Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ мРНК мозга человека и шимпанзе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ мРНК мозга человека и шимпанзе"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова_

На правах рукописи

НАДЕЖДИН ЕВГЕНИЙ ВИКТОРОВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ мРНК МОЗГА ЧЕЛОВЕКА И ШИМПАНЗЕ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

академик РАН Официальные оппоненты:

чл.- корр. РАН, профессор

доктор биологических наук, профессор

Е.Д. Свердлов

Л.И. Корочкин А.В. Иткес

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится 15 июня 2005 г. в 10 часов на заседании Специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу:

117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 12 мая 2005 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор химических наук, профессор

В.А.Несмеянов

г2>3 53 Н

У ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Сравнение геномных последовательностей человека и шимпанзе показало, что различия на генетическом и белковом уровне между этими видами составляют всего 1-2%. Противоречие между незначительной разницей на молекулярном уровне и большой фенотипической разницей приводит большинство современных исследователей к фундаментальному выводу, что наблюдаемые различия могут быть обусловлены относительно небольшим числом изменений в системе регуляции экспрессии генов. Это могут быть изменения в цис-регуляторных участках генома или в транс-действующих факторах. По-видимому, лишь относительно небольшое количество генов человека и шимпанзе изменили характер своей экспрессии. Согласно распространенной в последнее время гипотезе, не только активация, но и супрессия некоторых генов может приводить к возникновению фенотипических свойств, характерных для человека.

До недавнего времени, из-за отсутствия адекватных методов, не проводилось систематического поиска генов, дифференциально экспрессирующихся у человека и шимпанзе. Метод супрессионной вычитающей гибридизации позволяет идентифицировать транскрипты, различающиеся как по уровню представленности в мозге человека и шимпанзе, так и по нуклеотидной последовательности, что особенно важно при проведении межвидового сравнения.

Объектом данного исследования является мозг, поскольку известно, что именно в головном мозге различия в спектрах и уровне транскрипции генов человека и шимпанзе наиболее значимы.

Обнаружение дифференциальных транскриптов позволило нам впервые идентифицировать некоторые гены, различающиеся по структуре и уровню экспрессии в мозге человека и шимпанзе.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы является полногеномный поиск и идентификация генов, отличающихся по структуре и уровню экспрессии в мозге человека и шимпанзе. Настоящая работа состояла из двух частей: первая - поиск и идентификация транскриптов, экспрессия или структура которых различается в гомологичных отделах мозга человека и шимпанзе. Для выполнения этой задачи был выбран разработанный в Лаборатории вариант вычитающей гибридизации - супрессионной вычитающей гибридизации. Вторая часть работы была посвящена структурному анализу обнаруженных дифференциальных генов и функциональному анализу одного из них - гена транстиретина.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Выделить суммарную РНК из гомологичных отделов мозга человека и шимпанзе и синтезировать на ее основе кДНК.

2. Провести вычитающую гибридизацию кДНК мозга

3. Идентифицировать мРНК, дифференциальные по уровню транскрипции и/или нуклеотидной последовательности.

4. Сравнить профили экспрессии идентифицированных генов в отделах мозга человека и шимпанзе.

5. Провести сравнительный анализ геномного окружения дифференциальных генов, определить структурные особенности, влияющие на уровень их транскрипции.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В данной работе осуществлен анализ различий экспрессии генов в мозге человека и шимпанзе. Среди множества обнаруженных различий найдено два новых гена, дифференциально транскрибирующихся в мозге человека и шимпанзе. Один из них - ген транстиретина соответствует белку переносчику тироидных гормонов и вызывает особый интерес, поскольку тироидные гормоны являются важнейшими регуляторами развития и функционирования мозга. Ввиду этого элементы регуляции транспорта и биосинтеза тироидных гормонов с высокой вероятностью могут являться объектом эволюционно значимых изменений.

Впервые проведенный анализ тканеспецифичности транскрипции транстиретина в мозге человека и шимпанзе показал, что уровень его экспрессии у шимпанзе в мозжечке в 8-10 раз выше, а в переднем мозге в 10 раз ниже, чем в тех же отделах мозга человека. Впервые было проведено исследование экспрессии гена транстиретина в различных отделах эмбрионального и взрослого мозга человека и показана тканеспецифичность его экспрессии; идентифицированы участки связывания транскрипционных факторов, расположенные в 5'-прилегающей области гена транстиретина человека на фрагменте длиной 7 т.п.о., в клеточных линиях сосудистого сплетения мозга и печени.

Публикаиия и апробация работы.

По теме диссертационной работы опубликовано две статьи в отечественных научных журналах, а также глава в монографии международного авторского коллектива. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Геном Человека 2002», Шанхай, КНР, 2002 г.; на Международной школе Федерации европейских биохимических обществ (ФЕБО) "New molecular strategies to treat neurodegenerative diseases" Офир, Португалия, 2004г.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждения, материалы и

методы, выводы. Материал иллюстрирован _ рисунками и _ таблицами.

Библиографический указатель включает_цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Вычитающая гибридизация кДНК из мозжечков человека и шимпанзе.

Для идентификации генов, дифференциально транскрибирующихся в мозге человека и шимпанзе, была проведена вычитающая гибридизация кДНК, синтезированных на матрицах суммарной РНК из мозжечков человека (Homo sapiens) и шимпанзе {Pan troglodytes). Используемый в работе метод супрессионной вычитающей гибридизации кДНК позволяет идентифицировать различающиеся по уровню транскрипции гены, в том числе гомологичные транскрипты, не идентичные по нуклеотидной последовательности. Это свойство метода особенно важно при межвидовом сравнении, когда вклад структурных различий в сравниваемых образцах значителен.

Выбор мозжечков в качестве источника суммарной РНК обоснован тем, что мозжечок является морфологически обособленным отделом головного мозга, что позволяет целиком отделить его от остального мозга. При использовании в работе целого мозжечка достигается морфологическая и генетическая идентичность сравниваемых образцов. Также известно о непропорциональном изменении в процессе эволюции размеров мозжечка относительно других отделов мозга человека по сравнению с высшими приматами.

На первом этапе работы выделяли суммарную РНК из мозжечков человека и шимпанзе. Далее на полученных РНК синтезировали кДНК высокопроцессивной обратной транскриптазой SuperScript с использованием олиго (дТ) праймера. Для построения второй цепи кДНК применяли эффект cap-switch. Данный подход позволяет получать набор двуцепочечных кДНК, обогащенных полноразмерными копиями транскриптов. Эти особенности получения кДНК позволяют эффективно проводить вычитающую гибридизацию.

Подготовительные этапы получения трейсера и драйвера для проведения вычитания кДНК, а также саму вычитающую гибридизацию проводили в соответствии с протоколом системы "PCR-Select cDNA Subtraction Kit". Было проведено две вычитающие гибридизации: (1) для получения библиотеки, обогащенной специфичными для человека транскриптами, при вычитании в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка человека, а драйвера -кДНК из мозжечка шимпанзе; (2) для получения библиотеки, обогащенной транскриптами специфичными для шимпанзе, в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка шимпанзе, а драйвером служила кДНК мозжечка человека (рис. 1 п.1).

Эффективность вычитающей гибридизации оценивали в пулах кДНК после вычитания по изменению количества кДНК гена, уровень транскрипции которого в гомологичных отделах мозга человека и шимпанзе одинаков. Поскольку транскрипция такого гена не дифференциальна, после проведения вычитающей гибридизации содержание его кДНК должно уменьшаться в пулах, обогащенных дифференциальными кДНК. Для такой оценки был выбран ген глицерапьдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ). Из литературных данных известно, что нуклеотидная последовательность ГАФДГ консервативна, а на предварительном этапе работы было показано, что ген ГАФДГ экспрессируется в мозжечках

человека и шимпанзе на приблизительно одинаковом уровне. После проведения вычитающей гибридизации оценивали содержание кДНК ГАФДГ в вычтенных кДНК по сравнению с исходным. Продукт амплификации кДНК гена ГАФДГ в вычтенных пулах кДНК появлялся на б циклов ПЦР позже по сравнению с исходным, т.о. эффективность «обеднения» вычтенных кДНК можно оценить как ~26 раз, т.е. ~ 60 раз.

Вычтенные кДНК клонировали в плазмидный вектор и рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки E.coli. Рекомбинантные клоны были ранжированы в 96-луночные планшеты. В результате были получены две ранжированные библиотеки содержащие по -700 индивидуальных клонов (рис. 1 п.2).

