Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) - белок-партнер для биосинтеза и выделения пептидов из клеток Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Зеленый флуоресцентный белок (GFP) - белок-партнер для биосинтеза и выделения пептидов из клеток Escherichia coli"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова

На правах рукописи

СКОСЫРЕВ ВИТАЛИИ СЕРГЕЕВИЧ

ЗЕЛЕНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК (GFP) -БЕЛОК-ПАРТНЕР ДЛЯ БИОСИНТЕЗА И ВЫДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЗ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2005

Работа выполнена в лаборатории организации белковых структур филиала Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук Л. М. Винокуров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С. М. Деев кандидат биологических наук А. С. Солонин

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита состоится "30" марта 2005 г. в часов на заседании Специализированного совета Д.0002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан "26" февраля 2005 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Низкомолекулярные полипептиды — высокоактивные органические соединения, широко распространенные в живых организмах и выполняющие разнообразные, как правило, регуляторные функции. Для проявления функциональной активности достаточны следовые количества вещества. Однако для изучения физико-химических свойств и механизма действия пептидов требуются значительные количества высокоочищенного препарата. Низкое содержание пептидов в природных объектах требует разработки новых более продуктивных методов их получения. В настоящее время подавляющее большинство рекомбинантных белков и полипептидов получают культивированием генетически трансформированных микроорганизмов, чаще всего клеток Escherichia coli. Однако биосинтез низкомолекулярных полипептидов в чужеродных клетках зачастую сопряжен с рядом трудностей: низкой устойчивостью гетерологичных пептидов к действию внутриклеточных протеаз, а также сложностью их последующего выделения из грубого клеточного лизата. Отсутствие в клетке подходящих условий для образования упорядоченной структуры полипептида ведет к его частичной или полной деградации в процессе синтеза. Отсутствие репортерной и лиганд-связывающей активности осложняет подбор оптимальных условий для биосинтеза и выделения продукта. Более того, пептиды, обладающие антимикробным действием, могут оказывать отрицательное влияние на рост клеток-хозяев.

Включение целевого полипептида в состав гибридного белка на основе высокоэкспрессируемого белка-партнера — одно из возможных решений проблемы получения полноразмерного продукта в чужеродных клетках. Белок-партнер обеспечивает не только суперэкспрессию целевого пептида, но и возможность его последующего выделения. Несмотря на очевидные преимущества включения пептида в состав гибридного белка, успех синтеза во многом определяется структурой молекулы гибридного белка (положением пептида в молекуле, структурой аминокислотного линкера) и свойствами белка-партнера. Эти обстоятельства придают актуальность изучению влияния структурообразующих элементов гибридного белка на общую стабильность молекулы, а также поиску оптимального

белка-партнера, обеспечивающего высокую экспрессию, легкую идентификацию и эффективную очистку синтезируемого продукта.

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) из Aequorea victoria, широко используемый в качестве репортерного белка, соответствует требованиям, предъявляемым к белку-партнеру: устойчив к действию внутриклеточных протеаз и хаотропных агентов, легко детектируется, экспрессируется с высокой эффективностью в различных организмах и клетках, в том числе в клетках Е. coli, экстрагируется органическими растворителями без потери функциональной активности. Эти свойства благоприятствуют использованию GFP не только в качестве репортерного белка, но и в качестве белка-партнера для биосинтеза и выделения низкомолекулярных полипептидов.

Цель диссертационной работы заключалась в изучении влияния структурообразующих элементов гибридного белка на общую стабильность гибридной молекулы и разработке нового эффективного метода выделения полипептидов. Были поставлены следующие задачи:

- изучить влияние структуры аминокислотного линкера на стабильность гибридного белка in vivo и in vitro;

- изучить зависимость эффективности биосинтеза целевого продукта от свойств используемого белка-партнера и положения пептида в молекуле гибрида;

- разработать новый метод очистки полипептидов в составе гибрида, используя экстракционные свойства GFP;

- разработать эффективный способ синтеза и выделения функционально активного антибактериального пептида саркотоксина IA из клеток Е. coli.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе представлен новый метод очистки низкомолекулярных полипептидов в составе гибридных белков на основе GFP с использованием двухфазной системы разделения.

Изучены особенности синтеза рекомбинантного саркотоксина IA в составе различных гибридных белков: глутатион^-трансфераза-саркотоксина (GST-Sarc), саркотоксин-обелина (Sarc-Ob), зеленого флуоресцентного белка-саркотоксина

(EGFP-Sarc) в клетках Е. coli. Впервые предложен высокоэффективный способ получения функционально активного саркотоксина IA из прокариотических клеток.

Выявлена зависимость протеолитической деградации гибридных белков in vivo и in vitro от структуры аминокислотного линкера, функциональных свойств белка-партнера и положения целевого пептида в молекуле гибрида. Полученные результаты могут быть использованы при создании новых гибридных конструкций.

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены на 9-м международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Marine Biological Laboratory, Woods Hole, 1996), на IV чтениях, посвященных памяти ЮА. Овчинникова (Пущино, 1998), на IV Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 1999), на отчетной конференции по биоорганической химии (Пущино, 1999), на V чтениях, посвященных памяти ЮА. Овчинникова (Пущино, 2000), на IX международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2002» (Москва, 2002).

По материалам диссертации опубликовано 11 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 129 страницах, содержит 27 рисунков и 17 таблиц. Библиографический указатель содержит 343 источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение влияния структуры аминокислотного линкера на стабильность гибридного белка in vivo и in vitro.

Пептидный линкер, объединяющий функциональные модули гибридного белка, является существенным элементом, вносящим вклад в стабилизацию гибридной молекулы. Обеспечивая эффективное сворачивание белковых модулей, аминокислотная вставка, как правило, представляет собой неструктурированный участок. Присутствие в составе линкера дополнительного сайта, необходимого для

последующего протеолитического разделения гибрида, делает его легкой мишенью для действия внутриклеточных протеаз.

С целью выяснения влияния структуры пептидной вставки на устойчивость гибридной молекулы к действию протеаз in vivo и in vitro были использованы три различные линкерные последовательности, объединяющие зеленый флуоресцентный белок и обелин.

1.1 Изучение процесса протеолитической деградации GFP-Ob in vitro. Гены гибридного белка GFP-обелин с различными линкерными последовательностями клонировали в единой рамке считывания в составе вектора pET-llcjoe под контролем лактозного оператора и промотора фага Т7. Репортерная активность, присущая зеленому флуоресцентному белку (GFP) из Aequorea victoria и Са2+-активируемому фотобелку обелину из Obelia longissima, значительно упрощает процесс детектирования продукта как in vitro, так и in vivo.

При разработке линкерной последовательности были учтены следующие требования:

• пептидная вставка должна обладать максимальной устойчивостью к протеолитическому воздействию (использование аминокислот, исключающих образование потенциальных участков для протеолитического действия);

• пептидная вставка должна обладать достаточной гибкостью (препятствие образованию вторичной структуры — введение в состав линкера остатков пролина).

