Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние мажорного белка цитоплазматических мРНП р50 на трансляцию мРНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние мажорного белка цитоплазматических мРНП р50 на трансляцию мРНК"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В.ЛОМОНОСОВА

на правах рукописи УДК 547. 963. 3

КОВРИГИНА

Елизавета Александровна

ВЛИЯНИЕ МАЖОРНОГО БЕЛКА ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ мРНП р50 НА ТРАНСЛЯЦИЮ мРНК

03. 00. 03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

академик РАН, профессор Л.П. Овчинников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.В. Скарлат, доктор биологических наук A.A. Преображенский

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН .

Защита диссертации состоится -Й- 998г.

/л 1

б ) часов на Заседании Специализированного Совета Д. 053. 05. 70

при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологичеи факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

Ш (JUb^ijj 1998г.

В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Процесс экспрессии генов в эукариотических клетках контролируется на множестве уровней. Особое место в системе такого контроля принадлежит семейству белков, известных как белки с доменом "холодового шока". Белки этого семейства узнают специфические последовательности ДНК (Y-боксы) в промоторах генов и контролируют процесс транскрипции мРНК (Sommerville, 1992). Те же самые белки входят в состав цитоплазматических мРНП в качестве мажорных структурных компонентов и контролируют трансляцию мРНК. Белки р54/р56 из этого семейства отвечают за маскированное состояние мРНК в ооцитах Xenopus levies (Richter and Smith, 1991). Белок p50 ретикулоцитов кролика, также принадлежащий к этому семейству, может оказывать как позитивное, так и негативное действие на белковый синтез в бесклеточной системе в зависимости от его количества на мРНК. При весовом соотношении р50/мРНК около двух, что характерно для транслируемых мРНП полирибосом, белок выполняет функцию фактора трансляции. При более высоком соотношении р50/мРНК, характерном для свободных. нетранслируемых мРНП, белок выступает в качестве репрессора трансляции (Minich and Ovchinnikov, 1992). Сродство р50 к мРНК и, как следствие, его количество на матрице может изменяться в результате фосфорилирования. До недавнего времени оставалось неисследованным, на какие стадии белкового синтеза оказывают влияние белки с доменом холодового шока.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы заключалась в исследовании механизма действия р50 на трансляцию. В связи с этим были посавлены следующие задачи: 1) исследовать как функциональная инактивация р50 повлияет на трансляцию эндогенных и экзогенных мРНК in vitro; определить стадию белкового синтеза, требующую участия р50. 2) исседовать влияние экзогенного р50 на бесклеточную систему трансляции; определить стадию белкового синтеза, ингибируемую р50.

Научная новизна работы. В результате проделанной работы впервые показано, что мажорный белок цитоплазматических мРНП р50 необходим для эффективного белкового синтеза на стадии инициации трансляции. р50 не требуется для образования 48 S преинициаторного комплекса, но необходим на одной из последующих стадий процесса

инициации. При увеличении соотношения р50/мРНК в бесклеточной системе трансляции происходит ингибирование белкового синтеза на стадии инициации, которое сопровождается накоплением мРНК в форме свободных мРНП.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международной конференции "Translational Control" (Колд Спринг Харбор, США, 1996), на Всеросийском биохимическом съезде (Москва, 1997), на Конференции молодых ученых (Пущино, 1997), на ежегодных научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1994 , 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных

работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", посвященный подробному описанию механизмов инициации трансляции эукариот, "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы". Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование позитивной роли мажорного белка мРНП р50 в трансляции

1.1. Иммунонейтрализация р50 в лизатах ретикулоцитов кролика приводит к полному подавлению их белок-синтезирующей активности

Для подтверждения позитивной роли р50 в трансляции было исследовано влияние на этот процесс in vitro моноспецифических антител к р50. Добавление антител в бесклеточную систему трансляции из ретикулоцитов кролика приводило к сильному подавлению белкового синтеза как на эндогенной, так и на экзогенной глобиновой мРНК. Неспецифические IgG из неиммунизированных животных, взятые в качестве контроля, оказывали лишь незначительной влияние на белковый синтез (рис. 1).