•»«•»••«(в*

•••••••••о*

»«»Ot»l»>»>

o«oo»ooieoo i*io*oo««oo ieo*o«aoct« »eoototnoi «ittooioiet oototenooo,

О«ОООО®0«@в 080»00«00»0 eoooee®oo®e ©•ooooeoee© •oeo»©e®o«o

OOgQttOOlO»,

®e«»eee«»®a

««•ItltOltt •«•Oteiftt« >t»IHM>Q»

Зонд «Ч-Ш" Зонд "Ш-Ч" Зонд "Ч-Ш" Зонд "Ш-Ч"

"+" гибридизация гибридизация гибридизация "+" гибридизация

--ж. AT'

Отбор дифференциальных клонов, определение первичной структуры, идентификация дифференциальных кДНК

Рисунок 1. Схема эксперимента по дифференциальной гибридизации библиотек кДНК, полученных в результате вычитающих гибридизаций кДНК мозжечков человека и шимпанзе. 1. Проведение двух вычитающих гибридизаций: Ч-Ш (человек - шимпанзе) - для получения библиотеки, обогащенной специфичными для человека транскриптами, при вычитании в

качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка чечовека, а драйвера - кДНК из мозжечка шимпанзе; Ш-Ч (шимпанзе - человек) - для попучения библиотеки, обогащенной транскриптами специфичными для шимпанзе, в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка шимпанзе, а драйвером служила кДНК мозжечка человека 2 Клонирование вычтенных кДНК в плазмидный вектор, трансформация клеток Е coli, получение двух ранжированных библиотек 3 Почучение двух копий реплик ДНК вставок каждого клона на фильтрах, дифференциачьная гибридизация с зондами, являющимися радиоактивно меченными пупами кДНК (Ч-Ш ипи Ш-Ч), полученными после вычитающих гибридизаций.

Дифференциальная гибридизация. Отбор и идентификация дифференциальных транскриптов.

Поиск дифференциальных клонов проводили методом дифференциальной блот и дот-блот гибридизации (рис. 1) Вставки рекомбинантных индивидуальных клонов, представляющие собой вычтенные кДНК, амплифицировали, продукты амплификации наносили на нейлоновую мембрану (для дот-блот гибридизации) или разделяли в агарозном геле и переносили на мембрану (для блот гибридизации). ДНК вставки каждого клона наносили на две мембраны, чтобы проводить гибридизацию параллельно с двумя зондами (рис. 1 п.З). В качестве зондов для сравнительной гибридизации использовали радиоактивно меченные пулы кДНК, полученные после вычитающей гибридизации Клонированные фрагменты кДНК, дававшие сильный сигнал при гибридизации со «своим» зондом («+» гибридизация) и слабый или отсутствующий сигнал при гибридизации с противоположным зондом («-» гибридизация), отбирали как дифференциальные. Из двух библиотек было отобрано 19 клонов, вставки которых давали наиболее четко различающиеся сигналы при «+» и «-»-гибридизациях, после чего определяли первичную структуру ДНК их вставок

Сравнение дифференциально гибридизующихся последовательностей с последовательностями, депонированными в базе данных GenBank, показало, что все отобранные клоны содержат фрагменты транскриптов генов митохондриального генома человека и шимпанзе.

Сильное обогащение дифференциальных кДНК последовательностями митохондриального генома, по-видимому, объясняется как более высокой степенью дивергенции последовательностей митохондриальных ДНК человека и шимпанзе по сравнению с геномной ядерной, так и сравнительно высокой представленностью этих транскриптов в клетках, поскольку известно, что митохондриальные гены отличаются высоким уровнем экспрессии в большинстве клеток Проведенное сравнение последовательностей митохондриальных кДНК шимпанзе с гомологичными кДНК человека показало высокий уровень дивергенции (~9%) митохондриальных генов человека и шимпанзе, что хорошо согласуется с литературными данными, согласно которым степень идентичности митохондриальной ДНК человека и шимпанзе составляет около 85%, что значительно ниже степени идентичности ядерной геномной ДНК (в среднем, 98,5%).

Чтобы исключить из анализа митохондриальные кДНК был проведена гибридизация дифференциальных библиотек с митохондриальными зондами Для этого были отдельно амплифицированы фрагменты ДНК митохондриальных геномов человека и шимпанзе, их

радиоактивно метили и гибридизовали митохондриальной ДНК человека мембраны с нанесенными кДНК человека, мембраны с кДНК шимпанзе - с митохондриальныч зондом шимпанзе (рис. 2).

А В С DE F GH

Рисунок 2. Радиоавтографы дифференциального скрининга библиотеки, обогащенной шимпанзе- специфическими транскриптами, с зондом митохондриальной ДНК шимпанзе.

А. Блот-гибридизация. Б. Дот-блот гибридизация

Стрелками обозначены клоны, отобранные для определения первичной структуры ДНК

Анализ результатов гибридизации показал, что приблизительно 95% обеих библиотек составляют митохондриальные последовательности.

Для дальнейшего анализа были отобраны фрагменты кДНК, которые не гибридизовались с митохондриальными зондами. Результаты идентификации последовательностей ДНК, отобранных на этом этапе работы, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Фрагменты кДНКиз библиотек, специфичных для человека и шимпанзе, не гибридизовавшиеся с митохондриальными зондами_

Номер клона Ген Степень идентичности фрагментов кДНК с генами

шимпанзе человека

Н4: С 6 тРНКт и прилегающие области 89% 100%

Н4: G4 Цитохромоксидаза, суб. II 90% 100%

Н5:Н4 Л/и-повтор + полиаденило-вый тракт длиной 35 п.о. а а

Н5: D3 Ген 12S/16S рРНК 95% 96%

Ch4: А5 мРНК К1АА0537 б 99,5%

Ch5'G12 мРНК транстиретина 100% 97%

— не возможно точно картировать обнаруженную последоватечьность Alu повтора из-за многочисленности копий Alu элементов в геноме человека и шимпанзе

— последовательность гена KIAA0537 шимпанзе отсутствует в базах данных

-б-

Среди проанализированных последовательностей было найдено три транскрипта немитохондриальной природы. В одном случае это был фрагмент -/(/«-повтора, в двух других случаях были идентифицированы фрагменты кДНК, гомологичные кДНК KIAA0537 и мРНК гена транстиретина.

Анализ гена KIAA0537.

Ген KIAA0537, аннотированный как АМФ-активируемая протеинкиназа 5 (AMP-activated protein kinase family member 5), локализован на 12 хромосоме человека, и содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок длиной 661 а о. Экзон-интронная структура данного гена неизвестна По литературным данным этот ген транскрибируется в сердце и мозге человека на сравнительно высоком уровне, тогда как в скелетной мышце, почке и яичнике он менее представлен. Сравнение определенной нами первичной структуры фрагмента кДНК К!Л АО 5 37 шимпанзе с последовательностью гена человека, депонированной в GenBank, показало 99,5% идентичность

Дифференциальность транскрипции гена KIAA0537 в мозжечках человека и шимпанзе подтверждали методом RT-PCR. Для синтеза первых цепей кДНК использовали препараты той же суммарной РНК из мозжечка человека и шимпанзе, что и для вычитающей гибридизации.

Было показано, что уровень транскрипции гена KIAA0537 в мозжечке человека в 6-10 раз выше, чем у шимпанзе (рис. 3 А).

А

272 л о IHI^^H^^^l^HHIIBH

зо зз * да 39 эз « з» М Чеямск Шимпанзе

Б

30 333*3910 33 36 3» Человек Шимпанзе

Рисунок 3. RT-PCR анализ уровня транскрипции генов KJAA0537 (А) и транстиретина (Б) в мозжечках человека и шимпанзе

Цифрами обозначено количество циклов RT-PCR, М - маркер длин фрагментов Стреitai с цифрами указывают положения и размеры амтифицированных фрагментов

Структурно-функциональный анализ гена транстиретина.

Транстиретин (transthyretin, TTR) (другое название - преальбумин) осуществляет связывание и транспорт тироидных гормонов (в частности, тироксина) и ретинола из плазмы крови в мозг. Многие мутации гена TTR приводят к возникновению амилоидных болезней человека Поскольку тироидные гормоны являются важнейшими регуляторами дифференцировки и функционирования мозга, то элементы системы регуляции транспорта и биосинтеза тироидных гормонов с высокой вероятностью могут быть объектами эволюционно значимых изменений Транстиретин с этой точки зрения заслуживает особого

внимания, поскольку из трех известных белков-переносчиков тироидпых гормонов только он синтезируется в головном мозге. Очевидно, что разница в концентрации мРНК ТТЛ может иметь весьма существенное значение для развития и функционирования мозга. Именно поэтому дальнейшая работа была посвящена анализу различий в структуре и транскрипции этого гена у человека и шимпанзе и сравнительному анализу уровня транскрипции гена транстиретина в разных отделах мозга человека

Сравнение последовательностей мРНК транстиретина человека и шимпанзе.

Ген транстиретина человека локализован на хромосоме 18 в локусе ql2.1, имеет длину около 6,9 т.п.о. и содержит четыре экзона, которым соответствует мРНК длиной 615 но. (рис 4). Функциональный белок состоит из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых включает 127 а.о.

For Rev

Г7/.- ■■ » ^..... 'и*-^ • .» '.ж.'»«* у.-1.' •:-■-' ^ПИИЩГ!?/-!

I-1

1 Т.П.О.

Рисунок 4. Схема гена транстиретина чечовека и шимпанзе Прямоугольниками обозначены экзоны Объемной стрелкой - промотор Тонкими стрелками - праймеры для RT-PCR

В ходе работы была определена полная последовательность кДНК гена транстиретина шимпанзе Сравнение последовательностей кДНК TTR человека и шимпанзе показало сравнительно высокий (~3%) уровень их дивергенции Было обнаружено 11 нуклеотидных замен, 8 из которых расположены в кодирующей части гена транстиретина, и одна делеция. При этом три замены в кодирующей части гена приводят к замене аминокислот в белке. Замены Arg34Lys и Asp39Glu являются синонимическими и выявлены в белках некоторых других позвоночных животных. Замена Asnl24Ile является несинонимичной, и не была описана ранее. На рисунке 5 представлена трехмерная структура функционального тетрамера белка транстиретина человека с обозначенными положениями аминокислотных остатков, отличающихся у человека и шимпанзе.