Таким образом, с учетом предъявляемых требований, в качестве линкерных пептидов использовались представленные в таблице 1 четырех- и девятнадцатичленные аминокислотные последовательности. Гибридный белок GFP-обелин (GObl) содержал аминокислотную последовательность из четырех аминокислот -Pro-Gly-Thr-Gly- (табл. 1). С-концевой остаток лизина GFP был соединен с остатком пролина в линкере, образуя связь -Lys-Pro-, устойчивую к действию сериновых протеаз. Гибридные белки GOb2 и GOb3 содержали в своем составе девятнадцатичленные вставки. Как и в случае с GObl, в GOb2 и GOb3 C-концевой остаток лизина GFP был блокирован пролином. Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептидную вставку в GOb3, была идентична

Таблица 1. Схематическое изображение трипсинолиза гибридных белков GFP-обелин (1-3).

Гибридный белок GFP-обелин iV-концевой модуль гибридного белка (GFP) Аминокислотная »ставка С-концевой модуль гибридного белка (Обели и)

1 | ...ELYK |- -Р G Т G- -Issk -27 цД» YAVKLKTD... 1 —Н—1 -22 кДа

2 3 - PGTATPATTPTTAPTAGTG -

-jssK YAVKLKTD...

-PGTR -27 «Да GRCSGRRGQWGRCTG-I 1 1 возможные участки расщепления -24 кДа -29 кДа предпо участок р t t -22 кДа лагаемый асщепления

нуклеотидной последовательности, кодирующей пептидную вставку в GOb2, но имела обратную ориентацию. Наименее устойчивая к действию сериновых протеаз пептидная вставка GOb3 содержит аминокислотные остатки цистеина и триптофана, которые могут существенно влиять как на структуру гибридной молекулы, так и на ее физические и функциональные свойства.

Для изучения вклада структуры линкерного пептида (вставки) и его ближайшего окружения в процесс деградации гибридных белков in vitro был проведен сравнительный трипсинолиз предварительно ренатурированных и очищенных гибридных белков GObl, GOb2 и GOb3. Выделенные белки обладали репортерной активностью обоих модулей. Поскольку для проявления люминесцентной активности обелину необходим кальций, в присутствии которого фотобелок приобретает необходимую конформацию, ограниченный протеолиз проводился в присутствии ионов Са2+.

Под действием трипсина GObl образует ряд укороченных фрагментов, что хорошо видно на ДСН ПААГ (рис. la). Молекулярные массы мажорных фрагментов (~27 и ~22 кДа) соответствуют размерам составляющих гибридный белок модулей GFP (~26.9 кДа) и обелина (~22.2 кДа). Это доказывает то, что наиболее чувствительным местом к действию клеточных протеаз является пептидная вставка и ее ближайшее окружение.

Несмотря на различия в длине пептидного линкера, протеолитический распад

Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов триптического

расщепления гибридных белков GObl (a), GOb2 (б), GOb3 (в). Положение маркеров молекулярных масс, а также индивидуальных модулей GFP и обелина указаны стрелками.

GOb2 (табл. 1, рис. 1б) был аналогичен распаду, наблюдавшемуся для GObl. Единственным отличием было образование полипептидного

фрагмента с молекулярной массой в ~29 кДа вместо фрагмента с молекулярной массой в ~27 кДа, образовавшегося при деградации GObl. Именно длиной пептидной вставки объясняется разница в ~2 кДа.

Исходя из аминокислотного состава вставки молекулы GOb3, можно было предсказать низкую устойчивость гибридного белка к протеолизу. Это предположение было подтверждено экспериментально. Как видно на рис. 1в, под действием трипсина основная часть гибридного белка в течение получаса деградировала до протеолитически устойчивого GFP (табл. 1). Следует отметить, что обелиновый модуль в процессе трипсинолиза двух других гибридных белков (GObl и GOb2) также подвергался значительному протеолитическому воздействию, что подтверждается снижением люминесцентной активности обелина в процессе трипсинолиза.

1.2Изучениепроцесса протеолитической деградации GFP-Ob in vivo. С целью выяснения вопроса о том, в какой степени данные об устойчивости гибридных белков к действию трипсина in vitro соответствуют данным in vivo, было

проведено изучение процесса деградации белков в клетках Е.еоН. Все химерные генные конструкции хорошо экспрессировались. При этом продукт экспрессии в значительной мере накапливался в клетках в виде тел включения (табл. 2). Использование поликлональных кроличьих антител против протеолитически стабильного ОБР позволило наблюдать за ходом деградации гибридных белков в процессе их накопления в клетке. Из представленных иммуноблотов (рис. 2) видно, что в процессе биосинтеза гибридных белков ООЬ1 и ООЬ2 наряду с полноразмерным продуктом увеличивается доля деградированного белка. Несмотря на высокий уровень синтеза полноразмерного гибридного продукта, значительная часть гибридных белков (от 30 до 45%) находится в клетках в деградированном виде (табл. 2). Последующее разрушение клеток и разделение клеточного лизата центрифугированием на растворимую и нерастворимую фракцию показало, что основная часть полноразмерного гибридного белка находится с

Таблица 2. Содержание полноразмерных гибридных белков GFP - обелин в клетках^, coli.

Гибридные белки Содержание полноразмерного белка, (%)

общее* в нерастворимой фракции** в растворимой фракции**

GOb 1 66.7 64.1 2.6

GOb 2 55.2 49.8 5.4 Х

GOb 3 60.5 56.4 4.1

* Данные получены в результате расчета иммуноблотов, представленных на рис. 2 а, б, в (4 ч после индукции).

•* Обсчет результатов иммуноблота, представленного на рис. 3.

в нерастворимой фракции (тела включения). В растворимой фракции клеток гибридные белки в значительной мере подвергались протеолизу, что подтверждается незначительным содержанием полноразмерного белка (27-36%) относительно всего GFP-содержащего продукта (рис. 3). Таким образом, стабильность гибридных белков GOb in vivo определялась не структурой вставки, а уровнем синтеза белка.

Рис. 2. Иммуноблотинг суммарных белков лизата клеток с рекомбинантными плазмидамии рООЫ (а), рООЪ2 (б), рООЪЗ (в), полученных в условиях индукции синтеза гибридных белков и разделенных электрофорезом в градиентном (9-25%) денатурирующем ПААГ Стрелками указаны положения химерного белка ООЪ3 и ОБР.

Использование сильного промотора бактериофага Т7 определяло высокую экспрессию продукта, что увеличивало вероятность внутриклеточной агрегации продуцируемого белка и, как следствие, его стабильность. Тем не менее, наличие зеленой флуоресцентной окраски клеток и тел включения в случае GObl и GOb2 и ее отсутствие в случае GOb3, свидетельствовало о несомненном вкладе линкерного

пептида в образование нативной конформации GFP в составе гибридного белка.

