Молекулярное моделирование связывания лиганда с активным центром холинэстераз

Белинская, Дарья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярное моделирование связывания лиганда с активным центром холинэстераз
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное моделирование связывания лиганда с активным центром холинэстераз"

На права.

правок рукописи

ооз4ообэа

Белинская Дарья Александровна

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДА С АКТИВНЫМ ЦЕНТРОМ ХОЛИНЭСТЕРАЗ

03.01.04 - Биохимия

2 8 йНВ 2010

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

003490690

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии сенсорных систем Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Шестакова Наталия Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Тихонов Денис Борисович

кандидат биологических наук Стефанов Василий Евгеньевич

Ведущее научное учреждение: Санкт-Петербургский Государственный

Медицинский Университет имени И.П. Павлова

Защита диссертации состоится « ¡-¡у> 2о{0 года в 12. часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44).

Автореферат разослан « ¿4 » ^ с 2009 ]

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Сериновые гидролазы холинэстеразы (ХЭ) присутствуют во многих организмах, от беспозвоночных до млекопитающих. По субстратно-ингибиторной специфичности ХЭ делятся на ацетилхолинэстеразы (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы (БуХЭ). АХЭ участвует в проведении нервного импульса и является мишенью для многих нейролептических препаратов, фосфорорганических ингибиторов и нервнопаралитических отравляющих веществ, а БуХЭ способна гидролизовать широкий спектр токсичных эфиров (зарин, зоман) (Бресткин А.П. и др., 1997). Поэтому исследование механизма связывания различных типов лигандов в активном центре этих ферментов представляет огромный интерес с теоретической и практической точки зрения: для изучения механизма действия ферментов в целом, для создания новых эффективных лекарственных средств, инсектицидов и пестицидов избирательного действия.

С момента открытия ХЭ было синтезировано и апробировано множество веществ, являющихся субстратами и ингибиторами этих ферментов, измерены значения кинетических констант взаимодействия ХЭ с сотнями эффекторов различной природы (Садыков А.С. и др., 1976). Методом рентгеноструктурного анализа определены трехмерные структуры кристаллов АХЭ и БуХЭ (Бизвшап сП а1., 1991; Ы1со1а У. е1 а1., 2003). Однако полученные экспериментальные данные не позволяют «проследить» поэтапно весь процесс связывания лигандов в активном центре ферментов. Компьютерное моделирование позволяет получить структуру продуктивного лиганд-ферментного комплекса, рассчитать его динамические и энергетические параметры, выявить факторы, обуславливающие субстратно-ингибиторную специфичность ферментов. Накопленные данные о кинетических характеристиках взаимодействия ХЭ с различными типами лигандов и известные трехмерные структуры этих ферментов дают возможность использовать данный подход и для изучения ХЭ. Полученные данные могут быть использованы для изучения механизма действия ферментов в целом.

Цель работы.

Целью данной работы являлось моделирование механизма продуктивного связывания молекул субстратов и ингибиторов в активных центрах ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы методами теоретического конформационного анализа, молекулярного докинга и молекулярной динамики.

Задачи исследования.

1. Построить и исследовать модели продуктивных комплексов холинэстераз с субстратами,

обратимыми и необратимыми ингибиторами.

2. Оценить роль электростатических взаимодействий в процессе связывания молекул лигандов в активном центре холинэстераз.

3. Определить конформацию нейромедиатора ацетилхолина, продуктивную для гидролиза под действием бутирилхолинэстеразы.

4. Создать критерий отбора конформаций структурных аналогов ацетилхолина, продуктивных для гидролиза под действием бутирилхолинэстеразы.

5. Оценить конформационные и структурные изменения активного центра холинэстераз в процессе сорбции лигандов.

6. В рамках построенных моделей провести анализ структурно-функциональных отношений лигандов холинэстераз.

Положения, выносимые на защиту.

■ Для образования продуктивного комплекса холинэстераз с субстратом и необратимым ингибитором необходима активация аминокислот каталитической триады фермента, а именно перенос протона с серина на гистидин, что сопровождается конформационными изменениями активного центра.

■ Роль электростатических взаимодействий на стадии сорбции положительно заряженных молекул лиганда выражается в заякоривании его катионной группировки в районе бензольного кольца триптофана анионного участка активного центра холинэстераз за счет образования пи-катионных взаимодействий. Эффективность ингибирующей способности обратимого положительно заряженного ингибитора зависит прочности этой связи.

■ Энергетически устойчивая полусвернутая транс-антигош-конформации АХ является продуктивной для гидролиза под действием БуХЭ. БуХЭ гидролизует только те аналоги АХ, у которых имеются энергетически устойчивые конформеры, совместимые с продуктивной конформацией АХ по взаимному расположению функциональных атомов: карбонильного углерода, карбонильного кислорода и азота. Отклонение значений расстояний между этими атомами не превышает 0.02 нм.

Научная новизна результатов.

Впервые для построения модели комплексов АХЭ и БуХЭ с лигандами была использована активированная форма аминокислот каталитической триады ХЭ, что позволило прийти к новым, неочевидным результатам:

• Образование продуктивного комплекса ХЭ с молекулой субстрата или необратимого ингибитора возможно только при условии, что каталитический серин депротонирован, а каталитический гистидин - дважды протонирован.

• Различие в периоде стабильности продуктивных комплексов АХ с АХЭ и БуХЭ коррелирует с различием в скоростях гидролиза АХ под действием АХЭ и БуХЭ.

Впервые методами молекулярного моделирования проведен сравнительный анализ чувствительности АХЭ и БуХЭ к заряду лиганда, что позволило выявить роль электростатических взаимодействий на стадии сорбции лигандов в активный центр ХЭ и определить их влияние на эффективность обратимого ингибирования.

Впервые показано, что продуктивной для гидролиза под действием БуХЭ является полусвернутая транс-антигош-конформация АХ. Показано, что в ряду аналогов АХ продуктивны для бутирилхолинэстеразного гидролиза только те конформации, конформация холинового фрагмента которых по взаимному расположению функционально значимых атомов совпадает с продуктивной конформацией АХ.

Теоретическое и практическое значение работы.

Разработанная в данной работе методика моделирования продуктивных фермент-лигандных комплексов с использованием неактивированных и активированных форм аминокислот активного центра имеют теоретическое значения для развития методов исследования механизма действия ферментов. На практике данный подход может быть применен для прескринига лекарственных препаратов против болезни Альцгеймера, являющихся обратимыми ингибиторами холинэстераз.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на конференции «XXXII неделя науки в СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2003), итоговом семинаре по физике и астрономии по результатам конкурса грантов 2002 года для молодых ученых Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2003), 8-й международной Путинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), конференции «XXXIII неделя науки в СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2004), 9-й международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), международной конференции «3. German Conference on Chemoinformatics» (Гослар, 2007), 12-й международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), международной конференции «33d FEBS Congress» (Афины, 2008).

Публикации.

По результатам диссертации опубликовано 11 печатных работ, 2 из них в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа (77 страниц) состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (101 ссылка), содержит 11 иллюстраций и 12 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования

Объектом представленного исследования являются холинэстеразы (ХЭ), относящиеся к классу сериновых гидролаз. По субстратно-ингибиторной специфичности эти ферменты подразделяются на две группы: ацетилхолинэстеразы (АХЭ, КФ 3.1.1.7) и бутирилхолинэстеразы (БуХЭ, 3.1.1.8). АХЭ была выделена из синаптической щели и эритроцитов крови и принимает участие в проведении нервного импульса, гидролизуя нейромедиатор ацетилхолин (АХ), и является мишенью для действия фосфорорганических ингибиторов и нервнопаралитических отравляющих веществ. БуХЭ была обнаружена в сыворотке крови (Бресткин А.П. и др., 1997). Хотя физиологическая функция БуХЭ до конца не определена, этот фермент также представляет огромный интерес. Известно, что АХЭ и БуХЭ имеют схожий набор субстратов и ингибиторов. Опыты на трансгенных мышах с «выключенной» АХЭ показали, что в отсутствие этого фермента БуХЭ выполняет ее роль, гидролизуя АХ. Но в отличие от АХЭ, БуХЭ способна гидролизовать многие токсичные эфиры, в том числе кокаин, и нервнопаралитическне отравляющие вещества, такие как зоман (£okugra§ N.A., 2003).

Выделено и изучено множество ХЭ из различных организмов (Моралев С.Н., Перченок А.Ю., 2008), но «эталонными» считаются АХЭ нервной ткани и эритроцитов крови человека и БуХЭ сыворотки крови млекопитающих. Из них наиболее изучены АХЭ электрического ската Torpedo californica и БуХЭ сыворотки крови лошади и человека, кинетические характеристики и трехмерные структуры именно этих ферментов и используются в данной работе.

В представленном исследовании изучалось взаимодействие ХЭ с субстратами, обратимыми и необратимыми ингибиторами. В качестве субстратов использовались АХ (СНзС(0)0(СНг)2 N+(CH])j) и 33 его аналога с различной структурой ацильной части и холинового фрагмента. В качестве обратимых ингибиторов - тетраметиламмоний (Ы+(СНз)4,

ТМА) и неопентан (С(СНз)4), в качестве необратимого ингибитора - метилфторфосфорилхолин (CH3P(F)(0)0(CH2)2 N+(CH3)3, МФФХ).

В работе использовались методы анализа структурно-функциональных отношений, молекулярного докинга и молекулярной динамики.

Метод анализа структурно-функциональных отношений основан на комплементарности структуры субстрата строению сорбционного участка активного центра фермента. В качестве структурных параметров субстратов использовались энергетические и геометрические характеристики полных наборов устойчивых конформаций, в качестве кинетических характеристик - взятые из литературы кинетические константы гидролиза субстратов под действием АХЭ и БуХЭ.

