Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика библиотек кДНК эмбриональной печени и эмбрионального головного мозга человека комплексными зондами кДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика библиотек кДНК эмбриональной печени и эмбрионального головного мозга человека комплексными зондами кДНК"

РГ6 од

АКАДЕМЫ НАУК УКРЛКНИ

1НСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БГОЛОГН I ГЕНЕТИКИ

На правах рукопису УДК 677.214. 622

ДМИТРЕНЙО Володимир Володимирович

ОТРИМАННЯ I ХАРАКТЕРИСТИКА Б1ВЛ10ТЕК кДНК ЕЫБРЮНАЛЬНО* ПЕЧ1НКИ I ЕМБРЮНАЛЫЮГО ГОЛОВНОГО МО0КУ ЛВДИНИ КОМГШКСНИМИ ЗОНДАМИ кДНК

03.00.03 - молекулярна б!олог1я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацИ на здобуття вченого ступени кандидата б!олог1чних наук

КиЛв - 1903

Робота виконана у В1дд1л1 б1осинтеэу нуклеКнових киолот 1нституту молекулярно! б1олог11: 1 генетики АН УкраКни.

Дауюв1 кер1вники: доктор 01олог1чних наук,- професор Е М. Кавсан

доктор 01олог1чних наук А. Е Риндич

Оф1ц1йн1 опоненти: кандидат 01олог1чних наук А. П. Соломко академ1к 3. А. Бутенко

Ведуча орган1аац1я: Ки^вський 1нститут удосконалення л1кар*в Шн1стерства охорони здоров'я УкраХни

Захист дисертацН в1д0удеться -хсо£тн-р 1993 р. о А* год на вас1данн1 специал1зовано£ ради Д 016.11.01 1нституту молеку-лярно* б1олог1)£ 1 генетики АН УкраХни ва адресов: 252143, КиХв-143, вул. Заболотного, 1БО

3 дисертац1ею можна ознайомитись у 01бл1отец1 1нституту мо-лекулярно£ 01ологИ 1 генетики АН УкраИни.

Автореферат роз1сланий 1993 р.

Вчений секретар специал!зовано£ ради кандидат б!олог!чних наук

Л. Л. Лукаш

- АктуадьнЮть проблемы. Визначення вс!х ген!в, як! м1стить геном людини, е одним з найбхльш актуальних питань сучасног молекулярной б!ологН ! молекулярной генетики. На визначення повноХ структур!! спадкового апарату людини та механ1зм!в його функц!юван-ня спрямована м!жнародна програма "Геном людини". Однак визначення повно! нуклеотидног посладовност! геному людини, що е концевою ме-■foio uiei прогреми,- буде недостатнхм для того, щаб встановити будо-ву .reniB та ix регуляторних елементгв. Систематизована роэробка б1бл1отек кДНК рхзних opraniB людини, масттабне сиквенуг.ання кДКК сприяють вивченню картини к!льк!ено1 та як1сно5: експрес!.- ген1в у р!зних типах кл1тин, а також доповнюють результата по сиквенуванню геному людини.

ДисертаЩйна робота присвячена вивченню будови i експресН reniB, як! функц10нують в печ1нц1 та в мозку людини. В печхнц! синтезуетъся велика к!льк1сть б1лк!в, як! не виробляоться в !нтих типах кл!тин або синтезуються в ±нших кл!тинах в значно менших к:лькостях. На перших стадиях ембр!онального розвитку организму печ1нка е основним органом кровотворення. "Велика, кхлькхсть б1лкхв кров' яноХ плазми синтезуеться i секретуеться печенкою. Sa склад-н!стю мРНК печШки поступасться тхльки мРНК мозку, складн!сть якоХ найвиша пор!вняно з мРНК хнших тканин. 1снуе г!потеза, вхдповхдно до яко! посл1довност1 РНК, що транскрибуються в дан!й тканин!, та-кож трайскрибуоться в !нш!й тканин! з большою складнЮтю РНК. Тагам чином. разом тотальн! мРНК мозку i печ!нки аиадають транскрипти практично Bcix ген!в, як1 мостить геном лодини.

Експерименти по перехресн1й гхбридизацП надлишку мРКК однх-е 1[ тканини з кДНК 1ншо1 тканини показують, пр б1льш!сть ген1в, як! експресуюгься у р!зних кд!тинах визначаюгь функцН, Heo6xiflHi для BCix вид1в кл!тин. Q1 функцН називаоть "домашнхми" (housekeeping). Лише б1ля 10% посл!довностей мРНК даного типу кл!тин (для мРНК мозку - б!ля 5020 характерн! для цих кл!тин. Експрес1я таких мРНК наэиваеться тканино-специфичною. В !нших кл!_тинах вони або не експресуються зовс1м, або експресуюгься на духе низькому р!вн!. Так1 велик! р!эниц1 у репрезентативност! спе-циф!чних мРНК у р!эних кл!тинах дають можлив!сть характеризувати як!сно 1 к!льк!сно пул ген!в, ар експресуюгься в дан!й тканин! ор-ган!зму, за допомогою розробки б!бл!отеки кДНК комплексними пробами мРНК, або синтеаованими в1дпов!дними кДНК.

Мета i вавдання досл!джеиня. Уетою роботи було отримакня та характеристика б!бл!отек кДНК «мбр1оналъноЛ печ!нки та ембр!-онального головного мозку людини р1аннми комплексними пробами

- г -

кЛНК, вид1лення та характеристика ген1в, як! експресуються на мажорному р!вн! в цих органах i мають р!зн! типи спедиф1Чност1 eKcnpecii: "печ1нко-спедиф1чн1", "мозок-специф!чн!", "загальн!" (housekeeping), "ембрхональн!", "доросл1".

