 моль''л мин"1. Из этого следует, что чувствительность БуХЭ сыворотки (плазмы) кропи более чем в 1000 раз выше по сравнению с АХЭ мозга и сыворотки крови рыб.

Сравнение чувствительности к ДДВФ холинэстераз рыб и млекопитающих показывает, что АХЭ у этих животных по данному показателю очень близки, в то время как чувствительность БуХЭ рыб на два порядка выше, чем БуХЭ млекопитающих. Так, значения к2 для АХЭ m эритроцитов человека, мозга мыши, быка и крысы варьируют от 3,5х105 до 4.5х10\ а БуХЭ сыворотки лошади равняются 3.9x10* моль"1 л мин*1 (Розенгарт и др., 19*78). Факт высокой чувствительности БуХЭ рыб к ДДВФ использован нами при разработка метода энзим этического определения ФОС в воде (Автор, свид. SUjVil359741 А1. 1987; Козловская и др., 1996), а ДДВФ предложен в качестве селективного ингибитора для раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ в тканях рыб, где они присутствуют совместно (ЧуГіко и др., 2002).

Таким образом, при изучении ингибировання ХЭ мозга и крови рыб ДДВФ установлено, что чувствительность аналогичных ферментов в этих тканях одинакова. Показано, что АХЭ по чувствительности к этому инги би юру практически мало отличается от чувствительности АХЭ млекопитающих. В то же время чувствительность БуХЭ рыб более чем в 1000 раз выше по сравнению с АХЭ и более чем в 100 раз - по сравнению с БуХЭ млекопитающих.

ДЛВФ как избирательный ингибитор для' раздельного определение активности АХЭ и БуХЭ рыб # -

Учитывая неодинаковую функциональную значимость разных типов ХЭ, часто. возникает необходимость раздельного определения их активности. Не смотря на различия между ними, это не всегда представляется легким, особенно при работе с неочищенными ферментами, когда приходится иметь дело со смесью обоих типов ХЭ, присутствующих в биологических тканях одновременно, например в плазме. Высокая чувствительность БуХЭ карповых рыб к ДДВФ предполагает его селективность по отношению к данному ферменту. Было

проведено более летальное сравнительное исследование степени ннгибнрованил АХЭ и БуХЭ плотвы в зависимости от концентрации ДДВФ (Рис. 4)

5 6 7 8 концентрация ДДВФ, ¿1

Рнс.4. Зависимость степени ингибирования активности ЛХЭ мозга и БуХЭ сыворотки крови плотвы от концентрации ДДВФ.

I - ЛХЭ, 2 - БуХЭ;-график «активность-концентрация»,----

график «степень ингибированмя - концентрация».

Полученные результаты показывают, что активность ЛХЭ плотвы угнеталась на 100% при концентрации ДДВФ 5x1 О*4 М (р! 3.6), а при концентрации Ю"7 М (р! 7.0) - она не отличалась от контроля. При этой же концентрации ингибитора гнлролизуюшая способность БуХЭ составляла 3%, а при концентрации 2.5x10'10 М (р! 9.6) инактивации фермента не наблюдалось. Из графиков следует, что диапазоны эффективных концентраций ДДВФ для АХЭ и БуХЭ плотвы не перекрываются и концентрации ингибитора Ю'МО'7 М могут быть рекомендованы для раздельного определения их активности в тканях плотвы. Рассчитанные из графиков «степень ингнбирования - концентрация ингибитора» значения рЬо ДДВФ и соответствующие им величины к> для АХЭ и БуХЭ равнялись соответственно 4.9 и 8.2, и 2 и 3700 х10: моль*1 л мин"1, а степень избирательности составила 1850 раз. Значения к; для БуХЭ плотвы оказались чуть выше тех, что показаны в табл.4. Однако выявленные различия* не противоречат друг другу-и объясняются качественной разницей ингибитора, В первом случае ДДВФ получен методом активации

хлорофоса, а во втором - использован коммерческий препарат. Вместе с тем известно, что антихолинэстеразное действие активированного ДДВФ на порядок выше, чем у синтезированного промышленным методом. Возможная причина — образование при активировании хлорофоса побочного продукта дипропил-2.2-дихлорвиннл фосфата, который по антихолинэстеразному действию в 100 раз эффективнее ДДВФ (Бресткин и др., 1997).

Поскольку ХЭ плотвы и других исследованных вщюв рыб по чувствительности к ДДВФ практически не отличаются (табл. 4), можно говорить в целом о селективности этого ингибитора для БуХЭ пресноводных костистых рыб.

Соотношение доли БуХЭ и АХЭ в общей активности ХЭ плазмы кропи карповых рыб. Принимая во внимание высокую селективность ДДВФ для БуХЭ рыб, с его использованием проведено раздельное определение активности АХЭ и БуХЭ в плазме у видов, где они при су I ствуют совместно: леще, синце, плотве, густере, язе, уклейке и жерехе (Табл.2). Установлено, что доля БуХЭ у этих рыб составляет 83» 96% от обшей активности ХЭ при использовании в качестве субстрата ЛТХ (Табл. б).

Таблица б.

Соотношение доли активности БуХЭ и АХЭ ("/а) в обшей активности ХЭ плазмы крови некоторых видов карповых рыб

Виды рыб | БуХЭ | АХЭ

Лещ 86 14

Сииец 88 12

Плотва 83 17

Густера 92 8

Язь 95 5

Уклея 96 4

Жерех 83 17

Основные кинетические свойства АХЭ _рыб. Скорость

гидролиза субстратов АХЭ мозга всех исследованных видов рыб и быка уменьшалась в ряду АТХ>МеТХ>ПрТХ»БуТХ. Соотношение скоростей их гидролиза варьировало между видами незначительно, равняясь в среднем 100:68:20:<1. У быка оно было несколько другим: 100:71:49:0 (Табл.7).

Таблица 7.

Соотношение скоростей гидролиза различных тиохолиновых эфиров АХЭ мозга рыб и эритроцитов быка.