Чтобы убедиться, что ингибирование белкового синтеза под действием антител к р50 обусловлено функциональной инактивацией этого белка, р50 был удален из лизатов ретикулоцитов, обработанных микрококковой

нуклеазой, путем его иммуноадсорбции на белокА-сефарозе. Белок-синтезирующая активность таких лизатов постепенно снижалась по мере удаления р50 вплоть до их полной инактивации (рис. 2). Добавление чистого препарата р50, синтезированного с плазмиды в Е. coli и, следовательно, свободного от примесей других эукариотических белков, в инактивированные лизаты полностью восстанавливало белковый синтез или сильно его стимулировало (рис. 3). Этот эксперимент однозначно свидетельствует в пользу того, что р50 необходим для эффективной работы аппарата трансляции.

анти-р50 IgG преиммунные IgG

8 О IgG, мкг

Рис. I. Моноспецнфичсскне янти-р50 1а(; нигибируют трансляцию эндогенной и экзогенной глобиновой мРНК в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика. Лизаты ретикулоиитов кролика (15 мкл) с эндогенной (Л) или экзогенной (0,5 мкг) мРНК (Б) прединкубировали с указанными количествами антител или преиммунных 10 мин при 0"С. Белок-синтезирующую активность лизатов определяли по включению [14С]1_еи в бело* в течение 60 мни при 30°С.

25 п

20

я

s 2 \ С

s

s p~

V ij

0 so

s к

01 B" 2 4 a

m

15

10 -

5 -

-•— анти-р50 IgG — преиммунные IgG

0.0 0.2 0.4 0.6

IgG, мг/мл

0.8

Рис. 2. Удаление p50 in лизата ретикулоцитов кролика с помощью антител приводит к потере способности транслировать мРНК. Лизаты (200 мкл), обработанные микрококковой нуклеазой, прединкубировали с указанными количествами анти-р50 IgG или преиммунных IgG 10 мин при 0°С и пропускали через белокА-сефарозу. К порциям лизатов (15 мкл) добавляли глобиновую мРНК. Белок-синтезирующую активность определяли по включению [14C]Leu. Вставка: Western иммунноблот исходного лизата и лизатов, истощенных с помощью антител против р50. Порции лизатов (3 мкл),

р50, мг

лизат, заннгибированный антителами к р50

- на эндогенной мРНК I I - на экзогенной 98 глобиновой РНК лизат после нммуноадсорбции р50 I I - на экзогенной 9Б глобиновой мРНК

Рис. 3. Очищенный р50 стимулирует трансляцию в бесклеточньи системах из ретикулоцнтов кролика с нейтрализованным или удаленным р50. Указанные количества р50 добавляли к 15 мкл лизатов, в которых р50 был неГгтрализован или удален с помощью антител. Белок-синтсзирующую активность таких лизатов определяли по включению [иС]Ьеи в белок и выражали в процентах от включения ИС в лизатах, прошедших идентичную обработку в отсутсвие антител. А - сильное ингибирование: лизаты нейтрализовали 6 мкг или иммуноистощали 12 мкг анти-р50 ^С. Б - умеренное ингибирование. лизаты нейтрализовали 3 мкг или иммуноистощали 6 мкг анти-р50

1.2. Ингибирование белкового синтеза при иммунонейтрализации р50 не обусловлено ускорением распада мРНК Логично было бы предположить, что связывание или удаление мажорного белка мРНП р50 из клеточных лизатов ведет к ускорению распада мРНК, что и является причиной ингибирования белкового синтеза. Для проверки этого предположения лизаты с иммунонейтрализованным р50 инкубировали в условиях бесклеточной системы трансляции. Матричная активность суммарной РНК, полученной из таких лизатов, была сравнена с матричной активностью препаратов суммарной РНК из исходного лизата и из лизата, инкубированного в условиях бесклеточной системы трансляции без антител. Оказалось, что активность трех перечисленных препаратов РНК была совершенно одинакова (рис. 4А) и во всех трех случаях синтезировался полноразмерный глобин (рис. 4В). Это означает, что инактивация р50 за счет его связывания антителами не приводит к ускорению деградации мРНК лизата. Следовательно, ингибирование белкового синтеза антителами к р50 не обусловлено ускорением распада мРНК.