Расчеты параметров трехмерной структуры молекул субстратов (значения валетных и торсионных углов, объем молекул, расстояния между функционально-значимыми атомами) проводились методом молекулярной механики с помощью универсальной конформационной программы ZMM (Zhorov B.S. et al., 2000). Устойчивые конформации находились методом минимазации энергии, заселенность конформаций определялась по формуле:

Pi = exp(AEi/RT) / Iexp(AEj/RT), где ДЕк - энергия к-ого конформационного состояния, отсчитанная от глобального энергетического минимума молекулы (Шсстакова и др., 1989).

Расчет объемов молекул по данным о значениях ван-дер-Ваальсовых радиусов атомов проводили с помощью программы Volume. Графические изображения молекул получали с помощью программ MolGraph и HyperChem7. Достоверность корреляций оценивали по критерию Фишера, коэффициент корреляции принимался достоверным, если уровень значимости не превышал 0.05. Транс-, гош+-, гош" и антикланальные торсионные углы (+120°) и (-120°) обозначались символами t, g, g, а и а соответственно (Белинская Д.А. и др., 2005).

Молекулярный докинг молекул лигандов в активные центры АХЭ и БуХЭ был проведен с помощью программы ICM Molsoft Ltd. В качестве начальной конформации молекул АХЭ и БуХЭ использовались данные рентгеноструктурного анализа этих ферментов из базы данных белков PDB (код структуры 2АСЕ для АХЭ и 1P0I для БуХЭ). Молекулы воды, Сахаров и лигандов были удалены из первоначальных структур. Модели молекул лигандов были построены в молекулярном редакторе, включенном в программный пакет ICM. Устойчивые конформации комплексов ХЭз с лигандами были найдены путем минимизации энергии методом Монте-Карло, варьировались геометрические параметры лиганда и боковых цепей аминокислот центра связывания.

Конформационные изменения во времени лиганд-ферментных комплексов были рассчитаны методом молекулярной динамики с помощью программного пакета GROMACS.

Комплексы, полученные методом молекулярного докинга, виртуально помещались в периодическую кубическую решетку размером 450 нанометров (нм, 1 нм = 10"9 м), заполненную молекулами воды. Шаг интегрирования был принят равным 0.002 пикосекунд (пс, 1 пс = 10"12 с), длина траекторий составляла от 5000 пс до 20000 пс. Реальное время взаимодействия ферментов с субстратами и ингибиторами исчисляется миллисекундами, но выбранные длины траекторий являются достаточными для моделирования поведения лиганда, сорбированного в активном центре ХЭ. Для описания молекул воды использовался модельный потенциал SPC. Для поддержания постоянной температуры 300 К и постоянного давления 1 бар применялись термостат и баростат Берендсена с временными константами 0.1 пс и 1 пс соответственно. Дальние электростатические взаимодействия рассчитывались методом Эвальда. Взаимодействия Леннард-Джонса не учитывались при межатомном расстоянии большем 1 нм. Длины связей поддерживались постоянными с помощью алгоритма LINCS (Sharma S. et al., 2005).

Для того, чтобы количественно оценить способность лиганда взаимодействовать с ХЭ, методом сплошных сред (continuum approach) были рассчитаны свободные энергии связывания AGbind (аффинности). Расчет проводился с помощью программного пакета ICM. Свободная энергия связывания рассчитывалась как разница между энергией сольватированного комплекса и суммы энергий сольватированных фермента и лиганда. В данном методе свободная энергия молекулы в растворе представляется в виде суммы:

AGbind = AGnp + AGci - AGSC. AGnp - свободная энергия Гиббса гидрофобных взаимодействий водной среды с боковыми радикалами, доступными растворителю. В работе константа поверхностного натяжения была принята равной 1200 кал-моль"1-нм "2. AGj - сумма свободных энергий десольватации парциальных зарядов, перенесенных из раствора в центр связывания фермента, и свободной энергии электростатического взаимодействия лиганда и фермента. В работе электростатические взаимодействия были рассчитаны методом граничных элементов. Диэлектрическая константа была принята равной 12 для белка и 80 для растворителя. AGSC характеризует изменение энтропии молекулы при помещении ее в раствор (Gani O.A.B.S.M. et al., 2008).

Результаты и обсуждение

Особенности сорбции АХ и его аналогов в активные центры ХЭ.

Для исследования особенностей механизма сорбционной стадии взаимодействия субстратов с ХЭ был проведен молекулярный докинг молекулы АХ в активные центры АХЭ и

БуХЭ. Анализ полученный структур показал, что триметиламмониевая группа молекулы АХ сорбируется в анионном сайте ферментов над бензольным кольцом триптофана на расстоянии 0,45 нм от его центра. Таким образом, выполняются все условия образования пи-катионной связи между положительно заряженным атомом азота АХ и триптофаном анионного сайта фермента. Однако графический анализ показал, что в комплексах АХ-АХЭ и АХ-БуХЭ ацильная часть молекулы субстрата сорбируется в противоположную от каталитической триады сторону (рис. 1), таким образом, полученные комплексы не могут быть продуктивными.

Дальнейшие конформационные изменения полученных комплексов были рассчитаны методом молекулярной динамики. Для обоих ферментов время симуляции составила 5000 пс. По полученным траекториям были построены зависимости от времени расстояний между карбонильным атомом АХ и гидроксилом каталитического серина, а также между атомом азота субстрата и бензольным кольцом триптофана (рис. 2).

На протяжении всего времени симуляции положение триметиламмониевой группировки жестко закреплено над бензольным кольцом триптофана пи-катионным взаимодействием, а ацильная часть молекулы АХ в обоих случаях остается ориентированной в противоположную сторону от каталитической триады эстеразного участка активного центра фермента. Отсюда можно сделать вывод, что структурных изменений фермент-субстратного комплекса недостаточно для прохождения заключительной стадии сорбции АХ в активном центре ХЭ, а именно продуктивного расположения ацильной части в эстеразном пункте.

а).

б).

Оксианионкая попость

Кагапнтичесная триада

8ег20О

Оксианионная полость А(а199

Каталитическая триада

л . ~

Рисунок I. Молекула ацетилхолина, непродуктивно сорбированная в активном центре ацетилхолинэстеразы (а) и бутирилхолинэстеразы (б).

Было выдвинуто предположение, что перенос протона с гидроксила серина на имидазольное кольцо каталитического гистидина необходим не только для первой стадии

реакции холинэстеразиого гидролиза, но и для завершения продуктивной сорбции молекулы АХ в активном центре ХЭз.

Для проверки данного предположения был проведен молекулярный докинг АХ в активные центры АХЭ и БуХЭ в активированном состоянии, в котором каталитический серии депротонирован, а гистидин - дважды протонирован. При этом были обнаружены конформационные изменения структуры аминокислот активного центра АХЭ и БуХЭ, а именно во взаимном расположении боковых радикалов каталитических серина и гистидина.

а).

б).

1000 2000 3000 4000 5000 Время (пс)

Рисунок 2. Зависимость расстояния между карбонильным атомом АХ и гидроксилом протонированного каталитического серина (черная линия), а также между атомом азота субстрата и бензольным кольцом триптофана (серая линия) ферментов ацетилхолинэстеразы (а) и бутирилхолинэстеразы (б).

Анализ полученных комплексов показал, что и в комплексе АХ-АХЭ, и в комплексе АХ-БуХЭ (рис. 3) триметиламмониевая группа субстрата сорбируется в анионном сайте фермента через пи-катионную связь с бензольным кольцом триптофана. Ацильная же часть молекулы АХ в полученных комплексах сорбируется возле каталитической триады на расстоянии 0.31 нм и 0.28 нм от атома кислорода серина АХЭ и БуХЭ соответственно. Такие расстояния являются достаточными для атаки гидроксила серина на карбонильный углерод субстрата. В комплексе АХ-АХЭ холиновый фрагмент молекулы АХ находится в продуктивной конформации: в полностью вытянутой tt-конформации (Шестакова H.H. и др., 1989), в комплексе АХ-БуХЭ - в полусвернутой tg -конформации в. В обоих комплексах ацильная часть субстрата сорбируется в оксианионной полости фермента. Все характеристики комплексов, полученных методом молекулярного докинга, позволяют выделить их в качестве кандидатов в продуктивные.

Стабильность предполагаемых продуктивных комплексов АХ с АХЭ и БуХЭ была проверена методом молекулярной динамики. Для обоих ферментов время симуляции составила

5000 пс. По полученным траекториям были построены зависимости от времени расстояний между карбонильным атомом АХ и гидроксилом каталитического серина, а также между атомом азота субстрата и бензольным кольцом триптофана (рис. 4).

а). б).

Оксианионнзя

попасть А1а291

\ V

в*»*

V ;

Каталитическая триада

8ег200 . Н|5440

Оксигнноннля

полость жд|а)99

Каталитическая триада

С1у116 & I Г И'|5438

Рисунок 3. Молекула ацетилхолина, продуктивно сорбированная в активном центре ацетилхолинэстеразой (а) и бутирилхолинэстеразой (б).

а).

б).

1000 2000 3000 Время (пс)

4000 5000

2000 3000 4000 Время (пс)

Рисунок 4. Зависимость расстояния между карбонильным атомом АХ и атомом кислорода депротонированного каталитического серина (черная линия), а также между атомом азота субстрата и бензольным кольцом триптофана (серая линия) ферментов ацетилхолинэстеразы (а) и бутирилхолинэстеразы (б).

Анализ представленных графиков показал, что комплекс АХ-АХЭ стабилен на протяжении всего периода симуляции, положение триметиламмониевой группы и ацильной

части АХ жестко закреплено в активном центре фермента. Комплекс АХ-БуХЭ остается стабильным всего лишь на протяжении 150 пс, затем молекула субстрата покидает активный центр фермента. Однако известно, что время, за которое проходит реакция ацилирования, составляет порядка 10 пс, то есть продуктивное положение АХ в активном центре БуХЭ сохраняется достаточный для реакции период времени. Следовательно, результаты молекулярной динамики подтверждают продуктивность полученных методом молекулярного докинга комплексов. Такое различие в стабильности комплексов согласуется с кинетическими данными о том, что скорость гидролиза для пары АХ-АХЭ в несколько раз выше, чем для пары АХ-БуХЭ (Бресткин А.П. и др., 1997).