Для досягнення мети роботи посл1довно виртшувалось дек!лька аавдань:

1. Отримання бхбл^отек кДНК ембр1онально51 печ!нки i ембрхонального головного мозку людини у плазмедному 1 фаговому векторах.

2. Вид!лення груп ген1в з разним типом eKcnpecii за допомогою диференцхйного скрин!нгу б!бЛ10тек кДНК тотальними зондами кДНК р!зних тканин, зондом геномно* ДНК, зондами 1ндив1дуальних клоно-ваних кДНК.

3. Характеристика вид1лених генхв блотинг-гхбридизацхею, частковим сиквенуванням та комп'ютерним анал1зом визначених нукле-отидних послхдовностей.

Наукова новизна та практична ц1нн1сть роботи.' У результат! проведеноi роботи сконструйован1 б!бл1отеки кДНК ембр1онально5[ леч!нки людини у плазм!дноыу та фаговому векторах; за допомогою диференц!йно£ ПбридизадН з пробами тотальних кДНК р!зних тканин !з б!бл!отек кДКК ембр1онально1 печ1нки i ембр!оналыюго головного мозку 'людини вид!лен1 мажорн1 транскрипти з р!зними типами експрееН: "печ1нко-специфхчн1", "мозок-специф1чн1", "загальн!", "ембр1ональн1", "доросл!"; визначена нуклеотидна посл!довн!сть 61ля трьох десятк!в кДНК р!зних тип!в.

Комп'ютерний анализ нуклеотидних послхдовностей показав, цр первинн! транскрипти дек!лькох ген!в г р!зними типами eKcnpecii п!ддаються альтернативному процессингов! на стад!!' пол!аден!люван-ня 3'-К1нця з використанням одного й того ж сигналу пол!аден!лю-вання AAUAAA, в тому числ! в одному орган! одного !нд!в!дууму, адэ с не зовс!м звичним i мало досл!дженим явищем.

Б1льш1сть сиквенованих кДНК являють собою-.нев!дом!. не опубликован! ран!ие гени. Нуклеотидн! ! дедукован! ам!нокислотн! посл!довност! цих ген!в не виявили поы!тноХ гомолог!i н! з одн!ею а посл!дов!юстей у hoe!th!x верс!ях EMBL-банку, GenBank та PIR-банку.

Вид!лен! кДНК в подальоому будуть використан! для картування ген!в на !ндив!дуальних хромосомах, а також для вид!лення регуля-торних елемент!в, як! эабезпечуюггь в1дпов!дну специф!'чн!сть

eKcnpecii.

Досл!дження мають не т!льки теоретичний, але й практичний

1нтерес, оск!льки видЛлен! гени тхутъ бути використан! як эонди для диагностики певних захворювань, а також для створення ген-но-!нженерних конструкций для отримання ц!нних бхлкових продуктхв.

Апробац!я роботи. Результаты досд!джень докладались на 19-му э'1зд1 <1>ЕБ0 ( Рим, 1тал1я, 1989), 11-му мЮТародному конгрес! Шжнародного товариства биологii розвитку (Утрехт, Шдерланд:;. 1989), 1-й та П-й Всесоюзных конференцхях "Геном человека" (Пе-реславль-Залеський, 1990 и 1991), Свропейському конгрес! 61олог11 розвитку (IepycajuiM, 1зра£ль, 1991), VI-му з'1зд1 Украхнського товариства генетик:в та селекц!онер!в (Полтава, 1992), м!лмародних конференциях "Gene expression during liver differentiation and disease"(C0peHT0, 1тал1я, 1991), "Genome mapping and sequencing" (Колд Спринг Харбор, США, 1991, 1992 та 1993) та "Regulation of liver gene expression in health ang disease" (Колд Спринг Харбор, США. 1993).

Публ1кацП. По материалам дисертацН опубл:ковано 3 журнальн! статт!.

Структура та об'ем роботи. Дисертац1я складаеться з вступу, огляду л!тератури, експериментально! частини, bhchobkib та списку л1тератури, який м!стить кайменування. Робота викладена на -foq стор1нках машинописного тексту i мхстить 30 малюнки та 2 таблиц!.

МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ

Тканини людини для видхлення РНК були отриман1 з Укра5!нського центру ембр!ональних тканин (м.Ки1в).

Тотальну РНК вид1ляли з заморожених тканин людини гуан!д1н1-зот1оЩанатним методом (Chirgwin et al., 1979).

ПолКА)-РНК отримували фракц1онуванням тотально! РНК на ол1го^Т)- целшоз! (Aviv and Leder, 1972).

Синтез двухсп1рально31 кДНК проводили як описано (Maniatis et al. , 1982), використовуюч! власну зворотну транскриптазу э Blpycy м!елобластозу птах!в (Кавсан та !н. , 1975) та ДНК-пол1меразу I Е. coli. Для отримання зонду кДНК високо! питомо£ активност1 у pea-кц!ю зворотно! транскрипцИ бралося 250 - 500 мкКи "Pl-dCTP, а концентрац!я "холодного" dCTP зменшувалась до 25 мкМ.

Клонування кДНК у склад! плазм1дного вектору pBR322 проводили методом добавляння к!пцевих гомопол1мерних посл1довностей dG: dC (Maniatis et al., 1982), а у склад1 бактер!офагу XgtlO - за допо-могою синтетичних л!нкер!в EcoRI (Glover, 1985).

Для виявлення plarnoc клас!в reHiB були використан! эонди кДНК ембр!онально£ печ!нки людини (в!к 1С тижн!в). ембр!онального мозку

ЛЮДИНИ (BiK 10 THJKKiB), нирки доросло); людини. Для виявлення КЛОНИВ, ЯК1 М1СТЯТЬ П0СЛ1ДОВНОСТ!, ЩО ПОВТОРЮЮТЬСЯ у reHOMi людини, був використаний зонд тотально* геномно* ДНК людини, а для виявлення м!тохондр1альних ген!в - зонд М1Тохондр1альноа ДНК миш1.