По результатам анализа данных из GenBank, из 12 обнаруженных различий .между последовательностями

Рисунок 5. Трехмерная структура функционального тетрамера белка транстиретина человека Стрелками обозначены положения аминокислотных остатков, отличающихся у человека и шимпанзе Крупными стрелками обозначены положения остатков Аю, замененных в белке шимпанзе на Не

мРНК транстиретина у человека и шимпанзе только одно встречается как полиморфизм в человеческой популяции.

Для подтверждения видоспецифичности обнаруженной замены Asnl24Ile была определена нуклеотидная последовательность 4 экзона гена TTR еще двух индивидуумов шимпанзе Обнаруженная нуклеотидная замена присутствует во всех исследованных последовательностях. Идентичная структура обнаружена также при анализе последовательности соответствующего участка генома шимпанзе, депонированной на сервере Genome Browser. Таким образом, обнаруженная нуклеотидная замена, приводящая к несинонимической замене в аминокислотной последовательности белка, является видоспецифичной для шимпанзе.

В настоящее время установлена нуклеотидная последовательность геномного локуса транстиретина шимпанзе. Сравнение установленной нами последовательности кДНК транстиретина с геномной последовательностью позволяет сделать вывод, что ген шимпанзе организован так же, как и ген человека, т.е. содержит 4 экзона, разделенных нитронами в одинаковых положениях.

Сравнительный анализ уровня транскрипиии гена транстиретина в отделах мозга человека и шимпанзе.

Дифференциальность транскрипции гена транстиретина в мозжечках человека и шимпанзе была подтверждена методом RT-PCR (рис. ЗБ). Для синтеза первых цепей кДНК использовали препараты той же суммарной РНК из мозжечка человека и шимпанзе, что и для вычитающей гибридизации.

Из литературных данных известно, что транстиретин экспрессируется у человека преимущественно в печени и сосудистом сплетении мозга (морфологическое образование стенок третьего и крыши четвертого желудочков мозга, непосредственно связанное с осуществлением функций гематоэнцефалического барьера). Однако в ходе данной работы впервые было обнаружено, что ген TTR транскрибируется также и в мозжечке (рис. ЗБ). Поскольку данные о транскрипции TTR в различных отделах мозга человека и шимпанзе отсутствуют, интересно было изучить транскрипцию TTR в разных отделах мозга. Для этого необходимо проанализировать транскрипцию TTR в тканях отделов мозга, полученных от нескольких индивидуумов. К сожалению, для шимпанзе провести такой анализ практически невозможно из-за недоступности материала, поэтому все данные о транскрипции 777? в отделах мозга шимпанзе получены только для одного индивидуума.

Было проведено сравнение уровня транскрипции транстиретина в нескольких отделах головного мозга взрослого человека, а именно: мозжечке, передней коре и сосудистом сплетении. Определение уровня транскрипции TTR в отделах мозга человека и шимпанзе проводили методом RT-PCR с олигонуклеотидными праймерами, комплементарными последовательностям первого и третьего экзонов гена TTR (рис. 4), на 1-х цепях кДНК, синтезированных на основе суммарных РНК, выделенных из соответствующих тканей.

Результаты определения уровней транскрипции гена 777? в отделах мозга человека и шимпанзе представлены в таблице 2.

Таблица 2. Транскрипция гена транстиретта в отделах мозга человека и шимпанзе_

Образец Уровень транскрипции генов*

Р-актин 777?

Передняя кора

Шимпанзе 24 36

Человек #22 24 33

Человек #54 24 33

Человек #4 21 27

Мозжечок

Шимпанзе 33 36

Человек #22 30 39

Человек #1 27 39

Человек #2 30 б н.т.

Человек #42 30 н.т.

Человек #54 33 Н.Т.

Человек #4 сосудистое сплетение мозга 27 15

- количество циклов КГ-РСК, необходимых для получения 100 нг амплифицированной кДНК.

нет транскрипции - считали, что транскрипция гена отсутствует, если в течение 39 циклов ЯТ-РСЯ на матрице соответствующей кДНК не удавалось амплифицировать ~100 нгДНК.

При проведении синтеза первых цепей кДНК в качестве матрицы использовали одинаковое количество суммарной РНК. Эффективность синтеза первых цепей кДНК оценивали методом ЯТ-РСЯ по содержанию кДНК р-актина. Литературные данные об уровне транскрипции [¡-актина в разных отделах мозга человека и, тем более, шимпанзе отсутствуют. Некоторый разброс данных по уровню транскрипции Р-актина в разных образцах мозжечков человека объясняется, скорее всего, эффективностью синтеза первых цепей кДНК На основании полученных нами данных мы можем считать, что уровень транскрипции р-актина в гомологичных отделах мозга человека и шимпанзе практически одинаков (табл 2) При этом во всех проанализированных образцах мозжечков он существенно ниже, чем во всех образцах передней коры.

На образцах кДНК четырех индивидуумов было показано, что уровень транскрипции 777? в мозжечках человека такой же или еще более низкий, чем у индивидуума, кДНК которого была использована для вычитающей гибридизации (Человек #22). Несмотря на разницу в уровнях транскрипции р-актина в мозжечках шимпанзе и человека и существенный разброс значений уровня транскрипции р-актина среди образцов кДНК человека мы считаем, что проводить сравнение уровней транскрипции 777? в мозжечках человека и шимпанзе корректно, поскольку уровень транскрипции 777? во всех образцах кДНК мозжечка человека существенно ниже, чем уровень транскрипции 777? в образце

кДНК шимпанзе, несмотря на относительно высокие значения транскрипции Р-актина в мозжечках человека.

Поэтому исходя из полученных данных, можно сказать, что уровень экспрессии гена транстиретина в мозжечке шимпанзе ~ 10 раз выше, чем в мозжечке человека (рис. 3 Б, табл. 2).

На образцах кДНК трех индивидуумов было показано, что уровень транскрипции гена транстиретина в передней коре головного мозга человека в ~ 10 раз выше, чем в мозжечке

Сравнение уровней транскрипции транстиретина в передней коре головного мозга человека и шимпанзе показало, что у человека он в ~ 10 раз выше, чем у шимпанзе.

Уровень транскрипции транстиретина в сосудистом сплетении мозга человека был, как и ожидалось, высоким (тысячи транскриптов на клетку).

Важно отметить, что приблизительно в то же время, когда нами был охарактеризован ген транстиретина, как дифференциально транскрибирующийся в мозжечках человека и шимпанзе, в работе группы А. Варки (Gagneux et al, 2001) было показано, что содержание белка транстиретина в цереброспинальной жидкости у шимпанзе выше, чем у человека. Это хорошо согласуется с полученными в ходе данной работы данными по дифференциальной транскрипции TTR в мозжечках человека и шимпанзе.

Тканеспеиифичность транскрипции гена транстиретина в разных отделах эмбрионального мозга человека.

Поскольку транстиретин является переносчиком тироидных гормонов, важнейших регуляторов дифференцировки и функционирования мозга, то разница в концентрации этого белка может иметь весьма существенное значение для развития мозга Однако исследований по тканеспецифичности экспрессии транстиретина в различных отделах эмбрионального мозга человека до настоящей работы не проводилось.

Таблица 3. Транскрипция гена транстиретина в отделах эмбрионального мозга человека.

Отдел мозга Уровень транскрипции генов"

Р-актин TTR

Базальные ядра 24 27

Лобная доля 24 36

Затылочная кора 24 33

Гипоталамус 24 30

Таламус 24 36

Гиппокамп 24 27

* - количество циклов RT-PCR, необходимых для получения 100 нг

амплифицированной кДНК.

На этом этапе работы были использованы ткани из следующих отделов эмбрионального мозга человека: лобная доля, затылочная кора, базальные ядра, гипоталамус, таламус, гиппокамп (табл. 3) Из всех образцов была выделена суммарная РНК, синтезированы первые цепи кДНК и методом ЯТ-РСЯ проведен анализ уровня транскрипции транстиретина.

Показано, что максимальный уровень транскрипции наблюдается в базальных ядрах и гиппокампе Эти ткани содержат ~102 транскриптов на клетку. Уровень транскрипции транстиретина в гипоталамусе и затылочной коре примерно в 10 раз ниже Уровень транскрипции транстиретина в таламусе и лобной доле сравнительно низкий- несколько транскриптов на клетку. Интересно отметить, что уровень транскрипции транстиретина в эмбриональной лобной доле - в !0 раз ниже, чем в аналогичном отделе мозга взрослого человека. Неравномерный характер транскрипции ТТЛ, наблюдаемый в эмбриональном мозге, возможно, связан с его участием в процессах развития и специализации мозговых структур.

Сравнительный анализ областей регуляции гена транстиретина в геномах мыши, человека и шимпанзе.