Рис. 3. Иммуноблотинг гибридных белков, включающих GFP и обелин, полученных из растворимой (1) и нерастворимой (2) клеточных фракций и разделенных электрофорезом в градиентном (9-25%) денатурирующем ПААГ

Несмотря на отсутствие достоверной зависимости между стабильностью гибридного белка и структурой пептидного линкера in vivo, на основе данных

трипсинолиза гибридных белков in vitro можно сделать вывод, что аминокислотная вставка вносит существенный вклад в стабилизацию белка. Длина пептидной вставки, в нашем случае, не оказывала сколько-нибудь заметного влияния ни на стабильность гибридного белка, ни на его функциональные свойства.

2. Изучение влияния свойств белка-партнера и положения целевого пептида на синтез полноразмерного гибрида.

В процессе биосинтеза рекомбинантного саркотоксина было обнаружено, что наряду с линкером критическое влияние на синтез полноразмерного продукта оказывает положение целевого пептида в молекуле гибрида и физические свойства используемого белка-партнера.

Саркотоксин IA крайне неустойчив к действию сериновых протеаз и не имеет упорядоченной структуры в водном растворе. Кроме того, пептид высокотоксичен и обладает широким спектром действия как на грам-положительные, так и на грам-отрицательные бактерии, что усложняет задачу получения полноразмерного пептида в клетках Е. coli.

С целью оптимизации биосинтеза пептида ген рекомбинантного саркотоксина был слит в единой рамке считывания с генами белков, обладающих высокой экспрессией в клетках E.coli. Были созданы химерные генные конструкции, кодирующие следующие белки: глутатион^-трансфераза-саркотоксин (GST-Sarc), саркотоксин-обелин (Sarc-Ob), зеленый флуоресцентный белок-саркотоксин (GFP-Sarc) (табл. 3).

2.1 Глутатион-8-трансфераза - саркотоксин

Глутатион^-трансфераза (GST), широко используемая в качестве белка-партнера, обеспечивает высокий уровень экспрессии гибридного белка и способствует его накоплению в растворимом виде в цитоплазме клеток.

Ген саркотоксина был клонирован в единой рамке считывания с С-концевой последовательностью GST, используя коммерчески доступный вектор. Как и ожидалось, гибридный белок GST-Sarc аккумулировался в клетках в растворимом виде (рис. 4А). Однако уровень его экспресси не был высоким. Только небольшая фракция экспрессируемого продукта содержала полноразмерный пептид. Мажорной

полосе соответствовал продукт с молекулярным весом в 24.0 кДа, принадлежащий модулю GST (рис. 4А).

Таблица 3. Свойства гибридных белков.

Гибридные белки GST-Sarc Sarc-Ob GFP-Sarc

Молекулярный вес, кДа 30.6 26.7 31.5

Основная форма накопления в клетке растворимая тела включения тела включения

Функциональная активность образующих гибридный белок модулей GST-присутствует Sarc-отсутствует* ОЬ-присутствует Sarc-отсутствует GFP-отсутствует (в телах включения) Sarc-отсутствует

Процент полноразмерного белка < 10%** < 20%*** > 90%**

* - саркотоксин в составе гибридного белка не оказывал влияния на скорость

клеточного роста,

** - результат обсчета ДСН ПААГ,

*** - результат аминокислотного анализа белка.

Результат последующей очистки белка на глутатион-сефарозе подтвердил, что значительная часть гибридного белка деградирует в клетках до GST (рис. 4А). В процессе выделения гибридный белок подвергся дальнейшему протеолизу, несмотря на присутствие в растворе ингибиторов протеаз, результатом чего явилось снижение доли полноразмерного белка и увеличение доли протеолитически стабильного GST. Обработка очищенного белка тромбином привела к полному расщеплению GST-Sarc и деградации саркотоксина. Таким образом, глутатион^-трансфераза, способствующая накоплению гибридного белка в растворимом виде, не пригодна для биосинтеза рекомбинантного саркотоксина в клетках E.coli.

2.2Саркотоксин - обелин

Было предположено, что включение пептида в состав гибридного белка на основе белка-партнера, образующего в клетках E.coli тела включения, позволит избежать деградации саркотоксина. Ранее было показано, что люминесцентный белок обелин из семейства кальций-связывающих фотобелков синтезируется в клетках

Рис. 4. Электрофоретический анализ биосинтеза и очистки гибридных белков (А) О8Т-8агс. 1, 30,000 g супернатант после разрушения клеток (растворимая фракция), 2, очищенный на глутатион-сефарозе белок. (Б) 8аге-ОЪ 3, стандарты молекулярных масс 94, 67, 43, 30, 20, 14 кДа, 4, тела включения; 5, белок после очистки на ДЭАЭ сефарозе. (В) ЕОРР-8агс. 6, 12, стандарты молекулярных масс 97, 66, 45, 36, 29, 24, 20, 14 кДа, 7, клетки после индукции синтеза белка; 8, 30,000 g супернатант после разрушения клеток (растворимая фракция); 9, тела включения; 10, протеолитический фрагмент ОБР-8агс, выделенный экстракцией этанолом; 11, БОБР.

Е. coli с образованием тел включения и легко может быть переведен в активную форму при инкубации с субстратом. Однако только iV-концевая часть обелина может быть использована для создания гибридного белка, поскольку для проявления функциональной активности, ему необходим свободный С-концевой участок.

Химерный ген sarc-ob, также как и gst-sarc, хорошо экспрессировался в клетках E.coli. Практически весь синтезированный белок аккумулировался в клетках в виде тел включения. Согласно результатам электрофоретического разделения (рис. 4Б), выделенный белковый препарат соответствовал по молекулярному весу гибридному белку Sarc-Ob и обладал люминесцентной активностью обелина. Однако последующий аминокислотный анализ N-концевой последовательности белка показал, что более 80% продукта укорочено на 4 или 8 аминокислотных остатков, необходимых для проявления антибактериальной активности саркотоксина. Поскольку в составе тел включения белок устойчив к протеолизу (например, GOb3), деградация саркотоксинового модуля, вероятно, происходит котрансляционно.

Незащищенный .N-концевой гидрофильный участок пептида подвергается действию внутриклеточных протеаз, что приводит к значительному снижению доли полноразмерного саркотоксина. Таким образом, TV-концевое положение пептида в молекуле крайне нежелательно даже в составе гибридов на основе белков-партнеров, склонных к образованию нерастворимых агрегатов.

2.3Зеленый флуоресцентный белок — саркотоксин

В отличие от обелина функциональная активность GFP не зависит от положения целевого полипептида в составе молекулы гибрида Более того, при оптимальной температуре культивирования клеток Е. coli (37°С), гибридные белки на основе GFP обычно образуют тела включения (например, GObl-GOb3). Учитывая отрицательный результат синтеза саркотоксина в составе химерной конструкции sarc-ob, ген пептида был слит с С-концевым участком гена egfp. Полученная в результате клонирования генетическая конструкция egfp-sarc хорошо экспрессировалась в клетках Е. coli, а продукт экспрессии накапливался в составе тел включения (рис. 4В). Незначительная часть синтезируемого белка находилась в растворимой фракции клеток и обладала флуоресценцией GFP. Электрофоретический анализ белка, выделенного из клеточного лизата органической экстракцией, показал, что данная фракция белка содержит протеолитически деградированный по модулю саркотоксина продукт (рис. 4В, дорожка 10). Напротив, в составе тел включения преобладал полноразмерный гибридный белок (рис. 4В, дорожка 9). В результате перемещения пептида в С-концевое положение молекулы гибрида был получен полноразмерный пептид саркотоксина (см. ниже).

3. Разработка метода выделения низкомолекулярных полипептидов в составе гибридных белков на основе GFP.

Наряду с проблемой биосинтеза полноразмерного белка существует проблема очистки продукта от примесных клеточных белков. Высокая экспрессия GFP в клетках Е. coli (GFP-Ob, GFP-Sarc) позволяет использовать его в качестве белка-партнера для синтеза полипептидов. Однако отсутствие лиганд-связывающей активности препятствует использованию GFP для выделения пептидов традиционными хроматографическими методами. Тем не менее, нами было

обнаружено, что GFP поддается высокой очистке с сохранением функциональной активности в результате экстракции этанолом На основании обнаруженного свойства было интересно оценить возможность использования GFP в качестве белка-партнера для выделения низкомолекулярных полипептидов органической экстракцией

3 1 Создание и синтез гибридных белков в клетках Е coli

Химерные гены на основе egfp egfp-pdey, egfp-th, egfp-sarc были клонированы по аналогии с gob в рЕТ11 векторе (Clontech) под контролем промотора фага 11. Химерный ген bccp-egfp был также клонирован под контролем промотора фага Т7 в векторе pBS+ (Stratagene). Все представленные полипептиды, за исключением ВССР, имеют эукариотическое происхождение и не экспрессируются в свободном виде в

клетках E coli

EGFP linker Г/ ' " - -

23 аа 30 аа 26 9 к ГУ а 78 kDa

EGFP linker / >

4 аа 60 аа 26 9 кПа 4 6 kDa

EGFP linker

4 аа ¡S3 kDa 40 aa 26 9 kDa

linker EGFP

Рис. 5. Схематическое изображение гибридных белков EGFP - мутантная форма GFP, PDEy - фрагмент (57-87 аминокислотная последовательность) у субьединицы фосфодиэстеразы, Th

- предшественник тахиплезина, Sarc

- саркотоксин, ВССР - фрагмент биотин карбоксилазы, linker -аминокислотная вставка

Как и ожидалось, гибридные

белки на основе GFP (рис 5) активно

экспрессировались в клетках Е coh

(рис. 6) и за исключением BCCP-EGFP аккумулировались в телах включения В

составе тел включения EGFP не обладал флуоресценцией ни в одной из гибридных

конструкций Последующая ренатурация белков

in vitro приводила к восстановлению и

образованию de novo флуоресценции EGFP.

9766-

Рис. 6. Уровень экспрессии гибридных белков в клетках Е coh М - стандарты молекулярных масс (кДа), 1 - клетки до индукции синтеза рекомбинантных белков, 2-5 клетки после индукции синтеза белков (2 - БОБР-РОЕу, 3 - БОБР-ТЬ, 4 -БОБР^агс, 5 - БССР-БОБР)

453629242014-

* * £ * *

******** *** флпю&нщ фтзф 9№r ¿яг

mm**

шшш шиши? atfw&v

' ш ff Ш

**

3.2 Выделение ЕО¥Р-РБЕу.

Общая схема очистки белка соответствовала ранее описанному методу выделения GFP, тогда как условия очистки несколько отличались от условий оригинального метода. Ренатурированный ЕОРР-РОЕу экстрагировался этанолом подобно GFP. Более 80% гибридного белка с нативной конформацией EGFP переходило в спиртовую фазу. Изменение величины рН раствора сульфата аммония в диапазоне физиологических значений (от 6 до 8) заметно не отражалось на количестве экстрагируемого белка.

При добавлении н-бутанола к этанольной фазе, GFP вытеснялся в водную фазу. Однако в условиях полного перехода GFP в водную фазу, более 60% флуоресцентного ЕОРР-РОЕу оставалось в органической фазе. Добавление соли (№0) приводило к увеличению фракции флуоресцентного гибридного белка,

экстрагируемого в водную фазу при минимальном перераспределении

суммарного белка (рис. 7). При конечной

Рис. 7. Зависимость реэкстракции EGFP-РБЕу в воду от ионной силы раствора Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда (А) и спектрофотометрически по поглощению белка при 488 нм (В) Исходное количество белка в спиртовой фазе (Ог) принимали за 100%.

концентрации №С1 равной 1,5 М EGFP-PDEy полностью переходил в водную фазу. Образующаяся при этом плотная интерфаза не содержала флуоресцентного белка, что свидетельствует об оптимальных условиях реэкстракции. После дополнительной хроматографической очистки белкового препарата от примесей органических растворителей на колонке с ВШу1-Тоуореаг1 было получено вещество 90% чистоты (табл. 4, рис.8Б) с относительно высоким выходом продукта (44-48%). Увеличение величины отношения максимумов поглощения при 488 и 280 нм говорит об увеличении доли флуоресцентного белка и подтверждает высокую степень очистки продукта (рис. 8А).

Рис. 8. Анализ гибридных белков, выделенных органической экстракцией Спектры поглощения (А, В, Д и Ж) и электрофореграммы (Б, Г, Е и 3) гибридных белков БОБР-РОБу (А и Б), БОБР-ТЬ (В и Г), БОБР-8агс (Д и Е) и ВССР-БОБР (Ж и 3) Спектры поглощения белковых фракций до экстракции ( ), после органической экстракции и хроматографии на ВШу1-Тоуореаг1 (—) Дорожки на ДСН ПААГ 1, белки из тел включения (1 на рисунке 3 - белки клеточные лизата после осаждения 40% сульфатом аммония), 2, гибридные белки после выделения органической экстракцией и хроматографического разделения на ВШу1-Тоуореаг1, М, стандарты молекулярных масс (кДа)

3 3 Выделение EGFP-Sarc, EGFP-Th и BCCP-EGFP

Чтобы оценить влияние модуля полипептида на экстракцию гибридного белка, условия выделения БОБР-8агс и БОБР-ТЬ полностью соответствовали условиям выделения БОБР-РОБУ

Как и в предыдущем случае, полипептиды гибридных белков БОБР^агс и БОБР-ТЬ имели С-концевое положение БОБР-8агс, включая аминокислоты линкера,

содержал самый короткий полипептид (рис 5) Однако, несмотря на размер пептида, конечный выход белка оказался наименьшим (табл 4)

Таблица 4. Сводные характеристики выделения гибридных белков органической

экстракцией.

Гибридный белок Количество белка (мкг) Выход (%)' Чистота (%У

До экстракции После экстракции и хроматографии

Общий белок" Флуоресцентный белок6 Общий белок" Флуоресцентный белок®

ЕОРР-РИЕу 3046 886 460 420 46 ±2 90

ЕОРР-ТЬ 3120 913 162 147 16± 2 90

ЕОРР-Багс 3058 930 95 78 9± 1 80

' Количество общих белков определяли по методу Брэдфорда. 6 Количество флуоресцентного белка определяли по поглощению раствора при 488 нм, используя коэффициент экстинкции ЕОРР: Е488 = 55,900 М-1 еш-1. в Среднее значение 2 независимых экспериментов ± стандартная ошибка. г Чистоту выделенных белков определяли по соотношению флуоресцентного белка к общему белку.

