Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномика и протеомика литических бактериофагов Pseudomonas aeruginosa

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Геномика и протеомика литических бактериофагов Pseudomonas aeruginosa"

На правах рукописи

МИРОШНИКОВ КОНСТАНТИН АНАТОЛЬЕВИЧ

Геномика и протеомика литических бактериофагов Рьеийотопаь aeruginosa

03.01.04 - биохимия 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2013

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Месянжинов Вадим Викторович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор

(Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта РАН) Кочетков Сергей Николаевич

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор

(Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) Габибов Александр Габибович

доктор биологических наук, профессор (кафедра химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова) Ефременко Елена Николаевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится « 25 » июня 2013 года в 1500 ч. на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « 24 » мая 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынекая И.К.

РОССИЙСКАЯ

■ ch;v/'apc г и L: иная

БИЬЛИО'1 ЕКА 2013

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Вирусы, инфицирующие бактерии (бактериофаги, или фаги), чрезвычайно широко представлены в биосфере и оказывают критическое регуляторное воздействие на экологию и эволюцию прокариот, а зачастую, и биоценозов в целом. В последние годы мировым научным сообществом было приложено много усилий в области исследования бактериофагов на уровне их геномов и протеомов. Геномика бактериофагов служит практически неисчерпаемым резервуаром информации для изучения эволюции, генетической изменчивости и популяционной динамики как собственно фагов, так и прокариотических организмов-хозяев Существует общемировая тенденция подробного изучения молекулярных взаимодействий и регуляции процессов в геномах и протеомах высших организмов (в особенности человека) и симбиотичсских популяций («постгеномика»). В этом контексте бактериофаги со сравнительно несложно организованным генетическим аппаратом становятся удобным модельным объектом для выявления закономерностей строения генома, переноса генетического материала, регулирования транскрипции генов, пост-трансляционной модификации белков, их укладки в биологически активную третичную структуру (фолдинга), формирования многобелковых комплексов и множества других аспектов современной биохимии.

Интерес к изучению бактериофагов поддерживается, помимо фундаментальных аспектов, возможностью их применения в качестве медицинских препаратов. В последние 20 лет стремительный рост числа и разнообразия штаммов патогенных микроорганизмов, устойчивых к низкомолекулярным антибиотикам, стимулировал поиск альтернативных методов лечения и контроля бактериальных инфекций. Для максимально эффективного и научно обоснованного применения бактериофагов в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и аквакультурах требуется глубокое их изучение и систематизация на генном уровне, а также высокая степень очистки применяемых фаговых препаратов. Достаточно перспективным представляется, кроме того, применение энзибиотиков - отдельных белков фагового происхождения.

В 2000 году лаборатория молекулярной биоинженерии института биоорганической химии РАН в сотрудничестве с лабораторией генных технологий K.U.Leuven (Бельгия) и лабораторией генетики бактериофагов (НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов) инициировала комплексную программу определения и анализа геномов фагов, инфицирующих грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa. Эти бактерии считаются умеренно патогенными, тем не менее, синегнойные внутрибольничные инфекции, провоцируемые ими, вызывают серьезное беспокойство у врачей в силу антибиотикоустойчивости псевдомонад. На момент старта исследовательского проекта была накоплена достаточно широкая описательная база о разновидностях бактериофагов Р. aeruginosa, их морфологическом разнообразии и некоторых аспектах взаимодействия с клетками-хозяевами. Эмпирически были созданы коллекции псевдомонадных фагов, в частности, наборы для тнпирования штаммов Р. aeruginosa по их фагоустойчивости («эталонная коллекция Линдберга»), Однако, несмотря на существенный прогресс в области геномного секвенирования к началу 2000-х годов, бактериофаги Р. aeruginosa оставались малоисследованными на генетическом уровне. В базу данных GenBank было депонировано 7 геномов псевдомонадных вирусов, относящихся к 4 отрядам, из которых только 2 принадлежали к наиболее распространенным хвостатым (Caudovirales) фагам, и лишь I являлся литическим. т.е. потенциально применимым для практических приложений. Таким образом, углубленное исследование геномов и протеомов бактериофагов Р. aeruginosa представляет собой многостороннюю и актуальную проблему как для фундаментальной, так и для прикладной науки.

Целью исследования являлся поиск, выделение и очистка литичсских бактериофагов Р. aeruginosa, полное определение последовательностей их геномов,

расшифровка, углубленный анализ в сочетании с данными протеомов тех же фагов, установление закономерностей строения геномов гомологичных бактериофагов и вариативности в пределах таксономического вида, оценка пригодности бактериофагов данного вида для клинических приложений; определение структурно и функционально важных белков бактериофагов, получение их в рекомбинантной форме, исследования физико-химических свойств и структуры рекомбинантных белков. Практически, проведенная работа позволяет оценивать применимость псевдомонадных фагов, содержащихся в коллекциях и выделенных de novo, для антимикробной терапии, анализировать эволюционные аспекты, а также выделять отдельные белки, полезные для биотехнологии и пищевой промышленности. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- разработать унифицированную схему, позволяющую описывать расшифрованные последовательности геномов, осуществлять поиск в базах данных открытых рамок считывания, регуляторных элементов, гомологии последовательностей генов и транслированных белков, сопоставлять предсказанные гены с протеомами фаговых частиц, трактовать роль тех или иных генов;

на основании сравнения геномов близкородственных фагов выяснить пригодность таксономических видов фагов для терапевтических приложений, выявляя наличие и закрепленность в геномах генов потенциально токсических белков и модулей интеграции вирусного генома в бактериальный. По консерватизму отдельных частей геномов прояснить эволюционные пути образования таксономических единиц.

- выбрать структурно и функционально важные белки, кодируемые геномами бактериофагов. Получить эти белки в рекомбинантной, растворимой, биологически активной форме. Исследовать белки физико-химическими и структурными методами.

Научная новизна работы.

Впервые определены и аннотированы в GenBank полные последовательности ДНК геномов бактериофагов P.aeruginosa РВ1 (NC_011810), SN (NC 011756), 14-1 (NC_011703), LMA2 (NC_011166), LBL3 (NC_0l 1165) (глава 1.1), YuA (NC_0I01I6) (гл.

I.2), (pPMGl (NC 016765.1) (гл. 1.3). По представлению коллектива с участием автора международная комиссия по таксономии вирусов (ICTV) приняла обоснование таксономических видов РВ1- и YuA- подобных бактериофагов;

Впервые определены белковые составы (структурные протеомы) (pKZ-подобных (гл.

II.1), PBl-подобных (гл. II.2) и YuA-подобных (гл. II.3) бактериофагов. Разработаны рекомбинантные системы синтеза, выделения и очистки ряда белков литических бактериофагов P.aeruginosa, в том числе и с помощью оптимизированного белково-инженерного подхода посредством конструирования химерных белков с пептидил-нролилизомеразпым доменом SlyD;

Впервые проведены сравнительные протеомные исследования нескольких групп бактериофагов, с помощью криоэлектронной микроскопии построены пространственные модели капсидов бактериофагов SN (гл. 11.2.1), YuA (гл. II.3.I) и ранее известного фага КМУ(гл. 11.4). Иммуноэлектронномикроскопически показана локализация в вирусной частице структурных белков <pKZgpl31, SNgp22 и SNgp29, YuAgp57 и YuAgp63, KMVgp47;

В рекомбинантном виде получен закодированный в геноме фК2-подобного бактериофага EL первый обнаруженный вирусный шаперонин ELgpl46, с помощью крио-ЭМ реконструкции построены модели его конформационных состояний, предложена схема его функционирования (гл.III. 1);

Рентгеноструктурным анализом впервые определены кристаллические структуры пептидогликан-лизирующего фермента бактериофага (рК2 (gpl44, разрешение 2,ЗА, PDB:3BKV_A, гл.III.2), ('-концевого фрагмента хвостовой фибриллы бактериофага ipKZ

(gpl31, разрешение 1,9A, PDB:4GBF_A, гл.Ш.З). центрального шила бактериофага SN (gp43. разрешение 1.8Á. YP 002418849.1, гл.Ш.4);

Автором впервые разработана ПЦР-тестовая система определения таксономической принадлежности бактериофагов P.aeruginosa в контексте возможности использования фагов в терапевтических препаратах (гл.IV).

Практическая значимость работы.

Выделены и идентифицированы новые логические бактериофаги P.aeruginosa, относящиеся к различным таксономическим видам. Оптимизирован хроматографический метод, позволяющий получать очищенные препараты бактериофагов из клеточных лизатов и природных источников.

На основе обобщенных геномных данных создана унифицированная ПЦР-система. которая позволяет определять групповую принадлежность бактериофагов P. aeruginosa, выделенных de novo и находящихся в плохо охарактеризованных коллекциях без проведения длительных культуральных работ, электронной микроскопии и полной расшифровки последовательностей геномов.

Личный вклад соискателя.

Автору принадлежит определяющая роль в выборе направления исследований, постановке цели и задач для ее выполнения, в разработке схем проведения экспериментов на всех этапах исследований, анализе и обобщении результатов и оформлении их в виде публикаций. Работа выполнена в лаборатории молекулярной биоинженерии ФГБУН Института биоорганической химии им. М М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Некоторые исследования проводились во ФГУП НИИгенетика, на кафедре химической энзимологии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, в Katholieke Universiteit Лёвен (Бельгия), MRC-LMB Кембридж (Великобритания). EFPL Лозанна, (Швейцария), Purdue University Вест-Лафайетг (США), University of Texas, Эль-Пасо (США). В работах, выполненных в соавторстве, автор лично принимал участие в экспериментах, интерпретации полученных результатов, подготовке научных публикаций, выступал с докладами на конференциях и международных симпозиумах.

Апробация результатов.

Материалы исследований по теме диссертации были представлены на следующих российских и международных конференциях: Российские симпозиумы "Белки и пептиды" III (Пушино, 2007) и IV (Казань, 2009), Phages in Interaction I (2007), II (2008) и III (2009, Левей, Бельгия), Байкальские Микробиологические симпозиумы «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» II (2007) и III (2011) (Иркутск), XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2008), IV съезд Российского общества биохимиков (Новосибирск, 2008), Phage Biology, Ecology and Therapy Meeting (Тбилиси. Грузия, 2008), конференция "Перспективы фаговой терапии" в рамках Польско-Российских мероприятий, посвященных 50-летию сотрудничества Российской и Польской академий наук (Варшава, Польша, 2008), Conference Jaques Monod «Protein folds in infectious and neurodegenerative diseases» (Оссуа, Франция, 2009), 18th (2009) и 19th (2011) Evergreen International Phage Biology Meeting (Олимпия, США), II симпозиум «Биофарма» (Ереван, Армения, 2010), Viruses of Microbes I (Париж, Франция, 2010) и II (Брюссель, Бельгия, 2012), IV Conference on Bacteriophage Research (Осака, Япония, 2010), конференция «Вакцинология-2010» (Москва, 2010), Всероссийский конгресс «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (Санкт-Петербург, 2011), Iя Symposium on Antimicrobial Research (Пекин, Китай, 2011), межинститутский семинар «Проблемы и перспективы исследования протеолитичсских ферментов» (Москва, 2013).

Публикации.

По материалу диссертации опубликовано 48 печатных работ, в том числе 1 обзор, 16 статей, 31 тезис докладов

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, которая включает материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы (410 наименований). Работа изложена на 230 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу и 72 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Главной стратегической задачей данного исследования являлась разработка комплексной экспериментальной схемы изучения литических бактериофагов псевдомонад - от их выделения из природных источников до практического применения и структуры индивидуальных ключевых белков. В случае достижения такого унифицированного алгоритма исследований в дальнейшем его можно будет распространить в приложении к фагам других бактерий, вирусам в целом и, возможно, к микроорганизмам с небольшими геномами. Проведенная работа отражает произошедший за последнее десятилетие существенный прогресс в методах геномного секвенирования. протеомики, электронной микроскопии и программной обработки данных. Также заметно повышение в течение 2000-х годов интереса научного сообщества к данной теме. В настоящее время в мире различными аспектами структуры, геномики, молекулярных механизмов, эволюции, практического применения бактериофагов P. aeruginosa занимается свыше 40 научных групп. Данные, опубликованные этими исследователями в сотрудничесгве с нашей лабораторией, но без прямого участия автора, а также полностью независимо, зачастую дополняют и корректируют результаты, полученные нами. В полном манускрипте диссертации подробно анализированы и суммированы сведения, имеющиеся по каждой теме на данный момент, с указанием происхождения информации. В тексте автореферата изложены результаты, полученные непосредственно с участием автора.

Сокращения:

КД - спектрометрия кругового дихроизма; НК - негативная колония;

ПЛФ - пептидогликанлизирующий фермент; ЭМ - электронная микроскопия

ICTV - Международный комитет по таксономии вирусов;

GlcN Ас -jV-ацетилглюкозамин; gp - продукт гена;

MS - масс-спектрометрия; MurNAc -iV-ацетилмурамовая кислота;

ORF- открытая рамка считывания;

SDS-PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Геиомика литических бактериофагов P. aeruginosa

1.1. PBl-подобиые бактериофаги семейства Myoviridae.

Строго вирулентный фаг P. aeruginosa РВ1 (vB_PaeM_PBl по номенклатуре Международного комитета по таксономии вирусов ICTV) был впервые описан около 50 лет назад. За время исследований было найдено около 40 фагов, которые на основании кросс-гибридизации ДНК и морфологии считались родственными РВI. Несмотря на то, что РВ1-подобные фаги представляют собой широко распространенный и высокоэффективный вирулентный вид, до начала настоящей работы не имелось публикаций по геномному составу представителей этого вида фагов. Для оценки разнообразия фагов этой группы, помимо собственно фага РВ 1, из имеющихся коллекций и de лосо-выделенных образцов были отобраны 4 характерных представителя, имеющих

различия во внешнем виде негативных колоний (НК), скорости развития инфекционного цикла и диапазоне штаммов-хозяев (табл.1). Электронная микроскопия негативно контрастированных частиц показывает, что все 5 выбранных фагов морфологически одинаковы, имеют в составе жесткий сократимый хвост (ок. 140 нм) и изометрический капсид диаметром 74 нм (рис. 1). Таким образом, РВ1-подобные фаги относятся к морфотипу А1 семейства \fyoviridae. РВ1-подобные бактериофаги имеют характерные капсомеры, располагающиеся на головке фага в виде чашеобразных углублений (8 нм в диамет_

Рис. 1. Электронно-микроскопическое (ЭМ)- изображение негативно контрастированной частицы фага с сокращенным хвостом. Масштабная линейка 100 нм

В ходе работы были определены полные последовательности геномов фагов РВ1, LBL3, LMA2, SN и 14-1. Геномы, образованные линейной непермутированной дцДНК, несущественно различаются по размеру (от 64427 п о. для LBL3 и до 66530 п.о для LMA2). Общее сходство последовательностей этих геномов с неаннотированной последовательностью генома фага F8 Pseudomonas (NC 007810), которая содержалась в GenBank ранее, составляет от 87,2 до 93,5 % (табл. 1).

Таблиця 1. Общая характеристика исследуемых РВ1

подобных бактериофагов

Фаг Место вылеления Геном, п о. Идентичность с F8 Число ORF

РВ1 Эдинбург, Великобритания 65764 93,5 93

F8 Финляндия 66015 100 93

LBL3 Бланес, Испания 64427 88,6 88

LMA2 Маастрихт, Нидерланды 66530 87,6 95

SN Покров. Россия 66390 87,2 92

14-1 Регенсбург, Германия 66238 87,4 90

На основании гомологии последовательности и отличий структуры геномов выбранных фагов от других бактериофагов с известными геномами коллективом исследователей с участием автора было предложено формирование таксономического рода РВ1-подобных бактериофагов. Предложение было рассмотрено и ратифицировано комиссией 1CTV 2011г. (Саппоро, Япония) (http://talk.ictvonline.org/files/ ictv documents/m/ms1/4090.aspx). Хотя фаг F8 известен очень давно и является частью типирующей коллекции Линдберга. в качестве фага - «родоначальника» был выбран РВ1, как выделенный еще раньше (табл.1). В отличие от других литических фагов Pseudomonas, средний GC-состав для РВ1-подобных фагов (55,5%) существенно ниже, чем у бактерии хозяина Р. aeruginosa (66,6%). Гены тРНК в геномах РВ1-подобных фагов обнаружены не были, однако эффективность трансляции обеспечивается использованием тех же доминантных кодонов для каждой аминокислоты, что и у клетки-хозяина.

Таблица 2. Предполагаемые функции продуктов генов, входящих в состав геномов РВ-1 подобных фагов.

ORF Цепь ДНК Белом, а.о. Мщ, кДа Наличие в геномам: Ближайшие гомологи/Структурное предсказание

4 + 461 52,6 все Терминала [Enterobacteria phage НК620)

7.1 75 8,7 только LMA2 Coiled coll

в 133 14,5 все Сигнальный пептид, 2 трансмембранных домена

10 146 24,4 все Сигнальный пептид , 3 трансмембранных домена

12.1 - 166 18,В только SN и 14-1 Сходство с gp65 [микобактериофаг Gumball], предполагаемая метилтрансфераза [COG4627]

14.1 51 5,4 только LMA2 и РВ1 Сигнальный пептид (Р=0 84)

1в + 279 31,5 все Сходство с белком F фага Mu pfam 04233 - морфогенез вируса; Coiled coils

20 + 46 5,2 все Трансмембранный домен

ЗВ + 859 94,3 все Домен трансгликоэилазы SLT [pfam 01464], coiled coils Трансгликоэилаэа [фаг Enterobacteria PRD1]

42 + 432 43,2 все Белок базальной пластинки, суперсемействсО [COG 3299] gp08 WI Фаг Burkholderia BcepBIA]

44 + 965 102,9 все Белок хвостовой фибриллы фага [Pseudomonas putlda КТ2440)

45 + 143 16,4 все Белок сборки хвостовой фибриллы, ORF-191C [фаг P-EibC]

46 + 221 24,2 все /1изо14>1м: Гликозидгидролаза семейства 19 [cd 00325] Предсказанный эндолизин [Фаг Enterobacteria phiVIO]

48 304 34,9 все АТР-эависимая ДНК лигаэа [pfam01068] PBCV-1 ДНК-лигам [Burkholderia pseudomallel 1710b]

49 185 20,5 все ДНК-связывающий белок [Фаг Streptococcus EJ-1]

50 - 202 21,1 все 3 трансмембранных домена, сигнальный пептид (Р=0.99) Bbpl [Фаг Bordetella ВРР-1]

53 539 61,4 все Conserved C-terminal helicase domain [pfam 00271] gp2 [Pseudomonas phage YuA]

55 1037 116,2 все ДНК полимераэа III, альфа-субъединица [pfam 07733] gp68 [Фаг Mycobacterium Gumball]

56 195 21,3 все ДНК полимераза III, эпсилон-субъединица [pfam 00929]

57 339 37,5 все Полинуклеотидкинаэа, частичная последовательность PnkP, [Фаг Enterobacteria TLS]

59 306 35,3 все FAD-зависимая тимидилатсинтаза [PRK 00B47] gp70 [Фаг Mycobacterium Gumball]

67 396 45,1 все АТР-заеисимая энэонуклеаза V, альфа-субъединица [COG0507]

73 + 62 6,6 все 2 трансмембранных домена

74 + 580 65,4 все ДНК-праймаза [Фаг Burkholderia BcepNYS]

Геномы РВ1 -подобных фагов скомпонованы типично компактным образом с малым межгенным пространством (суммарно около 7,9%) и многочисленными перекрывающимися старт/стоп-кодонами. В составе геномов можно выделить 4 транскрипционных блока, расположенных на обеих цепочках ДНК и разделенных (в некоторых случаях в обоих направлениях) факторнезависимыми терминаторами с stem-1оор-структурами, которые весьма консервативны во всех изученных фагах (рис 2). Однако единственные распознаваемые с70-специфические промоторы расположены на старте структурной области, выше ORF 17 и 21 (рис. 2). Поскольку РВ1-подобные фаги не имеют РНК-полимеразы. закодированной в геноме бактериофага, они полностью зависят от транскрипционного механизма хозяина.