Одним из возможных объяснений наблюдаемых различий в уровне экспрессии транстиретина у человека и шимпанзе могут быть различия в структуре регуляторных последовательностей этих генов у человека и шимпанзе. Ген транстиретина относится к группе генов с выраженной тканеспецифичностью экспрессии. Известно, что у человека для экспрессии 777? в сосудистом сплетении мозга и печени необходим участок генома длиной 6 т.п.о., прилегающий к промотору гена 777? с 5'-конца, тогда как у мыши, по имеющимся данным, гомологичный участок составляет ~ 3 т.п.о. В настоящее время для регуляторных элементов, определяющих тканеспецифичность экспрессии гена транстиретина, экспериментально определено только положение промотора и энхансера, регулирующего экспрессию транстиретина в печени мыши. Структура и локализация регуляторных элементов в генах ТШ человека и высших приматов неизвестна.

Для анализа последовательности, содержащей регуляторные элементы, влияющие на экспрессию гена 777? у человека и шимпанзе, была определена нуклеотидная последовательность участка генома шимпанзе длиной ~7100 п.о. (последовательность депонирована в ОепВапк с номерами АУ505106 и АУ530327), прилегающая к точке инициации транскрипции гена в 5'-положении. Сравнение этой последовательности с соответствующей последовательностью генома человека позволило установить, что среднее значение степени идентичности этих последовательностей составляет 98.2%. Эти данные хорошо согласуются с известными из литературы значениями гомологии геномных последовательностей человека и шимпанзе. В исследованной последовательности шимпанзе по сравнению с соответствующим участком генома человека было выявлено: 104 единичные нуклеотидные замены, четыре динуклеотидные и две тринуклеотидные замены, две динуклеотидные делеции и одна деления семи нуклеотидов.

Из обнаруженных нуклеотидных изменений ~ 40% замен находятся внутри повторяющихся элементов генома, местоположение и размеры которых в исследуемой области совпадают у человека и шимпанзе, а нуклеотидные последовательности имеют высокую степень идентичности.

Для выявления потенциальных регуляторных элементов гена 777? было проведено сравнение нуклеотидных последовательностей исследуемых 7 т п.о.-участков генома человека и шимпанзе с нуклеотидной последовательностью аналогичного участка генома мыши, для которого известна локализация промотора и энхансера, обеспечивающего экспрессию гена 777? в печени (рис. 6). Анализ основывался на принятой гипотезе о более высокой консервативности функционально значимых участков генома в эволюции

Человек

Мышь

1 т.п.о.

ЕпНср ~ -4800 п.о.

Епки ~ -3500 п.о.

- -2700 п.о.

Транскрипция

I и I_^

р

~ -650 и.о. (а)

Транскрипция

Епк„

- -1800 п.о.

Содержание СЖ:,%

60

(б)

Рисунок 6. Схема распределения регуляторных элементов, СрО-островков (а) и С+С-состава (б) в участках генома (7 тпо) человека и мыши (номера локусов в вепВапк АС017100и АС129078), прилегающих к ¡'-концам генов транстиретина. (а) Вертикальными линиями обозначены положения динуклеотидов СрС. СрО-островки в последовательности человека обозначены горизонтальными скобками. Стрелкой обозначено направление транскрипции гена транстиретина Черными прямоугольниками обозначены экспериментально определенные ранее для мыши промотор (Р) и энхансер (ЕпИь), обеспечивающий экспрессию транстиретина в печени, а также участки генома человека, имеющие высокую степень идентичности с этими регуляторными элементами генома мыши Серыми прямоугопниками обозначены участки генома человека и мыши, имеющие высокую степень идентичности (85%), и предположительно содержащие энхансер, обеспечивающий экспрессию в сосудистом сплетении мозга (£пкср). Цифры под обозначениями регуляторных элементов показывают расстояние от этих элементов до точки начала транскрипции гена ТТЛ.

При сравнении обнаружено существенное различие в распределении (З+С-состава вдоль исследуемого фрагмента у человека (и шимпанзе) и мыши, что дает основания считать, что в процессе эволюции этот участок подвергался значительным преобразованиям. Изменение в распределении О+С-состава привело к существенному различию в распределении Срв-динуклеотидов внутри этих участков у мыши и человека.

Поскольку СрО-динуклеотиды являются мишенью метилирования геномной ДНК, различие в их распределении наводит на мысль о различии эпигенетических факторов, регулирующих экспрессию гена у грызунов и высших приматов. В частности, на расстоянии примерно 650 п о. от точки начала транскрипции у человека и шимпанзе обнаруживается участок с повышенным, по сравнению с геномом мыши, содержанием <3+С и Срб. Возможно, этот участок в геноме человека играет роль СрО-островка, существенного для регуляции экспрессии генов. Другой потенциальный СрО-островок, отсутствующий в последовательности мыши, находится на расстоянии примерно 4800 п.о. от точки начала транскрипции в участке, консервативном для геномов мыши и человека.

В результате сравнительного анализа было локализовано три области (рис. 6), имеющих, по сравнению с остальной последовательностью исследуемого участка, более высокую степень идентичности:

1. Область промотора длиной - 200 п.о. В геномах человека и мыши значение степени идентичности этого участка - 85%. Далее гомология между последовательностями человека и мыши практически теряется Последовательности промотора человека и шимпанзе совпадают на 100%. Здесь находятся базовые элементы проксимального промотора, такие как ТАТА-бокс, САТ-бокс и частично дуплицированный элемент связывания гормонов. В силу полной идентичности, эта область не может определять различия в уровне транскрипции генов ТТЛ у человека и шимпанзе.

2. Область длиной ~ 100 п.о., гомологичная фрагменту гена транстиретина мыши, который содержит энхансер (ЕпЬь), определяющий экспрессию гена транстиретина в печени (рис. 6 и 7). Степень идентичности этого участка у мыши и человека составляет ~ 60%, что достоверно выше степени идентичности остальных проанализированных нами последовательностей человека и мыши на протяжении 7 т п.о. данной последовательности (-50%).

Мышь

Человек

Шимпанзе

Мышь

Человек

Шимпанзе

Мышь Человек Шимпанзе

Рисунок 7. Выравнивание нуклеотидных последовательностей человека и шимпанзе с фрагментом генома мыши, содержащим эюансер Enhn■ Жирным шрифтом выделена последовательность экспериментально определенного мышиного энхансера Enh/,. В рамки заключены экспериментально определенные для мыши участки связывания с транскрипционными факторами С/ЕВР, HNe-3, API. Серым фоном закрашены идентичные последовательности.

С/ЕВР

AGAGACMGGATGTGAAGATAAAGTGAGGTGCTTTGAAGCACTGS<aGGafrGTI4»GM|A

TAAGACAAGGAAGTGGGGAGAAAGTAAGGCAATTCAGGGTATAGAGAAGA TAAGACAAGGAAGTGGGGAGAAAGTAAGGCAATTCAGGGTACAGAGAAGA

ГССТАААТЧ Г ГОСТАМИГ

HNF-3

GAT-GGAAAAC TACTGATGACCCTTGCAGAGAC- - JGACTATTAG3« CATGTTTGAICAGGC

CATTGGAAAATCACTGATGAAGCTTACAGAGATW AGATTATTTT И ААТАТАААА/ GA— CATTGGAAAATCACTGATAAAGCTTACAGAGATA* AGATTATTTTП AATATAAAAiЗА---

С/ЕВР

API

GCCGGJCGATCAGCAGGTAGACTGTCTG-GAG CGAGA3GGTACAAAAAATAGAAAGAATAAGAT CGAGA3GGTACAAAAAATAGAAAGAATAASAT

Из литературных данных известно, что этот энхансер гена транстиретина мыши содержит в себе участки связывания факторов транскрипции С/ЕВР, АР-1, НОТ-З, которые влияют на уровень экспрессии гена. Анализ соответствующего фрагмента гена транстиретина человека показал, что участки связывания этих факторов транскрипции в ходе эволюции претерпели существенные изменения.

Степень идентичности этой области у человека и шимпанзе составляет 98.2%. В ходе сравнения были идентифицированы две замены в геноме шимпанзе по сравнению с геномом человека, но обе замены находятся вне участков связывания с транскрипционными факторами. Таким образом, по видимому, этот участок также не может быть ответственен за различия в экспрессии гена у человека и шимпанзе.

3. Область длиной ~ 150 п о , со степенью идентичности для человека и мыши около 85% (рис. 6 и 8). Если обсуждаемый участок действительно является регулятором транскрипции, то, поскольку энхансер транстиретина мыши ЕпЬь локализован в другом месте, можно предположить, что этот фрагмент вовлечен в регуляцию экспрессии в сосудистом сплетении мозга. Анализ методами биоинформатики показал, что на этом участке имеется несколько потенциальных сайтов связывания с различными транскрипционными факторами. Среди них такие известные, как факторы транскрипции, содержащие гомео- и РОи-домены, принимающие участие в развитии и дифференцировке.

Степень идентичности этой области у человека и шимпанзе составляет 98.1%: в геноме шимпанзе находятся одна единичная нуклеотидная замена и тройная нуклеотидная замена, которая отличает шимпанзе от человека и мыши, имеющих в этом месте идентичные последовательности. Возможно, что идентифицированные у шимпанзе нуклеотидные замены могут быть причиной различий в уровне экспрессии гена транстиретина в мозге человека и шимпанзе.

Мышь ТССТТССАСТАА6ССТССТ6СТАА6С6АСТТА6СА6АА0АСАААТАССА6ТСТТТввве-

Чеяовек ТССТСАСАСТСССССТСАТССТСвСССТТАС0ССАСАСТ6САААТ6АСАСТАТГГО<К<М Шимп ТССТСАСАСТСССССТСАТССТОССССТТАССОСАСА6ТССАААТСАТССТАТТТ«3«КЗ

Мышь СТСГОААТСТТТ(ЗСАвСТСАААСААТТСААТТТТ<лТТАйСТССССТТОАССТОСАТАА^

Человек СССТС^ТСТГГРвС1иЗ<ОТвААТ1ЛТТаи«^

шимп сажэдтсттттадоговаииш^^

Мышь ССТССАЯСТТТ<^ТТААТ<^ТААССАААТСЛТААА-САСТСАТТТТААААССАТААТССТ

человек агававстстмттмФОя^

Шимп СТСССС«тТСАТТААТ<ОТААССАААГСАТААААаАТТСАТСТТААААССАТААТАСС

Мышь етИиОТЯЛСАвТСЛеАТввТСТТСТЙАТААТС-'ААСС

Человек ШтТААХТкАХЯвТгквМвбГГОСТАебТААСССАААА Шимп кАТТТААГТААТАСТТАСАТйетТССТАйСТААСССАААА

Рисунок 8. Выравнивание области предполагаемого энхансера Епкср, обеспечивающего экспрессию гена ТТЛ в сосудистом сплетении мозга человека, шимпанзе и мыши Жирным шрифтом выделены последовательности, имеющие для трех геномов высокую степень

идентичности (85%) и предположительно содержащие энхансер Епкср. Серым фоном закрашены идентичные последовательности.

Попытки_экспериментальной_идентификации_регуляторных

последовательностей ¡'-прилегающей области гена транстиретина человека.

Для экспериментального подтверждения функциональной значимости идентифицированных методами биоинформатики потенциальных регуляторных участков в 5 -прилегающей области гена ТТЛ человека был применен метод определения активности энханееров по изменению уровня экспрессии репортерного гена. Этот подход является стандартным методом детекции регуляторных последовательностей, таких как энхансеры и промоторы.

В работе использовали клетки линий Нер02 (линия гепатоцитов человека) и гЗЮ -линии сосудистого сплетения мозга крысы. Выбор именно этих клеточных линий для анализа регуляторных последовательностей гена 777? объясняется тем, что линия Нер02 по своим свойствам является в наибольшей степени приближенной к клеткам печени человека. Клеточная линия 2310 в настоящее время является уникальной стабильной клеточной линией сосудистого сплетения мозга. Поскольку ген ТТЛ обладает высокоспецифичным профилем экспрессии, то, очевидно, что в регуляции его экспрессии должны принимать участие факторы, присутствующие только в гепатоцитах и клетках сосудистого сплетения мозга.

Для проведения эксперимента была выбрана последовательность длиной ~7 т.п.о., прилегающая к точке инициации транскрипции с 5'-конца. Были получены три попарно перекрывающихся фрагмента этой области, со средним размером около 2,5 т.п.о. В вектор, содержащий последовательность репортерного гена зеленого флуоресцентного белка (евРР) под контролем промотора ТТЛ, были встроены каждый из этих фрагментов (в 5' - область промотора 7ТЛ). Если энхансерные элементы локализованы в тестируемых участках 5'-прилегающей облает гена ПК человека, то они должны усиливать экспрессию репортерного гена ОКР по сравнению с конструкцией, содержащей только промотор 7ТЛ.

Был проведен ряд трансфекций ДНК экспериментальных конструкций, а также положительных и отрицательных контролей в клетки линий Нер<Э2 и ЪЪ10. Высокий уровень экспрессии вИР в клетках, трансфицированных ДНК вектора, содержащего ген вТР под контролем промотора и энхансера СМУ (положительный контроль), показывает, что все трансфекции прошли успешно. Однако уровень экспрессии вЕР в клетках, трансфицированных векторами, содержащими перед промотором ТТЯ тестируемые участки гена ТТЯ, очень незначительно отличался от уровня экспрессии йРР под контролем одиночного промотора ТТЛ.

Таким образом, данная серия экспериментов не позволила выявить фрагменты 5'-прилегающей области гена ТТЛ человека, содержащие энхансерные последовательности, вовлеченные в регуляцию экспрессии гена ТТЛ в мозге и печени.

Такие результаты могут быть следствием более сложной системы регуляции гена 777?, включающей в себя несколько расположенных в других областях генома регуляторных последовательностей По-видимому, для проявления активности регуляторные элементы гена транстиретина должны находиться в природном геномном окружении

Попытки идентификации последовательностей гена TTR человека, связывающихся с белками ядерных экстрактов.

Одним из экспериментальных подходов, позволяющем судить о вовлеченности данной последовательности в функциональные ДНК-белковые взаимодействия в клетке, в том числе и в регуляцию транскрипции гена, является способность регуляторных последовательностей ДНК связываться с белками ядерных экстрактов in vitro Растворимая фракция ядерного экстракта содержит белки, в нормальных физиологических условиях находящиеся в ядре клетки, в том числе разнообразные факторы, участвующие в регуляции транскрипции

Для идентификации участков фрагмента 5'-прилегающей области гена транстиретина человека (7 т п о.), взаимодействующих с транскрипционными факторами, был применен новый метод, разработанный в Лаборатории. Фрагмент ДНК (7 т.п.о.) 5'-прилегающей области гена TTR человека амплифицировали, гидролизовали и инкубировали с ядерными белковыми экстрактами из клеток линий HepG2 и Z310. Образовавшиеся комплексы и не связавшиеся фрагменты ДНК разделяли на двумерном ПААГ электрофорезе, вырезали участок геля, содержащий фрагменты ДНК, связавшиеся с белками (рис. 9). Фрагменты ДНК элюировали из геля, амплифицировали, полученные амплификаты клонировали, определяли первичную структуру вставок ДНК из случайно отобранных клонов и картировали полученные последовательности на физической карте генома человека (рис. 10).

Было проанализировано 18 фрагментов ДНК, связывающихся с белками ядерного экстракта из клеточной линии Z310 (рис. 10 А) и 23 фрагмента ДНК, связывающихся с белками ядерного экстракта из клеточной линии HepG2 (рис 10 Б).

Значительное число фрагментов ДНК, связывающихся с белками ядерных экстрактов обеих клеточных линий, было картировано внутри последовательностей повторяющихся элементов генома человека, расположенных в этой области, что, возможно, отражает участие повторяющихся элементов генома в регуляции транскрипции гена TTR.

Способность связывать белки показали также фрагменты, локализованные в областях потенциальных энхансеров гена TTR (Enhh и Enhcp), предсказанных на основании анализа нуклеотидных последовательностей (см. рис. 6 и 10) Участок, содержащий последовательность Enhcp показал связывание с белками обеих клеточных линий Участок гипотетического энхансера, регулирующего экспрессию гена TTR в печени (Enhh) связывался только с белками экстракта линии HepG2, причем в районе Enhh было картировано 5 перекрывающихся между собой фрагментов (рис 10 Б).

Направление первого электрофореза

1« -в- 4*

"I 3|

II 31

Рисунок 9. Разделение фрагментов ДНК, соответствующих ¡'-прилегающей обпасти гена транстиретина человека, связавшихся с белками ядерного экстракта клеточной линии Нера, на двумерном ПААГ эчектрофорезе Стрелками обозначены направчения раздечения фрагментов в первом и втором направлениях Четырехугочъником ограничена область геля, из которой элюировали фрагменты ДНК

ЕпЬ„

4 1—1 Ы|-1

ЕпЬ,

«Ос "~=ххк>

ИЯЕ ТАТА бокс

эюон 1 экзон 2

ЫРАИ

1ЛМА1 и / 13 \

ТНЕ1С СЬагНе 8 М1Ш> А1и Л>

интрон 1

Рисунок 10. Распределение участков связывания с белками ядерных экстрактов кчеточных линий 23210 (А) и НерС2 (Б) в локусе гена 777? человека. Жирными горизонтачьными отрезками обозначены участки, связывающиеся с белками ядерного экстракта клеточной линии 2310 Тонкими горизонтачьными отрезками обозначены участки, связывающиеся с белками ядерного экстракта клеточной пинии Нер02 Стречками обозначены повторяющиеся элементы генома человека, находящиеся в данном локусе Серыми прямоугольниками обозначены опредеченные в ходе работы гипотетические энхансеры гена ТТК человека Серыми вертикальными отрезками обозначено расположение регуляторных посчедоватечьностей промотора гена ТТЛ Серыми стрелками обозначены экзоны ТТЯ Звездочками (*) обозначены фрагменты, связывание которых с белками ядерных экстрактов соответствующих клеточных линий подтверждалось экспериментом по торможению в геле.