Вид1лення фагоБОз! ДНК э рекомб1нантних' фаг1в проводили як описано Манхат1сом i cniBaBT. (Kfc\niatis et al. , 1982), плазм1дну ДНК вид1ляли методом Б1рнбойма (Birnboim, 1983).

Нуклеотидну посл1довн1сть ДНК визначали -за методом Макса-ма-Г1л0ерта (Maxam and Gilbert, 1980), або эа модиф1кац1ею методу Сенгера (Sanger et al, 1977).

ПбридизаЩйний анализ нуклеЕнових кислот. фхксованих на н1троцелюлозних або нейлонових ф!льтрах. проводили на протяз1 10-16 годин при 42е С у розчин! сл1дуючого складу: 4xSSC; 2xDenhardt; 100 мкг/мл денатуровано! ДНК TiMyea теляти; 50Z формам^; 10 мМ HEPES, рН 7. 5; 0,01-0,03 мкг/мл MP-Mi4eHoli ДНК вонду. При вхдмивц! фхльтрхв в!д незг!бридизованого матер!алу у суворих умовах гранична концентрац1я NaCl складала 0,03 М (65*С), у несу-ворих умовах - 0,3 М (50*С).

Пол1меразну ланцюгову реакц!ю (ГШР) проводили як описано CaiKi i cniBaBT. (Saiki et al., 1988), використовуючи термо-стаб!льну ДНК-пол1меразу (1ЯФ, Санкт-Петербург), на приборах ф1рми Perkin Elmer Cetus (США), або виготовлених у в1ддШ. Умови ре-акцИ: Q4*C х 46 сек. , 54°С х 1 хвил., 72eC X 1 хвил. , 30 ЦшШв.

Комп'ютерний анал!з нуклеотидних посл1довностей проводився ва допомогою програм "Microgenie" (Beckman, USA) та "GENEPRO" (Riverside Scientific Enterprises, USA).

Огриман! результат та Sx обгсшорения

1. Огримання i характеристика б!бл1отек кДНК ембрЮналъноХ печ!нки та ембр1онального моаку людини.

В робот! були використан! сконструйован! нами 01бл1отеки кДНК ембр!онально£ печ1нки людини в плаам1дному та фаговому векторах, а також б1бл!отека кДНК ембр!оналъно$ печ1нки лвднни ф1рми Clonteoh (США), та б!бл1отека кДНК ембр!онального головного кюэку людини, яка була отримана в1д Imperial Cancer Research Fund (Лондон) у вигляд! нейлоновая ф!льтр1в а 1моб1л10ованими клонами кДНК.

Для конструювання б!бл!отек ембр1онально£ печ1нки людини ми отримувапи мРНК а ембрЮнальноХ печ1нки (в1к ембр!ону 23 ти*н1), яка була люб'яэно надана нам СЛ. Шварцем (I®, Санкт-Петербург). Шелл конструювання 01бл1отеки була проведена И ампл1ф1кац1я на поверхн! агаризованого середовища для довгострокового 8бер1гання i

використання. Середн1й роэм1р вставок кДНК визначався електро1$оре-зом рестрикованих ДНК з двох десятк1в дов!льно вШбраних клон1в плазм1дно1 (сайт клонування - Pst I), або фаговоЯ (сайт клонування - EcoR I) б!бл1отек.

Пбл1отека кДНК ембр!онально1 печ!нки людини ф!рми Clontech (ClonLech Laboratories, Inc. , Palo Alto, USA) була сконструйова-на на мРНК ембрЮну в!ком 26 TwwiiB. Як аазначено у паспорт1 баблЮтеки, середн!й розм!р вставок визначався за допомогою ПЛР на семи дов1льно взятих фагах. Для полегшення процедур г1бриди-аац1йного анал1зу та обробки отриманих результат1в, було проведено упорядкування частини б1бл1отеки переколюванням дек!лькох тисяч фагових клон1в в 1мунолог1чн1 планшети на 96 ком1рок. Для анал1зу було взято дванадцять плантет!в, тобто 1152 клони.

В рамках м1жнародноХ программ "Геном людини" разом э доктором Лерахом (Imperial Cancer Research Fund, London) проводиться роботи по характеристик орган 1зовано! б!блЮтеки кДНК ембр1онального мозку людини. Б1бл1отека була отримана в лабораторН доктора Лера-

Таблиця 1. Дан1 по конструхжанню бхблЮтек кДНК ембр1оналыю* печ1нки та ембр!онального головного мозку людини.

Б1бл1отека

Вектор

Праймер К1ль- Ефектив- Середн1й

ДЛЯ KiCTb HlCTb poaMip

синтезу реком- 1слону- вставок

кДНК б!нант- вання кДНК

яих (КЛ0Н1В (п. и.)

ItnOHiB на 1 мкг пол1( А) РНК)

Ембр1ональноЛ pBR322 печшки

ЕмбрЮнальноК AgtlO печ!нки

Ембр1онально* AgtlO печ!нки (Clontech) IiL 1064а

Ембр1онального pSPORT юэку

oligo(dT),9 6x10* 3x10*

oligoidT)« 10

ollgo(dT)» 1,7x10* та розс!яна эатравка

оИвго(ат)ю ю*

6x10

050 600 1600

1200

ха. кДНК була синтезова на мРНК э ембрЮну в1ком 17 тихи!в 1 кло-

- Й -

нована у склад! ллазм!дного вектору pSPORT спрямовано по сайтах Not I i Sal I. 0рган1зована. або упорядкована, б1бл!отека - це 61-блаотека, в HKift колен клон кДНК мае свое визначене м!сце у ко-Mipui. В!дбитки орх'анизовааох б!6л10теки на нейлонових ф!лътрах а виеокою иЦлыпстю клон1в - так acani гриди - молуть багатораэово гхбридлзуватися з р!зними зондами, а данi по обробц1 картин г!бри-дизащi заноситись до компьютера. Таким чином, мохе бути охарактеризована експрес!Я в кл1тинах pismix тканин (або в одних кл!тинах при piaHOwy ф131олоПчному стан i) будь-якого гену, який знахо-диться у св01й KOMipui. Ochobhí данi по конструюванню б1бл1отек приведен! у таблиц! 1.

