Выделение пептидов из панинтестина и изучение их биологических свойств

Брещенко, Елена Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение пептидов из панинтестина и изучение их биологических свойств
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение пептидов из панинтестина и изучение их биологических свойств"

На правах рукописи

БРЕЩЕНКО Елена Евгеньевна

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕПТИДОВ ИЗ ПАНИНТЕСТИНА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 2003

Работа выполнена в Кубанской государственной медицинской академии и Российском центре функциональной хирургической гастроэнтерологии

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Сторожук П.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Бондаренко Т.И.

доктор биологических наук профессор Волжина Н.Г.

Ведущая организация: Ставропольская государственная медицинская академия

Защита диссертации состоится « 27 » ноября 2003 г. в ут) час, на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в Ростовском государственном университете (344006, г.Росгов-на-Дону, ул. Б.Садовая, 105, РГУ, ауд у&Ъ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного университета (344006, г.Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан « 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук В.В. Бабенко

'72о2.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. В связи с ростом количества гастроэнтерологических заболеваний, широко распространенных среди взрослого и детского населения и сопровождающихся секреторной недостаточностью желудка, поджелудочной железы, печени, тонкого кишечника, растет и потребность в различных препаратах ферментозаместительной терапии, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами (Златкина А.Р. и со-авт., 1998; Ивашкин В.Т., Рапопорт С.И., 1999). Ферментные препараты отличаются друг от друга как сочетанием и дозой содержащихся в них пищеварительных ферментов, так и наличием различных добавок. Успех корре-гирующей ферментотерапии зависит от правильного подбора лекарственного средства (Яковенко Э.П., 1998; Охлобыстин A.B., 2001; DiMagno Е.Р.,

Известно (Яковенко Э.П., 1998), что в некоторых из ферментных препаратов содержатся высокие дозировки ферментов заместительной терапии (пепсина, трипсина, химотрипсина, липазы, амилазы), однако и они не могут полностью компенсировать недостающую часть ферментов, так как покрывают только десятые или сотые доли суточной нормы (Сторожук П.Г., Быков И.М., 1994; Быков И.М., 2001). Несмотря на то, что ферментозамести-тельная терапия не может оказывать существенного влияния на процессы пищеварения из-за недостаточного содержания в препаратах пищеварительных ферментов, многие исследователи отмечают положительный терапевтический эффект от применения препаратов ферментозаместительной терапии. Возможно, такие результаты связаны с наличием в препаратах биологически активных пептидов.

На кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии уже несколько десятилетий разрабатываются технологии получения препаратов ферментозаместительной терапии и изучаются их биохимические и физиологические свойства. Профессором Н.П. Пятницким были созданы пепсинсодержащие препараты пепсидил и сальпепсин (A.c. № 200740, 1967; A.c. № 289812, 1970), затем проф. П.Г. Сторожуком и М.М. Мыкрты-чаном была разработана технология получения нового искусственного желудочного сока - копепсидила (A.c. № 908358, 1982). Позже коллектив сотрудников кафедры биохимии разработал технологию приготовления препарата панинтестин (A.c. № 1476653, 1987), предназначенного для лечения заболеваний с секреторной недостаточностью поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Технология получения панинтестина предусматривает введение в гомогенат поджелудочной железы слизистой оболочки тонкой кишки, где содержатся ферменты, активирующие трипсиноген, и заканчивающие гидролиз мелких пептидов трипептидазы, дипептидазы, в результате чего происходит активация всех панкреатических ферментов, гидролиз белков собственных тканей органа с образованием многообразных форм пептидов.

1999).

При исследовании препаратов ферментозаместительной терапии было установлено, что они обладают способностью повышать секреторную деятельность желудка, поджелудочной железы и тонкой кишки. Это свойство принадлежит сопутствующим пептидам, которые были выделены из пепси-дила и копепсидила (Хангалдова Т.Н., 1977; Быков И.М., 1982). Также было установлено, что препарат панинтестин обладает подобным свойством (Быков И.М., 2001). В связи с этим изучение механизмов действия препаратов заместительной энзимотерапии является одной из актуальных проблем современной гастроэнтерологии. Особое значение она приобретает при хирургическом лечении заболеваний желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Эта проблема актуальна и в педиатрии, так как недостаточность секреторной деятельности пищеварительных желез у детей не позволяет ребенку нормально питаться, что сказывается на его росте и развитии.

Целью настоящей работы является выделение биологически активных пептидов из панинтестина и исследование их влияния на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке.

В связи с этим перед исследователем стояли следующие задачи:

1. При помощи гель-фильтрации и других современных физико-химических методов выделить из панинтестина пептиды с различной молекулярной массой, определить их молекулярную массу и идентифицировать наиболее активные фракции.

2. В экспериментах на животных провести исследование влияния высоко* и низкомолекулярных пептидов на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки.

3. Провести сравнительный анализ воздействия на активность пищеварительных ферментов пептидов, выделенных из панинтестина, современных модуляторов желудочной и панкреатической секреции, применяемых в клинике и научно-исследовательских целях, а также пептидов, выделенных из ткани язвы желудка.

Новизна результатов исследования

Установлено, что препарат панинтестин, разработанный, на кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии и предназначенный для коррекции секреторной недостаточности поджелудочной железы, содержит как высокомолекулярные белки, так и биологически активные пептиды. , , ,

Впервые с использованием различных физико-химических методов, из панинтестина выделены пептиды, проведен анализ и определена их молекулярная масса.

Выявлено, что пептиды, входящие в состав панинтестина, обладают биологической активностью по отношению к органам пищеварения. Иссле-

дованиями на лабораторных животных установлено, что различные пептиды обладают разнонаправленным действием: одни из них увеличивают активность ферментов желудочно-кишечного тракта, другие - уменьшают. Эффект зависит от молекулярной массы и первичной структуры пептида.

Впервые в острых опытах на крысах показано, что высокая биологическая активность полученных пептидов по своей интенсивности часто не уступает известным стимуляторам секреции желудка и внешнесекреторной функции поджелудочной железы (пентагастрин, гистамин).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Из препарата ферментозаместительной терапии панинтестина, технология приготовления которого разработана на кафедре биохимии КГМА, при помощи гель-фильтрации и других современных физико-химических методов выделены биологически активные пептиды, определены их молекулярные массы и идентифицированы наиболее активные фракции.

2. Установлено, что высоко- и низкомолекулярные пептиды, выделенные из панинтестина, обладают способностью изменять активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки экспериментальных животных.

3. При сравнительном анализе воздействия на активность пищеварительных ферментов пептидов, выделенных из панинтестина, современных стимуляторов и ингибиторов желудочной и панкреатической секреции, применяемых в клинике и научно-исследовательских целях, а также пептидов, выделенных из ткани язвы желудка, показано, что пептиды, полученные из панинтестина, по степени влияния не уступают признанным модуляторам секреции пищеварительных желез.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработана схема хроматографического разделения препаратов ферментозаместительной терапии (ПФЗТ) и получения из них биологически активных пептидов. Это позволит использовать отдельные фракции пептидов для практических целей в качестве стимуляторов и ингибиторов желудочной и панкреатической секреции.

Исследованиями установлено, что при получении ПФЗТ не следует добиваться тщательной очистки ферментов от сопутствующих пептидов, так как от этих примесей зависит биологическая активность препаратов.

Результаты исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах биохимии и общей химии Кубанской государственной медицинской академии, на кафедре биохимии человека и животных Кубанского государственного университета.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Органосохраняющие принципы в хирургии неотложных состояний» (Ейск, 2001), X юбилейной между-народной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2002), 18-ой Всероссийской научной

конференции с международным участием «Физиология и патология пищеварения» (Геленджик, 2002).

Публикации. По материалам проведенных исследований опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, приложения и указателя использованной литературы. Диссертация иллюстрирована одной схемой, 11 таблицами и 35 рисунками. Указатель использованной литературы состоит из 315 источников, в том числе 120 на русском и 195 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. В работе был использован препарат ферментозаместительной терапии панинтестин, а также выделенные из него пептиды. С целью выделения из панинтестина пептидов и их анализа применяли хроматографические методы (колоночную гель-фильтрацию и высокоэффективную хроматографию), капиллярный электрофорез, масс-спектрометрию, мембранную фильтрацию.

Гель-фильтрацию проводили по методике JI.A. Остермана (1985) с использованием оборудования фирмы LKB (Швеция), наличие белковых фракций фиксировали на спектрофотометре СФ-46. Высокоэффективную хроматографию осуществляли на микроколоночном жидкостном хроматографе "Миллихром А-02" (производства фирмы "Эконова", Новосибирск). Разделение методом капиллярного электрофореза проводили на приборе фирмы ABI (модель 270А). Масс-спектры MALDI снимали на приборе Vision-2000 (Thermo Bioanalysis Corp., Англия). Источник возбуждения -азотный лазер (337 нм).

Влияние выделенных из панинтестина пептидов исследовали на экспериментальных животных (крысах). Острые опыты поставлены на 560 белых крысах-самцах весом 150-200 г. В этих экспериментах одновременно исследовалось действие того или иного фактора на ферментные системы нескольких органов - желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Изучение действия пептидов проводили при парентеральном введении, так как они, не всасываясь в кровь, проникают в межклеточные щели и оказывают свое паракринное действие через мембраны клеток пищеварительных желез. Необходимость экспериментов на крысах диктовалась также ограниченным количеством испытуемого материала, в частности пептидов. Дозировки вводимых пептидов рассчитывали по содержанию белка, определяемого модифицированным методом Кьельдаля (Покровский A.A., 1964).

В гомогенатах желудка определяли активность пепсина экспресс-методом Н.П. Пятницкого (1968) и классическим методом N.L. Anson (1938) в модификации D.M. Goldberg et al. (1969).