Для того, чтобы смоделировать поведение субстрата после заякоривания азота в анионном сайте и дальнейшей активации триады, в данном исследовании методами молекулярного моделирования было изучено взаимодействие формилхолина (CH(0)0(Clh)2 N+(CH;)j, ФоХ) и БуХЭ. Был проведен молекулярный докинг молекулы ФоХ в неактивированный активный центр БуХЭ. Анализ показал, что в полученном комплексе триметиламмониевая группа, как и в случае АХ, заякоривание в анионном сайте фермента на расстоянии 0.44 нм от центра кольца триптофана. Ацильная часть повернута к выходу из ущелья активного центра, в противоположную от каталитической триады сторону. Затем в полученном комплексе протон с гидроксильной группы каталитического серина был перенесен на имидазольное кольцо гистидина, и дальнейшие конформационные изменения комплекса были исследованы методом молекулярной динамики. Период симуляции составил 20000 пс. Анализ полученной траектории показал, что триметиламмониевая группа остается жестко закрепленной в анионном сайте БуХЭ через пи-катионное взаимодействие с бензольным кольцом триптофана, расстояние между карбонильным атомом углерода и гидроксилом серина за время симуляции уменьшилось до 0.42 нм. Графический анализ показал, что в конечном комплексе ацильная часть субстрата направлена в сторону каталитической триады. Данный результат подтверждает, что активация аминокислот каталитической триады необходима не только для прохождения самой реакции холинэстеразного гидролиза, но и для образования продуктивного фермент-субстратного комплекса.

Молекулярный докинг молекулы АХ в активные центры АХЭ и БуХЭ с неактивированными и активированными аминокислотами каталитической триады показал, что в обоих случаях триметиламмониевая группа субстрата сорбируется в анионном сайте фермента возле остатка триптофана, образуя пи-катионную связь с его бензольным кольцом (рис. 1, 3). Сделан вывод, что сначала происходит заякоривание азота лиганда возле триптофана анионного сайта, и лишь затем ацильная часть АХ «подстраивается» возле триады.

Расчет продуктивных комплексов АХЭ и БуХЭ с АХ методом молекулярной динамики показал, что комплекс АХ-АХЭ во много раз стабильнее комплекса АХ-БуХЭ. Поскольку скорость гидролиза АХ под действием АХЭ в несколько раз выше, чем скорость гидролиза под действием БуХЭ, сделан вывод, что скорость холинэстеразного гидролиза определяется стабильностью продуктивного комплекса. Этот вывод указывает на то, что стадия сорбции молекулы лиганда в активный центр ХЭ является лимитирующей для всего процесса ферментативной реакции.

Полученные данные свидетельствуют о том, для продуктивной сорбции молекулы субстрата в активном центре ХЭ необходима активация фермента. По всей видимости, процесс активации начинается уже в момент взаимодействия лиганда и периферического сайта ХЭ, и процессы переноса протона с каталитического серина на гистидин и «подстройки» ацильной части субстрата в активном центре сопряжены во времени. Дальнейшие квантово-химические расчеты смогут смоделировать этот процесс.

Теоретический конформационный анализ аналогов АХ с различной структурой ацилыюй части н холинового фрагмента.

Известно, что полностью вытянутая tt-конформация АХ продуктивна для гидролиза под действием АХЭ (Шестакова H.H. и др., 1989). Для определения продуктивной конформации АХ для гидролиза под действием БуХЭ был проведен теоретический конформационный анализ 34 аналогов АХ с общей формулой R-C(0)0-A-N+(CH3)3. Список соединений и литературные данные об относительных скоростях их гидролиза под действием ХЭ приведены в таблице 1.

Был проведен полный конформационный анализ АХ и его структурных аналогов (I)-(XXXII), найдены все устойчивые конформации молекул, рассчитаны их геометрические и энергетические характеристики. Взаимное расположение функционально значимых атомов (азот, карбонильный кислород и карбонильный углерод) у всех представленных соединений, кроме соединений (XXXI) и (XXXII), зависит от значений торсионных углов холинового фрагмента: т0 (СН3-С(0)-0-Ср), Ii (С(0)-0-Ср-Са), т2 (0-Cp-Ca-N). Для угла т0 возможна только цис- или транс-конформация, но энергия цис-конформера более чем на 3 ккал/моль выше, поэтому при расчете использовалась только транс-конформация. Таким образом, для описания холинового фрагмента указанных соединений варьировались значения двух углов: ti и Тг. Для соединений (XXXI) и (XXXII) значения углов т0' и т0" ((СН3-С(0)-0-Ст) и (СНз-С(О)-О-С5) соответственно) также принимались равными 180°. Для соединения (XXXI) варьировались значения углов тГ (С(0)-0-Сг-Ср), т2' (0-Ст-Ср- С"), т3' (Cy-Cp-Cu-N); для соединения (XXXII) -значения углов ц" (С(0)-0-С8-С1'), т2" (0-Св-Ст- Ср), т3" (C^C-C^C"), т4" (CT-Cp-Ca-N).

Расчет показал, что в ряду аналогов ацетилхолина с различной структурой ацильной части (соединения (1)-(ХХН)) для всех данных молекул из 9 возможных конформаций холинового фрагмента существует 7 устойчивых. Для каждой конформации холинового фрагмента была рассчитана суммарная заселенность и затем были рассчитаны коэффициенты корреляции между значениями найденных заселенностей и скоростями холинэстеразного гидролиза данных соединений. Была выявлена достоверная корреляция между заселенностью полностью вытянутой П-конформации холинового фрагмента и скоростью гидролиза под действием АХЭ, что согласуется с литературными данными и доказывает достоверность применяемого в представленной работе подхода.

Была выявлена достоверная корреляция между заселенностью полусвернутой lg'-конформации холинового фрагмента и скоростью гидролиза под действием БуХЭ, что позволяет определить эту конформацию как продуктивную для бутирилхолинэстеразного гидролиза, и- и ^"-конформации АХ различаются расстоянием между функционально значимыми атомами: между карбонильным углеродом и азотом (с1с\) и между карбонильным кислородом и азотом (сЬы).

Был проведен полный конформационный анализ аналогов АХ с различной структурой холинового фрагмента (соединения (ХХШ)-(ХХХ1У)). Из полученного набора устойчивых конформеров были отобраны те, которые по значениям с!сы и ¿оы соответствуют конформации АХ. Выявлена достоверная корреляция между их заселенностью и скоростью гидролиза под действием БуХЭ (коэффициент корреляции равен 0.62). Был сделан вывод, что для гидролиза под действием БуХЭ продуктивны только те конформации субстратов, у которых расстояние между функционально значимыми атомами соответствует полусвернутой fg"-конформации АХ, отклонение значений с1сы и с^ не превышает 0.02 нм.

Наблюдаемые различия в скоростях гидролиза для пар энантиомеров при одинаковых заселенностях ^"-подобных конформаций свидетельствует о том, что в активном центре БуХЭ в направлении Я-энантиотопных атомов водорода продуктивно сорбированного /«"-конформера АХ имеется область существенного объема фермента, откуда производится атака серина на карбонильный углерод, а со стороны 8-энантиотопных атомов - область исключенного объема. Однако, примечательно, что оба изомера ацетил-а-метилхолина (соединения (XXIII) и (XXIV)) гидролизуются под действием БуХЭ с одинаковой скоростью (гидролиз под действием АХЭ проходит с разными скоростями), следовательно, протяженность области существенного объема БуХЭ меньше, чем у АХЭ.

Был проведен корреляционный анализ по поиску зависимости между объемами молекул и скоростью их гидролиза под действием ХЭ. В случае АХЭ была найдена достоверная корреляция, в случае БуХЭ найденный коэффициент корреляции не является достоверным, что

говорит об отсутствии какой-либо зависимости между объемом молекулы и скоростью ее гидролиза под действием БуХЭ. Такое различие может быть объяснено тем, что стерические размеры активного центра БуХЭ, по крайней мере, в районе каталитической триады, и подхода к нему существенно больше, чем у АХЭ.

Тот факт, что разные конформации АХ продуктивны для ацетилхолинэстеразного и бутирилхолинэстеразного гидролиза, и объясняет различия в субстратной специфичности АХЭ и БуХЭ. Взаимное расположение функционально значимых атомов аналогов АХ (карбонильного углерода, карбонильного кислорода и азота) является критерием отбора продуктивных для гидролиза под действием этих ферментов конформеров. Выявленная корреляция между параметрами изолированных молекул субстратов и обобщенных кинетических характеристик указывает на то, что в продуктивном комплексе молекула лиганда находится в энергетически устойчивой конформации, что подтверждается высокими скоростями гидролиза жесткого циклопропильного аналога АХ.

Таблица 1а. Аналоги ацетилхолина с общей формулой К-С(0)0-(СН2)2 -И+(СН3)3 и относительные скорости их гидролиза под действием АХЭ и БуХЭ.

(I)

(II)

(III)

(IV)

(V)

(VI)

(VII)

(VIII)

(IX)

(X)

(XI)

(XII)

(XIII)

(XIV)

(XV)

(XVI)

(XVII)

(XVIII)

(XIX)

(XX)

(XXI)

(XXII)

V отн, %, АХЭ

СНз-

н-С2Н,-с,н7-СД1.Г (СН,)2СН-С2Н5(СН,)СН-* (С2Н5)2СН-

сн2=сн-сн,сн=сн-сн2=снсн,-СН2=С(СНз)-С2Н5СН=СН- * СН,=СНСН2СН2-СН,СН=С(СН3)-(СН,)2ОСН- * СН3СН=С(С2Н5)- * С„н5-С6Н5СИ2СН2-

,1ч-П-а1—

лг

N11—^

<г

сг*

V огн, %, БуХЭ

100 66 70 2 1

40 1 о 12 2 11 20 0 О 0 О

о о о

100 180 180 240 180 108 13 16 100 20 186 47 10 220 11 0 9 50 195 50

240

Таблица 16. Аналоги ацетилхолина с общей формулой К-С(0)0-(С'1Ь)2 -М+(СНз)з и относительные скорости их гидролиза под действием АХЭ и БуХЭ.

