Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вивчення репресii/активацii трансляцii МРНК вi9лками iнформосом ретикулоцитiв кроля

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Вивчення репресii/активацii трансляцii МРНК вi9лками iнформосом ретикулоцитiв кроля"

АКАДЕМIЯ НАУК УКШНИ. ПЩТУТ ЮЛЕКУЛЯРНО! БЮЛОГП I ГЕНЕТИКИ На правах рукспксу.

МАЙДЕБУРА 1гор Петрович

УДК 677. £16. 35.

БИВЧЕННЯ РЕПРЕС11/АКТИВАЦ1Г ТРАВ2ЛЯШ мРНК Б1ЛКАШ Ш20РШС0М РЕТИКУЛОЦИТ1В КРОЖ

03.00.03 - молекулярна бюдопя

Авто'реферат

дисертацП на адобуття вченого ступени «кандидата бюлопчних наук

РГ8 3

КИ1В - 1994.

Робота виконана в лабораторП гекетичног тженерГг 1нституту ф1 81олог1'1 рослин та генетики А.Е Укра'х'ни м. Ки1в, та в 1нститут1 01лку РАН м. Пущино.

На/ковяй кер!вник: доктор бюлопчних наук

A. П. Даекалюк

кандидат бюлопчних наук

B. В. М1Е1х

0ф1д1йн1 опоненти: доктор бюлопчних наук

С. М. ХрапукоЪ кандидат бюлопчних наук К. А. Солдаткш

Вадуча установа - институт бюорган1чно'х Х1МП' 1 нафгохшп А. Е Укра1ни

спещал1говано1 ради 1нституту молекулярно\' сюлонх 1 генетики А. Е Укра*ни аа адресок» 262627, Ни'1'в-143, вул. Заболотного .160.

3 дисертац1ею мокна оакайомитись в СЮлютещ ¡кституту молеку-лярно1 бюлоиз.' 1 генетики А.Е Укра'1'ни.

Автореферат роз 1сланий квиня 1994 р.

Вчений секретар спещад18овано'1 ради,

кандидат бюлопчних наук

АКТУАЛЬЩСТЬ ПРОБЛЕМЕ Наукова проблема, поставлена в запропоно-ван1й робот1 стосуеться вивчення механ1зму регулящ V експресп генетично! 1 нформат 1 на трансляЩйному р!вн1. В1домо, шр 1Нформад1йя: РНК еукарют ¿снують в асощацп з спецнф1чним набором 01ЛК1В, формуючи мРНП-частки, або !нформосоми. Розр1зня-югь В1льн1 цитоплазматичн! 1 шшсомн! 1нформосоми. М!ж шльни-ми 1 полюомними шформосомами ¡снують суттев1 в1дм!нност! в К1лькюному 1 якюному склад! б!лк!в, асоЩйованих з мРНК, а такой в транслящйшй активност! цих двох клас1в !нформосом. Як правило, шльш 1нформосоми транслмсться нз значно нижчому рт-Н1... шж вид1лена з них мРНК 1 полюомн! тформосоми, що вкаэуе на !снування компоненту "маскуючого" IX т ране ля ц но. Виходячи з цих поаищй, ми вважади дощльним видиення б1лку(1в) ¡нфорыо-сом, впливаючого на транслящйну актнвнлсть мРНК, дослмження його властивостей 1 побудову на баз! отриманих даних модел1 регулящ! транслящйно! активност! мРНК з участю такого регуля-торного б!лку. Вивчення залропоновано! проблеми мае велик© значения для розушння процессе, котр1 магаь мюце в тщацИ трансляции В!домо, пр в склад1 1нформосом основна к1льк!сть б1лку роэташована на 5'I З'некодуючих посл1довностях, котр1 являться регуляторними при трансляцГ! мРНК. Ераховуючи, що б!лки 1нформосом можуть впливати на доступшсть промоторних частин мРНК для фактор!в шщащ 1 транслящ 1 1 на вторинну структуру мРНК, ыожна припустити, щр саме через таку взаемодш бишв 8 мРНК зд1йснюеться модулящя 11 транслящ йно! активност 1. Розк-риття механ!зму регулящ К уранслящйно!' активност1 мРНК, при взаемодИ' б!лк1в 1нфоршсом 1 мРНК дозволило б розиирити по-няття про процес взаемодИ фактор!в транслящ 1 з мРНК, оск1льки б!лки шформосом беасумн!вно впливають на таку вааемодио, а та-кож зрозум!ти продеси щр лежать в основ! шщацН трансляции

ЫЕТА I ЗАВДАННЯ ДОС Л ШПЕНЬ. Загальна направлен 1сть запропоно-вано1 роботи нащлена на вивчення механ!зму регулящ 1 експресП' генетично! !нформацИ на трансляЩйному р1вн!. Основною мэтою являлась 1дентиф1кац1я, видцення 1 вивчення властивостей регу-ляторного б1лкового кошоненту( 1в) тформосом, а також побудова на баз! отриманих результата модел! механ!зму регуляц! 1 в участю цього б1лку транслящйш! активност! мРНК. У в 1дпов1дност1 з цим були поставлен! сл!дуюч! задач!: - энайти оптимальну систему для вивчення модуляцИ транс-лящйно! активност! мРНК б!лкаш ¡нформосом.