Об изменении активности ферментов в поджелудочной железе и слизистой оболочке тонкой кишки судили, определяя следующие биохимические показатели: активность трипсина (в мкмоль-З/мин) методом Н. Тирру et at. (1962), суммарную протеолитическую активность (в ммоль-тирозин/мин) методом N.L. Anson (1938) в модификации П.Г. Сторожука и B.JI. Криштопы (1969), активность химотрипсина (в мг/мл) по методу Н.П. Пятницкого (1965), активность амилазы (в ммоль-З/мин) по методике П.Г. Сторожука и Т.И. Анашкиной (1969).

Для оценки действия пептидов, полученных различными физико-химическими методами, на активность ферментов органов гастродуоде-нального комплекса его сравнивали с влиянием модуляторов секреции желудка и экзокринной деятельности поджелудочной железы - пентагастрина, гистамина и даларгина, а также пептидов, выделенных из ткани свежеиссе-ченной язвы желудка. Ульцерозная ткань была получена при реконструктивных и органосохраняющих операциях, проводимых в Российском центре функциональной хирургической гастроэнтерологии.

Для обработки результатов использовали общепринятые методы вариационной статистики (Мерков A.M., Поляков JI.E., 1974; Гланц С.А., 1999). Полученные результаты графически интерпретированы различными видами диаграмм, гистограмм, графиков, при построении которых использовался программный пакет Excel (MS Office 97).

Способы выделения биологически активных пептидов из панинтестина и изучение их основных биохимических свойств

Гель-фильтрация, или, точнее, гельпроникающая хроматография, наряду с электрофоретическими и некоторыми другими методами относится к наиболее широко применяемым способам выделения и очистки белков и пептидов. Принцип метода основан на разделении смеси белков и пептидов в зависимости от молекулярной массы с использованием хроматографиче-ских колонок, заполненных гелеобразными носителями, в частности, сефа-дексами различных марок. Носитель представляет собой открытую попе-рСЧКО-CUIiITj ,'ю трехмерную молекулярную сетку, сформированную в виде шариков (гранул) для удобства наполнения колонок (Остерман JI. А., 1985).

Поры внутри гранул имеют такие размеры, что некоторые из них недоступны для крупных молекул, тогда как более мелкие молекулы могут проникать во все поры. Недоступность пор обусловлена тем, что они или слишком узки для молекул, или если даже достаточно широки, то не имеют каналов, выходящих на поверхность гранул. Неподвижной фазой при гель-фильтрации является жидкость, находящаяся внутри пористых, хорошо смачиваемых гранул носителя, заполняющих колонку, а подвижной - какой-либо элюент, подбираемый индивидуально в зависимости от типа разделяемой смеси белков и пептидов, поставленной задачи и пр. Поскольку в пределах гомогенной серии макромолекул размеры и молекулярная масса тесно

связаны, элюционные объемы глобулярных белков в значительной степени определяются их молекулярными массами (ММ), но не зависят от концентрации белка, ионной силы раствора и только для некоторых белков зависят от температуры (Скоупс Р., 1985; Березкин В.Г., 1999; Scopes R.K., 1994).

Гель-фильтрацию применяют также и для определения молекулярной массы белков, поскольку существует линейная зависимость между логарифмом ММ белка и его элюционным объемом (Уэ) (Остерман JI.A., 1985; Сакодынский К.И. и соавт., 1993).

Для выделения низкомолекулярных пептидов использовали вытяжку из гомогенатов поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота. Подготовку гомогената проводили согласно А. с. СССР № 1476653.

Разделение пептидов вели методом гель-хроматографии по методике (Остерман Л.А., 1985) с применением различных марок сефадексов при температуре ниже 10°С.

На колонку размером 70x2,5 см, заполненную сефадексом G-100, наносили вытяжку из гомогената ПЖ в количестве 12-15 мл. В качестве элю-ента использовали 0,15М раствор хлорида натрия. Скорость подачи элюи-рующего раствора (50 мл/час) регулировали с помощью перистальтического насоса фирмы LKB (Швеция). Отдельные фракции собирали автоматическим коллектором LKB по 8-10 мл. Наличие белков и полипептидов в отдельных фракциях определяли при помощи спектрофотометра СФ-46 при Х-2В0 нм. При анализе хроматограммы установлено, что пик максимального светопоглощения лежит в области 6-23 фракций. Таким образом в результате хроматографического разделения получили фракцию очищенных полипептидов с объемом элюции V3 = 140 мл.

Очищенные полипептиды помещали в емкости для сушки и сушили лиофильным методом. Пробу высушенного полипептида растворяли в 0,15М NaCl (концентрация раствора полипептида составляла 15 мг/мл) и ре-хроматографировали на колонке с сефадексом G-25 (той же фирмы). На колонку размером 75x2,5 см наносили 7 мл раствора очищенного полипептида. Отдельные фракции по 7-8 мл собирали автоматическим коллектором фракций, наличие белков и пептидов определяли спектрофотометрически. В результате повторной гель-фильтрационной очистки было получено несколько фракций полипептидов (рис. 1), которым соответствовало максимальное светопоглощение.

Поскольку логарифмы молекулярных масс хроматографируемых веществ находятся в линейной зависимости от отношения VJ VCB, определение молекулярной массы выделяемых пептидов вели, измеряя элюционные объемы (Уэ) белков с известными молекулярными массами при пропускании их через ту же хроматографическую колонку, на которой проводилиразделение пептидов панинтестина. В качестве маркерных белков использовали трип-

Номера фракций

Рис. 1. Хроматографическое разделение очищенного полипептида на сефадексе С-25

син (ММ 23800), папаин (ММ 20700), цитохром С (ММ 15000), рибонуклеа-зу (ММ 13500), инсулин (ММ 5800), а-меланоцит-стимулирующий гормон (ММ 1645), бацитрацин (ММ 1450).

Затем измерили элюционные объемы исследуемых пептидов и, пользуясь графиком (рис. 2), определили их молекулярную массу.

Молекулярная масса выделенных пептидов была равна приблизительно: пептид А - 5500-6500 Да, пептид В - 3300-3500 Да, пептид С - 2000-

Рис. 2. Зависимость отношения элюционного объема к свободному объему колонки от ММ белков и пептидов

2500 Да. Эти пептиды были использованы для испытания биологической активности на животных и для детального анализа с применением современных методов физико-химического инструментального анализа.

Дальнейшие исследования проводили совместно с Институтом биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Москва).

Разделение пептидов панинтестина и их анализ вели по нескольким независимым методикам. В качестве исходной пробы был выбран полученный гель-фильтрацией пептид В, который в опытах на лабораторных животных показал выраженную биологическую активность. План разделения и исследования состава пептида В представлен на схеме 1.

В основу первого метода исследования - высокоэффективной жидкостной хроматографии - положена избирательная растворимость различных веществ в полярных и неполярных растворителях. Распределительная жидкостная колоночная хроматография предполагает наличие двух жидких фаз, неподвижной и подвижной, притом, что неподвижность одной из них обусловлена ее связью с твердой матрицей, заполняющей хроматографиче-скую колонку. По самой сути хроматографического процесса компоненты фракционируемой смеси должны быть лучше растворимы в неподвижной фазе, чем в подвижной. Если при этом неподвижная фаза водная, а подвижная представлена органическим растворителем или водно-органической смесью, а вещества в целом гидрофильны, то и разделение идет по степени гидрофильности.

У различных аминокислот гидрофобные или гидрофильные свойства выражены сильнее или слабее в соответствии с химической природой радикалов, входящих в их состав. Гидрофобность или гидрофильность пептидов и белков определяется их аминокислотным составом. Высокоэффективная жидкостная хроматография позволяет за короткое время с большой точностью проводить разделение, идентификацию и количественное определение состава сложных смесей.

Для анализа пептида, выделенного из панинтестина, использовали микроколоночный жидкостной хроматограф "Миллихром А-02" (производства фирмы "Эконова", Новосибирск). Применяли колонку Nucleosil С18 размером 2x75 мм. В качестве градиентной системы была выбрана смесь 0,1%-ной трифторуксусной кислоты с ацетонитрилом. Температура процесса 35°С. Контроль появления компонентов смеси в элюате осуществляли при: X = 210 и X = 280 нм.

РАЗДЕЛЕНИЕ ПЕПТИДА В, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПАНИНТЕСТИНА

Сокращения на схеме: Ф - фракция, КЭФ - капиллярный электрофорез, МС -масс-спектрометрия

Схема 1. План проведения исследования пептида В, выделенного из панинтестина методом гель-фильтрации

са 35°С. Контроль появления компонентов смеси в элюате осуществляли при: >. = 210 и Х = 280 нм.

На хроматограмме исходного пептида В (рис. 3) хорошо видны пять пиков (пики обозначены как фракции 1-5). Фракции 1-5 собирали, лиофи-лизировали и снова хроматографировали в тех же условиях.

На представленном рисунке видно, что пептид В, выделяемый при колоночной гель-фильтрации в виде одного общего пика (рис. 1), при более тонком разделении методом высокоэффективной жидкостной хроматографии дает не одну, а несколько фракций, значительно различающихся по физико-химическим свойствам. Так, время удержания самой гидрофобной

фракции (1-ой) меньше времени удержания наиболее гидрофильной (5-ой) почти в четыре раза. По полученным данным можно сделать предположение, что фракции, входящие в состав выделенного гель-хроматографией пептида В, различны по соотношению гидрофильных и гидрофобных аминокислот, или по первичной структуре. Кроме этого следует отметить, что фракции 1-5 отличаются друг от друга и в количественном отношении: содержание фракции 5 максимально, тогда как остальных компонентов в смеси значительно меньше, т. е. в составе взятого для исследования пептида В преобладают гидрофильные аминокислоты. На хроматограмме исходного пептида В (рис. 3) видно также, что 4-я фракция в свою очередь тоже не является однородной и, видимо, при определенных условиях может быть разделена на еще более мелкие фракции.

Рис.3. Хроматограмма пептида В

Для исследования фракций, выделенных из пептида В, применяли капиллярный электрофорез, в основе которого лежит способность заряженных частиц перемещаться в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами: во-первых, молекулы (как низкомолекулярные, так и макромолекулы) несут на себе заряды неодинаковой величины и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени, во-вторых, их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В случае классического электрофореза применя-

ются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также увеличить сопротивление трения макромолекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. С помощью кварцевого капилляра с внутренним диаметром 50-100 мкм удается достигнуть высокоэффективного разделения белков, при котором из-за сравнительно большого отношения поверхности к объему значительно уменьшается влияние мешающей разделению термически индуцированной конвекции (Волощук A.M., 1996). Капиллярному электрофорезу подвергали как исходный пептид В для разделения входящих в его состав пептидов, так и рехроматографированные фракции 1-5 с целью более детального анализа. Разделение проводили на приборе фирмы ABI (модель 270А), капилляр диаметром 75 мкм.

Метод электрофоретического разделения подтверждает, что взятый для изучения пептид не однороден по составу, а включает в себя несколько различных пептидов, различающихся по физико-химическим свойствам, в частности по величине заряда и, возможно, молекулярным массам. Величины пиков на электрофореграмме исходного пептида значительно различаются между собой, тогда как на электрофореграммах отдельных рехромато-графированных фракций таких отличий не наблюдается. Сравнивая результаты капиллярного электрофореза и жидкостной хроматографии, можно также отметить, что преобладающей фракцией в составе пептида В является фракция 5.

Для детального анализа хроматографированных фракций использовали метод масс-спектрометрии, который широко применяют для идентификации и установления структуры органических соединений. Сущность метода заключается в том, что анализируемое вещество подвергают ионизации (в случае исследования органических соединений используют химическую ионизацию или лазерное излучение), а затем ионизированные молекулы и атомы разделяют в масс-спектрометре по их массам. Масс-спектрометрия позволяет определить молекулярную массу и структуру органических соединений (Карасек Ф., Клемент Р., 1993; Геккелер К.Е., Экштайн X., 1994; Золотов Ю.А., 2000; Churacek J., 1993).

Масс-спектры MALDI снимали на приборе Vision-2000 (Thermo Bioanalysis Corp., Англия). Источник возбуждения - азотный лазер (337 нм). Максимальная энергия возбуждения — 250 мкДж. В качестве матрицы была использована дигидроксибензойная кислота. Данный метод применяли для анализа рехроматографированных фракций, полученных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Использование масс-спектрометрии подтверждает, что образец В обладает значительной неоднородностью и состоит из компонентов, различающихся по молекулярной массе. В масс-спектрах есть пики с массами 347-497, что соответствует 3-4-5-членным пептидам.

Следующим использованным способом разделения компонентов па-нинтестина была фильтрация на мембранных фильтрах «Центрикон», представляющих собой материал с размером пор, соответствующим молекулам определенных величин. Применялись фильтры с диапазонами отсечки фракций с молекулярными массами: 1-я > 30 кДа, 2-я - 3-10 кДа и 3-я < 3 кДа. Самую низкомолекулярную фракцию (условно обозначенную как С3) использовали для изучения влияния на активность ферментов в желудке, двенадцатиперстной кишке и поджелудочной железе.

Действие пептидов, выделенных из панинтестина, на активность пищеварительных ферментов в слизистой желудка, двенадцатиперстной кишки и ткани поджелудочной железы у крыс

В острых опытах на крысах было исследовано действие некоторых выделенных из панинтестина пептидов на активность ферментов желудочно-кишечного тракта.

В первой серии опытов исследовалось влияние пептидов I и II,' выделенных методом гель-хроматографии на сефадексе марки С-100 из полуфабриката панинтестина, приготовленного из разных проб биоматериала. Для исследования были выбраны фракции, показавшие максимальное све-топоглощение при длине волны 280 нм, т. е. содержащие наибольшее количество пептидов.

Опыты были поставлены на трех группах беспородных белых крыс-самцов массой по 150-200 г (п=30). Крысам после 24-часового голодания вводили внутрибрюшинно выделенные из панинтестина пептиды I и II из расчета 6 мкг/кг веса, разведенные физиологическим раствором. Дозировки рассчитывали по концентрации белка в пробах, определенной методом Кьельдаля в модификации Конвея. В качестве контроля использовали изотонический раствор хлорида натрия. После 60-минутной экспозиции животные подвергались декапитации, из брюшной полости извлекали желудок, поджелудочную железу и двенадцатиперстную кишку, из них готовили 10%-ные гомогенаты и определяли следующие показатели: в гомогенате желудка - протеолитическую активность пепсина, в гомогенатах поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки — активность трипсина, суммарную протеолитическую активность и активность амилазы. Полученные данные обрабатывались статистически.

Парентеральное введение пептидов I и II вызывает увеличение активности пепсина в слизистой желудка на 56 и 63% соответственно. Эти же пептиды увеличивают активность трипсина в ПЖ - на 20% (пептид I) и 86% (пептид II) и не оказывают существенного влияния на суммарную активность протеиназ. Что же касается амилазы, то ее активность в поджелудочной железе под действием выделенных из панинтестина пептидов I и II снижается на 56 и 32% соответственно. Влияние этих же пептидов на актив-

ность ферментов в гомогенате двенадцатиперстной кишки имеет иной характер: пептиды I и II существенно повышают СПА (на 40 и 114% соответственно) в гомогенате ДПК, но не вызывают изменений активности трипсина, а активность амилазы уменьшается, но не так заметно, как в гомогенате ПЖ (на 31 и 10% соответственно).

В следующей серии опытов на животных для изучения биологических свойств пептидов панинтестина были взяты три пептида, полученные методом гель-фильтрации с использованием сефадексов марок G-100 и G-25 и различающиеся по молекулярным массам: пептид А, пептид В и пептид С (рис. 1). Опыты поставлены на пяти группах крыс (п=40). Условия проведения эксперимента были такими же, как в предыдущей серии. Крысам I группы (контроль) внутрибрюшинно вводили 1 мл физиологического раствора, крысам II, III и IV групп вводили соответственно пептиды А, В и С из расчета 6 мкг на 1 кг массы, разведенные физиологическим раствором. Крысам V группы вводили пентагастрин, который является мощным современным фактором стимуляции желез гастропанкреатодуоденального комплекса. Было установлено, что пептиды А, В и С изменяют активность пищеварительных ферментов у,крыс разнонаправлено, так, пептиды.А и С в гомогенате поджелудочной железы снижают активность трипсина на 3437%, химотрипсина - на 33-35%, а суммарную протеолитическую активность — в среднем на 25%. В то же время пептид В повышает активность всех указанных протеиназ на 16-51%. Введение пептидов изменяет также и активность ферментов в гомогенате двенадцатиперстной кишки (табл. 1), но не влияет на активность пепсина в слизистой оболочке желудка у крыс.

В следующей серии опытов на животных изучали действие другого пептида, входящего в состав панинтестина. Пептид, условно обозначенный как С3, получали из пептида В, показавшего выраженную биологическую активность в острых опытах на животных. Пептид В, выделенный "методом последовательной гель-фильтрации из полуфабриката панинтестина на колонках с сефадексами G-100 и G-25, разделяли путем фильтрации на мембранных фильтрах «Центрикон» (совместно с Институтом биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва). Выбранный для исследования пептид имел молекулярную массу < 3 кДа.

При парентеральном введении пептида С3 увеличивается активность ферментов в гомогенатах как поджелудочной железы, так и в двенадцатиперстной кишки: трипсина - на 54-61%, амилазы - на 56-87%. Существенного изменения суммарной протеолитической активности и пепсина не наблюдалось.

В связи со значительным эффектом, оказываемым низкомолекулярным пептидом Сз на активность некоторых пищеварительных гидролаз, было проведено сравнительное исследование влияний этого пептида и модуля идаларгина. В данной серии опытов были использованы также пептиды,

Таблица 1

Активность ферментов поджелудочной железы и ДНК у опытной (п = 40) и контрольной (п = 40) групп крыс при введении пептидов А, В и С (на 1 г влажной ткани)

Фермент Физиологический раствор (контроль) Пептид А Пептид В Пептид С Пентатастрин

М+Ш % М±Ш % М±Ш % М±Ш | % М±т %

Поджелудочная железа

Активность трипсина, мкмоль-15/мин 138,5±3,6 100 91,4±4,2* 66 209,1±6,8* 151 87,3±3,4* 63 192,5±5,9* 139

Суммарная протеоли-тическая активность, ммоль-Т/мин 117,1±4,1 100 89,0±5,1* 76 144,0±6,6* 123 86,7±4,4* 74 159,2±4,8* 136

Активность химот-рипсина, мг/мл 14,3±0,6 100 9,7±0,8* 68 16,6±1,1 116 9,3±1,0-" 65 16,7±0,7 117

Двенадцатиперстная кишка

Активность трипсина, мкмоль-8/мин 40,2±3,0 100 32,2±2,7* 80 57,1±3,9* 142 28,5±2,9* 71 52,3±4,2* 130

Суммарная протеоли-тическая активность, ммоль-Т/мин 22,6±2,1 100 25,3±2,7 112 30,7±3,0* 136 24,6±1,8 109 33,4±2,9* 148

Активность химот-рипсина, мг/мл 9,1±0,6 100 8,8±0,5 97 9,3±0,5 102 8,7±0,6 96 10,4±0,3 114

Примечание:* отмечено р < 0,05

выделенные из ткани свежеиссеченных язв желудка методом колоночной гель-хроматографии и обозначенные как гастроульцерозный пептид С1ЛМ (однократная очистка на сефадексе в-100) и ОЦР-2 (повторное хроматогра-фирование на сефадексах в-100 и С-50). Молекулярная масса этих пептидов, определенная по маркерным белкам составляла приблизительно 4500— 5500 кДа у пептида СиР-1 и 2500-3500 кДа - у ОШ-2.

В результате проведенных исследований биоматериала было установлено (рис. 4, 5), что у крыс под действием пентагастрина активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы увеличивается на 39%, а суммарная протеолитическая активность - на 24%. Активность амилазы в поджелудочной железе под влиянием пентагастрина растет, достигая 122%. Активность протеиназ в слизистой двенадцатиперстной кишки у крыс в ответ на введение пентагастрина также изменяется: активность трипсина возрастает на 24%, суммарная активность протеиназ - на 40%. Протеолитическая активность пепсина в гомогенате желудка увеличивается на 35% по сравнению с контрольной группой крыс.

Под действием гистамина активность ферментов в органах желудочно-кишечного тракта у крыс изменяется следующим образом: активность пепсина увеличивается на 26% в сравнении с контролем, активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы возрастает до 163%, а в гомогенате двенадцатиперстной кишки - до 128%. Изменение суммарной протеоли-тической активности у этой группы крыс не столь существенно: в гомогенате поджелудочной железы СПА возрастает на 20%, а в гомогенате двенадцатиперстной кишки - на 24%. Активность амилазы увеличивается на 65% в гомогенате поджелудочной железы и не изменяется в гомогенате двенадцатиперстной кишки.

Введение даларгина снижает активность всех пищеварительных ферментов желудочно-кишечного тракта: активность пепсина уменьшается на 37,4%, активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы падает на 28,5%, а в гомогенате двенадцатиперстной кишки — на 24,5%. Активность амилазы и СПА в ответ на введение даларгина изменяются не столь значительно: в гомогенате двенадцатиперстной кишки активность амилазы составляет 88,6% от контрольной, а суммарная активность протеиназ - 87%. Однако эти изменения статистически недостоверны.

В острых опытах на крысах установлено также, что под влиянием пептида С3, введенного животным парентерально, значительно увеличивается активность трипсина и амилазы как в поджелудочной железе (на 51 и 84% соответственно), так и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки (на 59 и 54% соответственно), в то время как активность протеиназ практически не изменяется. Однако этот пептид не оказывает существенного влияния и на активность пепсина в слизистой оболочке желудка.

При введении пептида ОЦР-1 (гастроульцерозного пептида), выделенного из ткани язвы желудка, активность трипсина в гомогенатах

| ■ контроль И пентагастрин Игистамин ®даларгин

I ЯпептидСз ВпептидоиР-1 □ пептид в 11Р-2

трипсин СПА амилаза

Рис. 4. Изменение активностей трипсина, амилазы и суммарной протеолитической активности в гомогенате ПЖ крыс под действием пентагастрина, гистамина, даларгина и пептидов С3, СЦР-1 и виР-2 по сравнению с контролем

трипсин СПА амилаза

Рис. 5. Изменение активностей трипсина, амилазы и суммарной протеолитической активности в гомогенате ДПК крыс под действием пентагастрина, гистамина, даларгина и пептидов С3, вир-! и ОЦР-2 по сравнению с контролем

I I

' поджелудочной железы увеличивается на 14%, а суммарная протеолитиче-

ская активность - на 26%. При этом на 78% возрастает и активность амилазы. В слизистой желудка активность пепсина увеличивается на 18%. При 1 внутрибрюшинном введении ОиР-2 процент увеличения активности не-

сколько ниже, чем при действии 01ЛМ, но также носит статистически | достоверный характер. В гомогенате двенадцатиперстной кишки под дей-

ствием ульцерозных пептидов активность ферментов уменьшается почти во всех случаях, кроме активности трипсина, которая возрастает под влиянием ОиР-1 на 27%.

Таким образом установлено, что препарат панинтестин, предназначенный для коррекции секреторной недостаточности пищеварительных желез, содержит пептиды, оказывающие гормоноподобное действие на активность ферментов органов гастропанкреатодуоденального комплекса. При этом направление и степень воздействия всецело зависят от состава и структуры самого пептида. Возможно, эти пептиды, образующиеся при изготовлении препарата, а также содержащиеся в используемом для его производства материале (ткани поджелудочной железы и слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки), похожи по строению на пептидные гастро-интестинальные гормоны - гастрин, холецистокинин, бомбезин и др. Можно предположить, что сходство строения позволяет полученным нами пептидам взаимодействовать с рецепторами пептидных гормонов желудочно-кишечного тракта и действовать по механизмам, сходным с механизмами действия гастроинтестинальных гормонов.

Стимулирующим влиянием обладают также и пептиды, полученные из ткани язвы желудка. Представляется вероятным, что слизистая желудка, вовлеченная в патологический процесс, сопровождающийся образованием язвы, продуцирует биологически активные пептиды. Их образование мо' жет быть связано с преждевременной активацией лизосомальных протеи-наз (катепсинов), которые гидролизуют внутриклеточные протеины, или действием ферментов, локализованных в протеосомах, также подвергающих деградации видоизмененные воспалительным процессом внутрикле-^ точные белки.

При этом следует отметить, что низкомолекулярные пептиды, прошедшие более тщательную очистку — пентагастрин и пептид С3 - обладают наибольшим действием, особенно хорошо выраженным в отношении панкреатических протеиназ и амилазы.

' Выводы

1. Разработан метод экстракции и хроматографического выделения пепти-1 дов, содержащихся в гастроэнтерологических препаратах ферментоза-

местительной терапии (ПФЗТ), которые обладают биологической активностью, выражающейся в изменении активности пищеварительных ферментов.

2. Методами гель-фильтрации, высокоэффективной хроматографии и капиллярного электрофореза из панинтестина, который, как и другие ПФЗТ, содержит в основном панкреатические ферменты, выделено около двух десятков биологически активных пептидных фракций молекулярной массой до 5500-6500 Да.

3. Выделенные из панинтестина пептиды при парентеральном введении экспериментальным животным (крысам) обладают способностью как увеличивать активность ферментов пищеварительных желез, так и тормозить ее. При этом не всегда наблюдается параллельность изменений активности ферментов в желудке, поджелудочной железе и слизистой тонкой кишки.

4. Выделенные из панинтестина методом колоночной гель-фильтрации пептиды А, В и С (ММ 5500-6500, 3000-3500 и 2000-2500 Да соответственно) при внутрибрюшинном введении животным оказывают резко выраженное действие. Пептид В стимулирует активность панкреатических и интестинальных ферментов, а пептиды А и С - угнетают. На активность пепсина они сколько-нибудь заметного действия не оказывают.

5. Установлено, что более выраженным свойством влиять на активность пищеварительных ферментов обладают низкомолекулярные пептиды (ММ < 3000 Да), что, по-видимому, зависит от первичной структуры ' пептидов.

6. Низкомолекулярный пептид С3 (ММ < 3000 Да), полученный из фракции В при помощи комбинированных физико-химических способов выделения (колоночной гель-хроматографии и мембранной фильтрации) по интенсивности своей способности увеличивать активность ферментов органов гастродуоденальной зоны приближается к действию таких стимуляторов как гистамин и пентагастрин, а подчас и превышает его.

7. При помощи разработанной на кафедре биохимии КГМА технологии выделения пептидов из гастроэнтерологических препаратов ферменто-заместительной терапии получены пептиды из ульцерозной ткани желудка, которые обладают способностью влиять на активность ферментов в органах гастродуоденального комплекса.

Список печатных трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Сторожук П.Г., Быков И.М., Хвостова Т.С., Брещенко Е.Е., Быков М.И. Действие пептидов, выделенных из Панинтестина, на биосинтез фер-

ментов желудочно-кишечного тракта у крыс // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2000. - Т.10, № 5. - С. 72.

2. Сторожук П.Г., Быков И.М., Хвостова Т.С., Брещенко Е.Е., Быков М.И. Биохимическая оценка гастроэнтерологических препаратов ферменто-заместительной терапии // Там же. С. 72.

3. Сторожук П.Г., Быков И.М., Брещенко Е.Е., Хвостова Т.С., Быков М.И., Плахотнюкова В.В. Новый взгляд на механизмы действия препаратов ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии // Аллергология и иммунология.-2001,- Т.2, №1.- С. 148-154.

4. Сторожук П.Г., Быков И.М., Хвостова Т.С., Брещенко Е.Е., Быков М.И. Протеолитические свойства и другие биохимические характеристики патентованных препаратов ферментозаместительной терапии // Кубан. науч. мед. вестн. - 2001. - № 1 (55). - С. 9-11.

5. Сторожук П.Г., Быков И.М., Брещенко Е.Е., Хвостова Т.С. Хромато-графическое выделение биологически активных ферментов из панинте-стина и исследование их действия на синтез ферментов поджелудочной железы, желудка и двенадцатиперстной кишки //Там же. С. 19-21.

6. Сторожук П.Г., Быков И.М., Брещенко Е.Е., Хвостова Т.С., Быков М.И. Триптическая и общая протеолитическая активность некоторых отечественных и зарубежных препаратов ферментозаместительной терапии // В мат. Всерос. науч.-практ. конф. «Органосохраняющие принципы в хирургии неотложных состояний». - Ейск, 2001. - С. 119-121.

7. Сторожук П.Г., Оноприев A.B., Быков И.М., Быков М.И., Брещенко Е.Е., Хвостова Т.С. Выделение пептидов из ульцерозной ткани желудка и исследование их биологической активности // Intern. J. on Immunorehabilitation. - 2002. - Т. 4, № 1. - С. 28-32.

8. Сторожук П.Г., Оноприев A.B., Быков И.М., Брещенко Е.Е., Быков М.И., Хвостова Т.С. Технология выделения пептидов из гастродуоде-нальных язв и изучение их биологической активности // В мат. 10-й юбил. междунар. конф. «Новые информ. технологии в медицине и экологии». - Ялта-Гурзуф, 2002. - С. 113-115.

9. Сторожук П.Г., Быков И.М., Брещенко Е.Е., Быков М.И., Хвостова Т.С. Гастродуоденальные ульцерозные пептиды и их действие на биосинтез кишечных ферментов // В мат. 18-й Всерос. науч. конф. с междунар. участием «Физиология и патология пищеварения». - Геленджик, 2002. - С. 235-236.

Ю.Сторожук П.Г., Быков И.М., Оноприев A.B., Брещенко Е.Е, Быков М.И.. Хроматографическое разделение полипептидов, выделенных из ульцерозной ткани ДПК и определение их аминокислотного состава // Intern. J. on Immunorehabilitation. - 2003. - Т. 5, № 1. - С. 105.

Использованные сокращения

' ПФЗТ - препараты ферментозаместительной терапии ММ - молекулярная масса СПА - суммарная протеолитическая активность ДПК-двенадцатиперстная кишка ПЖ - поджелудочная железа GUP - гастроульцерозный пептид

Издательство ООО «ЦВВР» Лицензия ЛР № 65-36 от 05.08.99 г. Заказ № 425 от 21.10 2003 г. Тираж 100 экземпляров. Печ лист 1,0 Усл.печл 1,0. Формат 60*84/16. Компьютерный набор и верстка. Издательско-полиграфический комплекс « Биос» РГУ 344091, г. Ростов-на-Дону, ул. Зорге, 28/2, корп. 5 «В», 4 этаж. Лицензия на полиграфическую деятельность № 65-125 от 09 02.98 г.

¿bog- Д

l72og i 17 2 О 8

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Брещенко, Елена Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. НЕЙРОГУМОРАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СЕКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ЖЕЛУДКА И ЭКЗО-4 КРИННОЙ СЕКРЕЦИИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

1.1. Регуляция желудочной секреции гормонами пептидной и непептидной природы.

1.2. Ферменты панкреатического сока и регуляция экзокринной секреции поджелудочной железы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Технология получения препарата «Панинтестин» и выделения из него биологически активных пептидов.

2.2. Постановка эксперимента на животных.

2.2. 1. Определение содержания пептидов в пробе для расчета дозировки.

2. 3. Методы исследования.

2.3.1. Определение молокосвертывающей способности пепсина.

2. 3. 2. Определение протеолитической активности пепсина.

2. 3. 3. Определение активности панкреатических протеиназ суммарно.

2. 3. 4. Определение активности трипсина.

2. 3. 5. Определение активности химотрипсина.

2. 3. 6. Определение активности амилазы.

2. 4. Статистические методы исследования.

ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

ПЕПТИДОВ ИЗ ПАНИНТЕСТИНА И ИЗУЧЕНИЕ

ИХ ОСНОВНЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

3.1. Хроматографическое разделение пептидов панинтестина методом гель-фильтрации.

3.2. Определение молекулярной массы пептидов, выделенных из панинтестина.

3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография и ее использование для фракционирования пептида В, выделенного из панинтестина.

3.4. Разделение и анализ пептида В панинтестина с использованием методов капиллярного электрофореза, масс-спектрометрии и мембранной фильтрации.

ГЛАВА 4. ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПАНИНТЕСТИНА, НА АКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ В СЛИЗИСТОЙ ЖЕЛУДКА, ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ И ТКАНИ

ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У КРЫС.

4.1. Влияние пептидов, выделенных из панинтестина методом гель-фильтрации, на активность пищеварительных ферментов желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки.

4.2. Влияние низкомолекулярного пептида Сз, выделенного из пептида В методом мембранной фильтрации, на активность пищеварительных ферментов в органах гастропанкреато-дуоденального комплекса.

4.3. Сравнение изменения активности пищеварительных ферментов под действием пептида С3, выделенного из панинтестина, и патентованных средств, применяемых для стимуляции или подавления внешнесекреторной деятельности органов гастропанкреатодуоденального комплекса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение пептидов из панинтестина и изучение их биологических свойств"

Актуальность исследования. В связи с ростом количества гастроэнтерологических заболеваний, широко распространенных среди взрослого и детского населения и сопровождающихся секреторной недостаточностью желудка, поджелудочной железы, печени, тонкого кишечника, растет и потребность в различных препаратах ферментозаместительной терапии, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами (Златкина А.Р. и соавт., 1998; Ивашкин В Т., Рапопорт С.И., 1999). Ферментные препараты отличаются друг от друга как сочетанием и дозой содержащихся в них пищеварительных ферментов, так и наличием различных добавок. Успех коррегирующей ферментотерапии зависит от правильного подбора лекарственного средства (Яковенко Э.П., 1998; Охлобыстин A.B., 2001; Di-Magno Е.Р., 1999).

Известно (Яковенко Э.П., 1998), что в некоторых из ферментных препаратов содержатся высокие дозировки ферментов заместительной терапии (пепсина, трипсина, химотрипсина, липазы, амилазы), однако и они не могут полностью компенсировать недостающую часть ферментов, так как покрывают только десятые или сотые доли суточной нормы (Сторожук П.Г., Быков И.М., 1994; Быков И.М., 2001). Несмотря на то, что ферменто-заместительная терапия не может оказывать существенного влияния на процессы пищеварения из-за недостаточного содержания в препаратах пищеварительных ферментов, многие исследователи отмечают положительный терапевтический эффект от применения препаратов ферментозаместительной терапии. Возможно, такие результаты связаны с наличием в препаратах биологически активных пептидов.

На кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии уже несколько десятилетий разрабатываются технологии получения препаратов ферментозаместительной терапии и изучаются их биохимические и физиологические свойства. Профессором Н.П. Пятницким были созданы пепсинсодержащие препараты пепсидил и сальпепсин (A.c. № 200740, 1967; A.c. № 289812, 1970), затем проф. П.Г. Сторожуком и М.М. Мыкртычаном была разработана технология получения нового искусственного желудочного сока - копепсидила (A.c. № 908358, 1982). Позже коллектив сотрудников кафедры биохимии разработал технологию приготовления препарата панинтестин (A.c. № 1476653,1987), предназначенного для лечения заболеваний с секреторной недостаточностью поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Технология получения панинтести-на предусматривает введение в гомогенат поджелудочной железы слизистой оболочки тонкой кишки, где содержатся ферменты, активирующие трипсиноген, и заканчивающие гидролиз мелких пептидов трипептидазы, дипептидазы, в результате чего происходит активация всех панкреатических ферментов, гидролиз белков собственных тканей органа с образованием многообразных форм пептидов.

При исследовании препаратов ферментозаместительной терапии было установлено, что они обладают способностью повышать секреторную деятельность желудка, поджелудочной железы и тонкой кишки. Это свойство принадлежит сопутствующим пептидам, которые были выделены из пепсидила и копепсидила (Хангалдова Т.Н., 1977; Быков И.М., 1982). Также было установлено, что препарат панинтестин обладает подобным свойством (Быков И.М., 2001). В связи с этим изучение механизмов действия препаратов заместительной энзимотерапии является одной из актуальных проблем современной гастроэнтерологии. Особое значение она приобретает при хирургическом лечении заболеваний желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Эта проблема актуальна и в педиатрии, так как недостаточность секреторной деятельности пищеварительных желез у детей не позволяет ребенку нормально питаться, что сказывается на его росте и развитии.

Целью настоящей работы является выделение пептидов из панинте-стина и исследование их влияния на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке.

В связи с этим перед исследователем стояли следующие задачи:

2. В экспериментах на животных провести исследование влияния высоко- и низкомолекулярных пептидов на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки.

Новизна результатов исследования

Установлено, что препарат панинтестин, разработанный на кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии и предназначенный для коррекции секреторной недостаточности поджелудочной железы, содержит как высокомолекулярные белки, так и биологически активные пептиды.

Выявлено, что пептиды, входящие в состав панинтестина, обладают биологической активностью по отношению к органам пищеварения. Исследованиями на лабораторных животных установлено, что различные пептиды обладают разнонаправленным действием: одни из них увеличивают активность ферментов желудочно-кишечного тракта, другие -уменьшают. Эффект зависит от молекулярной массы и первичной структуры пептида.

Впервые в острых опытах на крысах показано, что высокая биологическая активность полученных пептидов по своей интенсивности часто не уступает известным стимуляторам секреции желудка и внешнесекретор-ной функции поджелудочной железы (пентагастрин, гистамин).

Основные положения, выносимые на защиту

Теоретическая и практическая значимость работы

Сведения о внедрении результатов исследования в практику

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Органосохраняющие принципы в хирургии неотложных состояний» (Ейск, 2001), X юбилейной международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2002), 18-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и патология пищеварения» (Геленджик, 2002).

Публикации. По материалам проведенных исследований опубликовано 10 печатных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Брещенко, Елена Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод экстракции и хроматографического выделения пептидов, содержащихся в гастроэнтерологических препаратах ферментоза-местительной терапии (ПФЗТ), которые обладают биологической активностью, выражающейся в изменении активности пищеварительных ферментов.

6. Низкомолекулярный пептид Сз (ММ < 3000 Да), полученный из фракции В при помощи комбинированных физико-химических способов выделения (колоночной гель-хроматографии и мембранной фильтрации) по своей способности увеличивать активность ферментов органов гаст-родуоденальной зоны приближается к действию таких стимуляторов как гистамин и пентагастрин, а подчас и превышает его.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Технология получения препаратов ферментозаместительной терапии и изучение механизмов их действия традиционно входят в число научных приоритетов кафедры биохимии Кубанской медицинской академии.

Работы в этом направлении были начаты проф. Н.П. Пятницким и в течение нескольких десятилетий продолжаются его учениками. Наибольшее распространение среди препаратов ферментозаместительной терапии, разработанных ими, получили «Пепсидил» (Пятницкий Н.П. Авт.св. № 200740, 1967), «Сальпепсин» (Пятницкий Н.П., Пятницкая И.Н. Авт.св. № 263808, 1969) и «Копепсидил» (Сторожук П.Г., Мкртычан М.М. Авт.св. № 908358, 1982). Препараты, предложенные Н.П. Пятницким и другими авторами, прошли клиническую апробацию и показали высокую терапевтическую эффективность. Положительное действие этих препаратов приписывалось исключительно пепсину, ферменту, восполняющему его недостаточность в собственном желудочном соке больных (Маланьина Н.С., 1974).

В диссертациях Т.Н. Хангалдовой (1977), И.М. Быкова (1982), И.И. Павлюченко (1987), А.Н. Колесникова (1987) и других работах, выполненных под руководством проф. П.Г. Сторожука и посвященных технологии создания новых отечественных препаратов ферментозаместительной терапии и изучению их биологических свойств, были установлены новые, ранее неизвестные научные факты. Так, Т.Н. Хангалдовой (1977) показано, что препараты пепсина обладают свойством усиливать желудочную секрецию, вызванную пищевым раздражителем, и что эта стимуляция секреции обусловлена наличием в препаратах биологически активных пептидов с молекулярной массой 10000-12000 Да.

Затем в работе И.М. Быкова (1982) было проведено разделение белковых фракций пепсинсодержащих препаратов методом молекулярных сит и выделено три пептида, обладающих высокой биологической активностью. Совместно с Институтом биохимии им. акад. A.B. Палладина (г. Киев) был изучен аминокислотный состав и молекулярная масса этих пептидов. Было установлено, что молекулярная масса этих пептидов составляла от 2400 до 3200 Да.

На кафедре биохимии проводились исследования влияния пептидов, выделенных из пепсинсодержащих препаратов, на ферментообразование в органах пищеварения у лабораторных животных при различных видах введения (Сторожук П.Г., Литвинова Т.Н., Маланьина Н.С.,1979; Сторо-жук П.Г., Литвинова Т.Н., Быков И.М., 1979а; Быков И.М., 1982; Сторожук П.Г., Литвинова Т.Н., Быков И.М., Ханферян P.A., 1983; Сторожук П.Г., Быков И.М., Павлюченко И.И., Колесников А.Н., 1986а). Было установлено, что эти пептиды оказывают влияние не только на секреторную функцию желудка, но и на экскреторную функцию поджелудочной железы.

Наряду с препаратами, содержащими пепсин, изучались и физиологические и биохимические свойства полиферментных препаратов, применяемых при лечении заболеваний с недостаточностью ферментовыдели-тельной функции поджелудочной железы и тонкой кишки (Сторожук П.Г., 1985; Сторожук П.Г., Быков И.М., Маланьина Н.С., Павлюченко И.И., 1986; Сторожук П.Г., Быков И.М., 1994; Быков И.М. и соавт., 2000; Сторожук П.Г., Быков И.М., Хвостова Т.С. и др., 2000а; Сторожук П.Г., Быков И М., Брещенко Е.Е., Хвостова Т.С., 2001; Сторожук П.Г., Быков И.М., Брещенко Е.Е. и др., 2001а). В сравнении с другими, широко используемыми в клинике препаратами ферментозаместительной терапии, такими как фестал, панзинорм, дигестал и другие, прошел экспериментальную апробацию и препарат панинтестин, получаемый по технологии П.Г. Сторо-жука, И.М. Быкова, И.И. Павлюченко (1987). По полученным данным было сделано предположение, что полиферментные препараты обладают способностью изменять секрецию пищеварительных ферментов за счет содержащихся в них пептидов, образующихся в процессе производства ауто-лизным методом и проявляющих гормоноподобный эффект в отношении экзокринных желез органов пищеварительной системы.

В результате проведенных исследований было установлено, что препарат панинтестин имеет неоднородный состав и включает в себя помимо высокомолекулярных белковых фракций, обладающих ферментативной (протеолитической и амилолитической) активностью, ряд низкомолекулярных фракций, у которых ферментативная активность отсутствует. В процессе получения панинтестина под влиянием собственных протеиназ поджелудочной железы и слизистой оболочки тонкой кишки происходит протеолиз тканевых белков этих органов, в результате чего образуются пептиды с различной молекулярной массой.

В последующих работах была предпринята попытка выделить пептиды методом колоночной гель-хроматографии с использованием сефадек-сов О-100 и С-25 из полуфабриката панинтестина, который готовится путем аутолиза смеси гомогенатов поджелудочной железы и слизистой тонкой кишки. Удалось получить ряд пептидов различной молекулярной массы. Была установлена молекулярная масса некоторых из них, которая составила от 2000-2500 Да (пептид С) до 5500-6500 Да (пептид А), и изучена биологическая активность этих пептидов в опытах на животных. Полученные пептиды были неоднородны по составу, что подтверждено дальнейшими исследованиями с помощью современных физико-химических анализов, проведенных совместно с Институтом биоорганической химии им. акад. ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Москва, 2002). Для разделения и анализа пептидов, выделенных из панинтестина, применялись такие методы, как высокоэффективная жидкостная хроматография, основанная на избирательной растворимости различных веществ в полярных и неполярных растворителях, капиллярный электрофорез, в основу которого положена способность заряженных частиц перемещаться в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью, и массспектромет-рия, широко используемая для идентификации и установления структуры органических соединений. Для детального исследования был выбран пептид В, который в опытах на крысах показал выраженный стимулирующий эффект. Исследования проводились на микроколоночном жидкостном хроматографе «Миллихром А-02» (производства фирмы «Эконова», Новосибирск), приборе для капиллярного электрофореза фирмы ABI, масс-спектры снимались на приборе Vision-2000 (фирмы Thermo Bioanalysis Corp., Англия). Современными физико-химическими методами доказано, что пептид В, полученный гель-фильтрацией на молекулярных ситах (се-фадексы G-100 и G-25), состоит не менее чем из пяти пептидных фракций, некоторые из которых содержат 3-5 аминокислотных остатка.

В качестве экспериментальных животных для изучения биологической активности полученных пептидов были выбраны крысы, поскольку они являются животными, на которых можно проводить острый эксперимент и одновременно исследовать действие того или иного фактора на ткани и ферментные системы нескольких органов. Было необходимо установить действие выделенных из панинтестина пептидов на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и слизистой двенадцатиперстной кишки. Причем ферменты пищеварения в желудочно-кишечном тракте подвергаются взаимоперевариванию, в результате чего из них образуются многообразные осколки, обладающие различными биологическими свойствами. Поэтому изучение действия пептидов следует проводить при парентеральном введении, так как они, не всасываясь в кровь, могут проникать в межклеточные щели и оказывать свое действие через мембраны клеток пищеварительных желез. Необходимость экспериментов на крысах диктуется также ограниченным количеством испытуемого материала, в частности пептидов.

В острых опытах на крысах установлено, что при парентеральном введении пептидов I и II, полученных колоночной гель-фильтрацией на сефадексе в-100 из полуфабриката панинтестина, приготовленного из разных проб биоматериала, происходило изменение активности как желудочных протеиназ, так и протеолитических ферментов, синтезирующихся в поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке. Увеличение активности пепсина в желудке составляло 56-63% по сравнению с контрольной группой животных, прирост активности трипсина - от 20 до 86%, а общая активность протеиназ существенно не изменялась. Изменения активности трипсина и суммарных протеиназ в гомогенатах двенадцатиперстной кишки носили другой характер: пептиды I и II существенно повышают СПА (на 40 и 114% соответственно) в гомогенате двенадцатиперстной кишки, но не вызывают статистически достоверных изменений активности трипсина. Активность амилазы под действием этих пептидов уменьшается как в поджелудочной железе, так и в двенадцатиперстной кишке (на 32-56 и 10-31% соответственно). Следует отметить, что активность определяемых ферментов изменяется параллельно в ткани поджелудочной железы и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки.

Пептиды, полученные последовательным разделением полуфабриката панинтестина на сефадексах О-ЮО и 0-25, также проявляли биологическую активность. Этим методом было получено три пептидные фракции, обозначенные как А, В и С. В опытах, проведенных на крысах, было показано, что эти пептиды, введенные парентерально, оказывают разнонаправленное влияние на активность ферментов в желудке, поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке. Так в поджелудочной железе пептиды А и С оказывают угнетающее действие на активность трипсина и химот-рипсина, снижая ее в среднем на 25 и 34% соотвественно. В то же время пептид В увеличивает активность трипсина на 23%, а химотрипсина - на

16%. В гомогенате двенадцатиперстной кишки активность ферментов также изменялась, причем также как и в поджелудочной железе, пептиды А и С ослабляли активность трипсина на 20-29%, а пептид В увеличивал ее на 42%. Суммарная активность протеиназ увеличивалась под действием всех трех пептидов, но в различной степени: на 42% при введении пептида В и менее значительно - на 9-12% под влиянием пептидов А и С.

Поскольку пептид В показал наибольший стимулирующий эффект, он был выбран для дальнейших, более тонких, физико-химических исследований. Этот пептид был не только исследован с помощью широко известных физико-химических способов, но и подвергнут дополнительному фракционированию мембранной фильтрацией на фильтрах «Центрикон», позволяющей разделить смесь на фракции с различной молекулярной массой. Применялись фильтры с диапазоном отсечки фракций с молекулярными массами: 1-я > 30 кДа, 2-я - 3-10 кДа и 3-я < 3 кДа. При помощи этого метода был получен низкомолекулярный пептид, условно обозначенный как Сз, имевший молекулярную массу < 3 кДа. Было изучено влияние этого пептида на активность пищеварительных ферментов в поджелудочной железе, желудке и двенадцатиперстной кишке. Также было проведено исследование действия пептида Сз в сравнении с применяющимися в клинике и НИР модуляторами секреции пищеварительных желез - пентагастри-ном, гистамином и даларгином, а также пептидами, выделенными из уль-церозной ткани желудка.

Так, у крыс под действием пентагастрина активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы увеличивается на 39% (р<0,001), а суммарная протеолитическая активность - на 24%. Активность амилазы в поджелудочной железе под влиянием пентагастрина растет, достигая 122% (р<0,01). Активность протеиназ в слизистой двенадцатиперстной кишки у крыс в ответ на введение пентагастрина также изменяется: активность трипсина возрастает на 24% (р<0,05), суммарная активность протеиназ на 40%. Протеолитическая активность пепсина в гомогенате желудка увеличивается на 35% по сравнению с контрольной группой крыс.