Семейство,вид АТХ* ПрТХ БуТХ МеТХ

СупНпМае

Лещ 100 22 £ 1.0 0.9 ± 0.2 62 ±2,3

Синец 100 24± 1.1 1.1 ±0.2 61 ± 1.(3

Плотва 100 20 ±0.6 0.3 ± 0.2 63 ± 2.2

Густера 100 25 «2.1 2 ±0.2 65 ± 2.7

Карп 100 26 ± 1.3 0.2 ± 0.1 66 ± 4.4

Елец 100 - 1 ±06 74 ±4.5

Карась 100 18 ±0.6 0.9 ±0.3 58 ± 0.9

Линь 100 25 ± 0.7 I ±0.4 69 ±2.6

РегсМае

Окунь 100 18 ±1.5 1.б± 0.4 73 ± 1.3

Судак 100 13 ± 1.3 0.6 ±0.3 67 ±3.9

Берш 100 11 ж 1.2 0 74 ± 1.5

ЬотЕйае

Налим 100 - 0 65

Бык 100 49 0.5 71

Примечание: АТХ - аиетилтихолнн, ПрТХ - пропнонилтиохолин, БуТХ - бутирилтиохолин, МеТХ - ацетил-Р-метиптиохолин; соотношение скоростей пиролиза рассчитано при концентрации су бстратов 4.3 х 10*4 М

Заметны различия при гидролизе ПрТХ. У рыб увеличение длины аиильной части субстрата при переходе от АТХ к ПрТХ вызывает примерно в 2 раза более выраженное снижение активности АХЭ, чем у фермента быка. Структурное изменение в тиохолиновоЙ части субстрата (наличие ß-метильной группы в МеТХ) снижает активность обеих АХЭ почти одинаково и в меньшей степени, чем при изменении в аиильной: относительные скорости пиролиза МеТХ у них различались мало. Полученные результаты предполагают, что активный центр АХЭ мозга рыб по сравнению с АХЭ быка менее приспособлен конформациокно для гидролиза субстрата с более длинной ацнлыюй частью, чем у АТХ. Причина таких различий по современным представлениям может быть в вариабельности аминокислотных остатков, формирующих активный центр холинэстераз (Harel et а!., 1992; Hosea et al., 1995; Ordentlich et al., 1995). В целом полученные результаты соответствует данным других исследователей (Habig et at., 1988; Бресткин и др., 1997).

Исследование зависимости скорости гидролиза тиохолнновых субстратов от их концентрации и расчета основных кинетических параметров проведены на АХЭ мозга густеры (АХЭГ) и для сравнения для АХЭ эритроцитов быка (АХЭБ) (Рис.5).

Рис. 5. Зависимость скорости гидролиза тиохолнновых эфиров от их концентрации под действием АХЭ мозга густеры

Анстилтнохолин (♦), ацетнл-р-метилтиохолин (■), пропионилтиохолин (Ж), бутирилтиохолин (•),

У ЛХЭГ со всеми исследованными субсц. атами, за исключением БуТХ, скорость пиролиза возрастает с увеличением их концентрации до 2 мМ. Эта концентрация оказалась оптимальной со всеми исследованными субстратами (табл. 8), Дальнейшее повышение приводит к снижению активности ферментов, т.е. наблюдается эффект субстратного торможения.

' Таблица 8

Кинетические характеристики гидролиза тиохолиноных эфиров различной структуры аиетилхолиыэстеразой мозга густеры (ЛХЭГ) и - . эритроцитов быка (АХЭБ)

Фермент Параметр Субстрат

. ■ АТХ И ПрТХИ МсТХИ

АХЭГ (5)^хЮЛМ V,,, х10'7, моль мг*1 мин"1 КтХЮ^М ^ти X Ю-7, моль мг"1 мин* 1 2 3.4 ¿0.1 1.7 ± 0.1 3.6 ±0.1 t 2 1.1 ±0.1 4.9 ± 0.5 1.4 ±0.1 2 2.3 ± 0.1 2.7 ± 0.3 *2.6 ±0,1

Утвд/Кя, X 10*\ мг1 мин"1 22 3 10

АХЭБ (5)^Х10ЛМ УС{1, х10*7, моль мг"1 мин1 Кп,х10ЛМ V™ X 10"\ моль мг"1 мин* 1 1.6 2.4 ±0.1 1.2 ± 0.1 2.6 ±0.1 1.6 1.3 ± o.ot 1.8 ± 0.01 1.4 ±0.1 1.6 1.7 ±0.1 1.5 ±0.04 1.9 ±0.1

X ЮЛ мг*' мни'1 22 8 13

Сравнение величин К^ и в большей степени V^/Km показывает, что у АХЭГ и ЛХЭБ практически одинаковое сродство к АТХ, Значения V,^ также достаточно близкие. Однако применить этот показатель для сравнения общей гидролитической способности исследуемых холинэстераз не представляется возможным, т.к. в работе использованы с одной стороны частично очищенная АХЭБ, а с другой - неочищенный препарат го смеси субклеточных фракций мозга АХЭГ. Тем не менее, полученные данные с большой долей уверенности позволяют предположить, что после частичной очистки АХЭГ величина V™* у нее будет существенно выше, чем у АХЭБ. Анализ величин V^/Km и V^ показывает, что АХЭГ и АХЭБ неодинаково реагируют на структурные изменения в молекуле субстрата на разных стадиях его пиролиза. Наибольшие различия у них

проявляются на сорбционной стадии реакции при ¡рменениях в аштьной части субстрата. Как следует из данных таблицы 8, у ЛХЭГ при переходе от АТХ к ПрТХ сродство к субстрату (V^/Km) уменьшается в среднем в 8 раз, а у ЛХЭБ лишь в 3 раза. В тоже время скорость распада фермент-субстратного комплекса (V^,) снижается соответственно в 3 и 2 раза. При изменениях в алкильной части молекулы субстрата (АТХ и МеТХ) АХЭГ и ЛХЭБ ведут себя почти одинаково: сродство к субстрату уменьшается в 1,4 раза, а скорость распада фермент-субстратного комплекса - примерно в 2 раза.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что АХЭ мозга рыб, наряду с обшнми чертами, характерными для «типичной» ЛХЭБ, имеет свои отличительные особенности, связанные с гидролизом субстратов. АХЭГ является более специализированным ферментом в субстратном отношении, чем «типичная» ЛХЭБ. * Эта специфичность выражена, главным образом, в отношении ацильпой части субстрата.

