Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Опноидные пептиды в качестве модуляторов холинэстеразной активности

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Опноидные пептиды в качестве модуляторов холинэстеразной активности"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им.И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

УДК 577.150.5:577.153.4

МУРАНЕВИЧ Сергей Александрович

ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ В КАЧЕСТВЕ МОДУЛЯТОРОВ ХОЛИНЗСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

03.00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН и Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Полосатов М.В.

доктор биологических наук, профессор Розенгарт Е.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Соколова H.A.

кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник Багров А.Я.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет им. академика И.П. Павлова

Защита состоится и усн¿7 1996 года в '/¿>3 часов на

заседании Диссертационного совета К 002.89.01 в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан "_:'0 " .сс, j 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для регуляции множественных биохимических процессов метаболизма, лежащих в основе физиологических и поведенческих реакций, в ходе эволюции образовался ряд ре-гуляторных систем. Среди них особое место занимает система эндогенных опиоидных пептидов (ОП), основными представителями которой являются эндорфины и энкефалины.

Система ОП, возникшая на ранних этапах эволюции, принимает участие практически во всех процессах, происходящих в организме. Мультифункциональность действия ОП в большей мере объясняется их влиянием на яейрональные процессы мозга вообще и на еинапти-ческую передачу в частности.

В настоящее время выделяют две формы участия ОП в синапти-ческой передаче - в качестве нейротрансмиттеров (НТ), эффект действия которых опосредован через взаимодействие с соответствующими рецепторами, а также в качестве нейромодуляторов - внутри-синаптических и дистантных, воздействующих на проводимость си-наптических мембран и обмен медиаторов. Существо модулирующего действия пептидов до конца не раскрыто. Вот почему актуальной, несмотря на интенсивное изучение, остается проблема познания молекулярных механизмов модулирующего действия нейропептидов (НП).

Возможным объяснением ряда эффектов ОП, в основе которых лежат механизмы, отличные от "классического" лиганд-рецепторного взаимодействия, могло бы служить допущение о регуляции пептидами активности ферментов синаптического звена. Данное предположение практически не исследовано и нуждалось в экспериментальном подтверждении. Однако взаимодействие НП со множеством других биорегуляторов затрудняет процесс их аналитического исследования. В наших исследованиях, на модельной системе было изучено влияние ОП на активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ), поскольку энкефалины, при локализации с ацетилхолином в одном и: том же пресинапти-ческом окончании, выделяясь в синаптическую щель, оказывают на холинергические процессы ряд эффектов, которые не опосредованны синалтическими рецепторами. С другой стороны, нами было изучено действие ОП на активность бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), родственного АХЭ фермента, на каталитической поверхности которого были обнаружены центры для связывания опиатов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в доказательстве существования в качестве одного из механизмов модуляции опиоидными пептидами синалтических процессов - прямой регуляции активности ферментов пептидными лигандами на примере взаимодействия ОП с холинэстеразами.

Основные задачи исследования:

- изучить взаимодействие эндогенных ОП, их фрагментов и синтетических аналогов с АХЭ;

- изучить взаимодействие эндогенных ОП, их фрагментов и синтетических аналогов с БуХЭ;

- провести сравнительный анализ эффективности ОП, их фрагментов и синтетических аналогов но отношению к холинэстеразам, от структуры эффекторов.

- провести сравнительный анализ между реакционной способностью АХЭ и БуХЭ по отношению к ОП, их фрагментам и синтетическим аналогам.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые обнаружена регуляция активности АХЭ из эритроцитов крови человека и БуХЭ из сыворотки крови лошади опиоидньши пептидами. Впервые среди изученного ряда пептидов (эндорфины, прознкефалины, энкефалины, их фрагменты и синтетические аналоги) выявлены как активаторы, так и ингибиторы холинэстераз. Описан ряд закономерностей между структурой соединений, направленностью и величиной оказываемого ими на холинэстеразы эффекта.

Анализ результатов тестирования действия ОП на холинэстераз-ную активность позволил сделать заключение о существовании на каталитической поверхности холинэстераз нескольких участков, отличающихся от центров связывания опиоидов на классических опиат-ных рецепторах. Так, в случае АХЭ выявлены участки для взаимодействия с неконкурентными активаторами и ингибиторами пептидной природы. В случае БуХЭ впервые выявлены участки для взаимодействия с неконкурентными, неконкурентно-бесконкурентными пептидными ингибиторами, а также пептидными активаторами неконкурентного, смешанного и синергистического типов действия.

Представленные экспериментальные результаты наряду с данными литературы составили основу оригинальной гипотетической схемы возможных механизмов модуляции пептидами синалтических процессов, составной частью которой является путь регуляции пептидами активности ферментов синалтического звена, нашедший подтверждение в данной работе на примере регуляции активности холинэстераз опиоидными пептидами.