-доел!дитя 61лковий спектр В1льних цитоплазматичних 1 полюом-них 1нфзрмосом;

-пор1бняти характеристики двох miaciB 1нформосом при транслят i in vitro;

-розробити метод видиення i очистки регуляторного б1лку 1нформосом;

- вивчити вплив такого б!лку на трансляцию мРНК in vitro;

- вивчити можлив! шляхи регуляцГ! транслящйно'! активност! мРНК з участю регуляторного б i дку;

- встановити специф!чн1сть впливу регуляторного б!лку на трансляцш р!зних мРНК;

-побудувати на 6a3i отриманих даних модель мехашэму penpecii та активацП' транслят i мРНК з участю регуляторного бику 1нфор-мосом.

НАУКОВА НОВИЗНА ТА ПРАКТИЧНА Ц1НН1СТЬ РОБОТЕ В результат! проведено! роботи отримаш дан1, котр1 дозволяють роаширити 1сную-41 уявлення про процес регулящ i транслят i мРНК у еукарют. Дослужено спектр 61ЛК1В в1льних i полюомних 1нформосом. Впер-ше показано, то б!лки В1льних хнформосом роз'еднують мРНК а апаратом транслят i безклтнно* системи з зародк1в пшенит, в той час, як б1лки полюомних 1нформосом не спричиняють тако! дИ. Розроблено метод очистки з стушнню чистоти S5% i вид1лення з в i ль них 1нформосом ретикулоципв кроля регуляторного б!жу з молекулярной иасою 50 кДа, а також показаний його вплив на транс-лящю мРНК in vitro, досл1джено властивост! вид1леного биту. В результаи таких досл!джень отримаш дан1, як! дали змогу побудувати модель регуляш i трансляЩйно! активност1 мРНК з участю вкаааного б1лку 1нформосом.

АПРОБАШЯ РОБОТИ. OcHOBHi результата, викладеш в дисертад1йн1й робот! допов1 дались i обсуджувались на симпоа!ум! з молекулярно'1 i кл1тинно1 бюлогП (20th Annual Meeting. London 1991), на конферешш молодих вчених 1 спещал!ст!в з питань ОЮлогП i еколог!'1 (Ялта 1993), на 8ас!данн! науково-методичного сем1нару В1дд1лу регуляци синтезу б1лку 1нституту б!лку РАН (м. Пувдно

1993), на розширеному сем1нар! лабораторП' генетично! 1нженерП' 1нституту ф!31олог! 1 рослин 1 генетики А.Е Укра'1'ни (м. Ки'а'в

1994), на розширеному сем!нар1 в!дд1л1в механ!зм!в транслят'i i

молекудярних механ!эм1в бюсинтеэу б!лку 1нституту молекулярноУ бюлог1'1 i генетики А. Н. Украхни (1094).

ПУВЛ1КАЦП. По матер¡алам дисертацП' опублiковано 5 роб1т.

СТРУКТУРА ТА ОБСЯГ РОБОТИ. Дисертащя складаеться а вступу, ог-ляду л1тератури, описания матер!ал1в та метод1в, описания результате дослшв та ix обговорення, висновтв' та списку л1тератури, використано'].' при написание дисертацП'. Загальний об'ем дисертацП' складае 120 сторонок, вюпочажчи 22 малюнки 1 3 таблищ.

ОБ'ШИ ТА МЕТОДИ Д0СЛ1ДЗКЕННЯ. Досл1дження проводились ' на 1нформосомах вщцлених а ретикулоцит i в кроля. Ретикулоцитоз у крол!в 1ндукували 1н'екщями фен1лпдразину (Adams et al. 1969). Безм1тохондр1апьний л1зат, безрибосомний Л1зат i шшсоми отри-мували дифэренщйним ультрацентрифугуванням, П1сля ппотон1чного Л1зису ретикулоцит!в. BiJibHi цитоплазматичн1 1 пол1сомн1 1нфор-мосоми отримували методом термально'! хроматографа на ол1го(с1Т) -целюлоз! (Jaln et al. 1S79). Депротешзацт !нформосом проводили методом фенольнох екстракцй' (Хеймс i XirriHc 1989). Спектр 61 ж! в асощйованих з мРНК вивчали застосовуючи метод SDS-електрофорезу (Laemmli 1970) та двом1рного електрофорезу (О 'Farrell 1975). Трансляцию мРНК i 1нформосом проводили в'безкл1-Тинн1й систем! трансляцIi з зародк1в пшениц! ( Erickson et al. 1983), i в безкл1тинн!й систем! а ретикулоципв кроля (Хеймс i XirriHc 1989). Концентрадш мРНК визначали спектрофотометр ¿ею, а концентрацш б1лку - по фарбуванню ф!льтр!в методом пор1внян-ня з кольоровою шкалою (Schaffner et al. 1973). В1дносний bmict 6!jikib в npenapaii ¡нформосом визначали денс!тометр!ею пол!ак-рилам!дного гелю на лрилад1 Ultraskan. Обмежений б!лковий про-теол1з проводили пюля електроелюцй' б1лку з в!дпов!дно'1 зони гелю з настушшм застосуванням протеази V8 Staphi lococcus •aureus (Kleveland 1977). Фосфор!лювання б1лк1в !нформосом проводили шляхом 1нкубацП" препарату 1нформосом . з PJ АТР (Rittschoff et al. 1982). 1дентиф1кащю фосфор шованих б!лк1в проводили методом рад!оавтограф1 i'. Фракцюнування б1лк!в, асотйованих з мРНК i' тих що знаходяться у в!льному стан! проводили шляхом гельф!льтрац11 на прилад! FPLC на хроматограф!чн1й колонц!