Активносп. АХЭ и БуХЭ в мтге и плазме пресноводных костистых рыб- межвилопые и межсемейстменнме различия.

Активность ХЭ и их состав может значительно варьировать не только у животных, относящихся к разным филогенетическим группам, но и среди близкородственных организмов (Лейбсон 1963; Вержбннская, Лейбсон 1963; Вержбинская и др., 1969; Hill 1988; Westlake et al.,1983). Исследование на рыбах показало, что имеются значительные качественные межвидовые различия спектра ХЭ в тканях (Рис.1) и количественные различия в способности гнлролизопать ЛТХ и БуТХ (Табл. 2). Эти результаты предполагают возможность существования различий в холинергическом статусе среди пресноводных костистых рыб и требуют более детального исследования проблемы. Использование селективного ингибитора БуХЭ позволило раздельно определ1ГГЬ уровень нормальный активности ЛХЭ и БуХЭ в мозге и плазме рыб и исследовать степень межвидовых и мсжссмейственных различий.

Результаты исследования показывают, что активность ЛХЭ мозга рыб варьирует как среди видов, так и семейств (Табл. 9). Максимальные 15 кратные различия выявлены между представителем ceM.Lotidae (налим) и Cyprinidae (плотва). Различия среди представителей семейств были достоверны (р<0.05) и активности ЛХЭ в среднем уменьшались в ряду: Cyprinidae> Esocidae> Percidac> Lotidae, Вариабельность активности АХЭ внутри семейств были меньше к не превышали 3 раз среди представителей сем, Cyprinidae (плотва и карп) и 2 раз среди Percidae {судак и окунь). Среди большинства исследованных карповых

активность АХЭ не различалась достоверно (р>0.05). У карася и карпа она была чуть ниже, чем у остальных представителей семейства и была такой же, как у щуки (ЕшсІсІае).

Таблшш 9.

Активность АХЭ в мозге и плазме (мкмоль АТХИ/г ткани или мл плазмы/ч) и БуХЭ вплазме (мкмоль БТХИ/мл плазмы/ч) разных видов пресноводных костистых рыб

Семейство, Мозг Плазма

вид АХЭ АХЭ БуХЭ

Cvorinidae •

Плотва 2011 ± 87* 18.6 ±0.7' 1048 ±124'

Уклейка 1156 ±86*' ' 11.6 ±0.8^ 975 ± 26*

Лещ ІМОібг*' 4.2 ± 0.2' 87 ± 13"

Язь 1078 ±130*' 1.9± 0,2Г 237 ±42'

Синец 1054±57о> 17.0 ± 2.1 1083 ± 85*

Густера 990 ±96°-" - 4.9 ±0.5" 483 ± 86*

Жерех 1238 ±47* • 2.4 ± 0.6Г,Ж 26 ± Г

Чехонь 877 ± 62* 5.8 ± 0.7м н/о

Карась 704 ± S1 10.6 ± 0.53 н/о

Карп 651 ±45г 6.3 ± 0.3* н/о

Esocidae

Щука 691 ± 38[ 4.9 ± 0.4м н/о

Percidae

Судак 414±33й ' 1.2 ±0.1* н/о

Берш 296 ±19® 2.2 ± 0.4''* к/о

Ерш 256 ± 17м1 • 1.6±0.Г'* н/о

Окунь 214 ± 10* 2.8 ± 0.5"" н/о

Lotidne

Налим 138 ±15' 1.5±0.21'ж н/о

Примечание: средние значения + ошибки средних (х ± пи); N=12; средние в одинаковых колонках с одинаковыми буквенными индексами не отличаются достоверно при р<0.05 (АКОУА, Ь^И-тест); н/о - скорость гидролиза БТХИ ниже предела обнаружения 0.01 мкмоль/мл/ч и не может быть измерена при данных условиях.

На биохимическом уровне эти различия могут быть связаны с активностю каталитического центра (число оборотов а^) »/или в

содержании ХЭ в организме. Ранее было продемонстрировано, что aclt АХЭ мозга и эритроцитов даже в таких эволюционно удаленных группах как насекомые, круглоротые, амфибии, птицы и млекопитающие варьирует в незначительных пределах 0.8-6.2x10* мин"1. (Брик, Яковлев 1962; Grigoi'eva, Konitcheva 1993; Григорьева и др., 1987; Бресткин и др., 1974; Яковлев, Волкова 1962; Marcliot et al., 1993; Taylor et al„ 1995). У карпа а^ ЛХЭ мозга равен З.ЗхЮ'мии*1 (Брик, 1969). Эти данные позволяют предположить, что различия в активности каталитического центра ЛХЭ не являются ведущим фактором, определяющим межвидовые и межсемейственные различия в ее удельной активности в мозге. Более вероятно, что неодинаковое содержание фермента в нервной ткани разных видов основная причина этого феномена. В пользу последнего свидетельствуют гистохимические и биохимические данные, полученные на нескольких пресноводных и морских видах рыб (Contestable, 1975, 1978; Contestabile, Zaraioni, 1975),

Среди всех исследованных видов рыб была отмечена положительная достоверная (р<0.05) корреляция между активностью разных типов АХЭ и БуХЭ в мозге и плазме (рис.6). Наиболее вероятно предположить, что существуют физиологическая основа этого феномена. Как известно, избыток ЛХ ингнбирует активность АХЭ и активирует БуХЭ (O'Brien, I960; Silver, 1974; Бресткин и др., 1997). Следовательно, если содержание ЛХ в ткани по какой-то причине достигает избыточного уровня, то БуХЭ в этот момент более эффективна для его гидролиза. Эта посылка лежит в основе одного из предположений о физиологической роли БуХЭ в организме, как «мусорщике» ("scavenger"), удаляющем избыток ЛХ из организма. В этой связи обращает на себя внимание полученный в нашем исследовании факт скоррелнрованиости уровней активности обоих типов ХЭ в мозге и плазме рыб: только виды с высоким уровнем активности ЛХЭ в M03iy и плазме (большинство карповых) имеют в плазме БуХЭ. Это предполагает, что присутствие БуХЭ в плазме указывает на более высокую интенсивность метаболизма АХ и более высокий холинергический статус организма карповых по сравнению со щукой, налимом и окуневыми.

Изменения активности АХЭ в мозге рыб при остром стрессе, ипдуиировлнпом ппелением адреналина. Выявленные межвидовые и межсемейственные различия в уровнях активности ХЭ в тканях рыб наблюдаются при стабильных условиях окружающей среды. Однако можно предположить, что различные стрессорные факторы могут влиять на ферментативную активность. Чтобы выяснить возможное влияние стресса на активность ХЭ рыб и их участие в стресс-ответе, было

„ 2000

т ^ § | 1500

я *

_ „ 1000 ? -

м ®

1-8 500

§-" о

г =0.67,Т*11.38

« г

О 4 а 12 16

активность АХЭ в плазме, мкмоль/мп/ч

20

2000 4

А £ 1500

ч о

л X

I 5 1ооо

£ й 500-

......... -г ■'■' I ■■' - ---1-

0 200 400 600 800 активность ЕХЭ в плазме, мкмоль/мл/ч

1000

™ ^ 3 §

а г

Ш <»" 2 я

0 200 400 600 800 активность БХЭ в плазме. мкмоль/млМ

1000

Рис 6. Корреляция между активностью АХЭ в мозге и плазме и БУХЭ в плазме рыб

г - коэффициент корреляции, р — критерий Фишера, р<0.05. Виды рыб:1-налим, 2-окунь, 3-ерш, 4-берш, 5-судак, 6-щука, 7-карн, 8-карась, 9-чехонь, 10-жерех, 11-густера, 12-синец, 13-язь, 14-леш, 15-уклейка, 16-плотва.

проведено исследование динамики активности АХЭ в мозге окуня при инъекции адреналина (1.5 мг/кг), одного из известных стресс-гормонов (Панин 1983; Смит 1986). Выявленные изменения активности АХЭ носят двухфазный характер: краткосрочное (0.5ч) снижение с последующим продолжительны*» {72 ч) достоверным увеличением активности АХЭ на 4060% относительно контратя (ТабдЛО). Содержание ВБ в течение всего периода наблюдений варьировало в пределах контроля, за исключением 24 ч, когда его уровень был превышен.

Таблица 10.

Динамика активности АХЭ и содержания водорастворимых белков в мозгу, ко!ше1гграння глюкозы в крови окуня (Регса ПчуЫИз Ь.) после инъекции алреналина

Показатель Вариант эксперимента

Контроль Рингер Адреналин

0.5 АХЭ' Белок5 Глюкоза* 433.3+29.8' 46.6+1.7 43.112.9 423.8+52.1 44.5+3.0 90.9+8.9* 183.5+27.0* 37.544,0 91.4+7.2*

4 АХЭ Белок Глюкоза - 327.6+21.7 31.8+1.2 49.3+5.8 694.0+16.2* 47.8+0.8 98,6+7.0*

12 ЛХЭ Белок Глюкоза - 478.2+18.6 43.8±3.5 57.5+4.9* 630.0+43,6* 48.0+4,1 115.7+20.8*

24 ЛХЭ Белок Глюкоза 382.6+32.1 39.2-2.0 32.2+3.0 581.7+19.7" 44.6+1.7* 33.4+1.9 366.0+53.2 53,6+2.3* 61.2+8.0*

48 АХЭ Белок Глюкоза - 412,7+31.8 35.2+0.6 45.8+6.2 646.4+42.0* 44.6+1.9 38.3+2.2

72 АХЭ Белок Глюкоза 331.8+34.4 31.7±2,2 213+3.0 338.8+19.4 34.9+1.3 32.7+1.0 680.4+45.6* 44.7+3.7 62.5+5.0*

водорастворимых белков (ВБ), мг/г ткани; * - концентрация глюкозы, мг%; г - средняя ± ошибка средней, п=10 рыб/определение; * - достоверно отличается от контроля при рЧ>.05

О стрессорном характере, изменений свидетельствует стойкая гиперкликемия, наблюдавшаяся у рыб уже в первые 30 мин после инъекции и сохраняющаяся в течение всего периода наблюдения. Общая направленность индуцированных адреналином изменений активности АХЭ в мозге окуня сходна с той, что обнаружена у млекопитающих (Сибуль 1966; Маслова, Резник 1971; Алексцдзе, Балавадзс 1977).

Влияние адреналина на активность АХЭ может быть как прямое» так и опосредованное. На млекопитающих установлено, что при прямом действии in vitro адреналин вызывает снижение активности АХЭ (Сибуль 1966), пр>гчем эффект зависит от концентрации гормона. Это может служтъ причиной снижения активности АХЭ в мозге окуня, наблюдаемые через 30 мин после инъекции адреналина. При опосредованном влиянии адреналина активность АХЭ может повышаться за счет индуктивного сшггсза молекул фермента de novo, что было продемонстрировано на крысах (Алекспдзе, Балавалзе 1977; Елаев 1985),' Следовательно, наблюдаемое у окуня повышение активности АХЭ в мозге связано, вероятнее всего, именно с синтезом дополшггелыюго количества фермента de novo и механизм этого синтеза, видимо, такой же, как и млекопитающих.

Таким образом, проведенное исследование показало, что адреналин оказывает влияние на активность АХЭ в мозге рыб. Из этого следует, что любой стресснруюший фактор, повышающий уровень адреналина способен приводить к изменениям активности АХЭ в мозге рыб. ВТЩНЧО, изменения активности АХЭ в мозге рыб являются одним ш элементов вторичного ответа рыб при стрессе. -

Сезонная динамика" активности АХЭ мозга окуня. В жизни рыб существенное значение имеют взаимоотношения со средой их обитания, которая характеризуется постоянной изменчивостью. Изменения большинства природных факторов окружающей среды имеют сезонную циклическую периодичность, что особенно ярко проявляется в средних и северных широтах. Приспособление рыб к жизни в условиях циклических изменений среды осуществляется путем синхронташш их биологических ритмов-с природными циклами. Считается, что сезонные биологические ритмы обусловлены либо влиянием факторов окружающей среды, либо эндогенными ритмами (феномен «биологических часов»), а чаше всего независимым совокупным влиянием того и другого. Двумя наиболее значимыми внешними факторами, регулирующими годовые ритмы, являются температура н фотопериод (Лав 1973; Шульман 1972). Для рыб, как пойкилотермных животных, температура среды обитания - один го наиболее существенных внешних факторов, оказывающих значительное

слияние на интенсивность метаболизма и протекание биохимических и физиологических процессов (Хочачка, Сомеро 1977; Хлебович 1981). В связи с этим представляло интерес исследовать сезонную динамику ХЭ в тканях рыб. Было установлено, что активность ЛХЭ в среднем и промежуточном мозге окуня изменяется в течение года и имеет четко выраженную сезонную периодичность (Рис. 7).

II Ш IV V VI VII VIII IX X XI XII месяцы

11980 ЕШ1981 ЕШ31982 —1981 -»-1982

Рис. 7. Сезонные изменения активности ЛХЭ (столбики) в среднем и промежуточном мозге окуня (Perca fluviátil;s L) и температуры воды (линия) в месте его обитания в Рыбинском водохранилище в период 19801982гг.

Динамика активности ЛХЭ не зависит от пола, но имеет обратно пропорциональную зависимость от длины тела и веса мозга. В целом, летом она выше, чем зимой и следует сезонным изменениям температуры воды. Положительная корреляции активности ЛХЭ и температуры воды, полученная при температурой адаптации окуня в лабораторных условиях подтверждает это заключение. Вместе с тем обращают на себя внимание следующие факты:

а) заметное увеличение активности ЛХЭ начинается в феврале, когда температура води находится все еще на минимальном годовом уровне; б)

наибольшая активность фермента наблюдается в апреле - мае, а максимальные среднемесячные значения температуры воды приходятся на июль-август. Наиболее вероятно предположить, что изменение фотопериода выполняет триггерную роль и запускает целый комплекс биохимических и физиологических перестроек в организме рыб, включая и метаболизм ЛХЭ (Baslow, Nigielly 1964). Наивысший уровень активности АХЭ в апреле-мае приход>гтся на период нереста рыб. Связь изменений активности ЛХЭ в мозге рыб с нерестом недавно была подтверждена экспериментальным путем в лабораторных условиях (Pavlov 1994а). Поскольку )1звестно, что нерест - это черезвычайно стрессирующнй период в биологическом шисле рыб (Лав 1973; Шульман 1972), то причина увеличения активности ЛХЭ в мозге вероятнее всего имеет стрессорную природу, что обсуждается выше. Сходные сезонные изменения активности ЛХЭ в мозге и БуХЭ в плазме и печени отмечены нами у плотны. Таким образом, в основе сезонных изменений активности ЛХЭ мозга рыб лежат как эндогенные причины, так и факторы окружающей среды.

Роль ингибирования ЛХЭ мозга ДДВФ ' в нарушении пищевого поведение рыб. Известно, что пищевое поведение рыб нарушается при действии сублетальных концентраций ФОС (Little et al., 1989). При этом наиболее обычным типом нарушения является уменьшение количества потребляемой пищи и/или прекращение питания (Sandheinrich, Atchison, 1990). Относительно ФОС известно, что основной мишенью их действия в организме является ЛХЭ, один из важных компонентов холинергичсской нервной системы, как ее центральных, так и периферических отделов (O'Brien, I960; 1967). Ингибирование ЛХЭ ведет к нарушению проведения нервного импульса и этот феномен хорошо известен не только у млекопитающих, но и у рыб (Weiss, 1961; Weiss, Gakstatter, 1964; Coppage, 1972).' Эти факты позволяют предположить, что основной механизм подавления поведения рыб при сублеталъном токсическом действии ФОС — есть на самом деле блокирование проведения нервного импульса в соответствующих отделах ЦНС, которое может приводить к нарушению холикергической регуляции поведения рыб. - Однако значение этих эффектов для токсикогенной патологии поведения рыб до сих пор оставалось неясной.

В результате проведенного исследования было показано, что 96 ч экспозиция рыб к ДДВФ в ■ сублетальной концентрации привела к достоверному снижению активности АХЭ в их мозге (Табл.11).

Таблица II.

Влияние экспозиции к ДДВФ (1.87 мг/л, 1/15 ЛК50 за 48 ч) и инъекции ТМБ-4 на активность ЛХЭ мозга годовиков леща (Abramis brama L.).

Период Контроль ДДВФ Активность АХЭ, %от контроля

96 ч экспозншш к ДДВФ 1463 ± 98 * 471 ± 19 і 32

12 ч реабилитации в чистой воле - 663 ±51' 54

12 ч после ииъекпнп раствора Рингера 1221 ± 112 619 ±39* 51

12 ч после инъекции ТМБ-4 - 1006 ±83 82

Примечание: * представлены средние значения активности АХЭ и ошибки средней (х±ш,; мкмоль АТХН/ г ткани/ ч); N = 10;1 - различия с контролем достоверны при р=0.01

Результаты исслелования пищевого поведения леща показывают, что уже спустя 24 ч после начала действия ДДВФ на рыб у них также достоверно снижается количество потребляемого корма (Табл. 12).

Таблица 12.

Количество потребляемого корма при разных вариантах экспозиции годовиков леща (Abramis brama L.) к ДДВФ

Вариант эксперимента Количество хнрономнд, штук на 3 рыбы в день

до экспозиции 96 ч экспозиции 72 ч реабилитации

Контроль 86.8 ± 1.0* 88.0 ±0.7 89.5 ± 0.3

ДДВФ 85.2 * 1.3 57.4 ± 1.9 * 58.0 ±2.1*

ДДВФ + атропин 81.3 ±2.7 66.3 ±2.5* 88.5 ± 1.2

ДДВФ + ТМБ-4 80.9 ±2.6 63.3 + 7.5* 87.5 ± 0.9

Примечание: * представлены средние значения количества съеденных хпрономнд и ошибки средней (х1пги); N м число наблюдений; * — различия с контролем достоверны при р-0.01

В результате различных вариантов реабилитационных процедур, включая инъекции фармакологических препаратов, обладающих антшотным действием, активность АХЭ и количество потребляемого корма после прекращения действия токсиканта менялся в различной степени. Ни при замене токсиканта на чистую воду, ни после ттъекцни раствора Рингера как активность АХЭ, так и пищевое поведение не восстанавливались до нормы до конца эксперимента.

В противоположность этому рыбы, инъецированные ТМВ-4, за такое же время реабишггации демонстрируют почти полное восстановление активности. АХЭ почти до нормы и одновременно пищевого поведения до контрольного уровня. Как известно in исследований на млекопнтаюншх, реактивирующий эффект ТМБ-4 связан со значительным ускорением процесса дефосфорилирования активного центра АХЭ после его фосфорнлнрованкя_ в процессе взаимодействия с ФОС. Однако у млекопитающих этот реактиватор очень слабо проникает через гемэтоэнцефалический барьер. Поэтому его обычно используют как антидот периферического действия (Голиков, Зауголышков, 1970). Как следует in полученных данных, у рыб, в отличие от млекопитающих, ТМБ-4 хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер и оказывает антидогный эффект центрального действия. Восстановление нормального пищевого поведения наблюдается и при инъекции другого антидота, известного' как блокатора м-холинорецепторов центрального действия. Полученные результаты. представлештыс здесь наглядно. демонстрируют функциональную связь между восстановлением активности АХЭ и нормального функционирования холннергических синапсов в мозге рыб и эффективностью их пищевого поведения.

Роль ХЭ в избирательной устойчивости различных видов рыб к летальному действию ДДВФ in vivo. Известно, что животные, в том числе и рыбы, могут значительно различаться по устойчивости к острому действию ФОС (Markng, Mauck, 1975; Розенгарт, Шерстобитов, 1978). Для рыб вопрос о причинах селективности остается открытым. Вмсстс с тем, исходя нз данных, полученных на млекопитающих и насекомых, предполагается, что основные возможные причины этого следующие: а) различная чувствительность АХЭ мозга рыб к действию ФОС; б) неодинаковая скорость их поступления в организм у разных видов рыб; в) различия в скорости детоксикацин токсикантов в организме рыб и г) .защитная функция БХЭ плазмы. Исследование показало, что различия между окунем и карпом в устойчивости к острому действию ДДВФ достигают охоло 40 раз (Табл.13).

Таблица 13.

Значения JIK<o ДДВФ для карпа и окуня при экспозиции 48 часов

Вид Количество рыб, шт. ЛКід, мг/л Границы доверительного интервала ЛК^ мг/л

Карп 36 21.9 20.2-23.8

Окунь 42 0.59 0.54 - 0.64

различия достоверны между окунем и карпом при р=0.01

Как продемонстрировано выше, по '{увствительности к ннгибированию ДДВФ in vitro АХЭ мозга рыб, включая окуня и карпа, фактически не различается (табл.5), что указывает иа низкую значимость этого фактора в формировании межвидовых различий в их устойчивости к действию токсиканта. Вместе с тем, уровень /дельной активности АХЭ в мозге у карпа примерно в 3 раза выше, чем у окуня (табл. 9), что может быть одной из причин более высокой устойчивости карпа к ДДВФ. В пользу этого свидетельствует ранее установленный факт, что более устойчивая к ФОС популяция рыбы гамбузии обладает и более высоким уровнем активности АХЭ в периферическом отделе нервной системы (Chambers, 1976). Кроме того, собственные данные и результаты других исследователей показывают, что в целом представители сем, Cypriniclae обладают большей устойчивостью к токсическому действию ФОС, чем виды из других семейств, включая Percidae (Markng, Mauck, 1975; Гантвсрг, 1985; Чуйко, 1987; Frumin ct al.. 1992). Наряду с этим, они имеют и более высокую активность ЛХЭ в мозге (табл. 9). Можно предположить, что чем выше активность ЛХЭ, тем требуется большая доза ингибитора, чтобы сниз)гть ее уровень до летального. Однако это не позволяет полностью объяснить существующие между окунем и карпом различия в устойчивости к ДДВФ.

Исследование детоксикационной способности печени у эгих видов выявило, что у окуня она в 7 раз ниже, чем у карла. Причем выявленные различия связаны как с более высокой удельной скоростью ферментативной детоксикации ДДВФ, ток и с большей массой печени у карпа (Табл. 14).

Кроме того, анализ динамики содержания ДДВФ в крови этих видов в начальный период их контакта с токенкашом свидетельствует и о межвидовых различиях в скорости его поступления в организм рыб: у окуня она примерно в 4 раза выше, чем у карпа (рис. 8).

Таблица 14.

Скорость ферментативного разрушения ДДВФ гомогенатами печенії in vitro и ее масса у одноразмерных карпа и окуня.

