Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бактериофаг Т4: молекулярное клонирование генов и суперпродукция ферментов метаболизма ДНК

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Таняшин, Валерий Иванович

Введение . II

Обзор литературы

ГЛАВА I. Контролируемая крупноблочная фрагментация ДНК. Системы модификации-рестрикции в* coli и Т-четных бактериофагов

1.1. Бактериофаги с двух спиральной ДНК.

1.2. Гидродинамическая фрагментация ДНК.

1.3. Индуцируемая хозяином модификация-рестрикция.

1.4. Номенклатура систем модификации-рестрикции.

1.5. Генетический контроль индуцируемой хозяином модификации-рестрикции

1.6. Системы модификации-рестрикции Т-четных фагов.

1.7. Эндонуклеазы рестрикции класса II. Распространение в природе

1.8. Эндонуклеазы рестрикции класса II в E,coli.

1.9. Особенности действия рестриктаз класса II при изменении условий гидролиза, добавлении антибиотиков и при использовании необычных субстратов

ГЛАВА 2. Управляемая ассоциация фрагментов ДНК в функционирующей генетический материал

2.1. Соединение фрагментов ДНК

2.2. ДНК-лигазы

2.2.1. Механизм реакции

2.2.2. Субстратная специфичность

2.2.3. Функции ДНК-лигазы фага Т4.

2.2.4. Клонирование структурных генов полинуклеотидлигаз E.coli и фага Т4.

ГЛАВА 3. Векторы на основе плазмид E.coli и бактериофага

3.1. Блочный характер организации природных плазмид

3.2. Блоки репликации

3.3. Блоки, контролирующие стабильность плазмид

3.4. Блоки антибиотикорезистентности

3.5. Специализированные векторы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии клонированных генов

3.6. Промоторы

3.7. Сайт связывания с рибосомой.

3.8. Получение негибридных белков с использованием промотора PL

3.9. Векторы с промоторами фага

ЗЛО. Получение гибридных белков с использованием промотора Р фага ^.

3.11. Плазмидные векторы, применявшиеся для клонирования фрагментов ДНК фага Т4.

3.12. Векторы на основе бактериофага . III

3.13. Общие представления о бактериофаге А. III

3.14. Размножение мутантов фага ^ в различных клетках-хозяевах

3.15. Регуляция развития бактериофага У.

3.16. Общие принципы конструирования векторов на основе фага

3.17. Выбор и использование векторов на основе бактериофага

- б

3.18. Векторы, полученные на основе фага ^ и использовавшиеся для клонирования фрагментов ДНК фага Т

3.19. Экспрессия генов прокариот в составе векторов,, полученных на основе бактериофага

ГЛАВА 4. Некоторые итоги структурно-функциональных исследований ДНК фага Т4 с помощью молекулярного клонирования in vitro

4.1. Особенности фрагментации ДНК Т-четных фагов с помощью эндонуклеаз рестрикции

4.2. Получение и характеристика мутантов фага Т4, содержащих Ц-ДНК.

4.3. Рестрикционное картирование ДНК фага Т

4.4. Клонирование фрагментов ДНК фага Т

4.5. Первичная структура некоторых областей ДНК фага

4.6. Функциональный анализ гибридных молекул ДНК, содержащих гены бактериофага Т

4.7. Использование рекомбинантных ДНК для изучения транскрипции фага Т4.

4.8. Использование банка клонированных генов для изучения репарации и репликации фага Т

4.9. Индукция мутаций в специфических генах бактериофага Т4 с использованием клонированных фрагментов и метода спасения маркера

4.10. Проблема клонирования генов фага Т4, продукты которых летальны для E.coli

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. Материалы и методы.

ГЛАВА б. Ацентрический гидродинамический разрыв и возможность выделения генетических групп сцепления фага Т

6.1. Исследование гидродинамического разрыва ДНК фагов Т5+ и Т5 st(o) до и после обработки полинуклеотидлигазой

6.2. Гидродинамический разрыв и биологическая активность ДНК фагов Т4, Т5 и Л

ГЛАВА 7. Ферментативный гидролиз ДНК Т-четных бактериофагов и молекулярное клонирование полученных фрагментов.

7.1. ecoRI - рестрикция ОМЦ ДНК фага Т4.

7.2. Рестрикция Ц-ДНК фага Т

7.3. EcoRV - рестрикция ДНК Т-четных бактериофагов.

7.4. Ограничение Т-четных фагов in vivo

7.5. Получение EcoRI - ЛТ4-рекомбинантов и их идентификация

7.6. Получение Hindlll - "ХТ4-рекомбинантов и их идентификация

7.7. Клонирование EcoRV - фрагментов ДНК фага

7.8. Исследование ДНК АТ4-рекомбинантов с ранними генами фага Т4. Рестрикционный анализ ДНК !ХТ4-рекомбинантов, содержащих гены фага Т4 62,

44, 45, 46 и

7.9. Определение ориентации встроенного фрагмента

ДНК фага Т4 в составе рекомбинанта ^596

7.10. Исследование рекомбинантного фага 9\596

7.11. Исследование ДНК АТ4-рекомбинантов с поздними генами фага Т

Т4-рекомбинанты, содержащие EcoRI - фрагменты ДНК фага Т4 с генами 50

7.12. /\Т4-рекомбинанты, содержащие Hindlll - фрагмент ДНК фага Т4 с генами 6-12.

7.13. АТ4-рекомбинант, содержащий EcoRI - фрагмент да фага Т4 с генами 25

7.14. ^Т4-рекомбинанты, содержащие Hindlll - фрагменты ДНК фага Т4 с генами 25

7.15. Локализация участков узнавания эндонуклеазы рестрикции Smal на генетической карте фага

7.16. Рестрикционный и функциональный анализ ДНК ^\Т4-рекомбинантов, несущих фрагменты ДНК из области генов 34

7.17. Конструирование векторных плазмид для клонирования фрагментов ДНК области генов 30

7.18. Клонирование фрагментов ДНК, содержащих ген дигидрофолатредуктазы в плазмидных векторах в E.coli и S.marcescens

7.19. Исследование экспрессии поздних генов фага Т в составе рекомбинантных ДНК

ГЛАВА 8. Исследование функционирования генов 46, 45, 44, 62,

42 в составе Т4-рекомбинантов

8.1. Анализ экспрессии генов фага Т4, клонированных в составе бактериофага методом электрофореза в полиакриламидном геле

8.2. Комплементация in vivo

8.3. Особенности внутриклеточного развития ЛТ4-рекомбинантных фагов и их генетическая характеристика

ГЛАВА 9. Конструирование плазмидного вектора, содержащего ранние промоторы с направленно регулируемой транскрипцией

9.1. Получение гибридной плазмиды piL203 и анализ функционирования ее генов

9.2. Идентификация фрагментов гибридных плазмид

9.3. Анализ синтеза репрессора с1857 в клетках, содержащих гибридные плазмиды plL

9.4. Генетический анализ регуляторной области фага лямбда, введенной в плазмиду

9.5. Доказательство наличия в гибридных плазмидах термочувствительной транскрипции с левого фагового прэмотора

9.6. Делеционные мутанты плазмид plL202 и plL203. •

ГЛАВА 10. Конструирование штамма-суперпродуцента генетически очищенной полинуклеотидлигазы фага Т

10.1. Клонирование гена полинуклеотидлигазы фага

Т4 в плазмиде plL

10.2. Конструирование рекомбинантной плазмидой ДНК PILL435 , кодирующей синтез ДНК-лигазы фага Т

10.3. Анализ генетических маркеров в штаммах E.coli, содержащих рекомбинантную плазмиду piLL435 • •

10.4. Синтез ДНК-лигазы фага Т4 в клетках E.coli

AAI25, содержащих плазмиду pilL

ГЛАВА II. Обсуждение результатов

11.1. Ферментативный гидролиз ДНК Т-четных бактериофагов и клонирование полученных фрагментов

11.2. Исследование ДНК Т4-рекомбинантов, содержащих ранние гены фага Т4.

11.3. Проблема выделения генов области 30-34 фага Т4. Клонирование и экспрессия гена дигидрофолат-редуктазы в E.coli и S.marcescens

11.4. Экспрессия генов базальной пластинки фага Т4 в составе рекомбинантных ДНК.

11.5. Анализ экспрессии генов фага Т4, клонированных в составе бактериофага ^Х методом электрофореза в полиакриламидном геле

11.6. Селективные преимущества векторных плазмид, содержащих область иммунитета фага А.

11.7. Акцепторная способность гибридных плазмид с областью иммунитета фага 'А

11.8. Редуцированные плазмиды piL233, 243, 242, их селективные и акцепторные характеристики

11.9. Регулируемая экспрессия генов, встроенных в piL-плазмиды, обеспечиваемая за счет функционирования промоторов вектора. Относительное расположение промоторов и сайтов интеграции

11.10. Регуляция экспрессии клонируемых фрагментов с использованием мутантов по генам негативных регуляторов транскрипции (его, cl)

11.11. Экспрессия гена ДНК-лигазы фага Т4 в составе плазшды plLL

11.12. Перспективы исследований по клонированию генов ферментов и сверхсинтезу кодируемых ими продуктов

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бактериофаг Т4: молекулярное клонирование генов и суперпродукция ферментов метаболизма ДНК"

Т-четные бактериофаги были описаны Б 1945 Г, (Demerec, Рало, 1945). С их помощью было доказано, что материальным носителем наследственности является ДНК (Hershey, Chase, 1952), обнаружена генетическая рекомбинация (DelbrCfck, Bailey ,1946), получены первые результаты по изучению тонкой структуры гена ( Benzer, 1961), показана коллинеарность гена и полипептидной цепи (stretton, Brenner, 1965).

При работе с Т-четными фагами был также открыт феномен модификации-рестрикции (Luria, Human, 1952), обнаружена мРНК и выяснены функции индуцированных фагами ферментов ( Cohen, 1968), установлен прерывистый характер репликации и открыты фрагменты Оказаки ( Okazaki et al.,1968).

Очень скоро исследователям стало ясно, что дальнейший научный прогресс невозможен без углубленной, детальной разработки одной или небольшого числа систем. В качестве такой системы был выбран бактериофаг Т4. Уже к 1963 г. была получена его насыщенная генетическая карта (Epstein et al.,1963).

В связи с наличием большого количества мутантов по существенным фаговым функциям биохимики предпочитали проводить свои работы именно с фагом Т4. Анализ функций на молекулярном уровне давал биохимикам основание предположить возможность получения новых типов мутантов, которые часто действительно изолировались и, естественно, снова подвергались биохимическому анализу. Становилось ясным, что картирование кавдого гена и определение функции его продукта - цель достижимая, несмотря на величину и сложность бактериофага Т4, хромосома которого только в 20 раз меньше хромосомы кишечной палочки»

Поскольку бактериофаг Т4 был одним из наиболее изученных в отношении регуляций активности генов, репликации, рекомбинации, репарации и морфогенеза, исследователи часто обращались к разработанным на нем моделям (Rabussay, Geiduschek, 1977).

Интенсивные исследования требовали существенной детализации моделей и их проверки с помощью методов биохимии и молекулярной биологии, поскольку они (модели) базировались преимущественно на генетических данных.

К 1975 г. выяснилось, что более детальное изучение основных генетических процессов с использованием интактного фага практически невозможно, так как, например, исследование экспрессии генов осложнено большим числом одновременно работающих цистронов, транскрипция которых часто осуществляется с нескольких промоторов* Аналогичные проблемы возникали цри изучении репликации, рекомбинации, репарации и морфогенеза.

Становилось очевидным, что необходимо использовать новые методы, позволяющие расчленять геном на отдельные элементы и изучать последние в простых, хорошо разработанных системах. Именно таким методом оказалось молекулярное клонирование in vitro« РазРаботка метода молекулярного клонирования в полном смысле слова революционизировала современную биологию. Оказалось возможным выделять гены как про-, так и эукариотного происхождения и изучать их структуру. Существенно упростилось также определение аминокислотной последовательности белков.

Благодаря разработке методов введения мутаций в клонированный фрагмент, была в принципе решена задача получения набора мутационных белков и изучения влияния изменений структуры на их функцию. Естественно, такой подход оказывался особенно плодотворным при наличии данных о первичной структуре.

Конструирование мутантов с использованием синтетических оли-годезоксирибонуклеотидов как сайт-специфических мутагенов открывает захватывающие перспективы. Особенно плодотворным представляется использование этого подхода в комплексе с клонированием генов из уже полученных и хорошо охарактеризованных мутантов. Именно их изучение позволит разработать рациональную стратегию получения новых форм in vitro. Ясно, что коллекция имеющихся мутантов бактериофага Т4 является поистине бесценной для такого рода исследований.

С помощью молекулярного клонирования может быть осуществлена генетическая очистка соответствующего белка, что имеет важные следствия, прежде всего для выделения ферментов и освобождения последних от интерферирующих активностей. Вопросы генетической очистки являются ключевыми для таких ферментов фага Т4, как ДНК-лигаза, РНК-лигаза, долинуклеотидкиназа, ДНК-полимераза, компоненты решш-кативного комплекса и т.д., широко использующихся при проведении молекулярно-биологкче ских исследований.

Наконец, выделенный ген можно ввести в специализированный многокопийный вектор под мощный промотор и тем самым в десятки-сотни раз увеличить производство соответствующего продукта, Важно, что это можно делать как в отношении интактного, так и мутационно измененного белка.

Наиболее эффективный путь создания специализированного вектора - введение в плазмидный вектор регуляторной области бактериофага А. Очевидными преимуществами этой системы являются, во-первых, наличие позитивных и негативных регуляторов транскрипции в геноме фага Л , их физическая близость к фаговым промоторам, во-вторых, многоступенчатость регуляции, в-третьих, мощность ранних фаговых промоторов достаточно высока- под их непосредственным контролем находится около трети фаговых генов (Hayes, 1979). Кроме того, эта система регуляции при всей ее сложности относится к наиболее изученным системам, имеется достаточно большое количество мутантов по отдельным генам, участвующим в регуляции транскрипции (Кемпбелл, 1975).

Применение рекомбинантных плазмид, содержащих область иммунитета фага А , позволяет решать как практические, так и теоретические задачи. Используя в векторах для регулируемой транскрипции мощные фаговые промоторы, особенно левый (PL ), можно создавать штаммы E.coli - суперпродуценты белковых веществ. Кроме того, такие плазмиды могут быть использованы для более глубокого изучения регуляции транскрипции как фаговых, так и бактериальных оперо-нов.

ДНК фага Т4 необычна в том отношении, что вместо остатка де-зоксицитидиловой кислоты содержит глюкозилированный оксиметилцити-дин. Такая двойная модификация делает ДНК фага Т4 необыкновенно устойчивой к действию нуклеаз, в том числе рестриктаз. Поэтому первой проблемой, с которой пришлось столкнуться, оказалась проблема фрагментации ДНК.

В разделе "Материалы и методы" сравнительно подробно описывается метод получения эндонуклеазы EcoRV из сконструированного нами штамма-суперпродуцента, содержащего рекомбинантную плазмиду plbRV It, Как будет ясно из дальнейшего изложения, применение высокоактивного препарата EcoRV сыграло важную роль в разработке методов фрагментации глюко зшшрованной и оксимет ил содержащей ДНК фага Т4.

В 70-е годы мы исследовали энзиматическую фрагментацию ДНК, модифицированной in vitro с помощью химических методов, а также гидродинамическую фрагментацию неканонической ДНК фага Т5, содержащей фиксированные однонитевые разрывы. Некоторые результаты работ по этой тематике представлены в вводной главе раздела "Экс-, периментальная часть" диссертации.

Основное внимание уделено данным по фрагментации, клонированию и структурно-функциональному анализу модифицированных и немо-дифицированных ДНК фага Т4. Приведены результаты изучения АТ4-рекомбинантов и гибридных плазмид, содержащих области генов 42 -46, 50 - 48 и 30 - 38,

Особое внимание уделено изучению экспрессии генов метаболизма ДНК (42, 62, 44 , 45, 46, frd) в составе А Т4-рекомбинантов и гибридных плазмид. Приводятся также данные по синтезу компонентов базальной пластинки клонами,содержащими рекомбинантные ДНК, в том числе клетками Serratia marcescens, несущими плазмиду с геном дигидрофолатредуктазы фага Т4. Далее приводятся данные по конструированию гибридных плазмид, с регуляторной областью бактериофага Л и созданию штамма-суперпродуцента генетически очищенной ДНК-лигазы фага Т4.