а смолою Superóse 6В, Шсдя чого матер i ал 1дентиф1кували методом денсиометрП' проф!лю елюц!'! при довжин1 хвил1 поглинання 280 нм.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ.

В результат проведених досл!джень ми показали, шр б!льш Н1Ж 80% мРНК виьних i б!ля 30% под!сомних шформосом ретику-лоцит i в кроля кодують г лоб t н. Це дало мождивють вважати, що транслящйна активнють обох класпв 1нформосои визначаеться транслятйною активнютю мРНК гло01ну, а б!льш1сть б!лк1в су-wapHoi фракц! í 1кформосом асоц1йован1 з глобшовою мРНК. Нами встановлен! kíaskíchí i hkijhi в!дм1ни в cnererpi б!лк!в ыльних i ПОЛ1СОМНИХ шформосом, шр вказуе на можливють участ! цих 61ЛК1В в регуляцП транслящйно'! активност1 мРНК. •

виши В1льних ийормэсоы ретикулощгпв кроля роз-еднують мрнк з

АПАРАТОМ ТРАНСЛЯЦП В БЕЗКЛ1ТИНН1Й СИСТЕМ1 ТРАЖУВД11 3 ЗАР0Д-KIB ПШЕНЩ1. BiflOMO (Mínich 1989,1090), ВД В1льн1 Шформосоми ретикулоципв кроля дуже слабо направляють синтез б1лку в без-кл!тшшй систем i трансляц1 i з зародк!в пшениц!, на В1дмшу В1Д вид1лено'1 з них мРНК та полюомних шформосом ретикулоципв. Транслшчи зростаючх концентрац'Л в!льних i полюомних шфэрмо-сом ретикулоципв на фон! мРНК нам вдалось встановити шр:. 1) В1льн1 шформосоми не мютять неспециф!чного 1нгиб1тору процесу трансляцП',' оск!льки ix присутн!сть не впливае на трансляцш мРНК (мал. 1а), 2) В1льн1 шформосоми слабо конкурують ( на В1дм1ну в!д вид1лено'1 з них мРНК i в!д шшсомних шформосом) за фактори трансляцп, оск!льки bhcoki концентрат i В1льних Шформосом не спричиняють шгибування 'грансляцГх в безюитиннШ систем! трансляцП' з зародк!в пшениц! (мал. 1а) як це можна спостер1гати у випадку полюомних шфорыосом (мал. 16). Виходя-чи з вказаних результат 1в*гми зробшш висновок про"те, ир б!лко-вий компонент в!льних шформосом роз'еднуе мРНК в апаратом трансляцП' безкл1тинно1 системи а зародк!в пшенищ.

Б1ЛКИ 0,5 М КС1-ЗМИВУ 3 РИБОСОЬШИХ СУБЧАСТОК РЕТИКУЛОЦИПВ КРОЛЯ АКТИВУЮТЬ ТРАЙСЛЯЦШ В1ЛБНИХ 1ШОРЮСОМ В БЕЗКЛ1ТИНШЙ СИС-TEMI 13 ЗАРОДОВ ШЕНИЦ!.

s

a №

a

S

es

s -1 о

«

w Э

M

8 "J

о

s

о w о ш

•о «

о

M о

ф

•а

m

п

И S

9 Е

•о п ж я о о о г:

•в ф н

a tí

о о

ь §

о -

о ta

» •а

п

ё й I

Ч ш

и-Ш

К Ol

Г) р §

и 8

M

s

5'

О)

я

о_

ш ы

я

~ g я

•" >-3

я -а

8- £ W

о

■а ф и

о g

к •а о

и ■а

я со

Ш в

я «о

в s

и.