В перших експериментах по диференЩйному скринхнгу плазм!дно* 6i6jiiO'reiai кДНК ембр1онапьно1 печхнки одразу було виявлено, що пе-реважна частина печ!нко-специф!чних клон!в м!стила вставки кДНК сироваткового альбум!ну та ембр1ональних *j - та - глоб!н!в. В наступних експериментах зонди кДНК альбум!ну та кДНК -глоб1ну, були використан! для !дентиф!кацИ клонiв hkí м1стять ц! кДНК.

На мал. 1 показаний приклад диференц!йно£ НбридизацН клон!в плазм!дно1 б!бл1отеки кДНК ембр1онально£ печ!нки. Пор!вняння картин г!бридизац!51 з двома зондами кДНК виявляе клони, hkí г!бриди-эукиься т!льки з кДНК ембр!ональао! печ!нки i м!стять, таким чином. "печ!нко-специф!чн1" гени, а також клони з "загааьними" генами, як! гЮридизуються з обома зондами.

А Б

г

. «I

- ;• .л ■

.У * •

Мал. 1. Диферентйна г1бридизац1я клон!в з б!бл!отеки кДНК ембр!онально£ печхнки людини на ochobí вектору pBR322. А - г!бри-дизагдгя з зондом кДНК нирки людини; В - г!бридиаац1я а зондом кДНК ембрхонально! печ!нки людини. Стрелками (L) позначен! клони, як! míctstu "печ!нко-специф1чя!и гени.

3 тисяч! рекомб!нантних плазм!дних та тисяч! фагових клон!в

б1бл!отек, сконструйованих нами, було видхлено вхдповхдио двадцять п'ять та тридцять два клони, як1 мхстять "печ1нко-специф1чн1" тени. Як з тою. так I з 1ншою пробою г^бридиэувалося б:ля сотн! кло-н1в з плазмтдно! б1бл!отеки I б!ля сотнх клон1в фаговоХ б1блхотеки.

На мал. 2 показаний зразок диференц1йно£ г^бридизаШ упоряд-кованоХ б!бл1отеки кДНК ембрхональноК печ!нки ф^рми С1оп1есЬ разними кДНК-зондами. Поравнявши картини гхбридизацН а трьома би-користаними зондами кДНК, можна заэначити, наприклад, що клони В1,

г а * 5 с 7в 9 «о к

«1 о • ! -1

О о

о о

в о

в о еС »

о о ф

• - ф

_ • • •

I 2) О ( 7 I ! » 1М2

В

А о 0 © < - *

В » *

С г* ! I

О ! ■

Е С в

Р ? л м V

в • |

н э I Ч в>

1 2 3 4 5 с т } 9 (1 12

А о «

В О

С

о

Е • 4

Г О а « •

с

н « О

Мал. 2. Диференц1йна НбридизаШя клон1в з б1бл!отеки кДНК ембр1ональноХ печ1нки людини у фаговому вектор1 ф1рми С1оп1еоЬ з зондами кД!5К екбр1оналыюХ печ!нки людини (А), кДКК ембр!оналы:о-го моэку людини (Б) та кЛНК нирки доросло* людини (В).

. • • "^ . .•: з - • . . ...•"и

л ' • • • < •• .'..л •• »■ * , ... » .

- • • . • • • • • ' л» I

• * •..*••.»• V".. ""Л,**

.» » . '■ ?'.» •■>.,'и.-«

г

я'/.-. •. •

в Iй.

>* ' ' * ' ' * ■ »'а

К. ...

т» . _».-.« • • • . •

• г . чв I . •4

I .л • £

Мал. 3. Диференд1йна г!бредизац1я одного з гридхв организовано! б1бл!отеки кДНК ембр!онального головного мозку людини з зондами кДНК еперсонального мозку лвдини (А) та кДНК ембр!онально£ печ!нки лвдини (В). Стр1дками позначен! в!дпов!дно "моаок-специ-ф1чн!" та "леч1нко-споциф1чн1" клони.

С2, D4 м1стять "печ1нко-специф!чн1" гени, тому щр г1бридизуються 1нтенсивно т1льки з кДНК ембр1онально! печ!нки. Клони Е9. Н9, НИ, як1 г1бридизуються э однаковою !нтенсивн!стю з ус!ма зондами, беэ сумн1ву мхстять "загальн!" гени. Клони F5, Об та Н4 можна визна«и--ти як "ембрхональн!", тому шр хнтенсивн1сть г1бридизац1£ цих клон1в з кДНК нирки доросло! людини набагато менша, Hi* з кДГЗ ембрхональних печ!нки та мозку.

Усього з 1152 клонiв на дванадцяти планшетах ia зондом кДНК альбум1ну Пбридизувалося 72 клони (б1ля 6.3% клон1в), is эондом кДНК гамма-глоб1ну - 12 клонхв (б1ля 17. клон!в).

1з зондом кЛНК ембр!онально£ печ!нки г1бридизувалося б!ля 26Х клон1В. з кДНК ембр!онального мозку - б1ля 207., а з кДНК нирки -б!ля 16Z клоШв.

Досить велика к1льк1сть клонив м1стить повтори - б!ля 9Х клон!в г1бридизувалося з геномною ДНК людини. Б1ля 47. клон!в м!стять "м1тохондр1альн!" гени - ia зондом м!тохондриально! ДНК миш! г1бридизувалося 45 клон!в.

KpiM цього б!ля 77. клонiв можна визначити як "ембр!ональн!". Дванадцять клон!в (Six можно назвати "дорсслими") г1бридиэувалися а б1льшою !нтенсивн!стю э кДНК нирок доросло! людини.

BiciM клоШв г1бридизувалися э б1льшою 1нтенсивн1стю э кДНК eM6piопального мозку, н!ж з двома 1ншими зондами i, таким чином, м!стять "моэок-специф1чн! гени".

Диференц1йний скрин!нг орган1зовано£ б1бл!отеки кДНК ембр!о-нального головного мозку людини проводився зондами кДНК ембр!-онально! печ!нки та ембр!онального мозку людини. На мал. 3 подан! картини г1бридизац1! одного з грид!в. Кожен грид м!стить 20 тисяч клон1в. Пор1вняння картин Пбридизац!! дозволило виявити клони, як! м1стять "мозок-специфхчн!" гени, а також клони, як! м!стять гени, шр специф1чно експресуюгься в печ1нц!, i для яких 1нтен-сивШсть г1бридизац11 з кДНК печ1нки эначно вища^ Н1Ж а кДНК моа-ку. Для подалъшого анал!зу в!д!брано 172 "мозок-специф!чя!" клони та 118 "печ!нко-специф1чних" клон!в. В ав'яэку а високою щ1льн1стю клон1в на гридах 1 обмеженЛстю розм!ру автореферату неможливо в1дм1тити на малюнках вс! клони а "мозок-специф!чниш" та "печ!нко-специф!чними" генами. Для прикладу по два таких клони в1дм1чено на малюнках стр1лками.

Таким чином, лиференц1йним скрин!нгом б1бл!отек кДНК ембр!-онально! печ1нки та ембр1онального головного мозку людини буди ви-д!лен! набори ген!в а р1зними типами специф!чностх eKcnpecii: "печ!нко-специф!чн1", имозок-сйециф1чн1", "загальн!иембр1онавь-Hi", "доросл!".

2. Характеристика i вид1лення ген!в з piзною специф!чн!стю експресН.

KpiM клонiв кДНК альбумину та ембрхоналышх гама-глобШв s Ыбл1отек ембр1онально1 пеШнки людики було в!д!брано для подаль-шого анал1зу 39 клонхв, як! м1стять "печ1нко-специф1чн1" гени, та б1ля сотн! клон1в, яка м1стять гени з iHiuoio специф1чн1стю експресН.

Для визначення po3MipiB вставок кДНК у вШбраних г!6ридиэа-ц!ею клонах та переварки результат!в скринингу б1бл1отек був проведений блотинг-г!бридизац!йний анализ ДНК з клонхв, як1 м1стять "печ1Нко-спецлф1чл1" та "аагальн1" гени. На мал. 4 показано зразок 0лотинг-г1бридизац1йного анал1зу клон!в. Як видно на малюнку, пор1вняння картин г!бридизацН вказуе на те. щр клони L7 та L9 И^отять "печ!нко-специф!чн! гени", решта - housekeeping гени.

Шсля блотинг-гiОридизац1йного анализу клонхв з метою 1ден-тиф1кацИ ген!в проводилося часткове сиквенування вставок кДНК та А Е

L7 C<t С5 СЗ L9 С2 Сб ¡¿7С4~ CS CS i.sTC2 Се

Ков

Мал. 4. Блотинг-г!бридизац!йний анал!э ДНК а клон1в, як1 мЮтять "печ!нка-специф1чн!" та "загальн1" гени. А - г!бридизац!я а кДНК ембр1онально1 петнки людини, Б - г!бридизац1я г кДНК нирки люди-ни.

комп'ютерний анал!з нуклеотидних посл1довностей цих кДНК. Спочатку сиквенування вставок кДНК з фагових клон!в проводилось га методом Сенгера пхсля субююнування цих кДНК в склад! плазм!дного вектора. Пот!м став використовуватись б!льш прискорений метод, який виклю-чае довгий за часом етал субклонування вставок кДНК - сиквенування продукт!в пол!меразно£ ланцюгово! реакцН (ПЛР). ПЛР проводиться або на фагов!й ДНК, або безпосередньо на фагов!й бляшц!.

Серед "печ!нко-специф!чних" були !дентиф!кован! гени 'альбум!-

Ki'.-W

8Жм

- м -

ну, «1|-антитрипс!ну, ембрюнальних ej- та ¿-глобШв, «14- глоб!-ну. Серед housekeeping reHiB були 1дентиф1кован1 гени MiTO-хондр1альних цитохром С оксидаэи та URF4 (unidentified reading frame).

Пор1вняння нуклеотидних послхдовностей в1домих reHiB, як! були сиквенован1 нами, з опублхкованими рхзними авторами в р!зн! роки показало £х напрочуд високу консервативность. Так, нуклеотидн! послхдовност! кДНК м!тохондр1альних цитохром С оксидаэи та URF4, а також «12-глоб1на та ембр!онального Ад-глоб!на не мають в!дм1н В1Д опубл1кованих ран!ше, а в кДНК альбум1на та ембр!онального -гло-6iHa нуклеотидн! зам!ни вхдбувакч'ься не випадково, а в так званих "гарячих точках". Шр1вняння сиквенованоХ нами нуклеотидноХ посл1довност1 фрагменту транслюемо! области гену альбумина, який в!дпов1дае С-к1нцев1й дхлянцх б1лка, з опубл^ковешими ран!ше !нши-ми авторами (Lawn et al. , 1981; Dugaiczyk et al.. 1982; Urano et al. , 1986) показало, що в ньому е лише дв1 нуклеотиднх зам!ни у третьому положеныi кодонав. якл не приводить до змхни ам1нокислот. В сиквенован1й нами кДНК, так же як i в кДНК Лауна i сп!вавт. у 1содон1 лейцину (положения 532) знаходиться залишок тим!дину зам!сть цитидхну в геномн1й ДНК (Urano et al. , 1986) та в кДНК Ду-гайчика i спхвавт. , а в кодон! алан!ну (положения 552) знаходиться

524 530

Lys Lys Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala

о • « AAG AAA CAA ACT GCA CTT GTT GAG CTT GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA

540 ~ 550

Thr Lys Glu Gin Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu

АСА AAA GAG CAA CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG

560 570

Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys

AAG TGC TGC AAG GCT GAC GAT ¡ГОЛ AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA

Lys Leu Val Ala Ala Ser ucMJ Gin Ala Ala Leu Gly Leu AAA

AAA CTT GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAA • • •

Уал. 5. Нуклеотидна посл!довн:сть фрагменту транслюемо£ облаетi ге-иу аяьбум!на i виведена з Hei ам1нокислотна посл!довн!сть С-к!нце-аоХ д!лянки б!лка Шдкреслен! нуклеотидн! залишки, яким у po6oTi Дугайчика 1 сп!вавт. в1дпов1дають С н Т. Нумерац!ю ам!нокислотних залишк!в дано по ц!й робот!.

залишок аденоз!ну (як i п геномн!й ДНК) зам!сть тим!дину в кДНК

Дугайчика 1 сп1вавт. (мал. 5).

Нуклеотидна посл!довн!сть тpaнcлюcмoi облает! гену 4$-глоб!-на в чотирьох сиквенованих нами клонах повн!стю сгИвпадае э опубл!кованою ран!ше хншими авторами, а'нуклеотидн! посл1довност1 З'-нетранслюемих район!в мають деякх в!дм!ни (мал.6 А).

Нами виэначено два вар!анти З'-нетранслюсмого району кДНК

I

II

III

IV

V

Тег

10

30

. Т6А GCT СACTGCCCAT GAT GCAGAGCT T T СAAGGAT AGGCT Т Т AT Т С

G G G

G

60 70

I TGCAAGCAATACAAATAATAAATCTATTCTGCTAAGAGATCACt ( А) п .

II - И А)п

III |(А)п

IV Т ;(А)п

V 4(А)п

В

Тег

I .. TGA GCCTCTTGCCCATGATTCAGAGCTTTCAAGGATAGGCTTTATTC

II .. TGA GCCTCTTGCCCATGATTCAGAGCTTTCAAGGATAGGCTTTATTC

I TGCAAGCAATACAAATAATAAATCTATTCTGCTGAGAGATC1(А)п

II TGCAAGCAATACAAATAATAAATCTATTCTGCTGAGAGATCACl (А)п

lim. 6. Пор!вниння нуклеотидних посл!довностей З'-нетранслюемих ра-йон1в кДНК ембр!ональних та ¿-глоб!н!в. А - пор1вняння кДНК °|-глоб1н!в. I, II - посл!довност!, як1 виэначен1 в дан!й робот!; III - посл!довн!сть, описана у робот! Форже i сп!вавт. (Forget et al., 1979); IV - посл!довн!сть, описана у робот! Каваллеско ! cniBaBT. (Cavallesco et al., 1980); V - посл!довн!сть, описана у робот! .Лонг ! сп!вавт. (Lang et al. , 1985). В - пор1вняння кДНК глоб!н!в. I - посл!довн!сть, визначена у дан!й робот!; II -nocjiflOBHicTb, описана Пуном i сп1вавт. (Poon et al., 1978). У посл!довностях II, III, IV та V наведен! т!льки т! нуклеотидн! ва-

ЛЯШКИ, ПО ЯКИХ ВОНИ В!Др!ЭНЯЮТЬСЯ В!Д ПОСЛ!ДОВиОСТ1 I.

глоб1ну, один з яких noBHicTio сп1впадае з геномной посл!Довн1стю, опубл1кованою Слайтомом i спхвавт. (Slightom et al. , 1980), а дру-гий В1др1зняеться делецхею залишка аденоз1ну в положенн! 58 3' -нетранслюемого району (мал. 6 A). BapíaHT гену а такою делец1ею був вид!лений Шиокава i сп!вавт. (Shiokawa et al. , 1989) при попу-ляцЮнному анал1з1 гама-глоб!нових reiiiB у населения ЯпонН. Нук-леотидн! замени у кДНК -глоб1ну та альбум1ну, безумовно, Biflo''-ралаюггь алельн1 вар1анти ген!в.

Лише в кДНК «*, -антитр1псину, сикьенован!й нами, е одна нукле-отидна заМна пор!вняно з »<ЩЖ Боллена 1 сп!вавт. (Bollen et al. , 1990), яка призводить до замШення ам1нокислотного залишку в поло-женн1 101 (мал. 7).

Пошук гомолог!чних нуклеотидних посл1довностей в EMBL-банку та GeneBank дозволив встановити, що поряд а в1домими генами б!льш1сть сиквенованих нами кДНК являюгь собою не описан! paHime гени. IU результати сп!впадають з результатами аналоНчних роб!т, як! проводиться в зару61лних лаборатор!ях. Нуклеотидн! посл!довно-

35 40

FSLYRQLAHQS СС TTC AGC СТА TAC CGC CAG CTG GCA CAC СAG TCC

60

FFSPVS I ATAFA TTC TTC TCC CCA GTG AGC АТС GCT АСА GCC TTT GCA 70

TXADTHDE ILEG ACC AAG GCT GAC ACT CAC GAT GAA АТС CTG GAG GGC 90

TEIPEAQIHE GF ACQ GAG ATT CCG GAG GCT CAG АТС CAT GAA GGC TTC

104 î L N ACC CTC AAC...

