Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5(2.7.4.13): выделение и свойства белка, идентификация и клонирование гена

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5(2.7.4.13): выделение и свойства белка, идентификация и клонирование гена"

На правах рукописи

МЖУЛИНСКАЯ ГАЛИНА ВИКТОРОВНА

Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5 (2.7.4.13): выделение и свойства белка, идентификация и клонирование гена

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2004

Работа выполнена в Филиале Института биоорганической химии РАН

Научные руководители:

кандидат биологических наук Феофанов С.А.

кандидат биологических наук Зимин А.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Бурьянов Я.И.

доктор биологических наук Кулаковская Т.В.

Ведущая организация: Центр "Биоинженерия" РАН, г.Москва

Защита диссертации состоится «<&"» феб/ииьл.- 2004 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д002.038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ИБК РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН Автореферат разослан «¿У ъл^Лшиу - 2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д002.038.0\/Л I ^

кандидат биологических наук ^ ^ "молихина

¿w; - f

2 sane

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Фосфорилирование дезоксирибонуклеозидмонофосфатов до соответствующих дифосфатов является одним из ключевых этапов биосинтеза предшественников ДНК -

дезоксирибонуклеозидтрифосфатов - в клетках про- и эукариот. Эти реакции в живых клетках катализируют ферменты класса трансфераз -дезоксирибонуклеозидмонсфосфаткиназы (дНМФ-киназы), в качестве донора фосфорила использующие АТФ или дАТФ.

дНМФ+(д)АТФ О дНДФ+(д)АДФ Бактерии, дрожжи и высшие эукариоты, как правило, индуцируют нуклеозидмонофосфаткиназы, специфичные к азотистому основанию субстрата - аденилаткиназы, гуанилаткиназы и т.д.

Инфекция Esherichia coli колифагом сопровождается активной репликацией фаговой ДНК. Для обеспечения возросшей потребности в дНТФ бактериофаги индуцируют синтез менее специфичных к субстрату ферментов: так, дНМФ-киназы Т-четных колифагов (КФ 2.7.4.12) фосфорилируют три субстрата, в том числе гидроксиметилированный дЦМФ, характерный для ДНК этих фагов. Бактериофаг Т5 также кодирует дНМФ-киназу (КФ 2.7.4.13), продукт гена dnk. Этот фермент обладает уникально широкой специфичностью к субстрату и фосфорилирует все четыре монофосфата, соответствующие каноническим основаниям ДНК - дГМФ, дТМФ, дАМФ и дЦМФ. Ранее фермент был частично очищен (Bessman et all, 1964), что позволило авторам охарактеризовать ряд его биохимических свойств - субстратную специфичность, константы Михаэлиса для различных субстратов. При этом невысокая степень очистки не позволила определить молекулярную массу фермента и его удельную активность. Кроме того, отсутствовали данные о первичной структуре гена. Ранее неоднократно предпринимались попытки "шотган"-клонирования фрагментов генома бактериофага Т5, но они не дали результата применительно к ранней области генома, в которой находится ген dnk.

Биосинтез нуклеозидтрифосфатов является объектом постоянного внимания ученых, поскольку, помимо функции мономеров нуклеиновых кислот, эти макроэргические соединения играют большую роль в процессах синтеза и распада белков, липидов и углеводов, участвуют в регуляции метаболизма. Изучение ферментов биосинтеза дНТФ, в том числе и дНМФ-киназы, на классической модели бактериофага обеспечит глубокое понимание механизмов регуляции этого процесса в нормальных и инфицированных вирусом клетках. Кроме того, широкая специфичность фермента бактериофага Т5 - потенциальный источник знаний о структурных основах субстратной специфичности киназ. Особое значение приобретает исследование дНМФ-киназы бактериофага Т5 в связи с возможным применением такого фермента для энзиматического синтеза дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, широко используемых в научных

Цель 11 задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось структурно-функциональное и генетическое исследование дНМФ-киназы бактериофага Т5, а также выявление новых дНМФ-киназ широкой специфичности. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и очистить до гомогенного состояния дНМФ-киназу бактериофага Т5 из инфицированной фагом биомассы Е.соИ, определить молекулярную массу белка, изучить физико-химические свойства фермента.

2. Секвенировать область генома бактериофага Т5, содержащую ген Лпк, и идентифицировать ген, пользуясь данными о ферменте.

3. Клонировать ген йпк и экспрессировать его в Е.соИ, разработать простой способ очистки белка из клеток штамма-продуцента с высоким выходом.

4. Провести анализ компьютерных баз данных на основании полученной информации о структуре киназ с целью поиска гомологичных ферментов из других источников.

Научная новизна.

В настоящей работе впервые описан процесс очистки дНМФ-киназы бактериофага Т5 до гомогенного состояния из инфицированной фагом биомассы Е.соН и определены ее физико-химические свойства -молекулярная масса, изоэлектрическая точка, температурная стабильность, -а также аминокислотная последовательность И-конца белка. Выполнены секвенирование фрагмента области С генома бактериофага, содержащего ген <1пк, и его описание (включающее находящиеся в нем открытые рамки считывания, потенциальные промоторы и терминаторы транскрипции). Ген (1пк идентифицирован и клонирован в плазмиду с эффективным промотором. Рекомбинантная дНМФ-киназа очищена из клеток штамма-продуцента с высоким выходом двумя альтернативными способами. На основании полученной информации о первичной структуре дНМФ-киназы бактериофага Т5 сделано предположение о возможном пространственном строении белка. В рамках исследования фаговых дНМФ-киназ также выделен и клонирован ген новой дНМФ-киназы широкой специфичности, кодируемой бактериофагом фСЗ 1. Научно-практическая ценность.

Полученная в результате работы информация о новом гене расширяет представления о строении фаговых киназ и открывает новые возможности для изучения структуры ферментов данной группы и основ их субстратной специфичности. Определение первичной последовательности фрагмента ДНК бактериофага Т5 важно для дальнейшего исследования фагового генома. Кроме того, в работе показана принципиальная возможность использования дНМФ-киназы бактериофага Т5 в технологии энзиматического синтеза нуклеотидов, в том числе модифицированных, что представляет интерес для молекулярной биологии и медицины.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на конференциях «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001), "Биология - наука XXI века" (Пущино,

2001), на международной научной школе-конференции "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва,

2002), на VI чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино, 2002).

I Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 статьи, секвенированная последовательность помещена в GenBank (AY509815, AY 140897).

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на /// страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы ссылок) и приложения. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и содержит / таблиц.

МЕТОДЫ

Стандартные методы. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976). Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1968). Секвенирование N-конца белка осуществляли методом деградации по Эдману при помощи газофазного анализатора модели 477/120А ("Applied Biosystems", США). Молекулярную массу нативного фермента определяли методом аналитического равновесного ультрацентрифугирования (Bowen, 1971).

Бактериофаг для выделения геномной ДНК очищали равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия, как описано (Maniatis et al., 1982). Для гидролиза ДНК бактериофагов и плазмид использовали следующие эндонуклеазы рестрикции и ДНК-модифицирующие ферменты: Ассб51, ВатШ, Clal, Muni, NdeI, Ncol, щелочную фосфатазу E.coli, ДНК-лигазу фага Т4, термостабильную ДНК-полимеразу Taq фирмы "Fermentas" (Литва).

Гибридизацшо ДНК бактериофагов с зондом, получение компетентных клеток и трансформацию, получение бактериофагов в высоком титре и инфицированных фагом клеток E.coli, а также клонирование и скрининг колоний осуществляли, как описано (Maniatis et al., 1982).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе фирмы "Perkin Elmer" (США) в 25-50 мкл смеси, содержащей однократный t буфер для Taq ДНК-полимеразы, 1,5-2,5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого

дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 25 пмоль 5'- и З'-концевых праймеров, 0,01-1 мкг ДНК-матрицы, 1-2 ед. акт. ДНК-полимеразы Taq.

Нуклеотидную последовательность определяли методом Сэнгера (Sanger et al., 1977) с использованием [<х-33Р]дАТФ и [а-32Р]дАТФ. ПЦР

осуществляли при помощи кита для секвенирования FemtoMol DNA sequencing kit ("Promega", США), согласно протоколу фирмы. Пробы анализировали на 6-7% полиакриламидных гелях (550x280x0,2-0,4 мм), электрофорез вели, как описано (Краев, 1988), на приборе "Macrophore" (LKB, Швеция) при температуре 5б°С и напряжении электрического поля 1900 V.

Для иммобилизации белка использовали сорбент на основе пористого стекла Силохром С-80 (завод "Люминофор", г. Ставрополь), аминопропилированный (обменная емкость по NH2-rpynnaM 0,25-1,00 ммоль/г) и активированный глутаровым диальдегидом. 1

Методы очистки белка. Для приготовления клеточного экстракта клетки суспендировали в четырехкратном объеме буфера, содержащего 40 мМ трис-HCl (рН 8,0), 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ p-меркаптоэтанола, и разрушали ультразвуком. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием (10000 g, 30 мин). Нуклеиновые кислоты из экстракта удаляли осаждением стрептомицинсульфатом из расчета 1,5 мг/мл либо пропусканием через колонку с DEAE-Toyopearl 650 М. Ионообменную хроматографию проводили на приборе FPLC, используя колонки с MonoQ различного объема. Белки элюировали линейным градиентом NaCl. Аффинную хроматографию вели, используя 1,5-мл колонку с Toyopearl AF-Red 650М, адсорбированный белок смывали буфером, содержащим 5 мМ АТФ. Все процедуры проводили при 4°С.

Секвенирование фрагмента генома бактериофага Т5. На первом этапе для секвенирования использовали "составную матрицу". Для ее получения геномную ДНК бактериофага Т5 гидролизовали, выделяли КргА - Крп\ фрагмент 7 (Rhoades, 1982), близкий к картированному гену dnk. К липким концам фрагмента 7 лигировали синтетические олигонуклеотиды (5' GTACCACGGTCGGAGCCCCGGGCTC - олиго 1). Затем фрагмент амплифицировали с помощью олиго 2 (5' GAGCCCGGGGCTCCGACCGTG), комплементарного части олиго 1, и гидролизовали рестриктазой Muni. Один из полученных Kpnl-Munl фрагментов использовали в качестве матрицы для секвенирования. Секвенирующим праймером являлся олиго 3 (5' CGGGGCTCCGACCGTG), представляющий собой укороченный олиго 2. Такой подход позволил получить первую последовательность длиной 200 п.н. без предварительного клонирования выбранного фрагмента.

На втором этапе секвенирования в качестве матрицы использовали геномную ДНК фага Т5, а также ПЦР-фрагменты, полученные методом "прыжков по хромосоме" (Забаровский, 2001). Этот подход состоял в '

получении гидролизата ДНК фага выбранной эндонуклеазой, его кольцевании лигазой и последующем проведении инвертированной ПЦР ,

с расходящимися праймерами и кольцевыми фрагментами в роли матрицы. В качестве рестриктаз для "прыжка" использовались Асс651 и СМ.

Определение активности киназ. Активность дНМФ-киназ определяли спектрофотометрическим методом, основанным на сопряжении образования нуклеозиддифосфатов с окислением НАДН (Bessman, 1963). Для тестирования активности иммобшгазованного фермента пробы после реакции анализировали полуколичественно методом восходящей тонкослойной хроматографии на Kieselgel 60 F2J4 ("Merck", Германия) в системе диоксан:5М Ш4ОН:1М NH3COOH (43:54:3).

Программное обеспечение. Нуклеотидные последовательности анализировали при помощи программ Dm5 и Gene Runner v.3.0, подбор праймеров для клонирования осуществляли при помощи программы 01igo4. Для анализа аминокислотных последовательностей использовали программу BLAST Search (Altschul et al, 1997), а также Multalin 3.0 (Corpet, 1988). Пространственную структуру киназы бактериофага Т5 анализировали при помощи программы Cn3D Viewer.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение и свойства дНМФ-киназы бактериофага Т5 1.1. Очистка дНМФ-киназы из инфицированных фагом клеток E.coli Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5 (КФ 2.7.4.13) была очищена до гомогенного состояния из клеток Escherichia coli, инфицированных нелизирующим мутантом бактериофага Т5 ашН128а, при помощи фракционирования сульфатом аммония, двух анионообменных хроматографий при различных значениях pH и аффинной хроматографии на Toyopearl AF-Red. Результаты стандартного выделения приведены в таблице 1. Фермент был очищен в 1190 раз с выходом 55,6 %.

Таблица 1. Очистка дНМФ-киназы бактериофага Т5.

стадия очистки объем, мл общий белок, мг общая активность, Б удельная активность, РА,г степень очистки по fanKY выход, %

грубый экстракт 100 2400 330 0,14 - 100,0

фракционирование сульфатом аммония 240 1920 288 0,15 1,07 87

1я ионообменная хроматография Mono Q, рН=8.0 27 25 240 9,1 65 73

осаждение сульфатом аммония 14 21 235 11,2 80 71

2я ионообменная хроматография Mono Q, рН=7.5 4 7,4 219 29,6 210 66

аффинная хроматография 1 1,1 183,5 166,8 1190 55,6

1.2. Физико-химические свойства белка

Полученный препарат белка давал одну полосу на геле при электрофорезе в денатурирующих условиях, соответствующую белку размером около 29 кДа (см. рис. 1). Электрофорез в нативных условиях и аналитическое ультрацентрифугирование показали, что белок существует в растворе как мономер с молекулярной массой 29,14 ± 3,03 к Да. Гомогенный препарат фермента катализировал фосфорилирование четырех различных субстратов - дАМФ, дТМФ, дГМФ, дЦМФ, - с разной скоростью (табл. 2). Соотношение активностей соответствовало показанному предыдущими исследователями (ВевБшап е1 а1, 1964). Оптимум рН работы фермента лежит в области 7,0 - 7,5. Было показано, что фермент стабилен при 37°С, относительно стабилен при 42°С и быстро инактивируется при нагревании его свыше 47°С.

1

6 7

> «г/л

<'*>»% ОМШМ

■ ...и

"в Чтё

о СЛ

-94,0 кДа

-66,0 кДа

45,0 кДа

30,0 кДа

-20,1 кДа -14,2 к Да

Рис. 1. Денатурирующий электрофорез в

полиакриламидном геле проб после каждой стадии очистки. 1 - грубый экстракт, 2 -фракционирование сульфатом аммония, 3 - первая ионообменная хроматография, 4 - осаждение сульфатом аммония, 5 - вторая ионообменная хроматография,

6 - аффинная хроматография,

7 - маркеры молекулярной массы.

Таблица 2. Соотношение удельной активности дНМФ-киназы бактериофага Т5 на различных субстратах.

субстрат удельная активность, Е/мг относительная скорость реакции, %

дАМФ 232,0 100

дТМФ 166,8 71

дГМФ 153,6 65

дЦМФ 84,2 36

1.3. Определение N-концевой последовательности аминокислот

Для автоматического секвенирования по Эдману использовали 200 пМ гомогенного белка, перенесенного на Immobilon Р Transfer membrane (Millipore) методом блотгинга. В результате была определена 21-аминокислотная последовательность xVLVGLHGEAGSGKDGVAKLII. Подчеркнутый участок представляет собой консервативный сайт связывания АТФ, имеющий обобщенную структуру GxxGxGK (Ikeda et al, 1988).

2. Структурная организация фрагмента ранней области С генома бактериофага TS (13-19,5 % генома)

2.1. Анализ нуклеотидной последовательности

Для решения задачи поиска и идентификации гена dnk бактериофага Т5 был разработан подход к секвенированию, суть которого описана в методической части. Это позволило определить первичную структуру фрагмента кластера С ранней области генома бактериофага длиной 7729 п.н. (GenBank Ac. No. AY140897, AY509815).

Секвенированная область согласуется с рестрикционной картой (Rhoades, 1982) и охватывает от 13 до 19,5 % генома бактериофага. GC-содержание данной области составляет 36,6%, транскрипция в секвенированном участке осуществляется справа налево, что согласуется с транскрипционной картой бактериофага (McCorquodale, Warner, 1987). В секвенированном непрерывном фрагменте обнаружены 17 открытых рамок считывания (ОРС), пять предполагаемых промоторов бактериофага Т5 и два потенциальных р-независимых терминатора транскрипции. Нужно отметить тесное расположение и даже перекрывание генов, что характерно для фаговых геномов. Также был обнаружен один из пяти "ников" - одноцепочечных разрывов фосфодиэфирной связи, свойственных ДНК бактериофага Т5 (Rhoades, 1977). Основные элементы приведены в таблице 3.

2.2. Локализация открытых рамок считывания

Анализ ОРС, обнаруженных в секвенированной последовательности, осуществляли с помощью программ Blast, Multalin и Gene Runner. Было показано, что продукты трансляции lys и orfllc проявляют достоверное сходство с двумя белками, образующими систему лизиса многих фагов (Wang et al, 2000), - холином и эндолизином (лизоцимом). Интересно, что гены, кодирующие поздние функции, находятся в ранней области. При этом их общий промотор не обозначен на карте (McCorquodale, 1987), в то время как остальные четыре потенциальных промотора этой области можно сопоставить с промоторами карты Р5-Р8. Скорее всего, это означает, что промотор генов холина и лизоцима поздний, то есть геном бактериофага Т5 организован мозаично, чего ранее не предполагалось. Однако, возможно, холин и лизоцим - ранние белки, но существует механизм, регулирующий активность холина на стадиях развития фага, предшествующих лизису.

Таблица 3. Положение основных элементов структуры фрагмента области С генома бактериофага Т5, молекулярные массы (ММ) потенциальных продуктов, их возможные функции и сходство с последовательностями белков, депонированных в ОепВапк.

элемент позиция ММ белка (кДа) потенциальная функция сходство % идентичности GenBank accession No

старт стоп

Р5 400 341 промотор промотор P-D/E 33 бактериофага Т5 86% (52/60) Ml 1600.1

Р6 918 844 промотор промотор P-F 30 бактериофага Т5 100% (75/75) Ml 1604.1

orf4c 1528 1007 20,20 фосфоэстераза фосфогвдролаза (Corynebacterium glutamicum) 30% (53/173) NC003450

orßc 2391 1528 32,58 протеин-фосфатаза серин-треониновая протеин-фосфатаза бактериофага X 30% (80/265) NP040641.1

Р7 2713 2683 промотор

orf7c 3027 2737 11,09 тиоредоксин тиоредоксин (Pseudomonas syringae ) 39% (25/63) AA058669

Р8 3527 3458 промотор

Т1 4013 3963 терминатор

lys 4435 4022 15,25 лизоцим эндолизин (бактериофаг Р27) 41% (49/117) AJ298298

orfllc 5088 4432 24,85 холин холин (бактериофаг RB49) 30% (60/196) CAD48127

PN 5157 5088 промотор

Т2 5250 5200 терминатор

orfl2c 5844 5245 22,83 протеаза С1р протеиназа (Mesorhizobium loti) 30% (27/90) BAB54350

dnk 6609 5857 28,67 дНМФ-киназа

nick 6428 6427

orflôc >7734 7336 14,90 эндонуклеаза эндонуклеаза (бактериофаг ХрЮ) 34% (37/106) NP858997.1

Кроме того, был обнаружен ген тиоредоксина бактериофага Т5 (огрс), а также ген 0офс), продукт которого проявляет достоверное сходство с серин-треониновыми фосфатазами из разных организмов. Очевидна регуляторная функция этого белка - возможно, он обеспечивает временную модификацию белков клетки хозяина при переключении метаболизма на синтез белков бактериофага.

Следует упомянуть, что продукт orfl2c проявляет выраженное сходство с протеазной субъединицей АТФ-зависимой С1р протеазы. Такие белки бактерий и эукариот осуществляют энергозависимый протеолиз, участвуя в защите клеток от теплового шока и других стрессовых факторов (Maurizi et al., 1990, Fedhila et al., 2002, Nair et al., 2003). Последние открытия говорят о широкой распространенности белков этого класса в клетках про- и эукариот.

Наконец, секвенирование позволило идентифицировать ген длиной 750 п.н., размер продукта которого (28,668 кДа) и N-концевая аминокислотная последовательность практически совпали с определенными экспериментально значением молекулярной массы (29,14 кДа) и N-концом дНМФ-киназы бактериофага, соответственно. Это был искомый ген dnk.

2.3. Потенциальные регуляторные элементы

В секвенированной области были обнаружены 5 потенциальных промоторов транскрипции (рис. 2), обладающих характерными чертами промоторов бактериофага Т5 для РНК-полимеразы E.colt содержание АТ-пар 75-85%, консервативные области -10, -33, расстояние между ними 17 п.н., область -43 АТ-богата (Gentz and Bujard, 1985). Два промотора имеют характерный для ранних промоторов бактериофага Т5 консенсус +7 TTGA. Один из них представляет собой известный ранний промотор фага P-F 30 и сопоставим с промотором Р6 транскрипционной карты (McCorquodale, Warner, 1987). Другие (за исключением того, под контролем которого находятся гены лизоцима и холина) соответствуют Р5, Р7 и Р8 карты.

Во фрагменте также обнаружены два потенциальных р-независимых терминатора транскрипции, имеющих все характерные черты: палиндром и U-богатую область за ним (рис. 3).

-44 -33

Р5 AAAAATTCAG Р6 AAAGTTTTAT Р7 ТТТАТТТТАС Р8 AAAAAAGTAG

-10

ETGCTT

TTGCTT TTGACT pn TAAAAAcccAinsaaa

FAAGCCTTAAAATTCTG rTGCTA\AATGCTTAAGTTTCTG TCAGCTAAAAATTTTGG TTTAGCCCTAGTTATTA FTTTCCTCCAAAATTAG

+1 +7 №GTTCATAAATTAATGAGAGAGG

EATAAT Й

ГАТААТFACTTTATAAATTGATGAGAAGGA ГАТААТ YTTTGTATAGATTGATAGGAGGAT ГАТААТ VTATACATAAATTAGTTAAGAGAG rATAATCGTACTGGTTAGAGGAGGTTACAA

Рис. 2. Потенциальные промоторы секвенированного фрагмента области С генома бактериофага Т5. Цифрами указаны координаты нуклеотидов относительно точки начала транскрипции. Нумерация промоторов дана в соответствии с картой (McCorquodale, Warner, 1987). Pn - промотор, не обозначенный на карте. Консервативные области -33 и —10 заключены в блоки.

2.4. Идентификация гена Ivs

Функция продукта гена lys была подтверждена экспериментально посредством экспрессии гена в E.coli. Ген был клонирован в плазмиду

а

ТА A G

G С Т Т

А-Т Т-А

G=C G=C

G=C G=C

G=C G=C

C=G A-T

G=C C=G

CTTAG=CTTTTT C=G

GAATC=GAAAAA TAATTTTAAG"=CTTTTCTTTT

C=G ATTAAAATTC=GAAAAGAAAA

G=C XI G=C T2

C=G G=C

C=G T-A

C=G C=G

T-A C=G

С G C=G

AT A-T

A A T С T

Рис. 3. Предполагаемые терминаторы транскрипции бактериофага Т5 секвенированного фрагмента области С генома бактериофага Т5.

рЕТЗа по сайтам Ndel-ВатШ. Отобранные клоны были проверены посредством индукции синтеза белка при помощи ИПТГ (изопропил-1-тио-р-О-галактопиранозида) в клетках штамма E.coli BL21(DE3). Было показано, что рекомбинантные плазмиды инициировали синтез продукта ожидаемого размера - около 15 кДа. Лизоцим в клетках обоих клонов находился в растворимом состоянии. Анализ активности экстракта показал, что продукт гена lys способен лизировать извне клетки энтеробактерий и бацилл.

3. Функциональная характеристика гена dnk

3.1. Идентификация, клонирование и экспрессия в E.coli

С целью получения фермента в больших количествах для дальнейших исследований идентифицированный путем секвенирования ген dnk, кодирующий дНМФ-киназу бактериофага Т5, был клонирован в плазмиду рЕТЗа по сайтам Ndel-ВатШ. Индукцию синтеза белка рекомбинантной плазмидой pdnkT5 осуществляли в клетках штамма E.coli BL21(DE3) при помощи ИПТГ, а также в клетках штамма E.coli Х129, содержащих вспомогательную плазмиду pGPl-2, путем прогревания клеток при 42°С. На рисунке 4 показана динамика накопления фермента в клетках. Фермент в обоих случаях находился в клетке в растворимой форме. Несмотря на некоторую токсичность продукта для E.coli, уровень синтеза белка составлял в среднем 18% активного фермента по отношеншо к тотальному белку.

1 23 4 5 6 7 89

Рис. 4. Динамика накопления дНМФ-киназы бактериофага Т5 в клетках штамма-продуцента при индукции 1 мМ ИПТГ.

1 - клетки до индукции, 2-8 - клетки через 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 и 5 часов после индукции, соответственно. 9 - маркеры молекулярной массы (94, 66, 45,30,20,1, 14,2 кДа).

3.2. Очистка и свойства рекомбинантной дНМФ-киназы бактериофага Т5

Рекомбинантная дНМФ-киназа была очищена до гомогенности из клеток Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ), содержащих плазмиду рс!пкТ5, с использованием двух альтернативных подходов (рис. 5). Первый подход включал в качестве основного этапа ионообменную хроматографию на Мопо<3, второй - аффинную хроматографию на Тоуореаг1 AF-R.ec!. Оба способа очистки дали хорошие результаты и высокий выход (63-65%) (табл. 4). Белок был очищен в 5,34 раза, при этом из 67 мг общего белка было получено 8 мг гомогенного фермента. Рекомбинантная дНМФ-киназа имела удельную активность и специфичность, идентичную таковым нативного фермента (см. табл. 2). Таким образом, было показано генетически, что все четыре активности принадлежат одному белку.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

fkmd Г^с * :

^ та* jggf

^ Щ

^ Ьыим

Рис. 5. Гель-электрофорез фракций рекомбинантной дНМФ-киназы

бактериофага Т5 после различных стадий очистки.

1,9 - маркеры молекулярной массы, 2 -экстракт инфицированных

бактериофагом Т5 клеток Е. coli, 3 -экстракт клеток Е. coli BL21(DE3), содержащих плазмиду pdnkT5, 4 -пропускание через колонку с Toyopearl 650М, 5 - осаждение сульфатом аммония, 6 - ионообменная хроматография, 7 - аффинная хроматография, 8 - гомогенная дНМФ-киназа, очищенная из инфицированных клеток.

Таблица 4. Очистка рекомбинантной дНМФ-киназы бактериофага Т5. Стадии, обозначенные звездочкой, представляют собой два альтернативных подхода. Активность фермента измеряли с дГМФ в качестве субстрата.

стадия очистки объем, мл конц. белка, мг/мл объемная активность Е/мл удельная активность Е/мг | степень очистки i выход, %

грубый экстракт 18 3,75 109 29 1,00 100,0

пропускание через Тоуореаг1650М 36 1,50 54 36 1,24 99,0

осаждение сульфатом аммония 32 1,50 60 40 1,38 98,0

а) ионообменная хроматография * 4,2 1,0 155 155 5,35 66,4

б) аффинная хроматография * 5,0 0,8 124 155 5,35 63,2

3.3. Анализ потенциальной структуры фермента

Кристаллическая структура более специфичной к субстрату дНМФ-киназы бактериофага Т4 была получена с разрешением в 2,0 Á (Teplyakov et al., 1993). Как и все нуклеозидмонофосфаткиназы, белок состоит из 3 доменов - основного, или CORE, НМФ-связывающего и LID-домена. Пространственное наложение аминокислотной последовательности киназы бактериофага Т5 на структуру киназы фага Т4 программой Cn3D Viewer показало сходство обоих белков в области АТФ-связывающего сайта (Ф-петли), домена LID, а также дНМФ-связывающего кармана, включающего структуры основного домена и альфа-спираль ¿НМФ-связывающего домена, образованную аминокислотами 131-149. Отметим, что характерная для Ф-петли дНМФ-киназы бактериофага Т4 аспарагиновая кислота в положении 15, следующая за консервативным лизином Ф-петли, свойственна также белку Т5, и обобщенную структуру Ф-петли фаговых киназ можно представить как GxxxSGKD.

Можно заключить, что оба фермента имеют определенное сходство в строении активных центров, объясняемое их широкой специфичностью к субстрату. Отличия в поверхностных структурах белковой глобулы дНМФ-киназы бактериофага Т4 по сравнению с дНМФ-киназой фага Т5 могут быть обусловлены различным зарядом молекул, разной субъединичной структурой (киназа фага Т4 является димером), а также взаимодействием этого фермента с другими белками, входящими в состав дНТФ-синтезирующего комплекса бактериофага Т4.

3.4. Ферментативный синтез дезоксирибоаденозин-а-тиотрифосфата СдАТФаЗ!

Нуклеозид-а-тиотрифосфаты применяются в молекулярной биологии как субстраты для получения фосфотиоатных аналогов нуклеиновых кислот, защищенных от воздействия нуклеаз, а также для секвенирования и сайт-направленного мутагенеза (Eckstein, 1985). Альтернативный химическому синтезу путь получения дНТФаБ заключается в использовании ферментативного фосфорилирования. Основным преимуществом этого пути является возможность синтеза только одного, природного (Sp, или экзо), диастереомера дНТФаБ.

Нами была исследована принципиальная возможность фосфорилирования Sp-Rp смеси химически синтезированных тиофосфатов при помощи рекомбинантной дНМФ-киназы бактериофага Т5. Для этого был получен иммобилизованный ферментный препарат (ИФП) на основе рекомбинантного фермента и проверена его способность к синтезу дезоксирибонуклеозид-а-тиотрифосфата аденозина из дАМФаБ по сравнению с синтезом дАТФ из дАМФ в одних и тех же условиях. Вторая стадия фосфорилирования осуществлялась неспецифической бактериальной нуклеозиддифосфокиназой, содержащейся в ИФП.

Было показано, что дНМФ-киназа бактериофага Т5 фосфорилирует дАМФаЗ, но с меньшей скоростью, чем дАМФ. В случае контрольного ИФП (клетки E.coli) синтеза трифосфата не наблюдалось. Полнота превращения модифицированного нуклеотида в трифосфат составила около 50%. Очевидно, в реакцию вступает только один из смеси диастереомеров модифицированного нуклеотида. Полученные результаты показывают, что дНМФ-киназу бактериофага Т5 можно рассматривать как потенциальный инструмент для синтеза in vitro модифицированных нуклеотидов, многие из которых являются противоопухолевыми агентами.

4. Широкоспецифичные дНМФ-киназы других бактериофагов

4.1. Ген 52 бактериофага (рСЗ 1 кодирует дНМФ-киназу

С целью поиска новых широкоспецифичных монофосфаткиназ был исследован продукт гена 52 бактериофага стрептомицетов <рСЗ 1, проявляющий значительную гомологию с геном дНМФ-киназы бактериофага Т4 (Smith et al., 1992). Для этого ген 52 бактериофага <рС31 клонировали по сайтам Ncol-BamHl в плазмиду рЕТ15Ь. В результате экспрессии гена 52 имел место синтез белка с ожидаемой молекулярной массой (рис. 6). Анализ клеточного экстракта показал, что продуцируемый в больших количествах белок находится в основном в телах включения. Однако, при измерении активности киназы в осветленных клеточных экстрактах было обнаружено, что уровень этого фермента превышает активность клеточных дНМФ-киназ в сотни раз. Таким образом, было показано, что ген 52 бактериофага срСЗ 1 действительно кодирует дНМФ-киназу.

1 2

Рис. 6. Гель-электрофорез рекомбинантной дНМФ-киназы бактериофага <рС31.

1 - маркеры молекулярной массы, 2 - экстракт клеток штамма-продуцента после индукции

е

ввь

Таблица 5. Соотношение активностей рекомбинантных дНМФ-киназ

бактериофагов фС31 и Т5. За 100% принимали активность ферментов с дТМФ.

субстрат активность, Е/мл активность, %

<рС31 Т5 <рС31 Т5

ТМФ 3.2 32,2 100 100

дГМФ 3.5 36,2 ПО 112

дАМФ 2,6 48,3 81 150

дЦМФ 1,4 18,2 44 57

Рекомбинантный фермент проявлял активность на всех четырех канонических дезоксирибонуклеозидмонофосфатах, оказавшись, таким образом, второй дНМФ-киназой, обладающей столь широкой специфичностью к субстрату. При этом соотношение активностей дНМФ-киназы фС31 на разных субстратах отличалось от такового дНМФ-киназы бактериофага Т5 (табл. 5). Тог факт, что фермент удалось получить лишь в телах включения, можно объяснить токсичностью дНМФ-киназы для E.coli, связанной с нарушением оптимальных для функционирования клетки соотношений дНТФ.

Анализ аминокислотной и потенциальной пространственной структуры киназ бактериофагов Т4, Т5 и фСЗ 1 показал, что эволюционно эти ферменты более близки друг к другу, чем к соответствующим ферментам бактерий-хозяев. Видимо, высокая потребность в дНТФ явилась движущей силой, которая обеспечила конвергентную эволюцию этих широкоспецифичных фаговых белков.

выводы

1. Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа (дНМФ-киназа) бактериофага Т5 (КФ 2.7.4.13) впервые очищена до гомогенного состояния из клеток Е. соИ, инфицированных бактериофагом Т5, с выходом 55,6% и степенью очистки 1190.

2. Изучены физико-химические и каталитические свойства дНМФ-киназы бактериофага Т5. Молекулярная масса белка составляет 29,14 ± 3,03 к Да, оптимум рН работы фермента лежит в области 7,0—7,5. Определены удельная активность фермента и 20 аминокислот 1Я-конца белка.

3. Установлена первичная структура фрагмента ранней области С генома бактериофага Т5 длиной 7736 п.н., содержащая кодирующий дНМФ-киназу ген с1пк. В секвенированном непрерывном фрагменте обнаружены 16 открытых рамок считывания, в том числе гены холина, лизоцима, тиоредоксина, протеинфосфатазы.

4. Ген с1пк, кодирующий дНМФ-киназу, клонирован в Е.соИ и экспрессирован. Рекомбинантный белок очищен до гомогенного состояния двумя альтернативными способами. На основе имеющихся данных об аминокислотной последовательности сделаны предположения о пространственной структуре белка.

5. Показана практическая возможность использования иммобилизованного препарата дНМФ-киназы бактериофага Т5 в технологии синтеза четырех канонических дезоксирибонуклеозидмонофосфатов, а также дАМФаБ.

6. Установлено, что ген 52 бактериофага <рС31 стрептомицетов кодирует дНМФ-киназу широкой специфичности, катализирующую фосфорилирование дАМФ, дТМФ, дЦМФ и дГМФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Galina V. Mikoulinskaia, Sergei I. Gubanov, Andrei A. Zimin, Igor V. Kolesnikov, Sergei A. Feofanov, and Anatolii I, Miroshnikov. Purification and characterization of the deoxynucleoside monophosphate kinase of bacteriophage T5. Protein expression and purification, 2003,27, 195-201.

2. Антонов K.B., Есипов P.C., Гуревич А.И., Чувиковский Д.В., Микулинская Г.В., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Химический и химико-ферментативный синтез а-тиотрифосфагов нуклеозидов. Биоорганическая химия, 2003,6:616-622.

3. Galina V. Mikoulinskaia, Andrei A. Zimin, Sergei A. Feofanov, and ^ Anatolii I. Miroshnikov. Identification, cloning and expression of

bacteriophage T5 dnk gene encoding a broad specificity deoxyribonucleoside monophosphate kinase (EC 2.7.4.13). Protein expression and purification, 2004, 33,166-175.

4. Микулинская Г.В., Губанов С.И., Шульга-Морской С.В., Зимин A.A., Веревкина К.Н., Пятков К.И., Феофанов С.А. Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы бактериофагов. IV Пущинская конференция молодых ученых, Пущино, 1999, с. 26-27.

5. Микулинская Г.В., Губанов С.И., Веревкина К.Н., Феофанов С.А., Новожилова Ю.К., Зимин A.A. Цитозинсодержащие бактериофаги Т4-типа. Международная конференция "Проблемы современной микробиологии и биотехнологии", Ташкент, 27-29 октября, 1999, с. 43-44.

6. Микулинская Г.В., Губанов С.И., Зимин A.A., Колесников И.В., Феофанов С.А., Мирошников А.И. дНМФ-киназа бактериофага Т5: получение гомогенного фермента и изучение его физико-химических свойств. "Биология - наука XXI века", Пущино, 2001, с. 39.

7. Микулинская Г.В., Зимин A.A., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Ранняя область генома бактериофага Т5: структурные исследования. "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", 24-26 октября, Пущино, 2001, с. 81-82.

8. Микулинская Г.В., Зимин A.A., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Структурно-функциональное исследование фрагмента ранней области генома бактериофага Т5. V чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, 22-23 ноября, Пущино, 2001, с. 11.

9. Микулинская Г.В., Зимин A.A., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Кластер С ранней области генома бактериофага Т5: структурное исследование, клонирование и экспрессия генов. Международная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2002, с. 52.

10. Микулинская Г.В., Зимин A.A., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Кодируемые бактериофагами дНМФ-киназы: идентификация новых ферментов, клонирование генов и исследование свойств. VI Пущинская школа-конференция молодых ученых, 20-24 мая, Пущино, 2002, с. 281.

11. Микулинская Г.В., Зимин A.A., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Структурно-функциональное и эволюционное изучение дНМФ-киназ бактериофагов. VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, 25 ноября-2 декабря, Москва-Пущино, 2002, с. 91-92.

Принято к исполнению 21/01/2004 Исполнено 22/01/2004

Заказ № 18 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 vvww.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2007-4 17868

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Микулинская, Галина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Организация ферментов биосинтеза дНТФ.

1.1.1. Биосинтез дНТФ в клетках E.coli, инфицированных бактериофагом Т4.

1.1.2. дНТФ-синтезирующие комплексы (ДСК).

1.1.3. Связь ДСК с репликационным аппаратом.

1.1.4. Организация ферментов биосинтеза дНТФ в других организмах.

1.2. Особенности физиологии бактериофага Т5.

1.2.1. Общие черты бактериофага Т5.

1.2.2. Особенности структуры ДНК.

1.2.3. FST-механизм транспорта ДНК в клетку.

1.2.4. Регуляция транскрипции генов.

1.2.5. Разрушение ДНК клетки-хозяина.'.

1.2.6. Ферменты биосинтеза дНТФ.

1.2.7. Степень изученности генома бактериофага.

1.3. Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5.

1.3.1. Роль фермента в метаболизме.

1.3.2. Описание фермента и его свойства.

1.3.3. Пространственная структура нуклеозидмонофосфаткиназ.

1.3.4. Структурные основы субстратной специфичности.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Микробиологические методы.

2.1.1. Штаммы бактерий, бактериофаги, плазмиды и среды.

2.1.2. Получение бактериофага Т5 в высоком титре.

2.1.3. Получение биомассы клеток E.coli, инфицированных бактериофагом Т5.

2.2. Аналитические методы.

2.2.1. Метод определения белка.

2.2.2. Электрофорез белков в ПААГ.

2.2.3. Определение N-концевой последовательности аминокислот.

2.2.4. Изоэлектрофокусирование.

2.2.5. Определение молекулярной массы дНМФ-киназы бактериофага Т5.

2.3. Определение активности дНМФ-киназ.

2.3.1. Хроматографический метод. ф 2.3.2. Спектрофотометрический метод.

2.3.3. Тестирование активности методом тонкослойной хроматографии.

2.4. Методы очистки дНМФ-киназы бактериофага Т5.

2.4.1. Приготовление клеточного экстракта.

2.4.2. Удаление нуклеиновых кислот.

2.4.3. Фракционирование сульфатом аммония.

2.4.4. Ионообменная хроматография.

2.4.5. Аффинная хроматография. t 2.5. Методы молекулярной биологии.

2.5.1. Выделение ДНК.

2.5.2. Гидролиз ДНК.

2.5.3. Лигирование фрагментов ДНК.

2.5.4. Полимеразная цепная реакция.

2.5.5. Определение первичной последовательности ДНК.

2.5.6. Праймеры.

2.5.7. Получение компетентных клеток и их трансформация. i 2.5.8. Скрининг рекомбинантных клонов.

2.5.9. Экспрессия рекомбинантных плазмид. ч 2.5.10. Гибридизация ДНК бактериофагов с зондом.

2.6. Компьютерные методы.

2.6.1. Анализ нуклеотидных последовательностей.

2.6.2. Анализ аминокислотных последовательностей.

2.6.3. Определение потенциальной пространственной структуры белка.

2.7. Методы биотехнологии. v 2.7.1. Иммобилизация дНМФ-киназы бактериофага Т5.

2.7.2. Синтез дНТФ при помощи ИФП дНМФ-киназы бактериофага Т5.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение и очистка дНМФ-киназы бактериофага Т5.

3.1.1. Очистка дНМФ-киназы.

3.1.2. Физико-химические свойства белка.

3.1.3. Определение N-концевой последовательности аминокислот.

3.2. Структурная организация фрагмента ранней области С генома бактериофага Т5 (13-19,5% генома).

3.2.1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности.

3.2.2. Локализация генов и открытых рамок считывания и анализ потенциальных функций их продуктов.

3.2.3. Потенциальные регуляторные элементы.

3.2.4. Клонирование гена lys и его экспрессия.

3.2.5. Идентификация продукта гена lys - лизоцима.

3.3. Функциональная характеристика гена dnk.

3.3.1. Клонирование гена dnk и его экспрессия в E.coli.

3.3.2. Очистка рекомбинантной дНМФ-киназы и ее свойства.

3.3.3. Анализ потенциальной структуры фермента.

3.3.4. Ферментативный синтез дезоксирибоаденозин-а-тиотрифосфата (дАТФа8).

3.4. Исследование широкоспецифичных киназ других бактериофагов.

3.4.1. Ген 52 бактериофага срС31: клонирование и экспрессия в E.coli.

3.4.2. Ген 52 кодирует дНМФ-киназу широкой специфичности.

3.4.3. Бактериофаг Т4-типа RB49 также кодирует дНМФ-киназу.

3.4.4. Анализ строения фаговых киназ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5(2.7.4.13): выделение и свойства белка, идентификация и клонирование гена"

Нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК - являются незаменимыми компонентами живой клетки, выполняя функцию хранения, передачи и реализации генетической информации. Нарушение структуры и биосинтеза нуклеиновых кислот лежит в основе многих заболеваний наследственной и вирусной этиологии. Предшественники нуклеиновых кислот, нуклеозидтрифосфаты, как соединения, обладающие макроэргическими связями, помимо функции предшественников нуклеиновых кислот, играют большую роль в процессах синтеза и распада белков, липидов и углеводов, являются кофакторами целого ряда ферментов. Поддержание нормальных концентраций и соотношения дНТФ в клетках является одним из важных показателей гомеостаза. В связи с этим большое значение в биологии и медицине имеет исследование метаболизма предшественников нуклеиновых кислот.

Фосфорилирование дезоксирибонуклеозидмонофосфатов до соответствующих дифосфатов является одним из ключевых этапов синтеза предшественников ДНК -дезоксирибонуклеозидтрифосфатов - в клетках про- и эукариот. Эти реакции в живых клетках катализируют ферменты класса трансфераз - нуклеозидмонофосфаткиназы (НМФ-киназы), в качестве донора фосфорила использующие АТФ или дАТФ. дНМФ+(д)АТФ о дНДФ+(д)АДФ Бактерии, дрожжи и высшие эукариоты, как правило, индуцируют по крайней мере четыре нуклеозидмонофосфаткиназы, специфичные к азотистому основанию субстрата.

Инфекция Escherichia coli колифагом сопровождается активной репликацией фаговой ДНК. При этом количество вновь синтезированной ДНК превышает количество ДНК клетки-хозяина примерно в 4,5 раза (Crawford, 1959). Т-четные бактериофаги (Т2,Т4, Т6) используют для синтеза своей ДНК пул нуклеотидов клетки хозяина, и только часть их синтезируется de novo. Тем не менее, для обеспечения потребности в трифосфатах эти фаги индуцируют дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы (КФ 2.7.4.12), катализирующие фосфорилирование трех из четырех дезоксирибонуклеозидмонофосфатов, входящих в ДНК этих фагов (дТМФ, дГМФ, гм-дЦМФ).

Бактериофаг Т5 также кодирует дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназу (КФ 2.7.4.13), продукт гена dnk. Однако, в отличие от Т-четных фагов, бактериофаг Т5 использует для быстрой репликации своей ДНК только дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, синтезированные de novo. Цитозин в ДНК фага не гидроксиметилирован; вероятно, поэтому киназа бактериофага Т5 фосфорилирует все четьфе монофосфата, соответствующие каноническим основаниям ДНК. дНМФ-киназа бактериофага Т5 пока является единственным ферментом группы нуклеозидмонофосфаткиназ, обладающим такой широкой субстратной специфичностью.

Этот фермент представляет интерес для исследования механизмов биосинтеза предшественников ДНК в инфицированных бактериофагом клетках, регуляции этого процесса в зависимости от клеточных нужд и роли в нем фаговых и клеточных белков. Изучение структуры и функций ферментов, участвующих в биосинтезе предшественников ДНК, в том числе дНМФ-киназы бактериофага Т5, способно дать информацию, необходимую для понимания их биологической роли. Кроме того, широкая специфичность фермента бактериофага Т5 - потенциальный источник знаний о молекулярных основах взаимодействия белок-субстрат, ключ к пониманию структурных основ специфичности киназ. Особое значение приобретает исследование широкоспецифичной киназы бактериофага Т5 в связи с потенциальным использованием такого фермента в технологии энзиматического синтеза дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, которые в настоящее время широко используются в научных исследованиях и в медицине.

Целью настоящей работы явилось структурно-функциональное и генетическое исследование дНМФ-киназы бактериофага Т5, а также выявление новых дНМФ-киназ широкой специфичности.

К моменту начала работы данный фермент был частично очищен (Bessman et all, 1964), что позволило авторам определить ряд его биохимических свойств — относительную скорость реакции, субстратную специфичность, константы Михаэлиса для различных субстратов и константы ингибирования. При этом невысокая степень очистки не позволила авторам определить молекулярную массу фермента и его удельную активность. Кроме того, отсутствовали данные о первичной структуре гена. Ранее неоднократно предпринимались попытки "шотган"-клонирования фрагментов генома бактериофага Т5, но они не дали результата применительно к ранней области генома, в которой находится ген dnk.

Исходя из имеющихся данных, для достижения выбранной цели были поставлены следующие задачи:

1) Выделить и очистить до гомогенного состояния дНМФ-киназу бактериофага Т5 из инфицированной фагом биомассы E.coli, определить молекулярную массу белка, изучить физико-химические свойства фермента.

2) Секвенировать область генома бактериофага Т5, содержащую ген dnk, кодирующий фермент, и идентифицировать ген, пользуясь данными о ферменте.

3) Клонировать ген dnk и экспрессировать его в E.coli, разработать простой способ очистки целевого белка из клеток штамма-продуцента с высоким выходом.

4) Провести анализ компьютерных баз данных на основании полученной информации о структуре киназ с целью поиска гомологичных ферментов из других источников.

В настоящей работе впервые описан процесс очистки дНМФ-киназы бактериофага Т5 до гомогенного состояния из инфицированной фагом биомассы E.coli и определены ее ранее неизвестные физико-химические свойства - молекулярная масса, изоэлектрическая точка, температурная стабильность, - а также аминокислотная последовательность N-конца белка. Выполнены секвенирование фрагмента области С генома бактериофага, содержащего ген dnk, и его описание (включающее открытые рамки считывания, потенциальные промоторы и терминаторы транскрипции). Ген dnk идентифицирован и клонирован в плазмиду с эффективным промотором. Рекомбинантная дНМФ-киназа бактериофага Т5 очищена из клеток штамма-продуцента с высоким выходом двумя альтернативными способами. На основании полученной информации о первичной структуре дНМФ-киназы Т5 сделано предположение о возможной пространственной структуре белка. В рамках исследования фаговых дНМФ-киназ выделен и клонирован ген новой дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы широкой специфичности, кодируемой бактериофагом фС31.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Микулинская, Галина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа (дНМФ-киназа) бактериофага Т5 (КФ 2.7.4.13) впервые очищена до гомогенного состояния из клеток E.coli, инфицированных бактериофагом Т5, с выходом 55,6% и степенью очистки 1190.

2. Изучены физико-химические и каталитические свойства дНМФ-киназы бактериофага Т5. Молекулярная масса белка составляет 29,14 ± 3,03 кДа, оптимум рН работы фермента лежит в области 7,0—7,5. Определены удельная активность фермента и 20 аминокислот N-конца белка.

3. Установлена первичная структура фрагмента ранней области С генома бактериофага ■ Т5 длиной 7736 п.н., содержащая кодирующий дНМФ-киназу ген dnk.

В секвенированном непрерывном фрагменте обнаружены 16 открытых рамок считывания, в том числе гены холина, лизоцима, тиоредоксина, протеинфосфатазы.

4. Ген dnk, кодирующий дНМФ-киназу, клонирован в E.coli и экспрессирован. Рекомбинантный белок очищен до гомогенного состояния двумя альтернативными способами. На основе имеющихся данных об аминокислотной последовательности сделаны предположения о пространственной структуре белка.

5. Показана практическая возможность использования иммобилизованного препарата j дНМФ-киназы бактериофага Т5 в технологии фосфорилирования четырех канонических дезоксирибонуклеозидмонофосфатов, а также дАМФаБ.

6. Установлено, что ген 52 бактериофага срСЗ 1 стрептомицетов кодирует дНМФ-киназу широкой специфичности, катализирующую фосфорилирование дАМФ, дТМФ, дЦМФ идГМФ.

С чувством глубокой признательности выражаю благодарность руководителям моей работы за помощь в работе и преподанные уроки. Искренне благодарна сотруднику ФИБХ РАН Зинченко Дмитрию Валерьевичу, бывшему сотруднику ИБ РАН Колесникову Игорю Валентиновичу, сотруднику ИБК РАН Фунтикову Вячеславу Алексеевичу за помощь в организации и проведении некоторых экспериментов. Большое спасибо Ксензенко Владимиру Николаевичу за помощь, полезные советы и обсуждение моей работы. Благодарю сотрудника ИБФМ РАН Шляпникова Михаила Григорьевича и сотрудника ИБХ РАН Каюшина Алексея Львовича за синтез олигонуклеотидов. Сердечно благодарна всем настоящим и бывшим сотрудникам Группы технологии синтеза нуклеиновых кислот и их компонентов ФИБХ РАН за помощь в работе и чуткое отношение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Микулинская, Галина Викторовна, Пущино

1. Забаровский, Е.Р.(2001). Альтернативные подходы к картированию и секвенированию генома. Мол биол 35:224-234.

2. Калиман, А.В., Крутилина, А.И., Крюков, В.М. (1987). Структура двух промоторов и терминатора транскрипции из области ранних генов Д10-Д15 бактериофага Т5. Мол Генет Микробиол Вирусол 10:14-19.

3. Краев А.С. (1988). Простая система клонирования в фаге М13 и секвенирования ДНК с терминаторами. Мол Биол 22:1164-1197.

4. Aduma, P.J., Gupta, S.V., Stuart, A.L., Tourigny, G. (1991). Deoxyribonucleoside triphosphate pools of herpes simplex virus infected cells: the influence of selective antiherpes agents and the role of the deaminase pathway. Biochem Cell Biol 69:409-414.

5. Angus, S.P., Wheeler, L.J., Ranmal, S.A., Zhang, X., Markey, M.P., Mathews, C.K., Knudsen, E.S. (2002). Retinoblastoma tumor suppressor targets dNTP metabolism to regulate DNA replication. J Biol Chem 277:44376-44384.

6. Bebenek, K., Roberts, J.D., Kunkel, T.A. (1992). The effects of dNTP pool imbalances on frameshift fidelity during DNA replication. J Biol Chem 267:3589-3596.

7. Bello L.J., Bessman M.J. (1963). The enzymology of virus-infected bacteria IV. Purification and properties of the deoxynucleotide kinase induced by bacteriophage T2. J Biol Chem 238:17771787.

8. Bello, L.J., Bessman, M.J. (1963). The enzymology of virus-infected bacteria.V.

9. Phosphorylation of hydroxymethyldeoxycytidine diphosphate and deoxythymidine diphosphatein normal and bacteriophage-infected E.coli. Biochim Biophys Acta 72:647-650.

10. Berget, S.M., Mozer, T.J., Warner, H.R. (1976). Early events after infection of Escherichia coliby bacteriophage T5. II. Control of the bacteriophage-induced 5'-nucleotidase activity. J Virol18:71-79.

11. Berget, S.M., Warner, H.R., McCorquodale, D.J. (1974). Isolation and partial characterization of bacteriophage T5 mutants deficient in the ability to induce deoxynucleoside monophosphate kinase. J Virol 14:78-85.

12. Bessman, M.J. (1963). Deoxynucleoside monophosphate kinases, in "Methods in Enzymology," vol.VI, pp. 166-177, Academic Press, New York and London.

13. Brunei F., Thi V.H., Pilaete M.F., Davison J. (1983). Transcription regulatory elements in the late region of bacteriophage T5 DNA. Nucleic Acid Res 11:7649-7658.

14. Brush, G.S., Bessman, M.J. (1993). Chemical modification of bacteriophage T4 deoxynucleotide kinase. Evidence of a single catalytic region. J Biol Chem 268:1603-1609.

15. Chen, M.X., McPartlin, A.E., Brown, L., Chen, Y.H., Barker, H.M., Cohen, P.T.(1994). A novel human protein serine/threonine phosphatase, which possesses four tetratricopeptide repeat motifs and localizes to the nucleus. EMBO J 13:4278-4290.

16. Cook, K.S., Seasholtz, A.F. (1982). Identification of some bacteriophage T4 prereplicative proteins on two-dimensional gel patterns. J Virol 42:767-772.

17. Corpet F. (1988). Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res 16:10881-10890.

18. Cory, J.G., Carter, G.L. (1985). Drug action on ribonucleotide reductase. Adv Enzyme Regul 24:385-401.

19. Crawford L.V. (1959). Nucleic acid methabolism in Escherichia coli infected with phage T5. Virology 7:359-374.

20. Decker, K., Krauel, V., Meesmann, A., Heller, K.J. (1994). Lytic conversion of Escherichia coli by bacteriophage T5: blocking of the FhuA receptor protein by a lipoprotein expressed early during infection. Mol Microbiol 12:321-332.

21. Desai S.M., Vaughan J., Weiss S.B. (1986). Identification and location of nine T5 bacteriophagetRNA genes by DNA sequence analysis. Nucleic Acid Res 14:4197-4120.

22. Desplats, C., Dez, C., Tetart, F., Eleaume, H., Krisch, H.M. (2002) Snapshot of the genome ofthe pseudo-T-even bacteriophage RB49. J Bacteriol 184 (10), 2789-2804.

23. Dreusicke, D., Karplus, P. A., Schulz, G. E. (1988). Refined structure porcine cytosolicadenylate kinase at 2.1 A resolution. J Mol Biol 199:359-371.

24. Duckworth, D.H., Bessman, M.J. (1967). The enzymology virus-infected bacteria. X. A biochemical-genetic study of the deoxynucleotide kinase induced by wild-type and amber mutants of phage T4. J Biol Chem 242:2877-2885.

25. Fricke, J., J. Neuhard, R. A. Kelln, S. Pedersen. (1995). The cmk gene encoding cytidine monophosphate kinase is located in the rpsA operon and is required for normal replication rate in Escherichia coll J Bacteriol 177:517-523.

26. Fukami-Kobayashi, K., Nosaka, M., Nakazawa, A., Go, M. (1996). Ancient divergence of long and short isoforms of adenylate kinase: molecular evolution of the nucleoside monophosphate kinase family. FEBS Lett 385:214-220.

27. Furukawa, H., Kuroiwa, Т., Mizushima, S. (1983). DNA injection during bacteriophage T4infection of Escherichia coli. J Bacteriol 154:938-945.

28. Gan, Z.R. (1991). Yeast thioredoxin genes. J Biol Chem 266:1692-1696.

29. Gentz, R., Bujard, H. (1985). Promoters recognized by Escherichia coli RNA polymeraseselected by function: highly efficient promoters from bacteriophage T5. J Bacteriol 164:70-77.

30. Goelz, S. E., Cronan, J. E. (1982). Adenylate kinase of Escherichia coli: evidence for afunctional interaction in phospholipid synthesis. Biochemistry 21:189-195.

31. Greenberg, G.R., He, P., Hilfinger, J., Tseng, M.-J. (1994). Deoxyribonucleoside triphosphatesynthesis and phage T4 DNA replication. In: Molecular Biology of Bacteriophage Т4/ ed. in chif

32. J.D.Karam; ed., J.W.Drake, K.N.Kreuzer, G.Mosig, D.H.Hall, F.E.Eiserling, L.W.Black,

33. E.K.Spicer, E.Kutter, K.Carlson, E.S.Miller. ASM press, Washington, DC, p. 14-27.

34. Griffig, J., Koob, R., Blakley, R.L. (1989). Mechanisms of inhibition of DNA synthesis by 2chlorodeoxyadenosine in human lymphoblastic cells. Cancer Res 49:6923-6928.

35. Griffith, J.P., Kim, J.L., Kim, E.E., Sintchak, M.D., Thomson, J.A., Fitzgibbon, M.J., Fleming,

36. M.A., Caron, P.R., Hsiao, K., Navia, M.A.(1995). X-ray structure of calcineurin inhibited by theimmunophilin-immunosuppressant FKBP12-FK506 complex. Cell 82:507-522.

37. Hendricks, S.P., and Mathews, C.K. (1997). Regulation of T4 phage aerobic ribonucleotidereductase. J Biol Chem 272:2861-2865.

38. Hendrix, R.W., Smith, M. С. M., Bums, R.N., Ford, M. E., Hatfull, G. F. (1999). Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: All the world's a phage. Proc Natl Acad Sci USA 96:2192-2197.

39. Heusterspreute, M., Ha-Thi, V., Tournis-Gamble, S., Davison, J. (1987). The first-step transfer-DNA injection-stop signal of bacteriophage T5. Gene 52:155-164.

40. Johnston, J.V., Nichols, B.P., Donelson, J.E. (1977). Distribution of "minor" nicks in bacteriophage T5 DNA. J Virol 22:510-519.

41. Kalasauskaite, E.V., Kadisaite, D.L., Daugelavicius, R.J., Grinius, L.L., Jasaitis, A.A. (1983). Studies on energy supply for genetic processes. Requirement for membrane potential in Escherichia coli infection by phage T4. Eur J Biochem 130:123-130.

42. Kaliman, A.V. (1996). Identification of the bacteriophage T5 dUTPase by protein sequence comparisons. DNA Seq 6:347-355.

43. Kaliman, A.V., Kryukov, V.M., Bayev, A.A. (1988). The nucleotide sequence of the region ofbacteriophage T5 early genes D10-D15. Nucleic Acids Res 16:10353-10354.

44. Kaneko, S., Miyazaki, Y., Yasuda, Т., Shishido, K. (1998). Cloning, sequence analysis andexpression of the basidiomycete Lentinus edodes gene uckl, encoding UMP-CMP kinase, thehomologue of Saccharomyces cerevisae URA6 gene. Gene 211:259-266.

45. Keweloh, H.W., Bakker, E.P. (1984). Increased permeability and subsequent resealing of thehost cell membrane early after infection of Escherichia coli with bacteriophage Tl. J Bacteriol160:354-359.

46. Knopf, K., Bujard, H. (1975). Structure and function of the genome of coliphage T5. Transcription in vitro of the "nicked" and "nick-free" T5+ DNA. Eur J Biochem 53:371-385.

47. Maltouf, F.A., Labedan, B. (1983). Host cell metabolic energy is not required for injection of bacteriophage T5 DNA. J Bacteriol 153:124-133.

48. Mathews, C.K. (1991). Metabolite channeling in deoxyribonucleotide and DNA biosynthesis. J Theor Biol 152:25-28.

49. Mathews, C.K., Moen, L.K., Wang, Y., Sargent, R.G. (1988). Intracellular organization of DNA precursor biosynthesis enzymes. TIBS 13:394-397.

50. Mathews, C.K., Sinha, N.K. (1982). Are DNA precursors concentrated at replication sites? Proc Natl Acad Sci USA 79:302-306.

51. Mathews, C.K., Slabaugh, M.B. (1986). Eucariotic DNA metabolism. Are deoxyribonucleotides channeled to replication sites? Exp Cell Res 162:285-295.

52. Maurizi, M.R., Clark, W.P., Kim, S.H., Gottesman, S. (1990). Clp P represents a unique family of serine proteases. J Biol Chem 265:12546-12552.

53. McCorquodale, D.J., Shaw, A.R., Shaw, P.K., Chinnadurai, G. (1976). Pre-early polypeptides of bacteriophages T5 and BF23. J Virol 22:480-488.

54. McCorquodale D.J., Warner H.R. (1988). Bacteriophage T5 and related phages. In:Bacteriophages, p.439-475.

55. McGaughey, K.M., Wheeler, L.J., Moore, J.T., Maley, G.F., Maley, F., Mathews, C.K. (1996). Protein-protein interaction involving T4 phage-coded deoxycytidylate deaminase and thymidylate synthase. J Biol Chem 271:23037-23042.

56. Mozer, T.J., Thompson, R.B., Berget, S.M., Warner, H.R. (1977). Isolation and characterization of a bacteriophage T5 mutant deficient in deoxynucleoside 5'-monophosphatase activity. J Virol 24:642-650.

57. Moyer, R.W., Rothe, C.T. (1977). Role of the T5 gene D15 nuclease in the generation of nicked bacteriophage T5 DNA. J Virol 24:177-193.

58. Muller, C. W., Schulz, G. E. (1992). Structure of the complex between adenylate kinase from Escherichia coli and the inhibitor Ap5 A refined at 1.9 A resolution. A model for a catalytic transition state. J Mol Biol 224:159-177.

59. Nichols, B.P., Donelson, J.E. (1977). Mapping and cloning of Eco Rl-fragments of bacteriophage T5+ DNA. Nucleic Acids Res 4:3715-3726.

60. Okajima, Т., Goto, S., Tanizawa, K., Tagaya, M., Fukui, Т., Shimofuruya, H., Suzuki, J. (1995). Cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli of cDNA encoding porcine brain UMP-CMP kinase. Biochem. J. 117:980-986.

61. Okajima, Т., Fukamizo, Т., Goto, S., Fukui, Т., Tanizawa, K. (1998). Exchange of nucleoside monophosphate-binding domains in adenylate kinase and UMP/CMP kinase. J Biochem (Tokyo) 124:359-367.

62. Oldmixon, E., Braun, V. (1978). Changes in fluorescence of 8-anilino-l-naphthalene sulfonate after bacteriophage T5 infection of Escherichia coli. Initial fluorescence rise coincides with onset of rubidium efflux. Biochim Biophys Acta 506:111-118.

63. Oliver, F.J., Collins, M.K., Lopez R., A. (1996). dNTP pools imbalance as a signal to initiate apoptosis. Experientia 52:995-1000.

64. Ostermann, N., Segura-Pena, D., Meiei;, C., Veit, Т., Monneijahn, C., Konrad, M., Lavie, A.2003). Structures of human thymidylate kinase in complex with prodrugs: implications for thestructure-based design of novel compounds. Biochemistry 42:2568-2577.

65. Pieroni, L., Bouille, P., Auclair, C., Guillosson, J.J., Nafziger, J. (1999). Early steps ofreplication of moloney murine leukemia virus in resting lymphocytes. Virology 262:408-415.

66. Pinedo, H.M., Peters, G.F. (1988). Fluorouracil: biochemistry and pharmacology. J Clin Oncol6:1653-1664.

67. Ponta, H., Altendorf, K.H., Schweiger, M.,Kaufmann, H.M., Yeh, P.M.L., Herrlich, P. (1976). E.coli membranes become permeable to ions following T7-virus-infection. Mol Gen Genet 149:145-150.

68. Reddy, G.P., Mathews, C.K. (1978). Functional compartmentation of DNA precursors in T4 phage-infected bacteria. J Biol Chem 253:3461-3467.

69. Rhoades, M. (1982). New physical map of bacteriophage T5 DNA. J Virol 43:566-570. Rhoades, M. (1986). Interruption-deficient mutants of bacteriophage T5: analysis of single-site mutants. J Virol 59:203-209.

70. Rikhter, V.A., Rabinov, I.V., Kuznetsov, S.A., Pavlii, T.B., Skoblov, I.u.S. (1988). Isolation and various properties of nucleoside monophosphate kinases from Escherichia coli. Prikl Biokhim Mikrobiol 24:310-318.

71. Sanger, F., Niclein, S., Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467.

72. Schweitzer, B.I., Dicker, A.P., Bertino, J.R. (1990). Dihydrofolate reductase as a therapeutic target. FASEB J 4:2441-2452.

73. Sekulic, N., Shuvalova, L., Spangenberg, O., Konrad, M., Lavie, A. (2002). Structural characterization of the closed conformation of mouse guanylate kinase. J Biol Chem 277:3023630243.

74. Shewach, D.S., and Lawrence, T.S. (1996). Gemcitabine and radiosensitization in human tumor cells. Invest New Drugs 14:257-263.

75. Silins, G.U., Blakeley, R.L., Riddles, P.W. (1996). Characterization of genes encoding a nucleoside monophosphate kinase and a L35 ribosomal protein from Babesia bovis. Mol Biochem Parasitol 76:231-244.

76. Smith, M.C.M., Ingham, C.J., Owen, C.E., Wood, N.T. (1992). Gene expression in the Streptomyces temperate phage (pC31. Gene 115:43-48.

77. Solow, В., Young, J.C., Kennelly, P.J. (1997). Gene cloning and expression and characterization of a toxin-sensitive protein phosphatase from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila TM-1. J Bacteriol 179:5072-5075.

78. Szabo, C., Dharmgrongartama, В., Moyer, R.W. (1975). The regulation of transcription in bacteriophage T5-infected Escherichia coli. Biochemistry 14:989-997.

79. Tomich, P.K., Chiu, C.S., Wovcha, M.G., Greenberg, G.R. (1974). Evidence for a complex regulating the in vivo activities of early enzymes induced by bacteriophage T4. J Biol Chem 249:7613-7622.

80. Van Rompay, A.R., Johansson, M., Karlsson, A. (2000). Phosphorylation of nucleosides and nucleoside analogs by mammalian nucleoside monophosphate kinases. J Pharmacol Ther 87:189-98.

81. Von Gabain, A., Hayward, G.S., Bujard, H. (1976). Physical mapping of the Hindlll, EcoRI, Sal and Sma restriction endonuclease cleavage fragments from bacteriophage T5 DNA. Mol Gen Genet 143:279-290.

82. Wagner, E.F., Ponta, H., Schweiger, M. (1980). Development of Escherichia coli virus Tl. The role of the proton-motive force. J Biol Chem 255:534-539.

83. Warner, H.R., Drong, R.F., Berget, S.M. (1975). Early events after infection of Escherichia coli by bacteriophage T5. Induction of a 5-nucleotidase activity and excretion of free bases. J Virol 15:273-280.

84. Zhang, X., Lu, Q., Inouye, M., Mathews, C.K. (1996). Effect of T4 phage infection and anaerobiosis upon nucleotide pools and mutagenesis in nucleoside diphosphokinase-defective Escherichia coli strains. J Bact 178:4115-4121.

85. Zhang, X„ Mathews, C.K. (1995). Natural DNA precursor pool asymmetry and base sequence context as determinants of replication fidelity. J Biol Chem 270:8401-8404.