о

tu H f

ta я м

►з •о

ta

» 4J

M

Ol

Ф

cu g

о H

tu

tu

Вклпчення [^С] лейцину в 5 шел 1X0-ооадауваного продукту /тио. 1мп/хв /

■ь- со Й 51

м

к н •а

ГЧ>

о

о о о

ач О

8

м 8

м

8

I

чп I

- б -

В Л1тератур1 приведено дан1 про те, да транслящю в!дьних !нформосом ретикулоципв кроля в безшитшшй систем! з аарод-к!в пшениц! можна аначно зб!льшити екзогенним внесениям б1дк1в О, 5 М KCl-змиву з пол1сом ретикулоцит!в кроля. Ми перев!рили на таку дно б!лки 0,5 М KCl-змиву з рибосомних субчастинок ретикулоципв кроля та б!лки окремих фракщй амиву. Диференщйним осадженням були отриман! фракцП' б1Ж!в, да висолювались в!дпо-в!дно 0-25Х, 25-40 %; 40-50% та 50-70% сульфатом амонш. В без-клтшну систему трансляцП' з зародкгЕ пшениц!, що шетала 15 мкг/мл в1льних !нформосом ретикулоцит!в кроля екзогенно вносили в!д 2 до 12 мкг бглку Р1зних фракц!й 0,5 М KCl-змиву а рибосомних субчасток i спостер1гали за зм1нами в piBHi трансдяци в!льних !нформосом. На малюнку 2 зображено вплив р1зних конце нтращй р1зних фракщй 0,5 М KCl-змиву на транслящйну актив-н!сть в!льних !нформосом. Внесения 61ЛК1В 0,5 М KCl-змиву суттево активувало транслящю в!льних ¡нформосом, що вказуе на присутнють в склад! б1лк!в змиву компоненту(iв) активуючого транслящю, а отже на !снування системи репресор-активатор. Кайб!лылий активуючий вплив на транслящю 1нформосом спричиняли б1лки, да осаджувались сульфатом амон!ю в !нтервал! 25-40Z. В1лки 0,5 М KCl-змиву значно в менш1й Mipi впливали на трансля-щйну активнють мРНК, вид!лено'1 з В1льних ¡нформосом.

ОЧИСТКА I ВВД1 ЛЕНИН Б1ЛКУ В1ЛЬШХ 1НФОРМОСОМ РЕТИКУЛОЦИПВ КРОЛЯ 3 МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАСОЮ 50 кДа.

В л!тератур! висувались припуцення про !нгиб!торну роль на транслящю в безюитиший систем! з зародк1в пшениц! б!лку в 1льних !нформосом з молекулярной масою 50 .кДа ретикулоципв кроля, оск!льки !нформосоми, щр Mi стили в 61ЛКОВОЫУ СКЛЭД1 757. вказаного б1лку, транслювались на низькому pibhi. Нам вдалось розробити метод очистки ! вид!лення з в!льних шформосом ретикулоципв кроля регуляторного б!лку з молекулярною масою 50 кДа (р50). Вказаний 0!лок е одним ie мажорних б!лк!в в!льних !нфор-мосом i в мРНП-частинах, вид1лених при ф1вюлопчних концентра-Ц1ях одновалентних каиощв доля цього б1лку в тотальному препарат! !нформосом становить 25-30Z (мал 36) . При гидвищенш концентрат! одновалентних каиошв до 500 мМ, доля цього б!лку в тотальному препарат 1 щдвищуеться до 75% (мал Зв). Для в!дд!лення б!лку в!д мРНК застосовувалась ¡нкубащя з 2М L1C1.

«

« к

I 8

□

а

о о. к

о

о

я £

я

о о

2 Ч 6 в

. шяшсть внесеного б1лку-{мкг.)'

10

12

Мал. г. Залежи сть р1вня транслящ* 15 мкг. /мл. вианих 1нформо-сом ретикулоципв кроля в безкл1тинн1й систеьи з зародив п®-ниц1 В1Д внесения б!лк!в, пр осаджуиться 255 сульфатом амоню

( —а.— ). 405 сульфатом амон!Ю(-о — ), 502 сульфатом

амоншС— • — ), 705 сульфатом амонги ( —• — ) з 0.5 М КС1-змиву з рибосомних субчастин ретикулоципв кроля.

Величина кайбтшого [ , наймениого | достов!рного ¡нтервалу.

- в -

! П ЮкДа да

-95 кДа .-68 кДа

,:-1»5 кДа -25 кДа

о> <£ в

Мал.3. Електрофореграма ачицэного препарату б1дку р50.(а). С1Д-кш в 1льних хнформосоы ретккулощшв кроля, отриманкх при ¿онн!й сил! буфера 200 мМ НаС1 ( &') 1 500 кМ №С1( в ).

Хроматографы на ДЕАЕ-целюлозi i гельф!льтрац1я дозволили провести очистку б1лку 1 переведения його в необх1дний буфер. Доля р50 в препарат! б1лку пюля очистки становила 95Х (мал. За). Встановлено амшокислотний склад б!лку р50. Як i для 1ншх 61л-к!в !нформосом, характерною рисою б1лку р50 являеться високий вмют гл1цину в його ашнокислотному склад!.

ВЙВЧЕННЯ ВПШВУ б1лку ВГЛЬКЮС ШФОПЮСОи РЕТИКУЛОЦИТ1В КРОЛЯ 3 ЮЛЕКУЛЯРНОЮ МАСОЮ. 50 кДа НА ТРАНСЛЯЩЮ мРНК В БЕЗКЛ1ТИННШ СИСТЕМ1 3 ЗАРОДИВ ПШЕНЩ1. Очистка б!'лку р50 дозеолилз досл1дити його вплив на транслятйну активн!сть мРНК in vitro. Вивчався вплив екзогениого внесения pismix концентрац!й б!лку на транслятйну активн1сть глоб1ново* мРНК (мал. 4), мРНК Вготэ Mosaic Virus (3), а також мРНК _галактоз!дази в безкл!тинн1й СИСТ0М1 транслят i з зародк1в пшениц!. Встановлено, шр внесения р50 спричиняе тгибування транслят i в безкл1тинн!й систем1 з вародк!в голенищ bcix трьох мРНК. Mi« тим, характер 1нгибування траисляцП' для р!зних мРНК був р1зний. фи внесен! р50 в безкл!-тинну систему, стушнь ¡нгибування транслят i пов'язувалась з сп1вв1дношенням в систем! р50 до мРНК вираженому в молях речо-вини, оскшки Timm такий П1дх1д дозволяв коректно ощнити специф1чн!сть впливу вказаного б1лку на трансляции мРНК. У ви-падку, якщр р50 специф!чно 1нгибуе транслящю двох мРНК, то його внесения в однакових молярних сп!вв1дношеннях до мРНК, спричиняло б пропортйне зментення ix транслятйно! активност1. АналоПчну д1ю спричиняв би б!лок при неспециф!чяому !нгибуван-Н1 транслят i двох мРНК. Але якщр р50 ютибуе трансляцш одте! мРНК специф1чно, a iHrao'i неспециф!чно, то при однакових молярних сп1вв1дношеннях б1лок/мРНК транслящя мРНК, для яко'1 характерна специф1чна взаемод!я з р50, буде в значно б1льш1й Mipi !нгибуватися. 3 малюнку 4 видно, шр 1нгибування транслят i' мРНК _галактоз1дази 1 BMV нозить л!н1йний характер, щр св!дчить про менш специф1чну взаемодш з ними б!лку р50 . Для мРНК глоб1ну внесения рБО в сп1вв1дношенн! до мРНК В1д 1 до 4 спричиняе значно б!льшу стутнь 1нгибування, н!ж б!льш bhcoki сшвв!дно-шення, щр може св1дчити про б1льшу специф1чн1сть 1нгибування транслятV мРНК глоб!ну при вказаних сшвв1дношеннях, про юнування сайт!в до яких р50 мае шдвищену спор1днен1сть i эв'язування з якими, можливо, призводить до б!льшого 1нгибування

1 2 > 4 -5 6 7 8

молярне сп!вЕ1дношенкя р50 до мРНК ;

¡¿ал. Ч Епяяв екзогенкого внесения б1лку р50 в безклтшку систему s зародов пиенкщ на транслящйку активнють мРНК глэб1ну ( — о — ), ЕМУ (—- • — ), ^галактоз iдази (-Д— ).

Величина найбиаиого } , найменаого [ доставiрнаго 1нтервалу,

- и -

трансляцН мРНК.

1ДЕНГИФ1КАШЯ Б1ЛКУ Р50 В СКЛАД1 В1ЛЫШХ I ПОЛЮОМНИХ 1Ш0РМ0-СОМ РЕТИКУЛОЦИТ1В КРОЛЯ. Для того, щрб зрозушти принцип регу-ляцП' трансляцП' мРНК з участю б1лку р50, необх1дно в1дпов1ети на питания про його присутнють в склад! в!льних 1 полюомних 1нформосом ретжулоципв кроля. Для 1дентиф!кацИ' цього б1лку в склад! обох клас!в !нформосом провели пор!вняння трьома неза-лежними методами: методом двом!рного електрофорезу • по 0Тагге11, обмеженим пептидним протеол!зом б!лку, елюйованого з в1дпов1дних зон електрофореграми в!льних 1 полюомних !нформо-сом та пор1внюши ам!нокислотний склад б!лку з молекулярной ма-сою 50 кДа обох вид!в 1нформосом. На матонку 5а ! 5г зобракено положения на рад!оавтограм! б!лку р50 в!льних ! пол!сомних !нформосом м!чених с'Л51] при електрофоретичному розд!ленн1. 1Ьр!внявши положения пепид!в, отриманих при протеол!31 В1ДПОВ1ДНИХ 61ЛК1В, мн прийшли до висновку про !дентичн!сть цих двох б!лк!в (мал. 56 ! 5в). Цей висновок п!дтвердився при пор!внянн! положения б!Ж1в при двом1рному електрофорез! препарату в!льних ! полюомних !нформосом по, ОТаггеИ та ам!нокис-лотного складу в1дпов!дних б!лк!в. Таким чином б!лок р50 входить до складу як в!льних, так ! полюомних !нформосом. •