Однако, существенных различий в распределении фрагментов ДНК, связывающихся с белками ядерных экстрактов из клеточных линий Нер02 и 7,310, обнаружено не было По-видимому, это объясняется повышенной способностью связывать белки ядерных экстрактов практически всей анализируемой последовательностью 5'-прилегающей области гена 777? человека, что может свидетельствовать о ее функциональной значимости в регуляции экспрессии 777?.

Для подтверждения того, что идентифицированные нами помедовательности действительно связываются с белками ядерных экстрактов, было выбрано несколько фрагментов ДНК из исследуемой области гена 777? (на рис. 10 они отмечены *) и с этими фрагментами ДНК проведено торможение в геле с белками ядерных экстрактов клеточных линий Нер02 и 2310. В результате для практически всех выбранных фрагментов было подтверждено связывание.

Анализ связывания последовательностей гипотетических знхансеров гена 7"77? человека и шимпанзе с белками ядерных экстрактов клеточных линий НерС/2 и 2310.

При сравнении нуклеотидных последовательностей гипотетических энхансеров гена 777? человека и шимпанзе в этих участках были обнаружены структурные различия, которые могли бы повлиять на характер связывания этих последовательностей с регуляторными белками Для того чтобы оценить, приводят ли структурные различия к различиям в характере связывания последовательностей с белками ядерных экстрактов, был использован метод торможения в геле На матрицах геномной ДНК человека и шимпанзе были амплифицированы фрагменты ДНК, соответствующие областям гипотетического энхансера, определяющего экспрессию гена транстиретина в печени (ЕпЬь), гипотетического энхансера, определяющего экспрессию гена транстиретина в сосудистом сплетении (ЕпЬср), а также области промотора гена 777?. Полученные фрагменты связывали с белками ядерных экстрактов клеточных линий 2310 и Нер02 и использовали для торможения в геле (рис. 11).

Из представленного радиоавтографа видно, что паттерн связывания с белками для каждого из анализируемых фрагментов гена 777? различен для двух клеточных линий. По-видимому, это может свидетельствовать об участии разных белков в регуляции транскрипции гена 777? в клетках печени и мозга.

Различий в связывании с белками ядерных экстрактов клеточных линий Нер02 и 7310 между фрагментами ДНК человека и шимпанзе, соответствующими промоторной области гена (Про) и гипотетическому энхансеру сосудистого сплетения (ЕпЬср), не обнаружено. В случае фрагмента промоторной области такой результат является ожидаемым, поскольку промоторные последовательности гена 777? человека и шимпанзе различаются крайне незначительно Сходный характер связывания фрагментов гипотетического ЕпЬср человека и шимпанзе, по-видимому, свидетельствует о том, что, обнаруженные структурные различия между этими последовательностями у человека и шимпанзе (в геноме шимпанзе по

сравнению с человеком находятся одна единичная нуклеотидная замена и тройная нуклеотидная замена) не повлияли на характер связывания с белками ядерных экстрактов.

Про ЕпЬср ЕпИь

Рисунок 11. Сдвиг электрофоретической подвижности фрагментов ДНК, соответствующих участкам гена транстиретина человека и шимпанзе в присутствии ядерных экстрактов клеточных пиний НерС2 и 7310- Про - промоторной области, ЕпНср -гипотетического энхансера сосудистого сплетения и Епкн - гипотетического энхансера печени. Ч - фрагмент ДНК человека, Ш - фрагмент ДНК шимпанзе, Нер - ядерный экстракт линии НерС2, 2 - ядерный экстракт пинии 2310, Чк - фрагмент ДНК человека, не инкубировавшийся с ядерным экстрактом, Щ, - фрагмент ДНК шимпанзе, не инкубировавшийся с ядерным экстрактом Прозрачными треугольниками показаны фрагменты, связывание которых с белками различаются для двух клеточных чиний Черными треугольниками показаны фрагменты, связывание которых с бежами одной клеточной линии различаются для чеювека и шимпанзе

Фрагмент ЕпЬь ДНК шимпанзе (область гипотетического энхансера печени) при связывании с белками экстрактов обеих клеточных линий образует зону связывания, отсутствующую у гомологичного фрагмента ДНК человека. Возможно, это связано со структурными различиями между фрагментами ЕпЬь человека и шимпанзе (были идентифицированы две замены в геноме шимпанзе по сравнению с геномом человека).

Способность фрагментов ЕпЬср и ЕпЬь связывать белки ядерных экстрактов клеточных линий свидетельствует о возможности их участия в регуляции экспрессии гена ТТЛ, в том числе и в качестве возможных энхансеров.

выводы

1. Впервые при проведении анализа различий в экспрессии генов в мозге человека и шимпанзе найдено два гена, дифференциально транскрибирующихся в мозжечках человека и шимпанзе: К1АА0537, кодирующий АМФ-активируемую протеинкиназу, и ТТЛ, кодирующий переносчик тироидных гормонов транстиретин.

2. Показано, что первичная структура фрагмента кДНК К1АА0537 шимпанзе на 99,5% идентична последовательности гена человека. Уровень транскрипции гена К1АА0537 в мозжечке человека в 6-10 раз выше, чем у шимпанзе.

3. Показано, что уровень транскрипции гена транстиретина у шимпанзе в мозжечке в 810 раз выше, а в переднем мозге в 10 раз ниже, чем в тех же отделах мозга человека. Впервые показана тканеспецифичность транскрипции гена транстиретина в отделах взрослого и эмбрионального мозга человека.

4. Определена полная первичная структура кДНК гена транстиретина шимпанзе. Среди 12 идентифицированных различий между последовательностями кДНК у человека и шимпанзе обнаружено одно, приводящее к несинонимической аминокислотной замене, существование которой подтверждено для геномов еще трех шимпанзе, что свидетельствует о видоспецифичности этой замены.

5. Определена первичная структура фрагмента ДНК шимпанзе длиной 7 т.п.о., содержащая регуляторные элементы гена транстиретина. В последовательности фрагмента генома шимпанзе по сравнению с соответствующим фрагментом генома человека было выявлено более 120 замен. Локализовано три участка, имеющих высокую степень идентичности у человека, шимпанзе и мыши. Один из этих участков находится в области промотора гена, два других, предположительно, являются энхансерами, связанными со специфичностью экспрессии гена транстиретина в печени и мозге.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Nadezhdin Е. V., Sverdlov E.D. How different is the human genome from the genomes of the great apes? In: Sverdlov E.D. (editor). Retroviruses and Primate Genome Evolution. ISBN: 1-58706-213-5. Georgetown, TX, USA. Landes Bioscience. 2005. p. 68-92.

2. E.B. Надеждин, Т.В. Винотрадова, Е.Д. Свердлов. Сравнительный анализ областей регуляции гена транстиретина в геномах мыши, человека и шимпанзе. Биоорг. химия (2004) 30(4): 383-388.

3. Надеждин Е. В., Виноградова Т. В., академик РАН Свердлов Е. Д. Межвидовая вычитающая гибридизация кДНК из мозга человека и шимпанзе. Доклады Академии Наук (2001) 381(5): 697-700.

4. Nadezhdin E.V., Vinogradova T.V., Sverdlov E.D. Interspecies subtractive hybridization of cDNA from human and chimpanzee brains. Human Genome Meeting HGM 2002, Shanghai, China, 14-17 April, 2002. Programme and Abstract book p. III. Poster presentation.

5. E. Nadezhdin, T. Vinogradova, E. Sverdlov. Comparative analysis of the transthyretin gene regulatory regions in the genomes of human, mouse, and chimpanzee. FEBS advanced course "New molecular strategies to treat neurodegenerative diseases". July 17-23, 2004. Ofir, Portugal. Program and Abstract book. p. 74-75. Poster presentation.

Заказ №508. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». Г. Москва, ул. Пнлиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

РНБ Русский фонд

2007-4 6569

09 ЙЮН 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Надеждин, Евгений Викторович

Введение.

Глава I. Генетические различия между человеком и высшими приматами. Обзор литературы.

1.1. Сравнение геномных последовательностей.

1.2. Структурные различия в геноме митохондрий.

1.3. Цитогенетические различия.

1.4. Различия в структуре и распределении повторяющихся элементов генома.

1.4.1. SINE и LINE элементы.

1.4.2. Эндогенныеретровирусы.

1.5. Различия в структуре и уровне экспрессии кодирующих последовательностей.

1.5.1. Случаи инактивации генов.

1.5.2. Дупликации генов.

1.5.3. Полиморфизмы.

1.5.3.1. Мононуклеотидные полиморфизмы (SNP).

1.5.4. Различия в структуре генов.-.

1.5.5. Различия в статусе метилирования генов.

1.5.6. Различия в уровне экспрессии генов.

1.6. Сравнение свойств белков человека и шимпанзе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ мРНК мозга человека и шимпанзе"

Среди множества нерешенных проблем эволюции одной из важнейших является определение молекулярно-генетических причин видообразования. В частности, чрезвычайно большой интерес вызывает вопрос, какие молекулярные изменения в структуре генома привели к дивергенции линий, ведущих к современному человеку и шимпанзе. Известно значительное сходство в морфологии и анатомии различных систем и органов человека и шимпанзе, в том числе и мозга. Показано также, что геномы этих двух видов совпадают на 98%, а кодирующие области генома более чем на 99%. При этом общие морфологические и функциональные различия между этими двумя видами очень велики. Это приводит к гипотезе о том, что в основе фенотипических различий лежит сравнительно небольшое число изменений в регуляции экспрессии генов. Однако в настоящее время ни одно из этих различий не обнаружено.

На современном этапе развития молекулярной генетики, когда полные последовательности геномов различных организмов становятся доступными для анализа, наиболее актуальной становится проблема сравнения организмов на уровне транскриптома, т.е. анализ экспрессирующихся последовательностей. Данные, полученные в ходе определения структуры геномов человека и шимпанзе, позволяют делать выводы о структурных различиях в генетическом материале этих видов, однако до настоящего момента очень мало известно о различиях в экспрессии отдельных генов между этими двумя близкородственными видами.

До недавнего времени, из-за отсутствия адекватных методов, не проводилось систематического поиска генов, дифференциально экспрессирующихся у человека и шимпанзе. Появившиеся в последние годы методы крупномасштабного сравнительного анализа геномов и транскриптов позволяют подойти к решению этого вопроса. Целью данной работы является полногеномный поиск и идентификация генов, отличающихся по структуре и уровню экспрессии в мозге человека и шимпанзе. Настоящая работа состояла из двух частей: первая - поиск и идентификация транскриптов, экспрессия или структура которых различается в гомологичных отделах мозга человека и шимпанзе. Вторая часть работы была посвящена структурному анализу обнаруженных дифференциальных генов и функциональному анализу одного из них - гена транстиретина.

Объектом данного исследования является мозг, так как мозг - это та структура, где различия в спектрах и уровне транскрипции различных генов наиболее значимы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Надеждин, Евгений Викторович

Выводы

1. Впервые при проведении анализа различий в экспрессии генов в мозге человека • и шимпанзе найдено два гена, дифференциально транскрибирующихся в мозжечках человека и шимпанзе: KIAA0537, кодирующий АМФ-активируемую протеинкиназу, и TTR, кодирующий переносчик тироидных гормонов транстиретин.

2. Показано, что первичная структура фрагмента кДНК KIAA0537 шимпанзе на 99,5% идентична последовательности гена человека. Уровень транскрипции гена KIAA0537 в мозжечке человека в 6-10 раз выше, чем у шимпанзе.

3. Показано, что уровень транскрипции гена транстиретина у шимпанзе в мозжечке в 8-10 раз выше, а в переднем мозге в 10 раз ниже, чем в тех же отделах мозга человека. Впервые показана тканеспецифичность транскрипции гена транстиретина в отделах взрослого и эмбрионального мозга человека.

4. Определена полная первичная структура кДНК гена транстиретина шимпанзе. Среди 12 идентифицированных различий между последовательностями кДНК у человека и шимпанзе обнаружено одно, приводящее к несинонимической Ф аминокислотнои замене, существование которой подтверждено для геномов еще трех шимпанзе, что свидетельствует о видоспецифичности этой замены.

5. Определена первичная структура фрагмента ДНК шимпанзе длиной 7 т.п.о., содержащая регуляторные элементы гена транстиретина. В последовательности фрагмента генома шимпанзе по сравнению с соответствующим фрагментом генома человека было выявлено более 120 замен. Локализовано три участка, имеющих высокую степень идентичности у человека, шимпанзе и мыши. Один из этих участков находится в области промотора гена, два других, предположительно, являются энхансерами, связанными со специфичностью экспрессии гена транстиретина в печени и мозге.

Я хочу выразить глубокую признательность своему научному руководителю -заведующему Лабораторией структуры и функций генов человека академику Е.Д. Свердлову за помощь и участие в данной работе. Также выражаю благодарность с.н.с. Т.В. Виноградовой за разнообразную помощь, плодотворные обсуждения и конструктивную критику данной работы. Отдельная благодарность Е.А. Стукачевой за ведение клеточных линий, проведение экспериментов по трансфекциям, а также за благожелательное отношение и конструктивные советы.

Хотелось бы поблагодарить весь большой коллектив сотрудников лаборатории за дружескую атмосферу, готовность всегда помочь словом и делом.

1.7. Заключение

Генетические изменения, происходящие в процессе видообразования, до настоящего времени остаются наименее исследованной областью молекулярной генетики. По оценкам, проведенным при сравнении экспрессии генов различных видов и подвидов, при видообразовании происходят изменения в сотнях генов. Они могут касаться как структуры, так и функций генома.

Из представленного обзора видно, что в настоящее время накоплены данные о различиях между геномами человека и шимпанзе, затрагивающие все уровни организации генетического материала, а также описаны некоторые различия на уровне протеомов. Однако представленные данные не позволяют нарисовать целостную законченную картину функционирования генетических факторов, обусловивших дивергенцию предковых линий, ведущих к современным видам человека и шимпанзе, поскольку, несмотря на значительный прогресс в этой области, достигнутый в последнее время, из-за значительного недостатка данных не удается выявить ключевые различия на молекулярном уровне, лежащие в основе столь значительных фенотипических различий между человеком и высшими приматами.

Анализ различий структуры геномов человека и шимпанзе показывает, что большинство известных в настоящее время причин, вызвавших эти различия, можно отнести к двум основным группам: (1) последствия инсерций ретроэлементов (в подавляющем большинстве случаев инсерции Alu повторов), вызывающие рекомбинационные изменения структуры генов; (2) точечные мутации, приводящие к изменению силы промоторов и как следствие, различиям в уровне экспрессии отдельных генов, потере/появлению новых экзонов и интронов, появлению полиморфных по аминокислотной последовательности белков, в том числе более коротких/длинных изоформ существующих белков, а также, альтернативным вариантам посттрансляционной модификации белков.

Следует отметить, что эти наблюдения носят предварительный и незаконченный характер, но появляющиеся новые систематические методы анализа геномов, транскриптомов и протеомов большого количества более простых модельных организмов позволяют обнаружить новые закономерности и законы видообразования, которые возможно будет проверять и подтверждать на таких сложных в работе объектах как человек и шимпанзе, и к уже описанным генетическим факторам, обусловливающим фенотипические различия между человеком и высшими приматами, прибавятся новые, еще не известные.

Глава II. Сравнение мРНК мозга человека и шимпанзе

В настоящее время для сравнения уровней экспрессии генов в двух или нескольких биологических образцах наиболее часто используются методы гибридизации микрочипов (microarray), дифференциального дисплея, SAGE (serial analysis of gene expression) и метод вычитающей гибридизации. Каждому из этих методов присущи свои достоинства и недостатки (для обзора см. [154]).

Метод дифференциального дисплея позволяет одновременно анализировать сразу несколько сравниваемых образцов, оценивая различия по размеру и интенсивности отдельных кДНК после разделения на электрофорезе. Однако при межвидовом сравнении велико количество мРНК, различающихся по структуре, в том числе и имеющих разную длину, поэтому их сравнение весьма затруднено.

Метод гибридизации с микрочипами позволяет проводить одновременное сравнение нескольких тысяч экспрессирующихся последовательностей в двух образцах [155]. Однако для использования этого метода при межвидовом сравнении существуют ограничения, связанные с неизвестными различиями в структуре генов сравниваемых организмов, поэтому использование микрочипов, сконструированных на основе последовательностей генов одного организма, для анализа уровня экспрессии другого организма может искажать получаемую картину различий (см. раздел 1.5. Обзора литературы).

Использование метода SAGE для межвидового сравнения также ограничено поскольку затруднена идентификация секвенированных тэгов в случае, если не известна геномная последовательность организма для которого проводится сравнение.

Метод вычитающей гибридизации позволяет обходить некоторые из проблем, возникающих при анализе микрочипов, однако сам имеет ряд недостатков, таких как достаточно высокий уровень фалыппозитивных фрагментов в вычтенных библиотеках, что требует проведения дополнительных этапов по идентификации истинно дифференциальных последовательностей, а также значительную трудоемкость. Тем не менее, вычитающая гибридизация является одним из наиболее эффективных методов для межвидового сравнения, позволяя в отличие, например, от метода с использованием микрочипов, проводить сравнения гомологичных последовательностей, не идентичных между собой на 100%, и получать информацию не только об уровнях экспрессии уже известных последовательностей, но также находить дифференциально экспрессирующиеся последовательности с неизвестной ранее структурой. Эти особенности метода делают его предпочтительным в настоящем исследовании, позволяя идентифицировать дифференциальные кДНК мозга человека и шимпанзе.

Для проведения сравнительно анализа уровней транскрипции генов в мозжечках человека и шимпанзе был выбран метод вычитающей гибридизации в модификации супрессивной вычитающей гибридизации, ранее разработанный в Лаборатории, и показавший высокую эффективность как при сравнении уровней экспрессии генов внутри одного организма, так и при сравнении геномных последовательностей разных видов бактерий [156].

2.1. Вычитающая гибридизация кДНК из мозжечков человека и шимпанзе

2.1.1. Выделение и характеристика суммарной РНК из мозжечков человека и шимпанзе.