А Б

1 трансляция ретрансляция

3020* -глоб,ш

1 2 3 4 5

м

РНК, мкг/мл

Рис. 4. Ингибирование белкового синтеза в лизатах ретикулоцитов кролика анти-р50 1ёС не обусловлено деградацей мРНК.

Бесклеточную систему' трансляции (15 мкл лизата) инкубировали в отсутствие (-) и в присутствии (+) анти-р50 антител в течение 60 мин при 30"С. После инкубации из обеих систем, а также из исходного лизата. выделяли суммарные препараты РНК и ретранслировали в лизате ретикулоцитов кролика, обработанном микрококковой нуклеазой.

А - радиоавтограф продуктов трансляции, меченных [~'55]Ме1 в течение 60 мин при 30"С и разделенных БОБ-ПААГ электрофорезом. I - «сходный лизат с эндогенной мРНК в отсутствие антител, 2 - исходный лизат в присутствии 8 мкг анти-р50 ^О, 3 - лизат, обработанный микрокковой нуклеазой. с суммарным препаратом РНК из лизата, инкубированного в отсутвие антител, 4 - лизат, обработанный микрокковой нуклеазой, с суммарным препаратом РНК из лизата, инкубированного в присутствии анти-р50 1§0, 5 -лизат, обработанный микрокковой нуклеазой без добавления РНК Б - включение [|4С]Ьеи в белок в зависимости от концентрации суммарной экзогенной РНК из исходного лизата

(-•-) и лизатов, инкубированных в течение 60 мин при 30"С с анти-р50 1§0 (-А-) или без антител (-■-).

1.3. Иммунонейтрализация р50 приводит к ускорению распада полирибосом.

Стадия трансляции, на которую действует ингибитор, может быть определена путем анализа профиля полирибосом: распад полирибосом указывает на преимущественное ингибирование инициации, в то время как накопление полирибосом и увеличение их размера говорит о преимущественном ингибировании элонгации и/или терминации.

Сравнение профилей полнрибосом после инкубации лизатов с антителами к р50 и без антител в условиях бесклеточной системы трансляции показано на рис. 5. Видно, что короткая трех-минутная инкубация без антител или с преиммунными 1дО не приводит к заметным изменениям количества полнрибосом по сравнению с их содержанием в исходном лизате (рис. 5А,Б,В). Однако инкубация с антителами к р50 в течение того же времени ведет к полному распаду полирибосом. Распад полирибосом сопровождается переходом радиоактивномеченного новосинтезированного пептида в зону седиментации свободного белка (рис. 5Г). Распад полирибосом говорит в пользу того, что трансляция ингибируется преимущественно на стадии инициации.

254 0.010

0.008 -

0.006

0.004

0.002 Ч 0.000

80 Э

I

0

1 Г 2 4

1-1 I Г

6 8 10 12

"I—I-1 Г

0 2 4 6 8 10 12

0.008 -

0.004

0.000

0 2 4 6 8 10 12

— —I—|—I—г О 2 4 6 8 10 12

4200 3500 2800 2100 1400 700 0

С.

Фракции

Р

Рис. 5. Анти-р50 ^С стимулируют распад полирибосом в бесклеточных системах трансляции из ретикулоцитов кролика. Лизаты ретикулоцитов кролика (15 мкл) с эндогенной мРНК инкубировали в течение 10 мин при 0°С и с [,4С]Ьеи в течение 2 мин при 30°С. Лизаты центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы. А - исходный лизат (контроль). Б - лизат, инкубированный без антител. В - лизат, инкубированный с 8 мкг преиммунных Г - лизат, инкубированный с 8 мкг анти-р50

IА. Иммунонейтрализация р50 в лизате не изменяет скорости элонгации и терминации Среднее время элонгации+терминации полипептидных цепей (transit time) может быть количественно определено по измерению кинетики включения радиоактивных аминокислот в общий белок и в завершенные полипептидные цепи, освобожденные с рибосом (Fan and Pennman, 1972). Метод был использован для определения влияния антител к р50 на скорость элонгации+терминации. Эта скорость для глобина в контрольной бесклеточной системе трансляции оказалась равной 1,4 мин. В системе, ингибированной антителами к р50, время элонгации+терминации оказалось тем же самым (рис. 6). Это означает, что р50 не требуется на стадии элонгации и терминации и, значит, необходим только на стадии инициации белкового синтеза.

