Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение фосфорилирования мажорного белка мРНП р50

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение фосфорилирования мажорного белка мРНП р50"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

п I,

С 1 !...•■» '-" "

на правах рукописи УДК 547. 963. 3

УСТИНОВ Валентин Анатольевич

ИЗУЧЕНИЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МАЖОРНОГО БЕЛКА мРНП р50

03. 00. 03 -Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель: ,

Доктор биологических наук, член-корр. РАН Л.П.Овчинников

Оффициальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю.Л.Дорохов,

доктор биологических наук, профессор А.А.Нейфах

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится " --"- '-^ " ¿уу^л - ■ 1997 г. в -¡-С — часов на Заседании Специализированного Совета Д 053. 05. 70 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан " " _1997 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. мРНК в цитоплазме клеток эукариот всегда связана с белками и образует рибонуклеопротеидные частицы (мРНП или информосомы) (Spirin et al., 1964; Spirin, 1966; 1969). Белки, ассоциированные с мРНК, контролируют ее активность в белковом синтезе, время жизни в клетке и внутриклеточное распределение (Spirin, 1996). Белки мРНП можно разделить на специфические, ассоциированные с определенными мРНК, и универсальные, связанные с большинством или всеми мРНК клетки. К последним принадлежит белок р50 - мажорный коровый белок цитоплазматических мРНП соматических клеток. На основании первичной структуры и способности специфически взаимодействовать с Y-box содержащей ДНК этот белок был также идентифицирован как член- семейства Y-box связывающих факторов транскрипции. р50 был обнаружен в ассоциации как с транслируемой мРНК полирибосом, так и с нетранслируемой мРНК свободных мРНП (Minich & Ovchinnikov, 1992; Minich et al., 1993). Было показано, что при небольшом соотношении р50/мРНК, что имеет место в полирибосомах, белок стимулирует трансляцию на стадии инициации, в то время как при более высоком соотношении р50/мРНК в свободных мРНП он репрессирует трансляцию (Minich et al., 1989; 1990). Было также показано, что р50 фосфорилируется in vivo и in vitro (Minich et al., 1993). Мы предположили, что фосфорилирование может изменять сродство этого белка к мРНК и, таким образом, изменять его содержание в мРНП.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена исследованию фосфорилирования белка р50, как возможного регуляторного механизма, контролирующего переход мРНК из нетранслируемого в транслируемое состояние. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: (1) экспрессировать р50 в E.coli; (2) выделить р50 из E.coli и сравнить его свойства со свойствами белка из мРНП ретикулоцитов кролика; (3) исследовать свойства протеинкиназы, фосфорилирующей р50 в лизатах ретикулоцитов кролика, и ее распределение в субклеточных фракциях; (4) определить число и положение в полипептидной цепи аминокислотных остатков р50,

фосфорилируемых в лизате ретикулоцитов; (5) исследовать влияние фосфорилирования р50 на его взаимодействие с мРНК и ДНК.

Научная новизна работы. В результате проделанной работы получен штамм E.coli - суперпродуцент белка р50 и разработан метод выделения рекомбинантного белка. Показано, что белок, экспрессированный в E.coli, не отличается от р50 из ретикулоцитов по всем исследованным свойствам. Исследовано распределение р50-протеинкиназной активности во фракциях лизата ретикулоцитов кролика и изучены ее свойства. Определена стехиометрия фосфорилирования in vitro р50 из E.coli и из полирибосомных и свободных мРНП, определено положение фосфорилируемых аминокислотных остатков в молекуле белка. Несколькими методами показано, что в результате фосфорилирования уменьшается сродство р50 к нуклеиновым кислотам; определена константа связывания фосфорилированного и нефосфорилированного р50 с мРНК и Y-box ДНК.

В целом, полученные в этой работе результаты позволяют по-новому взглянуть на проблему перехода мРНК из неактивного в активное состояние.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на

международных конференциях: "Translational Control" (Колд Спринг

«

Харбор, США, 1994, 1996), на Российско-Германском симпозиуме "Molecular and Medical Genetics" (Кёльн, Германия, 1995), Французско-Российском симпозиуме "Regulation of Gene Expression" (Новосибирск, 1995) и на ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1994, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", посвященный описанию функций эукариотических белков, взаимодействующих с мРНК в процессе трансляции, "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы". Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

Результаты и их обсуждение 1. Экспрессия мажорного белка мРНП р50 в E.coli.