сонфигурацня

атомов

соед. я А С" с" V отн, %, АХЭ V отн. %, БуХЭ

(XXIII) (XXIV) сн,-СН)- -СН,-С"Н(СН,)- я в 84 110 150 150

(XXV) (XXVI) с,н,- -СРН(СН5)-СН2- я в 0 0 0 10

(XXVII) (XXVIII) сн,-сн,- Р п -СП—сн- \/ СП, я в я в 56 96 33 61

(XXIX) СНз- я в 0 0

(XXX) сн,- в я 0 0

(XXXI) сн,- -СгН2-С|,Н2-СиН2- 70 7.2

(XXXII) СНз- -СйН2-С'Н2-СрН2-СиН2- 10 0.6

(XXXIII) (XXXIV) сн,- С11-Г 11 я Б 0.8 103 0 45

Роль электростатических взаимодействии в процессе сорбции лигапдов в активные центры холинэстераз по данным молекулярного моделирования.

Для выявления роли электростатических взаимодействий в процессе сорбции лигандов в активные центры ХЭ методами молекулярного моделирования изучены взаимодействия АХЭ и БуХЭ с молекулами положительно заряженного обратимого ингибитора тетраметиламмония И+(СНз)4 (ТМА) и модельного соединения неопентана (2,2-диметилпропан, С(СНз>4), незаряженного структурного аналога ТМА. Неопентан был выбран для того, чтобы выявить электростатическую составляющую взаимодействия катионсодержащего ТМА с ХЭ.

Был проведен молекулярный докинг молекул ТМА и модельного соединения неопентана в активный центр АХЭ и БуХЭ. Анализ показал, что в комплексах неопентан-АХЭ и неопентан-БуХЭ молекула лиганда сорбируется в ущелье активного центра на расстоянии 0.47 и 0.49 нм от центра бензольного кольца триптофана соответственно. Поскольку образование пи-катионной связи между незаряженной молекулой неопентана и остатком триптофана анионного сайта фермента невозможно, по всей видимости, лиганд закрепляется в активном центре АХЭ и БуХЭ за счет других сил, возможно, за счет гидрофобных взаимодействий с ароматическими аминокислотами ущелья активного центра.

Анализ полученных комплексов АХЭ и БуХЭ с молекулой ТМА показал, что молекула лиганда сорбируется в анионном сайте фермента над бензольным кольцом триптофана на

расстоянии 0,45 нм от его центра. Таким образом, выполняются все условия образования пи-катионной связи между положительно заряженной молекулой ТМА и триптофаном анионного сайта фермента.

Для того чтобы оценить количественно способность АХЭ и БуХЭ связывать положительно заряженные и нейтральные лиганды, по результатам молекулярного докинга были рассчитаны свободные энергии взаимодействия обоих ферментов с ТМА и модельным соединением неопентаном (таблица 2). Анализ полученных значений выявил, что наименьшее еродство наблюдается для незаряженных молекул. Такой результат согласуется с многочисленными экспериментальными данными о преимущественной активности положительно заряженных лигандов при взаимодействии с АХЭ и БуХЭ и свидетельствует об участии электростатических взаимодействий в процессе сорбции. Сопоставление значений свободной энергии связывания молекулы ТМА с АХЭ и БуХЭ показывают большую стабильность комплекса ТМА-АХЭ по сравнению с комплексом ТМА-БуХЭ. Такое соотношение качественно согласуется с экспериментальными данными о том, что ТМА является более сильным ингибитором для АХЭ, чем для БуХЭ.

Таблица 2. Оценка значений свободных энергий образования комплексов неопентана, тетраметиламмония с ацетилхолинэстеразой и бутирилхолинэстеразой и литературные данные о кинетических характеристиках взаимодействия лигандов с ферментами.

Лиганд Формула Ацетилхолинэстераза Бутирилхолинэстераза

Аффинность, ккал/моль Кинетический параметр Аффинность, ккал/моль Кинетический параметр

неопентан С(СН;) , -2.2 не активен -1.4 не активен

ТМА гг (СНз) , -10.6 ркА=3. ЗМ -8.2 р^=2. 5М

Полученные методом молекулярного докинга комплексы использовались как стартовые точки для дальнейшей симуляции методом молекулярной динамики. По полученным траекториям была рассчитана зависимость от времени значения расстояния между центральным атомом лиганда и центром бензольного кольца триптофана (рис. 5).

Анализ полученных графиков показал, что комплексы неопентана с АХЭ и БуХЭ нестабильны (рис 5а). При взаимодействии с АХЭ за расчетное время расстояние между центральным атомом неопентана и центром кольца триптофана увеличивается до 0.6 нм, при этом молекула неопентана сдвигается по направлению к периферическому сайту связывания, расположенному у входа в ущелье активного центра. Комплекс неопентан-БуХЭ еще более нестабилен т расстояние до триптофана резко увеличивается до 1.2 нм, графический анализ

конечного комплекса показал, что за 5000 пс лиганд полностью покидает активный центр через ущелье.

а).

б).

Уп./

Рисунок 5. Зависимость расстояния между центральным атомом лигандов ((а) центральным атомом углерода неопентана, (б) центральным атомом азота тетраметиламмония) и центром кольца триптофана анионного сайта ферментов ацетилхолинэстеразы (черная линия) и бутирилхолинзстеразы (серая линия).

В комплексе ТМА-АХЭ положение лиганда относительно бокового радикала триптофана практически не изменялось на протяжении 5000 пс симуляции, комплекс ТМА-БуХЭ менее стабилен (рис. 56). Описанное поведение необратимых ингибиторов в активном центре АХЭ и БуХЭ качественно согласуется с рассчитанными нами значениями аффинностей: чем ниже абсолютное значение свободной энергии, тем менее стабилен фермент-лигандный комплекс.

На основании проведенного исследования было показано, что на стадии сорбции роль электростатических взаимодействий ограничивается пи-катионным связыванием заряженной катионной группировки молекулы лиганда с бензольным кольцом триптофана. Эффективность ингибирующей способности обратимого положительно заряженного ингибитора зависит от прочности этой связи.

Известно, что для второй стадии холинэстеразного гидролиза, а именно деацилирования серина каталитической триады, необходим перенос протона с каталитического гистидина на каталитическую глутаминовую кислоту (Zhang Y. et al, 2002). Был проведен молекулярный докинг молекулы ФоХ в активные центры АХЭ и БуХЭ с «дважды» активированным активным центром: депротонированным серином, единожды протонированным гистидином и протонированной глутаминовой кислотой.

Графический анализ результатов молекулярного докинга показал, что ни один из полученных комплексов не является продуктивным. Более того, при такой активации аминокислот триады триметиламмониевая группа молекулы субстрата не образует пи-катионной связи с триптофаном «анионного» центра фермента. Известно, что процесс деацилирования серина сопряжен с выходом молекулы холина из активного центра ХЭ. Поэтому выдвинуто предположение, что переход протона с каталитического гистидина на глутаминовую кислоту ведет к перераспределению зарядов в активном центре АХЭ и БуХЭ, что в свою очередь способствует ослаблению пи-катионной связи между положительно заряженной группой молекулы лиганда и триптофаном «анионного» центра фермента.

Рисунок 6. Молекула формилхолина, непродуктивно сорбированная в активном центре ацетилхолинэстеразы (а) и бутирилхолинэстеразы (б).

Изучение механизма действия необратимого катионсодержащего ингибитора холинэстераз.

Для исследования механизма связывания ХЭ с необратимыми фосфорорганическими ингибиторами (ФОН) в работе был проведен молекулярный докинг молекулы метилфторфосфорилхолина (СНзР(Р)(0)0(СН:)2 1Ч+(СНз)з, МФФХ) в активные центры АХЭ и БуХЭ. Выбор данного соединения определялся тем, что его структура близка к структуре АХ, и из литературы известны кинетические характеристики его взаимодействия с АХЭ и БуХЭ. Результатом процедуры молекулярного докинга является набор наиболее энергетически выгодных конформаций лиганд-ферментного комплекса. С целью поиска продуктивных комплексов ХЭ с МФФХ из полученного набора были отобраны конформации с наименьшей энергией. Для оценки их продуктивности использовались следующие критерии:

1. Расстояние между гидроксильным атомом каталитического серина и атомом фосфора молекулы МФФХ сШ^Р-Эег), которое характеризует возможность реакции фосфорнлировання фермента.

2. Расстояние между центром кольца триптофана и атомом азота лиганда (-ПзКМ-Тгр), а также значение угла (а) между плоскостью бензольного кольца триптофана и отрезком, соединяющим его центр и атом азота. Оба эти параметра характеризуют возможность образования пи-катионной связи между катионом лиганда и анионным сайтом фермента.

3. Расстояния между фосфорильным кислородом лиганда и атомами водорода МН-групп остатков аланина и двух остатков глицина оксианионной полости (01у 118, 01у 119 и А1а201 для АХЭ; 01у116, 01у117 и АЫ99 для БуХЭ): (^(О^у! 18(116)), с115Н0,.-01у119(117)) и 1ВДОР-А1а201(199)), указывающее, сорбируется пи продуктивно фосфорильная часть ФОН в оксианионной полости фермента.

4. Расстояние между атомом НЕ каталитического гистидина и эфирным кислородом лиганда ((ИбКОе-Шз)), характеризующее возможность переноса протона с гистидина на эфирный кислород и дальнейшего освобождения холинового фрагмента.

5. Расстояние между атомами фосфора и азота лиганда с1Ы(М-Р), которое определяет конформацию холинового фрагмента молекулы МФФХ.