Вид Масса печени* Скорость фермеїгтатнвного разрушения, мкг/г/час

абсолютная относительная

Карп 1290 ±77 • 21.6 ± 1.5 38.8 + 5.1

Окунь 745 ± 12 9.9 + 0.7 12.7+1.4

абсолютная масса печени выражена в мг, относительная - в мг/г и рассчитана относительно массы тела; различия достоверны между окунем карпом при р=0.05.

30 40 время, мин

Рис. 8. Динамика содержания': ДДВФ в крови карпа и окуня при концентрации токсиканта в окружаюшей воде 21.9 мг/л

Учитывая высокий уровень активности БуХЭ в крови карповых рыб (табл.9) и ее высокую чувствительность к ДЦВФ (табл. 5) была исследована ее защитная роль при остром отравлении рыб ФОС. ■ Поскольку напрямую это измерить не представлялось возможным, были проведено сравнение острой токсичности ДДВФ для двух фенотипов леща: содержащего в крови БуХЭ и не имеющего ее. Результаты показали, что при экспозиции 48 ч значения ЛК» у двух фенотипов леща достоверно не отличаются, составляя соответственно 133.9 и 135.2 мг/л. Полученные данные позволяют заключить, что по крайней мере при остром действии ДДВФ на лета, наличие БуХЭ в крови не защищает его от отравления.

ВЫВОДЫ

1. У пресноводных костистых рыб присутствуют ХЭ, которые по субстратной специфичности, чувствительности к ингибиторам и кинетическим свойствам могут быть отнесены к двум основным типам: ЛХЭ (К.Ф. 3.1.1.7) и БуХЭ (К.Ф. 3,1.1.8.). Однако они имеют свои особенности, отличающие нх от типичных ХЭ млекопитающих.

2. Активность АХЭ обнаружена во всех прознал из ированных органах и плазме крови у всех исследованных видов рыб, а БуХЭ - только в плазме, печени и селезенке у представителей сем.Сургшикю. Независимо от вида наибольшая активность АХЭ выявляется в мозге, а БуХЭ - в плазме, где ее доля в обшей активности ХЭ составляет 83-95%. Уровень активности БуХЭ в плазме коррелирует с активностью АХЭ в мозге и плазме.

3. Активность ХЭ у рыб не зависит от н^ла и циклически изменяется в течение года, следуя сезонным изменениям температуры волы: летом она в 2-3 раза выше, чем зимой. Однако наивысшие ее значения наблюдаются во время нереста, что отражает стрессорный характер и общую направленность изменений метаболизма в этот период.

4. При остром стрессе, индуцированном инъекцией адреналина, активность АХЭ в мозге рыб изменяется. Выявленные изменения носят двухфазный характер: в первые минуты происходит снижение, а в последующие часы — повышение активности фермента. Повышенный уровень активности АХЭ сохраняется не менее трех суток после инъекции.

5. АХЭ в мозге играет роль в формировании пищевого поведения рыб. Снижение се активности при хроническом действии ФОС на рыб вызывает дискоординацию пишевого поведешш и приводит к снижению количества потребляемого корма. Реактивация АХЭ восстанавливает нормальный уровень питания. Снижение активности в процессе экспозиции к токсиканту происходит значительно быстрее (несколько часов), чем ее восстановление до нормы после прекращения контакта с токсикантом.

6. Чувств1гтсльность ХЭ к ФОС и уровень нх активности в тканях вносит незначительный вклад в избирательность токсического действия на рыб. Основные причины избирательности - межвидовые различия в скорости проникновения токсиканта в организм рыб и эффективности его детоксикаши.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Козловская ВИ, Чуїіко ГМ. Холиюстеразы сыворотки крови рыб ceM.Cyprinidae с различной устойчивостью к хлорофосу// В кн. Физиология и паразитология пресноводных животных. Тр. ИБВВ РАН (Флеров БА, ред). 1979. Л. Наука. №38(41). С. 32*41.

2. Чуйко ГМ, Кохтовская ВИ, Степанова ВМ. Эстсразы эфироп карбонових кислот сыворотки крови синіш (Abramis ballcrus), плотвы (Rutilus rutilus), леша (Abramis brama) и окуня (Perca fluviatilis)// Рук. дсп. в ВИНИТИ 22.11.1983. 1983, 6193-83деп. 10 с.

3. Козловская ВИ,' Степанова ВМ, Чуйко ГМ. Обратимость ннтоксикацш карпа карбофосом// В кн. Реакция пшробионтов на загрязнение. Ред. НС Строганов. 1983. М. Наука. С. 191-198.

4. Козловская ВИ, Чуйко ГМ. Изменения ацетилхолннэстерази мозга окуня (Perca fluviatilis L.) под воздействием хлорофоса// Гидроб. ж. 1985. Т. 21. №5. С. 49-53.

5. Чуйко ГМ, Чувствительность , ацетилхолиюстеразы мозга к хлорофосу и его токсичнос+ь для плотвы, леша, карпа и окуня// Биология внутренних вод. Информ. бюлл. 1985. № 66. С. 55-59.

6. Чуйко ГМ. Устойчивость карпа и окуня к хлорофосу и ДДВФ// Биология внутренних вод. Ипформ. бюлл. 1986. №69. С. 51-55.

' 7. Козловская ВИ, Чуйко ГМ, Мензикова OB, Петухова ВА. Способ определения фосфорорганнчсских пестицидов в воде// Автор, свидет. SU ' №1359741 Al. 1987.

8. Чуйко ГМ. Биохимические и физиологические механизмы различной устойчивости пресноводных костистых рыб к действию хлорофоса н ДДВФ// Автореф, на соиск, уч. степ к.б.н. 1987, Л. ИЭФиБ, 22с. . .. .

9. Чуйко ГМ, Холинэстераза сыворотки крови леща и его устойчивость хлорофосу// Биология внутренних вод. Информ. бюлл. 1987.

■ №74. С. 55-57.

10. Чуйко ГМ, Козловская ВН. Сезонные изменения активности ацетилхолиюстеразы мозга окуня (Perca fluviatilis L.)// В кн. Физиология ti токсикология шдробионто» (Сабуров ГЕ, ред). 1989. Ярославль. Яр ГУ. С. 27-38. ■

11. Козловская ВИ, Мензикова OB, Чуйко ГМ, Майер ФЛ. Холинзстеразы водных животных// В кн. Физиология, биохимия и токсикология пресноводных животных (Флеров БА, ред). 1990. Ленинград. Наука. №57(60). С. 42-66.

12. Козловская ВИ, Павлов ДФ, Чуй ко ГМ, Халько ВВ, Винннков ЮЯ, Анохин СВ. Влияние загрязняющих веществ на состояние рыбы в 111 сксни иском плесе Рыбинского водохранилища// Влияние стоков Череповецкого промышленного узла на эколлогическое состояние Рыбинского водохранилища (БА Флеров, ред.). 1990. Рыбинск. ИБВВ РАН. C.I23-143.

13. Павлов ДФ, Чуйко ГМ, Герасимов ЮВ, Содержание белка и активность аиетилхолнюстеразы в мозгу леша при хроническом действии кадмия// Биология внутренних вод. Ипформ.бюлл, 1990. №89. С.72-77.

14. Козловская ВИ, Чуйко ГМ, Мешикова ОВ, Подгорная ВА, Энзиматическнй метод определения в воле фосфорорганичсских пестицидов н их метаболитов// Биология внутренних вод. Информ.бюлл. 1996. JfelOO. С. 65-72.

15. Желнин ЮГО, Чуйко ГМ, Подгорная ВА. Активность холинэстсраз плазмы крови различных видов пресноводных костистых рыб//Биол. внутр. вод. 1998. №. 1.С. 74-79.

16. Чуйко ГМ, Павлов ДФ, Подгорная ВА, Степанова ВМ, Изменение активности аиетилхолинэстсразм и содержания водорастворимого белка в мозге мозачбикской тиляпии (Orcochromis mossambicus Peteis) при хроническом действии кадмия, нафталина и дихлофоса// Биол. внутр. вод.

2001. №3. С. 72-79.

17. Чуйко ГМ, Подгорная ВА. Холигвстеразы пресноводных костистых рыб// В кн. Современные проблемы биологии, химии, экологии и экологического образования .(Казн и ВН, Сибриков СГ, Тихонов СИ, Тятенкова 1Ш, ред.). 2001. Ярославль. ЯрГУ. С. 233-236.

18. Чуйко ГМ, Подгорная ВА, Лаврикова ИВ. Фосфорорганическое соединение 0,0-диметил-0-(2,2-дихлориииил)фосфат как избирательный ингибитор для раздельного определения активности ацетилхолнюстеразы и бутирилхолинзетеразы плотвы Rutilas rutilus// Ж. эоол. биохим. физиол.

2002. Т.38. №3. С. 203-207.

19. Kozlovskaya VI, Chuyfco GM, Lapkina LN, Nepomnyashchikh VA. Resistance of aquatic animals to organophosphorus pesticides and its mechanisms// In Problems of Aquatic Toxicology, Biotesting and Water Quality Management: Proceedings of USA-USSR Symposium, Borok, Yaroslavl Oblast, July 30-August 1, 1984. (In: Ryans RC, ed). 1986. Athens, GA. HPA Research Laboratory. P. 37-54.

20. Chuyko GM. Various resistance mechanisms of carp (Cyprinus carpio I„) and perch (Perca fluviatilis L.) to D1>VF organophosphorus compounas// In Fate and Effects of Pollutants in Aquatic Organisms and Ecosystcms:

Proceedings of USA-USSR Symposium, Athens, Georgia, October 19-21, 1987 (In: Ryans RC, ed). 1988. Athens. EPA. P.7S-S9.

21. Pavlov DF, Chuiko GM, Gerassimov YV, Tonkopiy VD. Feeding behavior and brain acetylcholinesterase'activity in bream (Abramis brama L.) as affected by DDVP, an organophosphoms tnsecticide//Comp. Biochem. Physiol. 1992. V.103C. N3. P. 563-568.

22. Frumin GT, Chuiko GM, Pavlov DF, Menzykova OV. New rapid method to evaluate the median effect concentration of xenobiotics in hydrobionts// Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1992. V. 49. P. 361-367.

23. Kozlovskaya. VI, Mayer FL, Meimkova . OV, Chuyko GM. Cholinesterases of aquatic animals// Rev. Environ. Contam. Toxicol. 1993. V. 132. P. 117-142.

24. Pavlov DF, Chuiko GM, Shabiova AG. Adrenaline induced changes of acetylcholinesterase activity in the brain of perch (Perca iluviatilis L.}// Comp. Biochem. Physiol. 1994. V. 108C.N1.P. 113-115.

25. Chuiko GM; Slynko YV. Relation of allozyme genotype to survivorsliip of juvenile bream, Abramis brama L., *. acutely exposed to DDVP, an organophosphonis pesticide// Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1995. V. 55. N5. P. 738-745 ' .

26. Chuiko GM, Zhclnin Y, Pod'goraaya VA. Seasonal fluctuations in brain acetyilCholinesterase activity and soluble protein content in roach (Rutilus rutilus L.): a freshwater fish from Northwest Russia// Comp. Biochem. Physiol. 1997. V. I17C.N3. P. 251-257.

27. Chuiko GM. Comparative study of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in brain and serum of several freshwater fish: specific activities and in vitro inhibition by DDVP, an organophosphorus pesticide// Comp. Biochem. Physiol. 2000. V. I27C. N 3. P. 233-242.

28. Chuiko GM, Podgomaya VA, Zhelnin YY, Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase Activities in Brain and Plasma of Several Fiesliwater Teleosts: Cross-species and Cross-family Differences// Comp. Biochem. Physiol.. 2003. V.135B. No 1. P.55-61.

Лицензия ПД 00661. Заказ 2357. Тираж 120. Отпечатано в типографии Ярославского государственного технического университета г. Ярославль, уд. Советская, И а, тел, 30-56-63.

Я».-»О 8