БИЗНАЧЕНШ СШВВ1ДН011ЕННЯ Б1ЛКУ Р50 3 мРНК В СКЛАД1 В1ЛБНИХ I' ПОЛЮОМНИХ 1ИЮРМОСОМ. Оскхльки р50 спричиняе !нгибування транслящ'1 мРНК, але входить як до складу в!льних, так ! полюомних !нформосом, ми припустили, що.цей б!лок присутн!й в !нформосомах в р!зних сп1вв!дн0шеннях. Для того, пюб встановити сп!вв!дноиення р50 в обох класах 1нформосом, був проведений наступний досл1д: на кожну дор1жку електрофореграми наносився б1лок в1льних 1 полюомних 1 нформосом, асощйований з 2,2 мкг. мРНК (машонок 6а 1 66). Июля електрофорезу визначалась вдаос-на к1лькють б1лку в кожн1й полос! шляхом сканування в1дпов!дних зон гелю (малюнок 6в ! 6г). Абсолютне значения к!лькост1 б!лку в зон! визначалось- перерахунком абсолютного значения тотального б!лку з урахуванням в!дносно'1 к!лькост1 б1лку в кожн1й полос!. Враховуючи молекулярну масу глоб!ново1 мРНК 1 б1лку р50 вираховували молярне сп!вв!дношення цих компо-ненпв в склад! 1нформосом. • Вам вдалось встановити, шр в в!ль-

hh

50 «Да - У

WTT7™!

:: -68 кДа

.'--АЗ к Да

Vi'

, : 2-25 кДа

Мал.5. Радюавтограф електрофореграми шчених . б1лк1в з молекулярними масами 50 кДа ыльних (а) 1 полЮомних (г) 1нфор-мосом ретикулоцинв кроля, та продукт i в обмеженого протеол1ву вказанного б!лку в i ль них (б) 1 пол!сомних (в) шформосом.

а

гзооо-

i 7800-

а б в г

Мал.'6. Електрофорэз С1лк1в зианих (б) 1 полюоыяих (а) - шфор-мосом ретикулощшв кроля, асощйованих а 2,2 мкг. МРНК,. та денсмтограма елктрофореграми вГЛьних (г) 1 поисомншс нформосом (в).

них 1нформосомах з одопею молекулою глоб!ново! мРНК асощйовано.. 4 молекули б i лку р50, а в полЮомних ¡нформосомах 2 молекули вказаного бику. Таким чином, регулящя транслящйно! активнос-т1 глоб1ново! мРНП-частки може бути пов'язана з к1льк1стю б i лку -репресора трансляцг! в склад1 шформосом. Пол!сомн! !нформосоми мютять в два рази менше б1лку-репресора i можливо завдяки цьому ix транслящйна активнють в безклтшшй систем! трансля-Ui i з зародк!в пшениц! значно перевишуе транслящйну активнють в!льних !нформосом.

Í0CC50PIЛЮВАННЯ- ДЕФОССЮРIЛЮВАННЯ Б1ЛКУ Р50 В IHXOPMOCOMAX. Л0КАЛ13АЦ1Я аШГОР1ЛЬОВАНОГО В1ЛКУ В АС0Ц1АЦ11 3 мРНК ТА В В1ЛБНОМУ CTAHI. Виходячи з того, шр в!льн! !нформосоми mícthtb в два рази б!льше б1лку-репресора трансляцп, hí» пол!сомн! 1нформосоми, ми припустили юнування механ1зму регулящ i к!ль-koctí б i лку р50 в асощац! i' г мРНК. Такий механ1зм водночас mir би являтись механ!змом регулящi транслящйно'! активностх мРНК. 3 нашо! точки зору, найб!льш в i рог 1 дно, ир регулящя к!лькост! б!лку в асощащ! з мРНК, могла б реал!зовуватись через мо-диф1кащю такого регуляторного бiлку. В свою чергу, для бага-тьох ¡нформосомних 61лк1в показано фосфорiлювання в склад! íh-формосом. Щрб перев!рити можливють фосфор 1 лювання р50, препарат в!льних i полюомних шформосом фосфор!лювали in vitro. Б1лок р50 фосфор!люеться як в вишних, так i в шшсомних !нформосомах, щр св!дчить про присутнють в склад! 1нформосом ендогенно! проте1нк1нази, оск1льки очищений б1лок р50 не спро-можний фосфор!люватися (дан! не приведен!). В лиератур1 наведен! дан!, зпдно яким фосфор i лювання регуляторного б1лку 60 кДа в склад! 1нформосом ооципв Xenopus эб1льшувало константу аеощац!! цього б1лку до мРНК в результат! чого знижувалась транслящйна активнють таких 1нформосом (Kick 1987). Висказу-валось припущэння про эв'язок М1ж низьким р!внем транслящ i !нформосом Xenopus в гетеролопчних системах трансляц!! 1 в!дсутн!стю в цих системах, фосфатаз дефосфор1лкж)чих вказаний б1лок. Шрб перев!рити припущення про роль фосфор1люфання-дефос-фор1люванкя р50 в регулящ i транслящйно! активност! мРНК 1нку-бували препарат ¡нформосом (котрий попередньо був фосфор1льова-ний in vitro) а б1лками 0,5 VI KCl-змиву з рибосомних субчасток ретикулоцинв кроля. Як видно а малюнку 7, июля !нкубащ! пре-

30 кДа-

few *** r95 scia

—;.

L68 i ■ к Да

кДа

-25 кДа

а 6

Ыал.7. радюавтограф електрофореграми б!лк1в в!льних 1нформо~ сом, фосфор шованих in vitro (a) i фосфор 1льованих б!лк1в пюля ¡нкубаш) препарат у 1нформосо м а 0.5 М KCl-змивом э рибо-сомних субчастин ретикулоципв кроля (б).

парату Шформосом в б!лками змиву на радюавтограф! вникла полоса шр в!дпов1дае б!лку р50. В той же час на електрофореграш не сталось эм1ни в штенсивност! полоси в1дпов1даючо'! б1лку р50, щр св1дчить про в1дсутн1сть деградащ'1 цього б!лку в про-цес1 шкубащк'. Таким чином, 0,5 Ы KCl-змив мютить фосфатазу, специф1чно дефосфор1люючу б!лок р50. Ми висунули припущены?, го саме наявнють тако* фосфатазй спричиняе активашю 0,5 М зми-вом трансляцп в1льних шформосом в безклттн1й систем1 з за-родк1в пшениц!. Шрб перев1рити, як впливае фосфор!лювання р50 на його асоц1ац1ю з мРНК, фосфор1льован1 in vitro шформосоми В1ДД1ЛЯЛИ в1д фракцП в 1 ль них б1лк!в гельф1льтрац!ею на смол! Superóse 6В. Б1лки kojkhoí фракцП розд1ляли електрофорезом 1 проводили радюавтограф1ю б1лк!в kojkhoí фракцП'. На малинку 8а. аображена електрофореграма б!лк!в вих1дного препарату шформосом, на малюнку 86 1 8в - електрофореграма " важно i' " 1 "лег-Koi" фракцП шформосом, а на малюнку 8г - електрофореграма в1льних б!лк1в, пр не'8в'язан! з мРНК. У bcíx фракцшх присут-Н1й 61 лок р50, але в фосфор i льованому стан i цей биок 1ден-тиф!куе ться лише в вих1дному препарат! шформосом, та в фракцП' 1нформосом в як1й з мРНК зв'язана найб1льша доля тотального б!лку (тобто в фракцП', яка теоретично знаходиться в б!льш транслящйно репресованому стан!) малюнок 9. Навпаки, в в1ль-ному стан! не спостер!гаеться фосфор 1лювання б1жу р50, це на нашу думку св1дчить про те, щр дисотювати з мРНК можуть лише молекули р50, як! не зазнали фосфорiлювання.

Таким чином, можна припустити юнування в ретйкулоцитах кроля механшму penpecii-активацП' трансляцП !ндив!дуальних мРНК, пов'язаного з фосфор1люванням-дефосфор1люванням регулятор-ного б1лку шформосом з молекулярной масою 50 кДа. На малюнку 10 схематично аображено модель такого механ1зму. Зпдно наведено'! модел! б1лок р50 моле асоцхювати 1 дисотювати з мРНК в зале jkhocti В1Д того, знаходиться вш в фосфор i льованому , чи де-фосфор1льованому стан!. Транслятйна активнють 1нформосом аалежить в1д сшвв1дношення активност! ендогенног протешкша-аи, фосфор!люючо!' 01лок р50 (в результат! чого зростае його спориненють до мРНК) 1 протеШфосфатааи, асоц1йовано'1 а рибо-сомними субчастками ретикулоципв кроля котра специф!чно дефос-фор1люе р50 (в результат! чого цей б!лок дисотюе з мРНК, а ос-тання переходить в транслящйно активний стан). В1дсутн!сть

t '

68 кДа 45 кДа - I

•50 кДа

25 кДа ^

а б в г

Мал. 8. Електрофореграма вих1дного препарат/ б!лк!В в1льних 1нформосом ретикулоциПв кроля (а), б!ЛК1в шр 1дентиф1куються в склад! 1нформосом (б,в) та OiJKiB як! не асоц!йован! з мРНКХг)

Мал. 9, Радюавтограф електрофореграми фосфор 1льованих in vitro 61ЛК1В в!льних !нформосом ретикулощшв кроля (а), фосфор!-льованих б1лк1в, шр !дентиф!кушься при гельф!льтрац11 в асотацИ з 1нформосомами (б, в) та фосфор!льованих б!лк!в, не асощйованих з мРНК (г).

0

-68 кДа

а б В г

Еих1дний стан. Воображено присутнють в клтап гнформосом, шр М1стять б!лок р50 та ендогенну проте хнкшазу, АТР, рибосомних субчасток з котрими асоц!йована проте1кфосфатаэа, щр дефосфор!-

люз р50. V V V .V

^ П П П По

/

Активы¿сть протегнфос-фатази В1ще активност1 проте шк: наги. Ке в!д-буваеться фосфор!лю-ваяня всIX молекул р50 в склад! !нформосом.

I V V V V ^ г(/ппо__

Ш фосфорьиован! молэ-кули р50 дюощюзть э

Гоа

1нформосоми переходить в транслящйно активний стан.

И

оо,

мРНК ■АТР

\

Актизшсть проте ш-К1наги вище активное« проте шфосфатаэи. В1д-буваеться фосфор!люван-ня р50 в склад! !нфоркосом та зб!льшення коне-А ОЛ 4 '1 См. ощац!! р50 з мРНК.

О

ПОЗНАЧЕККЯ. о

рибосомн! частиккирч

б1лок р50 □

енгдогенна протеашназа о

проте шфосфатааа ¿гй

О"

3 кРНК асощйовано 4 мо-лекули быку р50. Транс-лящйно репресований ста^ . ! нформосом.

Нкзький ревень транслявдйно].' активкссп в1льких ! нформосом ретикулоципв кроля ' в Сезкл1тккн!й систем! транрля-ц!1 з зародк!в пшениц! обу-м0вл9ний в1 дсутнютю проте Шфосфатази, дефосфор!люючоХ р50.

АШ

Изл.10 Схеьатичке зображання модел1 мзхан!зму регудяцх1 транс-лящйно! активности мРНК б!лками !нформосом.

трансляц!i В1льних 1нформоссм ретикулощшв кроля в безкл1тинн1й систем1 з зародк1в пшениц! можна пояснити В1дсутн1стю в ц!й систем! протешфосфатази, дефосфор^юючо! р50.

ШСНОВКИ.

1.1нформосоми ретикулоцит!в кроля являються оптимальною системою для досл!дження модуляш i' транслящйно!' активност! мРНК б1лками 1нформосом.

2. Б1лки в!льних !нформосом роз'еднуюгь апарат трансляц!I з МРНК, на В1ДМ1НУ В1Д 61ЛК!В ПОЛ!СОМНИХ iH$OpMOCOM, чим 1 поясню-еться низька трансляц! йна активн!сть вианих i нформосом ретикулощшв кроля в Севклтший систем! трансляц!'! э зародк!в пшениц!.

3. Фракшя б!лк!в 0,5 М KCl-змиву з рибосомних субчастинок ретикулощшв кроля, щр осаджуеться 25-40% сульфатом амонно, спричиняе найб!лыиий акгивуючий ефект на трансляц!ю в!льних ¡нформосом в безкл!тинн1й систем! трансляц!i з зародк!в пшениц!, що вказуе на присутн!сть в н!й б!лку - активатора трансляц! 1.

4. В результат! розробки методу очистки i вид!лення з в!льних

!нформосом ретикулощшв кроля б!лку з молекулярного масою 50 кДа вдалось доказати, щр цей б1лок бшш специф!чно шгибуе in vitro трансляц!ю мРНК глоб1ну i значно менш специф!чно 1нгибуе транслятю мРНК BMV та J& галактрз 1дази, щр дозволяе припустити 1нгиб1 торну роль р50 при трансляцГ! in vivo.

5. BiioK р50 !дентиф1кований як в склад1 В1льних, так ! полЮомних i нформосом, але в складi В1льних i нформосом з одшею молекулою мРНК асощйовано 4 молекули р50 а в склад! полюомних !нформосом - 2 молекули цього б!лку.

6. На основ i отриманих даних запропонована ( модель регулящ* трансляц!йно'1 активност1 мРНК в склад! мРНП-часток з участю б!лку р50, эндогенноi проте!нк!нази, фосфор!люючо! р50 i фосфатази,

що специф!чно дефосфор1люе вказаний б1лок.

Список po6iT, опубл!кованих по материалам дисертац!i: 1. W. Minich, I. Maidebura, L. Ovchinnlkov. p50 protein is responsible for repression of translation of rabbit reticulocyte free mRNPs // Abstracts 20th Annual Keystone Symposia on Molecular & Cellular Biology (Viley-Liss, 1991).-

1991.- P. 199.

2. W. Minich, I. Maldebura, L. Ovchinnikov. Purification and characterization of the major 50-kDa repressor protein from cytoplasmic mRNP of rabbit reticulocytes // Eur. J. Blochem.-1993.- V. 212.- P. 633-638.

3. 0. IL Майдебура, I. П. Майдебура. Ситогормональная регуляция трансляции мРНП-частиц опсредуется ассоциированными с ними белками // Теэ. Докл. Конференции молодых ученых "Актуальные вопросы биологии и экологии" (Ялта 19-21 октября 1993 г.). - Стр. 80.

4. Е Миних, Л Иайдебура, Е Корнеева, Е Евдокимова. Выделение и свойства белка с молекулярной массой 50 кДа из свободных цитоплазматических мРНП-частиц ретикулоцитов кролика // Украинский Биохимический Журнал.- 1994 г.- N 1.- С. 62-65.

5. И. Майдебура, Н. Корнеева, Е Миних. Фосфорилирование-дефос-форилирование белка информосом ретикулоцитов кролика с молекулярной массой 50 кДа и его возможное влияние на трансляцию мРНК // Украинский Биохимический журнал. - 1994. - N2. - С. 96-99.

Щдписано до друку 20.04.94r формат 60x84/16 ПапРр пру к. Уиов. друк. л. 1.0. Тираж 100 прииХрник. Заказ К«699_

Надруковано ДУОП ДНПП "Плодвинконсерв" и. Ки1в , Саксаганського , I