Данные о том, при каких значениях описанных выше параметров возможна продуктивная сорбция лиганда в активный центр ХЭ, были взяты из литературных источников (Соки§га§ КА., 2003). Помимо описанных параметров, для каждой полученной конформации была рассчитана энергия комплекса. Однако значение энергии комплекса может служить лишь для оценки вероятности нахождения молекулы в данной конфигурации, но не может являться критерием отбора продуктивных конформаций, поскольку известно, что продуктивный лиганд-ферментных комплекс не является наиболее энергетически выгодным.

Результаты молекулярного докинга МФФХ в активные центры АХЭ и БуХЭ с неактивированными аминокислотами каталитической триады представлены в таблицах 4 и 5 соответственно. Анализ рассчитанных параметров показал, что ни одна из полученных конформаций комплексов МФФХ-АХЭ и МФФХ-БуХЭ не является продуктивной. Пример непродуктивного комплекса МФФХ-АХЭ приведен на рисунке 7а. Был сделан вывод, что для правильного расположения молекулы ФОН в центре связывания ХЭ, так же, как и в случае субстрата, необходима активация аминокислот каталитической триады ферментов, а именно перенос протона с гидроксила каталитического серина на атом азота имидазольного кольца каталитического гистидина. Для проверки данной гипотезы был проведен молекулярный докинг молекулы МФФХ в активированные активные центры АХЭ и БуХЭ, и аналогичным

образом были отобраны и проанализированы наиболее энергетически выгодные конформации полученных комплексов.

Результаты докинга МФФХ в активированные активные центры АХЭ и БуХЭ представлены в таблицах 5 н 6 соответственно.

Таблица 3. Результат молекулярного докинга молекулы МФФХ в неактивированный активный центр АХЭ.__

Конформации

Параметры продуктивности 1 2 3 4 5

1 01$1(Р-5ег), нм 0.56 0.59 0.60 0.61 0.81

01з1(К-Тгр), нм 0.49 0.53 0.53 0.58 0.46

а, градусы 85.7 85.9 85.9 85.8 84.8

а151(Ор-С1у 118), нм 0.28 0.30 0.30 0.33 0.73

3 (11$!(0р-01у119), нм 0.41 0.43 0.45 0.49 0.74

сШ1(0Р-А1а201), нм 0.46 0.48 0.47 0.49 0.86

4 (Кз1(0Е-№5440), нм 0.78 0.81 0.79 0.79 0.79

5 (^(М-Р), нм 0.42 0.43 0.45 0.45 0.44

Энергия, ккап/моль -1639.01 -1604.79 -1604.60 -1604.46 -1599.88

Оценка продуктивности - - - - -

Таблица 4. Результат молекулярного докинга молекулы МФФХ в неактивированный активный

Конформации

Параметры продуктивности 1 2 3 4 5

1 0151(Р-Зег), нм 0.37 0.37 0.33 0.33 0.36

015Г(Ы-Тф), нм 0.48 0.46 0.45 0.46 0.47

а, градусы 86.4 86.8 86.7 86.1 86.3

<11з1(0р-01у118),нм 0.33 0.32 0.20 0.46 0.30

3 (Н51(0р-01у119), нм 0.46 0.43 0.21 0.52 0.43

Шз1(0р-А1а201), нм 0.55 0.54 0.31 0.52 0.53

4 0Е-НЫ40), нм 0.69 0.68 0.62 0.72 0.69

5 <^(>4-Р), нм 0.52 0.52 0.46 0.52 0.52

Энергия, ккал/моль -1595.84 -1595.75 -1591.17 -1587.87 -1580.53

Оценка продуктивности - - - - -

Таблица 5. Результат молекулярного докинга молекулы МФФХ в активированный активный центр ЛХЭ.__

Конформашш

Параметры продуктивности 1 2 3 4 5

1 О^Р-Зег), нм 0.36 0.37 0.35 0.35 0.42

о Ок^Ы-Тф), нм 0.46 0.45 0.46 0.46 0.48

а, градусы 86.8 87.1 87.3 87.1 86.4

(^(Ор-СТуШ), нм 0.21 0.20 0.23 0.26 0.42

3 1М(0р-01у119), нм 0.21 0.20 0.24 0.24 0.30

сШ1(0Р-А1а201), нм 0.24 0.24 0.25 0.27 0.49

4 аЫ(0Е-Н15440), нм 0.42 0.45 0.43 0.44 0.41

5 (^КИ-Р), нм 0.46 0.47 0.45 0.44 0.52

Энергия, ккал/моль -1622.81 -1622.48 -1622.39 -1622.15 -1620.85

Оценка продуктивности + + + + -

Таблица 6. Результат молекулярного докинга молекулы МФФХ в активированный активный центр БуХЭ.__

Конформацни

Параметры продуктивности 1 2 3 4 5

1 Б^Р-Бег), нм 0.62 0.43 0.45 0.60 0.62

1 01§1(М-Тгр), нм 0.45 0.48 0.46 0.44 0.45

а, градусы 85.5 87.9 85.8 85.6 85.7

сНз1(0р-01у118), нм 0.84 0.20 0.19 0.83 0.84

3 сМОр-С1у119), нм 0.86 0.21 0.21 0.85 0.86

сН51(Ор-А1а201), нм 0.89 0.26 0.27 0.87 0.90

4 (И51(Ое-Н1з440), нм 0.34 0.34 0.37 0.32 0.34

5 сНв^М-Р), нм 0.44 0.44 0.43 0.45 0.44

Энергия, ккал/моль -1573.51 -1571.79 -1560.92 -1560.21 -1559.97

Оценка продуктивности - + + - -

Анализ рассчитанных параметров показал, что среди полученных конформаций комплексов МФФХ-АХЭ и МФФХ-БуХЭ есть как те, которые не удовлетворяют всем вышеперечисленным критериям (Рис. 76), так и те, которые могут быть отобраны как продуктивные (Рис. 7в).

а). б). в).

Рисунок 7. Результаты молекулярного докинга молекулы метилфторфосфорилхолина (МФФХ) в активный центра ацетилхолинэстеразы (АХЭ): (а) МФФХ, непродуктивно сорбированный в неактивированном активном центре АХЭ, (б) МФФХ, непродуктивно сорбированный в активированном активном центре АХЭ, (в) МФФХ, продуктивно сорбированный в активированном активном центре АХЭ.

Результаты молекулярного докинга демонстрируют, что образование продуктивного комплекса ХЭ с необратимым ингибитором, так же, как и в случае субстрата, возможно только после активации аминокислот каталитической триады, а именно конформационных изменений активного центра фермента и переноса протона с гидроксила серина на имидазольное кольцо гистидина. Известно, что при природном уровне рН остатки серина и гистидина находятся в неактивированном состоянии, переход протона требует затрат энергии, поэтому остается открытым вопрос, какие внешние факторы способны спровоцировать такой перенос. Возможно, сорбция молекулы субстрата или необратимого ингибитора в периферическом сайте фермента приводит к конформационным изменениям в активном центре, благоприятствующим переносу протона с серина на гистидин. Моделирование таких процессов методами молекулярной динамики и квантовой химии является задачей наших последующих исследований.

Выводы.

1. Продуктивное связывание молекулы субстрата или необратимого ингибитора с активным центром холинэстераз возможно только при активации каталитической триады фермента, а именно переносе протона с каталитического серина на каталитический гистидин, сопровождающимся конформационными изменениями активного центра.

2. Роль электростатических взаимодействий в продуктивной сорбции положительно заряженных лигандов (субстратов, необратимых и обратимых ингибиторов) обусловлена образованием пи-катионной связи между молекулой лиганда и бензольным кольцом триптофана анионного участка активного центра холинэстераз. Заякоривание происходит вне

зависимости от активации каталитической триады. Эффективность ингибирующей способности обратимого положительно заряженного ингибитора зависит от прочности его пи-катионной связи с бензольным кольцом триптофана.

3. Энергетически устойчивая полусвернутая конформация ацетилхолина является продуктивной для гидролиза под действием бутирилхолинэстеразы. БуХЭ гидролизует только те аналоги АХ, у которых имеются энергетически устойчивые конформеры, совместимые с продуктивной конформацией АХ по взаимному расположению функциональных атомов: карбонильного углерода, карбонильного кислорода и азота (отклонение значений расстояний между этими атомами не превышает 0.02 нм).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Белинская Д. А., Шестакова Н. П., Иуффер А. X. Особенности сорбции субстратов в активный центр холинэстераз. // Сборник тезисов 12-й международной Пущинской школы-конференции «Биология - наука XXI века». 2008. С.8.

2. Belinskaya D.A., Shestakova N.N., Juffer А.Н. Theoretical investigation of substrate sorption into Cholinesterase active site. // The FEBS Journal. 2008. V.275. Supplement 1. P. 158.

3. Белинская Д. А., Шестакова H. H., Иуффер А. X. Изучение механизма сорбции субстратов в активный центр холинэстераз методами молекулярного моделирования. // Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 2008. С.37.

4. Belinskaya D.A., Shestakova N.N., Juffer А.Н. Modeling of Substrates Sorption into Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase Active Sites Using Molecular Docking Method. //Chemistry Central Journal. 2008. V.2. Supplement 1. P.30

5. Белинская Д.А., Шестакова H.H. Метод теоретического конформацнонного анализа для определения продуктивных конформаций субстратов ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы // Биоорганическая химия. 2005. Т.31. №4 С. 466-473.

6. Белинская Д.А. Моделирование продуктивной сорбции молекул субстратов в активном центре холинэстераз по данным теоретического конформацнонного анализа. // Сборник тезисов 9-й международной Пущинской школы-конференции «Биология - наука XXI века». 2005. С.143.

7. Белинская Д.А., Шестакова H.H. Особенности строения и механизма действия ферментов ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы по данным теоретического

конформационного анализа. // Сборник тезисов конференции «XXXIII неделя науки в СПбГПУ». 2004. С.72.