Для структурно-функциональных исследований р50 необходимо иметь дешевый и легкодоступный источник для выделения белка. С этой целью" мы экспрессировали р50 в E.coli и разработали метод выделения белка из бактерий.

Для экспрессии в E.coli кДНК р50 ретикулоцитов была переклонирована из исходного вектора pBluescript SK +/- в плазмиду рЕТ-3-1 (система Штудиера для экспрессии белков в E.coli).

После трансформации клеток E.coli штамма BL21 (БЕЗ) конструкцией рЕТ-3-1-р50 и индукции ИГГТГ в препаратах суммарного белка E.coli появился мажорный полипептид, соответсвующий по электрофоретической подвижности р50 из мРНП ретикулоцитов (рис. 1А). Этот полипептид взаимодействовал с антителами к р50 на иммуноблоте (рис. 1Б). Антитела к р50 реагировали еще с двумя полипептидами с молекулярной массой около 48 и 40 кДа. Возможно, последние являются продуктами абортивного синтеза р50 или результатом протеолитической деградации белка.

кДа 67433012"

индукции

1 2 3

-р50

кДа 67-

А

иптг,

1 2 3

Рис. 1. Анализ экспрессии « белка р50 в клгках E.coli

штамма BL-21(DE3),

* «ж.» — р50 трансформированных

плазмидой рЕТ-3-1-р50. ! Белки E.coli разделяли

SDS-гель электрофорезом и окрашивали кумасси G-250 (А), или переносили на мембрану и анализировали на связывание с

поликлональными антителами к р50 (Б). 1 и 2 - белки E.coli до и после соответственно, 3 - р50 из мРНП ретикулоцитов.

43"

30"

12-

Б

2. Выделение р50 из Е.соИ. После разрушения ультразвуком индуцированных клеток Е.соИ и осаждения клеточных обломков практически весь р50 обнаруживался в супернатанте (рис. 2А, дорожка 1).

1 2 3 4 5 6 7

р50

67

43

30 12

-р50

■^во

0,015 0,012 0,009 0,006 0,003

I I I I

i i i i i i i i i i—ь*

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16

Номера фракций В

Рис. 2. Выделение р50, экспрессированного в E.coli, (А) - Дифференциальное центрифугирование белков гомогената клеток E.cóli (SDS-гель электрофорез белков и окраска кумасси G-250). 1 и 2 - супернатант и осадок после центрифугирования при 10000 g. 3 и 4 - супернатант и осадок после центрифугирования при 100000 g. 5 - белки, смытые с рибосом 2М NaCl. 6 -рибосомы, промытые 2М NaCl. (Б) - Белки, смьггые с рибосом, после фракционирования на гепарин-сефарозе. 1 - исходный материал. 2 - белки, не связавшиеся с гепарин-сефарозой в ОДМ NaCl. 3-7 - белки, элюированные со смолы буфером с 0,25, 0,5, 0,7, 1 и 2М NaCl, соответственно. (В) - Белки 2М элюата с гепарин-сефарозы после хроматографии на Superóse 12.

4

f

После фракционирования супернатанта на рибосомы и безрибосомный экстракт в присутствии 0,5М NaCl большая часть р50 обнаруживалась во фракции рибосом (рис. 2А, дорожка 4). Белок диссоциировал из комплекса с рибосомами только в 2М NaCl (рис. 2А, дорожка 5).

Белки, диссоциированные из комплекса с рибосомами раствором с 2М NaCl, далее хроматографировали на гепарин-сефарозе (рис. 2Б). При ступенчатой элюции белков, адсорбированных на смоле при ЮОмМ NaCl, р50 смывался только буферным раствором с 2М NaCl (рис. 2Б, дорожка 7). Препарат белка на этой стадии очистки содержал лишь один примесный полипептид с молекулярной массой около 40 кДа, являющийся, по-видимому, фрагментом р50. Отделение р50 от его фрагмента было достигнуто гель-фильтрацией на Superóse 12 в буферном растворе с 2М NaCl (условия, препятствующие олигомеризации и сорбции белка на смолу). Белок р50 элюировался с колонки в зоне, соответствующей белкам с молекулярной массой около 50 кДа (рис. 2В).

