Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение мажорного белка р50 цитоплазматических мРНП соматических клеток

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение мажорного белка р50 цитоплазматических мРНП соматических клеток"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ _ _ _ л „ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Р Г 5 ОД 1 8 МАК ШО

на правах рукописи УДК 547. 963. 3 -

ЕВДОКИМОВА Валентина Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ МАЖОРНОГО БЕЛКА р50 ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ мРНП СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

03. 00. 03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, член-корр. РАН Л.П. Овчинников Оффициальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.А.Гвоздев, кандидат биологических наук А.С.Степанов.

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится "——-" -—I — 1996 г.

в-часов на Заседании Специализированного Совета Д. 053. 05. 70

при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан " 1996 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Экспрессия генов в клетках эукариот регулируется на нескольких уровнях. Одним из ключевых и наименее изученных уровней такой регуляции является стадия вовлечения свободных неактивных мРНП в полирибосомы. Этот процесс, как правило, контролируется белками, ассоциированными с мРНК - белками мРНП. Некоторые белки мРНП могут быть специфичными по отношению к определенным мРНК и осуществлять селективный контроль их трансляции, другие белки связаны со всеми или почти всеми мРНК клетки и могут отвечать за глобальную регуляцию белкового синтеза.

мРНП, изолированные из различных клеток и тканей, содержат два мажорных белка с молекулярными массами 70 и 50 кДа (р70 и р50). Белок р70 ассоциирован с З'-концевой поли(А)-последовательностью мРНК. Генетические и биохимические исследования показали важную роль р70 в клеточной выживаемости и его участие в инициации трансляции. Функции белка р50 до настоящего времени оставались малоизученными.

Первоначальные исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что белок р50 в ретикулоцитах кролика ассоциирован как с транслируемой мРНК полирибосом, так и с нетранслируемой мРНК свободных мРНП, причем содержание р50 на моль мРНК в полирибосомных мРНП вдвое ниже, чем в свободных неактивных мРНП. Было показано также, что р50 является репрессором трансляции мРНК • свободных мРНП и блокирует белковый синтез in vitro, скорее всего, на стадии инициации.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена исследованию свойств и функций белка р50 в трансляции. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: (1) клонировать и секвенировать кДНК, кодирующую белок р50 ретикулоцитов кролика; (2) исследовать четвертичную структуру р50; (3) определить места связывания р50 на мРНК; (4) сравнить содержание р50 в препаратах цитоплазматических мРНП из различных клеток и тканей; (5) исследовать влияние р50 на трансляцию.

Научная новизна работы. В результате проделанной работы была определена нуклеотидная последовательность кДНК р50 ретикулоцитов кролика. Оказалось, что по своей первичной структуре белок р50 принадлежит к семейству Y-Ьох-связывающих факторов транскрипции. Таким образом, показано, что р50 может контролировать экспрессию генов на двух уровнях: на уровне транскрипции мРНК с Y-box-содержащих генов в ядре и на уровне ее трансляции в цитоплазме.

Было показано, что белок р50 образует гомомультимерные комплексы с молекулярной массой около 800 кДа и при взаимодействии с мРНК вызывает плавление до 60% ее вторичной структуры.

Уведение р50 из бесклеточной системы трансляции путем связывания с Y-Ьох-содержащей ДНК приводит к сильному подавлению белкового синтеза. Следовательно, белок р50 может быть не только репрессором трансляции, но играть позитивную роль в этом процессе.

В целом, полученные в этой работе результаты позволяют по-новому взглянуть на функции р50 в клетке, а также на ту роль, которую играет этот белок в структурной организации цитоплазматических мРНП.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международной конференции "Translational Control" (Колд Спринг Харбор, США, 1994), на Российско-Германском симпозиуме "Molecular and Medical Genetics" (Кельн," Германия, 1995), Французско-Российском симпозиуме "Regulation of Gene Expression" (Новосибирск, 1995) и на ежегодных научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1993, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", посвященный описанию функций белков, взаимодействующих с мРНК в процессе трансляции в клетках эукариот, "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы". Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование и секвеиирование кДНК белка р50 ретикулоцитов

кролика.

Секвеиирование нескольких протеолитических фрагментов белка

р50 из свободных мРНП ретикулоцитов кролика и сравнение

аминокислотных последовательностей этих пептидов с базой данных ТМ

СепВапк показало практически полное совпадение последовательности аминокислот в пептидах р50 с аминокислотными последовательностями белков из семейства У-Ьох-связывающих факторов транскрипции (рис. 1). Исходя из аминокислотных последовательностей пептидов р50 были синтезированы олигонуклеотидные праймеры, использованные для получения кДНК на поли(А+) мРНК из ретикулоцитов кролика и амплификации этой кДНК в полимеразной цепной реакции. Синтезированный 563-нуклеотидный фрагмент был применен в качестве зонда для скрининга экспрессируемой библиотеки кДНК из ретикулоцитов кролика в /,2ЛРН векторе. В результате был идентифицирован клон, содержащий вставку длиной 1,5 тысячи пар нуклеотидов. Открытая рамка считывания в этой последовательности кодирует белок длиной 324 аминокислотных остатка (рис. 1). Этот белок содержит последовательности всех секвенированных пептидов р50.

мРНК, транскрибированная с клонированной кДНК, была транслирована в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Продукт трансляции этой мРНК совпал по подвижности при БОБ-гель электрофорезе с природным р50 из свободных мРНП ретикулоцитов кролика (рис. 2). Таким образом, очевидно, что клонированная нами кДНК содержит полноразмерную последовательность, кодирующую белок р50.

Нуклеотидная последовательность этой кДНК была передана в ТМ

ОепВапк (№ доступа Ш6821). Сравнение аминокислотной последовательности белка р50 с известными членами семейства У-Ьох-связывающих белков (рис. 1) показало, что р50 имеет около 98 % идентичности с белками ЕР1Л крысы, УВ-1/с1ЬрВ человека и 86% идентичности с ЕРЮ У1 Хепория.

pSO MSSEAETQQP PAAPPAAPAL SAAETKPGTT .................CSG AGSGGPGCUT-O

YB-1 .....-........A-..-- ---.....S- .................A------------

MSY1 --------------A-. -----------S- ..............................

KtJSYQ — — ----------h-. . ---------S- .................— - ----------

EF1A ----------- — -A-».—--------S- ..............................

YB3 ----V---EQ ...Q-D.E...G-A-QE .................... ..........

FRG Y1 ----V----Q ...Q-D..-- E...G-A-QE ..............................

FRG Y2 —.---A-E- EPV-QPESE. .PEIQ---IA ..............................

inRNP3 --.- — PRET S-VVQPS-.C .PBIH—DIV..............................

CbpA --EAG-ATTT TTTTLPQAPT £—AAA-QDP APKSPVGSGA PQAAAPAPAA HVA-N---DA

pSO ...............SAAPA GGDKKVIATK VLGTVKWFNV RNGYGFINRH DTKEDVFVHQ-8S

YB-1 .............................. ..............................

MSY1 ----------------------------------------------------------------------

MUSBY -------------------------------------------------- ----------

SFlA ------------------------------------------------------------

YB3 ................P-AP V-E-------------------------------------

FRG Y1 .......... ......P-AT V---------------------------------------

FRG Y2 ................--RM QAN---L--Q -Q----------------------------

iîiRNPJ ................PPM QIN--LL--Q -Q------------------ -S--------

DbpA APAATGTAAA ASLAAA-GSE DAE-—L—------------------------------

Ш) С.....]

pSO TAIKlQîNPRK YliRSVGDGET VEFDWEGEK GAEAAflVTGP CGVPVQGSKY AADRNHYRR.-147

Y3-1 -------------------- -----------E---------------------------.

MSY1 -------------------- -------------------- -------------------.

MUSYB -------------------- ---------------------------------------.

EF1A ---------------------------------------------------------.

YB3 --------------------------D--------------P-----------------.

FRG У1 ----------------------------------------E------------------.

FRG Y2 .......... F----------------------------------K--RP -PN-RRF--R

inRIiP3 ----------F--------- -------------------------K--RP -PNSTRF--Q

DbpA ----------------------------------------D----E--R-----RR---G

p50 .YPRRRGPPR KYQQNYQNSS SGEKNEGSES APEGQ..........AQQRR PYRRRRPPPY-196

YB-1 .--------- — —----------------------------------------------

MSYi .--------- ---------- ----------------------------------------

MUSYB .-----'-------------- ----------------------------------------

EF1A .--------- -----------------------—-------------------------

YB3 .-----------------------A--N------..EGTN .....Q-RPC -R--YPP-F-

FRG Y1 .--------- --------U-----A-EN------...DDS NQQR...... --H-------

FRG Y2 P-RP-ADT.. ..AGESGGEG VSP.........-QMSECER CEETSP—. -Q- — PP-FP

mRNP3 F-RP-ADT.. . .AGESGGEG VSP.........-QMSEGER GEETSP-—. -Q—PP-FP

DbpA Y-GTTT------AGEEEEEG --SSEGFDPP -TDR-FSGAR NQLRRP-Y-P Q—Q------

[III]

p50 YMRRPYGRRP QYSNPPVQ.G . . .EVMEGAD NQG..AÎ5EQ. GRPVRQNMYR GYRPRFRRGP-24 9

YB-1 ...............----- . ..----------..----. --------------------

MSY1 ------A--- ---------- ...-------—..----. --------------------

MUSYB ------A--- ---------- ...-------—..----.--------------------

£F1 A ------A------------- ...----------..----.--------------------

YB3 -S------------V---.- ...-SA-—E S—..----.-----------F--Q-----

FRG Y1 -S —..........A---.- ...-EA----S--..TD--.---A-------F--------

FRG Y2 -R--FRRGPR PNUQQNQGAE VTEQSENKDP VAPTSEALAS -DDPQRPPP- RF-Q----PP

mRNPJ -R--FRRCPR PNNQQNDGAS VTEQSENKDP AAPTSEALAS -DGQQRPPP- RFQQ----PP

DbpA KVGQTFD--S RVLPH-RR.X QAG-1G-MK- GVP..E-A-L AG--KR-PTY RP-Y-S-GP-

[IV]

I.......) [----

pSO PRQRÛPREDG NEEDKENQCD ETQGQ.QPPP S.RYRRNFNY RRRRPDNPKP QD.GKETKAA-306

YB-1 ..........................---Q R.-------------E---. ----------

MSY1 -------------------------.---Q R.-------------E----—.-------

MUSYB --------------------------Q R.-------------E----—.-------

EF1A -------------------------.---Q R.-------------E----—.-------

YB3 --------------------—-SHACHLM R.-------------E----—.-------

FRG Y1 --------E--------------S-.P—Q R.-------------E---S ----------

FRG Y2 RPRPA-QQTP ECG-C-TKAE SGEDPRPE-- RQ-N-PYVQR ---QGATQVA ATAQG-C--E

mRMP3 RPRPP-PQTP EGG-G-AKAE .G.....E-- RQ-N-PYVQR --AQQPPTVQ ATAQ.-S—S

DbpA RPRPA-.AV- EGG-G-TKAE TSGPN. --SV RRG---PY-----P-SS

(V)

.............]

p50 OPPAENSSAP EAEQGGAE-324

YB-1 -------RSR G

MSY1 --------------

MUSYB ..................

EF1A -S.......- ........

YB3 ETS---T--- --------

FRG Y1 ETS---T--- -.......

FRC Y2 PTQHPA-ESG TPSDSPTDDG APVQSSAPDP GIACTPAPS

iaRNPJ PSEHPA-EEG TPSDAPTDDG AFVETSEA.. GVECTTAPE

Рис. 1» Сравнение аминокислотной последовательности р50 с

эукариотическими Y- Ьок-связывающими белками. Последовательность р50 была определена как описано в разделе "Результаты и их обсуждение"; последовательности Y-box белков приведены согласно Wolffe et al., 1992. Совпадающие аминокислотьные остатки обозначены черточками, отсутствующие - точками. Последовательности секвенированных пептидов р50 показаны сверху.

Рис. 2 Анализ продуктов трансляции мРНК, экспрсссироваиной с клонированной кДНК. мРНК была транслирована в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика в присутствии :!Г'3-Ме1. -р50 Меченые продукты трансляции разделяли БОЗ-гель электрофорезом и радиоавтографировали. Бесклеточная система в присутствии 1 мкг мРНК (1), или без экзогенной мРНК (2). Справа показано положение р50 из свободных мРНП ретикулоцитов кролика.

Некоторые члены семейства Y-box-связывающих белков были идентифицированы как факторы транскрипции генов, содержащих Y-Ьох-последовательности в промоторах. Таким образом, мажорный белок мРНП р50 можно рассматривать не только как белок мРНП, репрессирующий трансляцию мРНК, но и как фактор транскрипции, контролирующий экспрессию определенных генов.

2. Анализ первичной структуры белка р50.

Белок р50 имеет рассчитанную pi около 10,0, что близко к эксперементально определенной. Белок богат Arg (11,72%), Gly (12,03%) и Pro (11,11%), содержит один остаток Тгр и не содержит остатков Cys. Рассчитанная молекулярная масса этого белка - 35804 Да, тогда как относительная молекулярная масса природного р50, определенная по подвижности при SDS-гель электрофорезе, составляет около 50000 Да. Это несоответствие, вероятно, объясняется аномальной электрофоретической подвижностью р50, характерной для белков с большим количеством заряженных аминокислотных остатков.

Особенности первичной структуры р50 схематически представлены на рис. 3. В N-концевой половине молекулы белок имеет так называемый домен холодового шока ("Cold shock domain", CSD) длиной 70 аминокислотных остатка, который на 43% идентичен мажорному белку холодового шока бактерий.

R1K2

Рис. 3. Особенности первичной структуры белка р50. CSD - домен холодового шока; El и R2 - мотивы РНП-1 (RNGYGFINR) и РНП-2 (VFVH), соответственно; ® - кластеры основных и ® - кислых аминокислотных остатков.

CSD практически идентичен у всех Y-Ьох-связывающих белков. Он содержит мотивы РНП-1 и РНП-2 и, по данным, имеющимся в литературе, способен связываться как с ДНК, так и с РНК. В домене холодового шока и С-концевой области за ним находятся чередующиеся кластеры отрицательно и положительно заряженных аминокислотных остатков (по четыре кластера каждого заряда). Предполагается, что эта часть белка может участвовать в неспецифическом взаимодействии с мРНК, а также в формировании четвертичных структур за счет белок-белковых взаимодействий.

3. Некоторые свойству. р50 как белка из семейства Y-Ьох-связывающих факторов транскрипции.

Поскольку Y-box-связывающие белки специфически взаимодействуют с ДНК, содержащей Y-Ьох-последовательности, мы проверили, обладает ли р50 такой способностью. Связывание р50 с Y-box -содержащим двухцепочечным олигодезоксирибонуклеотидом (Y-box ds oligo) и случайным ds oligo, не содержащим Y-Ьох-последовательности, было исследовано методом сорбции нуклеопротеидных комплексов на нитроцеллюлозных фильтрах (рис. 4, А,Б). Оказалось, что р50 связывается с меченым Y-box ds oligo в высокой и низкой ионной силе, тогда как неспецифический ds oligo взаимодействует с р50 только при низкой концентрации соли (рис. 4А).

NaCl.mM

s

• • • «

л

Рис. 4. Связывание р50 с ds oligo и

РНК. (А) - комплексы р50 (50 ng) с 10 ng 32P-Y- box ds oligo (верхний ряд) или со случайным ds oligo (нижний ряд) формировали при различных концентрациях NaCl и, затем, реакционную смесь пропускали через нитроцеллюлозные фильтры и фильтры радиоавтографировали; (Б) -связывание р50 с Р-Y-box ds oligo проводили при 300 мМ NaCl в присутствии 100 ng немеченых конкурентов, обозначенных на рисунке.

В экспериментах по конкуренции мы показали также, что глобиновая мРНК эффективно конкурирует с Y-box ds oligo за р50 (рис. 4Б), тогда как, тРНК и рибосомная РНК являются слабыми конкурентами. Возможно, это свидетельствует о некоторой специфичности р50 к мРНК и о перекрывании участков связывания ДНК и мРНК на молекуле р50.

В случае некоторых Y-box-связывающих белков была отмечена их способность к олигомеризации; предполагается, что эти белки образуют крупные белковые комплексы и на ДНК-промоторах. В связи с этим мы исследовали способность белка р50 из свободных мРНП ретикулоцитов кролика образовывать четвертичные структуры. Для этого суммарные белки мРНП анализировали методом гель-фильтрации на колонке FPLC Superóse 6 (рис. 5, А,Б). Белок р50 элюировался в области, соответствующей молекулярной массе около 800 кДа (фракции 7- 9), тогда как другие белки мРНП выходили с колонки согласно молекулярным массам их полипептидных цепей. При центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы р50 седиментировал как гомогенная частица с коэфициентом седиментации около 18S (рис. 6). Таким образом, р50 образует крупные гомоолигомерные комплексы, содержащие около двух десятков молекул р50. Вполне вероятно, что такого рода комплексы белок р50 может образовывать и в составе мРНП.

А

kDo 1 2 3 4 5 6 ? 8 9 10

94- _ '■'■■'Mi'- '

68-

43- í-V «Нч ft*" • ' '

30- y-, <$¡H>*»*'

Б

Рис. 5. Анализ четвертичном структуры белка р50. (А) - белки мРНП разделяли гель-фильтрацией на колонке FPLC Superóse 6 HR/10/30 (Pharmacia). (Б) Полученные фракции анализировали SDS-электрофорезом с последующей окраской Кумасси: (1) - маркеры молекулярной массы; (2) - суммарные белки мРНП; (3-10), фракции 7-14 панели (А). Слева указано положение маркеров молекулярной массы, справа - положение белка р50 из свободных мРНП ретикулоцитов кролика.

направление седиментации

Рис. 6. Седиментация белка р50 в градиенте концентрации сахарозы.

р50, полученный гель-фильтрацией на колонке Superóse 6 (рис. 5А), фиксировали 0.1%

глутаровым альдегидом и центрифугировали в 5-20% градиенте

сахарозы в роторе TLS-55 (Beckman) при 55000 об/мин, 2 часа, 4°С. Вертикальные линии показывают положение 9S глобиновой мРНК, 18S и 28S рРНК.

4. Влияние р50 на вторичную структуру мРНК.

Поскольку р50 узнает специфические последовательности в ДНК возникает вопрос, существуют ли определенные места связывания этого белка на мРНК. Мы попытались ответить на этот вопрос используя метод футпринтинга. Для этого а-глобиновую мРНК, меченную по З'-концу, смешивали с р50 и после образования комплексов инкубировали с РНКазой Т1 при двух разных концентрациях фермента. Контролями служила а-глобиновая мРНК, инкубированная с РНКазой без белка р50, а также мРНК, инкубированная с р50 без РНКазы. После инкубации РНК анализировали методом электорфореза в полиакриламидном геле в присутствии 6 М мочевины (рис. 7).

К нашему большому удивлению, р50 не только не защищал мРНК от деградации рибонуклеазой, но, наоборот, повышал ее чувствительность к ферменту (сравни дорожки 2-3 и 4-5). Сам белок РНКазной активностью не обладал (дорожка 6). Мы предположили, что усиление чувствительности мРНК к РНКазе в присутствии р50 было вызвано плавлением вторичной структуры мРНК на поверхности белковой глобулы.

Для проверки этого предположения было исследовано влияние р50 на спектр кругового дихроизма (КД) мРНК (рис. 8). Спектр КД комплексов

р50-мРНК при массовом соотношении белок:РНК 4:1 при 20°С, совпадал

со спектром свободной мРНК при 50°С. Количество вторичной структуры, сохранившейся в таких комплексах, можно оценить как 40% от исходной.

Рис. 7 Влияние р50 на чувствительность мРНК к РНКазе Т1.

3'-32Р-меченную <х-глобиновую мРНК инкубировали с

РНКазой Т1 в присутствии или в отсутствие р50 как обозначено. Продукты реакции разделяли электрофорезом в геле, содержащем 6 М мочевины. На рисунке показан радиоавтограф геля. Стрелками

обозначено положение маркеров,

ксиленцианола (ХС) и бромфенолового синего (В).

Таким образом, очевидно, что р50 плавит вторичную структуру мРНК и, следовательно, мРНК в составе мРНП-комплексов имеет конформацию, отличную от конформации свободной мРНК. Экспонированность мРНК для действия РНКазы может свидетельствовать также о поверхностном расположении расплавленной мРНК на белке р50. Вполне вероятно, что мРНК в составе мРНП располагается на поверхности крупных белковых частиц, образованных р50, и что структурная упаковка мРНК в цитоплазматических мРНП напоминает упаковку ДНК на поверхности нуклеосом или упаковку гетерогенной ядерной РНК на поверхности информофер.

1и/т1 0.1и/т1

Г^Аве Т1 - + -

р50 - + - + - +

тйЫА 4- + + + + + ■

• * • А

? 1 9

1 1

1 * •

* *

* — ХС

А

а * * \ \ —в

•

• 2 3 4 5 в

Рис. 8 Влияние р50 на спектр кругового дихроизма мРНК. 8 мкг а-

глобиновой мРНК смешивали с различными количествами р50. (1-3) -спектр КД мРНК при 20, 50 и 70°С, соответственно. (4-9) - спектр мРНК при 20°С в присутствии 0,4, 0,8, 1,2, 6,4, 12 и 36 мкг р50. (10) - спектр р50. Вставка - влияние р50 на КД мРНК при 260 нм.

5. Влияние белка р50 на трансляцию мРНК in vitro.

В предварительных эксперименах мы показали , что Y-box ds oligo избирательно связывается в лизате ретикулоцитов кролика только с белком р50 (рис. 9). Это свойство было использовано для селективного связывания р50 в бесклеточной системе трансляции.

Рис. 9. Анализ специфичности связывания Y-box ds oligo с белками лизата ретикулоцитов кролика.

Белки разделяли SDS-гель электрофорезом, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, ренатурировали и инкубировали с 32Р-меченным Y-box ds oligo. (1) - 0,5 мкг р50; (2) - 60 мкг суммарных белков лизата ретикулоцитов кролика.

1 2

Оказалось, что добавление этого олигонуклеотида приводит к полному подавлению трансляции в бесклеточной системе с экзогенной мРНК (рис. 10А) и значительному подавлению (примерно на 50%) в системе с эндогенной мРНК (рис. 10Б). Неспецифический ds oligo такого эффекта не оказывал. Прединкубация Y-box ds oligo с р50 устраняла его ингибиторное действие. Этот результат свидетельствует о том, что р50 необходим для процесса трансляции и может рассматриваться как еще один, ранее неизвестный, фактор трансляции. Поскольку специфический ds oligo оказывал более сильное влияние на белковый синтез в бесклеточной системе с экзогенной мРНК, можно предположить, что р50 необходим главным образом для вовлечения в трансляцию новых матриц и, возможно, способствует посадке на мРНК первой рибосомы.

Рис. 10. Влияние ds oligo на белковый синтез в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Лизаты ретикулоцитов кролика с эндогенной (А) и экзогенной (Б) глобиновой мРНК прединкубировали со специфическим Y-box ds oligo ( —я— ) или со случайным ds oligo ( — •— ). Белок-синтезирующую активность этих лизатов определяли по включению 14C-Leu,

6. Идентификация белка р50 в составе мРНП различных соматических

клеток.

В ретикулоцитах кролика основная масса мРНК, с которой ассоциирован р50, является глобиновой мРНК. Возникает вопрос, в какой степени р50 специфичен к определенным мРНК. Чтобы ответить на этот вопрос мы проанализировали препараты суммарных мРНП из мышц кролика и печени крысы (рис. 11 А). Оказалось, что во всех препаратах мРНП присутствует мажорный компонент с молекулярной массой около 50 кДа, который связывает антитела к р50 из свободных мРНП ретикулоцитов кролика примерно в той же степени, что и р50 из мРНП ретикулоцитов кролика. Кроме того, оказалось, что иммунологически родственный или тождественный белок с молекулярной массой 50 кДа присутствует также в полирибосомных мРНП ретикулоцитов кролика (рис. 11Б).

Таким образом, р50 является мажорным компонентом различных мРНП соматических клеток и, следовательно, связан со всеми или почти всеми клеточными мРНК.

1 2 3 12 3 4

р50—» '

--С—зо

А Б

Рис. 11. Обнаружение р50 в свободных и полирибосомных мРНП из различных тканей. (А) - белки свободных мРНП ретикулоцитов кролика (1), печени крысы (2) и мыщц кролика (3) были разделены ББв-гель электрофорезом. Слева показаны иммуноблоты с анти-р50 антителами; справа - окраска Кумасси. (4) - маркеры молекулярного веса. (Б) - белки свободных (1) и полирибосомных (2) мРНП ретикулоцитов кролика. Слева - иммуноблот; справа - окраска Кумасси.

выводы

1. Клонирована и секвенирована кДНК мажорного белка р50 из свободных мРНП ретикулоцитов кролика. Показано, что по своей аминокислотной последовательности р50 принадлежит к семейству Y-Ьох-связывающих белков, ранее описанных как факторы транскрипции. Таким образом, р50 может регулировать экспрессию генов на двух уровнях: на уровне транскрипции Y-Ьох-содержащих генов и на уровне трансляции цитоплазматических мРНК.

2. Исследованы некоторые свойства белка р50. Показано, что:

а) р50, как и другие белки семейства Y-Ьох-связывающих факторов транскрипции, обладает способностью специфически связывать двухцепочечный олигодезоксирибонуклеотид, содержащий Y-box-последовательность;

б) р50 в отсутствие мРНК образует гомоолигомерный комплекс с молекулярной массой около 800 кДа и коэфициентом седиментации около 20S;

(в) при взаимодействии с мРНК р50 усиливает доступность мРНК к действию РНКазы и плавит до 60% ее вторичной структуры.

Предположено, что роль р50 может состоять в структурной организации и упаковке эукариотических мРНК.

3. Показано, что специфическое связывание эндогенного р50 Y-box-содержащей ДНК в лизате ретикулоцитов кролика приводит к подавлению белкового синтеза. Таким образом, р50 может быть не только репрессором трансляции, но, при определенных условиях, функционировать как фактор трансляции.

4. Показано, что р50, или иммунологически родственные ему белки с той же относительной молекулярной массой, являются мажорными компонентами цитоплазматических мРНП различных соматических клеток, причем находятся в составе как свободных, неактивных мРНП, так и полирибосомных транслируемых мРНП. Таким образом, комплекс мРНК с р50 является универсальной формой существования мРНК в клетках эукариот.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Evdokimova, V.M., Sitikov, A.S., Simonenko, P.N., Lazarev, O.A., Vasilenko, K.S., Ustinov, V.A., Wei, C.-L., Hershey, J.W.B., and Ovehinnikov, L.P. The Major Protein of Messenger Kibonucleoprotein Particles in Somatic Cells is a Member of the Y-box binding Transcription Factor Family. Abstracts of papers presented at the 1994 meeting on "Translational Control", p. 280, Cold Spring Harbor, New York.

2. Evdokimova, V.M., Wei, C.-L., Sitikov, A.S., Simonenko, P.N., Lazarev, O.A., Vasilenko, K.S., Ustinov, V.A., Hershey, J.W.B., and Ovehinnikov, L.P. The Major Protein of Messenger Ribonueleoprotein Particles in Somatic Cells is a Member of the Y-box binding Transcription Factor Family. J. Biol. Chem. (1995) 270, N7, 3186-3192.

3. Устинов, B.A., Скабкин, M.A., Нащекин, Д.В., Евдокимова, В.М. и Овчинников, Л.П. Мажорный белок мРНП ретикулоцитов кролика, р50: экспрессия в E.coli, выделение и некоторые свойства рекомбинантного белка. Биохимия (1996), 61, N3 (принято в печать).