8. Белинская Д.А., Шестакова H.H. Продуктивная сорбция молекул субстратов в активном центре ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы по данным теоретического конформационного анализа. Представлено академиком РАН В.Л.Свидерским // Доклады Академии Наук. 2004. Т.396. №2. С.258-262.

9. Белинская Д.А. Продуктивная сорбция ацетилхолина в активном центре холинэстераз. // Сборник тезисов 8-й международной Пущинской школы-конференции «Биология -наука XXI века». 2004. С.26

10. Белинская Д.А., Фалькович С.Г. Теоретический анализ структурно-функциональных отношений субстратов холинэстераз. // Сборник тезисов итогового семинара по физике и астрономии по результатам конкурса грантов 2002 года для молодых ученых Санкт-Петербурга. 2003. С.5.

11. Белинская Д.А. Особенности продуктивной сорбции ацетилхолина в активном центре холннэстераз по данным теоретического конформационного анализа. // Сборник тезисов конференции «XXXII неделя науки в СПбГПУ». 2003. С.21.

Подпись соискателя

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 17.11.2009. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 5169Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812)297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белинская, Дарья Александровна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Холинэстеразы различных организмов.

1.1.1. Нетипичные ацетилхолинэстеразы.

1.1.2. Нетипичные бутирилхолинэстеразы.

1.2 Механизм взаимодействия ХЭ с лигандами.

1.2.1. Взаимодействие с субстратами.

1.2.1.1. Первая стадия - образование продуктивного фермент-субстратного комплекса.

1.2.1.2. Вторая стадия — ацилирование фермента.

1.2.1.3. Третья стадия - деацилирование фермента.

1.2.2 Взаимодействие ХЭ с обратимыми ингибиторами.

1.2.3. Взаимодействие ХЭ с необратимыми ингибиторами.

1.2.3.1. Первая стадия - образование фермент-ингибиторного комплекса.

1.2.3.2 Вторая стадия - фосфорилирование фермента.

1.2.3.3. Дефосфорилирование фермента.

1.3. Структура холинэстераз.

1.3.1. Эстеразный пункт.

1.3.2. Анионный сайт.

1.3.3. Оксианионная полость.

1.3.4. Ацильная петля.

1.3.5. Периферический анионный сайт. Омега-петля.

1.4. Молекулярное моделирование биологических молекул.

1.4.1. Молекулярный докинг.

1.4.2. Молекулярная динамика.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Силовые поля и минимизация энергии.

2.2. Расчет аффинностей.

2.3. Реализация методов и программное обеспечение.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Особенности сорбции АХ и его аналогов в активные центры ХЭ по данным молекулярного моделирования.

3.2. Теоретический конформационный анализ аналогов АХ с различной структурой ацильной части и холинового фрагмента.

3.3. Роль электростатических взаимодействий в процессе сорбции лигандов в активные центры холинэстераз по данным молекулярного моделирования.

3.4. Изучение механизма действия необратимого катионсодержащего ингибитора холинэстераз.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярное моделирование связывания лиганда с активным центром холинэстераз"

Актуальность темы.

Сериновые гидролазы холинэстеразы (ХЭ) присутствуют во многих организмах, от беспозвоночных до млекопитающих. По субстратно-ингибиторной специфичности ХЭ делятся на ацетилхолинэстеразы (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы (БуХЭ). АХЭ участвует в проведении нервного импульса и является мишенью для многих нейролептических препаратов, фосфорорганических ингибиторов и нервнопаралитических отравляющих веществ, а БуХЭ способна гидролизовать широкий спектр токсичных эфиров (зарин, зоман, кокаин). Поэтому исследование механизма связывания различных типов лигандов в активном центре этих ферментов представляет огромный интерес с теоретической и практической точки зрения: для изучения механизма действия ферментов в целом, для создания новых эффективных лекарственных средств, инсектицидов и пестицидов избирательного действия.

Компьютерное моделирование позволяет получить структуру продуктивного лиганд-ферментного комплекса, рассчитать его динамические и энергетические параметры, выявить факторы, обуславливающие субстратно-ингибиторную специфичность ферментов. Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные о кинетических характеристиках взаимодействия ХЭ с различными типами лигандов и известные трехмерные структуры этих ферментов дают возможность использовать данный подход и для изучения ХЭ. Полученные данные могут быть использованы для изучения механизма действия ферментов в целом.

Цель работы.

Задачи исследования.

1. Построить и исследовать модели продуктивных комплексов холинэстераз с субстратами, обратимыми и необратимыми ингибиторами.

6. В рамках построенных моделей провести анализ структурно-функциональных отношений лигандов холинэстераз.

Положения, выносимые на защиту.

Для образования продуктивного комплекса холинэстераз с субстратом и необратимым ингибитором необходима активация аминокислот каталитической триады фермента, а именно перенос протона с серина на гистидин, что сопровождается конформационными изменениями активного центра.

Энергетически устойчивая полусвернутая транс-антигош-конформации АХ является продуктивной для гидролиза под действием БуХЭ. БуХЭ гидролизует только те аналоги АХ, у которых имеются энергетически устойчивые конформеры, совместимые с продуктивной конформацией АХ по взаимному расположению функциональных атомов: карбонильного углерода, карбоксильного кислорода и азота. Отклонение значений расстояний между этими атомами не превышает 0.02 нм.

Роль электростатических взаимодействий на стадии сорбции положительно заряженных молекул лиганда выражается в заякоривании его катионной группировки в районе бензольного кольца триптофана анионного участка активного центра холинэстераз за счет образования пи-катионных взаимодействий. Эффективность ингибирующей способности обратимого положительно заряженного ингибитора зависит прочности этой связи.

Научная новизна результатов.

Теоретическое и практическое значение работы.

Апробация работы.

Пущино, 2004), конференции «XXXIII неделя науки в СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2004), 9-й международной Пущинской школе-конференции «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2005), международной конференции «3. German Conference on Chemoinformatics» (Гослар, 2007), 12-й международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), международной конференции «33 d FEBS Congress» (Афины, 2008).

Публикации.

По результатам диссертации опубликовано 11 печатных работ, 2 из них в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа (80 страниц) состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (101 ссылка), содержит 12 иллюстраций и 12 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Белинская, Дарья Александровна

выводы.

1. Образование продуктивных комплексов холинэстераз с молекулами субстратов и необратимых ингибиторов возможно только при активации каталитической триады фермента, а именно конформационных изменений активного центра фермента и переносе протона с каталитического серина на каталитический гистидин.

2. Роль электростатических взаимодействий при продуктивной сорбции положительно заряженных лигандов (субстратов, необратимых и обратимых ингибиторов) обусловлена образованием пи-катионной связи между молекулой лиганда и бензольным кольцом триптофана анионного участка активного центра холинэстераз. Заякоривание происходит вне зависимости от активации каталитической триады. Эффективность ингибирующей способности обратимого положительно заряженного ингибитора зависит от прочности его пи-катионной связи с бензольным кольцом триптофана.

3. Энергетически устойчивая полусвернутая конформация ацетилхолина является продуктивной для гидролиза под действием бутирилхолинэстеразы. БуХЭ гидролизует только те аналоги АХ, у которых имеются энергетически устойчивые конформеры, совместимые с продуктивной конформацией АХ по взаимному расположению функциональных атомов: карбонильного углерода, карбоксильного кислорода и азота (отклонение значений расстояний между этими атомами не превышает 0.02 нм).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белинская, Дарья Александровна, Санкт-Петербург

1. Белинская Д.А., Шестакова H.H. Определение продуктивных конформаций субстратов для гидролиза под действием ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы методом теоретического конформационного анализа // Биоорганическая химия. 2005. - Т.31. - С.419-426.

2. Белинская Д.А., Шестакова H.H. Продуктивная сорбция молекул субстратов в активном центре ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы по данным теоретического конформационного анализа // Доклады академии наук. — 2004. -Т.396. С.258-262.

3. Бресткин А.П., Годовиков H.H. Комбинированный вид ингибирования холинэстераз фосфорорганическими соединениями // Успехи химии. — 1978. — Т.7, №9.-С. 1609-1627.

4. Бресткин А.П., Жуковский Ю.Г., Фарцейгер H.JI. Каталитические свойства холинэстераз мозга и сыворотки крови голубя Columbia livia // Ж. эвол. биохим. физиол. 1983. - Т. 19, №2. - С. 138-143.i

5. Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.Н., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов. Владивосток: ТИНРО-Центр, 1997. -466 с.

6. Брик И.Л., Мандельштам Ю.Е. Свойства холинэстеразы нервной системы саранчи Locusta migratoria // Ж. эвол. биохим. физиол. 1973. - Т.9, №2. - С.138-143.

7. Брик И.Л., Мандельштам Ю.Е., Федин А.Н. Холинэргические системы насекомых. / Сравнительная фармакология синаптических рецепторов. Под ред. Е.М.Крепса. Л.: Наука, 1977. С. 143-151.

8. Дашевский В.Г. Конформационный анализ органических молекул. Москва: Химия, 1982. 272с.

9. Журавская С.А., Бобырева T.B. Физиолого-биохимичеекие основы действия инсектицидов на насекомых вредителей хлопчатника. Ташкент: ФАН, 1970. С.З-52.

10. Кулиева A.M., Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Особенности ингибиторной специфичности холинэстераз гусениц хлопковой совки Heliothis armígera Hbn. // Ж. эвол. биохим. физиол. 1995. - Т.31, № 1. с. 270-276.

11. Маслов В.Г. // Журнал структурной химии. 1977. Т.18. С.414-415.

12. Моралев С.Н. Активный центр холинэстераз. Статистический анализ вариабельности структуры // Ж. эвол. биохим. физиол. 2001. — Т.37, № 1. — С. 2127.

13. Моралев С.Н, Розенгарт Е.В. Сравнительная чувствительность холинэстераз различного происхождения к некоторым необратимым ингибиторам // Ж. эвол. биохим. физиол. 2004. - Т.40, № 1. - С. 3-15.

14. Моралев С.Н., Перченок A.IO. Сравнительный анализ чувствительности холинэстераз к обратимым ингибиторам методами многомерной статистики // Ж. эвол. биохим. физиол. 2008. - Т.44, № 5. - С. 488-491.

15. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Ингибиторный анализ холинэстераз различного происхождения (варьирование структуры отщепляемой группировки фосфорорганических ингибиторов) // Журн. Эволюц. Биохим. Физиолог. — 2005. — Т.41, № 3. — С.201-216.

16. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Сравнительный анализ чувствительности холинэстераз различного происхождения к бисониевым обратимым ингибиторам // Ж. эвол. биохим. физиол. 2008. - Т.44, № 4. - С. 352-363.

17. Никанорова Е.В. Новые данные о свойствах холинэстеразы гороховой тли (Acyrthosiphon pisum Harr.) // Бюлл. ВНИИ защ. раст. 1980. - Т.49. - С. 31-32. 64

18. Новожилов К.В., Сазонова И.Н., Андреева Н.А., Агеенко О.И. Некоторые характеристики холинэстеразы Apanteles glomeratus L., паразита капустной белянки Pieris brassicae L. // Бюлл. ВНИИ защ. раст. 1976. - Т.36. - С. 58-64.

19. Садыков А.С., Розенгарт Е.В., Абдувахабов А.А., Асланов Х.А. Холинэстеразы. Активный центр и механизм действия. — Ташкент: Фан, 1976. — 208с.

20. Тилябаев 3. Свойства холинэстеразы и карбоксилэстеразы нервной ткани саранчи Locusta migratoria // Ж. эвол. биохим. физиол. 1978ю - Т. 14, №14. - С. 405-407.

21. Чарыева О.Б., Кулиева A.M., Моралев С.Н., Розенгарт В.И. Холинэстеразы хлопковой совки (Heliothis armigera Hbh.) // Изв. АН ТуркмССР, сер. биол. наук. -1991. -№3.- С. 78-80. 44

22. Шестакова Н.Н., Розенгарт Е.В. Конформационные различия при сорбции холиновых лигандов в активном центре ацетилхолинэстеразы // Биоорганическая химия. 1995. - Т.21, № 5. - С.323-329.

23. Шестакова Н.Н., Розенгарт Е.В., Хованских А.Е., Жоров Б.С., Говырин В.А. Определение продуктивных конформаций субстратов ацетилхолинэстеразы с помощью теоретического конформационного анализа // Биоорганическая химия. -1989.- Т.15,№3,-С. 335-344.

24. Abagyan R., Totrov М., Kuznetsov D. ICM a new method for protein modelling and design. Applications to docking and structure prediction from the distorted native conformation// J. Сотр. Chem. 1994. V.15. P.488-506.

25. Abedi Karjiban R., Abdul Rahman M.B., Basri M., Salleh A.B., Jacobs D., Abdul Wahab H. Molecular dynamics study of the structure, flexibility and dynamics of thermostable 11 lipase at high temperatures // Protein J. 2009. - V.28, N 1. - P. 14-23.

26. Augustinsson K.-B. Electrophoresis studies on blood plasma esterases: 2. Avian, amphibian, reptilian and piscine plasmata // Acta Chem. Scand. 1959b. - V.13, N 6. -P. 1081-1096.

27. Berendsen N.J.C., Hayword S. Collective protein dynamics in relation to function. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. - V.10, N 2. - P. 165-169.

28. Berendsen H.J.C., Postma J.P.M., van Gunsteren W.F., Hermans J. Interaction models for water in relation to protein hydration // Intermolecular Forces/Eds Pullman B. Dordrecht: Reidel D. Publishing Company, 1981. P.331-342.

29. Berendsen H.J.C., van der Spoel D., van Drunen R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation // Comp. Phys. Comm. 1995. - V.91, N 1. - P.43-56.

30. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. 2000. V.28. P.235-242.

31. Brestkin A.P., Brick I.L., Grigor'eva G.M. Comparative pharmacology of cholincstcrases // Intern. Encycl. Pharmacol. Therap. Sect 85., N.l / Ed. M.J. Michelson. Oxford-N.Y.: Pergamon Press, 1973. P. 241-344.

32. Brick I.L., Brestkin A.P., Mandelstam Y.E. Properties of cholinesterase and carboxylesterase of nervous tissue of Periplaneta Americana // Insect Biochem. 1979. -V.9, N 4. — P. 397-401.

33. Bunker A., Mannisto P., St Pierre J.F., Rog T., Pomorski P., Stimson L., Karttunen M. Molecular dynamics simulations of the enzyme catechol-O-methyltransferase: methodological issues // SAR QSAR Environ Res. 2008. - V.19, N 1. - P. 179-89.

34. Qokugra§ N.A. Butyrylcholinesterase: Its function and inhibitors // Turkish Journal of Biochemistry. 2003. - V.28, N 1 - P.54-61.

35. Dauterman W.C., Talens A., van Asperen K. Partial purification and properties of fly head cholinesterase // J. Insect Physiol. 1962. - V.8, N 1. - P. 1-14.

36. Dobson C.M., Karplus M. Internal motion of proteins: Nuclear magnetic resonance measurements and dynamics simulations // Methods Enzymol. 1986. - V.131, N 1. - P. 362-369

37. Eichler J., Anselment A., Sussman J.L., Massoulie J., Silman I., Differential effects of "peripheral" site ligands on Torpedo and chicken acetylcholinesterase // Mol. Pharmacol. 1994. - V.45, N 2. - P. 335-340.

38. Enyedy I.J., Kovach I.M., Bencsura A. Molecular dynamics study of active-site interactions with tetracoordinate transients in acetylcholinesterase and its mutants // Biochem J. 2001. - V.353, N 3. - P. 645-53.

39. Favia AD, Nobeli I, Glaser F, Thornton JM. Molecular docking for substrate identification: the short-chain dehydrogenases/reductases // J. Mol. Biol. 2008. - V.375, N 3. - P. 855-874.

40. Gilson M.K., Straatsma T.P., McCammon J.A., Ripoll D.R., Faerman C.H., Axelsen P.H., Silman I., Sussman J.L. Open "back door" in a molecular dynamics simulation of acetylcholinesterase // Science. 1994. - V.263, N 5151. - P. 1276-1278.

41. Guibaut G.G., Huan S.S., Sadar M.H. Purification and properties of cholinesterases from honey bee Apis mellifera Linnaeus and boll weevils Anthonomus grandis Boheman // J. Agric. Food Chem. 1970. - V.18, N 4. - P.692. 36

42. Henchman R. H., Tai K., Shen T., McCammon J.A. Properties of water molecules in the active site gorge of acetylcholinesterase from computer simulation // Biophys J. 2002. -V.82, N 5. - P. 2671-2682.

43. Hevener K.E., Zhao W., Ball D.M., Babaoglu K., Qi J., White S.W., Lee R.E. Validation of Molecular Docking Programs for Virtual Screening against Dihydropteroate Synthase // J. Chem. Inf. Model. 2009. - V.49, N 2. - P. 444-460.

44. Hoare J. P., Laidler, K. J. // Molecular kinetics of the urea urease system II. The inhibition by products // J. Am. Chem. Soc. 1949. - V.71, N 6 - P.2487-2489

45. Horton J.R., Sawada K., Nishibori M., Cheng X. Structural basis for inhibition of histamine N-methyltransferase by diverse drugs // J. Mol. Biol. 2005. - V.353, N 2. -P. 334-344.

46. Hosea N.A., Berman H.A., Taylor P. Specificity and orientation of trigonal carboxyl esters and tetrahedral alkylphosphonyl esters in cholinesterases // Biochemistry. — 1995. -V. 34, N 36. P. 11528-11536.

47. Hosea N.A., Radic Z., Tsigelny I., Berman H.A., Quinn D.M., Taylor P. Aspartate 74 as a primary determinant in acetylcholinesterase governing specificity to cationic organophosphonates // Biochemistry. 1996. - V.35, N 33. - P. 10995-11004.

48. Ichiye T., Karplus M. Fluorescence depolarization of tryptophan residues in proteins: a molecular dynamics study // Biochemistry. 1983. - V.22, N 12. - P. 2884-2893.

49. Kunkee R.E., Zweig G. Substrate specificity studies on bee acetylcholinesterase purified by gradient centrifugation // J. Insect Physiol. 1963. - V.9, N 4. - P. 495-507.

50. Lamb M.L., Jorgenson W. Computational approaches to molecular recognition // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. - V.l, N 4. - P. 449-457.

51. Levine M.G., Suran A.A. A survey of some mammalian serum cholinesterases // Enzymologia. 1951. - V.15, N 1. - P. 17-20

52. Lockridge O. Genetic variants of human serum cholinesterase influence metabolism of the muscle relaxant succinylcholine// Pharmac. Ther. 1990. - V.47, N1. - P. 35-60.

53. Manulis S., Ishaaya J., Perry A.S. Acetylcholinesterase of Aphis citricola: Properties and significance in determining toxicity of systemic carbate compounds // Pestic. Biochem. Physiol. 1981. - V.15, N 3. - P. 267-274.

54. McCammon J.A., Gelin B.R., Karplus M. Dynamics of folded proteins // Nature. 1977. - V.267, N 5612. - P. 585-590.

55. Metcalf R.L., March R.B., Maxon M.G. Substrate preferences of insect cholinesterases // Ann. Entom. Soc. Amer. 1995. - V.48, N 4. - P. 222-228. 40

56. Moghul S., Wilkinson D. Use of acetylcholinesterase inhibitors in Alzheimer's disease // Expert Review of Neurotherapeutics. 2001. - V.l, N 1. - P.61-69.

57. Myers D.K. Studies on cholinesterase. 9. Species variation in the specificity pattern of the pseudocholinesterase // Biochem. J. 1953. - V.55, N 1. - P. 67-79.