Высокая степень гомологии ДНК между PBI-подобными фагами позволила провести сравнительный анализ открытых рамок считывания (ORF). На основе сравнения геномов и анализа tBlastx, предсказано от 88 (LBL3) до 95 (LMA2) ORF (табл. 1, 2, рис. 2), включая малые консервативные ORF

BCecfl

mt» ««» к»о »»

о нам 2мм 34000 ооооо mot «мм <ми

Рис. 2. Анализ геномов РВ-1 подобных фагов Верхняя часть: Предсказанные ORF и сходство их аминокислотной последовательности с соответствующими ORF фага F8 (повышение интенсивности серой окраски). Предсказанные промоторы и терминаторы показаны стрелками и шпильками. Красным указаны структурные белки, определенные MS. нижняя часть: Распределение (1С состава в геномах РВ-1 подобных фагов. График построен программой ISÖCHORE (http://www.ebi.ac. ukAools/emboss/cpeplot/index html).

(<150 п.о., напр. ORF 11.1), которые обычно игнорируются при аннотации геномов. Как и ожидалось, большинство белков бактериофагов (96%) консервативны у всех изучаемых

фагов, и идентифицировано только 6 оригинальных продуктов генов, предположительно имеющих эволюционно чуждое происхождение (orphan). Однако с приемлемым статистическим порогом сходства оказалось возможным обнаружить гомологи только 30 продуктов генов, причем лишь 17 белкам можно приписать достоверную биологическую функцию (табл.2).

По гомологии последовательностей могут быть предсказаны два фермента, участвующих в метаболизме нуклеотидов - киназа/фосфатаза (PBlgp57) и тимидилат синтетаза (PBlgp59). РВ1-подобные фаги используют для репликации холофермент ДНК-полимеразы III. Для этого в геноме консервативно поддерживаются две основные субъединицы каталитического комплекса. а-Субьеднннца (PBIgpS5) катализирует реакцию полимеризации. Е-Субьединица pollll, кодируемая РВ1 геном 56, представляет собой 3'-5'-экзонуклеазу, которая отвечает за проверяющую (proofreading) активность полимеразы. Несмотря на распространенность е-субьединиц среди прокариот, ее ген был ранее найден в геномах только двух бактериофагов (фаг Pseudomonas F116 и фаг Staphylococcus 47). Наличие ДНК-праймаэы (PBlgp74) и хеликазы (PBIgp53), закодированных в геномах РВ1 -подобных фагов предполагает, что этап элонгации процесса репликации независим от хозяйских факторов.

РВ1 -подобные фаги используют классическую двухкомпонентную систему лизиса. Эндо-ПЛФ (PBlgp46) закодирован в конце структурного модуля генома фага и имеет один домен |3-1,4-УУ-ацетил-0-глюкозаминидазы, которая расщепляет связи в полисахаридной цепочке пептидогликана. Этот фермент не имеет секреторного сигнала и специфического домена связывания с клеточной стенкой, что предполагает его аккумуляцию в цитоплазме, с последующим подключением холина для доступа к пептидогликановому слою. Хотя заметного сходства PB!gp50 с известными холинами не наблюдается, расположение гена 50 в геноме рядом с предполагаемым ПЛФ и 3 предсказанных трансмембранных домена с топологией «N -конец внутри» в составе PBIgp50 предполагают функцию этого белка как холина класса 1.

1.2. YuA-подобные бактериофаги семейства Siphoviridae.

Фаг YuA (Yurievka, тип A) (vBPaeSYuA по номенклатуре ICTV) был выделен из пробы воды пруда в Подольском районе Московской обл. дер. Юрьевка в 2003 году. YuA-инфекция характеризуется небольшими (1-3 мм в диаметре) и не полностью прозрачными бляшками. Обычно такой тип негативных колоний свидетельствует о лизогенной природе фага, однако многократные попытки выделить стабильный лизогенный по этому фагу штамм P. aeruginosa были безуспешными.

Электронно-микроскопическое исследование показывает, что YuA морфологически представляет собой типичный дцДНК-бактериофаг Siphoviridae, обладающий гибким несократимым хвостом (рис.3). YuA имеет удлиненную головку (морфотип В2), как и у фага P. aeruginosa Мб, неаннотированный геном которого был депонирован в GenBank ранее. Размер головки YuA составляет ~72 х 51 нм, а длина хвоста - примерно 14S нм. Также отличительной особенностью фагов YuA и Мб являются хвосты, увенчанные у конца короткими фибриллами.

Геномная ДНК фага YuA устойчива к действию многих эндонулеаз рестрикции. Предположительно, ДНК содержит неметилированные остатки аденина и цитоэина. Последовательность геномной ДНК YuA содержит 58663 п.о. и имеет содержание GC 64,3 %, что сходно с ОС-составом ДНК клетки-хозяина (66%).

Рис. 3. ЭМ-изображение (негативное контрастирование) бактериофага YuA. Шкала - 100 нм.

Рис. 4. Кольцевая карта генома бактериофага YuA. Внешний круг обозначает функциональные области каскадов генов: Метаболизм и репликацию ДНК, взаимодействие с клеткой-хозяином, лизис клетки-хозяина, соответственно Экспериментально подтвержденные структурные белки обозначены звездочкой, экспериментально подтвержденные промоторы обозначены черными стрелками.

Предсказанные промоторы и терминаторы указаны незакрашенными стрелками и булавками, соответственно Внутренний круг показывает области генома, гомологичные геномам фагов Р. aeruginosa 73 (фиолетовый), ijiJLOOl (синий) и B3/D3112 (красный).

В составе круговой карты генома предсказано 77 ORF (рис.4), все ориентированные в одном направлении и оставляющие некодирующей лишь 4% последовательности генома YuA. Потенциальных генов тРНК не выявлено. Основываясь на сходстве последовательностей продуктов генов YuA с последовательностями белков в базах данных, геном YuA можно приблизительно разделить на три функциональных области, содержащие продукты генов, участвующих в метаболизме нуклеиновой кислоты и репликации ДНК, во взаимодействии с клеткой-хозяином, в образовании вирусных частиц, упаковке дочерней ДНК и лизисе хозяина.

Геномная ДНК YuA на 91% гомологична геному фага Мб (NC_007809), причем эта гомология прослеживается во всем геноме, приводя к >80% идентичности аминокислот в 92% предсказанных ORF. Только шесть областей генома содержат последовательности, уникальные для YuA или Мб, включая последовательности, кодирующие белки YuAgp22, YuAgp40, YuAgp42 и YuAgp44, из которых YuA gp22 имеет сродство с регуляторным белком фага Т4 NrdA, a YuAgp44 проявляет сходство с бактериальными дигуанилат-циклазами. Уникальные области генома Мб содержат гены 17 и 71, которые, в свою очередь, имеют сходство с генами PBl-подобного фага Р. aeruginosa F8 и фага <|>JL001, инфицирующего мало охарактеризованную морскую а-протобактерию JL00I. На основании обшей мозаичной структуры генома и значительного сходства последовательностей ДНК было выдвинуто предложение объединить фаги YuA, Мб и <j>JL00l в отдельный таксономический род семейства Siphoviridae. Предложение было рассмотрено на сессии 1CTV 2012 (Левен, Бельгия) и ожидает ратификации в 2013 г.

Сравнение транслированных ORF фага YuA с последовательностями, находящимися в базе GeneBank, выявляет существенное сходство 30 предсказанных белков YuA и соответствующих белков, кодированных в геноме фага со сходной морфологией фЛ.001 (63469 п о ). Также 19 структурных белков YuA имеют сходство с белками фага 73 Р. aeruginosa из типирующей коллекции Линдберга, а 8 белков сходны с белками пиле-специфических фагов-транспоэонов P. aeruginosa ВЗ, DMS3 и D3112 (рис.4). В отличие от YuA и <|iJL001, фаги D3112, DMS3 и ВЗ - стабильные лизогенные псевдомонадные фаги, имеющие заметно меньшие геномы в 37611, 36415 и 38439 п.о., соответственно. Фаг 73 морфологически идентичен D3112, но имеет несколько больший геном (42999 п о ). Последние в геноме продукты (YuA gp70 до gp77) также выявляются в нескольких последовательностях геномов бактерий как криптоэлементы профагов, например в Hahella chejuensis, Xylella fastidiosa, Burkholderia cepacia и Haemophilus ducreyi, и в фаге Burkholderia cepacia BcepNazgul (57455 n o ).

На основании последовательности ДНК и исследования активности промотора были определены промоторы двух типов. Промотор первого типа соответствует предсказанному мотиву и находится перед генами 2 и 50. По гомологии эта последовательность соответствует типу ст70-подобных (TTAGGT-N17-TTAAAT). Промотор второго типа находится в структурной области, содержащей гены 55, 58 и 68, и проявляет примерно вдвое большую активность по сравнению с первым типом. Интересно, что не было найдено непосредственной промоторной активности для еще одной, строго консервативной внутригенной последовательности (CTTTACTTACTTCGG-N9-TATACTT), находящейся перед генами 8, 12, 28, 42 и 45 (рис.4), что означает необходимость одного или более фаговых белках для контроля экспрессии этих генов YuA. Дополнительно, были предсказаны 4 a-зависимых терминатора, регулирующих транскрипцию после генов J, 12, 55 и гена главного капсидного белка YuAgp56 (рис. 4).

Область генома YuA от ORF2 до ORF23 кодирует ряд белков, которые, по предсказанию, вовлечены в метаболизм нуклеотидов и репликацию ДНК. Ген 22 кодирует рибонуклеотидредуктазу, которая катализирует синтез ДНК восстановлением

рибонуклеотид дифосфатов (rNDP) до соответствующих дезоксирибонуклеотид-дифосфатов (dNDP). Дезоксицитидилат деаминаза (gp23) катализирует дезаминирование дезоксицитидилата до дезоксиуридинилата (dUMP). Также функция dUMP гидроксиметилазы предсказана для YuA gpl7. Наличие модифицированного основания было показано у фага Bacillus SPOl и предсказывалось для (jiJLOOl и Мб. YuA также кодирует белки, участвующие в репликации генома: хеликазу (YuAgp7). экзонукпеазу (YuAgpl3 и YuAgp41) и ДНК-полимеразу (YuAgp21).

Область генома YuA. включающая гены с предсказанными функциями взаимодействия с клеткой-хозяином, находится в диапазоне рамок считывания от ORF22 до ORF45. Предполагаемый репрессор (YuAgp25) содержит helix-tum-hclix мотивы, подобные предсказанным для вторичной структуры репрессора фага к. Белок YuAgp26 имеет сходство с предсказанными интегразами фага фЛЬОО! и вибриофагов VP2, VP5 и VP16, но последовательности всех этих белков заметно отличаются от тирозиновых и сериновых сайт-специфических рекомбиназ. Попытки выделить лизогенный штамм Р. aeruginosa с геномом фага YuA, интегрированным в хромосому бактерии, успехом не увенчались. Аналогичное отсутствие устойчивой интеграционной лизогении было описано для фЛЬОО! и отдаленно родственного фага Vibrio parahaemolylicus VP16. что вызывает сомнение в функциональности таких интеграэ.

Еще одно примечательное свойство этой области генома YuA заключается в наличии дигуанилатциклазы или GGDEF-домена (YuAgp44). Такой домен широко распространен среди бактериальных белков, функционируя как вторичный мессенджер. контролирующий адгезию бактериальных клеток. Недавно было показано, что GGDEF-домены оказывают влияние на транскрипционную активность генов, кодирующих белки клеточной поверхности и мембранно-связанные белки, и играют роль в образовании и диссоциации биопленок. Все 10 остатков, входящих в активный центр дигуанилатциклазы и поверхность, ответственную за димеризацию, консервативны в /V-концевой части YuAgp44. Это предполагает роль YuA gp44 в регулировании путей транедукции сигнала в Р. aeruginosa. Следующий продукт гена (YuAgp45) проявляет заметное сходство с ArdB, плазмидно-кодируемым белком, который эффективно ингибирует ферментативное расщепление ресгриктирующими эндонуклеазами типа 1. Наличие белков - ингибиторов рестрикции характерно для Т7-подобных фагов Podoviridae (Т7, ТЗ, K.1F, К1Е, SP6), а также для некоторых умеренных фагов.

Бактериофаг YuA кодирует нелинейный кластер перекрывающихся генов лизиса, организация которого похожа на кластеры лямбдоидных фагов. Р22-подобных фагов и фага ВЗ. Кассета лизиса YuA находится в структурной области, между генами, кодирующими морфогенез головки и хвоста. По сравнению с организацией кассеты лизиса в лямбдоидных фагах, взаимное расположение генов в кассете у YuA изменено. Ген предсказанной эндопептидазы Rz (YuAgp60) и вложенный ген Rzl (YuAgpöO. 1) (рамка считывания +1) находятся в каскаде раньше генов холина (YuA gp61) и ПЛФ (YuAgp62). YuAgpöl не проявляет гомологии с другими известными белками. Однако расположение в кассете лизиса, малый размер и три трансмембранных домена определяют его как холин класса I. Для предотвращения раннего лизиса пептидогликанов клетки-хозяина экспортирующимися эндо-ПЛФ должен существовать механизм ингибирования. Современная гипотеза действия системы регуляции «Rz/Rzl/холин» заключается в том, что активность холинов нарушает баланс мембранного потенциала, и это приводит к диссоциации комплекса ПЛФ-ингибитор. В таком случае холины служат таймером лизиса таким же образом, как и в классической холин-эндолизинной системе.

1.3. «pPMGl, Di-подобный лнтический бактериофаг семейства Siphoviridae.

Бактериофаг ipPMGl (vB_PaeS_PMGl по номенклатуре 1CTV) был выделен из природного источника (пруд в окрестностях Егорьевска Московской области) в ходе

поисков бактериофагов, способных преодолевать подавляющий эффект плазмид, с использованием в качестве хозяев штаммов Р. aeuginosa РА01, несущих плазмиды группы несовместимости 1псР2._

Рис. 5. Бактериофаг (pPMGl: (а) морфология вирусной частицы (ЭМ негативного контрастирования), (б) вид ореолов, образуемых фагом на газоне бактерий P. aeruginosa N44 (посев уколом); (в) профили рестрикции геномов фагов D3 (2, 4) и ipPMGl (3, 5) эндонуклеазами EcorV (2, 5) и Hindlll (4, 5). Линия 1 - XHmdIII-маркер

Бактериофаг (pPMGl обладает широким спектром литической активности, лизируя 60-70% клинических изолятов P. aeruginosa из коллекций, включая мутанты бактерий, устойчивые к фагам коммерческих препаратов и подавляющие развитие других фагов. На газоне бактерий P. aeruginosa PAOl фаг (pPMGl образует негативные колонии (НК), которым часто свойственно концентрическое строение (рис. 5). Бактерии, выделенные из ореолов таких НК, не являются лизогенами и прявляют чувствительность к повторной инфекции фагом фРМС1. Нам не удалось отобрать варианты фага, способные к стабильной лизогенизации, среди примерно 50000 НК. Фаг (pPMGl относится к морфогруппе В1 семейства Siphoviridae, с развитым базальным комплексом на конце хвоста. Частица фага имеет изометрическую головку с диаметром 57-58 нм и несократимый хвост длиной 145-150 нм. Анализ морфологии бактериофага (|>PMG1, размера и профиля рестрикции генома (рис.5) профиля основных структурных белков показывают его значительное родство с фагом P. aeruginosa D3, который охарактеризован как умеренный серотип-конвергирующий бактериофаг семейства Siphoviridae, имеет размер генома 56426 и.о. и кодирует 90 ORF.

Нами было проведено секвенирование генома ipPMGl, его аннотация и сравнение с геномами фагов D3 и PAJU2 (также отнесенного к группе ОЗ-подобных фагов). Линейный геном ipPMGl представлен дц ДНК размером 53848 и.о.. что несколько меньше, чем у фага D3, действительно проявляет высокий уровень родства с фагом D3, и кодирует 96 предполагаемых ORF и 4 гена тРНК. Эти тРНК могут ассистировать трансляции генов с низким GC-составом. Сравнение геномов фагов (pPMG 1 и D3 (рис. 6) выявляет три зоны, в которых обнаруживается очевидное нарушение гомологии -наличие замен, делеций, вставок и (редко) инверсий.

| 5? phiPMGi

1 SSS SS

Рис.6. Сравнение дуплицированного участка генома фага ЭЗ с гомологичными районами в геномах фРМО! и РАЛ)2.

Фаги <pPMGl и PAJU2 проявляют довольно ограниченную ДНК гомологию, при этом одна из областей существенной разницы геномов D3 и (pPMGl совпадает с расположением перемежающхся участков гомологии фага PA.IU2 с D3 (рис. 6). Сравнение геномов фагов (pPMGl и D3 позволяет предположить, что геном ipPMGl несколько более близок к предковому состоянию с точки зрения общей организации. На это указывает высокое сходство с D3 на большей части протяженности, без каких-либо вставок, а также отсутствие в различающейся части участков дупликаций или переносов, характерных только для D3 и являющихся, очевидно, вторичным явлением. Геном PAJU2 отличается от геномов cpPMGl и D3 (преимущественно в гомологичном регионе) значительными участками негомологии, однако сохранившиеся достаточно высокогомологичные участки в целом точно следуют порядку расположения в геноме ipPMGl и координатам в геноме (с точностью до сравнительно небольших различий длин негомологичных участков). Вообще говоря, само по себе такое различие геномов не позволяет определить, какая из ветвей (cpPMGl + D3 или PAJU2) более близка к предковому состоянию, без более подробного рассмотрения конкретных различий геномов.

Аннотированный геном фага <pPMGI депонирован в GenBank (NC_016765.1). Из 96 ORF, определенных в его геноме, 65 генов кодируют белки с высоким уровнем сходства с предполагаемыми белками фага D3. 14 генов (pPMGl кодируют белки, сходные с генопродуктами фага PAJU2. Несмотря на наличие в базах данных геномов близкородственных бактериофагов, лишь для 24 продуктов генов из 96 можно предсказать функциональную или структурную роль на основе гомологии последовательности ДНК или транслированного полипептида. Сравнение последовательностей генов фагов фРМС>1 и D3 с целью выявления причины биологических различий этих фагов не всегда позволяет сделать однозначный вывод. Например, все гены, продукты которых задействованы непосредственно в лизогенизации. и соответствующие сайты у обоих фагов проявляют высокое сходство. В генах имеется небольшое количество замен единичных нуклеотидов и, по-видимому, только их присутствием и можно объяснить имеющуюся нестабильность лизогении у фага (pPMGl.

Таблица 3. Предполагаемые функции продуктов генов, входящих в состав генома фРМО! ___

Ген (ORF) Позиция в геноме Длнна, а.о. Предполагаемая функция

1 37..417 126 Термнназа, малая субъединица

-> 419. 2110 563 Терминаза. большая субъединица

4 2264 . 3568 434 Белок портала

5 3572. .4462 296 С1рР-подобная протеаза

6 4459... 5646 395 Основной белок капсида

9 6390 . 6710 106 Коннектор головка-хвост

К) 6711 ...7067 118 Адаптер головка-хвост

16 10118 10639 173 Основной белок хвоста

17 10649 11008 119 Консервативный белок, аналог X крО

19 11336 13840 834 « Рулетка» длины хвоста

25 15891. 18620 909 Компонент хвоста

27 21048. 21143 31 Ингибитор полимеразы

2Н 21326 23389 687 (ЛПолисахаридацетшггрансфераза

29 23465. .24625 386 (ЛАнтаген Р полимераза

31 25549 26031 160 Эндолизин (ПЛФ)

35 27148... 28257 369 Интеграза

52 34719... 35054 III Предполагаемый регулятор транскрипции

70 41954 42625 221 с1 репрессор

71 42712 .42933 73 Сго-репрессор

72 42935 43243 102 Регуляторный белок СП

74 43503 44492 329 О-Белок, инициатор репликации ДНК

75 44489 45829 446 Хеликаза

хз 48480 49076 198 N1110, белок рекомбинации

96 53534... 53848 104 НГ^Н-зндонуклеаза

Область «иммунитета» фагов D3 и (pPMGl явно гомологична по структуре и функциям аналогичной области лямбдоидных фагов. Она содержит гены репрессора (сI) и антирепрессора (его), наряду с левым и правым оператор-промоторными комплексами. Как у л, так и у cpPMGl репрессорная мРНК не имеет типичных прокариотических рибосом-связывающих участков (SD-боксов) и первые три нуклеотида кодируют формил-метионин. Гомология последовательности между белками cl фагов к и <pPMGl невысока, но функционально важные аминокислотные остатки высоко консервативны. Гены морфогенеза демонстрируют наибольшую гомологию с аналогичными генами колифагов НК022 и НК97. Четыре структурных белка фага ipPMGl имеют 32 - 62% идентичных аминокислот с соответствующими белками НК022. Последовательность генов морфогенеза капсида (портап-протеаза-главный капсидный белок) организована аналогично колифагу НК97. Продукт гена ORF31 фага ipPMGl представляет полипептид из 160 а.о., имеющий сильную гомологию с эндо-ПЛФ фагов к, Р2, 186, НК.022 и НК.97, которые участвуют в лизисе клетки-хозяина в конце литического цикла. По сравнению с фагом X расположение эндо-ПЛФ (pPMGl в геноме иное. Он расположен возле модуля конверсии серотипа, который также отсутствует в фаге X. Бактериофаг фРМО 1 проявляет неспособность расти на лизогенах по фагу D3, которые проявляют признаки лизогенной конверсии (связанной с изменением состава полисахаридов на поверхности лизогенизированных бактерий). Известно, что в конверсии серотипа принимают участие три ORF. Их продукты представляют ингибитор а-полимеразы (PMGgp27), О-ацетилаэу (PMGgp28) и ß-полимеразу (PMGgp29). GC-состав области генома, включающей этот модуль, имеет девиантное значение, что предполагает его захват в результате эволюционного горизонтального переноса генов. Сравнение последовательности нуклеотидов этих генов фага D3 и фага ipPMGl обнаружило замену лишь двух нуклеотидов. Неясно, сохранена ли у фага

(pPMGl функциональность этих генов, контролирующих лиэогенную конверсию в отсутствие стабильной лизогениэации.

Хотя бактериофаг «pPMGl проявляет высокую степень родства с умеренным фагом D3, его специфические признаки - необратимая утрата способности к лизогениэации, развитие в присутствии плазмид, подавляющих рост других фагов. - позволяют рассматривать его в качестве потенциального кандидата для включения в терапевтические смеси фагов.

II. Структурная протеомика литических бактериофагов P. aeruginosa

II. 1. Протеомика <pKZ- подобных бактериофагов.

В целом <рКZ - подобные бактериофаги достаточно сильно отличаются от ранее известных миовирусов, причем при одинаковой морфологии и структуре их геномов сами последовательности геномных ДНК весьма различны. Таким образом, при анализе генома и наиболее представленных в протеоме белков возможно идентифицировать функции лишь очень небольшого количества продуктов генов (<10%). Сравнительная геномика, включающая в себя депонированные в GcnBank геномы de novo-выделенных (pKZ-подобных бактериофагов позволяет лишь уточнить особенности строения геномов и идентифицировать ранее пропущенные при аннотации малые ORF. но дает мало новой информации о роли и функции продуктов генов. Показателен пример недавно секвенированного фага Pseudomonas Lu 11, который предварительно отнесен к cpKZ-подобным. хотя имеет заметные отличия в морфологическом строении баэальной пластинки. Геном этого фага настолько сильно отличается от геномов других представителей группы, что на основе сравнительного анализа последовательности затруднительно идентифицировать даже основные структурные компоненты. Наиболее полная информация о строении вирионов cpKZ-подобных фагов и роли отдельных структурных белков получена на основе сравнительной протеомики, когда с помощью различных масс-спектрометрических методов были получены протеомы фагов (рКZ, EL, мутанта q>KZ ts 13, представляющего собой отдельную головку фага (нами), а также фага 201ф2-1 (Thomas et al., 2010). Всего в вирионах фKZ-подобных фагов по результатам (ES1)-MS/MS было идентифицировано 62 (<pKZ), 30 (фКZ tsl3), 64 (EL) и 69 (201ф2-1) структурных белков (табл.4).

Наиболее интенсивные полосы на геле при электрофоретическом разделении структурных белков вириона формируют основной белок капсида (<pKZgpl20, ELgp78 и 20^2-lgp200, соответственно) и основной белок хвостового чехла (фК229, ELgp6 и 20l<p2-lgp30). Сходство аминокислотных последовательностей этих белков между собой не столь велико (ок. 60%), однако закономерности последовательностей позволяют определить гомологи с помощью BlastP. Основной белок капсида в случае всех фКZ-подобных фагов подвергается протеолитическому процессингу. В случае же основного белка хвостового чехла протеолитического созревания соответствующих белков, за исключением отщепления N-концевого остатка метионина, обнаружено не было. Третий белок вириона с предсказанной функцией, длинный полипептид с небольшим стехиометрическим присутствием в частице ^KZgpl81, ELgpl83, 201 <р2-1 gp276) представляет собой комбинацию «рулетки» хвоста и белка механизма протыкания клеточной мембраны.

Таблица 4. Гомологичные структурные белки фК7-подобных бактериофагов

gppKZ Mw, кДа Гомолог gp EL1 Гомолог gp 201ф2-11 Функции, протеолитический процессинг

Структурные белки с установленными функциями

29 77.6 6 30 Белок хвостового чехла"

120 82.9 78 200 Основной белок капсцщг'( 164-747, 64,9кДа)

181 | 245,7 | 183 | 276 | Аппарат «протыкания» клетки, М'

Структурные компоненты РНК-полимеразы

80 50,5 44 139 РНК-пол иыераза, О'- субъединица.

178 164,8 186/187 273/274 РНК-полимераэа, 3- субъединица.

180 56,2 184 275 РНК-полимерам, Р- субъединица.

Компоненты головки фага

28 36,4 8 28

32 49,3 13 36

34 29,7 - 48

52 42,2 - 98

79 33,2 - 138

83 54,5 155 455/456

84 46,8 52 145 Лигаза (11-413,45,7кДа)'

86 48,9 - 146 (123-428, Э5.4кДа) '

94 56,9 - 156 N (1-95. 9,2цДа) и С (276-505, 26.4 кДа) "

99 54,7 69 162

128 84,3 104 213

145 84,1 156 230 Коллагеновые домены, N1

146 115,8 - 230

149 25.3 175 233

163 44,2 - 246С, 247 (55-395, Э8,1кДа)'

175 30,7 192 268 Протеаза, (1-210,23,7кДа)'

176 27,7 191 269

177 58,7 - 271 М( 1 -60, 6,4 кДа) и С(61 -519, 52,4кДа)

303 72,1 155 452 N(61-268, 22,8 кДа) и С(Э67-646, ЗІ.ЗкДа) '

Предполагаемые компоненты «внутреннего тела»

89 42,2 58 151 N (1-122, 13,1кДа)иС(156-387, 26,1 кДа) '

90 35,9 - 152

93 47,6 - 155 ДНК-связывающий белок (157-435, 41.4кДа)

95 58.9 - 157 (261-547,31,6кДа)м

97 87,8 - 159 N (14-66, 5,8кДа) и С (533-816, 30,7 кДа) 1

162 57,6 - 246N N(18-137, 13,2 кДа) и С(259-522, 29кДа) '

Компоненты хвоста и базальной пластинки

26 62.0 9 27

27 105,2 8 28

30 32.6 5 32

85 16.4 - -

87 110,3 - С'

91 20.9

92 50,6 - 154

101 52.0 71 164

119 20,2 - 198

127 33,6 - 212

129 99,5 103 214 Белок коннектора (?), N (1-262,29,ЗкДа) и С (263896, 70,1 кДа)'

130 45.6 103 215

131 84,6 112 216 Комплекс хвостовых фибрилл"

132 12,2 116 217 Комплекс хвостовых фибрилл, N 14

133 52,6 115 218 Комплекс хвостовых фибрилл"

134 51,6 114 219 Комплекс хвостовых фибрилл"

135 52,1 115 220 Комплекс хвостовых фибрилл"

139 32,6 106 224 м'

143 20,1 - 228

144 28.8 183 276 Эндо-ПЛФ

153 34,1 - 238 (53-304, 28,2кДа)'

157 51,1 169 243

160 17,8 168 245

174 57.6 192 261

184 25.2 - 280

201 72,6 - 298

202 13.5 166 299

244 13.4 - 313

298 36.3 - 201

Примечания:

1 - Гомологичные белки определяли с помощью Psi-Blast и BlastP Приведены продукты генов, гомологи которых встречаются в протеомах двух или трех qiKZ-подобных фагов Прочерк означает, что гомологи не были обнаружены в протеоме. N и С - в структурном протеоме обнаружены пептиды, соответствующие 1V- и С-частям ORF, соответственно. В случае точного установления границ протеолитического расщепления соответствующие аминокислотные остатки приведены.

2 - Отсутствует iV-концевой остаток Met.

3 - Белок протеолитически процессирован. В случае, когда место расщепления известно, приведена нумерация а.о и молекулярная масса полипептидов, обнаруженных в протеоме

4 - Входит в семейство паралогов

Три белка, детектированные с помощью MS в вирнонах cpKZ-подобных фагов (201<p2-1 gpl 39, 273/274 и 275, EL gp44. 184 и 186/187. <pKZgp80, 178 и 180) по последовательности похожи на р или Р' субъединицы бактериальных РНК полимераз. Во всех случаях пары генов, кодирующих предсказанные полимеразные субъединицы, расположены в геномах непосредственно перед геном, кодирующим белок протыкания клеточной стенки. Необходимо отметить, что хотя гомологичные гены 273 и 274 фага 201 <р2-1, и 186 и 187 фага EL предсказываются программой GeneMark как независимые рамки считывания, они принадлежат единой ORF, разделенной мобильным нитроном. Этот вывод можно сделать из факта, что 201<p2-lgp273/274 формирует единый белок, судя по полосе SDS-PAGE. Исследование последовательности ДНК между ORF273 и 274 выявляет гомологию с несколькими мобильными нитронами, найденными в геноме фага фКZ, однако гомологичный генам 273/274 фага 201 ф2-1 ген 178 фага фКZ интроном не прерывается.

Мультисубъединичная РНК-полимераза, входящая в состав частицы бактериофага -крайне необычное явление. Однако существует по крайней мере один прецедент РНК-полимеразы. ассоциированной с вирионом - в морфологическом комплексе Mvoviridae фага В. subtilis PBS2. Предположительно, РНК-полимеразы этого фага и (pKZ-подобных фагов проникают в инфицированную клетку для непосредственной экспрессии фаговых генов. При этом полностью собранный комплекс полимеразы слишком велик, чтобы проходить через хвостовую трубку, поэтому в клетку последовательно проникают отдельные субъединицы с последующей сборкой в функциональный полимеразный комплекс. Неизвестно, участвуют ли в формировании РНК-полимераэного комплекса другие белки вириона фК2-подобных фагов, или задейсгвуются белки клетки-хозяина. Некоторые белки фК2-подобных фагов имеют гомологию с хеликазами и лигазами, также в их геномах закодирована вторая РНК-полимераза, которая не ассоциирована с вирусной частицей и, вероятно, синтезируется в процессе инфекции, как и другие белки бактериофага. Вероятно, существует некая функциональная специализация структурной и синтезируемой РНК-полимераз фК2-подобных фагов, однако детали программы транскрипции неизвестны.

Помимо основных белков головки и хвоста, в протеоме фК2-подобных фагов стабильно присутствуют несколько консервативных белков с неизвестной функцией (табл.4). В целом, подробный анализ протеомов фагов фК7, EL, 201ф2-1, капсида фК-Z и вновь открываемых и секвенированных фагов из группы фК2-подобных позволяет идентифицировать большинство кодированных в геноме структурных белков. Сравнительная протеомика подтверждает предсказанные после секвенирования геномов рамки считывания и дает основу для дальнейшей функциональной характеризации и

оценки роли белков вириона в морфогенезе частицы и протекании инфекционного цикла.

11.2. Прогеом РВ1-подобных фагов

Изучение гомологии последовательностей предполагает, что в формировании вирусной частицы принимает участие область с ОЯР17 по О Я14 5 (табл.2). 508-РАСВ-анализ частиц фагов РВ1,1_В1.3 и показывает высоко консервативный паттерн полос, с небольшими вариациями в области 14-20 кДа (рис 7А). Этот консерватизм отражает более чем 95%-ю идентичность нуклеотидной последовательности геномов РВ1-подобных фагов в этой области (рис.2). Единственное существенное отклонение в схожести последовательностей обнаружено в ОИР 44, предположительно кодирующей белок хвостовой фибриллы.

Рис.7. А. Белки фаговых частиц, разделенные с помощью 12% ЗВБ-РАОЕ параллельно маркеру молекулярных масс; а - РВ1; Ь - ЕВЬЗ; с - вы. Указано положение основных структурных белков, определенных с помощью ЕБ1-МЭ/МЗ. В. Зимографический анализ фага БМ Зона просветления, обусловленная

пептидогликандеградирующей активностью, указана стрелкой.

Е51-М5/М8-аналич фагов РВ1, БЫ и 1.В1-3 приводит к экспериментальной идентификации 22 предсказанных белков при покрытии около 56 % их последовательностей (табл.5). Небольшиее различия в паттернах белков на 508-РАСЕ между РВI -подобными фагами сводятся к разнице в относительных количествах низкомолекулярных РШурЗО (15,8кДа) и РВ^р22 (16,4кДа). Продукты генов 22, 23, 29 и 30 идентифицированы как основные строительные блоки частицы. Известно, что наибольшим числом идентичных молекул в частице фага обычно представлен основной белок головки Можно предположить, что таковым для РВ1-подобных фагов является gp23, так как электрофоретическая полоса с максимальной интенсивностью соответствует этому белку (рис. 7А). Также известно, что во многих фагах основной капсидный белок претерпевает протеолитическую модификацию в ходе созревания частицы. Эта тенденция соблюдается и для белка gp23 РВ 1 -подобных фагов: при масс-спектроскопическом анализе не было обнаружено А'-концевых пептидов этого белка.

Белок РВ1цр38 с высокой молекулярной массой (94,ЗкДа) имеет в своем составе трансгликозилазный домен (остатки 490-600), включая домен связывания /У-ацетил-Д-глюкозамина и каталитический остаток Е5'2. Активность gp38 у фагов 14-1 и ЬВЬЗ была продемонстрирована методом зимографии, которая показывает специфическое разложение пептидогликана автоклавированных клеток Р. ае^тоза при ренатурации ёр38 (рис.7В).

Таблица 5. Белки, идентифицированные с помощью MS в протеоме РВ1 -подобных фагов ___

Продукт гена Молекулярная масса, кДа Степень покрытия последовательности в обнаруженных пептидах, % Функция, гомология, примечания

SN LBL3 PBI

17 84,3 27 25 19 Минорный компонент капсида [pfam 09714]

18 31,5 28 4 - Минорный компонент капсида [pfam 04233]

21 50,5 - 17 - С-концевой протеолиз

22 21,6 53 55 45 Минорный компонент капсида

23 41,6 50 45 21 V-концевой протеолиз

25 16,9 24 25 -

26 15,2 56 20 -

27 21,2 31 - -

29 53,7 40 43 22 Белок хвостового чехла

30 15,9 54 55 -

31 12,2 42 14 -

32 12,4 35 II -

34 17,8 32 40 -

35 19,8 25 6 -

36 21,6 11 - -

38 94,2 36 38 10 Структурный ПЛФ. трансгликозилаза

39 32,5 21 ІЗ -

41 24,2 11 - - Гомология с белками базальной пластинки

42 44,8 4 10 42 Белок базальной пластинки [COG 3299]

43 34,5 50 16 - Центральный хвостовой шил

44 103,2 37 зо 24 Белок хвостовой фибриллы

66 33,2 - 4 23

Прочерк означает, что пептиды соотвествующего белка не были обнаружены в MS.

II.2.1. Локализация белков в частице фага SN с помощью электронной микроскопии

На основе 900 исходных микрофотографий, полученных при криоэлектронной микроскопии PBI-подобного бактериофага SN, нами была осуществлена трехмерная реконструкция его калсида с разрешением около 18А. Показано, что капсид бактериофага SN представляет собой правильный икосаэдр с диаметром 74 нм с числом триангуляции Г = 9, на поверхности которого присутствуют несколько различающихся структурных белковых элементов (рис. 8А). Основные структурные элементы обладают симметрией вращения шестого порядка (рис. 8С). В 11 вершинах икосаэдра расположены структурные элементы, имеющие симметрию вращения пятого порядка (рис. 8В); последнюю, 12-ю вершину занимает капсомер, который формирует место присоединения сократимого хвоста вируса, также обладает симметрией вращения 5-го порядка и, в целом, похож на структуры, занимающие остальные вершины. Внутри капсида расположена геномная двухцепочечная ДНК вируса, протяженностью 66391 п.о.

А

В

Ф

I

С

Рис. 8. А - Пространственная реконструкция капсида бактериофага SN. Оттенками цвета выделены различные капсомеры на поверхности; В - вершинный капсомер; С -основной капсомер.

ESI-MS/MS - анализ бактериофага SN позволил экспериментально определить наличие в составе частицы 22 предсказанных биоинформационными методами белков (табл. 5). По аналогии с другими фагами с известной структурой, можно предположить, что в силу своего размера и разнообразия структурных элементов, капсид бактериофага SN не может состоять из одинаковых белков. Кроме того, неизвестно, какие из белков, представленных в протеоме, входят в состав головки, а какие в состав хвоста. Структурные особенности бактериофагов Т4, X, фК2 были изучены с помощью крио-ЭМ с использованием мутантов фагов, представляющих собой отдельно капсид или хвост. У недавно выделенного фага SN такие мутанты пока неизвестны. Из анализа первичной структуры многокопийных белков частицы фага SN, их функцию и топологию, кроме как для белка SNgp23, предположить нельзя.

Гомология последовательностей рамок считывания, кодирующих белки gp22, gp29 и gp30 у РВ1-подобных фагов, наблюдается только для представителей этого вида и, в некоторой степени, для группы Всер781 -подобных фагов Burkholderia cepacia, у которых роль большинства генов и их продуктов также неизвестна. Таким образом, стратегией локализации структурных белков бактериофага SN было выбрано получение целевых рекомбинантных белков и выработка антител к ним, с последующей визуализацией места прикрепления антитела к частице фага. Нами были получены плазмидные векторы, несущие гены 22 и 29 фага SN под контролем промотора Т7, и отработана система синтеза их растворимых продуктов в клетках Е. coli. Для обоих белков были получены поликлональные мышиные сыворотки, которые специфически взаимодействуют с соответствующими белками в составе фага. Иммуноэлектронная микроскопия непосредственно отображает локализацию связывания вторичных антител, меченных коллоидным золотом, с первичными антителами, которые специфически присоединились к белкам в составе частицы фага Анализ полученных изображений показывает, что при использовании в качестве первичных антител сыворотки против SNgp22 частицы золота связывались с головкой фага, а в случае сыворотки против SNgp29 - с хвостовым чехлом, причем связывание наблюдалось как с интактными, так и с сокращенными чехлами (рис.9).

Рис. 9. Иммуиоэлектрониая микроскопия. Суспензию фага SN инкубировали с сывороткой против SNgp22 (А) и SNgp29 (В), а затем с вторичными антителами, конъюгированными с частицами золота (10 нм). Образцы контрастировали 1%-ным уранилацетатом. Масштабная линейка 100 нм. (С) электронная микрофотографии (негативное контрастирование) поличехлов, формируемых рекомбинантным SN gp29. Масштабная линейка 100 нм.

На основании этого можно сделать вывод, что SNgp22 является белком, декорирующим поверхность капсида. a SNgp29 формирует хвостовой чехол. В пользу последнего утверждения свидетельствуют также данные электронной микроскопии, согласно которым рекомбинантный gp29 формирует полимерные структуры нерегулярной длины (поличехлы) подобно чехольным белкам других фагов (gpl8 фага Т4 и gp29 фага phiKZ (рис. 9С).

11.3. Протеом бактериофага YuA.

С помощью ESI-MS/MS (двумя способами — с предварительным разделением структурных белков очищенной частицы фага на SDS-PAGE, и с непосредственным протеолизом белков частицы в растворе - Whole Shotgun Approach, WSA) были определены 16 предсказанных белков с покрытием в 66,1% (табл. 6). Два белка с наибольшей интенсивностью на геле были определены как gp56 и gp66. предположительно основные капсидный и хвостовой белки. Присутствие этих двух белков было подтверждено денатурацией и последующим MS анализом цельных фаговых частиц. Последний метод обеспечивает более высокое аминокислотное покрытие обоих белков, детектируя пептиды, которые не определялись с помощью первого подхода. Более того, было подтверждено наличие в частице вириона YuA еще двух белков: gp64 и gp75 (табл. 6). Не все белки, идентифицированные SDS-PAGE/ESI-MS/MS, были найдены при WSA анализе, вероятно из-за того, что некоторые из них могли быть недоступны для расщепления трипсином после денатурации.

Хотя функциональная аннотация структурных белков достаточно ограничена, можно предположить, что YuAgp54 является белком морфогенеза головки, a YuAgp69 -«рулетка», определяющая длину хвоста. На основании сходства с белками фага BcepNazgul, продукты генов YuAgp70 до gp77 участвуют в структурировании и морфогенезе хвоста. Сравнительный анализ между YuA и Мб показывает, что YuA gp70

23

и §р71 наиболее сильно отличаются, т.е. скорее всего играют роль в распознавании клеток-хозяев.

YuAgp51 предсказывается как терминаза, которая связывается с незрелой фаговой частицей и упаковывает единичный объем генома. Этот продукт гена кодируется в области кластера структурных белков, но его присутствие в зрелой частице не подтверждено Е81-М5/М5 анализом.

Таблица 6. Белки, идентифицированные с помощью М5 в протеоме фага УиА

Продукт гена УиА Молекулярная масса, кДа SDS-PAGE - ESI-MS/MS Whole Shotgun (WSA) MS

Число пелтнцов Степень покрытия, % Число пептидов Степень покрытия, %

52 56,1 13 28 - -

54 45,0 14 32,3 2 10,4

55 27,9 4 14,6 - -

56 32,2 20 66,1 22 88,2

57 19,1 2 22,9 2 23,4

59 5,5 2 35,7 3 46,4

63 18,6 8 36 3 29,7

64 13,4 - - 3 63,1

65 16,4 3 22,7 1 10,4

66 54,0 33 63,3 21 66,1

69 100,4 24 26,3 - -

70 56,2 6 13,2 - -

71 35,7 9 40,6 4 24,5

72 62,2 9 17,6 3 15,1

73 30,1 6 24.5 -

74 8,2 - 1 37,5

76 76,9 16 27,0 2 3,4

77 17,1 3 36,6 - -

11.3.1. Реконструкция капсида УиА н ЭМ-локализация белков

Крио-ЭМ реконструкция капсида бактериофага УиА, выполненная на основе 3142 исходных микрофотографий, позволила нам построить пространственную модель с разрешением ок. ЗОЛ. Вытянутый капсид бактериофага УиА с размерами 72 нм х 51 нм состоит из гексамерных и пентамерных капсомеров в вершинах, характерных для бактериофагов с элементами икосаэдрической симметрии. Внутри капсида расположена геномная дцДНК, организованная в виде протяженной шпульки, направленной вдоль длинной оси симметрии головки (рис.10). На поверхности капсида УиА обнаружены спирально расположенные элементы декорирующих белков (рис. 10).

Масс-спектрометрическими методами были экспериментально определены 16 структурных белков частицы фага (табл. 6). Наибольшую интенсивность при БОБ-РАСЕ имеет полоса белка YuAgpS6. Роль остальных продуктов генов, участвующих в формировании вирусной частицы, предсказать достаточно затруднительно, за исключением нескольких, имеющих существенную гомологию с другими известными фаговыми белками.

С помощью программ ННРге(1 и ЗО-РББМ мы проанализировали возможные варианты укладки (фолды) небольших структурных белков и выбрали для дальнейшего анализа те, которые предполагают сильно различающиеся по гидрофобности и распределению заряда поверхности. Подобное распределение характерно для

декорирующих белков капсидов бактериофагов. Далее аналогично стратегии примененной для локализации белков у РВ1-подобных фагов, были получены целевые рекомбинантные белки и антитела к ним. с последующим введением метки коллоидного золота во вторичные антитела, и визуализацией взаимодействия антитела и частицы фага.

Рис. 10. Пространственная крио-ЭМ реконструкция капсида бактериофага YuA. А-внешняя поверхность капсида, В - срез капсида

Таким образом, в плазмидные векторы были клонированы выбранные на основе биоинформационного анализа гены YuA 63 и 57, и разработан метод выделения и очистки синтезированных в Е.соИ белков с последующим получением мышиных поликлональных антисывороток. Анализ изображений, полученных с помощью нммуно-ЭМ, выявил преимущественное связывание частиц золота с капсидом фага YuA в случае первичных антител против YuAgp63. При использованиие сыворотки против YuAgp57 связывание наблюдалось с проксимальной частью гибкого хвоста бактериофага YuA (рис.11).

На основании этого наблюдения можно предположить, что YuAgp63 является белком, формирующим спиральные декорирующие элементы на поверхности капсида, а YuAgp57 является компонентом базальной пластинки бактериофага.

Рис.11. Иммуно-ЭМ. Суспензию фага УиА инкубировали с сывороткой против YuAgp63 (А) и У1^р57 (В.С). а затем с вторичными антителами, конъюгированными с частицами золота (10 нм). Образцы контрастировали 1%-ным уранилацетатом.

11.4. Бактериофаг KMV семейства Podoviritlae

Высокоактивный литический бактериофаг P. aeruginosa KMV (в ряде публикаций ipKMV, vBPaePKMV по номенклатуре ICTV) был выделен из воды Чертановского пруда в г. Москве в 2000 г. Этот вирулентный фаг, формирующий крупные, прозрачные и быстро растущие НК. тем не менее имеет узкий диапазон инфекционности, около 30% по результатам проверки на двух библиотеках штаммов Р. aeruginosa. Электронная микроскопия определила принадлежность этого фага к семейству Podoviridae, с характерными небольшим икосаэдрическим капсидом и коротким несократимым хвостом. Геном фага KMV (NC_005045) и его структурный протеом были опубликованы в 2003-2004 гг. без непосредственного участия автора и детально не рассматриваются. Несмотря на то, что с тех пор были определены геномы еще 7 фагов, близкородственных KMV по морфологии и инфекционному циклу, и K.MV-подобные бактериофаги были выделены ICTV в отдельный род, до недавнего времени была не совсем понятна степень эволюционной оригинальности KMV. Многие гены и генопродукты K.MV имеют довольно высокую гомологию с белками колифага Т7, одного из наиболее изученных членов семейства Podoviridae. Организация генома KMV также довольно сходна с таковой у Т7. Существует, однако, разница в ряде регуляторных элементов (ориджин репликации, промоторы, гены ингибирования хозяйской транскрипции) и «поздней» локализации РНК полимеразы KMV в геноме. Экспериментально было показано, что KMV использует иной, чем Т7. механизм SignalArrest and Release (SAR) для лизирования P.aeruginosa. Исследования протеома KMV выявили ряд структурных генопродуктов, характерных для KMV-подобных бактериофагов и не имеющих явных ортологов у фагов, наиболее близким к Т7.

11.4.1. Реконструкция капсида KMV и Ш-.юка.пиации белков

Крио-ЭМ реконструкция капсида бактериофага KMV, выполненная нами на основе 9320 исходных микрофотографий дала пространственную модель с разрешением ок. 30А (рис. 12). Капсид KMV представляет собой правильный икосаэдр с числом триангуляции Т=7 и диаметром 54 нм. Особенностью строения капсида KMV являются выраженные декорирующие шины, расположенные на гранях вершинных капсомеров (рис. 12).

Настолько крупные (около 10 нм) поверхностные элементы представляют принципиальное отличие капсида KMV не только от кансида фага Т7, но и большинства известных подовирид. которые в целом достаточно похожи друг на друга по морфологии головки. Таким образом, решение о выделении KMV-подобных

бактериофагов в отдельную таксономическую группу получило подтверждение на уровне структуры вируса.

Основной капсомер

• Вершинный капсомер

О Декорирующие шипы

Рис. 12 - Пространственная крио-ЭМ реконструкция капсида бактериофага КМV. Оттенками цвета выделены различные капсомеры на поверхности

С целью выяснения белка, формирующего шипы капсида. мы клонировали в векторы экспрессии гены фага КМУ, кодирующие структурные белки, не имеющие гомологов в Т7-подобных бактериофагах, и разработали методы синтеза, выделения и очистки их растворимых продуктов. В случае поликлональиых мышиных сывороток

против рекомбинантного белка КМ\^р47 устойчивое связывание с частицами фага относительно хвоста фага (рис.13).

иммуно-ЭМ изображения показывают КМУ, причем в различных позициях

Рис.13 Иммуно-ЭМ. Суспензию фага КМУ инкубировали с сывороткой против КМ\^р47. а затем с вторичными антителами, конъюгированными с частицами золота (10 нм). Образцы контрастировали 1%-ным

уранил ацетатом.

Результат этого эксперимента позволяет достоверно предположить, что КМ\^р47 если и не формирует декорирующие шипы капсида самостоятельно, то во всяком случае, входит в комплекс белков, их формирующих. Локализация белков, входящих в состав минорных элементов частицы, в перспективе позволит использовать такие белки как матрицу для дисплея различных пептидных элементов на поверхности бактериофага.

III. Исследования индивидуальных белков бактериофагов Р. aeruginosa

III.I. ELgpl46 - уникальный шаперонин бактериофага

Шаперонины - широко распространенные молекулярные комплексы, которые управляют укладкой синтезированных полипептидных цепей в термодинамически стабильную нативную третичную или четвертичную структуру (фолдингом). Шаперонины подразделяют на группы I и II на основе необходимости в кошаперонине для их функционирования, и гетерогенности субъединиц. Шаперонины группы I являются гомоолигомерами, состоящими из 7 субъединиц в каждом из двух колец, и требующими наличия ко-шаперонина. Шаперонины этой группы хорошо изучены на примере системы (Е. coli GroEL/ES). Шаперонины функционируют в АТР-зависимом двустадийном режиме, когда в фолдинге белка участвует только одно из колец, в то время как другое кольцо задействовано в следующем цикле преобразования субстрата. Для группы I был впервые описан механизм шаперонин-управляемого фолдинга. В этом механизме субстрат присоединяется к АТР-связанному (цис) кольцу и закрывается ко-шаперонином GroES. Второе кольцо в это время находится в свободном от нуклеотида (транс) состоянии и предназначено для связывания с белком в следующем цикле фолдинга. Присоединение АТР к транс-кольцу запускает механизм отделения GroES от цис-кольца и высвобождения принявшго правильный фолд субстрата.

Известно, что бактериальная система шаперонинов GroEL/ES участвует в сворачивании вирусных белков в процессе морфогенеза бактериофага во время инфекции. Бактериофаги Т4 и RB49 используют шаперонин клетки-хозяина, но кодируют свой собственный ко-шаперонин. Вирусный кошаперонин позволяет формировать более глубокую полость, чем бактериальный GroES и, таким образом, обеспечивать фолдинг тех вирусных белков, которые конформационно не помещаются в бактериальную систему.

Шаперонин бактериофага EL - первый и до настоящего времени единственный ортологический шаперонин, обнаруженный в геномах фагов. Важно, что шаперонин EL функционирует по иному механизму, который включает разделение двух гептамерных колец с целью аккомодации больших вирусных белков-субстратов. Последовательность генома бактериофага EL выявила наличие гена 146, кодирующего продукт, имеющий сходство по последовательности с бактериальным шаперонином GroEL. Однако степень сходства (26%) слишком низка для надежного определения функции белка. Для того, чтобы выяснить, действительно ли gpl46 действует, как шаперонин, плазмидой, содержащей ген 146 фага EL, трансформировали gra£-дефицитный штамм Е. coli MGM100. Жизнеспособность клеток резко возрастала при индукции гена плазмиды. что свидетельствует о том, что ELgpl46 замещает бактериальный шаперонин GroEL в метаболизме клетки и выполняет аналогичные функции содействия фолдингу белков.

На основе пространственной реконструкции крио-ОМ изображений, полученных для трех конформационных состояний шаперонина gp 146 бактериофага EL, мы предположили наличие уникального механизма фолдинга белка, который имеет общие черты с механизмами действия шаперонинов групп I и II. По общему строению шаперонин EL похож на шаперонины группы I, так же имея в составе множественные копии одной субъединицы белка, организованные в два кольца с симметрией 7-го порядка. Общее свойство у ELgpl46 и шаперонинов группы II заключается в отсутствии кошаперонина. который прикрывает отверстие кольца и защищает внутреннюю полость. Ни одна из ORF генома фага EL не имеет гомологии с известными кошаперонинами. Кошаперонины клетки хозяина также никогда не отделялись в виде примесей при получении препарата ELgpl46. Реконструкция конформации белка со связанным ADP и апоконформации показывает, что функцию кошаперонина выполняет конформационная перестройка апикального домена, который прикрывает отверстие кольца по принципу «затвора». Помимо сходства с обеими группами известных

шаперонинов, белок ELgp!46 имеет ряд свойств, которые позволяют нам выделить его в отдельную, третью группу шаперонинов. Наиболее важное из них - формирование однокольцового интермедиата, индуцируемого гидролизом АТР. В целом, три различные конформации белка со связанными ATP, ADP, или без нуклеотидов можно представить как составляющие механизма фолдинга белков-субстратов, отличного от предложенного для GroEL (рис. 14).

Рис. 14. Гипотетический механизм действия шаперонина ELgpl46. АТР кооперативно и одновременно связывается с обоими кольцами комплекса. Открытая конформация (оранжевый цвет) позволяет субстрату связаться с апикальным доменом. После связывания субстрата АТР гидролизуется, запуская механизм перемещения апикального домена, закрывающего вход в полость, и экваториального домена, увеличивающего размер внутренней полости и разделяющего комплекс на два отдельных кольца (желтый цвет) Диссоциация ADP из участка связывания позволяет кольцам объединиться в закрытую двойную промежуточную конформацию (желто-зеленый цвет). Конечная апо-конформация представлена зеленым цветом. Связывание АТР открывает внутреннюю полость для выхода субстрата, уложенного в третичную структуру, и возвращает шаперонин в исходное открытое состояние

Первым этапом служит связывание с АТР и открытая конформация белка, предназначенная для связывания белка-субстрата. Связывание с субстратом служит

29

сигналом для гидролиза АТР. При гидролизе АТР и высвобождении неорганического фосфата происходит конформационная перестройка апикального домена, который образует крышку над отверстием внутренней полости и закрывает ее. Таким образом, субстрат фиксируется в полости, и внутренняя полость расширяется до 60А за счет перемещения центрального домена. Это перемещение не только увеличивает объяем внутренней полости, но и приводит к разделению колец, формирующих комплекс ELgpl46. Будучи отделенным от цитозоля, белок-субстрат принимает нужную конформацию. Детали строения внутренней полости еще предстоит выяснить, но, вероятно, задействован та же схема чередования гидрофобных и гидрофильных боковых цепей аминокислотных остатков, которая описана для GroEL.

Следующий этап механизма шаперонина EL включает в себя удаление ADP из участка связывания нуклеотидов, что приводит к движению экваториальных доменов белка по направлению к центру кольца на 45А. Это перемещение не только сжимает центральную полость до объема, примерно равного тому, что наблюдается в открытой АТР-связанной конформации, но и позволяет двум кольцам комплекса сойтись вместе. Связывание АТР со свободным участком связывания нуклеотидов стимулирует перемещение центрального домена еще на 15А в глубину полости и глобальное перестроение апикальных доменов, которое открывает вход внутрь полости.

■ 11.2. <pKZgp144 - Пептидогликанлизирующая трансгликозилаза

Анализ генома фага <pKZ выявил наличие белка <pKZgpl44 (260 а.о, 28815 Да), в котором результат поиска гомологии предполагает наличие домена, сходного с пептидогликан-лизирующими ферментами (ПЛФ). Каталитические домены <pKZgpl44 и другого белка того же фага, <pKZgpl81 имеют 52 % идентичности и 66% сходства последовательности. Вероятно, эти домены эволюционировали путем дупликации генов. Логично было бы предположить, что аналогично организации системы лизиса у фага Т4, меньший растворимый белок <pKZgpl44 выполняет роль эндо-ПЛФ. Однако практически все исследования протеома <pKZ показывали присутстствие <pKZgpl44 в наборе белков частицы фага. Количество <pKZgpl44 в протеоме варьирует, и вопрос о принадлежности этого ПЛФ к структурным белкам и его локализации остается открытым. Предположительно, <pKZgpl44 способен неспецифически связываться с частицей фага и присутствовать в структурном протеоме в виде устойчивой примеси. Анализ последовательности <pK_Zgp 144 также выявляет домен связывания с пептидогликанами в jV-концевой части белка. Это свидетельствует о том, что gp 144 - природный химерный белок, образовавшийся путем рекомбинации двух доменов. ПЛФ с множественными доменами или модулями встречаются в составе бактериофагов, инфицирующих грамположигельные бактерии, но в отличие от (pKZgpl44 такие белки несут пептидогликан-связывающий домен на С-конце полипептидной цепи. Растворимые эндо-ПЛФ бактериофагов, инфицирующих грамотрицательные бактерии, представляют собой одномодульные ферменты, за исключением родственных белков. Таким образом, (pKZgpl44 и его гомологи из (pKZ-подобных фагов (ELgpl88 и 20l<p2-lgp276 - первые найденные в природе олигомодульные ПЛФ грамотрицательных бактерий.

III.2.I. Структура белка q>KZgpl44 была определена нами с помощью ренгтеноструктурного анализа с разрешением 2,5А. Кроме того, была определена кристаллическая структура (pKZgpl44 в комплексе с хитотетраозой (GlcNAc)^, тетрамером N-ацетилглюкоэамина. Третичная структура белка фермента (рис. 15), как и было предсказано из анализа последовательности полипептида и физико-химических экспериментов, четко разделяется на два преимущественно а-спиральных домена,

включающих остатки I - 70 в пептидогликан-связывающем домене, и остатки 71- 260 в каталитическом центре фермента.

Рис. 15. Структура белка <рК^р144. Ленточная диаграмма. Градиент окрашивания полипептидной цепи от синего на /У-концс до красного на С-конце. Показана модель хитотетраозы, лежащая в активном центре фермента

iV-Концевой домен <pKZgpl44 представляет собой пучок из трех спиралей (рис.15). Область /V-конце вой метки His-tag частично видна на карте электронной плотности. N-Концевой домен имеет в своем составе три неспаренных остатка цистеина, два из которых экспонированы к растворителю и могут образовывать межмолекулярные дисульфидные связи с формированием в растворе белка лабильных димеров и тримеров. которые наблюдались при физико-химическом исследовании ipKZgpl44, Как предполагалось, по структуре /V-концевой домен <(>KZgpl44 сходен с предсказанным N-концевым доменом связывания с пептидогликаном D-Ala-D-Ala-рэсщепляющей карбоксипептидазы Streplomyces albus G (PDB 1D: llbu). Домены с похожими аминокислотными последовательностями были обнаружены в некоторых ферментах, разрушающих бактериальные клеточные стенки, а также в белках, ассоциированных с клеточной поверхностью. Подобно <pKZgpl44 и O-Ala-D-Ala карбоксипептидазе, такие многомодульные ферменты имеют, помимо активного центра, дополнительный домен на N- или С-конце белка. Предположительная функция таких доменов - дополнительное связывание и координация субстрата.

С-Концевой домен <pKZgpl44 (остатки 70 - 260) имеет существенное структурное сходство, особенно в области остатков 91 — 213, с литическими трансгликозилазами семейства 1. которое представлено в базах данных белком SLT70 E.coli. Субстрат-связывающие бороздки SLT70 и ПЛФ могут вмещать 6 остатков Сахаров в участках, обозначенных А, В, С, D, Е и F (рис. 15). Расщепление происходит между остатком N-ацетилмурамовой кислоты, связанном в позиции D, и А-ацетилглюкозамином, связанным в позиции Е. Структура <pKZgpl44 в комплексе с хитотетраозой показывает, что GlcNAc связан в участках А, В, С и D.

Масс-спектрометрический анализ продуктов разложения пептидогликана ферментом <pKZgpl44 подтвердил, что фермент по направленности действия представляет собой литическую трансгликозилазу. Ферменты этого типа гидролизуют Р(1,4)-гликозидную связь между А-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином, и формируют новую связь гликозидного центра мурамовой

кислоты с ее гидроксильной группой при Сб. Муралитическая активность рекомбинантного <pKZgpl44 составляет 2.1 х1012 ед/моль, что в 143 раза выше, чем у лизоцима из яичного белка. Максимум активности <pKZgpl44 достигается при рН 6,2 и ионной силе, соответствующей 120 мМ NaCl.

Добавление <pKZgpl44 к растущим клеткам P.aeruginosa вызывает только временное ингибирование роста бактерий. Однако при добавлении gpl44 к бактериям, обработанным хлороформом, происходит эффективное расщепление клеточных стенок и лизис бактерий. Обработка хлороформом пермеабилизует внешние мембраны клеток, давая доступ к пептидогликану снаружи. <pKZgpl44 может лизировать обработанные хлороформом клетки нескольких видов грамотрицательных бактерий, но неэффективен против грамположительной микрофлоры.

III.2.2. Механизм реакции, катализируемой <pKZgp)44. Предполагаемая модель «дублирующего активного центра».

Каталитический остаток Glu (pKZgp 144 расположен между позициями D и Е связывания субстрата (рис. 15). В соответствии с предполагаемым механизмом реакции литических трансгликозилаз (рис. 16) (Holtje et al. 1975) единственный ключевой остаток Glu"'' выступает как донор протона для атома кислорода в гликозидной связи между MurNAc (остаток D) и GlcNAc (остаток Е). Затем Glu11" удерживает протон гидроксильной группы С6 в составе интермедиата - мурамоил оксазолинового иона, что приводит к образованию 1,6-ангидромурамовой кислоты.

нет« eisuc i. t-onup* мигшьс aim«

ОЬ

IT-CM

Рис.16. Реакция (А) и предполагаемый механизм расщепления пептидогликана (В), катализируемого литическими трансгликозилазами

В отличие от трансгликозилаз, лизоцим белка куриного яйца имеет 2 каталитических аминокислотных остатка. Glu и Asp. Каталитический центр <pKZgpl44 не имеет других кислотных остатков в окружении позиций связывания Сахаров D и Е. Предполагаемый механизм катализа (pKZgp 144 подразумевает, что остаток Glu"5

должен оставаться протонированным при физиологических рН. Однако теоретическое вычисление значения рКа для Glu"5 на основе уточненной рентгеновской структуры дает очень низкое значение 1,1, что предполагает депротонированную форму остатка Glu"5. Мутагенез Glu"5 показал, что мутант <pKZgp!44 не теряет ферментативной активности полностью, а сохраняет около 30% активности фермента дикого типа. Из всего этого следует, что строение активного центра и аминокислотные остатки, участвующие в катализе, отличаются от канонической модели.

Для экспериментального подтверждения остатков, принимающих участие в работе активного центра, был синтезирован ряд одиночных и двойных мутантов по этим аминокислотам. Введение точечных мутаций не приводило к существенному изменению растворимости или вторичной структуры (по результатам КД). Одинарные мутанты <pKZgpl44 по Glu"5, Glu1 Туг 147 и Туг 47 в отдельности имели остаточную активность около 50% по сравнению с исходным белком. Мутация остатков His приводила к снижению активности на 20-30%, что подтверждает предположение об участии остатков гистидина в координации субстрата. Наша основная гипотеза предполагает наличие двух каталитических участков - основного Glu"5 " Туг147 и дублирующего Glu14* " Туг И7. Расположение аминокислот предполагаемого активного центра схоже с расположением аминокислот основного активного центра (рис. 17). Совмещение положения боковых цепей остатков «основного» и «дублирующего» активного центров с помощью вычисления минимального среднеквадратичного отклонения показывает практически одинаковую позицию.

Таблица 7 Изменение активности двойных мутантов <pKZgpl44.

Состояние Нативное Мутант Мутант Мутант

Активный центр-1 £115 у!1" Eii!Yi!ffF E"'A Y14' е"ьа y""f

Активный центр-2 £|7К у147 Е1'"A Y147 ЕтАУш gl ГЯ уМ '

Активность 100% 50% 0% 0%

Ключевой функциональной группой, осуществляющей атаку на Р(1,4) гликозидную связь, служит боковая цепь глутаминовой кислоты. При ее замене в обоих активных центрах (Е"5А, Е'™А) происходит полная инактивация фермента, а мутация в одном из активных центров приводит к общему снижению активности фермента на 50-70%. Одиночные мутации по тирозину также приводят к снижению активности фермента. Можно предположить, что остаток Туг фиксирует остаток Glu в наиболее выгодном с точки зрения протекания реакции положении. Замена Туг -> Phe приводит к смещению боковой цепи глутамата в сторону от выгодного положения и изменению активности мутантного сайта. В эксперименте с двойным мутантом Е|7*А, Y147F инактивации (pKZgpl44 не происходит. Несмотря на выключение одного из активных центров, вызванное заменой глутаминовой кислоты, второй активный центр сохраняет активность без остатка тирозина.

В этом контексте не совсем логична потеря активности мутантом (Е|15А, YI47F), где полностью мутированы аминокислоты основного активного центра, а дополнительный не изменен. Для объяснения этого явления необходимо было рассмотреть как детали пространственного взаимодейстия белка с субстратом, так и возможные изменениями в конформации белка, вызванными мутациями.

Поскольку хитотетраоза. которая использовалась как эмулятор субстрата в экспериментах по кристаллизации <pKZgpl44, достаточно сильно отличается по своей конформации от естественного субстрата /V-ацетилмурамоил-А'-ацетилглюкозамина, был проведен молекулярный докинг по вычислению возможных конфигураций связывания субстрата с молекулой белка. Наиболее вероятное расположение субстрата в бороздке

33

активного центра показано на рис. 18. В связи с тем. что пептидогликан (естественный субстрат фК^р144) имеет положительный поверхностный заряд за счет атомов азота, можно предположить, что заряд на поверхности фермента имеет большое значение для координации и связывания с субстратом. Вычисление поверхностного заряда глобулы белка фК2^р144 показывает, что бороздка связывания субстрата имеет преимущественно отрицателььный заряд.

Рис. 17. Боковые цепи аминокислотных остатков, формирующие активные центры фKZgpl44 и возможное расположение молекулы \1urNAc-GlcNAc. На верхних рисунках изображен общий вид фермента без субстрата (сверху слева) и с субстратом (сверху справа). На нижних рисунках крупным планом изображены сайты связывания фермента без субстрата (снизу слева) и с субстратом (снизу справа).

Для дополнительной оценки изменения конформаций белка при различных заменах был проведен молекулярно-динамический анализ конфигурации бороздки, путем оценки ее формы и и расстояний между Са атомами остатков, формирующих внешний створ бороздки. В случае некоторых мутаций, видимо, происходит нарушение сети взаимодействий между боковыми цепями а.о., формирующих активный центр, и область бороздки активного центра фKZgpI44 довольно сильно изменяет свою конформацию.

На основании кристаллической структуры ф!С^р144 и полученного методами докинга комплекса ф1<^р144 - МигЫАс-01сЫАс первым этапом ферментативного гидролиза является связывание субстрата с бороздкой на поверхности белковой глобулы, образуемой каталитическим доменом. Второй этапо катализа состоит в атаке Р( 1 -4) гликозидной связи и расщеплении субстрата. Очевидно, что замена аминокислот активных центров может повлиять на второй этап реакции. Однако мутация может привести и к изменению формы связывающей поверхности (бороздки), и к изменению распределения зарядов, что будет препятствовать правильной ориентации субстрата относительно аминокислот активного центра и блокировать всю реакцию в целом. Таким образом, можно предположить два механизма инактивации фН^р144 при точечном мутагенезе: непосредственная инактивация реакционного сайта, и изменение конформации молекулы, приводящее к неспособности фермента правильно координировать субстрат.

Мутант Н115А не обладает активностью, несмотря на то, что один из

реакционных центров остался в нативном состоянии и должен сохранить активность. Двойная мутация близкорасположенных аминокислот приводит к сильному изменению конформации связывающей субстрат поверхности и смене заряда в этой области бороздки. Такое изменение свойств поверхности, вероятно, не позволяет фК2ёр144 связывать субстрат, и фермент полностью теряет активность.

Мы предполагаем, что в полипептидной цепи трансгликозилазы шЬС^р144 существует два активных центра: основной Е115 У1" и дублирующий Е1™ У14'. Участок молекулы пептидогликана может связаться с бороздкой на глобуле фермента двумя способами (схематично изображено на рис.18). Предположительно, направление укладки субстрата имеет значение для протекания реакции и определяет, какой из активных центров проведет реакцию разрезания субстрата. То есть при инактивации одного из участков активного центра соответствующий способ укладки субстрата не будет приводить к реакции.

Рис. 18. Схема возможных направлений укладки субстрата в бороздку фЮ^р!44. Субстрат (/У-ацетилмурамоил-/У-ацетилглюкозамин) показан над стрелкой.

111.3. фК/.цр131 - Белок хвостовой фибриллы бактериофага фК/..

Изучение генома и протеома фага фК_/. выявляет группу белков-паралогов (продуктов генов, образованных дупликацией одного) ф!С^р132, ёр!33, вр134 и gpl35, которые все участвуют в формировании структуры хвостовой части фага. Сходство между паралогами фК2 проявляется только в Л'-концевой части последовательности. Высокое сходство лишь одной части последовательности и расположение генов этих белков в геноме указывают на возможную их роль в качестве хвостовых фибрилл или шипов, ответственных за узнавание и присоединение к клетке-хозяину. Консервативный Л'-концевой домен присоединяет фибриллу/шип к вирусной частице, а вариабельный С-концевой домен связывается с различными рецепторами на поверхности инфицируемой клетки. Кроме того, у фК2-подобных фагов имеются ортологи (продукты аналогичных по функции генов, явно имеющих общее происхождение) группы белков фК^р131-135: ЕЬёр 112-115, 201ф2-1цр216-220 и фPAЗgpl50-154. Непосредственными ортологами самого большого белка группы, фКгёр131 служат, соответственно, фPAЗgpl50 и 201ф2-1ёр216. Л'-концевые домены всех белков каждой группы проявляют более заметный консерватизм последовательности, чем С-концевые части. Только 46 из 400 а.о. полностью консервативны во всех трех белках в части полипептидной цепи, соответствующей ёр 131С. Поэтому белок фКгёР131 рассматривается как наиболее вероятно входящий в состав хвостовых фибрилл, и был выбран для детального изучения.

Сконструированный полноразмерный рекомбинантный белок ipKZgpl3I (771 а.о.) оказался малопригодным для структурных исследований, т.к. склонен к быстрой агрегации при повышении концентрации. Также белок подвергается специфическому протеолитическому (возможно, автолитическому) расщеплению, из продуктов которого более высокой стабильностью обладает С-концевая часть полипептида. Рекомбинантный фрагмент (pKZgpl31C (а.о 375-771), синтезировали в виде химерного белка с N-концевым присоединением пептидил-пролил-изомеразы E.coti SlyD. Белково-инженерная стратегия стабилизации белков во время рекомбинантного синтеза с помощью впоследствии отщепляемого домена, направляющего правильную укладку белка, была разработана в нашей лаборатории с использованием нескольких подобных доменов - «фолдонов». Подробное освещение темы использования химерных белков для получения правильно уложенных биологически активных белков выходит за рамки темы данной работы, поэтому детальное описание стратегии опущено. Получение фрагмента белка (pKZgpl31C в растворимой форме и не склонного к агрегации относится к успешным приложениям метода.

Кристаллическая структура <pKZgp!3IC представляет собой слегка искаженный семилопастной Р-пропеллер (рис. 19), каждая лопасть которого образована тремя антипараллельными р-тяжами. Лопасти соединены между собой с помощью петель и/или а-спиралей. На лицевой плоскости тороида р - пропеллера наблюдаются две выраженные выпуклости. Одна из них образована тяжами р9 и pi0 лопасти 3, а другая -тяжами pi7 и р18 лопасти 5.

Белок <pKZgpl31C проявляет устойчивость к действию SDS. Проба cpKZgpl31C, нагретая в течение 5 мин при 95°С мигрирует при SDS PAGE с подвижностью, соответствующей ~30 кДа. При этом полоса <pKZgpl31C, не подвергавшегося нагреванию, соответствует ~21кДа. Можно предположить, что без нагрева в присутствии SDS белок сохраняет структуру компактного тороида.

Рис.19. Кристаллическая структура С-концевого домена <рК2^р131 (йр131С). Ленточная диаграмма. Каждая лопасть пропеллера окрашена в отдельный цвет

Поиск белков, структурно сходных с (pKZgpl3IC в базе данных PDB с помощью алгоритма DALI дает 175 объектов соответствия. Это неудивительно, так как семилопастной пропеллер - достаточно распространенный элемент третичной структуры (фолд), не ассоциированный с какой-либо конкретной функцией. Белки подобного строения разнообразны как по организмам происхождения, так и по своей биологической роли. Например, наиболее сходными белками являются растительный

36

рецептор UVR8 Arabidopsis IItaliana (PDB ID 4D9S), регулятор конденсации хромосомы RCC1 Homo sapiens (PDB ID 3MVD), и предполагаемая убихитинлигаза HERC2 Homo sapiens (PDB ID 3K.CI). Ни один из 175 найденных белков не проявляет достаточного сходства с <pKZgpl31C. чтобы предположить функцию последнего.

В «семействе» белков с семилонастными p-пропеллерными фолдами (pKZgpl31C образует отдельную ветвь. В отличие от других белков, семилопастной (3-пронеллер у <pKZgpI3IC заметно искривлен, и между «лопастями» располагаются не только петли, но и a-спирали и р-тяжи (рис. 19). Во многих семилопастных p-пропеллерах боковые цепи аминокислотных остатков в составе петель часто вовлечены во взаимодействия с другими молекулами. В частности, в cpICZgpl31C во взаимодействиях могут участвовать остатки цистеина, из которых 4 расположены на поверхности белка. Интересно отметить, что из 175 белков, найденных программой DALI, только 4 вирусных. Три из них относятся к гидролизующим ферментам - эндосиалидаза фага K1F, гемагглютинин-нейраминидаза вируса парагриппа 5 и гемагглютинин-нейраминидаза вируса болезни Ньюкастла. Четвертый белок вируса Ectromelia, называемый семафорином, связывается с плексином клеток млекопитающих, таким образом управляя иммунным ответом. Семафорин - единственный известный вирусный белок, имеющий фолд семилопастного Р-пропеллера, у остальных пропеллерных белков вирусного происхождения этот домен шестилопастной.

Учитывая неравномерное распределение заряда и наличие нескольких ионов Mg2+ на поверхности молекулы белка, мы предполагали для белка <pKZgpl3IC функцию связывания с рецепторами на поверхности клетки или фермен тативную активность. Ни одно из этих предположений не подтвердилось. Наличие белка (pKZgpl31C в различных концентрациях в реакционной смеси не оказывало выраженного эффекта на инфекционную активность фага (pKZ в отношении клеток P. aeruginosa PAOI, как живых, так и обработанных хлороформом.

Местонахождение белка gp 131 в частице фага ipKZ было установлено визуализацией иммунных меток против <pKZgp 131С с помощью ЭМ негативного контрестирования. Было показано, что gp 131 находится на периферии базальной пластинки, где обычно располагаются выступающие из нее фибриллы (рис. 20). Этот результат согласуется с вышеприведенным анализом генома. Возможно, весь кластер генов q>KZ 131-135 кодирует белки, которые образуют периферию базальной пластинки и фибриллы.

Рис. 20. Локализация (pKZgpl31C в базальной пластинке бактериофага <pKZ, установленная с помощью антител против (pKZgpl31C, меченных частицами 10-нм золота (показаны стрелками).

III.4. SN gp43-белок центрального шипа вязальной пластинки РВ1-подобных бактериофагов

Бактериофаги с сократимыми хвостами (Myoviridae). пиоцины R-типа. профаг Serratia enlomophila. кассета вирулентности Pholorhabdus и система секреции типа VI грамотрицательных бактерий по принципу действия недавно были объединены в класс «сократимых систем инъекции». Эти системы представляют собой сложные макромолекулярные машины, состоящие из сотен белковых субъединиц 10-20 разновидностей, которые формируют сократимый чехол, внутреннюю несократимую трубку и базальную пластинку. В процессе действия системы инъекции способны преодолевать клеточную стенку и доставлять специфические белки и/или ДНК внутрь клетки. Предполагается, что специфический заостренный белковый комплекс, формирующий продолжение хвостовой трубки («аппарат протыкания клетки») физически протыкает внешнюю мембрану клетки в процессе сокращения хвостового чехла.

Для идентификации и определения структуры белка, формирующего аппарат протыкания у Myoviridae бактериофагов, мы моделировали предполагаемое строение базальной пластинки у РВ1 -подобного фага SN, которая устроена из меньшего числа белков и пространственно проще, чем у фага Т4 С помощью сравнения гомологии последовательностей белков базальных пластинок и молекулярного моделирования мы предположили мембранопроницающую роль для белка SNgp43 (221 а.о.). Этот белок был получен в рекомбинантной форме с помощью SlyD-белковой инженерии, получены белковые кристаллы, и путем рентгеновской кристаллографии мы решили пространственную струкутуру мембранопроницающего белка SNgp43 с разрешением

1.8Ä.

Рис.21. Кристаллическая структура 5^р43. Ленточная диаграмма. Полипептидная цепь каждого мономера окрашена в отдельный цвет

OB-fold

ß-спирал

наконечн»

Белок SNgp43 представляет собой шипообразный тример. состоящий из N-концевого олигонуклеотид/олигосахарид-свяэывающего домена(ОВ-1ЬИ), основной р -спирали и С-концевого домена-наконечника (рис.21).

Структура SNgp43 представляет собой треугольную призму длиной ок. I20Á, наибольшая ширина которой составляет 44Á. (рис 21). Три полипептидных цепи, составляющие тример. сильно взаимопереплетены. Около 35% всех экспонированных остатка мономеров SNgp43 скрыты внутри интерфейса тримера.

Остатки 1-17 SNgp43 образуют короткий сегмент с a-спиральной структурой. Собственно домен OB-fold сформирован остатками 18-92. Наиболее существенное отличие между этими доменами SNgp43 по сравнению с другими известными типами OB-fold заключается в длинной (20Á) шпилечной вставке между тяжами РЗ и р4 (рис 21). Подобная шпилька имеется также в структурах двух ортологов Т4 gp5 и T6SS VgrG. Ось домена OB-fold примерно параллельна оси тримера белкового комплекса.

Остатки 93-188 образуют домен p-спирали или p-призмы. В отличие от р-спиралей T4gp5 или P2gpV, где три цепи тримера образуют структуру, подобную штопору с чередованием р-тяжей из разных цепей, в белке SNgp43 домен состоит из р-слоя, состоящего из трех тяжей, расположенного с левым поворотом на 60° по отношению к домену OB-fold, а затем из трех поворотов переплетенной по часовой стрелке спирали. p-Спираль сужается к С-концу от 32А в диаметре (между внешними атомами Са) до 21Á. В начале спирали р-тяжи состоят из 6 а.о. с постепенным уменьшением до 4 а.о. На внешней поверхности p-спирали не обнаружено очевижных участков связывания углеводов или пептидов. У всех известных p-спиральных белков внутренняя поверхность спирали гидрофобна и обычно содержит большое число боковых цепей Val, Leu, lie, а также Phe, Met и Cys. Эта закономерность соблюдается и для р-спирали SNgp43.

С-Конец P-спирали заканчивается доменом-наконечником. Мономер этой тримерной структуры представляет собой 2 коротких р—тяжа, формирующих антипараллельный слой, расположенный вдоль оси тримера. и р-шпильки, которые в тримерной структуре сходятся вместе. Таким образом, диаметр домена сужается с 21 до 8Á. Внешняя поверхность вершинного домена образована остатками Gly, Ser и Tlir. Вершинный домен содержит атом железа, расположенный по центру и координированный 6 остатками His, имеющими характерную последовательность НхН. Ион железа, вероятно, играет двоякую роль, участвуя в процессе укладки белка в тример, удерживая вместе полипептидные цепи, и обеспечивая дополнительную стабильность вершинному домену в зрелой форме белка.

Структура SNgp43 показывает, что вершинный домен шипа представляет собой острую и стабильную структуру, сформированную тремя полипептидными цепями с общей координацией атома Fe. Белок SNgp43 и его делеционные мутанты устойчивы к диссоциации на мономеры в присутствии денатурирующих агентов. Хотя детали взаимодействия вершинного домена с мембраной неизвестны, структура SNgp43 и биофизические данные поддерживают гипотезу, что центральные шипы базальных пластинок служат белками, физически протыкающими мембрану, и не претерпевают конфирмационных изменений при контакте с мембраной.

111.5. <|>KZgpl81 - Структурный пситндог.чикннлпзирующпй фермент

Второй белок, кодируемый геномом q>KZ, который имеет в своем составе предсказанный домен с ПЛФ-активностью - (pKZgpl81. Это большой (2237 а.о.) полипептид, однозначно идентифицируемый в структурном протеоме бактериофага. Этот белок имеет выраженные гомологи в составе (pKZ-подобных фагов (ELgpl83 и 201(p2-lgp276), что подчеркивает важность его роли в жизненном цикле бактериофага.

Подвижность полосы белка <pKZgpl81 в SDS-PAGE. пептиды, идентифицированные посредством MS, и секвенирование Л/-концевой части белка по Эдману показывают отщепление М-концевых 144 а.о. в зрелой форме белка. Поиск гомологов ipKZgpl 81 в базах данных по последовательности гена и аминокислотной последовательности идентифицирует только ближайшие ортологи из (р KZ-подобных фагов. Однако анализ элементов предсказанной вторичной структуры с помощью алгоритма HHpred позволяет предположить, что /V-концевая часть белка ipKZgpl 81 служит белком «рулетки» (tape measure protein), который определяет длину хвоста бактериофага. Это предположение объясняет высокую гидрофобность и низкую растворимость и протеолитическую устойчивость полноразмерного рекомбинантного белка (pKZgpl81. Что касается С-концевой части (pKZgp 181. то эта последовательность (а.о. 1866-2051) проявляет около 66% сходства с последовательностью каталитического домена эндо-ПЛФ ipKZ gpl44. Можно предположить, что по механизму каталитического действия (pKZgp 181 также является литической трансгликозилазой. Остаток глутамата, непосредственно осуществляющий катализ, консервативен в (pKZgp 144 и gpl81(Glu"5 и Glu' соответственно). Однако «дублирующий» активный центр в (pKZgp181 скорее всего отсутствует или имеет меньшее функциональное значение, т.к. место остатка Glu17" (pKZgp 144 в последовательности белка <pKZgpl8l3aHHMaeT остаток Asp1960 Также в белке <pKZgpl81 отсутствует специализированный домен связывания с пептидогликаном, соответствующий N- концевой части ipKZgp 144. Предположительно, структура трансгликозилазного домена <pKZgpl8l и. в частности, участки связывания субстрата достаточно похожи на таковые у каталитического домена gpl44. Для выявления функциональных доменов были сконструированы различные делеционные мутанты С-конца (pKZgp 181 в соответствии с алгоритмом информационных координат аминокислотных остатков (IDIC-алгоритм). Все делегированные белки синтезировали в Е. coli с дальнейшей оценкой растворимости и активности.

Белок <pKZgpl81M3 проявлял токсичность по отношению к Е. coli, что свидетельствует о возможной активности, разрушающей клеточную стенку. Продукция наименьших по размеру мутантов ((pKZgpl81M5 - (pKZgpl81M9) приводила к формированию растворимых белков. Растворимость белка <pKZgpl8IM7 значительно увеличивалась при добавлении к /V-концу 17 а.о. (cpKZgpl8IM6). КД-спектроскопия растворимых делеционных мутантов выявляет преимущественно а-спиральную вторичную структуру.

Все растворимые делеционные мутанты <pKZgpl81 проявляют активность, кроме ipKZgpl8IM9. Таким образом, можно сделать вывод, что минимальным каталитическим доменом служит последовательность а.о. 1880 - 2042 (что соответствует по размерам мутанту фК-Zgp 181М8, который использовали для дальнейшей характеризации ферментативной активности). Можно предположить, что gpl81M9 входит в состав иглоподобной структуры, которая находится в центре ниже уровня базапьной пластинки и видна на крио-ЭМ реконструкции базальной пластинки <рКZ.

По свойствам ферментативной активности белок (pKZgpl81M8 достаточно близок по с подобным по последовательности эндо-ПЛФ <pKZgpl44. Активности <pKZgpl81M8 и (pKZgp 144 имеют максимум при pH 6.2. В целом, для q>KZgpl81М8 предпочтительна более кислая реакционная среда по сравнению с q>KZgpl44 (например, при pH 5.0 сохраняется 51% активности, а в случае ipKZgpl44 - лишь 24%. и напротив, при pH 8.0 «pKZgp 144 сохраняет 78% активности, a «pKZgpl81М8 - 42 %. Хотя оптимальная ионная сила достаточно близка для обоих белков (140 мМ для gpl81M8 и 120 мМ для gpl44 соответственно), gp181М8 проявляет заметную активность в более широком диапазоне ионной силы (до > 320 мМ).

По отношению к клеткам Р. aeruginosa с нарушенной внешней мембраной в качестве субстрата ферментативная активность при оптимальных условиях у белков (pKZgp 181М8 (только активный центр фермента) и <pKZgpl8IM6 (активный центр и

возможная «игла» - домен рецепгорного связывания) составляет 1.25 х 1012 ед/моль и 3.77 х 1012 ед/моль соответственно. Таким образом, присутствие С-концевого домена белка увеличивает активность примерно втрое.

Таблица 8. Основные свойства делеционных мутантов (рК2§р181

Мутант <pKZgpl81 Старт, a.o. Конец, a.o. Вектор Синтез белка в E.coli Раствори мость Актив носгь

gplSIMl 1594 2237 pET26 + - N/A

gp 181М2 1613 2237 pET26 + - N/A

gp 181МЗ 1661 2237 pQE30 токсичен N/A N/A

gpl81M4 1738 2237 pET26 + - -

gpl81M5 1744 2237 pET23 + + +

gpl8IM6 1863 2237 pET26 + + ++

gpl81M7 1880 2237 pQE30 + низкая ++

gpl81M8 1880 2042 pQE30 + + ++

gp 181M9 2043 2237 pQE30 + + -

N\A - невозможно определить наличие или отсутствие

Активность ipKZgp!81M6 примерно в 12 и 37 раз выше, чем у коммерческого лизоцима куриного яйца по отношению к тому же субстрату, но вдвое ниже, чем у (pKZgpl44. Как отмечалось выше, последний имеет дополнительный модуль связывания субстрата, что вероятно, влияет на активность. Каталитический домен структурного фермента <pKZ М8 значительно медленнее теряет активность под действием температуры (1 ч при 70°С для полной инактивации) по сравнению с эндо-ПЛФ <pKZgpl44 (10 мин при 60°С). Эти данные могут свидетельствовать о большей стабильности структурного каталитического домена, что отражает противодействие значительным механическим нагрузкам, которые этот белок испытывает в процессе инфицирования. Высокая термоустойчивость была ранее описана для структурного ПЛФ бактериофага KMV, который сохраняет 21% остаточной активности после 2 ч инкубации при 100°С.

Следует отметить, что ферментативное действие активных мутантов ipKZgpl81 проявляется не только на пептидогликане P. aeruginosa, но и в сравнимой степени на клетках Р. ßuorescens, Р. pulida, Е. coli, Salmonella typhimurium, Burkholderia solanacearum, Yersinia enterocolitica с внешней мембраной, обработанной хлороформом, то есть показывает для структурного фермента ipKZgpl81 значительно более широкий спектр субстратов, чем для самого фага ipKZ. который инфицирует лишь часть штаммов Р. aeruginosa.

Если рассматривать ферменты бактериофагов, связанные с лизисом бактерии-хозяина, как потенциальные «энзибиотики» для профилактики и лечения бактериальных инфекций, то более высокая стабильность структурных ферментов (или их отдельных доменов) делает их привлекательным кандидатным выбором. Например, рскомбинантное соединение пептидогликан-связываюшего домена ipKZgpl44 и каталитического домена cpKZgpl81 может обеспечить специфическое связывание с конкретным патогеном, сочетаемое с высокой активностью и стабильностью фермента.

III.6. (pPMGlgp31 - Нептндоглнканлнзирующаи трансглнкозилаза

Характерная особенность бактериофага (pPMGI — строго литический характер действия по отношению ко всем проверенным штаммам P. aeruginosa и образование ореола вокруг негативных колоний (рис. 5). Мы предположили, что наблюдаемое в присутствии фага образование ореола может быть обусловлено действием легко диффундирующего активного агента с небольшой молекулярной массой, вероятно, белковой природы. Такие ферменты, разрушающие полисахариды биопленок, были обнаружены у ряда бактериофагов. Однако возможен и иной механизм образования ореолов - продукция инфицированными бактериями специфических сигнальных веществ, которые при передаче к соседним клеткам активируют в них синтез собственных деполимераз полисахаридов. В этом случае, инициировать такой сигнал может один из небольших регуляторных белков бактериофага, идентифицировать который при анализе последовательности генома фага невозможно. Большинство белков фагов, которые регулируют клеточные процессы бактерий мало изучены и закономерности их последовательности и структуры неизвестны.

Для экспериментального поиска пептидогликан- и полисахаридрасщепляющих ферментов мы воспользовались сравнительно несложным методом скрининга экспрессионных библиотек, который позволяет быстро определять наличие закодированных ферментов в небольших геномах. Было проверено около 1000 клонов. Полисахариддеполимеразной активности по отношению к полисахариду устойчиво мукоидного штамма N44 P. aeruginosa, сравнимой с положительным контролем -альгинатлиазой Flavobacterium spp., в проанализированных колониях обнаружено не было. Таким образом, можно предположить, что ореол образуется при помощи сигнальной секреции бактериальных клеток без участия ферментативного механизма фага.

В 4 клонах была обнаружена пептидогликанлизирующая активность. Поскольку свойства мурамидазы бактериофага D3, близкого <pPMGI, ранее не были изучены, мы исследовали муралитический фермент PMGgp3l.

Поиск гомологий показал высокое сходство последовательности PMGgp31 с мурамоилгидролазами различных бактерий и бактериофагов, в том числе 55% гомологии с лизоцимом бактериофага К структура которого известна (участок последовательности PMGgp3l а.о. 16-59). Резонно предположить, что PMGgp31 также относится к трансгликозилазам и что консервативный остаток Glu25 формирует активный центр, а Туг"2 служит для координации субстрата. Рекомбинантный белок PMGgp3l (18,4 кДа) растворим и стабилен в растворе. Гель-фильтрация на калиброванной колонке показала, что белок в растворе представляет собой мономер. Анализ последовательности PMGgp31 и данные спектра КД показывает преимущественно содержание а-спиральной конформации белка. Эти результаты хорошо согласуются с пространственной моделью лизоцима бактериофага X. Фермент PMGgp3l эффективно разрушает клеточные стенки P. aeruginosa, обработанные хлороформом. Показано, что оптимум воздействия PMGgp31 на клеточные стснки Р. aeruginosa находится в интервале значений рН 6-8 и ионной силы, соответствующей 120 мМ NaCl. Белок не обладает термостабильностью и быстро теряет активность при нагревании выше 40°С. Эти параметры отличаются от оптимумов условий для большинства ПЛФ.

Активность рекомбинантного PMGgp3l по отношению к клеточным стенкам Р. aeruginosa составляет 2,82 ± 0,03 х Ю" ед/моль, что в 277 раз превышает активность лизоцима белка куриного яйца ив 11 раз - активность <pKZgpl44. Высокая активность белка может служить отражением универсальной роли единственного ПЛФ в составе генома фага cpPMGI (по аналогии с D3). С другой стороны, PMGgp31 оказывает лишь бактериостатическое действие на растущие клетки P.aeruginosa, то есть более оптимизирован в качестве эндофермента, задействованного на заключительной стадии

инфекции - «лизиса изнутри». Роль и механизм действия фермента при локальном разрушении клеточной стенки в начале инфекционного цикла остается невыясненной. Действие PMGgp31на клетки P.aeruginosa высокоспецифично, что характерно также для гомологичного лизоцима фага X и вызвано точной сгерической ориентацией субстрата в активном центре фермента. При синтезе рекомбинантного белка в E.coli и накоплении его в цитоплазме лизиса клеток не происходило. Косвенно этот факт подтверждает отсутствие гена вспомогательного порообраэующего белка (холина), который в большинстве случаев перекрывает ген фермента или находится внутри него. В этих случаях цитотоксический эффект на клетки, в которых происходит индукция, ярко выражен. Таким образом, вопрос о наличии и местонахождении гена холина в геномах ОЗ-подобных фагов остается открытым.

Идентификация и исследование новых цитолитических ферментов, способных разрушать патогенные бактерии - достаточно актуальная задача для биотехнологии, медицины и пищевой промышленности. В частности, важным источником таких белков служат бактериофаги, которые используют ПЛФ в осуществлении своего жизненного цикла. Описанная в этой работе рекомбинантная трансгликозилаза логического бактериофага фРМй I проявляет высокую активность в достаточно широком диапазоне условий и обладает высокой специфичностью. Эти свойства позволяют рассматривать PMGgp31 как потенциально перспективный объект (в комбинации с другими агентами, обеспечивающими доступ фермента к клеточной стенке) для медицинских и технологических приложений.

IV. ПЦР-система типнровяния бактериофагов P. aeruginosa

Для терапии синегнойных инфекций успешно применяются бактериофаги, в том числе и промышленно выпускаемые. Принципы селекции терапевтических бактериофагов в настоящее время в основном эмпирические, и не имеется строгой описательной базы, основанной на генетических данных. Некоторые из требований, предъявляемых к бактериофагам, используемым в составе терапевтических смесей, неразрывно связаны с изучением их генома. Знание полной последовательности генома фага позволяет проверить наличие генных модулей рекомбинации или транспозиции, свойственных умеренным фагам, генов факторов вирулентности или токсинов. Однако полное секвенирование геномов остается достаточно дорогой процедурой, особенно с учетом быстро меняющихся составов фаговых препаратов при адаптации их к новым штаммам патогенных микроорганизмов. В качестве более дешевой и технологичной альтернативы предложена система быстрого типирования имеющихся и de novo выделяемых бактериофагов P.aeruginosa на основе ПЦР-анализа, и на этом основании приведения состава терапевтических смесей фагов к оптимуму по генетическому составу. Сконструированная нами система быстрого отнесения на основе ПЦР-анализа имеющихся и de novo выделяемых бактериофагов синегнойной палочки P.aeruginosa к определенным группам позволяет выяснить пригодность тестируемого бактериофага к применению в составе терапевтических смесей фагов.

IV. 1. Анализ геномов бактериофагов P. aeruginosa.

На сегодняшний день в GenBank содержится более 60 полных геномов бактериофагов P.aeruginosa, что составляет 4% всех полностью секвенированных фагов. Практически исключительно в состав известных фаговых коктейлей входят бактериофаги Caudovirales (хвостатые). Имеющиеся в базе данных GenBank бактериофаги этого отряда можно подразделить следующим образом (табл.9):

Таблица 9. Свойства групп известных бактериофагов P.aeruginosa

№ Группа фагов Семейство Размер генома, т.п.о Число геномов Жизненн ый цикл

1 (pKZ-подобные Myoviridae 211-316 6 Литический

2 РВ1 - подобные Myoviridae 65-66 8 Литический

3 K.MV- подобные Podovirídae 42-43 8 Литический

4 N4- подобные Podoviridae 74 2 Литический

5 YuA- подобные Siphoviridae 59-59 3 Литический

6 LUZ24- подобные Podoviridae 45 2 Варьирует

7 D3- подобные Siphoviridae 56-57 6 Умеренный

8 Р2- подобные Myoviridae 35-36 2 Умеренный

9 119Х- подобные Podoviridae 42-43 2 Умеренный

10 Лямбдоидные Siphoviridae 43-44 2 Умеренный

11 FIO- подобные Siphoviridae 39-40 2 Умеренный

12 F116- подобные Siphoviridae 65 1 Умеренный

13 транспоэоны Siphoviridae 37-39 5 Умеренный

Частичное секвенирование de novo выделенных из природных источников бактериофагов P.aeruginosa показывает, что в подавляющем большинстве случаев их можно отнести к одному из вышеописанных видов. Таким образом, можно сделать некоторые предварительные выводы по пригодности тех или иных бактериофагов для терапевтических приложений:

1. Группы фагов 1-4 с достаточно высокой степенью уверенности можно тестировать в качестве составной части фаговых коктейлей.

2. Фаги из групп 5-8 можно рассматривать как кандидатные. Однако следует учитывать генетически заложенную возможность лизогенной конверсии и проводить интенсивную проверку на проявление лиэогении на широком спектре штаммов.

3. Фаги групп 9-13, способные к активной интеграции-транспозиции и токсической конверсии бактерий, должны быть исключены из использования в терапевтических целях.

За исключением фагов-транспозонов группы 13, объединяемых преимущественно по типу действия, а не по формально таксономическому родству, и отчасти группы 1, имеющей широкую вариабельность геномов на нукпеотидном уровне, выделенные группы бактериофагов сохраняют весьма высокую консервативность геномов. Основные различия геномов, определяющие принадлежность фага к отдельному виду, обычно находятся в высоко-вариативной области ранних генов, определяющих взаимодействия с клеточными системами хозяина, а также в генах хвостовых фибрилл и шипов, обусловливающих опознавание рецепторов на поверхности клеток-хозяев.

1V.2. Разработка ПЦР-снстемы определения генетической принадлежности бактериофагов

Анализ геномов бактериофагов показывает, что наиболее консервативными внутри каждой группы являются гены, кодирующие белковые продукты, формирующие структурные компоненты частицы фагов - икосаэдрическую головку (капсид) и хвост. Во всех случаях в качестве реперных консервативных генов были использованы гены мажорных или минорных белков капсидов. Были сконструированы и оптимизированы

последовательности праймеров для всех групп литических бактериофагов, и проведены ПЦР с использованием модельных фагов для определения оптимальных условий реакции.

Во всех случаях специфических праймеров к конкретным группам фагов образование единичного продукта со сходным количественным выходом наблюдалось в диапазоне температур отжига 57-64°С и концентрации Mg2+ 0,5 - 2,0 мМ. Установленная последовательным разбавлением матрицы чувствительность ПЦР-системы соответствует концентрации бактериофага 2 пг в пробе. Таким образом, минимально определяемой с помощью ПЦР тест-системы концентрацией бактериофагов в растворе примерно является 101 частиц бактериофага в 1 мл раствора. Внесение «искусственного загрязнения» - бактериальной ДНК E.coli в реакционную смесь в количестве до 200 нг заметного влияния на чувствительность реакции не оказывает. Тестирование селектривности ПЦР-системы было проведено в отношении тех групп бактериофагов Р.aeruginosa, для которых имеются репрезентативные коллекции, включающие не менее 10 бактериофагов, принадлежащих к определенной группе. В случае KMV-подобных, РВ1-подобных и YuA-подобных фагов ПЦР тест давал положительный сигнал в случае всех бактериофагов коллекции.

IV.3. ПЦР-ироверка наличии бактериофагов в коммерческих терапевтических препаратах.

Разработанные реакционные смеси для ПЦР-тестирования для всех основных известных типов литических бактериофагов, наличие которых с наибольшей вероятностью можно ожидать в промышленных терапевтических смесях фагов против псеводомонадных инфекций, были применены к промышленно производимым смесям лекарственных препаратов. Типичный агарозный гель, представляющий результат теста, приведен на рис.22._

Рис.22. Электрофоре ! в агарозном геле( 1%). 1 -6: результаты ГІЦР-реакций с препаратами № 1-6. соответственно (пары праймеров КМУ), 7 - маркер. 8 -позитивный контроль с использованием очищенной ДНК фага КМ V в качестве матрицы.

Для промышленных терапевтических смесей синегнойных бактериофагов, предоставленных ГИСК им. Тарасовича, были получены следующие результаты:

№1 - Бактериофаг синегнойный. Нижний Новгород, 100 мл, партия 11.07 КМУ

№2 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 06.08 КМУ

№3 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 08.08 КМУ

№4 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 11.08 КМУ

№5 - Бактериофаг синегнойный, Пермь, 20 мл, партия 0110 КМУ+ фКг

№6 - Бактериофаг синегнойный, 1 Іермь, 20 мл, партия 02.10 КМУ+ фКг

Таким образом, во всех смесях было установлено наличие Ро(1о\т<1ае КМУ-подобных бактериофагов, и в двух смесях - наличие МуоуИЛге <рК7 - подобных фагов. Обе группы фагов принадлежат к вирулентным, допустимым к применению в терапевтических смесях

IV.4. Титрование терапевтических смесей на штаммах P.aeruginosa и ЭМ-аналкз.

Принимая во внимание широкий штаммовый диапазон действия терапевтических смесей (больше, чем для каждого из известных индивидуальных бактериофагов), декларированное наличие в смесях нескольких типов фагов, и ограничение ПЦР-системы по чувствительности (уверенное определение фагов в концентрации > 103 бое), мы провели титрование терапевтических смесей для оценки количества негативных колоний (НК) различной морфологии. По результатам эксперимента в препаратах 1-4 достоверно подтверждается подавляющее количественное преимущество KMV-подобных фагов, что соответствует результатам исходного ПЦР-теста. Были проведены ПЦР-тесты с материалом, взятым из индивидуальных НК. Было еще раз подтверждено наличие KMV-подобных фагов во всех смесях и установлено наличие (pKZ-подобных фагов в смесях №5 и 6.

Поскольку титрование смесей в большинстве случаев давало несколько типов НК (бляшек) на газоне клеток P.aeruginosa, была проведена ЭМ-визуализация бактериофагов, входящих в состав смесей. Наблюдения подтвердили наличие во всех смесях бактериофагов семейства Podoviridae. относящихся к группе KMV-подобных. и крупных Myoviridae бактериофагов, относящихся к группе фКZ- подобных, в материале препаратов 5 и 6 (рис.23).

Помимо этого, как в материале терапевтических смесей, так и в материале НК наблюдалось небольшое количество бактериофагов мелких бактериофагов, принадлежащих к семействам Myoviridae и Siphoviridae, причем в материале некоторых негативных колоний и концентрация примесных бактериофагов, и их разнообразие были выше.

Рис.23. Исследование состава препарата бактериофагов №6. А - морфология НК на газоне штамма Ps.10 P.aeruginosa., В - ЭМ изображение негативного контрастиро-вания. В поле видны бактериофаги с морфологией, характерной для KMV- и (pKZ-подобных фагов.

ПЦР-сигнала дополнительно обнаруженные бактериофаги не дают, то есть либо их концентрация составляет величину ниже предела детекции ПЦР-системы, либо эти фаги относятся к группам, на геном которых детекционная система не разрабатывалась. Мы предположили следующие причины присутствия неидентифицированных бактериофагов в терапевтических смесях:

1. Поскольку состав образцов фаговых препаратов, из которых составляется терапевтическая смесь, охарактеризован недостаточно, возможно, что в образцах содержатся фаги нескольких видов. Такие фаги менее активны, и их влияние на общую активность препарата невелико. Однако так как это тоже псевдомонадные фаги, в культуре ферментации они также размножаются. Вероятно, на некоторых штаммах активность таких минорных фагов возрастает, и в материале бляшек их пропорция более заметна.

2. Все известные геномы штаммов P.aeruginosa содержат в своем составе группы генов, идентифицируемые как профаги. т.е. лизогены, захваченные в ходе эволюции. В литературе обсуждается возможность активации профагов как одного из ответов бактерий на массовую инфекцию бактериофагами. Генетика умеренных фагов, а тем более профагов P.aeruginosa изучена плохо, поэтому детекции таких вторичных фагов системой ПЦР не происходит.

Оба этих эффекта требуют дальнейшего углубленного изучения, однако следует заметить, что и доля таких «вторичных» фагов, и их активность значительно ниже, чем литических KMV- и ipKZ-подобных фагов, составляющих основное содержание терапевтических смесей.

ВЫВОДЫ

1. Впервые определены и аннотированы в GenBank полные последовательности ДНК-геномов бактериофагов P.aeruginosa РВ1 (NC_0118(0), SN (NC_011756), 14-1 (NC_0l 1703), LMA2 (NC_0I1166), LBL3 (NC_011165), YuA (NC_010116), cpPMGl (NC_016765.1). На базе проведенного сравнения геномов родственных фагов предложено обоснование новых таксономических родов PBl-подобных (рассмотрено и ратифицировано ICTV в 2011 г.) и YuA-подобных (рассмотрено 1CTV в 2012 г., ожидает ратификации) бактериофагов;

2. На основе реконструкции крио-ЭМ изображений впервые построены пространственные модели капсидов бактериофагов KMV, SN (РВ1-подобный). YuA. По результатам анализа протеомов фагов иммуно-ЭМ методами показана локализация в вирусной частице белков <pKZgpl31, SNgp22 и SNgp29, YuAgp57 и YuAgp63, KMVgp47

3. Закодированный в геноме ipKZ-подобного бактериофага EL первый обнаруженный вирусный шаперонин ELgpl46 получен в рекомбинантном виде, с помощью крио-ЭМ реконструкции построены модели его конформационных состояний, предложена схема его функционирования.

4. Методом рентгеновской кристаллографии впервые определены структуры белков cpKZgp 144 (трансгликозилаза, разрешение 2,ЗА), С-концевого домена <pKZgpl31 (хвостовая фибрилла, разрешение 1,9А), SNgp43 (центральный шип базальной пластинки, разрешение 1,8А). Для первого обнаруженного многодомеппого ПЛФ бактериофагов грамотрицательных бактерий q>KZgpl44 экспериментально подтверждено наличие неканонического активного центра.

5. Впервые разработана ПЦР-тестовая система определения таксономической принадлежности бактериофагов P.aeruginosa в контексте использования в терапевтических препаратах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Обзоо:

1. Мирошников К.А., Чертков О.В., Назаров П.А., Месянжинов ВВ. Пептидогликанлиэирующие ферменты бактериофагов как потенциальные противобактериальные препараты. Успехи биологической химии. (2006). Т.46. С.65-96

Экспериментальные статьи:

2. Sycheva L.V., Shncider М.М., Sykilinda N.N., Ivanova M.A., Miroshnlkov K.A., Lciman P.G. Crystal structure and location ofgpl31 in the bacteriophage phiKZ virion // Virology., 2012 V.434, p.257-265

3. Molugu S.K., Hildenbrand Z.L., Tafoya D., Негтега N., Morgan D., Sherman M., He L., Kurochkina L.P, Mesyanzhinov V.V., Miroshnikov K.A., Bemal R.A. Unique bacteriophage encoded chaperonin has evolved a novel protein folding mechanism // Life Science. 2013 (in press)

4. Крылов С.В., Плетенева Е.А., Буркальцева М.В., Шабурова О.В., Мирошников К.А., Лавинь Р., Корнелиссен А., Крылов В Н. Нестабильность генома фагов вида EL Pseudomonas aeruginosa: Исследование мутантов, проявляющих вирулентность.// Генетика. 2011. Т. 47. №2. С. 183-189

5. Chuprov-Netochin R.N., Amarantov S.V., Shneider M.M., Sykilinda N.N., Filchikov M.V., Ivanova M.A., Mesyanzhinov V.V., Miroshnikov K.A. Peptidyl-prolyl isomerase SLyD controls the recombinant folding of bacteriophage T4 long tail fibers // Biopharmaceutical J. 2011. V. 3.№l. p.30-36

6. Чертков О.В., Чупров-Неточин Р.Н., Легоцкий С.В., Сыкилинда H.H., Шнейдер М.М., Иванова М.А., Плетенева Е.А., Шабурова О.В., Буркальцева М.Б., Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н., Клячко Н.Л., Мирошников К.А. Свойства пептидогликанлизирующего фермента бактериофага (pPMG 1 Pseudomonas aeruginosa // Биоорганическая химия. 2011. Т.37, № 6, С. 1-8

7. Крылов В.Н., Мирошников К.А., Крылов С.В., Вейко В.П., Плетенева Е.А., Шабурова О.В., Буркальцева М.В. Межвидовая миграция и эволюция бактериофагов рода <pKZ - цель и критерии поиска новых (pKZ-подобных бактериофагов.// Генетика. 2010. Т. 46. №2. С. 159-167.

8. Плетенева Е.А.. Крылов С В.. Шабурова О.В., Буркальцева М.В.. Мирошников К.А., Крылов В.Н Псевдолизогения бактерий Pseudomonas aeruginosa, инфицированных (pKZ-подобными фагами // Генетика. 2010. Т. 46. № 1. С. 26-32.

9. Фильчиков М.В., Осмаков Д.И., Логовская Л.В., Сыкилинда H.H., Кадыков В.А., Курочкина Л.П., Месянжинов ВВ. Бернал P.A., Мирошников К.А. Пространственная реконструкция капсида и идентификация поверхностных белков бактериофага SN Pseudomonas aeruginosa электронно-микроскопическими методами. // Биоорганическая химия. 2009. Т. 35. № 6. С. 808-815.

10. Шабурова О.В., Крылов С В., Вейко В.П.. Плетенева Е.А., Буркальцева М.В,, Мирошников К.А.. Корнелиссен А., Лавинь Р.. Сыкилинда H.H.. Кадыков В.А., Месянжинов ВВ.. Волкарт Г.. Крылов ВН. Поиск факторов разрушения бактериальных биофильмов: Сравнение свойств группы бактериофагов Pseudomonas putida и специфичности их продуктов, образующих ореол. // Генетика. 2009. Т, 45. № 2. С. 185-195.

11. Lecoutere Е., Ceyssens P.J., Miroshnikov К.А., Mesyanzhinov V.V., Krylov V.N., Noben J.P., Robben J., Herlveldt K., Volckaert G., Lavigne R. Identification and comparative analysis of the structural proteomes of (pKZ and EL, two giant Pseudomonas aeruginosa bacteriophages.// Proteomics. 2009 V. 9.№. 11. p.3215-3219.

12. Ceyssens P.J., Miroshnikov К., Mattheus W„ Krylov V., Robben J., Noben J.P., Vanderschraeghe S., Sykilinda N.. Kropinski A.M., Volckaert G., Mesyanzhinov V., Lavigne R. Comparative analysis of the widespread and conserved PBl-like viruses infecting Pseudomonas aeruginosa. // Environ Microbiol. 2009. V. 11. №. 11. p.2874-2883.

13. Briers Y., Volckaert G., Lavigne R., Miroshnikov K., Chertkov O., Nekrasov A., Mesyanzhinov V. The structural peptidoglycan hydrolase gpl8l of bacteriophage <pKZ. Biochemical and Biophysical Research Communications. // 2008. V. 374. № 4. p. 747-751.

14. Плетенева E.A., Шабурова О.В., Сыкилинда H.H., Мнрошннков К.А., Кадыков В.А., Крылов C.B., Месянжинов В В., Крылов В.Н. Изучение разнообразия в группе фагов вида РВ1 (Myoviridae) Pseudomonas aeruginosa и их поведение на адсорбционно-устойчивых мутантах бактерий. // Генетика. 2008. Т. 44. № 2. С. 185-194.

15. Ceyssens P.J., Mesyanzhinov V., Sykilinda N., Briers Y., Roucourt В., Lavigne R., Robben J., Dumashin A., Miroshnikov K., Volckaert G., Hertveldt K.The genome and structural proteome of YuA, a new Pseudomonas aeruginosa phage resembling Мб. // J. Bacteriol. 2008. V. 190. №4. P. 1429-1435.

16. Fokine A, Miroshnikov K.A., Shneider M.M., Mesyanzhinov V.V., Rossinann M.G. Structure of the bacteriophage <pKZ lytic transglycosylase gpl44. // J. Biol. Chem. 2008 V. 283.№ 11. P.7242-7250.

17. Мирошников K.A., Файзуллина H.M., Сыкилинда H.H., Месянжинов B.B. Свойства эндолитической трансгликозилазы бактериофага ipKZ Pseudomonas aeruginosa, кодируемой геном 144. // Биохимия. 2006. Т. 71. № 3. С. 379-385.

Благодарность.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту, учителю и наставнику проф. Месянжинову ВВ.; сотрудникам и аспирантам лаборатории молекулярной биоинженерии ИБХ: Шнейдеру М.М., Сыкилинде H.H., Курочкиной Л.П., Файзуллиной Н.М. Чупрову-Неточину Р.Н., Фильчикову М.В., Черткову О.В., Ивановой М.А. ; соисполнителям и коллабораторам: Крылову В Н., Летарову A.B., Куликову Е Е., Клячко Н.Л., Лейману П.Г., Соколовой О.С., Кадыкову В.А., Lavigne R., Ceyssens Р.-J., Bemal R.A., van Raaij M.J., Rossmann M.G., Steven A.C., Thomas J., всем коллегам, друзьям и семье за помощь и поддержку в научной работе.

Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 10 Экз. Заказ № 6758 пография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

! З - - 96 35

2013073391

2013073391

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Мирошников, Константин Анатольевич, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. Ломоносова Химический факультет

На правах рукописи

0520^.351156

Мирошников Константин Анатольевич

Геномика и протеомика литических бактериофагов

РБеийотопаз аегщтоБа

03.01.04 биохимия 03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................................................................................7

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................................................9

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................15

1.1. Общие сведения о морфологии, таксономии, экологи и эволюции

фагов..................................................................................................................................................................................................................................15

1.1.1. Жизненный цикл бактериофагов......................................................................................................15

1.1.2. Классификация бактериофагов на основе их морфологии..........................................18

1.1.3. Гипотезы о происхождении бактериофагов..............................................................................21

1.1.4. Роль бактериофагов в формировании биосферы..................................................................23

1.1.5. Структура микробных сообществ. «Убить победителя»................................................24

1.1.6. Влияние фагов на жизнеспособность бактерий....................................................................25

1.2. Разнообразие бактериофагов и современные методы их изучения и систематизации................................................................................................................................................27

1.2.1. Культуральные методы и их ограничения................................................................................27

1.2.2. Изучение разнообразия бактериофагов на основе единого локуса......................28

1.2.3. Изучение разнообразия бактериофагов метагеномными методами....................31

1.3. Применение бактериофагов для контроля и лечения инфекций,

вызванных патогенными бактериями..........................................................................................33

1.4. Пептидогликанлизирующие ферменты (ПЛФ) бактериофагов..............................36

1.5. Pseudomonas aeruginosa - микроорганизм-хозяин исследуемых бактериофагов......................................................................................................................................................42

1.5.1. Факторы вирулентности Р. aeruginosa............................................................................................44

1.6. Бактериофаги Р. aeruginosa........................................................................................................................46

1.6.1. Фаги бактерий рода Pseudomonas sp. Общие сведения..................................................46

1.6.2. Фаги Р.aeruginosa семейства Myoviridae......................................................................................54

1.6.3. Фаги Pseudomonas семейства Siphoviridae................................................................................55

1.6.4. Фаги Pseudomonas семейства Podoviridae..................................................................................60

1.7. Заключение..............................................................................................................................................................63

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................................................64

2.1. Использованные в работе материалы..............................................................................................64

2.1.1. Реактивы и растворы........................................................................................................................64

2.1.2. Штаммы бактерий..............................................................................................................................................64

2.1.3. Плазмиды..................................................................................................................................................................65

2.1.4. Культуральные среды....................................................................................................................................65

2.1.5. Олигонуклеотиды..............................................................................................................................................65

2.2. Основные методы..............................................................................................................................................65

2.2.1. Выделение бактериофагов........................................................................................................................65

2.2.2. Выделение бактериофагов в препаративных масштабах................................................66

2.3. Очистка бактериофагов................................................................................................................................66

2.3.1. Осаждение полиэтиленгликолем/ультрацентрифугирование в градиенте концентрации хлористого цезия............................................................................................................66

2.3.2. Гель-фильтрация на микропористом стекле..............................................................................67

2.3.3. Анионообменная хроматография........................................................................................................67

2.4. Выделение и рестрикционный анализ ДНК..............................................................................67

2.5. Определение последовательности геномов фагов................................................................68

2.5.1. Конструирование генной библиотеки для 8Ьо1^п-секвенирования....................68

2.5.2. Стратегия Сэнгеровского секвенирования..............................................................................69

2.5.3. Определение концов геномов................................................................................................................70

2.5.4. Компьютерный анализ последовательности геномов фагов......................................70

2.5.5. Экспериментальное определение промоторов........................................................................71

2.5.6. Создание экспрессионной библиотеки генома........................................................................72

2.6. Анализ протеомовфагов..............................................................................................................................72

2.6.1. Белковые профили фагов и зимографический анализ......................................................72

2.6.2. Масс-спектрометрическое определение белковвириона................................................73

2.7. Электронная микроскопия и реконструкция криоэлектронно-микроскопических изображений........................................................................................................75

2.7.1. Электронная микроскопия негативного контрастирования......................................75

2.7.2. Иммуноэлектронная микроскопия....................................................................................................75

2.7.3. Криоэлектронная микроскопия............................................................................................................75

2.7.4. Реконструкция изображений....................................................................................................................76

2.8. Молекулярное клонирование и экспрессия................................................................................76

2.8.1. Амплификация фрагментов ДНК........................................................................................................76

2.8.2. Встраивание фрагментов ДНК в векторную плазмиду....................................................76

2.8.3. Экспрессия генов и анализ растворимости рекомбинантного белка..................77

2.9. Выделение и очистка рекомбинантных белков......................................................................77

2.9.1. Преципитация сульфатом аммония....................................................................................................78

2.9.2. №-хелатная аффинная хроматография............................................................................................78

2.9.3. Анионообменная хроматография........................................................................................................78

2.9.4. Гель-фильтрация................................................................................................................................................79

2.10. Характеризация белков физико-химическими методами..............................................80

2.10.1. Определение олигомерности белка гель-фильтрацией....................................................80

2.10.2. Спектрометрия кругового дихроизма..............................................................................................80

2.10.3. Иммунизация........................................................................................................................................................80

2.10.4. Иммуноблотинг..................................................................................................................................................80

2.10.5. Детекция активности ПЛФ......................................................................................................................81

2.10.6. Количественное определение активности ПЛФ....................................................................81

2.11. Кристаллизация белков и рентгеновская кристаллография..........................................82

2.11.1. Синтез и очистка селенометионинового производного..................................................82

2.11.2. Кристаллизация белка и сбор рентгенографических данных....................................82

2.11.3. Решение структуры белка и построение модели..................................................................83

2.11.4. Молекулярное моделирование и докинг......................................................................................84

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ......................................................................................................................................................85

3.1. Хроматографическая очистка бактериофагов..........................................................................85

3.1.1. Хроматография на широкопористом стекле..............................................................................85

3.1.2. Ионообменная хроматография..............................................................................................................87

3.1.3. Контроль чистоты и целостности частиц....................................................................................88

3.1.4. Контроль пирогенности препаратов................................................................................................89

3.2. фК2-подобные бактериофаги семейства Муо\тйае..........................................................90

3.2.1. Общая характеристика и оценка биоразнообразия фК2-подобных бактериофагов......................................................................................................................................................90

3.2.2. Морфологическая характеристика фК2 - подобных бактериофагов..................92

3.2.3. Общая характеристика геномов фКг - подобных бактериофагов........................97

3.2.4. Протеомика фК2 - подобных бактериофагов........................................................................99

3.2.4.1. Белки вириона, ассоциированные с РНК-полимеразой................................................103

3.2.4.2. Протеолитический процессинг и предполагаемый состав «внутреннего

тела» головки фК2-подобных фагов................................................................................................105

3.2.5. Исследования индивидуальных белков фК2 - подобных бактериофагов... 107

3.2.5.1. Е1^р 146-уникальный шаперонин бактериофага..............................................................107

3.2.5.1.1. Открытая конформация (АТР)................................................................................................................109

3.2.5.1.2. Закрытая (АОР) конформация................................................................................................................111

3.2.5.1.3. Апо-конформация (без нуклеотидов)..............................................................................................112

3.2.5.2. фKZgpl44-Пeптидoгликaнлизиpyющaятpaнcгликoзилaзa....................................116

3.2.5.2.1. Структура Л'-концевого домена фК^р 144................................................................................119

3.2.5.2.2. Структура каталитического домена..................................................................................................121

3.2.5.2.3. Механизм реакции, катализируемой фKZgpl44. Предполагаемая модель

4

«дублирующего активного центра»..................................................................................................122

3.2.5.3. ipKZgpl81 - Структурный пептидогликанлизирующий фермент........................129

3.2.5.4. (pKZgpl31 - Белок хвостовой фибриллы бактериофага cpKZ....................................133

3.3. РВ1 -подобные бактериофаги семейства Myoviridae..........................................................139

3.3.1. Общая характеристика и оценка биоразнообразия РВ 1 -подобных бактериофагов......................................................................................................................................................139

3.3.2. Морфологические свойства вирусных частиц РВ1-подобных бактериофагов......................................................................................................................................................142

3.3.3. Свойства генома РВ1-подобных бактериофагов..................................................................143

3.3.4. Аннотация геномов РВ 1-подобных фагов..................................................................................145

3.3.4.1. Организация геномов РВ1-подобных фагов..............................................................................147

3.3.4.2. Кластер малых белков..................................................................................................................................150

3.3.4.3. Механизм ДНК-репликации..................................................................................................................150

3.3.4.4. Лизис клетки хозяина....................................................................................................................................152

3.3.5. Протеом РВ1 -подобных фагов..............................................................................................................152

3.3.6. Локализация белков в частице фага с помощью электронной

микроскопии............................................................................................................................................................154

3.3.7. Структурные исследования индивидуальных белков РВ 1 -подобных бактериофагов. SN gp43 - белок центрального шипа базальной

пластинки..................................................................................................................................................................157

3.4. YuA -подобные бактериофаги семейства Siphoviridae....................................................159

3.4.1. Общая характеристика и морфология бактериофага YuA..........................................159

3.4.2. Геном бактериофага YuA............................................................................................................................161

3.4.2.1. Регуляторные элементы генома YuA................................................................................................163

3.4.2.2. Метаболизм ДНК и репликация генома......................................................................................164

3.4.2.3. Взаимодействие с клеткой-хозяином..............................................................................................165

3.4.2.4. Кассета лизиса YuA......................................................................................................................................166

3.4.3. Протеом бактериофага YuA....................................................................................................................167

3.4.4. Реконструкция капсида YuA и ЭМ-локализация белков..............................................168

3.5. (pPMGl, ЭЗ-подобный литический бактериофаг семейства Siphoviridae... 170

3.5.1. Общая характеристика и морфология бактериофага <pPMGl....................................170

3.5.2. Геном бактериофага (pPMGl..................................................................................................................172

3.5.3. Аннотация генома фага (pPMGl............................................................................................................174

3.5.4. Исследования индивидуальных белков бактериофага (pPMGl..............................177

3.5.4.1. Поиск генов пептидогликан- и полисахаридлитических ферментов в

геноме tpPMG..........................................................................................................................................................178

3.5.4.2. <|)PMGlgp31 - эндолитическая трансгликозилаза............... ....................................178

3.6. KMV-подобные бактериофаги семейства Podoviridae......................................................180

3.6.1. Общая характеристика KMV— подобных фагов....................................................................180

3.6.2. Сравнительная геномика KMV-подобных фагов..................................................................181

3.6.3. Структурные белки KMV-подобных бактериофагов........................................................185

3.6.4. Реконструкция капсида KMV и ЭМ-локализация белков..............................................185

3.7. ПЦР-система типирования терапевтических бактериофагов P.aeruginosa 187

3.7.1. Анализ геномов бактериофагов P.aeruginosa........................................................188

3.7.2. Выбор реперных генов и синтез ПЦР-праймеров..................................................................190

3.7.3. Подбор и оптимизация условий проведения ПЦР на индивидуальные

типы бактериофагов........................................................................................................................................192

3.7.3.1. Выбор оптимальных праймеров ПЦР........................................................................................192

3.7.3.2. Подбор оптимальной температуры отжига праймеров в ходе ПЦР....................193

3.7.3.3. Проверка чувствительности реакций ПЦР................................................................................194

3.7.3.4. Проверка селективности реакций ПЦР..........................................................................................195

3.7.4. ПЦР-проверка наличия бактериофагов в коммерческих препаратах..................1967

3.7.5. Титрование терапевтических смесей на штаммах P.aeruginosa..............................198

3.7.6. Электронно-микроскопический анализ содержания бактериофагов в терапевтических смесях..............................................................................................................................199

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................................202

4.1. Хроматографическая очистка бактерифагов............................................................................202

4.2. Геномика бактериофагов P.aeruginosa..........................................................................................203

4.3. Протеомика бактериофагов и изучение отдельных семейств белков................205

4.4. Применение геномики и протеомики бактериофагов в медицинских приложениях..........................................................................................................................................................207

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................................................................208

БЛАГОДАРНОСТИ..................................................................................................................................................................209

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................................210

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ATP аденозинтрифосфат

BSA Bovine serum albumin - бычий сывороточный альбумин

CPG Controlled pore glass - микропористое стекло с контролируемым размером пор

CV Column Volume - объем колонки

DMPG димиристоилфосфатидилглицерин

DTT дитиотреит

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

ESI Electrospray Ionization - электроспрей масс-спектрометрия

GlcNAc N-ацетилглюкозамин

gp gene product -продукт гена

HEWL Hen Egg White Lysozyme - лизоцим куриного яйца

HIC Hydrophobic interaction chromatography - хроматография гидрофобного взаимодействия

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses - Международный комитет по таксономии вирусов

IEC Ion exchange chromatography — ионообменная хроматография

IPTG изопронил-Ьтио-р-В-галактопиранозид

LPS Lipopolysaccharides — липополисахариды

MOPS 3-[М-Морфолино]пропансульфоновая кислота

MS масс-спектрометрия

MS/MS тандемная масс-спектрометрия

MurNAc N-ацетилмурамовая кислота

OD optical density — оптическая плотность

ORF Open reading frame - открытая рамка считывания

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле

PBS Phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буфер

PMSF фенилметилсульфонилфторид

SDS Sodium dodecylsulfate - додецилсульфат натрия

ТАЕ трис - ацетатный буфер с EDTA

Tris трис (гидроксиметил) аминометан

WSA Whole Shotgun Analysis — «Метод дробовика», масс-спектрометрический анализ без предварительного разделения фрагментов протеолиза белка

а.о. аминокислотный остаток

БОЕ бляшкообразующая единица

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

дцДНК двухцепочечная (дуплексн