Рис. 6. Анти-р50 Г(*С не влияют на скорость элонгацин/терминации полипептидных цепей. Лизаты ретикулоцитов кролика с эндогенной мРНК (15 мкл) инкубировали без антител (А) или с 38 мкг анти-р50 (Б) 10 мин при 0°С и затем с [14С]Ьеи в течение указанного времени при 30°С. Поли- и монорибосомы осаждали центрифугированием. Включение радиоактивности в белок измеряли в супернатанте (Бюз) и в рибосомнон фракции (полирибосомы). Скорость элонгации/терминации получали умножением на два расстояния вдоль оси времени между "суммарной" (Эш) и "пострибосомной" линиями.

1.5. Иммунонейтрализация р50 в лизате ретикулоцитов кролика приводит к ингибированию инициации трансляции прокариотической

мРНК

В проведенных экспериментах удаление р50 оказывало влияние на инициацию эукариотических мРНК с кэп-структурой на 5'-конце и с поли(А)-последовательностью на 3'-конце. Чтобы проверить, как повлияет удаление р50 на трансляцию некэпированной бактериальной мРНК, мРНК ß-галактозидазы Е. coli транслировали в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика без добавления антител и с антителами к р50. Синтез ß-галактозидазы в этой системе занимал значительное время и полноразмерный продукт появлялся только к сороковой минуте инкубации (рис. 7А). Антитела к р50, добавленные в начальный момент времени, полностью подавляли синтез ß-галактозидазы (рис. 7Б). В то же время, антитела к р50, добавленные через 10 мин инкубации системы, когда инициация белкового синтеза уже произошла, не влияли на количество и время появления полноразмерного продукта (рис. 7В). Таким образом, р50 требуется для трансляции не только эукариотической, но и бактериальной некэпированной мРНК, при этом он необходим только на стадии инициации.

В

кДа

9467433020-

5 1020 405 10 20 40 5 1020 40 Время, мин

Рис. 7. Анти-р50 ^С кнгибируют инициацию, но не элонгацию синтеза прокариотической Р-галактозидазы в бесклеточиой системе -р-гал трансляции из ретикулоцитов кролика. Реакции трансляции проводили с мРНК Р-галактозидазы Е.соЦ без антител (А) или в присутутствии 8 мкг анти-р50 добавленных в нулевое время инкубации (Б) или через 10 мин после начала инкубации (В). В указанное время отбирали пробы по 3 мкл. Продукты

трансляции, меченные S-Met, разделяли SDS-ПААГ электрофорезом и детектировали радиоавтографией.

1.6. Иммунонейтрализация р50 в лизате ретикулоцитов кролика приводит к накоплению 48 S преинициаторного комплекса Известно, что процесс вовлечения мРНК в белковый синтез -сложный, многоступенчатый процесс, подразделяющийся на несколько основных этапов:

1) взаимодействие мРНК с факторами инициации трансляции;

2) присоединение к комплексу мРНК с факторами инициации малой субчастицы рибосом с инициаторной Met-IRNA, с образованием 48 S преинициаторного комплекса;

3) продвижение малой субчастицы рибосом вдоль 5' нетранслируемой последовательности мРНК до инициирующего кодона (сканирование мРНК);

4) присоединение 60S субъчастицы рибосом с образованием 80S комплекса.

80S 60S 40S ! I I

в

80S 60S 40S

0.002 -

I I I I II Г

0 2 4 6 8 1012 14 16 0 2 4 6 8 1012 1416 0 2 4 6 8 1012 1416

Фракции

Рис. 8. Аити-р50 ^С вызывают накопление 485 преинициаторного комплекса.

Лизаты ретикулоцитов кролика с эндогенной мРНК ннкубировали в условиях бесклеточной системы трансляции в течение 15 мин при 30°С для распада полирибосом. К пробам добавляли 8 мкг анти-р50 ^О (Б) или 5 мкМ эдеина (В). Инкубацию продолжали в течение 10 мин при 0°С, и еще 7 мин при 30°С. А - инкубацию проводили без добавления или эдеина (контроль). Пробы центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы. Относительное количество а-глобиновой мРНК определяли гибридизацией с 32Р-меченной а-глобиновой кДНК

Чтобы определить этап инициации, требующий участия р50, бесклеточную систему инкубировали с антителами к р50. После инкубации систему фракционировали центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы и распределение мРНК анализировали гибридизацией с меченой а-глобиновой кДНК. На рис. 8Б видно, что вся а-глобиновая мРНК обнаруживается в виде 48 Б преинициаторного комплекса. В контрольной системе, инкубированной без антител, основная часть а-глобиновой мРНК находилась в зоне 80 Б (рис. 8А). Это означает, что р50 не требуется для присоединения к мРНК малой субчастицы рибосом, но необходим на последующих стадиях процесса инициации, приводящих к образованию 80 Б комплекса: это может быть сканирование мРНК или присоединение 60 Б субчастицы рибосом.

2. Исследование механизма действия мажорного белка мРНП р50 как репрессора трансляции

2.1. Добавление р50 в бесклеточную систему трансляции вызывает ингибирование белкового синтеза Ранее было показано, что добавление р50 в бемслеточную систему трансляции, заингибированную избытком глобиновой мРНК, приводит к восстановлению ее трансляции, но дальнейшее добавление р50 ингибирует белковый синтез. Было высказано предположение, что р50 при высоком соотношении р50/мРНК является репрессором трансляции (МтюЬ е! а!., 1990). Для проверки этого предположения в данной работе было исследовано влияние очищенного препарата белка р50, синтезированного с плазмиди в клетках Е.соИ, на синтез белка в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика. Оказалось, что добавление увеличивающихся количеств р50 приводит к ингибированию трансляции как на эндогенной мРНК лизата, так и на экзогенной глобиновой мРНК (рис. 9).

А Б

р50, мкг

Рис. 9. Добавление р50 в лизаты ретикулоцитов кролика приводит к ингибированию белкового синтеза. Указанные количества р50 были добавлены в бесклеточные системы трансляции с 15 мкл лпзата с эндогенной (А) и 0,5 мкг экзогенной глобиновой мРНК (Б). Белок-синтезирующую активность лизатов определяли по включению [|4С]Ьеи.

2.2. Ингибирование битового синтеза под действием р50 не связано с деградацией или функциональной инактивацией мРНК Чтобы проверить состояние мРНК в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика, инкубированной в присутствии дополнительного экзогенного р50, суммарная РНК из такой системы была разделена электрофоретически и, после переноса на мембрану, гибридизована с замеченной а-глобиновой кДНК. На радиоавтографе видно, что кДНК выявляет в таком препарате только одну полосу, соответствующую а-глобиновой мРНК, которая не отличается по размеру и интенсивности от соответствующей полосы в препаратах РНК, полученных из неинкубированного лизата и из бесклеточной системы, инкубированной без добавления экзогенного р50 (рис. 10 А). Таким образом, р50, ингибирующий белковый синтез, не вызывал заметной деградации а-глобиновой мРНК. Чтобы проверить, не происходит ли функциональная инактивация мРНК в системе, ингибированной р50, суммарная РНК, выделенная из системы после ее инкубации, была транслирована в бесклеточной системе, обработанной микрококковой нуклеазой (рис. 10Б). Матричная активность такой РНК оказалась сравнимой с матричной активностью РНК, выделенной из исходного лизата и из лизата,

инкубированного в условиях бссклеточной системы без р50. Во всех случаях при трансляции синтезировался полноразмерный глобин (рис. 10В). Таким образом, ингибирование белкового синтеза в бесклеточной системе под действием экзогенного р50 не обусловлено деградацией или . функциональной инактивацией мРНК.

Рис. 10. Добавление р50 в бесклеточную систему трансляции не вызывает деградации или функциональной инактивации мРНК лизата ретикулоцитов кролика. Бесклеточную систему трансляции (15 мкл лизата) инкубировали в отсутсвие и в присутствии 6 мкг экзогенного р50 в течение 60 мин при 30°С. После инкубации из обеих систем, а также из исходного лизата, выделяли суммарные препараты РНК, ретранслировали их в лизате ретикулоцитов кролика, обработанном микрококковой нуклеазой и тестировали на присутствие глобиновой мРНК гибридизацией с фрагментом а-глобиновой кДНК после электрофореза. А - радиоавтограф продуктов трансляции, меченных ["5]Ме1 в течение 60 мин при 30' С и разделенных 8Г)8-ПААГ электрофорезом. 1 - лизат, обработанный микрокковой нуклеазой без добавления РНК, 2 - исходный лизат на эндогенной мРНК в отсутствие р50, 3 - исходный лизат в присутствии 6 мкг р50, 4 - лизат, обработанный микрокковой нуклеазой, с суммарным препаратом РНК из лизата, инкубированного в отсутвие р50, 5 - лизат, обработанный микрокковой нуклеазой, с суммарным препаратом РНК из лизата, инкубированного в присутствии р50. Б - включение [14С]Ьеи в белок в зависимости от концентрации суммарной экзогенной РНК из исходного лизата ( -•- ) и лизатов, инкубированных в

течение 60 мин при 30°С без добавления р50 ( ) или с р50 ( -л.- ). В - радиоавтограф

препаратов РНК, разделенных электрофорезом и гибридизованных с 32Р-меченным фрагментом а-глобиновой кДНК: 1 - РНК исходного лизата, 2 - РНК лизата, инкубированного в течение 60 мин при 30°С, 3 - РНК лизата, инкуоированного в течение 60 мин при 30°С в присутствии 6 мкг р50.

2.3. Ингибирование белкового синтеза под действием р50 сопровождается распадом полирибосом

Как было сказано в разделе 1.3, стадию белкового синтеза, на которую действует ингибитор, можно определить по его влиянию на количество и размер полирибосом. Оказалось, что добавление в бесклеточную систему трансляции р50 приводит к полному распаду полирибосом уже за 3 мин, в то время как в контрольном лизате, инкубированном в условиях бесклеточной системы трансляции то же время, профиль полирибосом не отличался от профиля полирибосом исходного лизата (рис. 11). Быстрый распад полирибосом означает, что ингибирование белкового синтеза под действием р50 происходит преимущественно на стадии инициации.

^254 0 010

0 008

А

В

10 12 0 2 Фракции

6 8 10 12

!Г 2

а

и

Рнс. 11. Добавление р50 в бесклегочную систему трансляции из ретикулоцитов кролика стимулирует распад полирибосом. Лизаты ретикулоцитов кролика (15 мкл) инкубировали в течение 5 мин при 30"С в условиях бесклеточнои системы трансляции без добавок (Б) или с 6 мкг р50 (В). Размер полирибосом анализировали центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы. А - полирибосомный профиль исходного лизата

2.4. р50 подавляет присоединение к мРНК малой субчастицы рибосом.

Чтобы определить этап инициации трансляции, ингибируемый р50, были проанализированы комплексы, в которых накапливается а-глобиновая мРНК. Для этого бесклеточную систему трансляции с эндогенной мРНК инкубировали в присутствии ингибирующих количеств р50 и затем центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы.

А

254

0.006

0.004

0.002

0.000

1 Г 10 12 14

Фракции

Рис. 12. Добавление р50 в бесклеточную систему трансляции приводит к накоплению а-глобиновой мРНК в зоне свободных мРНП. Лизаты ретикулоцитов кролика (15 мкл) инкубировали в условиях бесклеточной системы трансляции без добавок (А) и с 6 мкг р50 (Б) в течение 3 мин при 30°С. Пробы фракционировали центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы. Распределение а-глобиновой РНК во фракциях градиента анализировали МопЬегп-гибридизацией с 32Р-меченным фрагментом кДНК а-глобина. Распределение 355-р50 анализировали радиоавтографией после БОЗ-ПААГ электрофореза.

Распределение а-глобиновой мРНК анализировали гибридизацией с а-глобиновой меченой кДНК. Оказалось, что основная часть мРНК а-глобина обнаруживается в зоне с коэффициентом седиментации около 20 Б, соответствующей положению свободных мРНП (рис. 12Б). Интересно, что добавленный в бесклеточную систему 35Б-р50 находится в тех же фракциях, что и эндогенная мРНК лизата (рис. 12Б). Таким образом, добавленный р50 связывался с мРНК и препятствовоал присоединению к 16

ней малой субчастицы рибосом. Нельзя также исключить, что р50 ингибирует предшевствующую стадию процесса инициации, а именно взаимодействие мРНК с факторами инициации трансляции.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что функциональная инактивация мажорного белка мРНП, р50, в лизатах ретикулоцитов кролика или его удаление делает лизаты полностью неактивными в белковом синтезе на эндогенных и экзогенных мРНК. При добавлении в такие неактивные лизаты экзогенного р50 происходит многократная стимуляция или полное восстановление белкового синтеза. Эти результаты подтверждают предположение о позитивной роли р50 в трансляции.

2. Ингибирование белкового синтеза в результате функциональной инактивации р50 не связано с деградацией или функциональной инактивацией мРНК. Ингибирование сопровождается распадом полирибосом и освобождением с рибосом растущего пептида. Ингибирование не влияет на скорость элонгации и терминации. Таким образом, р50 необходим на стадии инициации белкового синтеза.

3. При функциональной инактивации р50 мРНК накапливается в виде 48 Б лреинициаторного комплекса. Это означает, что р50 необходим на этапе присоединения 60 в субчастицы рибосом к 48 Б преинициаторному комплексу или на предыдущем этапе сканирования 5'-нетранслируемой области мРНК малой субчастицей рибосом.

4. Добавление экзогенного р50 в бесклеточные системы трансляции вызывает ингибирование белкового синтеза как на эндогенных, так и на экзогенных мРНК. Ингибирование не обусловлено деградацией или функциональной инактивацией мРНК.

5. Ингибирование белкового синтеза под действием р50 происходит на стадии инициации трансляции и сопровождается накоплением мРНК в форме свободных мРНП. Это означает, что при высоком соотношении р50/мРНК, р50 ингибирует процесс инициации на этапе присоединение мРНК к малой субчастице рибосом или на этапе взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Ковригина, Е.А., Нащекин, Д.В., Евдокимова, В.М. и Овчинников, Л.П. Мажорный белок цптоплазматических мРНП, р50, необходим для эффективной трансляции мРНК in vitro. Биохимия (1996), 61, 12, 21732180.

2. Evdokimova, V.M., Kovrigina, Е.А., Nashchekin, D.V., Davidova, E.K., Hershey, J.W.B., and Ovchinnikov, L.P. The Major Core Protein of Messenger Ribonukleoprotein Particles (p50) Promotes Initiation of Protein Biosynthesis in Vitro. J. Biol. Chem. (1998) 273, N6, 3574-3581.

3. Evdokimova, V.M., Ustinov, V.A., Kovrigina, E.A., Nashchekin, D.V., Skabkin, M.A., Davydova, E.K., Hershey, JAV.B. and Ovchinnikov L.P. •'The major corc rr.RNP protein p50 promotes initiation of protein biosynthesis in vitro" Abstracts of paper presented at the 1996 meeting on "Translation Control", p. 345, Cold Spring Harbor, New York.

4. Ковригина, E.A., Нащёкин, Д.В., Евдокимова, B.M., Овчинников Л.П. "Мажорный коровый белок мРНН, р50, необходим для эффективной инициации трансляции мРНК in vitro" (1997) II съезд биохимического общества РАН. Тезисы стендовых сообщений, часть II, с. 10.

5. Нащёкин, Д.В., Ковригина, Е.А., Евдокимова, В.М., Овчинников Л.П. "Мажорный коровый белок мРНП, р50, необходим для эффективной инициации трансляции мРНК in vitro" (1997) II открытая городская научная конференция молодых ученых, г. Пущино. Тезисы докладов, р.

6. Ковригина, Е.А., Нащёкин, Д.В., Евдокимова, В.М., Овчинников, Л.П. "Мажорный коровый белок мРНП р50 ингибирует трансляцию мРНК in vitro на стадии инициации", (1997) II открытая городская научная конференция молодых ученых, г. Пущино. Тезисы докладов, р. 19.

15.