Вероятно, амфифильная структура пептида, образующаяся в органическом окружении, препятствует переходу гибридного белка из одной фазы в другую. Подобно интегральным мембранным белкам саркотоксин в составе гибридного белка размещался на границе раздела фаз. Действительно, в процессе экстракции образовывалась плотная флуоресцирующая интерфаза, содержащая гибридный белок. Дополнительным доказательством влияния структуры пептида на экстракцию гибрида является тот факт, что протеолитический фрагмент с удаленным С-концевым доменом саркотоксина свободно перемещался из водной фазы в органическую и обратно (рис. 4В, дорожка 10).

Сравнительно невысокий выход ЕОРР-ТЬ (15-18%) вероятно также связан со структурой предшественника тахиплезина. Для образования плотной нативной конформации необходимо наличие двух дисульфидных связей, отсутствие которых может препятствовать экстракции гибридного белка. Несмотря на невысокий выход белков: ЕОРР- 8аге и ЕОРР-ТЬ, чистота продукта достигала 80 - 90% (табл. 4, рис. 8).

Очистка ВССР-ЕОРР наиболее ярко демонстрирует эффективность данного метода выделения. В отличие от других пептидов ВССР имел Л-концевое положение в молекуле гибридного белка и обладал, включая аминокислоты линкера,

сравнительно высоким молекулярным весом (рис. 5). Вероятно, благодаря прокариотическому происхождению, ВССР в составе гибридного белка в меньшей мере подвергался внутриклеточному протеолизу. Более того, белок накапливался в клетке в растворимой виде и не требовал дополнительной ренатурации. Относительно невысокое содержание гибридного белка в составе грубого клеточного лизата (сравнительно с содержанием гибридных белков в телах включения), а также наличие протеолитических фрагментов белка, обладающих флуоресценцией БОИ", не позволило нам точно оценить количественный выход и степень чистоты продукта.

Значительного освобождения от протеолических фрагментов гибридного белка удалось достичь на первом этапе выделения. 40% сульфат аммония полностью осаждает полноразмерный БССР-БОРР, тогда как свободный БОРР, образованный в результате внутриклеточной деградации гибридного белка, остается в растворе. Водная суспензия осадка (рис.83, дорожка 1) подвергалась стандартному методу очистки, описанному для ЕОРР-РБЕу. Гибридный белок прекрасно экстрагировался, несмотря на относительно высокий молекулярный вес. Вероятно, из-за высокой растворимости ВССР в органических растворителях (в 60% изопропаноле, литературные данные), В результате выделения из 1.5 грамм сырых клеток было получено около 6 мг высокоочищенного белка (рис. 8Ж и 3).

Высокий выход продукта (> 70%) наблюдался и в случае выделения человеческого рекомбинантного проинсулина, находящегося в составе гибридного белка на основе БОРР (неопубликованные данные).

Эффективность данного метода выделения прямо пропорционально зависит от количества нативного БОРР. Увеличивая долю гибридного белка активного по модулю БОРР (например, в процессе ренатурации белка из тел включения), можно увеличить процент экстрагируемого белка.

Репортерные свойства БОРР придают особую гибкость данному методу выделения. Визуальный метод контроля над всеми этапами синтеза и выделения белка, включая оптимизацию условий выделения, снижает временные затраты необходимые на трудоемкие методы анализа. Важно отметить, что весь процесс очистки, исключая хроматографическую стадию, занимает не более 20 минут. Кроме того, простота выделения и низкая стоимость используемых химических

компонентов позволяют использовать EGFP для выделения не только аналитических, но и препаративных количеств рекомбинантного белка.

4. Биосинтез и выделение рекомбинантного саркотоксина IA из клеток Е.

соИ.

Саркотоксин IA - антибактериальный поликатионный пептид из семейства цекропинов, вырабатываемый личинками мясной мухи Sarcophaga peregrina в ответ на повреждение гиподермы или бактериальное заражение. Пептид высокотоксичен и обладает широким спектром действия как на грам-положительные, так и на грам-отрицательные бактерии. Потенциально, он может быть использован в медицине и сельском хозяйстве в качестве нового безопасного антибиотика, поскольку, подавляя бактериальную инфекцию, практически не оказывает токсического действия на эукариотические организмы. Для проявления летального действия на бактерии достаточно наномолярных концентраций токсина. Тем не менее, для изучения механизма действия саркотоксина требуются значительные количества высокоочищенного пептида. Биосинтез пептида в гетерологичных клетках, даже эукариотического происхождения, осложняется его низкой устойчивостью к действию внутриклеточных протеаз. Мы демонстрируем возможность биосинтеза саркотоксина в высокочувствительных к действию пептида клетках Е. coli.

4.1 Синтезрекомбинантного саркотоксина.

Первые попытки синтеза саркотоксина в прокариотических или эукариотических клетках не увенчались успехом. Более того, попытка синтеза пептида в бесклеточной системе также была безуспешной, вероятно, по причине агрегации продукта, что вело к ингибированию трансляционной системы (неопубликованные данные, Матвеев СВ., Аллахов Ю.Б.). Ранее было показано, что

Са2+ активируемый фотобелок обелин, используемый в качестве репортерного белка,

Рис. 9. Радиоавтограф ПААГ после электрофоретического разделения продуктов синтеза. 1, в трансляционную смесь не добавлялась мРНК, 2, в трансляционную смесь добавлена обелиновая мРНК, 3, в трансляционную смесь добавлена мРНК гибридного белка

хорошо синтезируется in vitro С целью разработки метода эффективного синтеза саркотоксина и одновременного детектирования его накопления в бесклеточной системе трансляции был создан гибридный белок саркотоксин-обелин (Sarc-Ob)

мРНК Sarc-Ob была экспрессирована в эукариотической бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы Продукты синтеза анализировались с помощью ДСН ПААГ (рис 9) Несмотря на то, что эффективность синтеза Sarc-Ob несколько ниже синтеза самого обелина, была продемонстрирована принципиальная возможность синтеза пептида в составе гибридного белка

С целью разработки метода получения рекомбинантного саркотоксина в клетках Е coli ген пептида был слит в единой рамке считывания с генами белков, обладающих высокой экспрессией Было показано, что выбор белка-партнера (GST, Obelin, GFP, см выше), а также положение саркотоксина в составе гибридной молекулы определяют успех синтеза полноразмерного пептида

4 2 Очистка и характеристика рекомбинантного саркотоксина Амфифильная структура саркотоксина, препятствующая выделению гибридного белка методом органической экстракции, не позволяет достичь

значительного выхода пептида Тем не менее, высокое содержание полноразмерного пептида в составе тел включения благоприятствует выделению саркотоксина с

использованием хроматографических методов За счет введения в состав

Рис. 10. Разделение пептидов гидролизата GFP-Saгc с помощью HPLC Профили элюции гидролитических фрагментов GFP (А) и GFP-Saгc (Б) на Nucleosil «8 (размер частиц 5 мкм (4 6 х 250 мм)) при скорости потока 1 5 мл/мин и линейном градиенте ацетонитрила Фракции 1-5 (Б) анализировались на присутствие антибактериальной активности

BptMfl мин 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Время, чин

линкера аминокислотного остатка метионина было обеспечено разделение гибридного белка на отдельные модули за счет химического расщепление гибрида цианистым бромом. Саркотоксин не содержит в своей последовательности внутреннего метионина. Однако в составе EGFP находятся пять остатков метионина, осложняющих процесс идентификации и выделения искомого фрагмента. Гидролитическая смесь EGFP-Saгc была разделена на Nudeosil И8 с использованием ЖХВД. Сравнение профилей элюции пептидов гибридного белка и пептидов,

полученных в результате химического гидролиза EGFP, позволило идентифицировать пептид, соответствующий саркотоксину. Данное сопоставление выявило наличие дополнительного пика в профиле элюции гидролизата GFP-Saгc (рис. 10Б, пик 4). Фракции, соответствующие пикам 1-5 (рис. 10Б) были собраны и проанализированы на наличие антибактериальной активности. Как и предполагалось, препарат 4-ой фракции образовывал стерильную зону на бактериальном газоне (рис.

Результаты масс-спектрометрического анализа (рис. 12) и Л-коцевого

Рис. 11. Анализ хроматографических фракций на наличие антибактериальной активности Km - канамицин (2 мкг/мл)

11).

140

42144

аминокислотного анализа подтвердили наличие в анализируемой фракции

136

£ у

гомогенного

препарата

Рис. 12. Масс-спектрометрический анализ очищенного пептида (фракция 4, рис 10Б).

12 4

2 3 4 5 7 9 11 15 19

ш/гх 1000

Минимальная ингибирующая концентрация рекомбинантного саркотоксина, определенная для трех различных видов бактерий, соответствовала данным, опубликованным ранее (табл. 5). Незначительное увеличение значений ингибирующей концентрации для Bacillus megaterium и Pseudomonas aeruginosa, вероятно, объясняется отсутствием амидированного С-концевого аргинина характерного для природного саркотоксина.

Таблица 5. Антибактериальная специфичность очищенного рекомбинантного

саркотоксина.

Бактерии Минимальная ингибирующая концентрация, мкг/мл

Escherichia coli C600 0.2

Bacillus megaterium BKM 41 1.0

Pseudomonas aeruginosa PAO1 0.5

Таким образом, в результате выделения был получен гомогенный препарат функционально активного пептида с конечным выходом саркотоксина ~0.5 мг на литр клеточной культуры, что в несколько раз выше результатов, представленных ранее другими авторами (табл. 6).

Таблица 6. Сравнительный анализ эффективности выделения пептида саркотоксина IA из различных организмов.

Организм Количество пептида Примечание

Sarcophagaperegrina 50 мкг из 120 мл гемолимфы для получения 1 мл гемолимфы требуется ~150 личинок

Saccharomyces cerevisiae 80 мкг/л неочищенный пептид

Bombyx mori 20 мкг из 450 мл культуральной среды очищенный пептид

Escherichia coli 500 мкг/л очищенный пептид

выводы

1. Установлено значительное влияние структуры линкерного пептида и формы накопления продукта в клетке на устойчивость гибридных белков к протеолитическому действию:

• аминокислотный состав линкера и его ближайшее окружение оказывают критическое влияние на стабильность гибридного белка in vitro (GFP^b3),

• влияние линкера на стабильность гибридного белка in vivo нивелируется формой накопления (тела включения) синтезируемого продукта в клетке.

2. Выявлено определяющее значение положения целевого полипептида (саркотоксин) в молекуле гибридного белка и свойств белка-партнера на эффективность синтеза полноразмерного продукта.

3. Продемонстрирована целесообразность использования GFP в качестве белка-партнера для биосинтеза низкомолекулярных полипептидов в клетках Escherichia coli.

4. На основе уникальных свойств GFP разработан эффективный метод очистки низкомолекулярных полипептидов с использованием органической экстракции этанолом.

5. Показано, что эффективность экстракции зависит от структуры целевого пептида и не зависит от его положения в молекуле гибридного белка.

6. Впервые предложен эффективный способ получения биологически активного рекомбинантного антибактериального пептида - саркотоксина IA из клеток Escherichia coli.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Illarionov, В. A., Matveev, S. V., Skosyrev, V. S., Alakhov, Yu. В. Obelin as a carrier protein and reporter enzyme for small bioactive polypeptides synthesized in vitro: new approach to obtain sarcotoxin. Bioluminescence and Chemiluminiscence: Molecular Reporting with Photons. 1997 pp. 439-442.

2. B.C. Скосырев, А.Ю. Гороховатский, Л.М. Винокуров, Н.В. Руценко, Т.В. Ивашина, В.Н. Ксензенко, Ю.Б. Алахов. Зависимость стабильности гибридов зеленого флуоресцентного белка с обелином от природы составляющих их модулей и структуры аминокислотного линкера. Биоорганическая химия. 2001 Т. 27, № 5, 364371.

3. Skosyrev, V. S., Rudenko, N. V., Yakhnin, A. V., Zagranichny, V. Е., Popova, L. I., Zakharov, M. V., Gorokhovatsky, A. Yu., Vinokurov, L. M. EGFP as a fusion partner for the expression and organic extraction of small polypeptides. Prot. Expr. Purif. 2003 Jan; 27(l):55-62.

4. Skosyrev, V. S., Kulesskiy, E. A., Yakhnin, A. V., Temirov, Yu. V., Vinokurov, L. M. Expression of the recombinant antibacterial peptide sarcotoxin IA in Escherichia coli cells. Protein Expr Purif. 2003 Apr; 28(2):350-6.

5. Gorokhovatsky, A. Yu., Rudenko, N. V., Marchenkov, V. V., Skosyrev, V. S., Arzhanov, M. A., Burkhardt, N., Zakharov, M. V., Semisotnov, G. V., Vinokurov, L. M., Alakhov, Yu. B. Biotin homogeneous assay based on Aequorea victoria bioluminescence resonance energy transfer system. Anal. Biochem. 2003 Feb l;313(l):68-75.

Материалы работы доложены на конференциях:

1. Illarionov ВА, Matveev S.V., Skosyrev V.S. and Alakhov Yu.B. Obelin as a carrier protein and reporter enzyme for small bioactive polypeptides synthesized in vitro: new approach to obtain sarcotoxin (1996). 9th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminiscence, Marine Biological Laboratory, Woods Hole.

2. Скосырев B.C., Гороховатский А.Ю., Яхнин А.В., Ивашина Т.В., Ксензенко В.Н., Винокуров Л.М., Алахов Ю.Б. Обелин - репортерный белок для генно-инженерных, биохимических, иммунологических и физико-химических исследований (1998). IV чтения, посвященные памяти ЮА Овчинникова.

3. Скосырев B.C., Гороховатский А.Ю., Яхнин А.В., Ивашина Т.В., Ксензенко В.Н., Винокуров Л.М., Алахов Ю.Б. Кальций активируемый фотобелок обелин как репортерный модуль для создания гибридных белковых конструкций (1999). IV Путинская конференция молодых ученых.

4. Скосырев B.C. Гороховатский А.Ю. Яхнин А.В. Ивашина Т.В. Ксензенко В.Н. Винокуров Л.М. Алахов Ю.Б. Структура гибридных белков и их стабильность в ходе синтеза in vivo и очистки. Отчетная конференция по биоорганической химии 1999.

5. Скосырев B.C., Гороховатский А.Ю., Руденко Н.В., Заграничный В.Е., Винокуров Л.М., Алахов Ю.Б. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) как партнер для выделения низкомолекулярных полипептидов экстракцией этанолом (2000). V чтения, посвященные памяти ЮА. Овчинникова.

6. Кулесский ЕА, Скосырев B.C., Темиров Ю.В., Винокуров Л.М. Проблемы биосинтеза антибактериального пептида - саркотоксин IA (Sarcophaga peregrina) в клетках Escherichia coli (2002). IX Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2002».

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Скосырев, Виталий Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Глава

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Саркотоксин IA

1.1.1. Саркотоксин IA представитель семейства цекропинов

1.1.2. Структура и физические свойства пептида

1.1.3. Биологическая роль и механизм действия пептида

1.1.4. Синтез и выделение пептида

1.2. Гибридные белки

1.2.1. Структура гибридного белка

1.2.2. Регуляция уровня экспрессии рскомбинантного белка в клетках Escherichia coli

1.3. Зеленый флуоресцентный белок

1.3.1. Структура белка и образование хромофора

1.3.2. Мутантные варианты GFP и их спектрофотометрические свойства

1.3.3. Физико-химические свойства белка

1.3.4. Экспрессия GFP

1.3.5. Выделение GFP

Глава

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИЛ. Материалы

II.2. Методы исследования Н.2.1. Создание генно-инженерных конструкций П.2.2. Продукция гибридных белков в клетках Е. coli П.2.3. Выделение, ренатурация и очистка гибридных белков

II.2.4. Определение функциональной активности и количества продукта П.2.5. Ограниченный протеолиз И.2.6. Иммуноблотинг И.2.7. Аминокислотный и масс-спектрометрический анализ пептидов П.2.8. Синтез гибридного белка Sarc-Ob in vitro

Глава

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. Влияние структуры аминокислотного линкера на стабильность гибридного белка in vivo и in vitro

III. 1.1. Изучение процесса протеолитической деградации GFP-Ob in vitro

III. 1.2. Изучение процесса протеолитической деградации GFP-Ob in vivo

III.2. Изучение влияния свойств белка-партнера и положения целевого пептида на синтез полноразмерного гибрида Ш.2.1. Глутатион-8-трансфераза саркотоксин Ш.2.2. Саркотоксин обелин Ш.2.3. Зеленый флуоресцентный белок саркотоксин Ш.З. Разработка метода выделения низкомолекулярных полипептидов в составе гибридных белков на основе GFP Ш.3.1. Создание и синтез гибридных белков в клетках Е. coli Ш.3.2. Выделение EGFP-PDEy Ш.3.3. Выделение EGFP-Sarc, EGFP-Th и BCCP-EGFP Ш.4. Биосинтез и выделение рекомбинантного саркотоксина IA из клеток Е. coli Ш.4.1. Синтез рекомбинантного саркотоксина in vitro Ш.4.2. Очистка и характеристика рекомбинантного саркотоксина

Введение Диссертация по биологии, на тему "Зеленый флуоресцентный белок (GFP) - белок-партнер для биосинтеза и выделения пептидов из клеток Escherichia coli"

Низкомолекулярные полипеитиды - высокоактивные органические соединения, широко распространенные в живых организмах и выполняющие разнообразные, как правило, регуляторные функции. Для проявления функциональной активности достаточны следовые количества вещества. Однако для изучения физико-химических свойств и механизма действия пептидов требуются значительные количества высокоочищенного препарата. Низкое содержание пептидов в природных объектах требует разработки новых более продуктивных методов их получения. В настоящее время подавляющее большинство рекомбинантных белков и полипептндов получают культивированием генетически трансформированных микроорганизмов, чаще всего клеток Escherichia coli. Однако биосинтез низкомолекулярных пептидов в чужеродных клетках зачастую сопряжен с рядом трудностей: низкой устойчивостью гетерологичиых пептидов к действию внутриклеточных протеаз, а также сложностью их последующего выделения из грубого клеточного лизата.Отсутствие в клетке подходящих условий для образования упорядоченной структуры полипептида ведет к его частичной или полной деградации в процессе синтеза. Отсутствие репортерной и лиганд-связывающей активности осложняет подбор оптимальных условий для биосинтеза и выделения продукта. Более того, пептвды, обладающие антимикробным действием, могут оказывать отрицательное влияние на рост клеток-хозяев.Включение целевого полипептида в состав гибридного белка на основе высокоэкспрессируемого белка-партнера - одно из возможных решений проблемы получения полноразмерного продукта в чужеродных клетках. Белок-партнер обеспечивает не только суперэкснрессию целевого пептида, но и возможность его последующего выделения. Несмотря на очевидные преимущества включения пептида в состав гибридного белка, успех синтеза во многом определяется структурой молекулы гибридного белка (положением пептида в молекуле, структурой аминокислотного линкера) и свойствами белка-партнера. Эти обстоятельства придают актуальность изучению влияния структурообразующих элементов гибридного белка на общую стабильность молекулы, а также поиску оптимального белка-партнера, обеспечивающего высокую экспрессию, легкую идентификацию и эффективную очистку синтезируемого продукта.Зеленый флуоресцентный белок (GFP) из Aequorea victoria, широко используемый в качестве репортерного белка, соответствует требованиям, предъявляемым к белкупартнеру: устойчив к действию внутриклеточных протеаз и хаотропных- агентов, легко детектируется, экспрессируется с высокой эффективностью в различных организмах и клетках, в том числе в клетках Е. coli, экстрагируется органическими растворителями без потери функциональной активности. Эти свойства благоприятствуют использованию GFP не только в качестве репортерного белка, но и в качестве белка-партнера для биосинтеза и выделения низкомолекулярных полипептидов.Целью данной работы было изучение влияния структурообразующих элементов гибридного белка на общую стабильность гибридной молекулы и разработка нового эффективного метода выделения полипептидов. Были поставлены следующие задачи: - изучить влияние структуры аминокислотного линкера на стабильность гибридного белка in vivo и in vitro; - изучить зависимость эффективности биосинтеза целевого продукта от свойств используемого белка-партнера и положения пептида в молекуле гибрида; - разработать новый метод очистки полипептидов в составе гибрида, используя экстракционные свойства GFP; - разработать эффективный способ синтеза и выделения функционально активного антибактериального пептида саркотоксина IA из клеток Е. coli.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Скосырев, Виталий Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Установлено значительное влияние структуры линкерного пептида и формы накопления продукта в клетке на устойчивость гибридных белков к протеолитическому действию:

• аминокислотный состав линкера и его ближайшее окружение оказывают критическое влияние на стабильность гибридного белка in vitro (GFP-ОЬЗ);

• влияние линкера на стабильность гибридного белка in vivo нивелируется формой накопления (тела включения) синтезируемого продукта в клетке.

2. Выявлено определяющее значение положения целевого полииептида (саркотоксин) в молекуле гибридного белка и свойств белка-партнера па эффективность синтеза полноразмерного продукта.

3. Продемонстрирована целесообразность использования GFP в качестве белка-партнера для биосинтеза низкомолекулярпых полинептидов в клетках Escherichia coli.

4. На основе уникальных свойств GFP разработан эффективный метод очистки пептидов с использованием органической экстракции этанолом.

5. Показано, что эффективность экстракции зависит от структуры целевого пептида и не зависит от его положения в молекуле гибридного белка.

6. Впервые предложен эффективный способ получения биологически активного рекомбинантного антибактериального пептида - саркотоксина IA из клеток Escherichia coli.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе была продемонстрирована возможность использования зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве белка-партнера для эффективного синтеза низкомолекулярпых полнпептидов в клетках Е. coli. Все представленные в работе химерные конструкции на основе гена gfp хорошо экспрессировались. В условиях оптимальной температуры роста клеток (37°С) продукт экспрессии, как правило, аккумулировался в агрегированном виде. В составе тел включения, устойчивых к действию внутриклеточных протеолитических ферментов, преобладал полноразмерный гибридный белок. Продукт экспрессии растворимой фракции клеток был полностью деградирован но модулю пептида. Таким образом, включение продукта синтеза в состав тел включения является необходимым условием для получения полноразмерного целевого полииентида в клетках Е. coli.

Была установлена взаимосвязь между стабильностью синтезируемого белка и структурой аминокислотного линкера, соединяющего модули гибридного белка. Наличие потенциальных участков расщепления в составе вставки (GOb3 in vitro) ведет к деградации гибридного белка. Это обстоятельство требует более внимательного подхода к оценке аминокислотного состава вставки, особенно в случае, когда она кодируется произвольной нуклеотидной последовательностью, образованной в результате генно-инженерных манипуляций. Используя сильный промотор и белок-партнер, склонный к образованию в клетке нерастворимых агрегатов (тел включения), можно частично нивелировать влияние вставки на общую стабильность молекулы in vivo.

Исходя из результатов синтеза пептидов в составе гибридных белков на основе GFP, а также из результатов синтеза саркотоксина в составе гибридных белков на основе различных белков-партнеров, был разработан способ получения функционально активного пептида саркотоксина. Было обнаружено, что эффективность синтеза полноразмерного пептида в клетках Е. coli значительно зависит от положения молекулы пептида в составе гибрида, а также от свойств используемого белка-партнера. Только при использовании GFP в качестве белка-партнера был достигнут положительный результат. В результате выделения пептида из тел включения был получен высокоочищенный функционально активный препарат саркотоксина с относительно высоким конечным выходом продукта.

Было показано, что GFP может быть использован как белок-иартпер не только для биосинтеза гюлноразмерных гетерологичных полнпептидов в клетках Е. coli, но и, несмотря на отсутствие лиганд-связывающей активности, для высокоэффективного выделения продукта синтеза. Благодаря уникальной структуре GFP, обеспечивающей беспрепятственное перемещение молекулы в двухфазных системах, был разработан простой метод выделения низкомолекулярных полипентидов органической экстракцией. Было установлено, что эффективность экстракции продукта не зависит от положения молекулы GFP в гибридном белке, но значительно зависит как от количества функционально активного GFP, так и от структуры целевого полипептида. Оптимизация условий экстракции позволяет значительно увеличить конечный выход продукта с сохранением высокой степени очистки белка. Другие преимущества данного метода: низкая стоимость используемых химических компонентов, скорость выделения, визуализация всех этапов выделения и т.д. позволяют использовать этот метод не только для получения аналитических, но и препаративных количеств вещества.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скосырев, Виталий Сергеевич, Пущино

1. Briggs JD. Humoral immunity in lepidopterous larvae. J Exp Zool. 1958; 138: 155-88.

2. Boman HG. Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Annu.Rev.Immunol 1995; 13:61-92.

3. Hultmark D, Steiner H, Rasmuson T, Boman HG. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia. Eur J Biochem 1980; 106: 7-16.

4. Steiner H, Hultmark D, Engstrom A, Bennich H, Boman HG. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. Nature 1981; 292: 246-8.

5. Okada M, Natori S. Primary structure of sarcotoxin I, an antibacterial protein induced in the hemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh fly) larvac. J Biol Chcm 1985; 260: 71747.

6. Okada M, Natori S. Purification and characterization of an antibacterial protein from haemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh-fly) larvae. Biochem J 1983; 211: 727-34.

7. Hopp TP, Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1981; 78: 3824-8.

8. Travers P, Blundell TL, Sternberg MJ, Bodmer WF. Structural and evolutionary analysis of HLA-D-region products. Nature 1984; 310: 235-8.

9. Tanford C. The hydrophobic effect and the organization of living matter. Science 1978; 200:1012-8.

10. Ivvai H, Nakajima Y, Natori S, Arata Y, Shimada I. Solution conformation of an antibacterial peptide, sarcotoxin IA, as determined by 1H-NMR. Eur J Biochem 1993; 217:639-44.

11. Matsumoto N, Okada M, Takahashi II et al. Molecular cloning of a cDNA and assignment of the C-terminal of sarcotoxin I A, a potent antibacterial protein of Sarcophaga peregrina. Biochem J 1986; 239: 717-22.

12. Aly R, Granot D, Mahler-Slasky Y, Halpern N, Nir D, Galun E. Saccharomyces cerevisiae cells harboring the gene encoding sarcotoxin IA secrete a peptide that is toxic to plant pathogenic bacteria. Protein Expr Purif\999; 16: 120-4.

13. Okada M, Natori S. Mode of action of a bactericidal protein induced in the haemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh-fly) larvae. Biochcm J 1984; 222: 119-24.

14. Okada M, Natori S. Ionophore activity of sarcotoxin I, a bactericidal protein of Sarcophaga peregrina. Biochcm J \ 985; 229: 453-8.

15. Kimelberg HK, Papahadjopoulos D. Interactions of basic proteins with phospholipid membranes. Binding and changes in the sodium permeability of phosphatidylserine vesicles. J Biol Chcm 1971; 246: 1142-8.

16. Imai M, Inoue K, Nojima S. Effect of polymyxin В on liposomal membranes derived from Escherichia coli lipids. Biochim.Biophys Acta 1975; 375: 130-7.17.