Положения, выносимые на защиту:

- ОП в качестве регуляторов активности холинэстераз;

- характеристика эффективности а- и у-эндорфинов, проэнкефа-линов, энкефалинов, даларгина и их синтетических аналогов и фрагментов (всего 30 соединений) по отношению к активности ацетилхо-линэстеразы и бутирилхолинэстеразы, включающая:

- результаты сравнительного анализа между структурой эффекторов, направленностью, типом действия и величиной оказываемого на холинэстеразы эффекта;

- результаты сравнительного анализа между реактивностью аце-тилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы на воздействия ОП.

Практическая ценность работы.

Впервые выявлена модулирующая эффективность по отношению к холинэстеразам у таких хорошо исследованных НП, какими являются ОП.

Описан новый класс эффекторов для холинэстераз - опиоидные пептиды - являющихся, вероятно, эндогенными регуляторами активности данных ферментов.

На примере регуляции холинэстераз опиоидными пептидами продемонстрирована как регуляция ферментативной активности прямым (не опосредованным через рецептор) способом, так и объединение в одном протопептиде набора эндогенных регуляторов холинэстераз, поскольку эндорфины и энкефалины практически являются продуктами последовательного протеоляза (З-липотропина.

Результаты данного исследования существенны для изучения общих механизмов модуляции пептидными регуляторами нейроме-диаторных процессов: предложен и показан на модельной схеме новый механизм модуляции опиоидными пептидами холинергических процессов.

Представленные результаты могут быть полезны при создании модельных систем для изучения механизмов действия нейропеп-тидных модуляторов. Обнаруженная холинэстеразная эффективность пептидных лигандов системы ОП по отношению к холинэстеразам и проведенный анализ структурно-функциональных особенностей действия ОП на данные ферменты позволяют дать рекомендации для тестирования уже созданных и для направленного поиска новых лекарственных препаратов пептидной природы, обладающих специфической нейротропной активностью.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались на ленинградских городских конференциях молодых ученых и специалистов "Механизмы регуляции физиологических функций" (Ленинград, 1984, 1988); заседании кафедры физиологии человека и животных МГУ (Москва, 1987); Всесоюзном симпозиуме "Физиология пептидов" (Ленинград, 1988); Всесоюзном рабочем совещании "Медиаторы и поведение" (Новосибирск, 1988); X научной конференции болгарских аспирантов в СССР с международным участием "Актуальные проблемы современной науки" (Москва, 1988); П Всесоюзной конференций по нейронаукам (Киев, 1988); Ш ленинградском совещании "Направленный синтез физиологически активных соединений и проблемы количественной связи "структура-активность" биологически активных веществ" (Ленинград, 1988).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 22.3 источника .

Работа изложена на -><$3 страницах машинописного текста, включая 22 таблиц и Ц рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы препараты 30 представителей системы ОП - энкефалинов, проэнкефалинов, даларгина, их фрагментов и синтетических аналогов, а- и у-эндорфинов, синтезированных М.И.Титовым и сотрудниками (лаб. синтеза пептидов, ВКНЦ МЗ Рос-

сии, Москва), а также антагонист опиатных рецепторов - валоксон ("DuPont", США).

Исходя из субстратно-ингибиторной идентичности АХЭ (НФ 3.1.1.7) мозга и эритроцитов одного вида животного, в качестве модели АХЭ мозга человека, нами был использован водорастворимый препарат АХЭ из эритроцитов человека (удельная активность 1,2 ед.). В качестве модели БуХЭ (НФ 3.1.1.8) сыворотки крови человека был использован идентичный по своим свойствам ферментный препарат БуХЭ сыворотки крови лошади (удельная активность 9,6 ед.) (НИИ Вакцин и Сывороток, г.Пермь).

Исходя из очевидной невозможности на уровне in vivo дифференцированного анализа действия каждого эффектора независимо от других регуляторных механизмов, действие ОП на данные ферменты было изучено на модельной системе: каждый пептид инкубировали с очищенным препаратом фермента (0-30 мин. при 37° С), активность которого измерялась модифицированным методом Эллмана (Ellman et.al.,1961): рН 7,5, фосфатный буфер, ацетилтиохолинбромид и бу-тирилгиохолинйодид ("Chemapol", ЧССР) в качестве субстратов для АХЭ и БуХЭ соответственно.

Отсутствие изменения концентрации пептидов, на примере мет-энкефалина, в среде инкубации, определяли используя коммерческий набор для радиоиммунологического теста на метэнкефалин ("Immuno Nuclear Corporation", США).

Значения кинетических параметров ферментативной реакции (Кщ и V) рассчитывали методом двойных обратных величин (Корниш-Боуден, 1979). Об эффективности действия пептидных лигандов судили по величинам констант активации (Кд) и обобщенной ингиби-торной константе ( К/) для обратимо действующих эффекторов. При расчете Kj исходили из того, что величина данной константы складывается из конкурентной К/ и бесконкурентной составляющих К'; согласно формуле: 1/ К* = l/Kff-1/K'f (Бресткин и др. 1981). Для определения величин данных констант измеряли начальные скорости ферментативного гидролиза в опытах в отсутствие и в присутствии эффекторов, вычисляли Kj и К\ и выражали полученные значения в виде отрицательных десятичных логарифмов: р КpKj, pK'j. Тип обратимого торможения определяли по соотношению величин рК,- и рК'/: сметанный рК* > pK'j, конкурентный pK'f 0 и р Щ — рК^, неконкурентный рК; = pK'j, бесконкурентный pKj -» 0 и р К; = рК'г-Величину Кд рассчитывали по методу, предложенному ранее (Березин и др. 1971) и выражали в виде рКд. Тип активирующего действия определяли из соотношения численных значений коэффициентов уравнения начальной скорости ферментативной реакции а и р. Так, при смешенной активации а * 1 и (J ф 1, при синергисти-ческой а < 1, Р =» 1, неконкурентной а = 1, Р > 1 е бесконкурентной активации а = Р > 1. Величину эффекта, оказываемого опиоидными