Для сравнения мРНК был использованы мозжечки человека и шимпанзе. Выбор мозжечков в качестве объекта исследования обоснован тем, что мозжечок является морфологически обособленным отделом головного мозга, и это позволяет целиком отделить его от остального мозга. При использовании в работе целого мозжечка достигается морфологическая и генетическая идентичность сравниваемых образцов. Кроме того, в литературе имеются данные о непропорциональном изменении размеров мозжечка среди других отделов мозга человека по сравнению с высшими приматами и особом характере экспрессии генов в мозжечке по сравнению с другими отделами головного мозга [133, 157, 158].

На первом этапе работы были выделены препараты суммарной РНК из мозжечков человека (Homo sapiens sapiens) и шимпанзе (Pan troglodytes) с использованием гуанидин изотиоцианата и дополнительного переосаждения с LiCb, что позволило избавиться от основной низкомолекулярной фракции в препаратах суммарной РНК. Качество полученных РНК оценивали по соотношению интенсивности полос 18S и 28S рРНК при разделении в неденатурирующем агарозном геле.

Препараты суммарной РНК использовали как матрицы для синтеза кДНК с использованием олиго (дТ) праймера и высокопроцессивной обратной транскриптазы SuperScript. Для построения второй цепи кДНК применяли эффект cap-switch [159]. Данный подход позволяет получать набор двуцепочечных кДНК, обогащенный полноразмерными копиями транскриптов. Для синтеза использовали одинаковые количества суммарной РНК человека и шимпанзе. Эффективность синтеза кДНК оценивали по количеству копий мРНК генов Р-актина, клатрина и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ПЦР с праймерами b-actin For/Rev, Clathrin For/Rev и GAPDH For/Rev (табл. 7).

2.1.2. Вычитающая гибридизация. Отбор дифференциальных клонов

Подготовительные этапы получения трейсера и драйвера для проведения вычитания кДНК, а также саму вычитающую гибридизацию проводили в соответствии с протоколом системы "PCR-Select cDNA Subtraction Kit". Было проведено две вычитающие гибридизации: (1) для получения библиотеки, обогащенной специфичными для человека транскриптами, при вычитании в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка человека, а драйвера - кДНК из мозжечка шимпанзе; (2) для получения библиотеки, обогащенной транскриптами, специфичными для шимпанзе, в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка шимпанзе, а драйвером служила кДНК мозжечка человека (рис. 1, п.1).

Эффективность вычитающей гибридизации оценивали по изменению количества кДНК гена, уровень транскрипции которого в гомологичных отделах мозга человека и шимпанзе одинаков. Поскольку транскрипция такого гена не дифференциальна, после проведения вычитающей гибридизации содержание его кДНК должно уменьшаться в пулах дифференциальных кДНК. Для такой оценки был выбран ген глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH). Из литературных данных известно, что нуклеотидная последовательность GAPDH консервативна [160], а в ходе данной работы методом RT-PCR было показано, что ген GAPDH экспрессируется в мозжечках человека и шимпанзе на приблизительно одинаковом уровне.

После проведения вычитающей гибридизации оценивали содержание кДНК гена GAPDH в вычтенных кДНК по сравнению с исходным ПЦР с праймерами G3PDH For/Rev. Продукт амплификации кДНК гена GAPDH в вычтенных пулах кДНК появлялся на 6 циклов ПЦР позже по сравнению с исходным, т.о. эффективность «обеднения» вычтенных кДНК оценивалась как ~26 раз, т.е. ~ 60 раз.

Вычтенные кДНК клонировали в плазмидный вектор pGEM-T и трансформировали клетки E.coli. Полученные клоны были ранжированы в 96-луночные планшеты. В результате были получены две ранжированные библиотеки содержащие ~ по 700 индивидуальных клонов (рис. 1 п.2).

Вычитающая гибридизации

Ранжированные библиотеки

Дифференциальная гибридизация о • • • • • • • * •

• • о • •

Зонд "Ч-Ш" "+" гибридизация о«оо»оо»»оо е••о • о о о•оо

•оо*о*«оо»«

• ООО«О»ИО0

• ®в#оою«о»

ОО»О »»»»ООО

Зонд "Ш-Ч" гибридизация

О•О ООО о о•о• О0О1ОО»ОО»О t О О О « I о о о о « в«оооо»о#»о •otofoioovo оов о ©•оо•о»

Зонд "Ч-Ш" гибридизация

••••••••о»

•Q*0**0*«»« о*»о*оо**« • • •о • • • • • • • •••••••••о*

Зонд "Ш-Ч" '+"гибридизация

Отбор дифференциальных клопов, определение первичной структуры, идентификация дифференциальных кДН К

Рисунок I. Схема эксперимента по дифференциальной гибридизации библиотек кДНК, полученных в результате вычитающих гибридизаций кДНК мозжечков человека и шимпанзе. 1. Проведение двух вы читающих гибридизаций: Ч-Ш - для получения библиотеки, обогащенной специфичными для человека транскриптами, при вычитании в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка человека, а драйвера - кДНК из мозжечка шимпанзе; Ш-Ч - для получения библиотеки, обогащенной транскриптами специфичными для шимпанзе, в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка шимпанзе, а драйвером служила кДНК мозжечка человека. 2. Ююнирование вычтенных кДНК в плазмидный вектор, трансформация клеток E.coli, получение двух ранжированных библиотек. 3. Получение двух копий реплик ДНК вставок каждого клона на фильтрах, дифференциальная гибридизация с зондами, являющимися радиоактивно меченными пулами кДНК (Ч-Ш и Ш~Ч), полученными после вычитающих гибридизаций.

2.1.3. Дифференциальная гибридизация. Отбор и идентификация дифференциальных транскриптов.

Поиск дифференциальных клонов проводили методом дифференциальной блот и дот-блот гибридизации (рис, I и 2). Амплификацию ДНК вставок плазмид для переноса на фильтры проводили ПЦР в плашках с универсальными праймерами М13. Более 90% плазмид из индивидуальных клонов библиотек содержали вставки длиной от 150 п.о. до 1 т.п.о. Продукты амплификации наносили на нейлоновую мембрану (для дот-блот гибридизации) или разделяли в агарозном геле и переносили на мембрану (для блот гибридизации). Продукты амплификации ДНК вставки каждого клона наносили на две мембраны, чтобы проводить гибридизацию параллельно с двумя зондами (рис. 1 п.З).

А В С I) Е F G II

Рисунок 2. Радиоавтограф дифференциальной дот-блот гибридизации ДНК вставок клонов библиотеки, обогащенной шимпанзе-специфическими транскриптами. А - Гибридизация с радиоактивно меченными кДНК, обогащенными специфичными для шимпанзе кДНК, полученными после вычитающей гибридизации (Ш-Ч) («+» гибридизация).

Б — Гибридизация с обогащенными специфичными для человека кДНК, полученными после вычитающей гибридизации (Ч-Ш) («—» гибридизация).

Стрелками с подписями обозначены клоны, отобранные для определения первичной структуры ДНК их вставок.

В качестве зондов для сравнительной гибридизации использовали радиоактивно меченные кДНК, полученные после вычитающей гибридизации. Клонированные фрагменты кДНК, дававшие сильный сигнал при гибридизации со «своим» зондом («+» гибридизация) и слабый или отсутствующий сигнал при гибридизации с противоположным зондом («-» гибридизация), отбирали как дифференциальные. Не было обнаружено клонов, которые давали бы заметный сигнал при «+»-гибридизации и вообще не давали сигнала при «-«-гибридизации.

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 2 3 4 5 6 7 S 9 10 11 12

А2 Ш тт•4 • • * * • • 9 • • •• « • « • • # • ~ • • а

А • « I V « 0 9 в•• с # » # # * (

Е • Щ К+ФШФ » ♦ ' тШФШ • т С

G # • • • • • Ф в I

Из двух библиотек было отобрано 19 клонов, вставки которых давали наиболее четко различающиеся сигналы при «+» и «—«-гибридизациях, после чего определяли первичную структуру ДНК их вставок. Номера отобранных клонов приведены в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Надеждин, Евгений Викторович, Москва

1. King, М.С. and А.С. Wilson, Evolution at two levels in humans and chimpanzees. Science, 1975.188(4184): p. 107-16.

2. Fujiyama, A., et al., Construction and analysis of a human-chimpanzee comparative clone map. Science, 2002. 295(5552): p. 131-4.

3. Toder, R., Y. Xia, and E. Bausch, Interspecies comparative genome hybridization andinterspecies representational difference analysis reveal gross DNA differencesbetween humans and great apes. Chromosome Res, 1998. 6(6): p. 487-94.

4. Ueda, S., K. Washio, and K. Kurosaki, Human-specific sequences: isolation ofspecies-specific DNA regions by genome subtraction. Genomics, 1990. 8(1): p. 7-12.

5. Goodman, M., The role of immunochemical differences in the phyletic development ofhuman behavior. Human Biology, 1961.33: p. 131-162.

6. Kimura, M., The neutral theory of molecular evolution. 1983, Cambridge

7. Cambridgeshire.; New York: Cambridge University Press, xv, 367.

8. Wu, C.I. and W.H. Li, Evidence for higher rates of nucleotide substitution in rodentsthan in man. Proc Natl Acad Sci USA, 1985. 82(6): p. 1741-5.

9. Glazko, G.V. and M. Nei, Estimation of divergence times for major lineages ofprimate species. Mol Biol Evol, 2003. 20(3): p. 424-34.18.