Под действием гистамина активность ферментов в органах желудочно-кишечного тракта у крыс изменяется следующим образом: активность пепсина увеличивается на 26% (р<0,01) по сравнению с контролем, активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы возрастает до 163% (р<0,001) , а в гомогенате двенадцатиперстной кишки - до 128% (р<0,02). Изменение суммарной протеолитической активности у этой группы крыс не столь существенно: в гомогенате поджелудочной железы СП А возрастает на 20%, а в гомогенате двенадцатиперстной кишки - на 24%. Активность амилазы увеличивается на 65% в гомогенате поджелудочной железы и не изменяется в гомогенате двенадцатиперстной кишки.

Введение даларгина снижает активность всех пищеварительных ферментов желудочно-кишечного тракта: активность пепсина уменьшается на 37,4%, активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы падает на 28,5%, а в гомогенате двенадцатиперстной кишки - на 24,5%. Активность амилазы и СПА в ответ на введение даларгина изменяются не столь значительно: в гомогенате двенадцатиперстной кишки активность амилазы составляет 88,6% от контрольной, а суммарная активность протеиназ -87%. Однако эти изменения статистически недостоверны.

В острых опытах на крысах установлено также, что под влиянием пептида Сз, введенного животным парентерально, значительно возрастает активность трипсина и амилазы как в поджелудочной железе (на 51 и 84% соответственно), так и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки (на 59 и 54% соответственно), в то время как активность протеиназ практически не изменяется. Однако этот пептид не оказывает существенного влияния и на активность пепсина в слизистой оболочке желудка.

При введении пептида ОиР-1 (гастроульцерозного пептида), выделенного из ткани язвы желудка, активность трипсина в гомогенатах поджелудочной железы увеличивается на 14%, а суммарная протеолитиче-ская активность - на 26%. При этом на 78% возрастает и активность амилазы. В слизистой желудка содержание пепсина увеличивается на 18%. При внутрибрюшинном введении ОиР-2 процент увеличения активности несколько ниже, чем при действии ОЦР-1, но также носит статистически достоверный характер. В гомогенате двенадцатиперстной кишки под действием ульцерозных пептидов активность ферментов уменьшается почти во всех случаях, кроме активности трипсина, которая возрастает под влиянием ОИР-1 на 27%.

Таким образом установлено, что препарат панинтестин, предназначенный для коррекции секреторной недостаточности поджелудочной железы, содержит пептиды, оказывающие гормоноподобное действие на активность ферментов органов гастропанкреатодуоденального комплекса. При этом направление и степень воздействия всецело зависят от состава и структуры самого пептида. Возможно, эти пептиды, образующиеся при изготовлении препарата, а также содержащиеся в используемом для его производства материале (ткани поджелудочной железы и слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки), похожи по строению на пептидные гастро-интестинальные гормоны - гастрин, холецистокинин, бомбезин и др. Можно предположить, что сходство строения позволяет полученным нами пептидам взаимодействовать с рецепторами пептидных гормонов желудочно-кишечного тракта и действовать по механизмам, сходным с механизмами действия гастроинтестинальных гормонов.

Стимулирующим влиянием обладают также и пептиды, полученные из ткани язвы желудка. Представляется вероятным, что слизистая желудка, вовлеченная в патологический процесс, сопровождающийся образованием язвы, продуцирует биологически активные пептиды. Их образование может быть связано с преждевременной активацией лизосомальных протеиназ (катепсинов), которые гидролизуют внутриклеточные протеины, или действием ферментов, локализованных в протеосомах, также подвергающих деградации видоизмененные воспалительным процессом внутриклеточные белки.

При этом следует отметить, что низкомолекулярные пептиды, прошедшие более тщательную очистку - пентагастрин и пептид Сз - обладают наибольшим действием, особенно хорошо выраженным в отношении панкреатических протеиназ и амилазы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брещенко, Елена Евгеньевна, Краснодар

1. Адриан Т.Е., Блюм С.Р., Полак Дж.М. Регуляторные пептиды верхнего отдела пищеварительного тракта // Гастроэнтерология / Под ред. Дж.Х. Барона, Ф.Г. Муди. В 3 частях. Пер. с англ. - М.: Медицина, 1988. - 4.1. -304 с.

2. Амиров Н.Ш., Антонов Д.В. Спектр протеаз слизистой оболочки желудка в норме и при экспериментальном язвообразовании // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1983. - № 5. - С.75-78.

3. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1983. - 367 с.

4. Барашкова Г.М. Гастрин, холецистокинин-панкреозимин, секретин и взаимодействие моторной функции желудка, двенадцатиперстной кишки и желчевыводящего аппарата // Физиол. журн. СССР. 1975. - Т. 61, N 5. - С. 763-767.

5. Барашкова Г.М., Фокина A.A., Климов П.К. Действие энкефалинов и их аналогов на желудочную секрецию // Физиол. журнал СССР. 1982. -Т. 68,№5.-С. 632-638.

6. Березкин В.Г. Хроматография как научная дисциплина // Заводская лаборатория. 1999. - Т. 65, № 8. - с. 1-7.

7. Бидлингмейер Б., Фрайд Б., Хегнауер Г. Препаративная жидкостная хроматография. М.: Мир, 1990. - 358 с.

8. Брокерхов X., Дженсен Р. Липолитические ферменты. М: Мир, 1978. - 394 с.

9. Быков И.М. Действие отечественных препаратов пепсина на секреторную функцию желудка в норме и при патологии: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-нД, 1982. - 18 с.

10. Ю.Быков И М. Биохимическая оценка гастроэнтерологических ферментных препаратов и выделенных из них биологически активных пептидов: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. -Ростов-нД, 2001. 45 с.

11. Вальдек Ф. Функции желудочно-кишечного тракта // Физиология человека. В 4-х томах. / Под ред. Р.Шмидта и Г.Тевса. Пер. с англ. М., 1986.-Т. 4,- С. 109-144.

12. Вафин А.З. К изучению секреторной деятельности желудка // Физиол. журн. СССР. 1967. - Т. 53, № 4. - С. 455-458.

13. Волощук A.M. Руководство по капиллярному электрофорезу: Науч. совет РАН по хроматографии. М., 1996. - 231 с.

14. Гарднер Дж.Д., Йенсен Р.Т. Характеристика рецепторов к пептидам желудочно-кишечного тракта // Полак Дж.М. и др. Физиология и патофизиология желудочно-кишечного тракта. М., 1989. - С. 16-32.

15. Геккелер К.Е., Экштайн X. Аналитические и препаративные лабораторные методы. М.: Химия, 1994. - 407 с.

16. Геллер А.Л. Пентагастрин в изучении желудочной секреции и моторики у больных хроническим гастритом, гастродуоденитом и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Хабаровск, 1984. 23 с.

17. Геллер Л.И. Желудочная секреция и механизмы ее регуляции у здорового человека. Л.: Наука, 1975. - 132 с.

18. Геллер Л.И. Клиническая физиология поджелудочной железы. Хабаровск, 1977. - 93 с.

19. Геллер Л.И. Пептидно-гормональные регуляции системы пищеварения //Клин, медицина. 1986. - N 10. - С. 25-31.

20. Герасимов В.К., Румянцев С.Н., Туголукова В.Н. Переваривание бело-ксодержащих пищевых продуктов желудочным соком в норме и при патологии желудочно-кишечного тракта // Терапевт, арх. 1989. - Т. 61, № 11.-С. 62-64.

21. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. -459 с.23 .Григорович O.A. Желудочная секреция у людей разных типов телосложения в условиях ее стимулирования и ингибирования // Физиология человека. 1998. - Т. 24, N 2. - С. 117-121.

22. Гринберг Р. Г. Нейрогуморальная регуляция функций поджелудочной железы у человека и ее нарушения // Полак Дж.М. и др. Физиология и патофизиология желудочно-кишечного тракта. М, 1989. - С. 123-134.

23. Гроссман М. Желудочно-кишечные гормоны и патология пищеварительной системы. М.: Медицина. - 1981. - 271 с.

24. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. - Т. 1. - С. 1-392.

25. Ивашкин В.Т. Метаболическая организация функций желудка. Л.: Наука, 1981.- 214 с.

26. Ивашкин В.Т., Рапопорт С.И. Справочник практического врача по гастроэнтерологии. М.: Сов. спорт, 1999. - С. 118-126.

27. Карасек Ф., Клемент Р. Введение в хромато-масс-спектрометрию / Пер. с англ. М.: Химия, 1993. - 467 с.

28. Климов П.К. Пептиды и пищеварительная система. Л.: Наука, 1983. -272 с.

29. Климов П.К. Физиологическое значение пептидов мозга для деятельности пищеварительной системы. Л.: Наука, 1986. - 256 с.

30. Климов П.К., Ткаченко Е.И. Некоторые дополнения к основным принципам регуляции функций органов пищеварения // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1995. -N3.-C.3-15.

31. Климов П.К., Фокина A.A. Физиология поджелудочной железы. Регуляция внешнесекреторной деятельности. Л.: Наука, 1987. - 152 с.

32. Колесников А.Н. Биохимическая и физиологическая характеристика препаратов искусственного желудочного сока: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-нД, 1987. - 16 с.

33. Колодзейская М.В., Пилявская A.C. Пептидазы. Киев: Наук, думка, 1982.- 176 с.

34. Контурек С.Дж. Соматостатин, секреция и двигательная активность желудочно-кишечного тракта // Желудочно-кишечные гормоны / Под ред. М. Гроссмана. -М., 1981. С. 199-206.

35. Коробов Н.В. Даларгин опиоидный пептид периферического действия // Фармакология и токсикология. - 1988. - № 4. - С. 35-38.

36. Коротько Г.Ф. Желудочное пищеварение, его функциональная организация и роль в пищеварительном конвейере. Ташкент: Медицина, 1980. - 78 с.

37. Коротько Г.Ф. Саморегуляция панкреатической секреции // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1994. - Т.4, № 3.- С. 10-14.

38. Коротько Г.Ф. Регуляторные свойства ферментов пищеварительных желез // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1996. - Т. 82, № 3. - С. 74-81.

39. Коротько Г.Ф. Регуляция секреции поджелудочной железы // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1999. - Т. 9., № 4.- С. 41-49.

40. Коротько Г.Ф., Восканян С.Э. Генерализованное и селективное обратное торможение секреции панкреатических ферментов // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова 2001. - Т. 87, № 7. - С. 982-994.

41. Корочанская С.П., Сторожук П.Г. К методике определения амилазы // Лабораторное дело. 1974. - № 5. - С. 310-311.

42. Курзанов АН. Роль энкефалинов в пептидергической и холинергической регуляции гастродуоденопанкреатического комплекса. Автореф. дис. . д-ра. мед. наук. Краснодар, 2001. - 42 с.

43. Курзанов А.Н., Генрих С.Р., Алейник В.А. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на секреторную и моторную деятельность желудка // Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем. Томск, 1989. - С. 61-62.

44. Курзанов А.Н., Теплюк С.Г., Алейник В.А. Влияние даларгина на желудочную и панкреатическую секрецию // Нейропептиды в экспериментальной и клинической практике. М., 1986. - С. 37-54.

45. Ленинджер А. Основы биохимии / Пер. с англ. -М.: Мир, 1985. Т. 3. -320 с.

46. Локшина Л.А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов // Химия протеолитических ферментов. 3-й симпоз.: Тез. докл. и стенд, сообщений. 1993. - С.

47. Маланьина Н.С. Секреторно-выделительная деятельность желудка у детей первой недели жизни и ее изменение под влиянием сальпепсина и пепсикона: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1974. - 19 с.

48. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэл В. Биохимия человека: В 2-х томах / Пер. с англ.: М.: Мир, 1993. - Т. 2. - 415 е., с шт.

49. Мерков A.M., Поляков Л.Е. Санитарная статистика. М.: Медицина, 1974.-С. 51-92.

50. Мирза-заде A.A., Мирза-заде В.А. Панкреатический полипептид: обзор // Пробл. эндокринологии. 1987. - Т. 33, № 4. - С. 81-84.

51. Мосолов ВВ. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971. - 414 с.

52. Нейрогуморальная регуляция пищеварения / Под ред. В.Х. Василенко, E.H. Кочиной; АМН СССР. М.: Медицина, 1983. - 288 с.

53. Павлюченко И.И. Сравнительная биохимическая и физиологическая характеристика ферментных препаратов поджелудочной железы: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-нД, 1987. - 16 с.

54. Панасюк E.H., Скляров А.Я., Скляров Е.Я. Пепсиноген: физиологические и клинические аспекты // Врачеб. дело. 1990. - № 10. - С.80-83.

55. Пятницкий Н.П. Определение пепсина, химозина, уропепсиногена, ге-мопепсиногена, лактопепсиногена и химотрипсина // Достижения биологии в сельское хоз-во. - М., 1965. - С. 158-160.

56. Пятницкий Н.П. Способ получения искусственного желудочного сока: A.c. №200740, 1967.

57. Пятницкий Н.П. Способ определения пепсина: A.c. № 211030, 1968.

58. Пятницкий Н.П. Лекарственное средство: A.c. № 289812, 1970.

59. Пятницкий Н.П., Пятницкая И.Н. Лекарственное средство: A.c. № 263808,1969.

60. Радбиль О.С., Федорова М.В. О новом принципе торможения желудочной секреции. Обз. лит. // МРЖ. 1985. - Разд. 17, № 9. - С. 1-4.

61. Рафес Ю.И., Ягмур С.С. Об общих эффектах гастрина (пентагастрина) // Терапевт.арх. 1977. - Т. 49, № 2. - С. 37-38.

62. Руководство по изучению питания и здоровья населения./Под ред. A.A. Покровского. М.: Медицина, 1964. - 280 с.

63. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шатц В.А. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993.-464 с.

64. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 358 с.

65. Смагин В Г., Виноградов В.А., Шаталов В Н., Полонский В.М., Булгаков С.А., Анохина В.В., Беспалова Ж.Д. Ингибирующий эффект лей-энкефалина на желудочную секрецию у собак // Бюл. экспер. биологии и медицины. 1980. - № 6. - С. 652-654.

66. Соловьева Г.И., Народецкая P.B. Ответная реакция поджелудочной железы крыс на воздействие секретина и панкреозимина в условиях разного питания // Вопр. питания. 1987. - № 5. - С. 50-53.

67. Соловьева И.А., Климов П.К. Морфологическое обоснование единства нервного и гормонального контроля деятельности желудка // Физиол. журн. СССР. 1977. - Т. 63. - С. 1574-1579.

68. Столяров Б. В., Савинов И. М., Витенберг А. Г., Карцова А. А., Зенкевич И.Г., Калмановский В.И., Каламберт Ю.А. Практическая газовая и жидкостная хроматография. СПб.: Изд-во С.-Петербург, ун - та, 1998. -612 с.

69. Сторожук П.Г., Анашкина Т.И. Экспресс-метод количественного определения активности амилазы слюны, панкреатического сока и диастазы мочи И 2-й Всесоюз. биохим. съезд: Тез. секц. сообщ. Ташкент, 1969. -Секция 24.-С. 90-91.

70. Сторожук П.Г., Криштопа B.JI. Спектрофотометрическое определение суммарной активности протеиназ панкреатического сока // Сб. материалов к науч. конф. молодых ученых Кубани. Краснодар, 1969. -С. 115-116.

71. Сторожук П.Г. Гидролитическое расщепление белковых продуктов животного происхождения некоторыми ферментами желудочно-кишечного тракта // Вопр. питания. 1970. - № 4. - С. 3-8.

72. Сторожук П.Г., Литвинова Т.Н., Маланьина Н.С. Влияние новых отечественных препаратов пепсина на желудочную секрецию у собак // Конф. молодых ученых Кубанского мед. института «Патология пищеварения». 1979.-С. 8.

73. Сторожук П.Г., Литвинова Т.Н., Быков И.М. Влияние пептидов, входящих в состав лечебных препаратов пепсина, на желудочную секрецию усобак // Конф. молодых ученых Кубанского мед. института «Патология пищеварения». 1979а. - С. 138-140.

74. Сторожук П.Г., Быков И.М., Литвинова Т.Н. Полипептиды, выделенные из слизистой оболочки желудка, и их действие на биосинтез пепсина железами желудка // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1981. - № 2. - С. 40-42.

75. Сторожук П.Г., Мыкртычан М.М. Способ получения желудочного сока: А. с. №908358, 1982.

76. Сторожук П.Г. Успехи и проблемы ферментотерапии при патологии органов гастродуоденальной зоны // Некоторые вопр. медицинской и прикл. энзимологии: Науч. тр. Краснодар, 1985. - С. 4-15.

77. Сторожук П.Г., Быков И.М., Маланьина Н.С., Павлюченко И.И. Фер-ментообразующая функция пищеварительных желез под влиянием полипептида С, копепсидила и панинтестина // Украин. биохим. журн. -1986,- Т. 58, №5.-С. 84-87.

78. Сторожук П.Г., Быков И.М., Павлюченко И.И. Способ получения биологически активного вещества для ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии. А. с. СССР№ 1476653 от 08.04.1987.

79. Сторожук П.Г., Быков И.М. К механизму действия препаратов ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии и целенаправленности их применения // Кубан. науч. мед. вестн. 1994. - № 24. - С. 137-140.

80. Сторожук П.Г., Быков И.М., Павлюченко И.И. Пептиды слизистой желудка и поджелудочной железы как вегетативно-гуморальные регуляторы пищеварения // Интеграция механизмов регуляции висцерал. функций. Майкоп, 1996. - С. 79-81.

81. Сторожук П.Г. Развитие идей И.П. Павлова в трудах ученых Кубанского медицинского института по физиологии и патологии органов пищеварения // Кубан. науч. мед. вестн. 2000. - № 2. - С. 8-13.

82. Сторожук П.Г., Быков И.М., Брещенко Е.Е., Хвостова Т.С., Быков М.И., Плахотнюкова В.В. Новый взгляд на механизмы действия препаратов ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии И Аллергология и иммуннология. 2001а. - Т. 2, № 1. - С. 148-154.

83. Стыскин Е.Л., Илинсон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Мир, 1986. - 246 с.

84. Теплюк С.Г. Влияние даларгина на уровень желудочной секреции // Бюлл. ВКЦН АМН СССР. 1988. - № 2. - С. 67-68.

85. Тимофеева Н.М. Роль пептидаз в ассимиляции белков // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1993. - Т. 79, № 6. - С. 1-18.

86. Тимофеева Н.М. Гидролазы тонкой кишки // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2000. - Т. 10, N 1. - С. 41-47.

87. Уголев A.M. Энтериновая (кишечная гормональная) система. JL: Наука, 1978.-314 с.

88. Уголев A.M. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. Л.: Наука, 1985. - 544 с.

89. Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем. Л.: Наука, 1987. - 304 с.

90. Уголев A.M. Теория адекаватного питания и трофология. СПб.: Наука, 1991.-271 с.1. М.: Наука, 1995.-283 с.

91. Физиология пищеварения: Рук. по физиологии / Под ред. A.B. Соловьева. Л.: Наука, 1974. - 761 с.

92. Хангалдова Т.Н. Новые отечественные препараты пепсина и их влияние на желудочную секрецию у собак: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Краснодар, 1977. - 15 с.

Информация о работе

Брещенко, Елена Евгеньевна
кандидата биологических наук
Краснодар, 2003
ВАК 03.00.04

Диссертация

Выделение пептидов из панинтестина и изучение их биологических свойств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы