Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз"

На правах рукописи

ХАУСТОВ СЕРГЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

БЕСКЛЕТОЧНАЯ СИСТЕМА ТРАНСКРИПЦИИ-ТРАНСЛЯЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭКСПРЕССИРУЕМОГО СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕНА ИНГИБИТОРА РИБОНУКЛЕАЗ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

иильвзе 1

Пущино — 2008

003168361

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Железная Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Белецкий Игорь Петрович

кандидат биологических наук Масулис Ирина Станиславовна

Бедущая организация: Институт биоорганической химии им акад

М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН, г Москва

Защита состоится 22 мая 2008 г в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 002 038 01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г Пущино, Московская область, ул Институтская д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН, г Пущино

Автореферат разослан 21 апреля 2008 г

Ученый секретарь ,,

Диссертационного совета /'

кандидат биологических наук / Й]Г-0'у\у/ ТИ Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Экспрессия рекомбинантных генов в бесклеточных системах транскрипции-трансляции (БСТТ) становится все более востребованным способом получения белков Отсутствие механизмов клеточного контроля и возможность манипулировать составом реакционной смеси (добавление редуцирующих агентов, детергентов, ингибиторов протеаз и рибонуклеаз) делают белоксинтезирующие системы единственным возможным способом получения многих белков Этот подход позволяет решить проблемы, которые могут возникнуть при экспрессии in vivo цитотоксичносгь, агрегация, протеолиз, неправильное образование S-S связей Бесклеточный синтез универсален в геномных исследованиях для скрининга большого количества белков с неизвестными функциями, белковой инженерии in vitro, для получения белков, содержащих тяжелые и радиоактивные изотопы, не природные аминокислоты

Технологии бесклеточного белкового синтеза постоянно совершенствуются, предлагаются новые высокоэффективные системы для препаративного получения белков (до 3 мг/мл) с высокой степенью чистоты (до 80%) Это стало возможно благодаря разработке реакторов (обменных и проточных), в которых происходит пополнение компонентов и удаление метаболитов; оптимизации реакционной смеси (использование клеточного экстракта различной концентрации, добавление быстро деградирующих аминокислот), поиска более эффективных источников регенерации АТФ и ГТФ (пируват оксидаза/флавинадениндинуклеотид), выделения экстракта из мутантных штаммов Escherichia coli, лишенных активностей протеаз и рибонуклеаз [Spinn, 2004]

Совершенствование БСТТ направлено на уменьшение содержания компонентов клеточного экстракта в пользу очищенных составляющих' тРНК, РНК-полимераз, ко-факторов трансляции [Shimizu et al, 2001] Это позволяет избежать присутствия нежелательных примесей, более тонко регулировать

состав реакционной смеси, изучать функции любого из факторов трансляции Единственным компонентом, получение которого сегодня невозможно без использования живых клеток - это рибосомы Работы по созданию искусственной рибосомы начались с попытки получения рибосомальных белков малой субъединицы рибосомы Е coli, однако это оказалось безуспешным из-за низкого уровня экспрессии нативных генов, что связано с особенностями кодонового состава и наличием устойчивых вторичных структур мРНК [Culver and Noller, 1999] Решение этих проблем стало возможно благодаря развитию технологии химико-ферментативного синтеза генов С его помощью удалось получить оптимизированные гены всех белков 30S субъединицы рибосомы и экспрессировать их в БСТТ с высоким уровнем продукции [Tian et al, 2004] Можно ожидать, что в ближайшие годы будут синтезированы гены всех белковых компонентов, участвующих в БСТТ, что позволит получать ее без использования клеточного экстракта

Другим направлением совершенствования БСТТ может быть использование экспрессируемых генов компонентов БСТТ, что неизбежно приведет к появлению систем нового поколения саморегулирующихся, саморегенерирующихся и самовосполняющихся

Ингибитор рибонуклеаз (ИР) - это неотъемлемый компонент БСТТ, функция которого заключается в защите РНК от ферментативного гидролиза Традиционно ингибитор добавляют в реакционную смесь в виде очищенного белка, однако в процессе длительных реакций происходит его инактивация Мы предположили, что использование ИР в виде экспрессируемого гена может привести к увеличению эффективности работы системы, поскольку в этом случае пополнение активного белка происходит за счет его постоянной продукции

Цель исследования. Получение бесклеточной системы транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз

Задачи исследования.

I Синтез гена ингибитора рибонуклеаз (ИР)

1 Оптимизация нуклеотидной последовательности

2 Разработка стратегии синтеза генов, содержащих высокогомологичные повторы

3 Получение синтетических сегментов гена ИР

4 Анализ возникших мутаций для определения эффективности разработанной стратегии

5. Клонирование гена ИР

II Экспрессия гена ИР в Escherichia coli

1 Оптимизация условий экспрессии

2 Выделение ИР из клеточного экстракта

3 Разработка нового метода определения активности ИР

III Экспрессия гена ИР в бесклеточной системе сопряженной транскрипции-трансляции на основе Е coli

1 Оптимизация условий экспрессии

2 Изучение влияния гена ИР при его ко-экспрессии с геном зеленого флюоресцентного белка (GFP) на эффективность работы БСТТ

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана новая стратегия получения синтетических генов, содержащих высокогомологичные повторы, с использованием стадий получения и объединения одноцепочечных молекул ДНК Впервые предложено использование Т5 ДНК-нуклеазы для коррекции полученной ДНК на стадии клонирования

При экспрессии искусственного гена ИР в Е coli получен активный белок с выходом 1,5 мг/г биомассы, что на порядок выше, чем удается получить при экспрессии нативного гена Разработана новая схема очистки рекомбинантного ИР без использования иммобилизованной рибонуклеазы А Разработан новый метод простого и точного определения активности ИР, основанный на ингибировании гидролиза РНК рибонуклеазой А

Впервые показана возможность применения экспрессируемого гена ИР в

БСТТ для защиты РНК от гидролизующего действия рибонуклеаз При использовании экспрессируемого гена ИР в БСТТ увеличивается выход целевого белка Применение такого типа систем может решить проблемы синтеза белков, транслируемых с нестабильных мРНК или обладающих рибонузслеазной активностью

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи Результаты были представлены на III Московском международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), XIII и XIV международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006» и «Ломоносов - 2007» (Москва, 2006 и 2007), X и XI Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006 и 2007) Материалы диссертации были доложены на заседания секции «Молекулярная, клеточная и радиационная биология и окружающая среда» Ученого совета Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результатов и их обсуждение», «Выводы» и «Список литературы»

Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 35 рисунков. Библиография содержит 160 ссылок

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка метода синтеза генов, содержащих высокогомологичные повторы

Первой нашей задачей было создание высокоэкспрессируемого гена ИР для использования в Е coli и БСТТ на ее основе Одним из способов повышения эффективности экспрессии генов является оптимизация кодонового состава Для получения оптимизированного гена мы использовали метод химико-

ферментативного синтеза генов Как правило, искусственные гены получают объединением коротких олигонуклеотидов в ПЦР В реакции присутствуют от 2 до нескольких десятков олигонуклеотидов, которые гибридизуются комплементарными концами и объединяются с участием ДНК-лигазы или ДНК-полимеразы Модификации метода основаны на использовании различного числа олигонуклеотидов и способах их объединения

При получении гена ИР были опробованы различные способы объединения олигонуклеотидов, предложенные ранее Однако, в связи с особенностями строения гена, стандартные методы оказались неэффективными При работе с генами, содержащими высокогомологичные повторы, вероятность неспецифической гибридизации промежуточных продуктов ДНК настолько велика, что весь материал расходуется на образование неспецифических комплексов, а целевой продукт ДНК не детектируется

Разрабатывая стратегию получения генов, содержащих высокогомологичные повторы, мы исходили из следующих соображений Объединение двух молекул ДНК возможно, если они содержат взаимно комплементарные концы В процессе ПЦР происходит денатурация дуплексов ДНК и гибридизация комплементарных участков различных молекул В реакции объединения двух молекул ДНК участвуют только цепи, направленные друг к другу 3'-концами, поскольку после гибридизации, только они могут быть достроены ДНК-полимеразой до полноценного дуплекса. В это же время, в реакции присутствуют противоположно направленные цепи ДНК, которые гибридизуются как между собой, так и с комплементарными цепями, а также неспецифическим образом Именно эти взаимодействия приводят к существенному снижению эффективности реакции

Уменьшить неспецифическое взаимодействие ДНК нам удалось следующим образом При получении гена ИР, в каждой реакции мы объединяли не более 4 олигонуклеотидов В отличие от стандартных схем синтеза, мы использовали дуплексы ДНК для получения одноцепочечных молекул, которые затем объединяли с образованием более протяженных

продуктов Чтобы уменьшить число стадий синтеза ДНК, нуклеотидную последовательность гена ИР разделили на 4 сегмента АВ (464 пн), CD (350 п н.), EF (350 п н.) и G (277 п н), каждый из которых получали независимо (рис 1)

Рис 1 Стратегия химико-ферментативного синтеза сегмента гена ИР Одноцепочечные олигонуклеотиды объединяли по 4 в каждой отдельной ПЦР Дуплексы ДНК, полученные в результате объединения олигонуклеотидов, использовали в качестве матрицы в присутствии только одного из концевых праймеров для наработки молекул одноцепочечной ДНК Полученные продукты объединяли и снова использовали для наработки одноцепочечных молекул ДНК Стадии повторяли до получения продукта ДНК нужного размера

В ходе работы по получению сегментов гена ИР мы разработали новую стратегию, которая может быть использована для синтеза генов с высокой степенью внутренней гомологии Только с помощью разработанной нами стратегии оказалось возможным получить все 4 сегмента гена ИР общей длиной около 1,5 т п н

2. Анализ мутаций, возникших при синтезе ДНК При получении сегмента АВ гена ИР, число случайных мутаций составило 8,6 на т п н, что примерно в два раза больше средних показателей, которые можно ожидать при синтезе генов Для того, чтобы определить

б

причины возникновения столь высокого числа ошибок и предложить способы их уменьшения, были проанализированы результаты секвенирования.

Оказалось, что мутации преимущественно возникают в участках, содержащих прямые или палиндромные повторы, а также в областях, где доля А+Т или Г+Ц превышает 60%. Примерно 1/3 мутаций обнаружена в составе последовательностей ОО/СС, около 20% замен возникло в составе последовательности ААА/ТТТ.

Соотношение различных типов мутаций составило: делеция/вставка/транзиция/трансверсия, % = 28/2/50/20, что несколько отличается от данных, полученных при синтезе гена ОРР [Сагг et а1., 2004] (рис. 2). Одним из главных отличий является возникновение при синтезе гена ИР многонуклеотидных мутаций, которые относительно редко встречаются при получении искусственных генов. Поскольку в гене ИР встречаются повторяющиеся нуклеотидные последовательности, олигонуклеотид или промежуточный продукт объединения ДНК, может гибридизоваться с предыдущим или последующим повтором, что приводит к образованию многонуклеотидной делении или вставки, соответственно.

Рис. 2. Доля каждого типа мутаций, возникших при синтезе гена ИР в сравнении с данными, полученными при синтезе гена ОКР [Сагг « а!., 2004].

Данные, полученные при анализе мутаций сегмента АВ, позволяют говорить о том, что высокая частота мутаций при получении гена ИР связана с особенностями его нуклеотидной последовательности. Для уменьшения числа мутаций мы решили синтезировать менее протяженные сегменты гена ИР и использовать при их клонировании метод коррекции ДНК

3. Исправление мутаций

Аномально высокое число ошибок синтеза ДНК привело к тому, что нам не удалось найти правильный клон при получении наиболее протяженного сегмента АВ Все проанализированные клоны содержали единичные мутации в составе синтезированного сегмента Наиболее простым способом оказалась исправление возникших мутаций с помощью схемы, основанной на ПЦР (рис 3)

Рис. 3 Исправление мутаций в ДНК сегмента АВ с помощью ПЦР 1 - амплификация участков ДНК разных клонов, не содержащих мутации,

2 - объединение полученных ДНК, 3 - получение сегмента ДНК, не содержащего мутации

Поскольку мутации возникают случайно и распределяются независимо, то в различных клонах они детектируются в различных позициях. На основании данных секвенирования мы выбрали участки ДНК различных клонов, не содержащие мутации, амплифицировали их и объединили в ПЦР

С помощью описанного подхода нам удалось избавиться от однонуклеотидных мутаций Однако в большинстве проанализированных генетических конструкций были обнаружены многонуклеотидные дупликации, длина которых в разных клонах составила 9, 12 или 15 пн Все указанные

д

д

мутации находились в участке гена 287-460, который содержит наиболее высокогомологичные повторы При поиске способа избавиться от данного типа мутаций мы руководствовались следующими соображениями, при дупликации участка ДНК (рис 4, фрагмент У) есть вероятность того, что в его составе может присутствовать уникальный сайт эндонуклеазы рестрикции Обработка соответствующим ферментом и последующее дотирование позволяют избавиться от обнаруженной мутации К счастью, в составе дуплицированного фрагмента был обнаружен сайт эндонуклеазы рестрикции А§е1, что позволило получить сегмент АВ в исходном виде (рис 4)

Рис. 4. Схема удаления душшцированного фрагмента 237-302 с помощью сайт-специфической эндонуклеазы AgeI 1 - обработка плазмиды эндонуклеазой, 2 - очистка ДНК от низкомолекутарного фрагмента и лигирование X, У, X - уставное обозначение фрагментов ДНК

Таким образом, наиболее протяженный сегмент гена ИР, не содержащий мутаций в своем составе, был получен с применением схемы удаления мутаций на основе ПЦР и использованием эндонуклеазы рестрикции А§е1

4. Корректирование и клонирование синтетических ДНК

С помощью разработанной стратега« синтеза мы получили и клонировали сегменты гена ИР Для уменьшения числа ошибок в составе синтезированной ДНК мы впервые использовали Т5 ДНК-нуклеазу. Механизм действия фермента основан на сочетании его эндо- и экзонуклеазной активностей в область неспаренности вносится одноцепочечный разрыв, начиная с которого происходит гидролиз всей молекулы ДНК Наиболее

А£е1

целесообразно проводить обработку после реакции лигирования синтетической ДНК и вектора, поскольку в результате гидролиза кроме молекул, содержащих неспаренности и одноцепочечные разрывы, происходит удаление некорректно лигированных продуктов.

Эффективность обработки Т5 ДНК-нуклеазой оценивали по числу клонов, содержащих сегмент ДНК исходного размера. Результаты показали, что при использовании нуклеазы число клонов исходного размера увеличивается с 45% до 80% (рис. 5).

Д 1 2 3 4 5 6 7 В 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Б 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 16 19 20

Рис. 5. ПЦР-анализ клонов на наличие вставки исходного

размера. А - после обработки лигазной смеси Т5 ДНК-нуклеазой, Б - без обработки. Цифрами указаны номера клонов, стрелками

указано положение

фрагмента ДНК

необходимого размера.

На основе полученных данных можно сделать вывод, что использование Т5 ДНК-нуклеазы существенно увеличивает эффективность клонирования синтетических ДНК благодаря снижению числа делегированных и некорректно лигированных молекул, что существенно упрощает процесс скрининга клонов.

5. Получение полноразмерного гена ИР

Для клонирования полноразмерного гена ИР мы использовали вектор рЛУО, сконструированный в лаборатории Молекулярной генетики ИБ РАН. Принцип использования вектора основан на свойствах эндонуклеазы рестрикции ВЬуН [МаЫепко е1 а1., 1984], сайт расщепления которой находится в стороне от сайта узнавания. Вектор содержит два сайта ВЬу11, расположенные по обе стороны от сайта вта! и перекрывающиеся с ним на

2 п.н. В результате, клонированная по тупым концам ДНК может быть вырезана с образованием выступающих 5'-концов, причем без удаления или добавления нуклеотидных остатков.

Согласно стратегии синтеза, соседние сегменты гена содержат на концах идентичные 4 п.н. Таким образом, после гидролиза эндонуклеазой ВЬуП все сегменты содержат уникальные взаимокомплементарные липкие концы. Мы объединили 4 сегмента гена ИР в одной лигазной реакции между собой и с вектором рЕТ28Ь (рис. 6).

Рис. 6. Клонирование гена ИР. 1 - обработка плазмид, содержащих сегменты гена ИР соответствующими эндонуклеазами рестрикции, 2 - лигирование сегментов между собой и с подготовленным вектором рЕТ28Ь с образованием полноразмерного гена ИР в составе генетической

конструкции рЫ.

Таким образом, полноразмерный ген ИР был получен из синтетических сегментов ДНК с помощью промежуточного клонирования в вектор рЯУО с использованием ДНК-лигазы и эндонуклеазы рестрикции В'оуП.

6. Экспрессия гена ИР в E.coli и разработка схемы очистки белка Синтетический ген ИР в сосгаве генетической конструкции pRI экспрессировали в штамме Е coli BL21(DE3) с использованием изопропил-ß-D-тиогалактопиранозида в качестве индуктора. Выход активного ИР составил 100000 е аУл культуры клеток, что на порядок выше, чем при экспрессии нативного гена в Еcoll [Lee and Vallee, 1989] и Scerevisiae [Vicentim et al, 1990] Для выделения ИР из клеточного экстракта мы разработали новую схему хроматографической очистки.

В основе предложенных в настоящее время методов очистки ИР лежит применение аффинной хроматографии с использованием иммобилизованной рибонуклеазы A [Blackburn, 1979], что неизбежно приводит к присутствию остаточной рибонуклеазной активности в препарате белка До тех пор пока ИР сохраняет активность, рибонуклеаза остается связаной с ним, однако при инактивации ИР, происходит освобождение рибонуклеазы.

Для того чтобы избежать присутствия возможных примесей рибонуклеазы в полученном препарате ИР мы отказались от применения аффинной хроматографии Были проанализированы более 10 хроматографических носителей, на основании чего мы разработали новую схему очистки, основанную на осаждении сульфатом аммония и 4-х стадийной хроматографии, с помощью которой ИР был очищен до электрофоретически чистого состояния (рис 7)

«Да М 1 2 3 4 5 6 7 М

Рис 7. Образцы фракций последовательных стадий очистки ИР М - маркер молекулярных масс белков, 1 - лизат клеток Е coli после индукции, 2 - экстракт клеточных белков, 3 - элюат Q Big Beads, 4 -преципитат после осаждения 60% (NH^SO*, 5 - элюат Hydroxyl Apatite, б - элюат Q Масгоргер, 7 -элюат ANX Fast Flow

7. Опредепение активности ИР

Активность ИР принято измерять по степени ингибирования гидролизующего действия рибонуклеазы А В качестве субстрата обычно используют радиоактивно-меченную РНК или 2\3'-дезоксицитидинмонофосфат [Blackburn, 1979] В первом случае сложности связаны с использованием модифицированной РНК, во втором - с крайней нестабильностью субстрата

Мы разработали новый метод с целью упростить определение активности ИР Для этого в качестве субстрата мы использовали тотальную РНК Е coli Гидролиз оценивали по оптическому поглощению кислото-растворимой фракции РНК после инкубации образцов с рибонуклеазой А и ИР Расчет активности ингибитора осуществляли по формуле

Abs, *D* 100% „ А=-1-, где

Abs0*V* 50%

А - активность (е а /мкл), Absi - поглощение (эксперимент), Abs0 -поглощение (контроль без добавления ИР), D - разведение препарата ИР, V -объем препарата ИР, добавляемого в реакцию (мкл), 50% - коэффициент пересчета (согласно принятой номенклатуре 1 еа ИР соответствует 50% ингибированию 5 нг рибонуклеазы А)

Отказ от предложенного ранее использования радиоактивно-меченной РНК и нестабильных рибонуклеазных субстратов значительно упрощает процедуру определения активность ИР при сохранении точности метода

8. Экспрессия гена ИР в БСТТ на основе E.coli

Возможность экспрессии синтетического гена ИР в БСТТ на основе Е coli была проверена в аналитическом формате (batch), который является наиболее доступной системой для продукции белков in vitro и традиционно используется для моделирования биологических процессов и оптимизации условий синтеза В этом варианте реакция проходит, как правило, в небольшом объеме довольно

непродолжительно (1-4 часа), после чего ресурсы системы исчерпываются, и продукция белка останавливается.

Генетическую конструкцию pRi, содержащую искусственный оптимизированный ген ИР, вносили в стандартную реакционную смесь [Spirin, 2004]. После инкубации продукцию белка оценивали с помощью SDS-гель-злектрофореза по появлению полосы соответствующего размера (рис. 8 А). На рисунке видно, что большая часть ИР агрегирует, и только небольшая его доля детектируется в растворимом виде. Склонность ИР к агрегации, проявляющаяся как при экспрессии в живых клетках, так и в бесклеточных системах, вызвана содержанием в составе белка большого числа остатков гидрофобных аминокислот, которые склонны к образованию неспецифических внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Регулировать этот процесс при получении ИР in vivo крайне сложно, в то время, как в БСТТ эффективным оказалось добавление в реакционную смесь детергента Brij 35, который способен уменьшить гидрофобные взаимодействия (рис. 8 Б). На рисунке видно, что в БСТТ с добавлением 0,5% Brij 35 ИР нарабатывается преимущественно в растворимом виде.

А Б

М 1 2 3 4 5 М 1 2 3

(Ш —<■

ш g li %

Рис. 8. Экспрессии гена ИР в БСТТ. А. Стандартная БСТТ. М - маркер молекулярных масс белков, 1 - проба реакционной смеси до инкубации, 2 - препарат после инкубации, 3 -растворимая фракция после инкубации, 4 - осадок после инкубации, 5 - ИР (стандарт). Б. БСТТ с добавлением 0,5% Brij 35. 1 - проба реакционной смеси до инкубации, 2 -растворимая фракция после инкубации, 3 - осадок после инкубации. Реакцию проводили при 30°С в течение 1 часа, пробы центрифугировали при 16000g, белковые продукты разделяли SDS-гель-злектрофорезом и детектировали окрашиванием Coomassie Blue G-250.

48 —

30-

ш

ж %

ШГ

¿ák

i ■ 41ШГ ^Ш'

i^Ü? ш

Ингибитор рибонуклеаз отличается высоким содержанием цистеина, 32 остатка, часть из которых экспонирована на поверхности молекулы. Поэтому еще одной сложностью, возникающей при получении ИР, является его инактивация вследствие окисления SH-групп. Для решения этой проблемы в реакционную смесь добавляли 8 мМ ДТТ. Согласно измерениям, активность ИР, полученного в этих условиях, составила 40 е.а./мкл.

Безусловно, экспрессия in vitro предоставляет для исследователей больше возможностей по оптимизации условий и увеличению продукции целевого белка по сравнению с использованием живых клеток.

Следующим этапом работы была проверка возможности ко-экспрессии гена ИР и гена GFP. Для этого также был использован аналитический вариант БСТТ, в которую вводили плазмиды, содержащие гены целевых белков (рис. 9). Как видно на рисунке, при ко-экспрессии двух генов продукция обоих белков не изменяется, отрицательного взаимного влияния не наблюдается, что позволяет рассматривать данную систему как оптимальную модель для изучения влияния гена ИР на эффективность работы БСТТ.

М 1 2 3

Рис. 9. Экспрессия генов ИР и GFP. 1 - экспрессия гена ИР, 2 - экспрессия гена GFP, 3 - ко-экспрессия генов ИР и GFP, М - маркер молекулярных масс белков. Реакцию проводили при 30оС в течение 1 часа в присутствии 0,01 мМ [MC]-Leu, 0,5% Brij 35, 8 мМ ДТТ. Белковые продукты разделяли SDS-гель-элекгрофорезом и детектировали авторадиографией.

9. Получение БСТТ с использованием гена ИР

Поскольку мы выяснили, что ИР синтезируется в БСТТ в активном виде и может продуцироваться совместно с ОРР, следующим этапом нашей работы было изучение влияние гена ИР на эффективность работы системы при его ко-экспрессии с геном ОРР. Дта этого мы использовали БСТТ диализного типа, в

которой возможно пополнение компонентов реакционной смеси за счет питающего раствора, отделенного полупроницаемой мембраной. Синтез белка в таких системах протекает в течение длительного времени (около 24 часов), причем стабильность РЖ играет здесь определяющую роль, а добавление ИР яв.ияется крайне необходимым.

Мы ко-экспрессировали синтетический ген ИР с геном ОРР в БСТТ диализного типа, с добавлением 0,5% Вгц 35 и В мМ ДТТ. Оптимальные концентрации плазмид, содержащих гены ИР и вРР были подобраны экспериментальным путем. В качестве положительного контроля в БСТТ добавляли белковый ИР, что является традиционным способом защиты РНК. В качестве отрицательного контроля использовали препарат без добавления белкового ИР и его экспрессируемого гена. Через равные промеясутки времени из реакционной смеси отбирали пробы для анализа эффективности работы БСТТ. Согласно полученным данным, при 24-часовой инкубации добавление экспрессируемого гена ИР увеличивает продукцию СРР примерно на 50% по сравнению с отрицательным контролем, что приближается к значениям, полученным для положительного контроля (рис. 10 А).

Рис. 10. Эффективность работы БСТТ. А. Количество ОРР (определяли по флуоресценции). Б - Количество мРНК вБР (определенное методом ПЦР в режиме реального времени). Реакцию проводили в БСТТ диализного типа с добавлением 50 мкг/мл рОР'Р, 0,5% Вп) 35, 8 мМ ДТТ при 30°С в течение 24 часов. В разные реакции добавляли рЫ (7 мкг/мл или 13 мкг/мл), белковый ИР (0,5 ед./мкл) или не добавляли ИР и рЮ.

Как видно из рисунка 10, наибольший эффект использования ИР достигается при длительных инкубациях Кроме того стоит отметить, что выход графика на плато при концентрации pRI 13 мкг/мл происходит заметно позже Это говорит о том, что при несколько сниженном темпе синтеза tJFP по сравнению с положительным контролем на начальных стадиях, прекращение продукции целевого белка наступает существенно позже Выводом может служить предположение, что ресурсы стандартной БСТТ могут быть использованы более эффективно при дальнейшей модификации системы

Высказанное предположение подтверждают данные, полученные при определении количества мРНК GFP, синтезированной в БСТТ при различных условиях (рис. 10 Б) Оказалось, что при ко-экспрессии гена ИР с добавлением 13 мкг/мл pRI, количество мРНК намного больше, чем в положительном контроле Это означает, что при использовании экспрессируемого гена ИР в БСТТ, он наиболее эффективно выполняет свою функцию по связыванию рибонуклеаз и деградация РНК минимальна

Тот факт, что продукция GFP при ко-экспрессии гена ИР несколько снижается по сравнению с положительным контролем (примерно на 15% при добавлении 13 мкг/мл pRI) объясняется тем, что для экспрессии ИР расходуется часть ресурсов системы, предназначенных для GFP Снижение количества pRI менее эффективно при длительных инкубациях, поскольку в этом случае продуцированного ИР недостаточно для защиты РНК

Использование pRI при ко-экспрессии с геном GFP оказалось достаточно эффективным Применение разработанной нами системы может быть особенно важным при экспрессии генов белков, обладающих рибонуклеазной активностью, поскольку при их продукции необходимо эквивалентное увеличение количества ИР Постоянный синтез ИР также важен в открытых системах, где велика вероятность внесения экзогенной рибонуклеазной активности. При экспрессии некоторых генов добавление белкового ИР оказывается неэффективным Так, например, при получении липазы из Pseudomonas sp [Yang et al, 2000] активный фермент продуцируется только в

отсутствии редуцирующих агентов Белковый ИР в таких условиях ииактиЕируется в течение 30 минут [Кип et al, 1999], в то время как при ко-экспрессии гена ИР возможно постоянное пополнение ингибитора по мере его инактивации Для таких случаев мы также можем рекомендовать использование БСТТ, содержащей экспрессируемый ген ИР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нуклеотидная последовательность гена ИР была оптимизирована для высокоэффективной экспрессии в клетках Е сок и бесклеточных системах на ее основе Для получения искусственного гена синтетические олигонуклеотиды были сконструированы и объединены с образованием сегментов гена ИР Для объединения олигонузслеотидов была разработана новая стратегия с использованием стадий наработки и объединения одноцепочечных молекул ДНК

Синтетический сегмент АВ гена ИР, полученный с использованием разработанной нами стратегии синтеза генов, содержал большое число мутаций, которые присутствовали во всех проверенных клонах. Анализ мутаций показал, что их возникновение связано преимущественно с особенностями строения гена ИР. Сегмент АВ, не содержащий ошибок удалось получить только при использовании методов исправления мутаций Нуклеотидная последовательность оставшейся части гена ИР была разбита на менее протяженные сегменты, которые были получены независимо.

Дтя коррекции возникающих при синтезе и лигировании ошибок ДНК была впервые использована Т5 ДНК-нуклеаза, в результате чего число клонов, содержащих сегмент необходимой длины, увеличилось примерно в два раза Клоны, содержащие сегменты гена ИР без мутаций были найдены и использованы для получения полноразмерного гена

Синтезированный ген ИР был клонирован и экспрессирован в клетках Е с oh, причем выход активного белка оказался на порядок выше, чем обычно

удается получить при экспрессии нативного гена Для выделения ИР из клеточного экстракта была разработана новая схема очистки без традиционно применяемой аффинной хроматографии с использованием иммобилизованной рибонукпеазы А, что позволило получить гомогенный белок без примесей рибонуклеазной активности Для определения активности ИР был разработан новый простой и точный метод, основанный на ингибировании гидролиза РНК рибонуклазой А

Искусственный ген ИР экспрессировали в БСТТ отдельно и вместе с геном GFP Впервые показана возможность применения экспрессируемого гена ИР в БСТТ для защиты РНК от гидролизующего действия рибонуклеаз Использование экспрессируемого гена ИР в БСТТ увеличивает количество мРНК и выход целевого белка

ВЫВОДЫ

1 Разработана и применена новая стратегия получения синтетических ДНК, содержащих высокогомологичные повторы, на основе амплификации и объединения одноцепочечных молекул ДНК

2 Оптимизированный синтетический ген ингибитора рибонуклеаз был экспрессирован в Е coli с выходом 1,5 мг/г биомассы, что на порядок больше, чем при экспрессии нативного гена

3 Разработана новая схема очистки ингибитора рибонуклеаз без использования иммобилизованной рибонуклеазы А

4 Получена бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием синтетического экспрессируемого гена ингибитора рибонуклеаз

Список публикаций, выполненных по теме диссертации

1 Хаустов С А. Матвиенко НИ, Железная Л А (2008) Получение синтетических генов для молекулярно-биологических исследований на примере человеческого плацентарного ингибитора рибонуклеаз Российский биомедицинский журнал, том 9, с 49-62

2 Хаустов С. А. Матвиенко НИ, Железная Л А (2008) Синтез гена человеческого плацентарного ингибитора рибонуклеаз и его экспрессия в Е coli Технологии живых систем, №3

3 Хаустов С А. Перевязова Т А, Железная Л А, Матвиенко H И (2005) Сравнительная эффективность методов синтеза протяженных генов Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 1, Москва, с 136

4 Ткачук А П, Хаустов С А (2006) Клонирование, бактериальная экспрессия и исследование возможного применения в генно-инженерных целях D15 Т5 5'-3'экзонуклеазы бактериофага Т5 Материалы XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006», том IV, Изд-во МГУ, с 225

5 Ткачук А.П., Хаустов С А, Матвиенко НИ (2006) Получение и изучение свойств D15 5-3' экзонуклеазы бактериофага Т5 Материалы X Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино, с 55

6 Ткачук А П., Хаустов С А (2007) Получение и применение человеческого ингибитора рибонуклеаз в бесклеточной системе транскрипции-трансляции Материалы XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2007», том IV, Изд-во МГУ, с 136

7 Хаустов С А (2007) Анализ случайных мутаций, возникших при получении искусственного гена rnhl. Материалы XI Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, с. 118

Подписано в печать 21 04 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 298 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хаустов, Сергей Анатольевич

Список условных сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Бесклеточные белоксинтезирующие системы

1.1.1. История создания

1.1.2. Бесклеточные системы транскрипции-трансляции

1.1.3. Получение и состав

1.1.4. Энергетический обмен

1.1.5. Роль катионов

1.1.6. Различные типы систем

1.1.7. Реакторы для проведения биосинтеза белка

1.1.8. Получение "чистой" белоксинтезирующей системы 20 1.2. Технологии получения искусственных генов " "

1.2.1. Искусственные гены в современной молекулярной биологии

1.2.2. Метод Кораны - история синтез первого гена

1.2.3. Получение генов из частично комплементарных олигонуклеотидов

1.2.4. Стадии синтеза генов

1.2.5. Использование специализированных компьютерных программ

1.2.6. Развитие технологии синтеза олигонуклеотидов

1.2.7. Микросинтез олигонуклеотидов с использованием пико-чипов

1.2.8. Способы объединения олигонуклеотидов

1.2.8.1. Ферментативное объединение олигонуклеотидов

1.2.8.2. Попарное объединение дуплексов с использованием ДНК-лигазы

1.2.8.3. Синтез с помощью "якорных" и "линкерных" олигонуклеотидов

1.2.8.4. Множественное объединение олигонуклеотидов 37 1.2.8.4. "Серийное клонирование"

1.2.8.5. "Репаративная достройка"

1.2.8.6. Объединение олигонуклеотидов с использованием ПЦР

1.2.8.7. Получение генов на микрочипах

1.2.9. Способы объединения синтетических сегментов

1.2.9.1. Объединение с помощью ПЦР

1.2.9.2. Объединение с помощью ДНК-лигазы

1.2.9.3. Использование эндонуклеаз рестрикции типа IIS

1.2.10. Способы коррекции ошибок

1.2.10.1. Применение эндонуклеаз, узнающих неспаренности цепей ДНК

1.2.10.2. "Фильтрация совпадений"

1.2.10.3. "Общее слияние"

1.2.10.4. Гибридизация с "селекционными" олигонуклеотидам

1.2.11. Синтез вирусных геномов и мегакластеров генов

1.2.12. Синтез генома микроорганизма

1.2.13. Другие проекты по синтезу геномов

1.2.14. Этические проблемы получения искусственного организма 50 1.3. Объект исследования - плацентарный ингибитор рибонуклеаз

2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы и оборудование

2.2. Методы

2.2.1. Модификация нуклеотидной последовательности гена ИР

2.2.2. Условия ПЦР амплификации ДНК

2.2.3. Химико-ферментативный синтез ДНК

2.2.4. Скрининг рекомбинантных клонов с помощью ПЦР

2.2.5. Удаление мутаций с использованием ПЦР

2.2.6. Очистка ДНК с помощью препаративного электрофореза

2.2.7. Ферментативные реакции и их детектирование

2.2.8. Обработка препаратов Т5 ДНК-нуклеазой

2.2.9. Получение генетических конструкций

2.2.9.1. Клонирование синтетических сегментов гена ИР

2.2.9.2. Получение генетической конструкции pRI

2.2.9.3. Получение генетических конструкций pRI-His и pRI-Nus

2.2.9.4. Получение генетических конструкций pET-RN и pET-ANG

2.2.9.5. Получение генетических конструкций pRI-RN и pRI-ANG

2.2.10. Получение компетентных клеток E.coli

2.2.11. Трансформация компетентных клеток Е.coli

2.2.12. Выделение плазмидной ДНК из E.coli

2.2.13. Получение S30 экстракта E.coli

2.2.14. Транскрипция РНК in vitro

2.2.15. Выделение тотальной РНК E.coli

2.2.17. Экспрессия рекомбинантных генов в E.coli

2.2.17.1. Аналитическая экспрессия

2.2.17.2. Препаративная экспрессия

2.2.17.3. Ко-экспрессия гена ИР с генами шаперонов

2.2.18. Синтез белков в БСТТ на основе Е. coli

2.2.18.1. БСТТ в формате "batch"

2.2.18.2. Диализная БСТТ открытого типа

2.2.19. Выделение ИР из телец включения

2.2.19.1. Выделение ИР растворением в 8 М мочевине

2.2.19.2. Хроматографическая очистка ИР в денатурирующих условиях

2.2.19.3. рН-зависимая ренатурация ИР

2.2.20. Выделение ИР из клеточного экстракта E.coli

2.2.21. Определение концентрации и чистоты нуклеиновых кислот

2.2.22. Определение концентрации общего белка

2.2.23. Определение концентрации GFP по интенсивности флюоресценции

2.2.24. Электрофоретический анализ белков

2.2.25. Точное определение активности ИР

2.2.26. Оценка активности ИР с помощью электрофореза

2.2.27. Определение количества мРНК GFP с помощью ПЦР-РВ 83 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Оптимизация кодонового состава гена ИР

3.2. Разработка стратегии синтеза генов, содержащих высокогомологичные повторы

3.3. Анализ мутаций, возникших при синтезе ДНК

3.4. Исправление мутаций

3.5. Корректирование и клонирование синтетических ДНК

3.6. Получение полноразмерного гена ИР

3.7. Экспрессия гена ИР в Е. coli

3.7.1. Экспрессия гена ИР в составе pRI в Е. coli

3.7.2. Ко-экспрессия гена ИР с генами шаперонов

3.7.3. Ко-экспрессия гена ИР с генами рибонуклеазы А и ангиогенина

3.8. Выделение ИР

3.8.1. Выделение ИР из телец включения

3.8.2. Разработка схемы очистки ИР из клеточного экстракта

3.9. Определение активности ИР

3.10. Экспрессия гена ИР в БСТТ на основе Е. coli

3.11. Получение БСТТ с использованием гена ИР 114 Заключение 119 Выводы 120 Список публикаций, выполненных по теме диссертации 121 Список литературы 122 Благодарности

Список условных сокращений

АТФ - аденозин-5'-трифосфат ББС - бесклеточная белоксинтезурующая система БСА - бычий сывороточный альбумин БСТТ - бесклеточная система транскрипции-трансляции ГТФ - гуанозин-5'-трифосфат дАТФ - дезоксиаденозин-5'-трифосфат дГТФ - дезоксигуанозин-5'-трифосфат ДМСО - диметилсульфоксид дНТФ - смесь четырех дезокси-нуклеозид-5' -триф осфатов ДТТ - дитиотрейтол дТТФ - дезокситимидин-5'-трифосфат ДТЭ - дитиоэритритол дЦТФ -дезоксицитидин-5'-трифосфат е.а. - единица активности ИПТГ - изопропил-P-Dтиогалактопиранозид ИР - ингибитор рибонуклеаз кДНК - комплементарная ДНК н.о. - нуклеотидный остаток НТФ - смесь четырех нуклеозид-5'трифосфатов о.е. - оптическая единица п.н. - пара нуклеотидов ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакця в режиме реального времени ПЭГ - полиэтиленгликоль Трис - трис(гидроксиметил)аминометан ТХУ - трихлоруксусная кислота УТФ - уридин-5'-трифосфат ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид ЦТФ - цитидин-5'-трифосфат ЭДТА - этилендиаминтетраацетат Ап — поглощение при длине волны п нм GFP - зеленый флуоресцентный белок Н2О mQ — деионизованная вода Hepes - Ы-(2-гидроксиэтил)пиперазин

Ы'-(2-этансерная кислота) КО Ас - ацетат калия Mg(OAc)2 - ацетат магния Pipes — 1,4-пиперазинэтансерная кислота SDS - додецилсульфат натрия ТАЕ - Трис-ацетат-ЭДТА буфер ТВЕ - Трис-борат-ЭДТА буфер Т5 ДНК-нуклеаза - D15 З'-экзонуклеаза бактериофага Т

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз"

Экспрессия рекомбинантных генов в бесклеточных системах транскрипции-трансляции (БСТТ) становится все более востребованным способом получения белков. Отсутствие механизмов клеточного контроля и возможность манипулировать составом реакционной смеси (добавление редуцирующих агентов, детергентов, ингибиторов протеаз и рибонуклеаз) делают белоксинтезирующие системы единственным возможным способом получения многих белков. Этот подход позволяет решить проблемы, которые могут возникнуть при экспрессии in vivo: цитотоксичность, агрегация, протеолиз, неправильное образование S-S связей. Бесклеточный синтез универсален в геномных исследованиях для скрининга большого количества белков с неизвестными функциями, белковой инженерии in vitro, для получения белков, содержащих тяжелые и радиоактивные изотопы, неприродные аминокислоты.

Технологии бесклеточного белкового синтеза постоянно совершенствуются, предлагаются новые высокоэффективные системы для препаративного получения белков (до 3 мг/мл) с высокой степенью чистоты (до 80%). Это стало возможно благодаря разработке реакторов (обменных и проточных), в которых происходит пополнение компонентов и удаление интермедиатов; оптимизации реакционной смеси (использование клеточного экстракта различной концентрации, добавление деградирующих аминокислот); поиска более эффективных источников регенерации АТФ и ГТФ (пируват оксидаза/флавинадениндинуклеотид, пируват дегидрогеназа/никотинамидадениндинуклеотид); выделения экстракта из мутантных штаммов Escherichia coli, лишенных активностей протеаз и рибонуклеаз.

Другой подход к совершенствованию БСТТ направлен на уменьшение содержания компонентов клеточного экстракта в пользу очищенных составляющих: тРЬПС, РНК-полимераз, ко-факторов транскрипции и трансляции. Это позволяет избежать присутствия нежелательных примесей, более тонко регулировать состав реакционной смеси, изучать функции любого из факторов трансляции. Единственным компонентом, получение которого сегодня невозможно без использования живых клеток — это рибосомы. Работы по созданию искусственной рибосомы начались с попытки получения рекомбинантных рибосомальных белков малой субъединицы рибосомы E.coli, однако это оказалось безуспешным из-за низкого уровня экспрессии генов, что связано с особенностями кодонового состава и наличием устойчивых вторичных структур мРНК. Как ни странно, но кодоновый состав генов таких важных для клетки компонентов, как рибосомальные белки оказался неоптимальным при суперэкспрессии даже в ктетках E.coli, из которых были получены эти гены. Использование БСТТ также не позволило добиться увеличения выхода белков.

Решение этих проблем стало возможно благодаря развитию технологии химико-ферментативного синтеза генов. С его помощью удалось получить оптимизированные гены всех белков 30S субъединицы рибосомы и экспрессировать их в БСТТ с высоким уровнем продукции. Работа по объединению рибосомальных РНК и белков с образованием функциональной рибосомы не окончены. Можно также ожидать, что в ближайшие годы будут синтезированы гены всех белковых компонентов, участвующих в БСТТ, что позволит получать создать систему искусственного происхождения.

Еще одним направлением совершенствования БСТТ может быть использование экспрессируемых генов белков, участвующих в реакции. В этом случае в процессе транскрипции и трансляции происходит наработка необходимых факторов системы и их последующее участие в биосинтезе белка. Это неизбежно приведет к появлению систем нового поколения: саморегулирующихся, саморегенерирующихся и самовосполняющихся, поскольку при использовании данного подхода возможно постоянное пополнение компонентов реакции, запуск регулирующихся и каскадных процессов.

Ингибитор рибонуклеаз (ИР) - это неотъемлемый компонент БСТТ, функция которого заключается в защите РНК от ферментативного гидролиза. Традиционно ингибитор добавляют в реакционную смесь в виде очищенного белка, однако в процессе длительных реакций происходит его инактивация. Мы предположили, что использование ИР в виде экспрессируемого гена может привести к увеличению эффективности работы системы, поскольку в этом случае пополнение активного белка происходит за счет его постоянной продукции.

Целью данной работы было получение бесклеточной системы транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Хаустов, Сергей Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Разработана и применена новая стратегия получения синтетических ДНК, содержащих высокогомологичные повторы, на основе амплификации и объединения одноцепочечных молекул ДНК.

2. Оптимизированный синтетический ген ингибитора рибонуклеаз был экспрессирован в E.coli с выходом 1,5 мг/г биомассы, что на порядок больше, чем при экспрессии нативного гена.

3. Разработана новая схема очистки ингибитора рибонуклеаз без использования иммобилизованной рибонуклеазы А.

4. Получена бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием синтетического экспрессируемого гена ингибитора рибонуклеаз.

Список публикаций, выполненных по теме диссертации

1. Хаустов С.А., Матвиенко Н.И., Железная J1.A. (2008) Получение синтетических генов для молекулярно-биологических исследований на примере человеческого плацентарного ингибитора рибонуклеаз. Российский биомедицинский журнал, том 9, с. 49-62.

2. Хаустов С.А. Матвиенко Н.И., Железная JI.A. (2008) Синтез гена человеческого плацентарного ингибитора рибонуклеаз и его экспрессия в E.coli. Технологии живых систем, №3, с. 35-42.

3. Хаустов СА., Перевязова Т.А., Железная JI.A., Матвиенко Н.И. (2005) Сравнительная эффективность методов синтеза протяженных генов. Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 1, Москва, с. 136.

4. Ткачук А.П., Хаустов С.А. (2006) Клонирование, бактериальная экспрессия и исследование возможного применения в генно-инженерных целях D15 Т5 5',3'-экзонуклеазы бактериофага Т5. Материалы XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006», том IV, МГУ, с. 225.

5. Ткачук А.П., Хаустов С.А. Матвиенко Н.И. (2006) Получение и изучение свойств D15 5',3'-экзонуклеазы бактериофага Т5. Материалы X Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино, с. 55.

6. Ткачук А.П., Хаустов С.А. (2007) Получение и применение человеческого ингибитора рибонуклеаз в бесклеточной системе транскрипции-трансляции. Материалы XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2007», том IV, Изд-во МГУ, с. 136.

7. Хаустов С.А. (2007) Анализ случайных мутаций, возникших при получении искусственного гена rnhl. Материалы XI Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, с. 118.

Заключение

Нуклеотидная последовательность гена ИР была оптимизирована для высокоэффективной экспрессии в клетках E.coli и бесклеточных системах на ее основе. Для получения искусственного гена синтетические олигонуклеотиды были сконструированы и объединены с образованием сегментов гена ИР. Для объединения олигонуклеотидов была разработана новая стратегия с использованием стадий наработки и объединения одноцепочечных молекул ДНК.

Синтетический сегмент АВ гена ИР, полученный с использованием разработанной нами стратегии синтеза генов, содержал большое число мутаций, которые присутствовали во всех проверенных клонах. Анализ мутаций показал, что их возникновение связано преимущественно с особенностями строения гена ИР. Сегмент АВ, не содержащий ошибок удалось получить только при использовании методов исправления мутаций. Нуклеотидная последовательность оставшейся части гена ИР была разбита на менее протяженные сегменты, которые были получены независимо.

Для коррекции возникающих при синтезе и лигировании ошибок ДНК была впервые использована Т5 ДНК-нуклеаза, в результате чего, число клонов, содержащих сегмент необходимой длины, увеличилось примерно в два раза. Клоны, содержащие сегменты гена ИР без мутаций были найдены и использованы для получения полноразмерного гена.

Синтезированный ген ИР был клонирован и экспрессирован в клетках E.coli, причем выход активного белка оказался на порядок выше, чем обычно удается получить при экспрессии нативного гена. Для выделения ИР из клеточного экстракта была разработана новая схема очистки без традиционно применяемой аффинной хроматографии с использованием иммобилизованной рибонуклеазы А, что позволило получить гомогенный белок без примесей рибонуклеазной активности. Для определения активности ИР был разработан новый простой и точный метод, основанный на ингибировании гидролиза РНК рибонуклазой А.

Искусственный ген ИР экспрессировали в БСТТ отдельно и вместе с геном GFP. Впервые показана возможность применения экспрессируемого гена ИР в БСТТ для защиты РНК от гидролизующего действия рибонуклеаз. Использование экспрессируемого гена ИР в БСТТ увеличивает количество мРНК и выход целевого белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хаустов, Сергей Анатольевич, Пущино

1. Бунина З.Ф., Крамаров В.М., Мазанов А.Л., Пачкунов Д.М., Смолянинов В.В., Матвиенко Н.И. BbvII новая сайт-специфическая эндонуклеаза из Bacillus brevis 80. Биоорганическая химия, 1983.9(11), 1578-1582.

2. Валишева И.Б., Крамаров В.М., Убиета Р.Х., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Получение тандемных повторов фрагментов ДНК с помощью сайт-специфической эндонуклеазы типа IIS-BbvII. Структура и биосинтез белков, Пущине, 1988. 2, 17-24.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. 1984, Москва, Мир.

4. Радько С.П., Ильина А.П., Бодоев Н.В., Арчаков А.И. Синтез искусственного генома как основа синтетической биологии. Биомедицинская химия, 2007. 53(3), 237-248.

5. Яковлев Г.И., Митькевич В.А., Макаров А.А. Ингибиторы рибонуклеаз. Молекулярная биология, 2006. 40(6), 962-970.

6. Alakhov J.B., Baranov V.I., Ovodov S. J., Ryabova L.A., Spirin A. S., Morozov; I J. Method of preparing polypeptides in cell-free translation system. 1995. United States Patent 5,478,730.

7. Au L.-C., Yang F.-Y., Yang W.-J., Lo S.-H., Kao C.-F. Gene synthesis by a LCR-based approach: high-level production of leptin-L54 using synthetic gene in Escherichia coli. Biochem. Biophys.Res. Commun., 1998. 248, 200-203.

8. Baedeker M., Schulz G.E. Overexpression of a designed 2.2 kb gene of eukaryotic phenylaianine ammonia-lyase in Escherichia coli. FEBS Letters, 1999. 457, 57-60.

9. Binkowski B.F., Richmond K.E., Kaysen J., Sussman M.R., Belshaw P.J. Correcting errors in synthetic DNA through consensus shuffling. Nucleic Acids Res., 2005.33(6), e55.

10. Blackburn P, Gavilanes J.G. The role of lysine-41 of ribonuclease A in the interaction with RNase inhibitor from human placenta. J. Biol. Chem., 1980.255(22), 10959-65.13.