Разработанный метод выделения р50 позволил получить высокоочищенный препарат белка (-95% чистоты). Выход продукта составил около 2 мг р50 из 8 г клеток Е.соН. Такое же количество р50 ранее удавалось получить из 25 кроликов.

3. Сравнение свойств р50, экспрессированного в Е.соН, со свойствами белка

из ретикулоцитов.

Мы сравнили белок, выделенный из Е.соН с р50 из ретикулоцитов по трем свойствам: (1) по способности взаимодействовать с мРНК и Y-box ДНК, (2) по способности мультимеризоваться и (3) по способности фосфорилироваться in vitro.

Как коровый белок цитоплазматических мРНП р50 обладает высоким сродством к мРНК, как член семейства Y-box-связывающих факторов транскрипции специфически связывает олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие Y-box-последовательность (Evdokimova et aL, 1995). Белок, выделенный из Е.соН, не отличался от белка из ретикулоцитов по способности взаимодействовать с а-глобиновой мРНК и Y-box ДНК, как показано методом нативного гель электрофореза (рис. 3). Из

5

представленных на рисунке радиоавтографов видно, что оба белка образуют комплексы с нуклеиновыми кислотами, сходные по электрофоретической подвижности.

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

I ч ?• Î

У

_ ____I

А В

1'ис. 3. Сравнение связывания р50 из E.coli и ретикулоцитов с нуклеиновыми кислотами методом иативного гель электрофореза. (А) - 10 нг (0,05 пмоль) 32Р-а-глобиновой мРНК смешивали со 100; 500 и 1000 нг (2,8; иW пмоль) р50 из ретикулоцитов (дорожки 2-4) или с такими же количествами р50 из E.coli (дорожки 6-8): 1, 5 - мРНК без белка. (Б) - 10 нг (1 пмоль) 32Р-Y-box ДНК смешивали с 50; 100 и 250 нг 2,8 и ? пмоль) р50 из ретикулоцитов

(дорожки 2-4), либо с такими же количествами р50 из E.coli (дорожки 6-8): 1,5-Y-box ДНК без белка. На рисунке представлен радиоавтограф геля.

р50 из ретикулоцитов в отсутствие мРНК существует в виде гомомультимерного комплекса с молекулярной массой около 800 кДа (Evdokimova et al., 1995). При гель-фильтрации на колонке Superóse 6 белок из E.coli элюировался со смолы в зоне, соответствующей белкам с молекулярной массой около 800 кДа (рис. 4) и не отличался от белка из ретикулоцитов.

И наконец, подобно белку из ретикулоцитов, р50 из E.coli метился при инкубации in vitro с [у-32Р]АТР и безмитохондриальным лизатом ретикулоцитов кролика в качестве источника протеинкиназы (рис. 5).

Таким образом, по всем исследованным свойствам р50, экспрессированный в E.coli, не отличается от белка, выделенного из мРНП

ретикулоцитов кролика и может быть использован в дальнейших экспериментах вместо дорогостоящего р50 из ретикулоцитов.

Л 280 0.018

0015

0.012 -

0 009 -

0.006 -

0.003 -

0.000

Рис. 4. Гель-фильтрация р50 из E.coli на Superóse 6 в растворе со 150 мМ NaCI.

Стрелками показано положение белков-маркеров: тироглобулина (699 кДа), ферритина (440 кДа), БСА (67 кДа).

2 4 6 8 10 12

Номера фракций

14 16

к Да 67

43

3012 -

1 2

1 2

р50

р50

Рис. 5. Сравнение фосфорили-рования р50 из Е.соН (1) и мРНП ретикулоцитов кролика (2). р50

инкубировали с |у-32Р]АТР и лизатом ретикулоцитов кролика. Белки разделяли БРЭ-гель электрофорезом. (А) - окраска кумасси С-250, (Б) - радиоавтограф

А

Ii

4. Pacnpedc-irnue р50~протсинкиназ>,: ¡о фракциях ретикулоцитного ли зато и частичная очистка фермента.

Фракционирование лизата ретикулоцитов согласно схеме, представленной на рис. 6А, и проверка полученных фракций на активность с р50 из Е.соН показала, что более 2/3 протеиНкиназной активности находится в безрибосомном лизате и около 1/3 - во фракции рибосом (рис. 6Б). Вся р50-протеинкиназная активность диссоциировала из рибосом в

7

присутствии 1М КС1. Из безрибосомного лизата вся активность адсорбировалась на гепарин-сефарозе при низкой ионной силе раствора и смывалась со смолы раствором с 1М КС1.

безмитохондриальвый лизат ретикулоцитов

I 100000 g

безрибосомный лизат гепарин-сефароза

рибосомы

+ 1М КС1 100000 g

белки без гепарин-сродства к связывающие гепарину белки

белки, диссоциированные с рибосом 1 М КС1

промытые рибосомы

В 225 т

§ п 200 -

| §175 В 5150 , : §125 - 2 100

Рис. 6. Схема фракционирования лизата ретикуло-цитов (А)' и распределение р50-протеинкиназной активности во фракциях лизата (Б). Для определения р50-протеинкиназной активности фракции лизата инкубировали с р50 из Е.соИ в присутствии [у-32Р]АТР.

После БОБ-гель электрофореза полосы, соответствующие р50, вырезали и радиоактивность измеряли по Черенкову в сцинтилляцион-ном счетчике. За 100% протеинкиназной активности принимали активность в исходном безмитохондриаль-ном лизате. На вставке представлен радиоавтограф геля.

5. Свойства р50—протеинкиназы.

Компьютерный анализ первичной структуры р50 на присутствие сайтов фосфорилирования для известных протеинкиназ обнаружил 9 потенциальных сайтов для сСМР-зависимой протеинкингзы, 6 - для казеинкиназы И, 4 - для протеинкиназы С и 1 - для тирозинкиназы.

Фосфоаминокислотный анализ р5О из Е.соИ, фосфорилированного в присутствии лизата ретикулоцитов кролика в качестве источника протеинкиназы, обнаружил только фосфосерин (рис. 7А). Следовательно, тирозинкиназа может быть исключена из списка ферментов, фосфорилирующих р50.

-Ser - Thr

р50

*». -р50

туг:

Start

123456789 12

Б В

1 2 Г

Рис. 7. Свойства р50-протеинкиназы. (А) - Фосфоаминокислотный анализ р50 из Е.соИ, фосфорилированного в присутствии [у-32Р]АТР и безмитохондриального лизата. (Б) - Влияние эффекторов на фосфорилирование р50 в присутствии [у-32Р]АТР и фракции гепарин-связывающих белков. (В) - Фосфорилирование казеина в присутствии фракции гепарин-связывающих белков и [у-32Р]СТР (1) или [у-32Р]АТР (2). (Г) - Фосфорилирование р50 в присутсвии фракции гепарин-связьшающих белков или коммерческого препарата казеинкиназы II и [у-32Р]АТР. На рисунках представлены радиоавтографы после ЭСЗ-гель электрофореза.

В

На фосфорилирование р50 не оказывали влияние Са2+/СаМ (активаторы Са2+/СаМ-зависимых протеинкиназ), Н7 (специфический ингибитор сАМР-зависимой протеинкиназы и протеинкиназы С), сАМР (активатор сАМР-зависимой протеинкиназы), cGMP (активатор cGMP-зависимой протеинкиназы). Однако, фосфорилирование р50 сильно по^гз в ля лось гепарином и РНК и активировалось спермином и спермидином (р.-с ■ 7Б). Способность ингибироваться гепарином и РНК и активироваться Спермином и спермидином характерны для казеинкиназы II. Исходя из -)того мы делаем вывод, что фосфорилирование р50 в лизате ретикулоцитов катализируется казеинкиназой II. В пользу этого дополнительно свидетельствует способность протеинкиназы обеих фракций фосфорилировать казеин, используя в качестве донора фосфата не только АТР, но, в некоторой степени, и GTP (рис. 7В) и способность адсорбироваться на гепарин-сефарозе (рис. 6). Наконец, р50 эффективно фосфорилировался в присутствии коммерческого препарата казеинкиназы II (рис. 7Г).

На основании всех полученных результатов можно заключить, что в лизате ретикулоцитов кролика р50 фосфорилируется казеинкиназой II; другие протеинкиназы в процессе фосфорилирования р50, по-видимому, участия не принимают.

6. Определение числа и положения в полипептидной цепи аминокислотных остатков р50, фосфорилируемых р50-протеинкиназой.

Инкубация р50 из E.coli в присутствии фракции гепарин-связывающих белков в качестве источника протеинкиназы и [у-32Р]АТР и определение количества включившегося фосфата на моль белка, в зависимости от времени инкубации, показало, что насыщение наступает при включении 2,6 молей фосфата на моль белка (рис. 8А). Тот же максимальный уровень фосфорилирования достигался и при увеличении в инкубационной среде количества фермента (рис. 8Б). Исходя из этих результатов мы предположили, что р50 может фосфорилироваться in vitro по трем сериновым остаткам.

Ю

Время (мин) Количество фермента

(ед. х 1<Г3)

А Б

Рис. 8. Кинетика фосфорилирования р50 (А) и зависимость включения фосфата в р50 от количества протеинкиназы (Б). (А) - 1 мкг р50 инкубировали с 0,7 ед. частично очищенного препарата р50-протелнкиназы (фракция гепарин-связывающих белков) указанное время. (Б) - 1 мкг р50 инкубировали в течение 30 мин с указанным количеством фермента. X - р50 из E.colî, II - р50 из свободных мРНП ретикулоцитов.

Чтобы подтвердить это предположение, полностью

фосфорилированный р50 обработали протеазой V8 в бикарбонатном буфере

(в этих условиях расщепление происходит за остатками Glu).

Образовавшиеся протеолитические фрагменты разделили хроматографией

на колонке RP-318 системы HPLC (рис. 9).

Рис. 9. Хроматография на колонке RP-318 системы HPLC протеолити-ческих фрагментов белка р50, полупенных обработкой протеазой V8. Элю-ция градиентом

ацетонитрила. I поглощение при 218 нм; II - радиоактивность; III - концентрация ацетонитрила.

^218

СРМ х 1 0"э

ÜM

% СН,С M

[ 90 80 - 70 • 60 50 I- 40 30 20 10

1 7 13 19 25 31 37 43 49 55 61 67 73 82 86 94 100

МЛ

Анализ радиоактивности во фракциях с колонки показал, что она распределяется примерно поровну между тремя пиками, элюирующимися при 12, 17 и 22% ацетонитрила. В полученных радиоактивных пептидах были секвенированы первые 15 аминокислотных остатка. Первый пептид начинался с Thr-7 и должен заканчиваться Glu-24. Пептид содержит только один остаток Ser в положении 21 в консенсусной последовательности для казеинкиназы II. Второй пептид начинался с А1а-122 и должен заканчиваться Glu-166. Пептид содержит два остатка Ser в положении 136 и 165. Оба остатка находятся в окружении, не характерном для сайта узнавания казеинкиназой II. Третий пептид начинался с Thr-303 и должен заканчиваться Glu-317. Он содержал два рядом расположенных остатка Ser-313 и 314, последний из которых находится в консенсусной последовательности для казеинкиназы И. Таким образом, р50 фосфорилируется in vitro по Ser-21, Ser-136 и (или) 165, Ser-313 и (или) 314.

Степень фосфорилирования, которая достигается in vitro при исчерпывающем фосфорилировании р50 из свободных мРНП ниже по сравнению с белком из E.colt (рис. 8). Это может означать, что р50 в свободных мРНП, скорее всего, фосфорилирован in vivo в стехиометрии 1 фосфат на молекулу р50.

Таким образом, несмотря на то, что компьютерный анализ показал в белке р50 6 потенциальных сайтов фосфорилирования для казеинкиназыП, экспериментальные результаты свидетельсвуют о том, что в условиях in vitro р50~протеинкиназа фосфорилирует, скорее всего, только три сериновых остатка, только два из которых находятся в консенсусной последовательности для казеинкиназы II.

7. Влияние фосфорилирования р50 на его взаимодействие с а-глобиновой мРНК и Y-box ДНК.

Для исследования влияния фосфорилирования р50 на его сродство к нуклеиновым кислотам, разное количество фосфорилированного и нефосфорилированного р50 инкубировали с радиоактивно меченной а-

глобиновой мРНК или Y-box ДНК. Смеси анализировали нативным гель электрофорезом. На радиоавтографе видно, что с увеличением количества р50 подвижность мРНК или Y-box ДНК постепенно уменьшается (рис. 10А или 11 А, соответсвенно).

Рис. ' 10. Влияние фосфорилирования р50 на его взаимодействие с а-глобиновой мРНК. (А) - 10 нг (0,05 пмоль) 32Р-а-глобиновой мРНК смешивали со 100, 500 и 1000 нг (£,2, 1 -I и 28 пмоль) нефосфорилированного р50 (2-4) или исчерпывающе фосфорилированного (6-8). 1, 5 - мРНК без белка; 9 - мРНК инкубировали с казеинкиназой II без р50. Комплексы разделяли нативным гель электрофорезом. (Б) - 1 мкг нефосфорилированного (1) и фосфорилированного (2) р50 разделяли ЭОЗ-гель электрофорезом. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом электропереноса. Мембрану инкубировали с згР-а-глобиновой мРНК. На рисунках (А) и (Б) представлены радиоавтографы. (В) - 0,05 пмоль 32Р-а-глобиновую мРНК инкубировали с 0,014, 0,024, 0,028, 0,039, 0,04, 0,045 и 0,048 пмоль нефосфорилированного и фосфорилированного р50 из Е.соИ и фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры. Зависимость количества адсорбированной радиоактивной мРНК от количества белка представлена в координатах Скетчард. I - для нефосфорилированного, II - для фосфорилированного р50.

Y-box DNA

PM ck!l

ppSO

в

0.045 -,

0.040 -

—i

<

Z □ 0.035 -

X

я 0.030 -

>< 0.025 -

о

1Л о. 0.020 -

5* 1Л 0.015 -

а

к

< 0.010 -

Z

о

к g 0.005 -

i. 0.000 -

0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 1.05 1.10 {Y-box DNA * p50] I (Y-box DMA J

1 2 3

5 6 7 8 9 10 11 12

Рис, 11. Влияние фосфорилирования p50 на его взаимодействие с Y-box ДНК. (А) -10 нг (1 пмоль) 32Р-Y-box ДНК смешивали со 100, 250, 500, 750 и 1000 нг (2,6, ? , \Ll, 2.1 и18 пмоль) нефосфорилированного р50 (2-6) или исчерпывающе фосфорилировавного р50 (8-12). 1 - ДНК без белка; 7 - ДНК с казеникиназой II без р50. Комплексы разделяли нативным гель электрофорезом. (Б) - 1 мкг нефосфорилированного (1) и фосфорилированного (2) р50 разделяли SDS-гель электрофорезом. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали с 32P-Y-box ДНК На рисунке (А) и (В) представлены радиоавтографы. (В) 0,5 пмоль 32Р-Y-box ДНК инкубировали с 0,028, 0,14, 0,28, 0,49, 0,56 и 0,98 пмоль нефосфорилированного и фосфорилированного р50 из E.coli и фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры Результаты представлены в координатах Скетчард. I - прямая для нефосфорилированного, II - для фосфорилированного р50.

Это свидетельствует о том, что как нефосфорилированный, так и

фосфорилированный р50 образуют комплексы с мРНК и Y-box ДНК. Однако в обоих случаях комплексы фосфорилированного р50 с нуклеиновыми кислотами имеют большую электроферетическую подвижность, а, в случае с мРНК, дают более диффузное распределение. Все это означает, что фосфорилированный р50 имеет меньшее сродство к мРНК и Y-box ДНК по сравнению с нефосформлированным белком.

При анализе взаимодействия р50, иммобилизованного на нитроцеллюлозной мембране, с радиоактивно меченными мРНК или Y-box ДНК видно, что нефосфорилированный р50 связывает значительно больше мРНК или Y-box ДНК, чем фосфорилированный белок (рис. 10Б или 11 Б).

Наконец, методом адсорбции на нитроцеллюлозных фильтрах комплексов р50 с нуклеиновыми кислотами были определены константы связывания фосфорилированного и нефосфорилированного белка с радиоактивно меченной а-глобиновой мРНК и Y-box ДНК. Константа связывания для нефосфорилированного и фосфорилированного р50 с а-глобиновой мРНК оказалась равной (3,9 ± 0,7)х108 М"1 и (1,1 ± 0,2)х108 М"1, соответственно; с Y-box ДНК - (1,7 ± 0,2)х108 М"1 и (9 ± 0,9)х107 М"1, соответсвенно (рис. 10В или 11В). Другими словами, фосфорилирование р50 приводит к уменьшению его сродства к мРНК в 3,5 раза и к Y-box ДНК в 1,9 раза.

Таким образом, можно заключить, что фосфорилирование р50 сопровождается уменьшением сродства белка как I» мРНК, так и к ДНК. Причем сродство к мРНК уменьшается несколько больше, чем к Y-box ДНК. Исходя из этих результатов можно предположить, что фосфорилирование р50 в клетке будет уменьшать количество р50 на мРНК и переводить мРНК из нетранслируемого в транслируемое состояние.

Выводы

1. Получен штамм E.coli - суперпродуцент мажорного белка мРНП р50 и разработан метод выделения рекомбинантного белка.

2. Исследованы некоторые свойства р50, экспрессированного в E.coli. Показано, что рекомбинантый белок не отличается от природного р50 по способности связываться с мРНК и Y-box ДНК, мультимеризоваться и фосфорилироваться.

3. Исследовано распределение р50-протеинкиназной активности во фракциях лизата ретикулоцитов кролика. Показано, что 2/3 протеинкиназной активности находится в безрибосомном экстракте ретикулоцитов, из которого полностью адсорбируется на гепарин-сефарозе.

1/3 протеинкиназной активности ассоциированасрибосомами и смывается с них 1 М КС1.

4. Исследованы некоторые свойства р50-протеинкиназы ретикулоцитов кролика, позволившие идентифицировать её как казеинкиназу II.

5. Установлено, что белок р50 фосфорилируется in vitro по Ser-21, Ser-136 и/или Ser-165 и Ser-313 и/или Ser-314.

6. Несколькими методами показано, что после фосфорилирования р50 снижается его сродство к мРНК и Y-box ДНК. Константа связывания р50 с мРНК после фосфорилирования белка уменьшается в 3,5 раза, с ДНК - в 1,9 раз.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Evdokimova, V.M., Sitikov, A.S., Simonenko, P.N., Lazarev, O.A., Vasilenko,

K.S., Ustinov, V.A., Wei, C.-L., Hershey, J.W.B., and Ovchinnikov, L.P. The

i

Major Protein of Messenger Ribonucleoprotein Particles in Somatic Cells is a Member of the Y-box binding Transcription Factor Family. Abstracts of paper presented at the 1994»meeting on "Translational Control", p. 280, Cold Spring Harbor, New York.

2. Evdokimova, V.M., Wei, C.-L., Sitikov, A.S., Simonenko, P.N., Lazarev, O.A., Vasilenko, K.S., Ustinov, V.A., Hershey, J.W.B., and Ovchinnikov, L.P. The Major Protein of Messenger Ribonucleoprotein Particles in Somatic Cells is a Member of the Y-box binding Transcription Factor Family. J. Biol. Chem. (1995) 270, N7, 3186-3192.

3. Evdokimova, V.M., Ustinov, V.A., Kovrigina, E.A., Nashchekin, D.V., Skabkin, M.A., Davydova, E.K., Hershey, J.W.B., and Ovchinnikov, L.P. The Major Core mRNP Protein p50 promotes Initiation of Protein Biosynthesis in vitro. Abstracts of paper presented at the 1996 meeting on "Translational Control", p. 345, Cold Spring Harbor, New York.

4. Устинов, B.A., Скабкин, M.A., Нащекин, Д.В., Евдокимова, В.М. и Овчинников, Л.П. Мажорный белок мРНП ретикулоцитов кролика, р50: экспрессия в E.coli, выделение и некоторые свойства рекомбинантного белка. Виохимимя, т. 61, вып. 3, стр. 559-565, 1996.