Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и изучение S-REX - нового гена со специфической компартментализацией mРНК в нейронах

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бака, Иван Дмитриевич, Москва

Л 'Л Д /О Л я

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. Энгелыардта

На правах рукописи УДК 575:595

Бака Иван Дмитриевич —

КЛОНИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ 8-Еех НОВОГО ГЕНА СО СПЕЦИФИЧЕСКОЙ КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЕЙ мРНК

В НЕЙРОНАХ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: академик РАН Г.П. Георгиев, кандидат биологических наук В.Л. Бухман

Москва - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Дифференцированное распределение мРНК в ооцитах, развивающихся эмбрионах и некоторых типах соматических клеток 9

1.1.1. Возможные причины асимметричного распределения мРНК в клетках 10

1.1.2. Сигнальные последовательности, детерминирующие неслучайное распределением РНК в цитоплазме клеток 12

1.1.3. Возможные механизмы, посредством которых сигнальные последовательности нацеливают мРНК к местам их локализации 17

1.2. Особенности дифференцированного распределения мРНК в нейронах 23

1.2.1. Тип ы мРНК и их распределение в нейронах 23

1.2.2. Методические подходы для выявления мРНК, локализованных в дендритах 26

1.2.3. Возможные механизмы, обуславливающие направленную локализацию мРНК в нейронах и экспериментальные

подходы для их установления 29

1.3. Применение метода субтрактивной гибридизации для клонирования и изучения генов, специфически экспрессирующихся в определенных типах клеток и органов 34

1.4. Заключение 38 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 40

2.1. Реактивы и материалы 40

2.2. Биологические материалы 41

2.3. Выделение плазмидной ДНК 42

2.4. "Спасение" рекомбинантной плазмиды in vitro из бактериофага

A ZAPI1 43

2.5. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля с низкой температурой плавления 43

2.6. Радиоактивное мечение ДНК-зонда методом ник-трансляции 44

2.7. Радиоактивное мечение ДНК-зонда с использованием случайной затравки 44

2.8. Выделение суммарной РНК 45

2.9. Выделение поли(А)+ РНК 46

2.10. Хроматография на колонке Qiagen tip 5 46

2.11. Фракционирование РНК в агарозном геле, содержащем формальдегид 47

2.12. Перенос РНК на Hybond N 47

2.13. Гибридизация РНК-содержащих фильтров 47

2.14. Синтез DIG кРНК для in situ гибридизации 48

2.15. Синтез одноцепочечной кДНК 49

2.16. Биотинилирование поли(А)+ РНК 50

2.17. Субтрактивное клонирование кДНК из ограниченного

количества биологического материала 51

2.18. in situ гибридизация с DIG кРНК 55

2.19. Секвенирование ДНК 57

2.20. Полимеразная цепная реакция 57

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 58

ЗЛ. Модифицированный метод конструирования субтрактивной кДНК библиотеки и его применение для выделения синаптомсомспецифических клонов 58

3.2. S-Rex - новый нейроспецифический ген 61

3.3. Получение полных кДНК копий для двух основных транскриптов S-Rex гена крысы и цыпленка 63

3.4. Нетранслируемые области S-Rex 65

3.5. NSP - аналог S-Rex в геноме человека 67

3.6. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей

S-Rex белков 67

3.7. Внутриклеточная локализация S-Rex транскриптов 69

3.8. Экспрессия S-Rex мРНК в эмбриональном и постнатальном развитии 71

3.9.Другие транскрипты, являющиеся продуктами альтернативного сплайсинга внутренних экзонов S-Rex гена 73

ВЫВОДЫ 76

ПРИЛОЖЕНИЕ 78

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101

Список сокращений

п.н. (т.п.н.) - единица длины, соответствующая паре нуклеотидов (тысяче пар нуклеотидов) в двуспиральных нуклеиновых кислотах дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат поли(А)н РНК - полиаденилированная РНК cytPHK - цитоплазматическая РНК synPHK - синаптосомальная РНК pmtPHK - постмитохондриальная РНК НТО - нетранслируемая область мРНК ПНС- периферическая нервная система ЦНС- центральная нервная система DRG - ганглий заднего корешка спинного мозга СП - субтрактивная проба СБ - субтрактивная библиотека ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция SDS - додецилсульфат натрия

SSC - солевой раствор, содержащий 0,15М NaCl и 0,015М цитрат натрия DTT - дитиотрейтол

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

БСА - бычий сывороточный альбумин

ТЕ - буфер, 10 мм Tris НС1 рН 8,0, 1 мм ЭДТА

STE - 100 мм NaCl, 10 мм TrisHCl рН 8,0, 1 мм ЭДТА

ВВЕДЕНИЕ

Компартментализация макромолекул в пределах клетки необходима для ее функционирования и межклеточного взаимодействия в процессе развития и созревания. Хотя многое известно о механизмах специфического транспорта белков и мембран к определенным участкам различных эукариотических клеток (Kelly and Grote, 1993), данные о внутриклеточном распределении мРНК не так многочисленны. В последние годы стало очевидно, что специфическая внутриклеточная локализация отдельных мРНК является существенной для эмбрионального развития и функционирования клеток, имеющих поляризованную морфологию (Wilhem and Vale, 1993; St Johnson, 1995).

Нейрон является крайним примером высокополяризованной клетки со структурной и функциональной специфичностью отдельных клеточных ком-партаментов. Транскрипты различных белков дифференцированно распределяются между перикарием, дендритами и аксонами этих клеток. Большинство исследованных мРНК локализовано в перикрионе, например, мРНК кодирующие некоторые цитоскелетальные белки, мембранные белки и рецепторы (Bruckenstein et al., 1989; Kleiman et al., 1990, 1993; Craig et al., 1993). В дендритах обнаружены мРНК дендритных форм ассоциированного с микротрубочками белка 2 (Garner et al., 1988), альфа-субъединицы Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы I) (Burgin et al., 1990), белка амилоидного предшественника (Strong et al., 1990) и BDNF (Dugich-Djordjevic et al., 1992). Транспорт мРНК в аксоны был продемонстрирован для трех

нейропептидов, нейрофиламента-L и тирозингидроксилазы (Bloch et al., 1990; Jirikowski et al., 1990; Mohr et al., 1991; Mohr and Richter, 1992; Melia et al., 1994) Было высказано предположение, что регионализация отдельных мРНК в пределах различных частей нейрона является механизмом привязывания синтеза кодируемых белков к определенным сайтам. Обязательным условием этой гипотезы является наличие белок-синтезирующего аппарата в этих сайтах. Активный синтез белка был обнаружен в выделенных из культивируемых нейронов дендритах. (Torre and Steward, 1992), а также в выделенных синаптосомах (Rao and Steward, 1991). В дендритах полирибосомы обнаруживаются преимущественно в синаптических сайтах и в период роста синапса (Craig and Banker, 1994; Steward, 1995). В аксонах и пресинаптическом регионе, в отличие от дендритов, полирибосомы методом электронной микроскопии обнаружены не были, в результате этого сложилось мнение, что в аксонном компартаменте нейронов синтеза белка не происходит и что все аксонные белки транспортируются из перикариона (Steward and Banker, 1992; Prochintz, 1995). Недавние исследования показали, что прямой транспорт мРНК в аксоны является механизмом их накопления; при необходимости эти мРНК перемещаются обратно в перикарион для трансляции (Trembleau et al., 1994: Skutella et al., 1994).

По мере накопления данных о локализации белков внутри клетки, выдвигались различные гипотезы. Одна из гипотез, предложеных для объяснения механизма быстрого и избирательного реагирования нейронов на внешнюю стимуляцию, предполагает локализацию требуемых мРНК и, соответственно, синтеза кодируемых ими белков в области синаптического контакта. В последнее время концепция специфической, направленной

компартментал изации мРНК в клетках получила шрокое распространение и с ее помощью был объяснен ряд явлений, например события происходящие на самых ранних этапах эмбрионального развития.

Суммируя данные о наличии транспорта мРНК в отдельные участки клетки в течение нейрональных процессов, синтеза белков в постсинаптичес-ких окончаниях и возможной важной роли таких белков в функционировании синапса, несомненный интерес представляет выделение и характеристика некоторых новых мРНК такого рода, путем клонирования соответствующих кДНК.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л Дифференцированное распределение мРНК в ооцитах, развивающихся эмбрионах и некоторых типах соматических клеток.

Одним из ключевых вопросов клеточной биологии является выяснение механизмов распределения белков в клетках, особенно в тех, которые отличаются полярностью. Асимметричный характер организации клетки требует асимметричной локализации белков в субклеточных районах. Одним из возможных путей достижения этого может быть неравномерность в распределении мРНК. Факт дифференцированного распределения мРНК впервые был установлен в 1983 году (Jeffery et al, 1983) при исследовании мРНК актина в миоплазме яиц асцидий. Последующие исследования других типов мРНК подтвердили факт неслучайной локализации мРНК в различных частях клетки Так, было обнаружено, что в олигодендроцитах и клетках Шванна мРНК. миелина присутствует в клеточных отростках, тогда как другие мРНК, включая мРНК для противолипидных белков, обнаруживают перину-клеарную (perinucear) локализацию (Trapp et al., 1987).

В экспериментах с ооцитами Xenopus (Rebagliati et al., 1985) были клонированы несколько материнских мРНК, которые оказались преимущественно локализованы либо на вегетативном, либо на апикальном полюсах. Наиболее хорошо охарактеризованный из этих транскриптов, VG1, однородно распределялся на ранних стадиях развития ооцитов и был расположен у вегетативного кортекса на средних и поздних стадиях развития.

На ранних стадиях бластодермы у эмбрионов дрозофилы транскрипты генов сегментации проявляют различный характер локализации в периплазме, окружающей кортикальный слой ядра (Davis and Ish-Horowicz, 1991). В конце стадии бластодермы клеточные мембраны впячиваются для разделения периплазмы индивидуальной клетки на апикальную и базальную. gap гены - зиго-тенные гены, транскрипты которых первыми появляются в апикальной и базальной периплазме. Эти гены активируют транскрипцию pair-rule генов, мРНК которых локализованы в апикальном районе.

1.1.1 Возможные причины асимметричного распределения мРНК в

клетках.

Чем может быть обусловлено асимметричное распределение мРНК в клетках? Здесь возможно несколько причин. Поскольку мРНК является матрицей для трансляции, их локализация позволяет специфическим белкам синтезироваться в определенных клеточных районах, а не в других, где нет необходимости в них. В целом, локализованный белковый синтез можно рассматривать как один из эффективных путей "нацеливания" белков к требуемым участкам. Вероятно, для клетки более экономично направленно перемещать одиночную мРНК, которая может быть использована в процессе трансляции несколько раз, чем направлять и транспортировать много белковых молекул. Так, в культуре мышечной ткани цыпленка мРНК, соответствующие вементину, десмину и виккулину, направляются к участкам, где их белковые продукты концентрируются (Morris and Fulton, 1994). Поскольку эти белки обнаруживаются в процессе развития мышцы немного ранее, чем соответствующие мРНК, можно сделать вывод, что специфическая локализа-

ция мРНК не является необходимой для нацеливания белка в соответствующий участок. Однако, раз транскрипты также накапливаются в данном участке, белковый синтез может осуществляться точно в нужном месте, и даже, по мере трансляции, может происходить сборка костамеров.

Другая причина специфической локализации мРНК может быть связана с необходимостью предотвратить экспрессию белка, кодируемого данной мРНК, в других участках клетки. Приведенное объяснение является достаточно убедительным для случая с базовым миелиновым белком, являющимся компонентом миелинового щита, которым олигодендроциты покрывают аксоны. Это внутриклеточный белок, который взаимодействует с мембранами и может быть причиной их компактизации. В отличие от других компонентов миелина, которые транспортируются к миелинизирующим клеточным отросткам по секреторным каналам, базовый миелиновый белок транслируется на свободных рибосомах за счет локализованых здесь мРНК (Trapp et al.,1987). Дело в том, 410 направлять готовый базовый миелиновый белок от тела клетки к участкам миелиновой формации было бы сложно, поскольку белок внедрялся бы в любые мембраны по пути следования к своему "конечному пункту".

•» Специфическая локализация мРНК позволяет избежать этих трудностей и не допускает компактизации мембран большей части клеточного тела.

Специфичность локализации мРНК может играть сходную защитную роль и в клетках, в которых экспрессируется более чем одна изоформа определенного белка способного мультимеризоваться. Синтез разных изоформ в различных компартаментах клетки позволяет избежать образования гетеромульти-меров. Этот момент может быть очень важным для поддержания состава акти-новых филаментов в дифференцирующихся миобласгах. Так, мРНК ß-актина

локализуется в лидирующих пластинках на клеточной периферии, тогда как транскрипты а- и у-актина проявляют перинуклеарное распределение (Kislaus-kisetal., 1993, Hill and Gunning, 1993).

Специфическая локализация мРНК не только может обеспечивать доставку белков в соответствующие участки поляризованной клетки, но также может непосредственно отвечать за установление самой полярности. Как и в миобластах, транскрипты ß-актина располагаются в ведущих пластинках фибробластов эмбриона цыпленка (Lawrence and Singer, 1986). Используя антисенс сшигонуклеотиды, которые подавляют действие локализационных сигналов З'-нетранслируемой области мРНК, можно нарушить эту специфичность. В этом случае /З-актин больше не будет концентрироваться на лидирующем крае клетки, хотя уровни как самого белка, так и мРНК, не изменятся (Kislauskis et al., 1994). Такое перераспределение ß-актина является причиной разрушения пластинки, в результате чего клетка становится симметричной. Данный пример - лучшее доказательство функциональной значимости специфической локализации мРНК в соматических клетках.

1.1.2. Сигнальные последовательности, детерминирующие не случайное распределение РНК в цитоплазме клеток.

Общей особенностью, выявленной при исследовании локализованных мРНК, является то, что цис-действующие последовательности, необходимые для специфической локализации, находятся в пределах З'-нетранслируемой области транскрипта. Это делает нереальной модель, согласно которой натив-ный полипептид направляет мРНК в определенное место по мере того, как идет процесс трансляции.

Во всех случаях, где эти последовательности были точно картированы, они оказались относительно большими (Macdonald et al., 1993; Ferrandon et al., 1994). Имеются, возможно, два основных фактора, которые объясняют размеры этих локализационных сигнальных последовательностей (Johnston, 1995). Во-первых, в отличие от двухцепочечных ДНК, одноцепочечные молекулы РНК имеют способность складываться в комплекс вторичных структур. Если установление локализационного сигнала требует образования таких структур, связывающий сайт для одиночного белка может включать большой участок РНК. Во-вторых, похоже, что эти сигналы содержат множество сайтов для связывания белков, поскольку специфическая локализация мРНК может осуществляться в несколько этапов, каждый из которых требует различные транс-активные факторы.

Локализация bicoid мРНК на переднем полюсе яйца дрозофилы осуществляется, по крайней мере, в три этапа, имеющие различные генетические условия (St Johnson et al., 1989). На ранних стадиях оогенеза мРНК проявляет временную апикальную локализацию в питательных клетках перед тем, как она транспортируется к переднему краю ооцита, и оба эти этапа нарушаются мутациями в гене exuperantia (exu). Ген swallow необходим для "заяко-ривания" мРНК у кортекса после того, как она достигает переднего края ооцита (Stephenson et al.. 1988). Окончательно РНК освобождается от кортекса при активации яйца и "заякоривается" на переднем полюсе, причем ее поддержание там требует активности гена Staufen. Макдональд (Macdonald et al., 1993) идентифицировал в пределах 625 нуклеотидов локализационного сигнала bicoid, 53 нуклеотидную последовательность, названную BLEI элементом, который необходим для первого exu-зависимого этапа процесса локализации

мРНК. Двух внедренных в гетерологичный транскрипт копий этого элемента достаточно, чтобы направить данный транскрипт к переднему краю ооцита, но не достаточно для "заякоривания" РНК у кортекса. Используя метод инъецирования РНК, Ферандон с коллегами (Ferrandon et al., 1994) установил на 3'-нетранслируемом конце участок bicoid, который связывается со Staufen белком для предотвращения диффузии РНК, уже освобожденной в цитоплазме яйца. Последовательность, необходимая для осуществления последнего этапа многоступенчатого процесса локализации bicoid, занимает свыше 400 оснований. Это участок, вторичная структура которого может состоять из трех петель. Поскольку он включает элемент BLEI, сигнал локализации bicoid содержит, по крайней мере, два разных, но перекрывающихся элемента, которые определяют разные этапы локализации мРНК.

Результаты исследования Vgl мРНК ооцитов ксенопуса позволяют предположить, что данный транскрипт содержит множество независимых цис-ак-тивных элементов, поскольку локализация мРНК у вегетативного кортекса ооцита осуществляется �