пептидами на холинэстеразы, выражали как соотношение скоростей ферментативной реакции в присутствии эффектора и без него {v/v0).

Эффекгорные константы и кинетические параметры Кт и V рассчитывали с помощью вычислительного комплекса 15-ВУМС-28-025. Для статической обработки экспериментальных данных использовали общепринятые методы расчета средней арифметической и стандартного отклонения (Ашмарин, 1975). Оценка разности выборочных данных проводилась по первому критерию достоверности разности средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение характера взаимодействия опиоидных пептидов с холинэстеразами

В предварительных опытах нами было установлено, что энкефа-лины являются ингибиторами холинэстераз.

При изучении ингибирующего действия пептидов на ферменты, необходимо было установить обратимыми или необратимыми являются данные ингибиторы. Среди критериев обратимости и необратимости действия ингибиторов на практике наиболее частым служит независимость степени угнетения активности фермента от времени предынкубации с ингибитором (для обратимых) и зависимость ингибирующего эффекта от длительности инкубации (для необратимых).

В опытах по изучению длительности инкубации пептидных ли-гаядов с холинэстеразами было обнаружено, что величина оказываемого эффекта проэнкефалинами, энкефалинами, рядом их синтетических аналогов и их фрагментов зависит от времени предынкубации пептида с ферментом в отсутствии субстрата. Увеличение времени инкубации приводило к возрастанию ингибирующего эффекта и установлению равновесия в системе фермент-ингибитор: для АХЭ - к 30 минуте; для БуХЭ - к 10 минуте. Исключение составили циклические аналоги даларгина (УП1 и IX) по отношению к БуХЭ, налоксон и все активаторы - а- и у-эндорфины и пептиды -ХУП, XX, XXVI, эффект действия которых не зависел от времени предынкубации. Активность фермента за время предынкубации при 37° С оставалась постоянной. Несмотря на то, что для проявления максимального ингибирующего действия пептидов требовалась предынкубации, практически все пептиды за первые 5 мин. взаимодействия с АХЭ и 2,5 мин. взаимодействия с БуХЭ проявляли 50% от общей величины оказываемого эффекта, выраженной в отношении v/v(j. Формально, мы могли бы отнести данные ингибиторы к необратимым. Однако, увеличение во времени степени ингибирования может наблюдаться и в том случае, когда добавленное к системе соединение само не является эффективным, но превращается в обратимый ингибитор под действием фермента, а также в том случае, когда эффектор является аллостерическим.

Показано, что АХЭ обладает способностью гидролизовать энке-фалины. Об отсутствии деградации энкефалинов за время предынку-

Взаимодействие опиоидпых пептидов и налоксона с холинэстеразами

Соединение Ацетилхолинэстераза Бутирилхолинэстераза Сп

j № Э: Кинетические параметры тд Э: Кинетические параметры ТД

И Р к, рК, рК',- И р К; рК,- РК'/

А рКА а ß А рКА а ß

I Туг - Gly-GIy - Phe - Leu И 5.40 5.10 5.10 н И 4.22 3.80 4.00 н 15

П Туг - Gly-Gly - Phe - Leu - Arg И 4.74 4.44 4.44 н И 4.75 3.95 4.67 н-б 1

Ш Tyr - Ala-Gly - Phe - Leu - Arg И 4.91 4.56 4.66 н И 3.72 3.42 3.43 н 16

IV Tyr-DAla-Gly - Phe - Leu - Arg И 4.45 4.18 4.13 н и 4.31 4.00 4.00 н 1

V Tyr-DAla-Gly-DPhe - Leu - Arg И 5.00 4.69 4.70 н и 3.88 3.58 3.58 н 13

VI Tyr-DAla-Gly - Phe - Leu-DArg И 5.09 4.79 4.79 н и 4.20 3.75 4.00 н 8

vn Tyr-DAla-Gly - Phe-DLeu И 5.15 4.87 4.82 н и 3.98 3.45 3.83 н 15

vin 1- CH2 -1 Tyr-DAla-Gly - Phe - Leu - Arg И 5.06 4.62 4.87 н и 4.74 3.55 4.71 н-б 2

IX Tyr-DAla-Gly - Phe - Leu - ^.rg (Ж3 ОДг Tyr-DAla-Gly - Phe - Leu - Arg И 5.48 5.03 5.29 н и 5.72 4.08 5.70 н-б 0.6

X Tyr - Pro-Gly - Phe - Leu - Arg И 4.56 4.23 4.23 н * <3.00 - . - .

XI Tyr - Gly-Gly - Phe - Met И 5.24 4.94 4.93 н и 4.25 3.95 3.95 н 10

XII Tyr - Gly-Gly - Phe - Met - Arg И 4.86 4.50 4.61 я и 4.34 3.79 4.20 н-б 3

Х1П Tyr - Gly-Gly-Phe И 3.90 3.59 3.59 н и 4.31 4.01 4.00 н 0.4

XIV Tyr-DAla-Gly-Phe И 4.21 3.91 3.91 н и 3.86 3.35 3.69 н 2

XV Tyr-DAla-Gly И 3.95 3.65 3.65 н * <3.00 - - - -

XVI Tyr-DAla * <3.00 - - - А <3.00 - - - -

XVII ВА1а-в1у-Р1ге - Ьеи * <3.00 - - . А 4.08 0.52 1.50 см

XVIII 0А1а-01у-РЬе И 4.01 3.71 3.71 н * <3.00 - - -

XIX БА1а-01у И 3.63 3.33 3.33 н * <3.00 - -

XX 01у-РЬе - Ьеи * <3.00 - - - А 4.10 0.31 1.00 с -

XXI Иу-РЬе * <3.00 - - * <3.00 - - - -

XXII РЬе - Ьеи И 3.84 3.54 3.54 н И 3.88 3.44 3.67 н 1

XXIII Туг - Рго-Ьуг * <3.00 - - - А <3.00 - - - -

XXIV Туг - Рго-Агё * <3.00 . - * <3.00 - - -

XXV Туг-0А1а-01у-РЬе - С1у(МН2) И 4.21 3.91 3.91 н И 4.34 4.04 4.04 н 1

XXVI Туг-ВА1а-01у-РЬе(СН3)-01у(0Н) и 4.35 4.05 4.05 н А 4.54 1.00 1.60 и -

XXVII РЬе - А1а-61у-РЬе - 01у-Агй и 5.37 5.07 5.07 н И 4.46 4.15 4.16 н 8

ХХУШ Туг - Met-Gly-Pro - РЬе-Ьеи и 4.60 4.24 4.34 и А 4.44 0.77 1.31 см -

XXIX Туг-в1у-01у-РЬе-Ме(;-ТЬг-8ег-Ши-Ьуэ-Бег-Фп-ТЪг-Рго-Ьеи-Val-Thr-Leu (у-эндорфин) А 7.03 1.00 1.09 н А 4.25 0.29 1.00 с 600

XXX / Туг-61у-01у-РЬе-Ме^ТЬг-8ег-ОЬх-Ьув-Бег-Ип-ТЬг-Рго-Ьеи-Уа1-ТЬг (а-эндорфин) А 7.60 1.00 1.08 н А 6.38 0.82 1.00 с 20

XXXI Налоксон И 5.16 4.64 5.08 н-б И 4.65 4.24 4.50 н-б 3

ЧЭ

Примечания:

1. "Э" - эффект: "И" - ингибирование, "А" - активация, "*" отсутствие эффекта в пределах исследуемого интервала концентраций эффектора НИ - 10'4 М, р< 0.001;

2. "ТД" - тип действия эффектора: "н" - неконкурентный, "н-б" - неконкурентно-бесконкурентный, "см" - смешанный, "с" - синергистический;

3. "Сп" - специфичность действия эффектора к АХЭ по отношению к БуХЭ^ по Кг или КА в зависимости от направленности действия эффектора т.е. Сп( К ¿) = [ (АХЭ) / Кг (БуХЭ)] -1 и Сп(КА) = [КА (АХЭ) / КА (БуХЭ)] -К

бации с холинэстеразами свидетельствуют следующие доказательства:

1. радиоиммунологическое определение метэнкефалина в реакционной среде показало, что за время инкубации с ферментом, концентрация пептида в пробе изменяется незначительно, что соответствует стандартной ошибке метода;

2. величины ингибирующего действия самого лейнэкефалина и его аналога Tyr-DAIa-Gly-Ph.e-DLeu, являются соизмеримыми, несмотря на то, что данный аналог стабильнее лейэнкефалина в сыворотке крови в 10 раз;

3. ди-, три- и тетралептиды, которые, возможно, могли бы образоваться в инкубационной среде при гидролизе энкефалинов холинэстеразами, и оказывать ингибирующее действие на ферменты, по величинам Kj являлись на порядок более слабыми ингибиторами хо-линэстераз, чем их пентапептидные предшественники.

4. добавление в инкубационную среду ингибитора пептидаз ба-цитрацина ("Sigma", США) в концентрации 2 х 105 М не повлияло на величину оказываемого пептидами эффекта.

Об отсутствии деградации ОП за время протекания самой ферментативной реакции свидетельствует линейный график хода ферментативной реакции на исследуемом временном интервале (10 мин.), а также то, что гидролиз энкефалинов холинэстеразами, по данным литературы, угнетается в присутствии специфических для АХЭ и БуХЭ субстратов.

Перечисленные доказательства позволяют нам заключить, что увеличение во времени степени ингибирования связано с действием на холинэстеразы непосредственно ОП, а не их фрагментов, которые могли образоваться в результате деградации энкефалинов данными ферментами за время предынкубации или ферментативной реакции.

Таким образом, ингибиторы энкефалинового ряда могли оказаться либо необратимыми ингибиторами холинэстераз, либо ал-лостерическими эффекторами данных ферментов, поскольку холин-эстеразы являются аллостерическими ферментами. Анализ взаимодействия ОП с холинэстразами выявил следующие обстоятельства:

- для всех эффекторных соединений была характерна S-образная форма кривой зависимости оказываемого на фермент эффекта от концентрации пептида;

- оказываемые ОП эффекты не наблюдались на препаратах хо-линэстераз, которые до взаимодействия с лигандом подвергались мягким денатурирующим воздействиям, не приводящим к потере каталитической активности. Все это позволяет нам заключить, что ОП являются обратимыми аллостерическими эффекторами холинэстераз.

Специфичность эффекторного действия энкефалинов, проэнкефалинов и их аналогов по отношению к ходинэетеразам

Анализ взаимодействия энкефалинов (I, XI), проэнкефалинов (II, ХП) и их синтетических аналогов с холинэстеразами, кинетические параметры которого представлены в таблице, показал следующее:

1. Энкефалины и их линейные аналоги данной группы являются для холинэстераз обратимыми ингибиторами неконкурентного типа действия.

2. Как для АХЭ, так и для БуХЭ мет- и лейзнкефалины не различались ни по величине р К,-, ни по типу ингибирующего действия. Однако, энкефалины проявляли выраженную избирательность по отношению к АХЭ и являлись наиболее сильными ингибиторами данного фермента среди изученного ряда ациклических производных.

3. Увеличение длины пептидной цепи с С-конца приводило к снижению ингибиторной активности соединений без изменения типа ингибирования по отношению к АХЭ. При взаимодействии с БуХЭ, гексапептиды по силе антихолинэстеразного действия сопоставимы с энкефалинами, но являлись неконкурентно-бесконкурентными ингибиторами.

4. Даларгин (IV), аналог лейэнкефалина, нашедший клиническое применение, оказался в 10 раз более слабым ингибитором, чем энкефалины по отношению к АХЭ, и сопоставим с ними по величине Кг для БуХЭ. Даларгин являлся равноэффективным ингибитором холинэстераз неконкурентного типа действия.

5. Тестирование на холинэстеразнук> эффективность аналога да-ларгина (X) с заменой Б-аланина во втором положении на пролин, аминокислоту, введение которой всегда вызывает вынужденный изгиб пептидной цепи, позволило выявить принципиальное различие между участками на АХЭ и БуХЭ для связывания ОП. Так, если данная замена не повлияла на ингибирующие свойства гексапептида по отношению к АХЭ, то в опытах с БуХЭ данное соединение было совершенно не активно во всем исследованном интервале концентраций от 10'8 до 10-4М.

6. Циклизация молекулы даларгина и его димера, привела к увеличению антихолинэстеразной эффективности соединений по отношению к АХЭ до уровня эндогенных лентапептидов без изменения типа ингибирующего действия, тогда как в опытах с БуХЭ циклические аналоги (VIII, IX) были активнее по отношению к ферменту в 3 и 30 раз, чем лейэнкефалин и являлись неконкурентно-бесконкурентными ингибиторами БуХЭ.

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что для проявления максимального антихолинэстеразного эффекта данными соединениями имеет значение как структура пептида, так и общая пространственная конфигурация молекулы, свидетельствующие об определенной специфичности наблюдаемых эффектов. Увеличение численного значения р В^ у пространственно "жестких" циклических аналогов, по сравнению с их линейными аналогами, подтверждает это предположение, также как и введение_в структуру пептида стереоизомеров аминокислот. Анализ величин р К* позволяет заключить, что для проявления максимального эффекта на холин-эстеразы структура энкефалинов - эндогенных соединений - является оптимальной при взаимодействии со специфическими участками ферментов, поскольку все изученные линейные аналоги с отклоне-

ниями от природной аминокислотной последовательности оказались или более слабыми ингибиторами или их действие было сопоставимо по силе с энкефалинами.

Специфичность эффекторного действия фрагментов

энкефалинов и даларгина по отношению к холннэстеразам

Во вторую группу соединений включены ди-, три- и тетрапепти-ды, представляющие собой фрагменты энкефалинов и даларгина (IV), которые образуются при деградации пептидов. Изучение действия на холинэстеразы коротких фрагментов энкефалинов должно было показать необходимость всех пяти аминокислот и выявить наименьший фрагмент, обладающий холинэстеразной эффективностью, а также выяснить роль отдельных аминокислот во взаимодействии со специфическими участками холинэстераз-

На основе анализа кинетических параметров взаимодействия исследованных соединений можно сделать следующие выводы о структурно-функциональной зависимости строения фрагментов энкефалинов для проявления ими холинэстеразной эффективности:

1. Специфичной, для оказания максимального ингибирующего эффекта на АХЭ, является последовательность аминокислот, наблюдаемая в природных пентапетидах - удаление одной аминокислоты с С-конца и дальнейшее укорочение пептидной цепи энкефалинов приводило или к резкому снижению величины оказываемого эффекта без изменения типа ингибирующего действия или к полному его отсутствию у образовавшихся фрагментов.

2. Для проявления ингибирующего действия на АХЭ пента- и тетрапептидами данного ряда, необходимо наличие на Л-конце их молекулы тирозина; для оказания ингибирующего действия три- и дипептидами наличие данной аминокислоты на Ы-конце молекулы не являлось определяющим.

3. Результаты опытов с БуХЭ показали, что структурная организация участка молекулы БуХЭ, который обеспечивает взаимодействие с энкефалинами, приводящее к ингибированию активности фермента не требовала наличия всех пяти аминокислот в структуре лиганда для проявления им максимального эффекта, поскольку удаление одной С-концевой аминокислоты из пептидной цепи энкефалинов не отражалось на антихолинэстеразной эффективности соединения.

4. Необходимым условием для проявления пента- и тетрапептидами ингибиторной активности по отношению к БуХЭ являлось наличие тирозина на КГ-конце цепи.

5. Укорочение молекулы лейэнкефалина с Ы-конца привело к проявлению образовавшимися С-концевыми тетра: и трипептидом эффективности принципиально иной направленности. Данные соединения являлись активаторами БуХЭ смешанного и синергистического типов действия (XVII, XX). Связываясь как с активным центром фермента (XX), так и вне его (XVII) фрагменты вызывали увеличение сродства БуХЭ к субстрату, не являясь при этом субстратом для фер-

мента. Активирующее действие на БуХЭ, (в опытах с АХЭ данные соединения были неактивны) было сопоставимо по силе с ингиби-рующим действием как энкефалинов, так и их N-концевых тетрапеп-тидов.

Анализируя тип эффекторного действия на фермент ряда фрагментов лейэнкефалина, которые являлись результатом последовательного укорочения пептидной цепи молекулы с N-конца, мы сталкиваемся с интересным переходом от неконкурентного ингибирова-ния (I, VII) к активации - смешанной (XVH), а за тем синергисти-ческой (XX) и далее к неконкурентному ингибированию БуХЭ С-концевым дипептидом лейэнкефалина (XXII):

ингибиторы: Туг - DAla -Gly - Phe - Leu - Arg (даларгин) (IV),

Туг - Gly -Gly - Phe - Leu (лейэнкефалин) (I),

Туг - DAla -Gly - Phe - DLeu (VII);

активаторы: DAla -Gly - Phe - Leu (XVII),

-Gly - Phe - Leu (XX);

ингибитор: Phe - Leu (XXII).

Специфичность эффекторного действия синтетических аналогов энкефалинов по отношению к холинэстеразам

Аналоги энкефалинов, включенные в третью группу, характеризуются сложными аминокислотными заменами, осуществленными с целью придать пептидам устойчивость к действию деградирующих ферментов. Результаты тестирования данных соединений на холин-эстеразную эффективность, представленные в таблице, привели к следующим выводам:

1. Практически каждое изменение, внесенное в структуру эндогенных пентапептидов, на порядок уменьшало их эффекторную активность по отношению к АХЭ при сохранении типа ингибирующего действия, и только в случае замены в молекуле проэнкефалина КГ-концевого тирозина на близкую по своим физико-химическим свойствам аминокислоту фенилаланин, наблюдалось возрастание ин-гибиторной активности данного гексапелтида (XXVII) до уровня энкефалинов с сохранением неконкурентного типа ингибирования.

2. Анализ величин эффекториых констант соединений данной группы по отношению к БуХЭ показал, что обнаруженные центры для связывания пептидов обладают достаточной специфичностью. Так, два близких по строению пентапептида XXV и XXVI, различающихся заменами карбоксильной группы при С-концевой аминокислоте на амидную или спиртовую и метилированием РЬе4 у XXVI аналога - являлись эффекторами различной направленности, но были сопоставимы по силе и типу эффекторного действия. В свою очередь, гексапептид Рго2,А^6-лейэнкефалин (X) с единственной по сравнению с пролейэнкефалином аминокислотной заменой во втором положении был не активен по отношению к БуХЭ.

3. Обнаружение среди тестированных пептидных соединений активаторов БуХЭ неконкурентного, смешанного и синергистического типов, для проявления действия которых на фермент не требовалась предынкубадия, указывает на возможность существования нескольких участков для связывания пептидных активаторов.

Специфичность эффекторного действия а- и у-эндорфинов по отношению к холинэстеразам

В данную группу включены - а и у-эндорфины (XXIX, XXX), являющиеся в ряде случаев предшественниками метэнкефалина, а также антагонист опиатных рецепторов - налоксон, тестирование на холинэстеразную эффективность которого было проведено с целью сравнения участков связывания ОП на поверхности холинэстераз и опиатных рецепторах.

Результаты проведенного исследования по прямому действию эндорфинов на изучаемые ферменты показали:

1. Короткие эндорфины являлись равноэффективными активаторами неконкурентного типа действия по отношению к АХЭ. В опытах с БуХЭ, они проявляли синергистический тип активирующего действия, причем потеря у-эндорфином С-концевого лейцина приводила к возрастанию в 140 раз активирующей способности образовавшегося а-эндорфина. Для проявления активирующего действия эндорфинов на оба фермента предварительная инкубация не требовалась. Данные соединения проявляли выраженную специфичность по отношению к АХЭ. Так, у-эндорфин активировал данный фермент в 600 раз, а а-эндорфин в 20 раз сильнее, чем БуХЭ.

2. Налоксон являлся ингибитором холинэстераз неконкурентно-бесконкурентного типа действия, для проявления эффекта которого на фермент не требовалась предынкубация. Ингибирующее действие налоксона по эффективности было сопоставимо с энкефалинами.

3. На молекулах холинэстераз имеются участки связывания ОП отличающиеся от участков сорбции пептидов на классических опиатных рецепторах, поскольку с одной стороны, энкефалины и налоксон проявляли разный тип ивгибирующего действия; с другой стороны налоксон и эндорфины оказывали на холинэстеразы противоположные эффекты.

Таким образом, на примере взаимодействия с холинэстеразами эндорфинов и энкефалинов, являющихся фрагментами р-липо-тропина, мы сталкиваемся с объединением в одном протопептиде эффекторов холинэстераз противоположной направленности.

Можно предположить, что в результате взаимодействия со специфическими участками холинэстераз, ОП осуществляют регуляцию активности данных ферментов, что в свою очередь является одним из механизмов модуляции опиоидными пептидами процессов, связанных с действием ацетилхолина.

Возможные пути модуляции нсйропептидами синаптическнх процессов

В регуляторном влиянии нейронептидов (НП) на нервную систему важную роль играет нейромодуляция, механизмы которой требуют дальнейшего изучения. Экспериментальные данные, представленные в научной литературе за последние годы, позволяют выделить, кроме "классического", по крайней мере 6 различных направлений во взаимодействии НП с функциональными единицами синапса (см.рис.). В основе представленных взаимодействий лежит способность пептидных молекул образовывать мобильные комплексы с белками и фосфолипидами. К основным механизмам нейромодуляции, по нашему мнению, следует отнести регуляцию НП активности ферментов синаптического звена путем прямого взаимодействия пептидного лиганда с макромолекулой фермента (1). Результаты проведенного нами исследования являются частным доказательством данного положения. Способность НП к подобного рода регуляции наряду с возможностью регулировать аффинитет связывания нейротрансмит-тера (НТ) с соответствующим рецептором через взаимодействие НП с его аллостерическим и активным центрами (2) приводит к изменению активности систем вторичных посредников (3). Помимо этого, НП, по всей видимости, способны регулировать ионную проницаемость мембраны, взаимодействуя непосредственно с молекулой ионного канала или образуя ионный канал при внедрении молекулы НП в липидный матрикс, что также приводит к модуляции реакции нервной клетки на НТ (4). Взаимодействие пептидных лигандов с белками синаптиче-ских мембран - ферментами, ионными каналами и рецепторами - требует учета того, что НП могут образовывать с фосфолипидами комплексы, влияющие на "текучесть" мембран (5). И, наконец, мишенью действия пептидного модулятора может быть молекула как "классического", так и пептидного НТ, с которой НП может образовывать нековалентный комплекс (6), что также приведет к изменению реакции постсинаптической клетки.

Названные б вариантов молекулярных механизмов, опосредующих эффекты нерецепторного действия НП, по-нашему мнению, имеют большее значение, помимо модуляции нейронептидами действия "классических" НТ, для реализации эффектов тех пептидов, которые представляют собой биологически активные продукты посттрансляционной модификации пептидов, рецепторов, белков и ферментов, а также пептидов, синтез которых отсутствует в норме и наблюдается при неспецифичеких воздействиях на клетку. При отсутствии специфических рецепторов, модулирующее действие данных пептидов, возможно, опосредовано названными механизмами. С другой стороны, учитывая резко различающиеся временные характеристики действия основного НТ и сопутствующего ему НП, можно с большим основанием полагать, что с помощью описанных механизмов нерецепторного действия НП, данные регуляторы создают тот постоянно изменяющийся "рабочий фон", на котором действует классический НТ,

АКСОН ПРЕСИНАПС

СИНТЕЗ

пеатидергическяй нейрой

межклеточное пространство

Рис. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ МОДУЛЯЦИИ НЕЙРОПЕПТИДАМИ СИНАПТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

ПРЕ-СМ - пресинаптическая мембрана;

ПРЕ-СР(нт) - пресилаптический рецептор для "классического"

нейротрансмиттера (нт); ПРЕ-СР(нп) - пресинаптический рецептор для нейропеятида;

ПОСТ-СМ - поете инаптическая мембрана;

ПОСТ-СР(кт) - поете ннаптический рецептор для "классического"

нейротрансмиттера; ПОСТ-СР(нт) - постсиналгпческий рецептор для нейролептида.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучены в качестве эффекторов ацетилхолинэстеразы из эритроцитов человека и бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади 30 представителей системы опиодных пептидов, включающих а- и у-эндорфины, энкефалины, их фрагменты и синтетические аналоги, оказавшиеся либо ингибиторами, либо активаторами холин-эстераз, эффективность действия которых существенно зависела от структуры.

2. Эндогенные пентапептиды - мет- и лейэнкефалины оказались обратимыми ингибиторами холинэстераз неконкурентного типа, что предполагает взаимодействие пептидов с участком фермента вне его активного центра. Энкефалины проявляли выраженную избирательность по отношению к ацетилхолинэстеразе и являлись наиболее сильными ингибиторами данного фермента среди изученного ряда ациклических производных.

3. Исследование взаимодействия с холинэстеразами а- и у-эн-дорфинов, являющихся в ряде случаев предшественниками метэнке-фалина показало, что данные пептиды являются активаторами ферментов: неконкурентного типа действия по отношению к ацетилхолинэстеразе и синергистического типа действия по отношению к бу-тирилхолинэстеразе. Эффекторное действие у-эндорфина было в 600 раз, а а-эндорфина в 20 раз сильнее по отношению к ацетилхолинэстеразе, чем к бутирилхолинэстеразе.

4. При исследовании действия на холинэстеразную активность синтетических аналогов энкефалинов с заменами аминокислот в различных положениях и их фрагментов, показаны существенные различия в оказываемых на холинэстеразы регуляторных эффектах: по отношению к ацетилхолинэстеразе выявлены ингибиторы неконкурентного типа действия; по отношению к бутирилхолинэстеразе впервые обнаружены пептидные активаторы неконкурентного, смешанного и синергистического типов действия, а также неконкурентные и неконкурентно-бесконкурентные ингибиторы.

5. Анализ закономерностей взаимодействия с данными холинэстеразами опиоидных пептидов и налоксона, оказавшегося неконкурентно-бесконкурентным ингибитором, выявил эффекты, различающиеся: по направленности (налоксон и а-, у-эндорфины); по типу ингибирующего действия (налоксон и энкефалины); что позволяет сделать заключение о существовании на молекулах холинэстераз различных аллостерических участков для связывания опиоидов.

6. Предложена оригинальная схема возможных путей модуляции пептидами синаптических процессов, составной частью которой является механизм регуляции пептидами активности ферментов си-наптического звена, нашедший экспериментальное подтверждение в данной работе на примере модуляции опиоидными пептидами холин-эстеразной активности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мураневич С.А. Анализ действия энкефалинов и их синтетических аналогов на активность гамма-глутаыилтрансферазы из почек мышей линии С57 Black // Тез. докл. Ленинградской городской конф. мол. ученых и специалистов "Механизмы регуляции физиологических функций". - Ленинград, 1985. - С.95,

2. Мураневич С.А., Полосатое М.В., Розенгарт Е.В. Энкефалины и их синтетические аналоги в качестве неконкурентных обратимых ингибиторов ацетилхолинэстеразы // Докл. АН СССР. - 1988. - Т.298, №5.

- С.1260-1263.

3. Мураневич С.А. Опиоидные пептиды - регуляторы ацетилхолинэстеразы. К вопросу о механизмах модулирующего действия пептидов на нейромедиаторные процессы // Тез. докл. всесоюзн. симп. "Физиология пептидов". - Ленинград, 1988. - С. 129.

4. Мураневич С.А. Опиоидные пептиды в качестве возможных модуляторов холинергических процессов // Тез. докл. всесоюзн. совещ. "Медиаторы и поведение". - Новосибирск, 1988. - С.70-71.

5. Мураневич С.А. Нейропептиды - регуляторы активности сннапти-ческих ферментов / Институт физиологии им.И.П.Павлова АН СССР.

- Л., 1988. - 20 с. Деп. в ВИНИТИ 26.10.88., №7695-В88.

6. Мураневич С.А. Нейропептиды - регуляторы активности ферментов синаптического звена / Институт физиологии им.И.П.Павлова АН СССР. - Л., 1988. - 16 с. Деп. в ЦНТБ, София, НРБ 03.06.88., №Нд 4784/88.

7. Мураневич С.А. Возможный механизм модуляции энкефалинами холинергических процессов // Тез. докл. Ленинградской городской конференции мол. ученых и специалистов "Механизмы регуляции физиологических функций. - Ленинград, 1988. - С.59.

8. Мураневич С.А. Фрагменты бета-липотролина - регуляторы ацетилхолинэстеразы: комбинация регуляторов фермента в одном прото-пептиде // Тез. докл. П Всесоюзн. конф. по нейронаукам. - Киев, 1988. - С.140-141.

9. Мураневич С.А., Полосатов М.В. Опиоидные пептиды - регуляторы активности ацетилхолинэстеразы // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1989. - Т.58, №10. - С.457-459.

10. Мураневич С.А. Только ли через рецепторы осуществляется модулирующее действие нейропептидов? // Физиол. И.М.Сеченова. - 1993. - Т.79, №4. - С.9-29.