58. Nabeshima T., Kozaki T., Tomita T., Kono Y. An amino acid substitution on the second acetylcholinesterase in the pirimicarb-resistant strains of the peach potato aphid, Myzus persicae // Biochem. Biophys. Res. Comm. — 2003. — V.307. — P. 15.

59. Nicolet Y., Lockridge O., Masson P., Fontecilla-Camps J.C., Nachon F. Crystal structure of human butyrylcholinesterase and of its complexes with substrate and products. // J. Biol. Chem. -2003. V.278, N 42. - P.41141-41147.

60. Ord M.G., Thompson R.H.S. The preparations of soluble cholinesterases from mammalian heart and brain // Biochem. J. 1951. - V.49, N 1. - P. 191-199.

61. Ordentlich A., Barak D., Kronman C., Ariel N., Segall Y., Velan B., Shafferman A. Functional Characteristics of the Oxyanion Hole in Human Acetylcholinesterase // J. Biol. Chem. 1998. -V.273, N 31. - P.9509-19517.

62. Radic Z., Gibney G., Kawamoto S., MacPhee-Quigley K., Bongiorno C., Taylor P. Expression of recombinant acetylcholinesterase in a baculovirus system: kinetic properties of glutamate 199 mutants // Biochemistry. 1992. - V.31, N 40. - P. 97609767.

63. Radic Z., Pickering N.A., Vellom D.C., Camp S., Taylor P. Three distinct domains in the Cholinesterase molecule confer selectivity for acetyl- and butyrylcholinesterase inhibitors // Biochemistry. 1993. - V. 32, N45. - P.12074-12084.

64. Raves M.L., Harel M., Pang Y.P., Silman I., Kozikowski A.P., Sussman J.L. 3D structure of acetylcholinesterase complexed with the nootropic alkaloid, (-)-huperzine A // Nat. Struct. Biol. 1997. - V.4. - P.57-63.

65. Ripoll D.R., Faerman C.H., Axelsen P.H., Silman I., Sussman J.L. An electrostatic mechanism for substrate guidance down the aromatic gorge of acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. -1993. V.90, N 11. - P. 5128-5132.

66. Roan C.C., Maeda S. The Cholinesterase systems of three species of fruit flies and the effects of certain insecticidal compounds on these enzymes // J. Econ. Entomol. 1954. -V.47, N 3. - P. 507-514.

67. Roan C.C., Hopkins T.L. Mode of action of insecticides // Annu. Rev. Entomol. 1961. -V.6. - 333-46.

68. Sharma S., Juffer A.H. Hydrolysis of phosphohistidine in water and in prostatic acid phosphatase // Chem. Commun. 2009. - V.14, N 42. - P. 6385-6387.

69. Sharma S., Pirilä P., Kaija H., Porvari K., Vihko P., Juffer A.H. Theoretical investigations of prostatic acid phosphatase // Proteins. 2005. - V.58, N 2. - P. 295308.

70. Sharma S., Rauk A., Juffer A.H. A DFT study on the formation of a phosphohistidine intermediate in prostatic acid phosphatase // J. Am. Chem Soc. 2008. — V.130, N 30. — P. 9708-9716.

71. Silver A. The biology of cholinesterases. Amsterdam: North Holland Publishing Co., 1974.-574p.

72. Smith J., Cusack S., Pezzeca U., Brooks B.R., Karplus M. Inelastic neutron scattering analysis of low frequency motion in proteins: A normal mode study of the bovine pancreatic trypsin inhibitor // J. Chem. Phys. 1986. - V.85, N 1. - P. 3636-3654.

73. Sun H., Pang Y.P., Oksana Lockridge O., Brimijoin S. Re-engineering Butyrylcholinesterase as a Cocaine Hydrolase // Mol. Pharmacol. — 2002. V.62, N 2. — P. 220-224.

74. Sussman J.L., Harel V., Frolow F., Oefner C., Goldman A., Toker L., Silman I. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: A prototypic acetylcholinesterase binding protein // Science. 1991. - V.253, N 5022. - P.872-879.

75. Tan R.C., Truong T.N., McCammon J.A., Sussman J.L. Acetylcholinesterase: electrostatic steering increases the rate of ligand binding. // Biochemistry. 1993. - V.32, N 2 - P.401-403.

76. Tikhonov D.B., Zhorov B.S. Structural model for dihydropyridine binding to L-type calcium channels // J. Biol. Chem. 2009. - V.284, N 28. - P. 19006-19017.

77. Tikhonov D.B., Zhorov B.S. Sodium channels: ionic model of slow inactivation and state-dependent drug binding // Biophys. J. 2007. - V.93, N 5. - P. 1557-15570.

78. Tumiatti V., Bolognesi M.L., Minarini A., Rosini M., Milelli A., Matera R., Melchiorre C. Progress in acetylcholinesterase inhibitors for Alzheimer's disease: an update // Expert Opinion on Therapeutic Patents. 2008. V.18. P.387-401

79. Van Gunsteren W.F., Mark A.E. Validation of molecular dynamics simulations // J. Chem. Phys. -1998. V.108, N 15. - P. 6109-6116.

80. Van Vlijmen H.W., IJzerman A.P. Molecular modeling of a putative antagonist binding site on helix III of the beta-adrenoceptor // J. Comput. Aided Mol. Des. — 1989. V.3, N 2.-P. 165-174.

81. Wang Z., Ling B., Zhang R., Suo Y., Liu Y., Yu Z,. Liu C. Docking and molecular dynamics studies toward the binding of new natural phenolic marine inhibitors and aldose reductase // J. Chem. Inf. Model. 2009. - V.28, N 2. - P. 162-169.

82. Wlodek S.T., Shen T.Y., McCammon J.A. // Biopolymers. 2000. V.53. P.265-271

83. Wolfgang S., Contreras J.M., Parrot I., Rival Y.M., Wermuth C.G. Structure-based 3D QSAR and design of novel acetylcholinesterase inhibitors // J. Comput. Aided Mol. Des. 2001. - V.15, N 5. - P. 395-410.

84. Wood E., Zebra E., Picollo M., de Licastro S. Partial purification and characterization of Triatoma infestans head cholinesterase // Insect Biochem. 1979. - V. 9, N 6. - P. 595601.

85. Zaloj V., Elber R. Parallel computations of molecular dynamics trajectories using the stochastic path approach // Comput. Phys. Commun. 2000. - V.128, N 1. - P. 118-127.

86. Zhang Y., Kua J., McCammon J.A. Influence of Structural Fluctuation on Enzyme Reaction Energy Barriers in Combined Quantum Mechanical/Molecular Mechanical Studies. // J. Phys. Chem. 2003. - V.107. - P.4459-4463.

87. Zhang Y., Kua J, J. McCammon J.A. Role of the Catalytic Triad and Oxyanion Hole in Acetylcholinesterase Catalysis: An ab initio QM/MM Study // J. Am. Chem. Soc. -2002. V.124, N 35. - P. 10572-10577.

88. Zhorov B.S., Lin S.X. Monte Carlo-minimized energy profile of estradiol in the ligand-binding tunnel of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase: atomic mechanisms of steroid recognition // Proteins. 2000. - V.38, N 4. - P. 414-27.

89. Zhorov B.S., Shestakova N.N., and Rozengart E.V. Determination of productive conformation of acetylcholinesterase substrates using molecular mechanics // Quant. Struct.-Act. Relat. 1991. - V.10., N 3. - P.205-210.

90. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

91. Белинская Д. А., Йуффер А. X., Шестакова Н. Н. Роль электростатических взаимодействий в процессе сорбции лигандов в активные центры холинэстераз по данным молекулярного моделирования. // Биоорганическая химия. Принято к печати.

92. Белинская Д. А., Шестакова Н. Н., Йуффер А. X. Особенности сорбции субстратов в активный центр холинэстераз. // Сборник тезисов 12-й международной Пущинской школы-конференции «Биология наука XXI века». 2008. С.8.

93. Belmskaya D.A., Shestakova N.N., Juffer А.Н. Theoretical investigation of substrate sorption into Cholinesterase active site. // The FEBS Journal. 2008. V.275. Supplement 1. P.158.

94. Белинская Д. А., Шестакова H. H., Йуффер А. X. Изучение механизма сорбции субстратов в активный центр холинэстераз методами молекулярного моделирования. // Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 2008. С.37.

95. Belinskaya D.A., Shestakova N.N., Juffer А.Н. Modeling of Substrates Sorption into Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase Active Sites Using Molecular Docking Method. //Chemistry Central Journal. 2008. V.2. Supplement 1. P.30

96. Белинская Д.А., Шестакова H.H. Метод теоретического конформационного анализа для определения продуктивных конформаций субстратов ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы // Биоорганическая химия. 2005. Т.31. №4 С. 466-473.

97. Белинская Д.А., Шестакова H.H. Особенности строения и механизма действия ферментов ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы по данным теоретического конформационного анализа. // Сборник тезисов конференции «XXXIII неделя науки в СПбГГТУ». 2004. С.72.

98. Белинская Д.А. Продуктивная сорбция ацетилхолина в активном центре холинэстераз. // Сборник тезисов 8-й международной Пущинской школы-конференции «Биология наука XXI века». 2004. С.26

99. Белинская Д.А. Особенности продуктивной сорбции ацетилхолина в активном центре холинэстераз по данным теоретического конформационного анализа. // Сборник тезисов конференции «XXXII неделя науки в СПбГПУ». 2003. С.21.1. Подпись соискателя

Информация о работе

Белинская, Дарья Александровна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.01.04

Диссертация

Молекулярное моделирование связывания лиганда с активным центром холинэстераз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Молекулярное моделирование связывания лиганда с активным центром холинэстераз ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное моделирование связывания лиганда с активным центром холинэстераз"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белинская, Дарья Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярное моделирование связывания лиганда с активным центром холинэстераз"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Белинская, Дарья Александровна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белинская, Дарья Александровна, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярное моделирование связывания лиганда с активным центром холинэстераз
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия