Изучение двух групп уникальных - ΦKZ-подобных и Т7-подобных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa

Буркальцева, Мария Владленовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение двух групп уникальных - ΦKZ-подобных и Т7-подобных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение двух групп уникальных - ΦKZ-подобных и Т7-подобных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa"

На правах рукописи

Буркальцева Мария Владленовна

ИЗУЧЕНИЕ ДВУХ ГРУПП УНИКАЛЬНЫХ - фКЗ-ПОДОБНЫХ И Т7-ПОДОБНЫХ - БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в лаборатории генетики бактериофагов Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор В.Н. Крылов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор C.B. Каменева

доктор биологических наук В.З. Ахвердян

Ведущая организация: Институт общей генетики РАН

Защита диссертации состоится "_" _ 2005 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, г. Москва, 1 -й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИ Генетика.

Автореферат разослан_ 2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

т^/

ШЬ-if

/ьзбЩ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время резко увеличилось количество сообщений о появлении клинических изолятов патогенных бактерий с множественной устойчивостью к антибиотикам (multi-drug-resistant bacteria). Как следствие этого возникла идея возрождения фаготерапии как метода лечения бактериальных инфекций Однако введение фаготерапии в широкую практику ограничивается определенной опасностью при использовании бактериофагов (фаговая конверсия, трансдукция и распространение островков патогенности и др.). Поэтому во всех работах, где рассматривается возможность применения фаготерапии, считается обязательным всестороннее изучение используемых бактериофагов, вплоть до определения полной последовательности геномов.

Среди патогенных бактерий особое значение имеют бактерии Pseudomonas aeruginosa. Они являются причиной раневых и ожоговых инфекций, осложнений после хирургических операций и поражений различных органов при иммунодефицитных состояниях и др. Р aeruginosa колонизирует легкие больных наследственным заболеванием кистозным фиброзом, что в конечном итоге приводит к легальному исходу. Этот вид микроорганизмов является этиологическим агентом 15-20% всех внутрибольничных инфекций. Такая частая встречаемость Р. aeruginosa среди клинических изолятов вызвана устойчивостью бактерий данного вида ко многим широко используемым антибиотикам а также их способностью легко и быстро образовывать биопленки, непроницаемые для антибиотиков и ферментов, а также генетических векторов, несущих гены, комплементирующие дефектный ген CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene) при кистозном фиброзе.

В настоящей работе мы провели детальное исследование двух групп бактериофагов Р aeruginosa, представляющих большой научный и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Первая группа исследованных фагов - это гигантские фК^-подобные бактериофаги. Фаги этой группы обладают широким спектром литической

активности и часто присутствуют в коммерческих препаратах для фаготерапии Первым из этой группы был исследован фаг фК2 Р aeruginosa [Крылов В.Н., Жазыков И Ж 1978], относящийся к семейству Myoviridae. Особые свойства фага (j>KZ: широкий спектр литической активности, очень большой конечный выход, гигантский размер фаговой частицы, необычный способ упаковки ДНК, а также особенности генома <fiKZ делают этот фаг интересным объектом как для фундаментальных, так и для прикладных исследований. Поэтому для первой части настоящей работы были поставлены следующие цели: дальнейшее изучение фага фК7, определение распространенности родственных ему фагов в популяциях Pseudomonas разных регионов, выделение в этих регионах новых <j>KZ-подобных фагов, их изучение и сравнение с ранее классифицированными фагами этой группы с целью оценки их родства и путей эволюции.

Целью второй части настоящей работы было исследование новой группы впервые выделенных бактериофагов Р. aeruginosa, стратегия развития которых сходна с фагом Т7 Е coli (фКМУ-подобные фаги). Эти фаги также обладают набором уникальных свойств и являются активными компонентами большинства фаготерапевтических смесей.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые исследована труппа гигантских фК2-подобных фагов Р. aeruginosa, выделенных в различных регионах. Фаги данной группы проявляют значительное сходство по многим генетическим и фенотипическим признакам: внешнему виду негативных колоний, размеру и морфологии фаговой частицы, широкому спектру литической активности, способности преодолевать подавляющее действие многих плазмид, размеру генома, устойчивости ДНК к действию определенных эндонуклеаз, способности к общей трансдукции и др. На основании проведенных исследований (в том числе сравнения спектра литической активности, инактивации сывороткой, рестрикционного и гибридизационного анализов фаговой ДНК, анализа полипептидного состава зрелых фаговых частиц, N-концевой последовательности мажорного капсидного белка и др.) проведена классификация фК2-подобных фагов. Сделан

вывод, что фаги этой группы являются филогенетически родственными и представлены тремя видами: <|>KZ, Lin68 и EL нового рода <j>KZ семейства Myoviridae. Показано, что доминирующими в природных популяциях являются бактериофаги вида фК2 (11 из 15 выделенных фагов данной группы) Фаг фК2 обладает наибольшим геномом (около 300 т.п.н.) среди вирусов бактерий с известной полной последовательностью ДНК. В геноме фКZ идентифицировано 306 потенциальных открытых рамок считывания, из них только 59 кодируют продукты с известной функцией. Шесть представлены собственными тРНК, остальные - в основном белками, связанными с метаболизмом предшественников нуклеиновых кислот. Особенностью фКZ является отсутствие генных продуктов, сходных с какой-либо из известных ДНК-полимераз и наличие у него генов, кодирующих белки, гомологичные продуктам различных эукариотических организмов и патогенных бактерий.

Впервые выделен и изучен Т7-подобный фаг фКМУ, активный на бактериях Р. aeruginosa и имеющий ряд уникальных свойств: очень большой размер негативной колонии, очень высокая скорость роста, рост на бактериях, утративших способность поддерживать росг других фаюв, устойчивость ДНК к очень большому количеству эндонуклеаз рестрикции и др. Геном фага фКМУ (42 519 п.н.) содержит 48 предполагаемых генов. Несмотря на отсутствие i омологии на уровне ДНК, 11 из 48 предполагаемых генных продуктов фага фКМУ, в том числе РНК-полимераза, белки, участвующие в репликации ДНК, некоторые структурные белки имеют сходство на аминокислотном уровне с белками Т7-подобных фагов энтеробактерий. Нами исследовано 8 новых фКМУ-подобных фагов, выделенных в различных регионах Все фКМУ-подобные фаги по совокупности генетических и фенотипических признаков отнесены к одному новому виду фКМУ семейства Podoviridae.

Обе группы изученных фагов представляют несомненный интерес для научных исследований и перспективны для практического применения. Особенности роста и развития являются ценными свойствами этих фагов применительно к фаготерапии. Их

литические ферменты могут быть потенциальными кандидатами на использование в качестве антимикробных агентов (энзибиотиков) в клинической терапии. Способность продуцировать свои собственные РНК-полимеразу или тРНК также делают эти фаги привлекательным объектом молекулярно-биологических исследований и биотехнологии.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит го введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 16 рисунков. Библиография включает в себя 193 отечественных и зарубежных литературных источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 1. фКг-ПОДОБНЫЕ БАКТЕРИОФАГИ

1.1. Сравнение биологических свойств фагов.

Бактериофаги и их происхождение. Происхождение фага фК2 - Казахстан [Крылов В.Н., Жазыков И.Ж. 1978]. Бактериофаги, которые позднее были отнесены к двум видам фК2 и 1лп68 [Кгу1оу У.М, То1тасЬоуа Т.О., АкЬуепНап У.Ъ., 1993], имеют разное происхождение. Фаг 1лп21 из тшшрующей коллекции Линдберга [1лпс1Ьег£ Я.В. е! а1., 1964] и фаг РТВ80 [Кгу1оу У.К, То1тасЬоуа Т.О., АкЪуегйап У.7„, 1993], выделенный из коммерческого препарата фагов, были отнесены к виду фК7. Бактериофаг 1лп68 из коллекции Линдберга [ТлпсШегд И.В. й а!., 1964], сходный с фКг по морфотипу и размеру

Таблица 1. Происхождение фкг -подобных бактериофагов

Бактериофаги Происхождение

фкг Казахстан

Ьшб8, Ьш21 коллекция Линдберга (США)

РТВ80, NN коммерческие препараты (Грузия, Нижний Новгород)

бь, ии-, ьвв (ьввго, ьвс21, ьввга, ьвсгз, ЬВв26) водоемы Москвы и Московской области

РВБ (РВБ1, РВ02, РВОЗ, РВ04) р. Дунай (Германия)

генома, был отнесен к другому виду. Новые фаги были выделены в нашей лаборатории в

ходе настоящей работы из различных природных водоемов и коммерческих

терапевтических препаратов (таблица 1).

Фенотип негативных колоний фагов. Характерный признак всех фК2-подобных

фагов - опалесцирующие («голубые») негативные колонии Негативные колонии фагов EL и

RU отличаются меньшим размером и более сильной опалесценцией

Морфология фаговых частиц. Частица

бактериофага фК7. обладает очень большими

размерами (рис 1)- диаметр икосаэдрической

головки составляет 120 нм, несокращенный

хвостовой отросток имеет длину 180 нм и

ширину 20 нм [Крылов В.Н и др , 1978.] Анализ

электронных микрофотографий фК7,-гюдобных

фагов показал, что размеры капсида у них

одинаковы У фага LBG22 обнаружен сходный с Рисунок 1. Частицы фага фКZ.

Lin68 признак - укороченный хвост (порядка 160 нм). Остальные фаги не отличаются по этому признаку от <t>KZ

Спектр литической активности. Учитывая использование <j>K.Z-подобных фагов в коммерческих терапевтических смесях, представляло интерес выяснить возможные отличия по спектру роста между данными фагами, прежде всего на клинических бактериальных штаммах, на фагоустойчивых мутантах и на штаммах с плазмидами.

Оказалось, что фаги исследуемой группы обладают наиболее широким спектром литической активности среди других вирулентных фагов P. aeruginosa и способны развиваться на 50-60% всех клинических изолятов, причем часто только фаги этой группы способны их лизировать. Использование всех других известных видов вирулентных фагов повышает долю лизируемых клинических штаммов не более чем на 20%.

Таблица 2. Дифференциация фКг-подобных бактериофагов по спектру логической активности.

Бактериофаги Бактерии

P. aeruginosa P.fluorescau №9 и №21 биовара IV

PAOl PAOl EL* (H. 14.17)* RV11 РАОЗОЗ (Rmsl48) PA038 (PMG53)

+KZ + + - - - -

Lin21 + + + - - -

РТВ80 + + + - - -

Lio68 + + + + - +

NN + + + - - -

EL + - + - - -

RU + - + - - -

LBG20 + + + - - -

LBG21 + + + - - -

LBG22 + + + + - +

LBG23 + + + - -

LBG26 + + + - -

PBD1 + + - - -

PBD2 + + + - -

PBD3 + + + - -

PBD4 + + + - -

(+) - наличие роста, (-) - отсутствие роста, * - три штамма, отличающиеся по морфологии колоний, отобранные по устойчивости к фагу EL; RVH - клинический изолят; PA0303(Rmsl48) и PA038(PMG53) - получены от д-ра Jacoby G.A. (США); штаммы Р. ßuorescens получены от д-ра Кочеткова В.В. (ИБФМ, Пущине)

Большинство плазмид из коллекции д-ра Jacoby G.A. (США), использованных в опыте (8 из 10) (PMG73, Rmsl39, PMG1, PMG35, Rmsl65, Rip64, RPL11, Rmsl63), не оказывали влияния на рост фагов изучаемой группы. Подавление обнаружено только в случае плазмид Rmsl48 (IncP9) и PMG53 (IncP2). Плазмида PMG53 полностью подавляет рост всех фК2-подобных фагов, a Rmsl48 - всех, кроме Lin68 и нового фага LBG22 (таблица 2).

Все фаги группы фК2 кроме EL и RU растут практически на всех 70 фагоустойчивых мутантах Р aeruginosa РА01, отобранных к различным бактериофагам в ходе настоящей работы и ранее. Лишь в редких случаях рост этих фагов немного ухудшается. Фаги EL и RU

растут на 50 фагоустойчивых мутантах Все мутанты, полученные как устойчивые к Е1, или 1Ш, не ограничивают рост остальных фагов данной группы.

Отличительной особенностью фагов 1лп68 и 1ЛЮ22 оказалась их способность инфицировать, хотя и с низкой эффективностью, два штамма родственного вида бактерий Р (1иоге$сет №9 и №21 биовара IV.

Инактивация сывороткой Использование специфической анти-фК7 сыворотки позволило распределить фК2-подобные фаги в три группы. Фаги 1лп21 и РТВ80 относящиеся к виду фКХ, а также большинство новых фагов полностью инактивируются анти-фКг сывороткой. Фаги Цп68 и 1Л022 инактивируются со значительно меньшей эффективностью. Фаги ЕЬ и Ю_Г совсем не инактивируются анти-фКг сывороткой. Таким образом, белки фаговой частицы, ответственные за адсорбцию, существенно различаются у разных представителей фК2-подобных фагов.

1.2. Сравнение геномов фагов.

Сравнение размеров геномов. Геном бактериофага фК2 содержит 280 334 п.н. [МевуапгЫпоу V V. й а!., 2002] Одинаковый размер капсидов фаговых частиц исследуемых фагов и данные рестрикционного анализа свидетельствуют, что размеры геномов других фК2-подобных фагов сопоставимы с размером генома фК7. (больше 250 т п н.), у фагов ЕТ. и * 1Ш размер генома может бьггь чуть меньше.

Сравнение рестрикционных профилей ДНК На рис. 2 приведены результаты рестрикции ДНК фК^-подобных фагов эндонуклеазой НтйШ. Четырнадцать из шестнадцати бактериофагов обладают уникальным рестрикционным профилем. По характеру рестрикции все фК2-подобныо фаги делятся на три группы. Первая группа - фаги да, 1ЛЮ20, 1ЛЮ21, ЬВ023, и 1Ж}26, а также фаги РВИ - проявляют значительное сходство с фагами, отнесенными ранее к виду фК2 (фК2,Тлп21 и РТВ80) и содержат много идентичных фрагментов ДНК, что свидетельствует об определенной ограниченности числа и распределения сайтов рестрикции в геномах этих фагов. Более того, ДНК двух пар фагов:

ЬВ021 - ЬВ026 и РВ01 - РВ02, выделенных из разных природных источников, оказались идентичны между собой по характеру рестрикции при использовании разных эндонуклеаз. В то же время, как было показано выше, фаги РВ01 и РВ02 отличаются по росту на штамме ЯУ11. Возможно, геномы этих фагов различаются точечными мутациями, неразличимыми при рестрикционном анализе.

1 2345678 ^1234567» А. 1234567»

а 6 в

Рисунок 2. Характер рестрикции ДНК фК2-подобных бактериофагов эидонуклеазой Шт! III: а: 1 -4,2 - фкг, 3 - Ьга21,4 - РТВ80, 5 - NN. 6 - 1Лп68, 7 - ЕЬ, 8 - Яи б: -1 - фКг, г - ЬВС20,3 - 1.ВС21, 4 - 1,ВС23, 5 - ЬВвгб, 6 - ЬВС22, 7 - Ып68,8 - Ни. в: - 1 -фКг,2-РВ01,ЗРВП2,4-РВОЗ,5-РВ04,б-РТВ80,7-1лп21,8-Ш

Вторую группу фК7.-подобных фагов со сходным типом рестрикции составляют

фаги ЬВ022 и 1_лп68 (рис. 2а и 26), имеющие много других характерных общих свойств. Третья группа - это фаги ЕЬ и !Ш, которые проявляют сходный характер рестрикции, существенно отличающийся от всех остальных фКг-подобных фагов (рис 2а)

Определение гомологии ДНК Для определения степени гомологии ДНК внутри изучаемой группы фагов нами была проведена гибридизация ДНК новых фК2-подобных фагов с ДНК фагов фК2,1ЛЮ22 и ЕЬ (рис 3 и 4). Эти фаги представляют три группы фК2-подобных фагов, различающихся по характеру рестрикции. Как можно видеть на рис 3,

ДНК новых фагов NN. 1,В020, 1Ж>21, 1,В023, и ЬВ026, а также фагов 1лп21 и РТВ80 проявляет высокую степень гомологии с ДНК фага фК2. Для фагов группы РВБ ДНК-ДНК гибридизация не проводилась, т.к. по характеру рестрикции они минимально отличаются от фагов вида фК2 (рис. 2в). Полученные данные позволяют отнести фаги NN. 1ЛЮ20,1ЛЮ21, ЦВ023, ЬВБ26 и фаги группы РВЭ к виду фКг.

1234567 1 2 3 4 5 б 7 8

а б

Рисунок 3. Гибридизация по Саузерну фрагментов ДНК фКг-подобных бактериофагов после обработки эндонуклеазой HtndllJ с меченой ,2Р ДНК фага фКХ. а: 1 - фКг, 2 - РТВ80, 3 - Lin21, 4 - 6:1- фКZ, 2 - LBG20,3 - LBG21,4 - LBG23, NN, 5 - Lin68,6 - EL, 7 - RU S - LBG26, б - LBG22,7 - Lln68,8 - Ro.

Лишь один из новых фагов, LBG22, проявляет гомологию с фагом Lin68 (рис. 4а)

Все видимые рестрикционные фрагменты Lin68 гибридизуются с ДНК LBG22, поэтому оба фага мы отнесли к виду Lin68. Как видно на рисунках За,б и 4а фаги вида Lin68 проявляют слабую ДНК-гомологию с фагами вида фКZ. Это свидетельствует о прямом родстве этих видов, хотя их дивергенция и произошла, по-видимому, достаточно давно.

Фаги EL и RU имеют высокий уровень гомологии ДНК. В то же время они проявляют полное отсутствие явной ДНК-гомологии со всеми остальными фК7-подобными фагами (рис. 46). Это позволяет отнести фаги EL и RU к новому отдельному виду фК-Z-подобных бактериофагов - виду EL. Таким образом, на основании данных по сравнению

геномов фК2-подобные бактериофаги можно отнести к трем видам: фК2, 1лп68 и ЕЬ (таблица 3):

Рисунок 4. Гибридизация по Саузериу фрагментов ДНК фкг-подобных бактериофагов после обработки эндоиукпеазой ИМ III

я: с меченой ИР ДНК фага ЬВв22:1 - 6: с меченой "Р ДНК фага ЕЬ: 1 -

фКХ, 2 - ЫЮ20,3 - ЬВС21,4 - ЬВС23, фКЕ, 2 - РТВ80,3 - Ш21,4 - NN. 5 -

5 - ЬВв2б, 6 - ЬВС22,7 - Ь1п68, 8 - Ко. 1Лп68, б - ЕЬ, 7 - 1Ш.

Таблица 3. Классификация фКг -подобных бактериофагов

Вид Бактериофаги

фкг фкг, Ып21, РТВ80, NN. ЬВС20, ЬВС21, ЬВС23, ЬВС26, РВ01, РВ02, РВЮ, РВ1)4

Ыпб8 Ьга68 и 1.ВС22

ЕЬ ЕЬиШ)

1.3. Сравнение полипептидного состава зрелых частиц.

На рис. 5 представлены результаты электрофоретического разделения структурных белков зрелых частиц фагов изучаемой группы. Общее количество выявляемых индивидуальных белков у разных фагов приближается к 40. Каждый из фагов содержит несколько мажорных белков, сходных по молекулярному весу с соответствующими белками других фагов. Все фаги вида фК2 не отличаются друг от друга по набору белков. Фаги 1лп68 и 1ЛЮ22

содержат меньшее количество видимых полипептидов, чем фаги вида фКЪ и проявляют

небольшое отличие между собой. Фаги вида ЕЬ отличаются по набору полипептидов от фагов двух других видов.

кДа

94 -> 67 ->

* «вЛ* Шшш щ- тц11»»<ь»б

' 8"" Ем р5

43 ->

зо ->

20.1-> ^

4г. Ф, "" й

. * Ч *

,* г

V'* - тл

й»

М 1 2 3 4 5 6 7

21.5 '

м 1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 5.12% 50!5-ПААГ-электрофорез структурны* белков фКХ-подобиых бактериофагов: а: 1 - фкг; 2 - Ш21; 3 - РТВ80; 4 - NN5 5 - Ш68; б: 1 - РВШ, 2 - РВ01,3 - и№22,4 - Ш68, б - ни; 7 - еь 5 - ьтсгб, б - ьввгз, 7- ьвс21,8 - ьввго, 9 - фкг.

М - маркеры молекулярных масс

Таблица 4. №коицевая последовательность главного В таблице 4 приведено сравнение >1-

концевой последовательности главного белка капсида с молекулярным весом около 66 кДа у фагов трех видов. Фаги видов фКг и 1лп68, несмотря на практически полное отсутствие ДНК гомологии, имеют идентичные последовательности, тогда как фаги ЕЬ и Яи имеют другую последовательность этого мажорного белка. Это подтверждает наши

белка капсида трех видов фагов группы фкг

Бактериофаг Концевая последовательность аминокислот

фкг Азп-Туг-Агп-Ои-Нв-Зег-Оп

РТВ80 А5п-Туг-А5п-С1и-Н15-8ег-С1п

Ып21 Аш-Туг-Агп-Ои-НЬ-вег-Оп

NN Аап-Туг-Ат-Ои-Шз-Бег-Оп

Ыпб8 Азп-Туг-Ам-Ои-НЬ-Зег-Оп

ЕЬ Оу-РЬе-всг-МеНИп-Аар-РЬе

Ни С1у-РЬе-8ег-Ме1-С1п-А»р-РЬе

данные о том, что фаги вида I.in68 сохраняют большее родство с фагами вида <j>KZ, чем фаги вида EL.

Исходя из всех полученных данных, можно сделать вывод, что фаги исследованной группы являются филогенетически родственными и представлены тремя видами- фК2, Lin68 и EL нового рода фК2. семейства Myoviridae. фК2-подобные фаги широко распространены в природе, доминирующим в природных популяциях является вид фКZ (11 фагов).

1.4. Предполагаемые генные продукты фKZ.

Недавно в результате совместной работы с лабораторией гепной технологии Католического университета г. Левен, (Бельгия) и лабораторией Института биоорганической химии РАН был проведен анализ полной последовательности ДНК фага ipKZ. Размер генома фКZ (280 334 п.н.) является наибольшим среди геномов вирусов бактерий с известной полной последовательностью ДНК. В геноме фК2 идентифицировано 306 потенциальных открытых рамок считывания. Из них только 59 кодируют продукты с известной функцией, в основном белки, связанные с метаболизмом предшественников нуклеиновых кислот. Схожая ситуация характерна и для бактериофага Т4, у которого происхождение большинства фаговых генов не известно (известна функция только 69 из 280 потенциальных генных продуктов).

Геном 4>KZ кодирует несколько собственных тРНК, что может способствовать расширению спектра используемых хозяев. Особенностью фК2 является отсутствие продуктов генов, сходных с какой-либо из известных ДНК-полимераз, что позволяет ставить важные вопросы о возможных способах репликации данного фага Также не было найдено предполагаемых ф KZ-кодируемых белков, которые имели бы сходство с белками хозяина Р aeruginosa Важной особенностью генома бактериофага фК7 является наличие генов, кодирующих белки, гомологичные генным продуктам различных эукариотических организмов и патогенных бактерий, в том числе, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus

influenzae, Listeria sp, Rickettsia prowazeki, Vibrio cholerae, Salmonella typhimurium и др В таблице 5 приведены предполагаемые продукты генов фага <t>KZ, гомологичные белкам различных организмов.

Таблица 5. Продукты генов бактериофага фКг, гомологичные белкам различных организмов

Номер ОРС а/к Ожидаемые свойства ГП-сходства с ГП из банков данных Степень сходства

Bits Ехрос

004 173 Дигидрфолатредукгаза, ЕС 1.5.1.3 Haemophilus influenzae 261 Ве-22

039 327 Белок клеточного деления Thormoplama acldophilum 100 6е-4

040 160 ОРС 59 Pseudomonas фаг D3 201 4е-1б

056 334 ОРС 36.1 Бактериофаг SPP1 Bacillus subtllls 211 7е-16

06S 388 Белок ДНК репарации Methanobacterium thermoautotrophicum 109 5е-04

072 316 Orf36.1 Бактериофаг SPP1 Bacillus subtllis 178 4е-12

073 300 РНК-лолимераза, ß-субъединица, Shewanella vlolacea 99 0.006

074 677 Бета-субъединица РНК-полимеразы, Listeria murrayl 118 9е-05

094 505 Гипотетический белок, Rlcketsia prowazakeri 91 0.080

104 162 Гипотетический белок Rv0060, Mycobacterium tuberculosis 241 9е-20

114 94 Гипотетический белок Xyleila fastidiosa (strain 9a5c) 152 7е-10

131 771 Гипотетический белок yomR фага SPBc2 Bacillus subtllis 115 2е-04

132 109 Родственный белку фага, гомолог yqcC, Bacillus subtilis 89 0.018

133 462 ORF xkdV профага PBSX Bacillus subtilis 92 0.062

134 457 Гипотетический белок yomR, фага SPBc2 Bacillus subtllis 117 80-05

144 260 Caulobacter crescentus ГП, родственный фаговым ферментам 226 9е-18

145 789 лизиса ГП 49 бактериофага phi-C31, Streptomyces 111 7е-04

148 1093 Альфа-1 тип V коллаген, Rattus norveglcus 118 2е-04

155 481 Рибонуклеаза Н Pseudomonas aeruginosa 200 26-14

162 522 Белок органелл Plasmodium yoelll 96 0.023

164 296 Гемолизин Aqulfex aeollcu 95 0.016

165 830 Гипотетический белок F35D11.11, Caenorhabditis elegant 144 5.4е-18

178 1450 РНК-лолимераза Thermus aquaticus 164 1е-8

179 356 Продукт гена е11 бактериофага blL170 Lactococcus 149 1е-08

181 2237 Гипотетический белок СС2326 Caulobacter crescentus 257 2е-20

182 664 Гипотетический белок Caulobacter crescentus 272 4е-22

184 230 Гипотетический белок [САС1899] Clostridium acetobutylicum 96 0.008

188 352 Тимидилат киназа (DTMP -киназа), Caulobacter crescentus 177 6е-12

196 120 Белок иммунности бактериофага SPbeta Bacillus subtllls 92 0.011

201 648 Олигопептидаза F, Borrella burgdorferi 84 0.74

203 702 Вероятная хеликаза, Chlamidia trachomatis 114 7.5е-07

208 366 Белок VAT-2 Thermoplasma acidophilum 133 5е-07

214 189 Дезоксицитидин трифосфат дезаминаза, Rlcketsia prowazekll 525 4.0е-51

231 155 Белок Imp1, Mycoplasma hominis 99 0.002

232 302 Stringent starvation белок В; Escherichia coli 117 Se-05

233 235 Полипептид-деформилаза, Chlamidia pneumoniae 88 0.023

235 488 Тимидилат синтаза (EC 2.95.81), Escherichia coll 301 4е-26

237 277 Консервативный гипотетический белок ycgL, Bacillus subtllls 477 8е-47

243 298 Гипотетический белок, Melanoplussangulnlpes entomopoxvirus 102 0.002

245 144 Продукт ОРС агл.З, бактериофага Т4 Escherichia coll 129 7е-07

246 218 Гипотетический белок 19.2 KD Pseudomonas denltrlficans 139 9е-08

286 508 Гомолог белка деления клетки ftsh, Bacillus subtllls 157 5.4е-15

303 645 Гигантский антиген, связанный с мембраной эритроцита 128 4е-06

Plasmodium falciparum

305 386 Бета-цепь рибонуклеозид-редуктазы, Salmonella typhymurium 217 2е-16

306 778 Альфа-цепь рибонукпеозид-резуктазы, Vibrio cholerae 934 2е-99

Отсутствие заметной гомологии фК2 с другими бактериофагами на уровне ДНК

свидетельствует о том, что фК2-подобные фаги представляют собой эволюционно обособленную группу в семействе Myoviridae. Однако некоторые (jiKZ-кодируемые генные продукты имеют гомологию с белками широкого спектра микроорганизмов (энтеробактерии, псевдоманады, бациллы, стрептомицеты, метанобактерии, микоплазмы и др.), а 11 из них гомологичны белкам других фагов с двунитевой ДНК, инфицирующих различных хозяев, таких как Bacillus, Lactococcus и Streptomyces. Эти результаты согласуются с предположением, что все хвостатые фаги с двунитевой ДНК имеют обшее происхождение [Hendrix R.W. et al., 1999]. Эволюция бактериофагов может происходить за счет обмена генами или генетическими модулями внутри общей "сети", объединяющей как близко родственные так и отдаленно родственные геномы.

1.5. Возможность использования фКХ-подобных фагов в фаготерапии.

фК2-подобные фаги считаются перспективными с точки зрения фаготерапии и часто используются в фаготерапевтических смесях. Эти фаги легко получать в больших титрах, они устойчивы при хранении, у них необычайно широкий спектр литической активности в отношении штаммов вида Р aeruginosa. Однако в связи с недавно обнаруженными особенностями фК2-подобных фагов, такими как наличие генов с неясными функциями, кодирующими потенциальные токсины или белки патогенных бактерий, способность к псевдолизогении, а также освобождение при лизисе бактерий большого количества высокополимерной ДНК, создающей значительную вязкость, возникает вопрос о предосторожностях при их использовании для фаготерапии. Таким образом, пока не исключена возможность прямого горизонтального переноса генов разных организмов в геномы фагов этой группы, их способность к генетическому обмену с различными хозяевами, терапевтическое использование живых фагов этой группы преждевременно [Крылов В.Н., 2001]. Возможные последствия их применения могут быть более вредны, чем ценность присущего этим фагам широкого спектра литической активности. Результаты,

полученные нами при изучении фKZ-подобных фагов, подтверждают необходимость классификации и детального изучения бактериофагов, используемых в фаготерапии.

ГЛАВА 2. Бактериофаг фКМУ.

2.1. Биологические свойства фага фКМУ.

Выделение фага и внешние признаки негативных колоний Бактериофаг фКМУ был выделен нами в 1999 г. из небольшого водоема в г. Москве. Отличительным признаком фКМУ является большая величина негативной колонии (до 2 см), полная прозрачность центральной части и широкий ореол (см. рис. 8).

Морфология фаговых частиц. Электронная микроскопия фага фКМУ (рис. 6) показала, что фаговая частица состоит из юсосаэдрического капсида диаметром около 60 нм и короткого несократимого хвоста длиной порядка 20 нм. Таким образом, по морфологическим признакам фаг фКМУ относится к семейству Podoviridae (фаги с

Спектр литической активности. Фаг фКМУ проявлял достаточно высокую литическую активность, лизировав 10 из 30 проверенных клинических изолятов Р aeruginosa, полученных из

бактериологической лаборатории НИИ Скорой помощи им. Н.В. Склифосовского и Главного военного клинического госпиталя им. H.H. Бурденко.

Рост и развитие фага. Характерным признаком фага фКМУ является его очень быстрое развитие, проявляющееся в очень коротком минимальном латентном периоде (между 10 и 13 минутами). Другое важное свойство фКМУ - то, что в отличие от других фагов он может продолжать расти на бактериях, утративших способность поддерживать

короткими хвостами).

Рисунок 6. Частицы фага фКМУ

рост других фагов (зона лизиса, содержащая живой фаг продолжает увеличиваться на 2 - 4 сутки инкубации). Возможно, этот эффект объясняется особыми свойствами собственной РНК-полимеразы фага фКМУ, схожей с РНК-полимеразой Т7-подобных бактериофагов (см. далее).

2.2. Характеристика генома фКМУ, полученная на основе анализа полной последовательности ДНК. В результате совместной работы с лабораторией генной технологии Католического университета г. Левен, (Бельгия) и лабораторией Института биоорганической химии РАН был проведен анализ полной последовательности ДНК фага фКМУ. Геном фага фКМУ представляет собой линейную двухцепочечную молекулу ДНК размером 42 519 п.н. с прямыми терминальными повторами в 414 п.н. Такой небольшой размер генома характерен для всех членов семейства Рос1о\тс1ае, у которых к настоящему

Таблица 6. Предполагаемые генные продукты бактериофага фКМУ.

№ DPC Старт-стоп GC% а/к Предполагаемый ГП Степень сходства

Bita Expect

12 3503-6312 64,1 269 ДНК-полимераза А [Т7] 0,001

15 5178-9371 61,2 397 ДНК-В подобная хеликаза (PS00017) 1е-03

17 9978-10925 63,4 315 (V01146) ген 1.3, ДНК-лигам [Т7] 91 1е-17

АТФ-зависимая ДНК-лигаза

19 11254-13677 61,8 807 ДНК-полимераза A JT7J 6е-28

22 15091-16032 62,3 313 5'-3' экзонуклеаза [Т5] 6е-03

23 16022-16462 61,0 146 Эндонуклеаза VII [Т4] 43 0.001

26 (8035-20485 62,7 816 РНК-полимераза [Т7] 253 5е-66

30 21623-23155 62,6 510 Коннекторный белок [Т7] 165 8е-40

31 23159-24127 64,8 322 Пролин-богатый участок

32 24180-25187 62,8 335 Капсидный белок

33 25284-25838 62,0 184 Хвостовой белок А [ТЗ] 47 1е-04

34 25841-28321 62,0 826 Хвостовой белок В [Т7] 128 2е-28

36 28866-31562 63,0 898 Лизоцим (Е.С.3.2.1.17) [Т4] 57 1е-06

43 38546-40351 62,6 601 ДНК-пакующий белок В [Т7] 263 4е-69

44 40351-40548 62,6 66 Холин

45 40545-41027 61,5 160 Лизоцим [ф-Ealh] 89 2,Е-17

Фаговый лизоцим [Т4]

времени определена последовательность ДНК G+C состав 1енома фКМУ (62 3%) очень близкок к G+C составу генома бактерии-хозяина Р aeruginosa. ДНК фага фКМУ не содержит последовательностей, гомологичных последовательностям ни одного из известных организмов.

Геном фага фКМУ содержит 48 предполагаемых генов. Несмотря на отсутствие

гомологи на уровне ДНК 11 из 48 предполагаемых 1енных продуктов фКМУ (таблица 6). в

том числе РНК-полимераза, белки, участвующие в репликации ДНК, некоюрые

структурные белки имеют сходство на аминокислотном уровне с бетками Т7-подобных

фагов Удиви ie 1ьиым является отсутствие гомологии большого капсидного бе жа фКМУ

Таблица 7, Устойчивость некоторых фагов P. aeruginosa, с известными последовательностями ДНК к рестрикимоннмм ферментам (с сайтами узнавания > 6 п.и.).

фКМУ 42,519п н.* фкг 280,334 H.H.* АаЛ1 фГГХ 35,538 п.н * D3 56,425 [I H.* "Jc/NI

Aall ~Aatll Cvnl Sau I

Dra l Sbfl CWNI ßj/1107I Pad

AclNl Ec/13611 s/m ЕсПШ\ ß.v«NI Pmel

ЛраЛ EclXl .$//•3031 EclXl £c<?1051 Smil

АраЫ Ecolill Sgfl EcolCW Ecotlll Spel

Asel ЕсоШ Smil Fsel Mphimi Swal

Asni EcoSH Spei Not\ NsH

Aspl EcolCRl Srf1 Pspnm Pacl

Atsl FriOl £ie8387I Psp\l Рте I

Ватт Kspl PspALl РриШ

BartU MspCl Sspl Pstl Rsrll

В)И Noil Sstl Sacl Smil

Bgltt Pad Swal Sb/l Sna BI

Bse211 PmeS 51 7УЛ1111 Sfll Spe I

BspTl РтеI №4641 S/r214l Steel

Bsmi ftÄBJ Vnel Smal Zsp21

Bsßa i Pspnm Vspl SrfI

BslYl Pstl Xhol Sse83871

CeiNI Sacl Xholl Sstl

Cfim SacII Xhol

I П 1

>< « «S

Рисунок 7. Характер рестрикции ДНК бактериофага фКМУ различными эидонуклеазами

' - размер генома данного бактериофага

(ГП 32) с белками известных бактериофагов. Ни один из предполагаемых генных продуктов, кодируемых фКМУ, не имел сходства с белками Р aeruginosa, возможными прокариотическими токсинами и белками эукариот.

Гомология белков фагов фКМУ и Т7 свидетельствует о филогенетическом родстве Т7-подобных фагов энтеробактерий и псевдоманад. Однако, полное отсутствие гомологии ДНК фКМУ и Т7 (также как и с другими бактериофагами) говорит о том, что это фаг эволюционно удален от других членов семейства Podoviridae.

Рестрикционный анализ ДНК Отличительной особенностью ДНК фага фКМУ является устойчивость к большому числу рестрикционных ферментов с сайтами узнавания > 6 п н Количество эндонуклеаз рестрикции, к которым устойчива ДНК фага фКМУ, особенно, учитывая размеры генома фКМУ, существенно выше, чем у других известных бактериофагов, активных на Р aeruginosa (таблица 7). Возможно, утрата чувствительных сайтов произошла в результате длительной эволюции и миграции этого бактериофага среди бактерий-хозяев, имеющих различные системы рестрикции.

На рис. 7 представлены результаты электрофоретического разделения ДНК фага фКМУ, обработанной различными эндонуклеазами. В большинстве случаев количество сайтов, чувствительных к эндонуклеазам рестрикции, в геноме фКМУ не велико (2 - 3).

2.2. фКМУ-подобные бактериофаги.

Выделение новых фКМУ-подобных бактериофагов Учитывая уникальные свойства фКМУ, мы решили выяснить, насколько широко такие фаги распространены в природе. Основным признаком при отборе новых фагов служил вид негативной колонии (крупная, прозрачная, с характерным ореолом). В результате из природных водоемов и коммерческих фаготерапевтических препаратов различных производителей были отобраны В новых фКМУ-подобных бактериофагов (Таблица 8).

Таблица 8. Происхождение фКМУ -подобных бактериофагов

Бактериофаги Происхождение

фКМУ водоем Москвы

PRA5, PRA6, PRA7 водоемы Москвы и Московской области

PGR р. Дунай (Германия)

PRA1, PRA3, PRK, FMV коммерческие препараты (Уфа, Пермь)

Фаг PRK образует еще более крупные негативные колонии, чем фКМУ, а фаг FMV отличается от него по виду ореола (рис 8). Остальные фаги не отличаются по виду

Электронная микроскопия. Электронная микроскопия новых бактериофагов показала, что все они по морфологии фаговой частицы относятся к семейству Podoviridae.

Спектр литической активности. Все вновь выделенные фКМУ-подобные фаги сравнивали по росту на клинических изолятах бактерий, фагоустойчивых мутантах и на штаммах с плазмидами. Фаги исследованной группы различались по росту на клинических изолятах Р aeruginosa и могли лизировать около 25% всех исследованных клинических штаммов. Из 10 использованных в опыте плазмид только PMG53 ограничивает рост фКМУ-подобных фагов. Из 90 полученных в ходе настоящей работы и ранее мутантов P. aeruginosa РА01, устойчивых к различным бактериофагам, фКМУ-подобные фаги могли лизировать 40. Фагоустойчивые мутанты, полученные к любому из фКМУ-подобных фагов, ограничивали рост всех фагов данной группы. Это объясняется тем, что все фаги этой группы используют сходные структуры для адсорбции на бактериальной клетке.

негативной колонии от фКМУ.

Рисунок 8. Негативные колонии фКМУ-подобных фагов.

Рестрикционный анализ По результатам рестрикционного анализа все исследованные фКМУ-подобные фаги были разделены на три группы (рис 9). Фаги первой группы - PRA5, PRA6, PRA7 и PGR - имеют идентичные с фКМУ рестрикционные профили при использовании следующих эндонуклеаз. EcoRV, Hindlïï, SalGl, Smal, Xbal Рестрикционные профили фагов второй группы - PRA1, PRA3 и PRK -идентичны Они минимально отличаются от рестрикционных профилей фагов первой группы (при использовании эндонуклеаз EcoRV и HindiII) или не отличаются вовсе (при использовании эндонуклеаз SalGÏ, Smal, и Xbal). Третью группу составляет единственный фаг FMV, характер рестрикции которого при использовании эндонуклеаз EcoRV и HindiII в большей степени отличается от характера рестрикции фагов первых двух групп При обработке ДНК FMV "крупнощепящей" рестриктазой Xbal рестрикцикционные профили фагов FMV и

1 2 3 1 2 3 1 2 3 s НШШ EcoRV Xbal

■ЙМНкшк йш g Уц"

abc l

Ь с 2

Рисунок 9. Характер рестрикции Рисунок Ю. Гибридизация по Саузерну фКМУ-подобных фагов различными фрагментов ДНК фКМУ-подобиых эидоиуклеазами. I - Р11А1,2 - фКМУ, 3 бактериофагов после обработки _ ПЧУ. эидоиуклеазами 1 - НШ ///; 2 - ЕсоЯУ с

меченой 31Р ДНК фага фКМУ. Бактериофаги: а - РИА1, Ь - фКМУ, с - КМУ.

фКМУ оказались идентичными. Это может свидетельствовать о большой консервативности геномов фКМУ-иодобных фагов и исчерпании ими возможностей мутационной изменчивости. В то же время, было показано, что фаги в пределах групп, сходных по распределению сайтов рестрикции, имеют различия по спектру роста на клинических изолятах бактерий, и, следовательно, имеют определенные отличия в геномах.

Гибридизационный анализ На рис. 10 представлены результаты гибридизации ДНК фагов всех трех рестрикционных типов (фаги PRA3, фКМУ и FMV) с меченой 32Р ДНК фага фКМУ. Все рестрикционные фрагменты фагов PRA3 и FMV имеют высокий уровень гомологии с ДНК фага фКМУ. Полученные данные позволяют отнести все фаги исследованной группы к одному новому виду фКМУ.

Обнаружение новых фКМУ-подобных фагов свидетельствует, что они достаточно широко распространены в природе. Все 8 вновь выделенных бактериофагов по совокупности свойств генома, морфологии фаговых частиц и феногенетическим признакам отнесены к виду фКМУ семейства Podoviridae. Характерными особенностями стратегии развития: фагов данного вида являются очень быстрое развитие фага и лизис хозяйской клетки при относительно небольшом выходе зрелых фаговых частац. Такое общее свойство геномов данной группы фагов как устойчивость ко многим эндонуклеазам рестрикции, минимальное количество сайтов узнавания и их совпадение у фагов, отобранных в разных регионах, может свидетельствовать о сходстве путей эволюции этих фагов, направленной на максимальную защиту генома от возможного разрушения при инфекции и повышение скорости развития.

2.3. Возможное практическое применение фагов вида фКМУ. Способность фагов вида фКМУ инфицировать многие клинические изоляты P. aeruginosa (обусловленная в том числе устойчивостью к подавляющим эффектам большинства известных плазмид этих бактерий), а также короткий латентный период и высокая скорость роста фагов данного вида делают их очень привлекательными для применения в фаготерапии. Действительно,

мы обнаружили, что фаги такого типа достаточно часто присутствуют в различных фаготерапевтических препаратах. Однако к фагам вида фКМУ легко отбираются фагоустойчивые бактерии, поэтому эти фаги можно использовать только в смеси с фагами других видов, лизирукяцими такие бактерии.

Способность фагов вида фКМУ продуцировать свою собственную РНК-полимеразу представляет интерес для молекулярно-биологических исследований и биотехнологии. Можно предположить, что литические ферменты этих фагов могут бьггь использованы в качестве антимикробных агентов в терапии бактериальных инфекций. Недавно было показано, что продукт гена 36 фага фКМУ представляет собой высоко термостабильный лизоцим (сохраняющий 26% активности после 2 часов при 100° С и 21% после автоклавирования), который может представлять интерес для технологии консервирования продуктов питания [Ьа^^е Л.е1 а1., 2004].

ВЫВОДЫ

На основании изложенных выше результатов можно сделать следующие выводы:

1. Исследовано 15 гигантских фКг-подобных фагов (из них 11 новых), выделенных в различных регионах; показано, что эти фаги широко распространены в природе и проявляют значительное сходство по многим признакам (широкий спектр литической активности, внешний вид негативных колоний, особенности роста и развития, морфология фаговой частицы, размер генома и др.).

2. На основании проведенных исследований: сравнения морфологии фаговых частиц, спектра литической активности, инактивации сывороткой, рестрикционного и гибридизационного анализов фаговой ДНК, анализа полипептидного состава зрелых фаговых частиц и др. проведена классификация фК2-подобных фагов. Сделан вывод, что фаги этой группы являются филогенетически родственными и представлены тремя видами:

<t>KZ, Lin68 и EL нового рода <j)KZ семейства Myoviridae Доминирующим в природных популяциях является вид фК2. (11 фагов).

3. Отсутствие гомологии ДНК фагов вида EL с видами <|>KZ и Lin68 и ее крайне низкий уровень у фагов вида фКZ и Lin68 свидетельствуют о том, что дивергепция трех видов фК2-подобных фагов произошла достаточно давно.

4. Впервые выделен Т7-подобный фаг, активный на бактериях P. aeruginosa - фаг фКМУ. Этот фаг имеет ряд уникальных свойств, очень высокую скорость роста, рост на бактериях, утративших способность поддерживать рост других фагов, что может следовать из особых свойств собственной РНК-полимеразы фКМУ, имеющей гомологию с РНК-полимеразой фага Т7 Е. coli. Помимо РНК-полимеразы еще 10 из 48 предполагаемых генных продуктов фага фКМУ, в том числе белки, участвующие в репликации ДНК и некоторые структурные белки имеют сходство на амипокислотном уровне с белками Т7-подобных фагов энтеробактерий.

5. Исследовано 8 новых фКМУ-подобных фагов, выделенных в различных регионах. Все фКМУ-подобные фаги по совокупности генетических и фенотипических признаков отнесены к одному новому виду фКМУ семейства Podoviridae.

6. Устойчивость ДНК фКМУ к очень большому количеству эндонуклеаз рестрикции свидетельствует о длительной эволюции и миграции этого бактериофага среди бактерий-хозяев, имеющих различные системы рестрикции. Сравнение всех изученных фКМУ-подобных фагов по характеру рестрикции показало чрезвычайную ограниченность разнообразия данного признака (всего 3 варианта рестрикционного профиля) у этой группы фагов, что доказывает исчерпанность возможности их мутационной изменчивости.

7. Особенности роста и развития фК2-подобных фагов и фагов вида фКМУ делают их перспективными для использования в фаготерапии. Они взаимодополняют друг друга в практическом отношении и могут бьпъ использованы в оптимальных фаготерапевтических

смесях. Способность фагов изученных групп продуцировать свои собственные РНК-полимеразу или тРНК. а также различные литические ферменты делают их привлекательным объектом для молекулярной биологии и биотехнологии

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Mesyanzhinov V.V., Robben J., Grymonprez В., Kostyuchenko V.A., Bourkaltseva M V., Sykilinda N.N., Krylov V.N., and Volckaert G The Genome of Bacteriophage фК2 of Pseudomonas aeruginosa. J. Mol. Biol. 2002. V. 317. P. 1-19.

2 Буркальцева M.B., Крылов B.H, Плетенева Е.А., Шабурова O.B, Крылов С.В., Волкарт Г., Сыкилинда H.H., Курочкина Л.П.., Месянжинов В.В. Феногенетическая характеристика группы гигантских ф KZ-подобных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa. Генетика. 2002. Т. 38. № И. С. 1470 - 1479.

3. V. Krylov, Е. Pleteneva, М. Bourkaltseva, О. Shaburova, G. Volckaert, N. Sykilinda, L. Kurochkina and V. Mesyanzhinov. Myoviridae Bacteriophages of Pseudomonas aeruginosa: a Long and Complex Evolutionary Pathway. Research in Microbiol. 2003. V. 154. P. 269 - 275.

4. R. Lavigne, M.V. Burkal'tseva, J. Robben, N.N. Sykilinda, L.P. Kurochkina, B. Grymonprez, B. Joncks, V.N. Krylov, V.V. Mesyanzhinov and G. Volckaert. The Genome of Bacteriophage фКМУ, a T7-like Virus Infecting Pseudomonas aeruginosa. Virology. 2003. V. 312. P. 49-59.

5. Буркальцева M.B., Кадыков В. А., Крылов B.H. Изучение региональной специфичности геномов гигантских фагов Pseudomonas aeruginosa. Тезисы III Съезда ВОГиС. Москва. 6-12 июня 2004. С. 372.

6. Крылов В.Н., Буркальцева М.В., Сыкилинда H.H., Плетенева Е.А., Шабурова О.В., Кадыков В. А, Миллер С., Библ М. Сравнение геномов новых гигантских фагов Pseudomonas aeruginosa из природных популяций разных регионов. Генетика. 2004. Т. 40. №4. С. 462 - 468.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДК 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 22.09.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 80 экз. Заказ 564. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

»19810

РНБ Русский фонд

2006-4 16362

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Буркальцева, Мария Владленовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.б

1. Pseudomonas aeruginosa как условный патоген.б

2. Классификация бактериофагов P. aeruginosa.

2.1. Морфология бактериофагов P. aeruginosa.

2.2. Гомология геномов бактериофагов P. aeruginosa.

3. Модульная теория и эволюция бактериофагов.

3.1. Модульная теория эволюции.

3.2. Супергруппы бактериофагов.

3.2.1. Фаги-трапспозоны.

3.2.2. Т4-подобные бактериофаги.

3.2.3. Т7-подобныс бактериофаги.

4. Фаготерапия.

4.1. Использование бактериофагов Р. aeruginosa в фаготерапии.

4.2. Проблемы использования живых вирулентных бактериофагов в фаготерапии.

4.2.1. Общая и специализированная траисдукция.

4.2.2. Фаговая конверсия.

4.2.3. Псевдолизогения.

5. Бактериофаг <}>KZ Р. aeruginosa.

5.1. Биологические свойства бактериофага <}>KZ.

5.2. Структура частицы бактериофага <}>KZ.

5.3. Геном фага <}>KZ.

5.3.1. Основные свойства и организация генома <}>KZ.

5.3.2. Предполагаемые промоторы и терминаторы.

5.3.3 Внрус-кодирусмые тРНК.

5.4. Предполагаемые генные продукты бактериофага <}>KZ.

5.4.1. Сходство генных продуктов фага <}>KZ с известными белками.

5.4.2. Интрон-кодируемые эндонуклеазы.

5.4.3. Генные продукты, вовлеченные в метаболизм иуклеотндов.

5.4.4. Репликация ДНК.

5.4.5. Белки фага <}>KZ, родственные белкам других бактериофагов.

5.4.6. Белки фаговой частицы <}>KZ.

5.5. Бактериофаги группы <J)KZ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ФК^-ПОДОБ11ЫЕ БАКТЕРИОФАГИ.

1.1. Сравнение биологических свойств фагов.

1.1.1. Бактериофаги и их происхождение.

1.1.2. Выделение новых фК2-подобных бактериофагов.

1.1.3. Фенотип негативных колоний фагов.

1.1.4. Сравнение морфологии фаговых частиц.

1.1.5. Псевдолизогения.

1.1.6. Спектр литическои активности. 1.1.7. Способность к общей транедукции.

1.1.8. Инактивация сывороткой.

1.2. Сравнение геномов фК2-подобных фагов.

1.2.1. Сравнение размеров геномов.

1.2.2. Сравнение рестрикциопиых профилей ДНК.

1.2.3. Определение гомологии ДНК.

1.3. Сравнение полипептидного состава зрелых частиц.

1.4. Некоторые особенности предполагаемых генных продуктов фага <J>KZ.

1.5. Обсуждение.

1.5.1.Эволюция группы ф^-нодобиых бактериофагов.

1.5.2. Возможность использования фК2-подобных фагов в фаготерапии.

2. БАКТЕРИОФАГ фКМУ.

2.1. Биологические свойства фага фКМ V.

2.1.1. Выделение фага фКМУ и внешние признаки негативных колоний.

2.1.2. Морфология фаговых частиц.

2.1.3. Спектр литической активности.

2.1.4. Рост и развитие фага.

2.2. Изучение генома фага фКМУ.

92.2.1. Размер и GC-состав генома.

2.2.2. Рестрикционный анализ ДНК.

2.2.3. Характеристика генома фКМУ, полученная па основе анализа полной последовательности ДНК.

2.3. фКМУ-подобные бактериофаги.

2.3.1. Выделение новых фКМУ-подобных бактериофагов.

2.3.2. Морфология фаговых частиц. ш 2.3.3. Изучение генома новых фКМУ-подобных бактериофагов.

2.3.4. Спектр литической активности.

2.3.5. Феномен взаимодействия фКМУ-подобных и некоторых фК2-подобных фагов.

2.4. Обсуждение.

2.4.1. Эволюция фКМУ-подобных фагов.

2.4.2. Возможное практическое применение фагов вида фКМУ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение двух групп уникальных - ΦKZ-подобных и Т7-подобных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa"

В последнее время резко увеличилось количество сообщений о появлении клинических изолятов патогенных бактерий с множественной устойчивостью к антибиотикам (multi-drug-resistant bactcria). Как следствие этого возникла идея возрождения фаготерапии как метода лечения бактериальных инфекций. Однако введение фаготерапии в широкую практику ограничивается определенной опасностью при использовании бактериофагов (фаговая конверсия, транедукция и распространение островков патогенности и др.). Поэтому во всех работах, где рассматривается возможность применения фаготерапии, считается обязательным всестороннее изучение используемых бактериофагов, вплоть до определения полной последовательности геномов.

Среди патогенных бактерий особое значение имеют бактерии Pseudomonas aeruginosa. Они являются причиной раневых и ожоговых инфекций, осложнений после хирургических операций и поражений различных органов при иммунодефнцитиых состояниях и др. P. aeruginosa колонизирует легкие больных^наследственным заболеванием' г? кистозным фиброзом, что в конечном итоге приводит к летальному исходу. Этот вид микроорганизмов является этиологическим агентом 15-20% всех впутрнболышчных инфекции. Такая частая встречаемость P. aeruginosa среди клинических изолятов вызвана устойчивостью бактерий данного вида ко многим широко используемым антибиотикам а также их способностью легко и быстро образовывать бионленки, непроницаемые для антибиотиков и ферментов, а также генетических векторов, несущих гены, комплемептирующне дефектный ген CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene) при кнетозном фиброзе.

В настоящей работе мы провели детальное исследование двух групп бактериофагов P. aeruginosa, представляющих большой научный и практический интерес.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Буркальцева, Мария Владленовна

выводы

На основании изложенных выше результатов можно сделать следующие выводы:

1. Исследовано 15 гигантских (¡»^-подобных фагов (из них 11 новых), выделенных в различных регионах; показано, что эти фаги широко распространены в природе и проявляют значительное сходство по многим признакам (широкий спектр литической активности, внешний вид негативных колоний, особенности роста и развития, морфология фаговой частицы, размер генома и др.).

2. На основании проведенных исследований: сравнения морфологии фаговых частиц, спектра литической активности, инактивации сывороткой, рестрикциоппого и гибридизационного анализов фаговой ДНК, анализа полипептндиого состава зрелых фаговых частиц и др. проведена классификация (¡»KZ-иодобиых фагов. Сделан вывод, что фаги этой группы являются филогенетически родственными и представлены тремя видами: <J)KZ, Lin68 и EL нового рода <{>KZ семейства Myoviridae. Доминирующим в природных популяциях является вид $KZ. (11 фагов).

3. Отсутствие гомологии ДНК фагов вида EL с видами (¡>KZ и Lin68 и ее крайне низкий уровень у фагов вида (¡>KZ и Lin68 свидетельствуют о том, что дивергенция трех видов (¡>KZ-no;io6iibix фагов произошла достаточно давно.

4. Впервые выделен Т7-подобный фаг, активный на бактериях P. aeruginosa - фаг фКМУ. Этот фаг имеет ряд уникальных свойств: очень высокую скорость роста, рост на бактериях, утративших способность поддерживать рост других фагов, что может следовать из особых свойств собственной PIIK-иолимеразы фКМУ, имеющей гомологию с РПК-иолимеразой фага Т7 Е. coli. Помимо РНК-полимеразы еще 10 из 48 предполагаемых генных продуктов фага фКМУ, в том числе белки, участвующие в репликации ДНК и некоторые структурные белки имеют сходство па аминокислотном уровне с белками Т7-иодобпых фагов эптеробактерпй.

5. Исследовано 8 новых фКМУ-подобных фагов, выделенных в различных регионах. Все фКМУ-иодобпые фаги по совокупности генетических и фепотипических признаков отнесены к одному новому виду фКМУ семейства Рос1о\чги1ас.

6. Устойчивость ДНК фКМУ к очень большому количеству эпдонуклеаз рестрикции свидетельствует о длительной эволюции и миграции этого бактериофага среди бактерий-хозяев, имеющих различные системы рестрикции. Сравнение всех изученных фКМУ-подобных фагов по характеру рестрикции показало чрезвычайную ограниченность разнообразия данного признака (всего 3 варианта рестрикционного профиля) у этой группы фагов, что доказывает исчерпанность возможности их мутационной изменчивости.

7. Особенности роста и развития фК2-подобиых фагов и фагов вида фКМУ делают их перспективными для использования в фаготерапии. Они взаимодополияют друг друга в практическом отношении и могут быть использованы в оптимальных фаготерапевтнческих смесях. Способность фагов изученных групп продуцировать свон собственные РНК-полимеразу или тРНК, а также различные литические ферменты делают нх привлекательным объектом для молекулярной биологии и биотехнологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Буркальцева, Мария Владленовна, Москва

1. Ахвердяп В.З., Биднснко Е.М., Фрейзоп Е.В. (1988). Сравнительная характеристика группы (¡iKZ-подобиых вирулентных фагов Pseudomonas aeruginosa. Микробиологическая промышленность. Отечественный производственный опыт. № б. С. 1-5.

2. Ахвердян В.З., Лобанов А.О., Хренова Е.А., Крылов В.Н. (1998а). Рекомбинацноппое происхождение природных фагов-транспозопов родственных видов группы ВЗ, активных па бактериях вида Pseudomonas aeruginosa. Генетика. Т. 34. № 5. С. 697 700.

3. Ахвердяп В.З., Хренова Е.А., Богуш В.Г., Герасимова Т.В., Кирсанов Н.Б., Крылов В.Н. (1984). Широкая распространенность трапепозоппых фагов в природных популяциях Pseudomonas aeruginosa. Генетика. Т.20. № 10, С.1612-1619.

4. Ахвердян В.З., Хренова Е.А., Лобанов А.О., Крылов В.Н. (19986). Выявление роли дивергенции в эволюции фагов-транспозопов группы Pseudomonas aeruginosa. Генетика. Т. 34. № 6. С. 846-849.

5. Ахвердян В.З., Хренова Е.А., Реулец, М.А., Герасимова Т.В., Крылов В.Н. (1985). Характеристика фагов-транспозопов Pseudomonas aeruginosa, относящихся к двум группам, различимым по ДНК-ДНК-гомологии. Генетика. Т. 21. № 5. С. 735 — 747.

6. Беляков В.Д., Ряпнс Л.А., Илюхин В.И. (1990). Псевдомопады и пеевдомопозы. М., Медицина. С. 224.

7. Бпдненко Е.М., Ахвердяп В.З., Хренова Е.А., Япепко A.C., Крылов В.Н. (1989), Генетический контроль морфогенеза фага-траиспозопа D3112 Pseudomonas aeruginosa. Генетика, Т. 25. № 12. С. 2126 2137.

8. Герасимов В.А., Япепко A.C., Ахвердян В.З., Крылов В.Н. (1996). Взаимодействие фагов-транспозопонов Pseudomonas aeruginosa', генетический анализ признака подавления профагом D3112 развития фага В39. Генетика. Т.32. № 8. С. 1068 -1073.

9. Горбунова С.А., Ахвердян В.З., Черсмухпна Л.В., Крылов В.Н. (1985), Эффективный метод трапедукцпн вирулентным фагом рП6 с использованием специфических мутантов Pseudomonasputida PpGl. Генетика. Т. 21. № 5. С. 872 874.

10. Джусупова А.Б., Плотникова Т.Г., Крылов В.Н. (1982).Выявленне транедукции вирулентным бактериофагом (¡)KZ хромосомальных маркеров Pseudomonas aeruginosa в присутствии плазмиды RMS148. Генетика. Т. 18. № 11. С. 1799-1802.

11. Доув У. (1975). Биологические выводы. В кн: Фаг лямбда (Ред. Хсрши Л.Д.), N1., Мир, с. 379.

12. Кочеткова В.Л., Мамонтов Л.С., Московцсва P.J1., Ерастова E.JI., Трофимов Е.И., Попов М.И., Джубалиева С.К. (1989). Фаготерапия послеонерациопных гпойно-восиалительпых осложнений у онкологических больных. Сов. Мед. Т. 6. С. 23 26.

13. Крылов B.II. (1985). Современные проблемы бактсриофагии//Успсхи микробиологии. Т. 20. С. 22-53.

14. Крылов В.И. (2001). Фаготерапия с точки зрения генетики бактериофага: надежды, перспективы, проблемы безопасности, ограничения. Генетика. Т. 37. № 7. С. 869 -887.

15. Крылов В.И., Ахвсрдян В.З., Богуш В.Г., Хренова Е.Л., Рсулец М.Л. (1985). Модульная структура геномов фагов-транспозонов Pseudomonas aeruginosa// Генетика. Т. 21. №5. С. 724-734.

16. Крылов В.И., Ахвердян В.З., Хренова Е.А., Чсрсмухииа JI.B., Тяглов Б.В. (1986а). Два типа молекулярной структуры (состава) генома в пределах одного вида бактсриофагов-транспозонов Pseudomonas aeruginosa. Генетика. Т. 22. № 11. С. 2637 -2648.

17. Крылов В.II., Джусунова А.Б., Ахвердян В.З., Хренова Е.А., Алышкпп А.Ф., Копылова Ю.И. (1989). Изучение морфологии частиц и структуры геномов бактериофагов Pseudomonasputida с целыо их классификации. Генетика. Т. 25. № 9. С. 1559 1557.

18. Крылов В.П., Жазыков И.Ж. (1978). Бактериофаг (¡>KZ Pseudomonas aeruginosa -возможная модель для изучения генетического контроля морфогенеза. Генетика. Т. 14. № 4. С. 678-685.

19. Крылов В.П., Смирнова Т.А., Ребентиш Б.А., Мииенкова И.Б. (1978). Структура частицы бактериофага <J>KZ. Вопросы вирусологии. № 5. С. 568 571.

20. Крылов В.IL, Шарибжанова Т.О., Ахвердян В.З. (1992). Характеристика гомологичных участков в геномах группы умеренных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa разных видов. Генетика. Т. 28. № 3. С. 33-42.

21. Крылов B.IL, Янеико A.C., Черемухина Л.В. (19866). Различия в аллельиом состоянии генов, контролирующих специфичность адсорбции в группе фагов-трапепозонов Pseudomonas aeruginosa. Генетика. Т. 22. № 7. С. 1093 — 1098.

22. Литвин В.Ю., Гннцбург А.Л., Пушкарева В.И. и др. (1998). Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М., Фармарус-Приит. С. 256.

23. Мейпслл Г. (1976). Бактериальные нлазмиды. М., С. 172 190.

24. Митькина Л.Н., Крылов B.II. (1999). Природные межвидовые гибриды фагов-трапсиозопов Pseudomonas aeruginosa//Генетика. Т. 35. N 9. С. 1182-1190.

25. Митькина Л.Н., Крылов В.Н. (2000). Свойства природных межвидовых гибридов фагов-транспозоиов Pseudomonas aeruginosa: особенности транспозиции фага PL24// Генетика. Т. 36. №10. С. 1-9.

26. Плотникова Т.Г., Джусупова А.Б., Хренова Е.А., Крылов В.Н. (1982). Генетическое и феногснстнческое изучение группы ts-мутантов фага (¡)KZ Pseudomonas aeruginosa PAOl. Генетика. Т. 18. № 11. С. 1793 1798.

27. Тяглов Б.В., Крылов В.Н., Плотникова Т.Г., Минаев И.Е., Псрмогоров В.И. (1980). Некоторые физико-химические свойства бактериофага (¡)KZ. Молекулярная биология. 1980. Т. 14. Выи. 5. С. 1019- 1022.

28. Фрейзон Е.В., Конылова Ю.И., Черемухина Л.В., Крылов B.IL (1989). Влияние плазмид IncP-2-группы па рост бактериофагов Pseudomonas aeruginosa. Генетика. Т. 25. № 7. С. 1168- 1178.

29. Хренова Е.Л., Лхвердян В.З., Крылов O.II. (1984). Родство бактериофагов <j)KZ и 21 Pseudomonas aeruginosa, обладающих уникальной нуклеонротеидпой структурой в головке. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. № 5. С. 31-34.

30. Шарибжанова Т.О., Лхвердян В.З., Крылов D.H. (1992). Сравнительное изучение гомологии геномов и морфологии бактериофагов Pseudomonas aeruginosa для выявления филогенетического родства и экспресс-классификации. Генетика. Т. 28. № 3. С. 24 32.

31. Яковлев С.В., Яковлева В.П. (2001).//Лнтимикробная химиотерапия в таблицах. Consilium medicum, Т. 1. № 3. С. 3-50

32. Яковлева O.II., Романова Ю.М., Петровская В.Г. (1983). -Журнал микробиол. №9. С. 40-46.

33. Яненко Л.С., Беккаревич Л.О., Герасимов В.Л., Крылов В.П. (1988). Генетическая карта бактериофага-транспозона D3112 Pseudomonas aeruginosa. Генетика, Т. 24, № 12, С. 2120-2126.

34. Лскегтапп II.-W. and М. DuBow, (1987), Viruses of Prokaryotes, V. II, CRC Press, Boca Raton, Florida, P. 1 161

35. Лскегтапп II.-W., Cartier C., Slopek S., and Vieu J.-F. (1988). Morphology of Pseudomonas aeruginosa typing phages of the Lindberg set// Ann.Inst. Pasteur/Virol. V. 139. P. 389-404.

36. Лскегтапп II.-W., Kasatiya S.S., Kawata Т., (1984), Classification of Vibrio Bacteriophages, Intervirology, V. 22, P. 61 -71.

37. Лскегтапп H.-W. and Krisch U.M." (1997). Л catalogue of T4-type bacteriophages. Arch. Virol. V. 142. P. 2329 2345.

38. Adams M. (1959). Bacteriophages. Intersciences Publishers Inc., New York. Intcrscienccs Publishers Ltd. London.

39. Ahearn, D.G., Borazjani, R.N., Simmons, R.B., & Gabriel, M.M. (1999) Primary adhesion of Pseudomonas aeruginosa to inanimate surfaces including biomaterial Methods Enzymol. V.310. P. 551 -557.

40. Alisky, J., K. Iczkowski, A. Rapoport and N. Troitsky (1998). Bacteriophages show Promise as Antimicrobial Agents. Journal of Infection. V. 36. P. :5 15.

41. Altschul S. F., Madden, T. L., Schaffcr, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. V. 25. P. 3389-3402.

42. Autexicr C., Wragg-Legare S. and DuBow M.S. (1991). Characterization of the Pseudomonas aeruginosa transposable phage D3112 left end regulatory region. Biochim. Biophys. Acta. V. 1088. P. 147 150.

43. Bairoch, A. and Apweiler, R. (2000). The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000. Nucleic Acids Res. V. 28. P. 45-48.

44. Barrow, P. A. and Soothill, J. S. (1997). Bacteriophage therapy and prophylaxis: rediscovery and renewed assessment of potential. Trends Microbiol. V. 5. P. 268-271.

45. Barrow, P., Lovell, M., and Bcrchicri, A., Jr. (1998). Use of lytic bacteriophage for control of experimental Escherichia coli septicemia and meningitis in chickens and calves. Clin.Diagn.Lab Immunol. V. 5. P. 294-298.

46. Bartlett D.H., Wright M.E, Silverman M. (1988) Variable expression of extracellular polysaccharide in the marine bacterium Pseudomonas aeruginosa is controlled by genome rearrangement // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V. 85. P. 3923 3927.

47. Bateman A., Birney, E., Durbin, R., Eddy, S.R., Howe, K.L, & Sonnhammer, E.L. (2000) The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res. V. 28. P. 263-266.

48. Bcscmcr J. and Borodovsky, M. (1999) Heuristic approach to deriving models for gene finding. Nucleic Acids Res. V. 27. P. 3911-3920.

49. Black, L.W., Show, M.K., & Steven, A.C. (1994) Morphogenesis of T4 head In "Molecular biology of bacteriophage T4" (J.D. Karam, Ed.), pp. 218-258. Am. Soc. Microbiiol., Washington, DC.

50. Braid M.D., Silhavy J.L., Kitts C.L., Cano R.J., Howe M.M. (2004). Complete Genomic Sequence of bacteriophage B3, a Mu-likc phage of Pseudomonas aeruginosa. J. Baceriol., V. 186. № 19. P. 6560-6574.

51. Borodovsky M., and Mclninch, J. (1993) Recognition of genes in DNA sequence with ambiguities. Biosystems. V. 30. P. 161-171.

52. Botstcin D. (1980). A theory of modular evolution for bacteriophages. Ann. N.Y. Acad. Sci. V. 354. P. 484-490

53. Botstcin D. and Herskowitz J. (1974). Properties of hybrids between Salmonella phage P22 and coliphage lambda. Nature. 251:584.

54. Bodcy G.P., Dolivar R., Fainstcin V., Jadeja 1 (1983). //Infections causcd by Pseudomonas acruginisa. Rev. Inf. Dis., V. 5. № 2. P. 279 313.

55. Brussow, H., & Desiere, F. (2001) Comparative phage genomics and the evolution of Siphoviridac: insights from dairy phages. Mol. Microbiol. V. 39 P. 213-223.

56. Brussow H., Bruttin A., Desiere F. (1998). Molecular ecology and evolution of Streptococcus thermophilic bacteriophages. Virus Genes. V.16. P. 95 109.

57. Buck G.A., Cross R.E., Wong T.P., Loera J., Groman N. (1985). DNA relationships among some tox-bearing corynebacteriophages. //Infect. Immun.V. 49. N. 3. P.679-84.

58. Campbell A. (1977). Defective bacteriophages and incomplete prophages. In: Comprehensive virology. Eds.Fraenkel-Conrat II., Wagner R.R. N.Y. Plenum Press. V. 8. P. 259/

59. Campbell A. and Botstcin D. (1983). Evolution of the lambdoid phages. In: Lambda II (Hcndrix R.W. et.al. Eds). Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, NY, P. 365380.

60. Campbell J.I.A., Albrechtsen M., Sorcnsen J. (1995). Large Pseudomonas phages isolated from barley rhizosphere// FEMS Microbiology Ecology. V. 18 . P. 63-74.

61. Carlton RM (1999). Phage therapy: past history and future prospects. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). V. 47. P. 267-74.

62. Cerritelli, N1. E. and Studier, F. W. (1996). Purification and characterization of T7 head-tail connectors expressed from the cloned gene. J.Mol.Biol. V. 258. P. 299-307.

63. Chu F.K., Malcy G.F., Malcy F., & Belfort, M. (1984) Intervening sequence in the thymidylatc synthase gene of bacteriophage T4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 81. P. 30493053.

64. Cianciotto N.P., Groman N.B. (1997). Characterization of bacteriophages from tox-containing, non-toxigenic isolates of Coryncbactcrium diphthcriac.il Microb. Pathog. V.22 N6. P.343-51.

65. Classification and Nomenclature of Viruses, Ed. R.J. Francki, C.M. Fauquet, D.L. Knudson, F. Brown, (1991), Arch.Virol., Sup.2, P. ,159- 166.

66. Clyman, J., Quirk, S., & Belfort, M. (1994) Mobile introns in the T-evcn phages. In "Molecular biology of bacteriophage T4" (J.D. Karam, Ed.), P. 83-88. Am. Soc. Microbiiol., Washington, DC.

67. Costerton J.W. (1984), The etiology and persistence of cryptic bacterial infections: a hypothesis. Rev. Infectious diseases. V. 6. P.608-616.

68. Davis R.W., Ilyman R.W. (1971). A study in evolution: the DNA base sequence homology between coliphage T7 and T3. J. Mol. Boil. V. 62. P. 287 301.

69. Davis, B.M., Lawson, E.H., Sandkvist, M., Ali, A., Sozhamannan, S., & Waldor, M.K. (2000) Convergence of the secretory pathways for cholera toxin and the filamentous phage, CTXPhi. Science, V. 288. P. 333-335.

70. DeVault J.D., Berry A., Misra T., Darzins A., Chakrabarty A.M. (1989). Enviromental sensory signals and microbial pathogenesis: Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis // Bio/Technology. V. 7. P. 352 357.

71. DuBow M.S. (1987). Transposable Mu-like phages. In: Symonds N, Toussaint A, van de Putte, Howe MM (eds) Phage Mu. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, P. 201-213.

72. Endy, D., You, L., Yin, J., Molineux, I.J., (2000). Computation, prediction, and experimental tests of fitness for bacteriophage T7 mutants with permuted genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 97. P. 5375-5380.

73. Engel J. (1997) Versatile collagens in invertebrates. Science, V. 277. P. 1785-1786.

74. Ennifar E., "Nikulin A., Tishchenko S., Serganov A., Nevskaya N., Garber, M. Ehresmann B., Ehresmann C., Nikonov S., & Dumas P. (2000) The crystal structure of UUCG tetraloop. J. Mol. Biol., V. 304. P. 35-42.

75. Falquet, L., Pagni, M., Bucher, P., IIulo, N., Sigrist, C. J., Hofmann, K., and Bairoch, A. (2002). The PROSITE database, its status in 2002. Nucleic Acids Res. V. 30. P. 235-238.

76. Finlay B.B., Falkow S. (1989). //Common themes in microbial pathogenicity. Microbiol. Rev. V. 53. P. 210-230

77. Finlay B.B., Falkow, S. (1997). Common themes in microbial pathogenity revisited // Microbial Mol. Biol. Rev. V. 61. P. 136-169.

78. Foley, S., Bruttin, A., & Brussow, H. (2000) Widespread distribution of a group I intron and its three deletion derivatives in the lysin gene of Streptococcus thermophilic bacteriophages. J. Virol., V. 74. P. 611-618.

79. Garcia, L. R. and Molineux, I. J. (1995). Rate of translocation of bacteriophage T7 DNA across the membranes of Escherichia coli. J.Bacteriol. V. 177. P. 4066-4076.

80. Garcia E., Elliott J.M., Ramanculov E., Chain P.S., Chu M.C., Molineux I.J. (2003). The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. Sep;185(17).:P. 5248-62.

81. Giamarcllou, H. (2000). Therapeutic guidelines for Pseudomonas aeruginosa infections. Int. J.Antimicrob.Agents V. 16. P. 103-106

82. Gill G.S., Hull R.C., Curtiss R. (1981). Mutator bacteriophage D108 and its DNA: an electron microscopic characterization. J. Virol., V. 35. № l.P. 420.

83. Goodrich-Blair II., Scarlato V., Gott J.M., Xu M.Q., & Shub, D.A. (1990) A self-splicing group I intron in the Bacillus subtilis bacteriophage SPOl.Cell, V. 63. P. 417-424.

84. Harshey R.M. (1971). Comparative modular structure among related phage DNAs Carnegie Inst Wash Ycarb, V. 70. P. 3.

85. Hendrix, R. W., Smith, M. C., Burns, R. N., Ford, M. E., and Hatfull, G. F. (1999). Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: all the world's a phage. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A V. 96. P. 2192-2197.

86. Ho T.D., Slauch J.M., (2001), Chorocterization of grvA, on ontivirulence gene on the gifsy-2 phage in Salmonella enterica serovor typhimurium., J. Boctcriol., V. 183 (2), P. 611 — 620.

87. Ilofmann, K., Buchcr, P., Folquet, L., & Boiroch, A. (1999) The PROSITE dotobose, its stotus in 1999. Nucleic Acids Res. V. 27. P. 215-219.

88. Hollowoy B.W., Egon J.B., Monk M., (1960). Lysogeny in Pseudomonas aeruginosa. Austrol. J. Exptl. Biol. And Med. Sei. V.38. P. 321.

89. Holloway B.W., Krishnapillai V. (1975). Bacteriophages and Bactcriocins. In: Gcnetics and Biochemistry of Pseudomonas. Eds. Clarke P.I I., Richmond M.I I., London, New York, Sydney, Toronto: Willey and Sons. P.99.

90. Howe M.M. (1987). Phage Mu: an overview. In: Phage Mu. Eds. Symonds N., Toussaint A., van de Putte, Howe M.M. Cold Spring Harbor Lab.oratory, NY, P. 25 39.

91. Jacoby G.A. (1984). //Antimicrocrobial drug resistencc// Ed. L.E. Bryan, New York, ,p. 497-514

92. Jacoby G.A., Sutton L. (1982). Restriction-modification systems determined by Pseudomonas plasmids. Plasmid. V. 8(2). P. 141-147.

93. Jacoby G.A., Sutton L., Knobel L., Mammen P. (1983). Properties of IncP-2 plasmids of Pseudomonas spp.// Antimicrob. Agents Chemother. V. 24. P. 168-175.

94. Jim D. Karan. (1994). Molecular Biology of Bacteriophage T4. ASM Press. Washington. P. 482-483.

95. Juhala, R.J., Ford, M.E., Duda, R.L., Youlton, A., Hatfull, G.F., & Hendrix., R.W. (2000) Genomic sequences of bacteriophages IIK97 and IIK022: pervasive genetic mosaicism in the lambdoid bacteriophages. J. Mol. Biol., V. 299. P. 27-51.

96. Kawakami Y., Mikoshiba F., Nagasaki S. Et al. (1972).- J. Antibiot. (Tokyo). V. 25. P. 607-609

97. Kessler C. and Manta V. (1990) Specificity endonucleases and DNA modification methyltransferases. Gene, V. 92. P. 1-248.

98. Kim J.S. and Davidson N. (1974). Electron microscope hctcroduplcx studies of sequence relations ofT2, T4 and T6 bacteriophage DNAs. Virology. V. 57. P. 93 111.

99. Kim, B.C., Kim, K., Park, E. IL, & Lim, C. J. (1997) Nucleotide sequence and revised map location of the arn gene from bacteriophage T4. Mol Cells V. 17. P. 694-696.

100. Korsten, K. II., Tomkievvicz, C., and Hausmann, R. (1979). The strategy of infection as a criterion for phylogcnetic relationships of non-coli phages morphologically similar to phage T7. J.Gen. Virol. V. 43. P. 57-73.7"

101. Kostyuchenko, V.A., Navruzbekov, G.A., Kurochkina, L.P., Strelkov S.V., Mcsyanzhinov, V.V., & Rossmann, M.G. (1999) The structure of bacteriophage T4 gene product 9: the trigger for tail contractioa Structure Fold. Des., V. 7. P. 1213-1222.

102. Kovalyova IV, Kropinski AM. (2003). The complete genomic sequence of lytic bacteriophage gh-1 infecting Pseudomonas putida—evidence for close relationship to the T7 group. Virology. Jul V.5. № 311(2). P. 305-315.

103. Kropinski, A. M. (2000). Sequence of the genome of the temperate, serotype-converting, Pseudomonas aeruginosa bacteriophage D3. J.Bacteriol. V. 182. P. 6066-6074.

104. Krylov V.N. (1998). These puzzling pseudomonade transposon phages. Science in Russia. № 1. P. 38-44

105. Krylov, V.N., Smirnova, T.A., Minenkova, I.B., Plotnikova, T.G., Zhazikov, I.Z., & Khrenova, E.A. (1984) Pseudomonas bacteriophage cpKZ contains an inner body in its capsid. Can. J. Microbiol. V. 6. P. 758 -762.

106. Krylov V.N., Tolmacheva T.O., Akhvcrdian V.Z. (1993). DNA homology in species of bacteriophages active on Pseudomonas aeruginosa. Arch. Virol. V. 131. № 1 — 2. P. 141 -152.

107. Kutter E. (1997). Phage Therapy: Bacteriophages as Antibiotics, Evergreen State College, Olympia, WA 98505 -- Nov. 15,.

108. Kutter E., Gachechiladze K., Poglazov A., Marusich E., Shaidcr M., Aronsson P., Napuli A., Porter D. and Mesyanzhinov V. (1996). Evolution of T4-related phages. Virus Genes. V. 11. P. 285-297.

109. Kutter E., Kellenberger E., Carlson K. et al. (1994a). Effects of bacterial growth conditions and physiology on T4 infection. In: "Molecular biology of bacteriophage T4" Ed. Karam J.D. Amer. Soc. Microbiiol., Washington. P. 491-519.

110. Kuzio J., Kropinski A.M. (1983). O-antigcn conversion in Pseudomonas aeruginosa PAOl by bacteriophage D3. J. Bacteriol. V.155. P. 203-212.

111. Lambowitz A.M. and Belfort M. (1993) Introns as mobile genetic elements. Annu Rev Biochem. V. 62. P. 587-622.

112. Lanyi B., Bergan T. (1978). //Methods in microbiology. London, V. 10. P. 93-168

113. Lavigne R., Briers Y., Ilertveldt K., Robben J., Volckaert G. (2004) Identification and characterization of a highly thermostable bacteriophage lysozyme. Cell Mol. Life Sci. V. 61(21). P. 2753-2759.

114. Lecuit, M., Vandormael-Pournin, S., Lefort, J., Iluerre, M., Gounon, P., Dupuy, C., Babinet, C., & Cossart, P. (2001) A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. V. 292. P. 1722-1725.

115. Le Minor ct al. (1984), Genus Salmonella. In: Bergey's Mamual of Systematic Bacteriology., P. 427-458, Williams & Wilkins, Baltimore.

116. Lecuit, M., Vandormael-Pournin, S., Lefort, J., Iluerre, M., Gounon, P., Dupuy, C., Babinet, C., & Cossart, P. (2001) A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science, V. 292. P. 1722-1725.

117. Leffers G., Rao V.B. (1996). A discontinuous headful packaging model for packaging less then heedful length DNA molecules by bacteriophage T4. J. Mol. Biol. V. 24. P. 838-845.

118. Leiman, P.G, Kostyuchenko, V.A., Shneider, M.M., Kurochkina, L.P., Mesyanzhinov, V.V., & Rossmann, M.G. (2000) Structure of bacteriophage T4 gene product 11, the interface between the baseplate and short tail fibers. J. Mol. Biol. V. 301. P. 975-985.

119. Levin, B.R., & Tauxe, R.V. (1996) Cholera: nice bacteria and bad viruses. Curr. Biol. V. 6. P. 1389-1391.

120. Lindberg R.B., Latta R.L., Brame R.C., and Moncriff J.A. (1964). Definitive bacteriophage typing system for Pseudomonas aeruginosa!I Bact. Proc. P.81

121. Lindberg R.B., Latta R.L. (1974). Phage typing of Pseudomonas aeruginosa: clinical and epidemiologic considerations. J. Infect. Dis. V. 130. P. 33 43.

122. Loayza D., Carpousis A.J. and Krisch II.M. (1991). Gene 32 transcription and mRNA processing in T4-related bacteriophages. Mol. Microbiol. V. 5. P. 715 725.

123. Loessner, M.J., Inman, R.B., Lauer, P., & Calendar, R. (2000) Complete nucleotide sequence, molecular analysis and genome structure of bacteriophage A118 of Listeria monocytogenes: implications for phage evolution. Mol Microbiol. V. 35. P. 324-340.

124. Lowe T.M. and Eddy S.R (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. V. 25. P. 955-964.

125. Lucchini, S., Desiere, F., & Brussow, II. (1999) Comparative genomics of Streptococcus thcrmophilus phage species supports a modular evolution theory. J Virol. V. 73. P. 8647-8656.

126. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. N. Y.: Cold Spring Harbor Lab.

127. Martin D.W., Schurr M.J., Mudd M.H., Govan J.R.W., Holloway B.W., Deretic U. (1993) Mechanism of conversion to mucoidy in Pseudomonas aeruginosa infecting cystic fibrosis patients 11 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V. 90. № 18. P. 8377-8381.

128. Matsuzaki S., Inoue T., Kuroda M., Kimura S., Tanaka S. (1998). Cloning and sequencing of major capsid protein (mcp) gene of a vibrio-phage, KVP20, possibly related to T-even coliphages. Gene. V. 222. P. 25-30.

129. Matthews, D.A., Appelt, K„ Oatley, S.J., & Xuong, N.I I. (1990) Crystal structure of Escherichia coli thymidylate synthase containing bound 5-fluoro-2'-deoxyuridylate and 10-propargyl-5,8-dideazafolate. J. Mol. Biol. V. 214. P. 923-936.

130. McLaughlin, J.R., Wong, H.C., Ting, Y,E., Van Arsdell, J.N., & Chang, S. (1986) Control of lysogeny and immunity of Bacillus subtilis temperate bacteriophage SP beta by its d gene. J. Bacteriol. V. 67. P. 952-959.

131. McPhcetcrs D.S., Gosch G. and Gold L. (1988). Nucleotide sequence of the bacteriophage T2 and T6 gene 32 mRNAs. Nucleic Acids Res. V. 16. P. 9341.

132. McShan W.M., Ferretti J.J. (1997). Genetic diversity in temperate bacteriophages of Streptococcus pyogenes: identification of a second attachment site for phages carrying the erythrogenic toxin A gene.// J. Bacteriol. V. 179 . P.6509-11

133. Mikkonen M., Alatossava T. (1995) A group I intron in the terminase gene of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis phage LL-H. Microbiology, V. 141. P. 2183-2190.

134. Miller J.H. (1972) Experiments in molecular genetics. N. Y.: Cold Spring Harbor1.b.

135. Miller R.V., Rubero V.J.R., Mucoid (1984). Conversion by Phages of Pseudomonas aeruginosa Strains from Patients with Cystic Fibrosis, J.Clin.Microbiol. V.19. P.717 719

136. Moller, S., Croning, M. D., and Apweiler, R. (2002). Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions. Bioinformatics. V. 18. P. 218.

137. Monod, C., Repoila, F., Kutateladze, M., Tetart, F., & Krisch, H.M. (1997) The genome of the pseudo T-even bacteriophages, a diverse group that resembles T4. J. Mol. Bio. V. 267. P. 237-249.

138. Morgan A.F. (1979). Transduction of Pseudomonas aeruginosa with a mutant of bacteriophage E79. J. Bacteriol. V. 139. P. 137 140.

139. Morgan G.J., Hatfull G.F., Casjens S., and Hendrix R.W. (2002). Bacteriophage Mu genome sequence: analysis and comparison with Mu-like prophages in Haemophilus, Neisseria and Deinococcus. J. Mol. Biol. V. 317. P. 337 359.

140. Nida S.K., Ferretti J.J. (1982). Phage influence on the synthesis of extracellular toxins in group A streptococci.// Infect. Immun. V.36(2). P.745-50.

141. Nilsson A.S., Karlsson J.L., Haggard-Ljungquist E. (2004). Mol. Biol. Evol. V. 21(1). P. 1-13.

142. Pajunen M. I., Kiljunen S. J., and Skurnik, M. (2000). Bacteriophage phiYe03-12, specific for Yersinia enterocolitica serotype 03, is related to coliphages T3 and T7. J. Bacteriol. V. 182. P. 5114-5120.

143. Pajunen, M. I., Kiljunen, S. J., Soderholm, M. E., and Skurnik, M. (2001). Complete genomic sequence of the lytic bacteriophage ®Ye03-12 of Yersinia enterocolitica serotype 0:3. J.Bacteriol. V. 183. P. 1928-1937.

144. Pajunen, M.I., Elizondo, M.R., Skurnik, M., Kieleczawa, J., Molineux, I.J., (2003). Complete nucleotide sequence and likely recombinatorial origin of bacteriophage T3. J. Mol. Biol. V. 319. P. 1115-1132.

145. Rehmat S. and Shapiro J.A. (1983). Insertion and replication of the Pseudomonas aeruginosa mutator phage D3112. Mol. Gen. Genet. V. 192: P. 416-423.

146. Qiao X., Qiao J., Onodcra S., Mindich L. (2000). Characterization of phi 13, a bacteriophage related to phi6 and containing three ds RNA genomic segments. Virology. V. 275. P. 218-224.

147. Rao V.B., Thaker V., Black L.W. (1992). A phage T4 in vitro packaging system for cloning long DNA molecules. Gene. V. 113. P. 25 — 33.

148. Reese M. G. (2001). Application of a time-delay neural network to promoter annotation in the Drosophila melanogaster genome. Comput.Chem. 26, 51-56.

149. Rohwer F.L., Segall,A.M., Steward,G., Seguritan,V., Breitbart,M.,\Volven,F. and Azam,F (2000). The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOl shares homology with nonmarine phages. Limnol. Oceanogr. V. 45 (2). P. 408-418.

150. Salmon K.A., Freedman O., Ritchings B.W., and DuBow M.S. (2000). Characterization of the lysogcnic repressor (c) gene of the Psendomonas aeruginosa transposable bacteriophage D3112. Virology. V. 272. P. 85 97.

151. Salzbcrg S. L., Delcher A. L. Kasif, S. and White, O. (1998). Microbial gene identification using interpolated Markov models. Nucleic Acids Res. V. 26. P. 544-548.

152. Schacchtcr N., Mcdoff G., Eisenstain B (1993). //Mechanisms of microbial disease. Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland, USA,

153. Scholl D., Kicleczawa J., Kemp P., Rush J., Richardson C.C., Merril C., Adhya S., Molincux I.J. (2004) Genomic analysis of bacteriophages SP6 and Kl-5, an estranged subgroup of the T7 supergroup. J. Mol. Biol. Jan V. 30 № 335(5). P.l 151 1171

154. Selick I I.E., Stormo G.D., Dyson R.L. and Alberts B.M. (1993). Analysis of five presumptive protein-coding sequences clustered between the primosome genes, 41 and 61, of bacteriophages T4, T2 and T6. J. Virol., V. 67. P. 2305-2316.

155. Shub, D., Coctzee, T., Hall, D.H., & Belfort, M. (1994a) The self-splicing introns of bacteriophage T4. In "Molecular biology of bacteriophage T4" (J.D. Karam, Ed.), P. 186-192 Am. Soc. Microbiiol., Washington, DC.

156. Shub, D.A, Goodrich-Blair, II., & Eddy, S.R. (1994b) Amino acid sequence motif of group I intron endonucleases is conserved in open reading frames of group II introns Trends Biochem. Sci., V. 19. P. 402-404.

157. Shabalova, L.A., N.I. Kapranov, V.N. Krylov, T.O. Sharibjanova, V.Z. Akhverdian, L.K. Katosova, L.P. Klukina. 1992. Suscertibility of Pseudomonas aeruginosa in patients with

158. CF to Pseudomonas aeruginosa bacteriophage// Pediatric Pulmonology.Supplemcnt 8, September 1992. Sixth Annual North American Cystic Fibrosis Conference. Washington, DC. October 15-18, 1992. P. 295. Abstract 225.

159. Sjoberg, B.M., Hahne, S., Mathews, C.Z., Mathews, C.K., Rand, K.N., & Gait, M.J. (1986) The bacteriophage T4 gene for the small subunit of ribonucleotide reductase contains an intron. EMBOJ. V. 5. P. 2031-2036.

160. Slopek S., Kucharcwicz-Krukowska A; Weber-Dabrowska B; Dabrowski M (1985a). Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections. IV. Evaluation of the results obtained in 370 cases. Arch Immunol Ther Exp V. 33(2). P. 219-40.

161. Slopek S., Kucharcwicz-Krukowska A; Weber-Dabrowska B; Dabrowski M (1985b). Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections. V. Evaluation of the results obtained in children. Arch Immunol Ther Exp V. 33(2). P. 241-59.

162. Slopek S., B. Weber-Dabrowska, M. Dabrowski and A. Kucharcwica-Krukowska, (1987a). Results of Bacteriophage Treatment of Suppurative Bactcrial Infections in the Years 1981-1986. Arch. Immunol. Ther. Exp. V. 35. P. 569-583.

163. Slopek S. and A. Kucharcwica-Krukowska, (1987b). Immunogenic cffcct of bacteriophage in patients subjected to phage therapy. Arch Immunol Ther Exp V. 35(5). P. 55361.

164. Smith, M.C., Burns, N., Saycrs, J.R., Sorrell, J.A., Casjcns, S.R, & Ilendrix, R.W. (1998) Bacteriophage collagen. Scicnce, V. 279. P. 1834.

165. Smith, M.C., Burns, R.N., Wilson, S.E., & Gregory, M.A. (1999) The complete genome sequence of the Streptomyces temperate phage straight phiC31: evolutionary relationships to other viruses. Nucleic Acids Res., 27, 2145-2155.

166. Soothill J.S. (1992) Treatment of experimental infections of mice with bacteriophages. J. Med. Microbiol. V. 37(4). P. 258 261.

167. Soothill J.S. (1994). Bacteriophage prevents destruction of skin grafts by Pseudomonas aeruginosa. Burns. V. 20(3). P. 209 211.

168. Southern E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophores. J. Mol. Biol. V. 98. P. 503.

169. Stanier R.J., Palleroni N.J., DoudorofT M. (1966). The aerobic pseudomonads: a taxonomic study. J. Gen Microbiol., V. 43, P. 159-271

170. Susskind M., Botstein D. (1978). Molecular genetics of bacteriophage P22. Microbiol. Rev. V. 42. P. 385 -413.

171. Tao, Y., Strelkov, S.V., Mesyanzhinov, V.V., & Rossmann, M.G. (1997) Structure of bacteriophage T4 fibritin: a segmented coiled coil and the role of the C-terminal domain. Structure, V. 5. P. 789-798.

172. Taylor A.L. (1963). Bactcriophage-induced mutation in E.coli. Proc. Nat. Acad. Sci. USA V. 50: P. 1043-1051.

173. Tetart F., Desplats C., Kutatcladze M., Monod C., Ackermann II.-W., Krisch H.M. (2001). Phylogeny of the major head and tail genes of the wide-ranging T4-type bacteriophages// J. Bacteriol. V. 183. (1). P. 358-366.

174. Ulycznyj P.I., Salmon K.A., Douillard II. and DuBow M.S. (1995). Characterization of the Pscudomonas aeruginisa transposable bacteriophage D3112 A and B genes. Biochim. Biophys. Acta. V. 1264. № 3. p. 249 253.

175. Valpucsta, J. M. and Carrascosa, J. L. (1994). Structure of viral connectors and their function in bacteriophage assembly and DNA packaging. Q.Rev.Biophys. V. 27. P. 107-155.

176. Vander Byl C., Kropinski A.M. (2000). Sequence of the genome of Salmonella bacteriophage P22. J. Bacterid. V.182. P. 6472-6481.

177. Van Ilultcn, M.C.W., Wittcveldt, J., Peters, S., Kloosterboer, N., Tarchini, R., Fiers, M., Sandbrink, H., Lankhorst, R.K. & Vlak, J.M. (2001) The white spot syndrome virus DNA genome sequence Virology, V. 286. P. 7-22.

178. Van Sindcrcn, D., Karsens, II., Kok, J., Terpstra, P., Ruiters, M.H., Vencma, G, & Nauta, A. (1996) Sequence analysis and molecular characterization of the temperate lactococcal bacteriophage rlt. Mol. Microbiol., V. 19. P. 1343-1355.

179. Wang P.W., Chu L. and Guttman D.S., (2004). Complete sequence and evolutionary genomic analysis of the Pseudomonas aeruginosa transposable bacteriophage D3112. J. Bacterid. V. 186. №2. P. 400-410.

180. Williams K.P., Kassavetis G.A., Hercndecn D.R., and Geiduschck E.P. (1994) Regulation of late-gene expression. In "Molecular biology of bacteriophage T4" (J.D. Karam, Ed.), P. 161-175. Am. Soc. Microbial., Washington, DC.

181. Yeh L.S., Hsu T. and Karam J.D. (1998). Divergence of a DNA replication gene clastcr in the T4-related bacteriophage RB69. J. Bacteriol. V. 180. P. 2005 2013.

182. Young K.K., Edlin G., Wilson G.G. (1982). Genetic analysis of bacteriophage T4 transducing bacteriophages. J. Virol. V. 41. P. 345 347.

183. Young, R. (1992). Bacteriophage lysis: mechanism and regulation. Microbiol. Rev. V. 56. P. 430-481

184. Young, R. and Blasi, U. (1995). Holins: form and function in bacteriophage lysis. FEMSMicrobiol.Rev. V. 17. P. 191-205.

185. Young K.K., Edlin G. (1983). Physical and general analysis of bacteriophage T4 generalized transduction. Mol. Gen. Genet. V. 192. P. 241 -246.

Информация о работе

Буркальцева, Мария Владленовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изучение двух групп уникальных - ΦKZ-подобных и Т7-подобных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы