Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сложность нуклеотидных последовательностей мРНК вегетативных органов подсолнечника (Helianthus annuus L.)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сложность нуклеотидных последовательностей мРНК вегетативных органов подсолнечника (Helianthus annuus L.)"

ТТ"5—М--------------- —т--------------------------------

. л »ч; и ІГ.ГХ ■

І Ч ' - ■

’ ' На правах рукопису

КУНЦЕВИЧ Вікторія Ігорівна

УШ 547.963.3.

СКЛАДНІСТЬ НУКЛЕОТИДНИХ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ МРНК ВЕГЕТАТИВНИХ ОРГАНІВ СОНЯШНИКА (НеІіапШіБ аппииБ Ю

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на вдобуття наукового отупеня кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1004

Дисертацією е рукопис.

Робота виконана у відділі біохімії рослин Інституту фіБіологп рослин та генетики НАН України (м.Киів)

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор ЛОБОВ Віктор Павлович

Офіційні С.ЮНЄНТИ: доктор біологічних наук, професор ВОЯЦІЦЬКИЯ Володимир Михайлович

доктор біологічних наук НАЛИТА Станіслав Станіславович

Провідна організація: Інститут експериментальної ботаніки ІМ.В.Ф. Купревича АН Белорус і

Захист дисертації відбудеться 0( 1995 року

о 14°° годині на ваоіданні спеціалійованої вченої ради -Л 01.01.07 для еахисту дисертацій на біологічному факультеті Київського університету ім. Тараса Шевченка ; ва адресою: м. Київ, проспект Глушкова, 2, корп. 12. :

ПОШТОВА АДРЕСА: 252033, КИІВ-ЗЗ.ВУЛ. Володимироька 64, ■

спецрада Д 01.01.07,

біологічний факультет. . -

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці університету. •

Автореферат рові слано ' 1994р. .

' Вчений оекретар опеціалівованої ради, м—■— кандидат біологічних наук» професор (ґ7£)БРАЙОН

Актуальність і ступінь досдідлюності тематики дисертації. Вивчення диференціальної активності генів в процесі індивідуального розвитку рослин є одним з фундаментальних напрямків сучасної біології. Подальший розвиток біохімічних та генно-інженерних методів зумовив інтенсивні дослідження на молекулярному рівні окремих індивідуальних генів та відповідних матричних РКК, визначення їх первинних структур. Однак характеристика експресії одного чи декількох генів не дає уяви про.функціонування всього геному, ЯК ЄДИНОЇ, у ВИЩІЙ Мірі організованої структури. Практично відсутні роботи по регуляції експресії генетичної інформації рослин на посттран-скрипщйному рівні.

Внаслідок того, що регуляція експресії геному обумовлює функціонування певного набору структурних генів, необхідних для конкретного етапу розвитку багатоклітинного організму, один із аспектів вирішення цієї багатогранної проблеми пов’язаний з аналізом кінетичної складності нуклеотидних послідовностей мРНК та їх попередників ( кінетична складність нуклеотидних послідовностей - це сума довжин фрагментів всіх видів (по одній послідовності кожного виду)). Для вищих рослин така оцінка матричних та ядерних РНК у морфогенез і до сьогоднішнього часу проведена лише для тютюну [БоісіЬєгй Я. В. ,1988]. До того ж, вивчення регуляції експресії рослинного геному на транскрипційному і посттранскрипційному рівнях потребує наявності даних про структуру самого геному. Це зумовило обрання об’єктом досліджзнни соняшник (НеІіапШБ аппиіш Ь.), для якого детально проаналізовані особливості структури геному, проведена оцінка^інетичної складності нуклеотидних послідовностей тотальної ДНК та окремих компонентів геному ІЛобов К И , Тищенко Б. Е, 1984]. Такі дані надають можливість оцінити складність популяцій яРНК та мРНК. В свою чергу, порівняння складностей нуклеотидних послідовностей'яРНК різних органів, 8 одного беку, та співставленя їх зі складностями нуклеотидних послідовностей мРНК, що транслюються в цитоплазмі клітин, а іншого, дають загальну уяву як про диференціальну активність генів, так і про наявність регуляції експресії геному на транскрипці йному та посттранскрипці йному рівнях.

Мета та основні завдання дослідження. Метою роботи була оцінка диференціальної активності генів в процесі морфогенезу соняшника. У 8В’ язку в цим були поставлені слідуючі завдання:

1. Виділити полісоми, полісомну РНК is дводенних етиольова-них паростків , коренів 5-денних етиольованих паростків та 20-22 денних перших справжніх листків.

2. Виділити унікальні послідовності ДНК соняшника і вивна-

чити складність нуклеотидних послідовностей полісомної РНК органів, що вивчаються. •

3. Оцінити складність нуклеотидних послідовностей органос-пецифічних полісомних РНК

4. Виділити ядра і ядерну РНК паростків та коренів.

5. Провести порівняльний аналі8 складностей нуклеотидних послідовностей ядерних та полісомних РНК паростків та коренів.

Наукова новизна досліджень. Вперше досліджено полісомні мРНК вегетативних органів соняшника. Виявлено, що складність мРНК паростків і листків цієї культури у 4.4 рази перевищує складність мРНК коренів. Таким чином, вперше встановлена кількісна вариабельність. складності нуклеотидних послідовностей полісомних мРНК соняшника Показана наявність органоспе-цифічних мРНК в цитоплазмі клітин коренів і листків соняшника, дана їх кількісна оцінка. Вперше оцінена складність популяцій ядерних РНК в паростках і коренях соняшника. Показано, шр суттєва рівниця у складності популяцій мРНК паростків і коренів є наслідком процесів, шр відбуваються на транскрипційному і посттранскрипційному рівнях регуляції експресії геному соняшника.

Теоретична та практична цінність дослідження. Результати досліджень свідчать про те, що модель органоспецифічної регуляції експресії геному на транскрипційному та поеттранскрип-ційному рівнях, створена на основі досліджень, виконаних на рослинах тютюну (Karralay and Goldberg, 1984; Goldberg, 1986) не є універсальною. Регуляція експресії геному соняшника на транскрипційному та посттранскрипці йному рівнях вдійонюєтьоя по дешд іншому типу. Отримані дані поглиблюють уявлення про диференціальну активність генів в онтогенезі вищих рослин, можуть бути використані при створенні сучаоної теорії індивідуального розвитку рослин, стати теоретичною базою для отво-

. - з - . .

рення генно-інженерними методами нових сортів сільсько-господарських рослин, поліпшення властивостей існуючих культур.

Реалізація та впровадження наукових розробок. Робота виконана по завданню 10. Н2 цільової науково-технічної програми

0.74.05, по проблемі 5.1.1.4 КП ІЇГП і пов'язана 8 планом науково-дослідних робіт відділу по темі 2.3.6.230.

Апробація результатів наукових досліджень. Матеріали дисертації доповідались на II 8’ївді Всесоюзного товариства фівіологів рослин (Мінськ, 1390), VI Українському біохімічному 8’їзді (Київ, 1992), II з' їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ,1993).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 робіт.

Структура та обсяг дисертаційної роботи. Дисертація складається із вступу, 5 розділів, узагальнення та висновків, викладена на 109 сторінках машинописного тексту, до якого входять 11 малюнків, 4 таблиці. Список літератури становить 149 джерел, 8 яких 101 іноземне.

На захист пшюсяться:

1. Дані щодо оцінки кінетичної складності нуклеотидних послідовностей полісомних та ядерних РНК вегетативних органів соняшника.

2. Результати порівняльного аналізу складностей всього геному, фракції, унікальних послідовностей ДНК, яРНК, полісомних РНК, органоспецифічних мРНК, які свідчать про наявність регуляції експресії генів на рівні транскрипції і відображають диференціальну активность генів в процесі морфогенезу соняшника.

Особистий внесок дисертанта у розробку наукових результатів. Дисертантом разом з науковим керівником були окреслені мета і вавдання досліджень, самостійно проаналізовано і узагальнено результати досліджень. Отримані дані обгрунтовані теоретично, зроблені відповідні висновки, що відображено в дисертації та літературі.

Дисертант висловлює вдячність с. н. с., к.6. н. 0. М. Тищенко, в науковій групі якої були отримані результати досліджень.

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об’єктами дослідження були полісомні та ядерні РНК 2-денних етиольованих паростків, коренів 5-денних етиольова-

них паростків та 20-22-денних перших справжніх листків соняшника сорту Передовик. Паростки вирощували в рулонах фільтрувального паперу на дистильованій воді в термостаті при t=26-28°C. Для отримання перших справжніх ,листків рослини вирощували у вегетаційних посудинах, в грунтовій культурі в теплицях при нормальному рівні освітлення. .

ДНК виділяли is 7-денних етиольованих паростків соняшника sa методикою, що описана раніше [Лобов RIL ,19841.' Щрб відокремити одно- та дволанцюгову ДНК використовували гранульований оксиапатит, синтезований ва методом Мазі на А. А. [1975]. Щоб отримати унікальні послідовності ДНК соняшника сумарний очищений препарат ДНК попередньо фрагментували ультразвуком 8 частотою 22 кГц на УЗДН-1 в 0,12 М ФБ (фосфатний буфер- екві-молярний розчин NaHzPCU та NasHPCU) , pH 6,8 при 4°С на протязі 180 секунд і два рази реасоціювали ДНК до Cot 100 (добуток первісної концентрації ДНК та часу інкубації, виражений в моль с/jl). Надалі, унікальні послідовності ДНК, щр вв’язалися з оксиапатитом, елююваж 0,5 Ы ФБ при 60°0 та мітили методом нік-трансляції ва рекомендаціями фірми Amarsham і відокремлювали обернені повтори за методом toys is R.K.C1981J. Активність фракції вимірювали в сцинтиляційній рідині ХС-8 на лічильнику Isocap-300. '

З метою відокремлення і8 розчинів сахарози можливих білкових домішок, зокрема активних ферментів, буфери, що містили сахарозу, обробляли ва допомогою ДЕАЕ-целюлози.

Полісоми виділяли за модифікованим методом [Jackson A. D. ,1976]. Якість препаратів полісом контролювали по спектральним показникам та по седиментограмам, реєструючи оптичну щільність ультрафіолетовим фотометричним детектором ( 0КБ, РАН ). Препарат полісом розділяли в 15Z-45Z градієнті сахарози, відбирали фракцію з коефіцієнтом седиментації більш ніж 100S, обробляли ЕДТА і відокремлювали фракцію полісом в коефіцієнтом седиментації менш ніж 80S. Шлісомну РНК виділяли за модифікованим методом !Любимова Е.В.. 19771. Концентрацію та рівень чистоти РНК та ДНК визначали вимірюванням оптичної щільнлсті ро8чинів на спектрофотометрі Specord И-40 .

Ядра is паростків та коренів виділяли за модифікованим методом 1 скакова Б. К [1988]. Якість препарату контролювали під

■ - 5 -

мікроскопом. Підрахунок ядер проводили в камері Горяева. Ядра фарбували оцтовокислим миш’яком. Для отримання ядерної РНК використовували метод Маніатіса Т.С1984Л, дещр модифікований нами на етапі лізису ядер. -

аН-нуль-мДНК паростків соняшника відокремлювали за методикою [Kamalay J. С. ,19801. Гібридизацію УП ДНК 8 РНК проводили в 1 М NaCl, 0,01 М ФБ, 0,005 мМ ЕДТА при 66°С до необхідних значень Rot (добуток первісної концентрації РНК та часу інкубації, виражений в моль-л/с). Фракцію гібридних молекул ДНК: РІЖ визначали на допомогою хроматограф! ї на колонках з окоиапатитом. Для кожного значення Rot оцінювали величину са-мореасоціації ДНК. Результати досліджень оброблялись статистично С Зайцев Г. а, 19731.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ .

1. Виділення ПОЛІПОМ І ПОЛІСОМНОІ РНК 8 паростків, листків

та коренів соняшника. Основні труднощі при отриманні препаратів будь-якої РНК - це усунення рибонуклеазної активності як під час виділення, так і на подальших етапах досліджень. Окрім цього, конкретні завдання досліджень та біохімічні особливості кожного окремого виду організмів ставлять додаткові вимоги щодо методичних ПІДХОДІВ. Так , виділення РНК і8 РІЗНИХ органів соняшника було пов'язано не лише з інактивацією РНКаз, а й з максимальною очисткою РНК від білків і полісахаридів. Крім ТОГО, ВИХОДЯЧИ 8 кінцевої мети дослідження, необхідно було відокремити мРНК, ер транслюються в цитоплазмі, від домішок ядерної РНК та ДНК.

Виходячи 8 цього, на перших етапах досліджень виділяли по-лісоми і8 паростків, коренів та листків соняшника, із яких потім і отримували препарати РНК. За основу був В8ятий метод [ Jackson A. D. Д9761 дэщо модифікований нами. Зокрема, враховуючи наявність е органах соняшника активної поліфенолокоида-зи, в буфер для гомогеніваці ї вводили антиокислювач - аскорбінову кислоту. Окрім цього, наша модифікація передбачала додавання до постмітохондріального супернатанту клітинного лі-вату неіонного детергента а метою екстракції мембранно-вв’язаних полісом. Як наслідок, вихід сумарного препарату дорів-

2-1495»

. - б -нював для паростків - 0,9-1,1 мг/г , а для листків та коранів відповідно 0,4-0,6 мг/г та 0,3-0.4 мг/г тканини. На рио. 1 наведений профіль седиментації полісом, виділених з паростків. Як видно із седиментограми, ми одержували полісомний препарат високої якості: чітко виявлялися піки, що відповідають М0Н0-, ди-, три-... і, навіть, декасомам. Частка нуклеопротеїдів ів коефіцієнтом седиментації більше ніж 100 Б (не деградовані полі соми) дорівнювала в препаратах 50-80%. З метою очистки полісом від ядерних домішок фракцію І (рис. 1) обробляли ЕДТА і розділяли в градієнті сахарози. На рис. 2 наведений профіль седиментації полісом, щр оброблені ЕДТА. Чітко розрізняються два піки із коефіцієнтами седиментації менше ніж 80 Б, тому що після обробки ЕДТА полісоми дисоціюють на субодиниці , в той час як на седиментограмах полісом, що не були оброблені, розрізняється до 10 піків. Відсутність високомолекулярних ПІКІВ на седиментограмах полісом, оброблених ЕДТА, свідчила про відсутність рибонуклеопроте І Д і в ядерної природи, виходячи І8 чого фракцію II (рио.2) полісом із коефіцієнтом седиментації менше ніж 80Б використовували для виділення сумарної полісом-ної РІЖ, коефіцієнти чистоти якої становили по полісахаридах 0Ггво/0Ггзо>2, а ПО бІЛКаХ 0Ггво/0ГЕео=1,9.

Рис. 1. Типовий профіль седи- Рис.2. Типовий профіль седиментації полісом паростків ментації полісом після оброб-

в градієнті сахарози. ки ЕДТА.

Таким чином, застосування модифікованих нами методів [Jackson А.0.] та [Любимова Е.В.З дозволяло отримувати високоякісні препарати недеградованих полісом та виділяти 8 них

чисті, позбавлені ядерних доміиок препарати РНК, які можна використовувати в дослідах з молекулярної гібридизації.

2. Виділення унікальних послідовностей Ліні соняшника Щоб оцінити кінетичну складність нуклеотилних послідовностей по-лісомної і ядерної РНК методом молекулярної ДІЖ/РНК гібридизації необхідно було отримати препарати унікальних послідовностей ДШС, які мають високий рівень реакційної здатності, мінімальні домішки повторюваних послідовностей, високий рівень мітісіі, а також, оціниш кінбіи'^іу сшадпість цієї фракції. Виходячи 8 цього УП ДНК соняшника, виділену на описано вище, мітили эН-дЦТФ ва допомогою системи для нік-трансляції' по рекомендаціям фірми Amrsham При цьому суттєвим етапом підготовки 3Н-УП ДНК було вилучення обернених повторів, що складали для соняшника в середньому 18%,. тому ідо їх наявність ввмозі значно вплинути на оцінку кінетичної складності ДНК і РНК. Питома радіоактивність 3ІІ-мічених .УП. ДНК дорівнювала 1,8-10° імп/хв-мкг.

На рис. З наведені результати кінетики реасоціацн ^Н-мічених УП ДНК з надлишковою кількістю немічених фрагментів ДНК. Унікальні послідовності ДНК соняшника реаооціювали вгідно кінетики реакції другого порядку, при цьому при початкових значеннях Cot частка реасоційованих УП ДНК не перевищувала 5Z, тобто препарат практично не містив домішок повторюваних послі дойностей, тоді як при кінцевих значеннях Cot біля 20Z цих послідовностей яе утворювали дуплекси, що . враховувалось при оцінці складностей нуклеотидних послідовностей мРНК і яРНК, а саме, вводилась поправка на кількість молекул ДНК, здатних до гібридизації. . . . . , .

Раніше було визначено, шо частка УП ДНК соняшник* складає 20,6% геному [Лобов В. П., 19841. Враховуючи, що розмір гаплоїдного геному соняшника дорівнює 4,66-109пар нукяеотидів, оцінили, що кінетична складність унікальних послідовностей ДНК становить 0,96-10а пар нуклеотидів. -

Таким чином, були отримані препарати 3Н-УП ДНК, які максимально очищені від домішок повторюваних послідовностей, мають високу питому активність мітіси, зберігають високу реакційну здатність і можуть бути використані в реакціях а молекулярної гібридизації з метою оцінки складності полісомних і ядерних

qdt

Рио. 3. Крива кінетики рвасошації ЭН-УП ДНК соняшника.

Рио. 4. КрИБі кінетики Гібридизації ЭН-УП ДНК соняшника 8 полісомними РНК паростків(І), листків(2) та корен і в( 3).

3. Кінетична складність полісомних РІЖ паростків, листків та коренів соняшника. Гібридизація аН-мічених УП ДНК з надлишковою КІЛЬКІСТЮ ПОЛІСОМНИХ РНК різних органів дозволяє оцінити кількість різноманітних мРНК, що функціонують в цитоплазмі клітин. Як видно із рис.4 криві гібридизації для паростків, листків та коренів досягають ділянки плато при рівних значеннях Rot-, а саме, для паростків та'листків - приблизно 5-Ю3, для коренів - 3-Ю3. Тобто, при цих значеннях Rot молекули ДНК і РНК утворюють всі можливі дуплекси. Саме на підставі максимальних значень кількостей аН-УП ДІЖ, шр гібридизуються і8 полісомними РНК, провели оцінку складності нуклеотидних послідовностей полісомних РНК досліджених органів. Розрахунки даних молекулярної гібридизації ДНК;РНК наведені в таб.1. Статистична обробка отриманих даних показала, шр Вірогідних відмінностей МІЖ КІЛЬКІСТЮ аН-УП ДНК, шр утворюють дуплекси із полісомними РНК паростків та листків, немає. При цьому, між кількостями аН-УП ДНК, шр гібридизуються із полісомними РНК паростків та коренів , існує вірогідна рівниця. Враховуючи поправки на асиметрію транскрипції та на кількість молекул ДНК , здатних до гібридизації, підра-

. - 9 -

хували, що скоректоване значення частки УП ДНК, що гібридизується з полісомними РНК, складало для паростків соняшника 14,68%, для листків - 14,70% та для коренів - 3,33%. На підставі цих даних оцінили, що кінетична складність мРНК, яка дорівнює добутку кінетичної складності УП ДНК та скоректованого значення частки УП ДНК, шр гібридизується з полісомними РНК, дорівнює в паростках та листках соняшника приблизно по 1,41-10а нуклеотидів, а в коренях - 3,2-107 нуклеотидів.

Таблиця 1.

Складність нуклеотидних послідовностей мРНК вегетативних органів соняшника ( М+т, п-4^6 ). '

Орган

Параметри молекулярної ДНК; РНК гібриди- заці ї 2-денний етиольова-ний паросток перший справжній листок корінь 5-денного етиольов. паростка

Частка УП ДНК,%, 1^ 5,87+0,21 5,8810,21 1,33+0,01

Скоректоване значення часткі УПДНК,%, 2? 14,68+0,53 14,70+0,53 3,33+0,03

Частка генома, %, 3)* 3,02+0,11 3,0310,11 0,6910,01

Сімадніоть полісомної РІЖ , нуклеотиди, 4)* 1,41-10а+ 5,14- 10е 1.41-10аі 4,97-10е з.го-ю7! 2,55-10в

Кількість генів, 5^ 94000+3400 94000+3000 : 21300+170

у Примітка. 1)-кількість яІІ-мічоних УП ДНК, яка гібридизується о надлишково» кількістю полісонно і РНК в області плато; 2)-частка УП ДНК- 2/0,8; 3)-величина, що дорівнює добутку частки унікального компонента геному (20,6%) та частки УП ДІЖ, що гібридизується 8 полісомними РІЖ; 4)-добуток кінетичної складності УП ДНК(0,96-Ю9пар нуклеотидів) та скоректованого значення частки УП ДНК; 5)- складність мРНК/1500, де 1500 -середній розмір мРНК в нуклеотидах. '

- to -. •

Згідно літературних даних довжина різних молекул мРНК може вначно відрізнятись, але середній розмір рослинних мРНК варіює в межах 1 300 - 1 500 нуклеотидів CKamalay J. ,19801. Якщо припустити, що середній розмір мРНК дорівнює 1500 нукле-отидів, то кількість генів, що експресується в паростках, листках та коренях відповідно складає 94 000, 94 000 та 21 300 різноманітних транскриптів. При цьому, враховуючи, ' що унікальні послідовності ДНК у геномі соняшника становлять 20,6%, підрахували, що в полісомах вегетативних органів рослини 3,2-10г - 14,10-10^ нуклеотидів різноманітних мРНК транскрибуються лише з 0,69 - 3,03% всього геному соняшника.

Внаслідок молекулярної гібридизації УП ДНК з полісомними РНК паростків 14,681 УП ДНК утворює дуплекси з матрицями, функціонуючими в цитоплазмі клітин паростків.' Інші 85,32% УП ДНК, що не представлені в полісомах паростків, отримали назву нуль-мДНК паростків. Гібридизація цієї фракції УП ДНК з полі-сомними РНК коренів та листків дозволяє виявити набори матриць, функціонуючих лише в клітинах цих органів і відсутніх в цитоплазмі клітин паростків, визначити складність органоспе-цифічних РНК і оцінити тим самим диференційїзу активність генів в процесі морфогенезу соняшника. В зв'язку з цим, нами була відокремлена фракція нуль-мДНК паростків і проведена молекулярна гібридизація з полісомними РНК листків та коренів. Як видно із результатів, наведених в таб. 2, частка 3Н-нулЬгмДНК, що гібридизувалася і8 полісомними РНК листків та коренів, складала відповідно 0,37% та 0,34%, в той час я?: 3Н-нуль-мДНК і8 полісомними РНК паростків практично не гібридизувалася. Оскільки складність нуклеотидних послідовностей фракції 3Н-нуль- мДНК дорівнювала 8,19-Ю9 нуклеотидів, оцінили, що складність нуклеотидних послідовностей органоспеци-фічних мРНК листків та коренів відповідно склад аг 7,58-10® нуклеотидів та 6,96-10внуклзотидів, а це становить лише 0,072 та 0,066 % воього геному рослини. Тобто в. 22-денних перших справжніх листках соняшника з'являється приблизно 5 000 нових функціонуючих мРНК відносно до всього спектру мРНК 2-денних паростків, а в коренях 5-денних паростків, хоча Батальна складність мРНК в 4,4 рази менше, ніж складність мРНК пароо-. ТКІВ, 8’являється біля 4 600 нових матриць, шр не функцюну-

- 11 r

шь в цитоплазмі клітин 2-денних паростків соняшника.

Таблиця 2.

Параметри молекулярної'гібридизації 3Н-нуль-мДНК паростка в полісомними РНК листків та коренів соняшника ( Міт, п«4т6 ).

Опган

Параметри молекулярної: ДНК: РНК Гібридизації : Перший справжній : листок : Корінь 5-денного етиольованого паростка

Частка 3Н-нуль-мДНК, % : 0,37 + 0,02 : 0,34 ± 0,03

Складність мРНК, : нуклеотиди 7,5810а+3,68-10в: 6,96- 10аіб,75- 10а

Кількість генів : 5 000 і 245 : 4 600 і 450

Частка генома , X : 0,072 і 0,004 : 0,066 ± 0,006

Таким чином, з'ясовано, що на відміну від даних [Kamalay J. С. and Goldberg R. В., 1984] щодо полісомних РІЖ вегетативних органів тютюну, кінетична складність яких майже не відрізняється, б вегетативних органах соняшника реалізується інформація з рівної кількості різноманітних генів. Показана надлишковість всього геному в цілому і надлишковість ун і -ісальїшх послідовностей ДНК. При цьому, гібридизація нуль-мДНК паростків з полісомними мРНК листків та коренів дозволила виявити, що складність органоепецифічних мРНК цій органів відповідає лише 0,066%-0.072% всього геному.

4. Складність нукіеотщщих послідовностей пРНК паростків та коренів соппшншга. Процеси диференціації та морфогенезу б рослинних організмах характеризуються експресією специфічних наборів генів. Оцінити роль транскрипційного та посттран-скрипційного рівнів регуляції у формуванні спектрів послідовностей мРНК, функціонуючих в окремих органах рослини, можна вавдяки порівнянню наборів яРНК рівних органів та відповідних наборів мРНК. '

c -

Лля оцінки складності послідовностей яРНК паростків і коренів на перших етапах було відпрацьовано метод виділення ядер 8 досліджуваних органів. Попередньо був застосований метод виділення ядер в ступінчатому градієнті сахарози [Hamilton R.Н. ,1972], однак ні варіації в солевому складі буферів, ані в процентному вмісті сахарози не принесли жаданого результату. Препарат, отримуваний цим шляхом, містив більшість зруйнованих ядер. Навпаки, використання дещо модифікованого методу, заснованого на концентруванні ядер у вузькій ЗОНІ між 50Z і 807. гліцерином, дозволяв отримувати препарати з високим виходом незруйнованих ядер, що становив в середньому 5,1-10Q+0,8-10а ядер на грам рослинної тканини. Абсолютна кількість яРНК, що виділяли 8а дещо модифікованим методом Маніатіса Т. [1984] , в коренях та паростках коливалась в межах 0,01 - 0,03 пг РНК/ядро.

Таблиця 3.

Складність нуклеотидних послідовностей яРНК паростків та коренів соняшника ( M±m, n-5f7 ).

Орган

Параметри молекулярної: ДНК:РНК Гібридизації : 2-денний етиольо- : ваний паросток : Корінь 5-денного етиольованого паростка

Частка УП ДНК, 7. : 20,92 і 0,62 : 3,23 і 0,22

Скоректоване значення : частки УП ДНК, 7. . : 50,47 і 1,50 : 7,88 + 0,54 .

Частка генома, % • 10,40 і 0,16 : 1,62 ± 0,01

Складність яРНК, : нуклеотиди : 4,85- 10аі7,27- 10а : 7,57" 107'±4,10' 10в

Наступним етапом досліджень стало визначення та порівняння кінетичної складності нуклеотидних послідовностей яРНК паростків та коренів соняшника, складність полісомних РНК яких

відрізнялась в 4,4 рази. Таб. З містить основні показники молекулярної ДНК-яРНК гібридизації паростків та коренів соняшника. Зокрема, в ядрах паростків транскрибується в 6.41 раза більше яРНК ніж в ядрах коренів. При цьому порівняння ядерних

і шшсомних РНК паростків і коренів дозволило встановити, щр складність полісомної РНК паростків в 1,86 рази більша за складність ядерної РНК коренів. Це є прямим свідотством того, що регуляція експресії геному соняшника на транскрипційному рівні зумовлює кількісні та якісні відмінності в наборах мРШ, що транслюються в цитоплазмі клітин паростків та коренів.

Що стосується повноти експресії генетичної інформації соняшника та диференціальної активності генів, то рис. 5 наочно демонструє співвідношення складностей всього геному соняшника, його унікального компонента та отриманих даних пвдо складності ядерних та полісомних РНК паростків та коренів рослини.

Зокрема, складності яРНК паростків та коренів соняшника перевищують складність полі сонних мРНК відповідно в 3,44 та 2,37 рази, складаючи при цьому десяту, або навіть меншу частку геномі'.

ЮО

20.6

Л

т

(а)

Ш2

Геном УП ДНК ЯРНК МРНК

/0.4

□

(б)

20,6

1,82 0,бд

СЭ

Геном УП ДНК яРНК мРЩ

о

■ Рио.б. Нуклвотвдні послідовності 2-денних етиольованих паростків (а) та коренів 5-денних етиольованих паростків (0) ооняшника.

Кйлонка відображає окладність нуклеотидних послідовностей фракції нуклеїнових кислот, виражену в X генома.

- - 14 -

Узагальнення. Таким чином, методом молекулярної гібридизації УП ДНК в надлишковою кількістю полісомних та ядерних РНК оцінено складності нуклеотидних послідовноотей мРНК та яРНК вегетативних органів соняшника, а також органоспецифічних мРНК листків та коренів, які відбивають повноту експресії всього геному рослини і диференціальну активность генів в процесі морфогенезу соняшника. Порівняльний аналіз отриманих даних свідчить, що регуляція експресії генів соняшника на транскрипційному рівні зумовлює кількісні та якісні відмінності в наборах мРНК, щр транслюються в цитоплазмі клітин паростків та коренів.

ВИСНОВКИ.

- 1. З'ясовано, що в полісомах дводенних етиольованих паростків, 20-22-денних перших справжніх листків та 5-денних коренів представлено відповідно 1,41-10а; 1,41-10® та 3.20-10г

нуклеотидів різноманітних молекул мРНК, які транскрибуються 8 3,03%; 3,03% та 0,69% геному. Складність нуклеотидних послідовностей мРНК паростків та листків в 4,4 рази перевищує складність мРНК коренів. .

2. Досліджено, шо в коренях соняшника функціонує 6,69-10е нуклеотидів, а в листках - 7,58-10® нуклеотидів мРНК, щр відрізняються від мРНК паростків. В цілому, в полісомах вегетативних органів соняшника представлено 1,58-10а нуклеотидів різноманітних мРНК, чи 100600 транскриптів середнього розміру,

3. Визначено, шр складність нуклеотидних послідовностей яРНК паростків та коренів дорівнює відповідно 4,85-10® та 7,57- 10г нуклеотидів, що в 3,44 та 2,37 разів перевищує складність відповідних полісомних мРНК.

4. Виявлено, шр яРНК паростків і коренів транскрибуються в

10,40% і 1,62% геному роолини, при цьому тільки 29,13% нуклеотидних послідовностей яРНК транслюються в. полісомах паростків і 42,27% нуклеотидних послідовностей яРНК транслюються в полісомах коренів. .