7. Нуклеотидна i дедукована ам!нокислотна посл!довн1сть частини кДНК «1,-антитр1псину. Вид1лена нпслеотидна зам!на, яка визивае зам1иення ам!нокислотного залишку Arg на His. Hympaitfn ам!нокислот дано по робот! Боллена 1 сп!вавт.

стi нев!дсмих »сЛНК м!стять протяжн! рамки зчитування, але )сомл'-ягерний попук из зиявкэ гомолог!чннх ам!нокислотних посл1дориосгей

50

N S S N I AAC AGC ACC AAT АТС

M L S L G ATG CTC TCC CTG GGG 80

L N F N L CTG AAT TTC AAC СТО 100

Q E L L H CAG GAA CTC CTC CAT

у РIR-банку. У З'-нетранелыемому районi одн!е! з нев!домих кДНК було виявлено Alu-повтор.

3. Альтернативний яроцесинг первинних транскрипт!в р1зних jcnaciB ген!в.

Кр1м нуклеотидних зам1н для деяких сиквенованих нами "печ1нко-специф1чних" та "liousekeeping" ген!в знайдено альтерна-тивне пол1аден!лювання первинних транскрипт!в.

В п'яти сиквенованих нами клонах кДНК альбум1ну а одн!еХ б1бл!отеки одного хндив!дууму виявлено три р!аних сайти пол1-аденхлювання мРНК з використанням одного сигналу пол!аден!лгаання (мал.8). У клонах рНА1 та рНА12 вхдстань В1Д канонi4iioro сигналу

pHAl, pHAl 2... AAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGC рНА8, рНА25... AAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGC pHAl9 ... AAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTSTGC

pHAl, pHAl 2 ГТСААТ T AAT AAAAAATGGAAAGAATCH (A) n pHA8, pHA25 TTCAATTAATAAAAAATGGAAAGj(A)n pHA19 TTCAATTAATAAAAAATGGt(A)n

Мал. 8. Пор!вняння нуклеотидних посл!довностей 3'-к!нцевих д!лянок кДНК альбумина а р!зних клон!в . Сигнал пол!аден1лювання п1дкре-слений, стрхлками позначен! сайти пол!аден!лювання.

ААТААА до сайту пол1аден1лювання складае 15 нуклеотид!в, у клонах рЯАЗ та рНА25 - 10 нуклеотид!в, у клон! рНА19 - 6 нуклеотид!в.

Сайт пол1аден!лювання у вс!х чотирьох вид!лених нами клонах кДНК -глоб1ну однаковий, однак знаходиться на два нуклеотиди да-лх вхд сигналу ААТААА порхвняно а опубл!кованими ран!ше !ншими авторами (мал.6А). Сайт полхаден!лювання в сиквенован!й нами кДНК ^-глоб!ну знаходиться на два нуклеотиди ближче до сигналу ААТААА, порхвняно з описаним Пуном i сп!вавт. (Poon et al. , 1978) ( мал. 6Б).

Кр1м "печ!нко-специф!чних" ген!в альтернативне пол!аден!лк>-ванкя з використанням одного сигналу пол!аден!лювання було такох виявлене i для одного а "аагальних" ген!в - м!тохондр!ально1 ци-тохром С оксидазн II. Пауер i сп!вавт. (Power et al., 1989) опублхкували посл!довн!сть мРНК цитохром С оксидааи II, у яко! Mieue приеднання пол!(А)-хвоста ам!в£но на два нуклеотиди усереди-ну вхд к!нця гену. Вхдм!ни. в сайтах лол!аден!лювання ц!е£ мРНК,

зналчених нами та Ойялою з сШвавт. (Ojala et al., 1981), а одноХ сторони, i в po6oTi Пауера 1 спхвавт., з друго! (мал. 9), вказукль

Тег

I ... TAG CAOXCCTCTACCCCCTCTAGAGCCi(A)n

II... TAG CACCCCCTCTACCJCCCTCTAGAGl ( A) n

Мал. 9. Альтернативне пол!аден1лювання мРНК м!тохондр1алыю1 цитох-ром С оксидази II. I - посл:довн!сть 3'-нетранслюемого району, визначена у дан!й робот!, II - посл!довн!сть 3'-нетранслюемого району, описана Пауером ! сп!вавт.

на те, щр альтернативний npoueciHr 3'-к!нця мае м!сце не тхльки у ядр!, але ! в м!тохондр!ях.

1снування множинних сайт!в розцеплення/пол!аден!лювання при наявност! т!льки одного сигналу шШаденхлювання досить р!дке ! описане в л!тератур! т!льки для к!лькох reniB: поверхневого антигена Bipycy гепатита В (Simonsen and Levinson, 1983), рибосомного б!лка L30 миш! (Wiedeman and Perry, 1984), пролактина корови (Sasavage et'al., 1982), про-<12(1)коллагена курки (Aho et al., 1983), токсина¿-хордотион!на ячм!ню (Hernandez-Lucas et al.,

12 3 4

'!•. bji -

I

«9 до;

v «J

■ *

V

10.0 8.0

4.5

{ * - •

, • - • ■ I - ■ i • , - f M

i U.'.*« ■ I

Мал. 10. Блотинг-гiбридизац!йний анал!з РНК !а р!зних тканин а використанням зонду pL8. 1 - мРНК печ!нки людини; 2 - мРНК ниргл людини; 3 - мРНК печ!нки пацюка; 4 - мРНК м'яэ!в кроля. Кожна до-pi яка гелю м!стить 20 мкг тотальной мРНК.

- 16 - ' 1986), «<1^-глобул1на пацюка (Gao et al.. 1989).

Для правильного розщеплення i пол!аден1лювання неэр!ло! мРНК у eyKapiOT кр1м гёксануклеотиду AAUAAA,, який е найб1льш важливим, aie недостатн!м елементом для процесингу 3'-к!нця первинного транскрипту, мае.значения такод район в 3'-напрлм! вхд сайту добавления пол!(А) (Gil and Proudfoot, 1984). Визначене нами альтер-нативне використання одного й того ж сигналу пол1аден!лювання мРНК в однхй í т!й же ем5р!ональн!й.печ!нц! людини, певно, забезпечу-еться в!дпов!дною вторинною . структурою цього району РНК 1/або !снуванням додаткових регуляторних елемент1в у цьому район!.

РНК-блотинг з використанням як зонда одн!еЯ з левхдомих "эа-гальних" кДНК pL8 виявив транскрипти трьох po3MipiB у мРНК печ1нки i нирки людини - 4.6 т.н., 8.0 т.н. та 10.0 т.к. Розм!р тпанскриптхв у мРНК з м'яэ!в кроля -8.0 та 9. О т. н., а у мРНК пвч!нки Миш! - 4.5 т. н. (мал. 10). Напевне транскрипти р!зно* дов-жини утворююггься внасл!док використання р!эних промоторов 1/або альтернативного процесингу одного й того ж первинного транскрипту. 1снування для неведомого дос! гену, умовно названого pL8, транскрипт1в р!зного роэм1ру у р1зних вид1в ссавц!в вказуе на те, шр bíh приймае участь у. р1зних ф!з1олог!чних процесах. Зараз роз-почато роботу по встановленню функцхй транскриптхв цього гену.

1. Отриман! та частково охарактеризован! за допомогою зонд1в тотальних кДНК р!зних тканин б1бл!отеки кДНК eмбpíoнaльнoï печ1нки людини у плазмхдному та фаговому векторах, а також орган1зована б!бл!отека кДНК ем5р!онального головного мозку людини.

2. ДиференЩйним скрин1нгом б1бл!отек вид!лен! мажорн! транскрипти, HKi маоть pían! типи eKcnpeciï: "печ!нко-специф!чн1", "мозко-специф!чн!", "эагальн!", "ембр!ональн!", "доросл!", "м!то-ХОНДр!аЛЬН1".

3. Сиквеновано бхля трьох десятк!в кДНК, як! в!дносяться до plaiinx клас!в. Анал!з нуклеотидних посл!довностей показав, щр 0!льше половини сиквенованих кДНК - нев!дом!. Пор!вняння нуклеотидних посл!довностей в!домих ген!в, опубл!кованих в pi3Hi роки рхзними авторами, показуе ïx надзвичайно високу консервативн!сть а невеликими в!дм!нами в так званих "гарячих точках". Нуклеотидн! посл1дрвност! нев!домих ген!в представленi в м!жнародн! банки нуклеотидних послхдовностей.

4. РНК-блотинг з використанням одно! з не!дентиф!кованих кДНК вияьин h'üibhíсть транскрипт!в р!зних розм!р!в у мРНК пен!нки та нирок людини, а також у мРНК м'яз!в кроля та печ!нки пацюка Цей

факт може пояснюватись тим, до транскрипц!я не!дентиф1кованого гену в!дбуваеться а р1зних промотор1в i/або його первинний транскрипт п!ддаеться альтернативному нроцессингов!.

Б. Виявлено альтернативне пол1аден!лювання транскрипт1в дек!лькох *'печ!нко-специф!чних" та "вагальних" ген1в, в тому числ1 в одному орган1 одного !нд!в!дууму.

Список роб!т, опубл!кованих по тем! дисертацП.

1. V.M. Kavsan, V. V. Dmitrenko. Alternative processing of human albumin gene primary transcript // 19th FEB3 meet.: Abstracts -Ron», 1989. - P. Fr34.

2. V.M. Kavsan, V. V. Dmi trenko. Polyadenylation site heterogeneity of mRNA encoding serum albumin in human fetal liver // XI Intern. Congr. of ISDB: Abstracts - Utrecht, 1989. - V. 27, Suppl. , S 130.

а В. M. Кавсан, A. E Рындич, E E Дмитренко. Ткане- и органоспеци-фичоски экспрессируюшиеся генц.// I Всесоюзная конференция "Геном человека - 90": Тез. докл. - Переславль-Залесский, 1990. - С. 20-21.

4. Е Е Дмитренко, Е М. Кавсан. Гетерогенность сайта полиаденили-рования мРНК, кодирующей человеческий сывороточный альбумин // Генетика - 1990. - Т. 26, N 4, С. 765-769.

Б. Е Е Дмитренко, Е М. Кавсан. Неоднозначность сайтов полиадени-лирования мРНК в эмбриональной печени человека /J Докл. АН СССР. -

1990. - Т. 313, N 4, С. 993-995.

6. V. М. Kavsan, V. V. Dmi trenko. Tissue-specif io and housekeeping genes expression during liver differentiation // "Gene expression during liver differentiation and disease": Abstracts - Sorrento,

1991. - P. 182.

7. V. V. Dmi trenko, V. M. Kavsan. Variability of polyadenylation sites in mRNAs from human fetal liver // FEBS Lett. - 1991. -V. 280, N 2, P. 284-286.

8. V.V. Dmi trenko,' A. V. Rynditch, V. M. Kavsan. Sequencing of human livor-speoifio olones: alternative processing of mRNA in fetal liver // Meet, on "Genome mapping and sequencing": Abstracts -Cold Spring Harbor, 1991. - P. 182.

9. V. V. Dmi trenko, V.M. Kavsan. Alternative processing of tlssue-speoiflo and housekeeping genes primary transcripts in human fetal liver // "European Developmental Biology Congress' EDBC-91": Programm and Abstracts - Jerusalem, Israel, 1991. - P. 123.

10. V. Dmitrenko, V. Kavsan. The study of gene expression in human fetal liver by cDNA library analysis // Meet. "Regulation of liver gene expression in health and disease": Abstracts - Cold Spring Harbor, 1993. - P. 118.