5. Визначено, щр в ядрах паростків соняшника кількість різноманітних яРНК в 6,4< раза перевищує кількість різноманітних яРНК в клітинах коренів. Окрім цього, складність яРНК коренів в 1,86 раза менше , ніж складність полісомних РНК паростків.

6. Вперше виявлена кількісна варіабельність складності нуклеотидних послідовностей полісомшх та ядерних РНК вегетативних органів. Порівняння складностей полісомних та ядерних РНК свідчить про наявність регуляції експресії геному соняшника в процесі морфогенеза на транскрипційному та лосттран-скрипційному рівнях.

Рекомендації. Отримані дані можуть бути покладені в, основу подальших досліджень особливостей регуляції експресії генів в онтогенезі соняшника, бути використані при створенні сучасноі теорії індивідуального розвитку рослин, в навчальному процесі. СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ. .

1. Лобов RIL, Тищенко Е. Е, Кунцевич В. И. Сложность нуклеотидных последовательностей полисомной РНК вегетативных органов подсолнечника // Физиология растений.-1991.-38. вып. 6.-

С. 1110-1116.

2. Лобов Е П., Тищенко Е. Е , Кунцевич Е И. Количество и разнообразие транслируемых мРНК проростков и листьев подсолнечника// Доповіді. АН України.-1992.-5.-С. 135-137.

3. Кунцевич В. И., Тищенко Е. Е , Лобов Е П., Хилько Т. Д. Сравнительное исследование ядерной РНК и полисомной мРНК проростков подсолнечника // Укр. биохим. журн. -1994.-Т. 66. -N5. -С. 96-100.

4. Тищенко Е. Н., Сакало Е Д. , Кунцевич Е И. , Еилинская А. Т. Сложность ядерной РНК проростков и корней подсолнечника //

.Доповіді АН України. -1994.-N8.-С. 162-165.

б. Тищенко- о. М., Кунцевич Е І. Нуль-цДНК паростків соняшника // VI Український біохімічний в'їзд. Тези доповідей.гКиїв.-1992.-Ч. 2.-0. 53.

6. Тищенко Е. Н., Кунцевич Е И., Лобов Е П. Сложность нуклеотидных последовательностей мРНК вегетативных органов подсолнечника // Второй съевд Всесоюзного общества физиологов растений. Тевисы докладов. - Москва. -1992. -Ч. 2. -0.209.

7. Тищенко 0.Ы., Кунцевич Е 1. .Москаленко 0. Е , Лобов ЕЕ Варіабельність складності нуклеотидних поолідовноотей полі-сомної РНК коренів та паростків соняшника // II з’ївд Українського товариства Фівіологів рослин. Тези доповідей.-Київ. -1993.-Т. 2.-0.94-95.

8. Tishchenko Е. N., Kuntsevitch V. І., Bilinskaya А. Т. Nuc-

. - 16 -і lear RNAs in sunflower // 9th Congress of the FESPP. -Brno. -1994. -P. 11.

9. Tishchenko E. N., Kuntsevitch V. I., Bilinscaya A.T. Post-transcriptional ly regulation of some structural genes of sunflower// Congresul I, Prolemele fiziologiei si biochimiei plantelor. - Shisinau.-1994.-P. 86.

АННОТАЦИЯ

Кунцеви'' & И., "Сложность нуклеотидных последовательностей мРНК вегетативных органов подсолнечника".

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - "биохимия". Киевский университет им. Тараса Шэвченко, Киев, 1994.

Защищается 9 научных работ, в которых содержатся реэудьта-ты молекулярной гибридизации УП ДНК с избытком полисомных и ядерных РНК вегетативных органов подсолнечника. Впервые выявлена количественная вариабильность кинетической сложности нуклеотидных последовательностей полисомных и ядерных РНК вегетативных органов, которая отражает дифференциальную активность генов в процессе морфогенеза подсолнечника.

BRIEF INFORMATION

Kuntsevitch V. I. " Sequence complexities of polysomal RNAs from sunflower vegetative organs".

Thesis for obtaining a scientific grade of the Candidate of biological sciences on a speciality 03.00.Q^biochemistry, Kiev University named after Taras Shevchenko, Kiev, 1994.

The 9 scientific articals are defended. They contain the results of sensitive polysomal and nuclear RNA-excess/single-copy DNA hybridization reactions. For the first time we have discovered quantitive variability of polysomal and nuclear RNA sequence coplexities of vegetative organs, which reflect differential gene activity during sunflower morphogenesis.

Клвчові слова Неїianlhus annuus L. - експресія генома -нуклеотидні послідовності - полісомна РНК - органоспецифічні мРНК - яРНК. .

1-1495*