Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие нелизогенизирующих бактериофагов PSEUDOMONAS AERUGINOSA с клетками бактерий хозяина

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие нелизогенизирующих бактериофагов PSEUDOMONAS AERUGINOSA с клетками бактерий хозяина"

»5 О 5 9 г ■

' РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГЖ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

УДК 579.841.11-881+575.24:576.858.9

Балакшна Валентина Владимировна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕШОГЕНИЗИРУЩИ БАКТЕРИОФАГОВ КЕТООМОНАЗ АЕШШГОБА С КЛЕТКАМИ БАКТЕРИЙ ХОЗЯИНА

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 1992 г.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии

микроорганизмов РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор А.М.Воронин кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Л.А.Кулаков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Е.Л.Головлев доктор биологических наук, профессор Б.Н.Крылов

Ведущее учреждение: Московский государственный университет

ем.М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Кафедра генетики

Защита состоится " ^" •¿ЬьРЬСеЯ- 1992 года в ^'час. ^Лшн. на заседании Специализированного Совета (Д.002.69.01) при Институте биохимии и физиологиии микроорганизмов РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан "^ " года.

Ученый секретарь Специализированного Совета

доктор биологических наук

В.М.Вагабов

_ t ■■■>. 1

. .-Актуальность темы.Бактерии рода Pseudomonas привлекают к себе большое внимание исследователей. Это обусловлено целым рядом причинЦсевдомонады часто являются преобладающая! в различных ■природные популяциях. Некоторые вида вызывают различные заболева-Г..ния и растений. Бактерии рода Pseudomonas проявляют уни-

кальные способности утилизировать саше различные, в том числе дешевые, химические соединения в качестве источников углерода и энергии. Это создает предпосылки для использования псевдомонад в микробиологической промышленности, получения на их основе методами генной инженерии штаммов продуцентов.

В связи с этим вызывает особый интерес изучение механизмов взаимодействия бактерий Pseudomonas со специфичными бактериофагами. Принципиальное значение имеет вопрос о способах приобретения бактериями устойчивости к фагам. Исследования в этом направлении имеют важное теоретическое значение: изучается генетическая организация бактерий и фагов, выявляется роль фагов в эволюции генома бактерий, исследуется возникновение фагоустойчивых штаммов, Неоспоримо значение подобных исследований и для прикладной микробиологии. Практически все отрасли микробиологической промышленности, использующие в качестве продуцентов бактерии и актиномице-ты, сталкиваются с лизисами, которые вызываются бактериофагами и актинофагами. Не являются исключением и производства, использующие бактерии Pseudomonas. Расширяется использование бактериофагов в медицинской практике при лечении ряда инфекционных заболеваний человека, в ветеринарии - при лечении заболеваний скота, а также в растениеводстве - для борьбы с фигопатогекными микроорганизмами.

Для бактерий рода Pseudomonas описано большое число бактериофагов как вирулентных, так и умеренных. Многие из них представляют интерес. К таким бактериофагам относятся интенсивно . исследуемые фаги - гранспозоны P.aeruginosa. Значительно хуже изучены вирулентные бактериофаги р.aeruginosa.

В лаборатории биологии плазмид были выделены и описаны нели-зогенизирующие бактериофаги P.aeruginosa, принадлежащие к четырем неродственным группам. Было показано, что эти фаги обладают различной адсорбционной специфичностью. Структура генома фагов одной группы - Tu - изучалась более детально.

Представляло интерес исследование способов поддержания этих бактериофагов в бактериальных популяциях, их взаимодействие с клетками бактерии хозяина, в том числе - плазмидсодержащими и рестрицирующими бактериями.

Цель и конкретные задачи исследования. Целью настоящей

- г -

работы является изучение, взаимодействия нелизогешзирующих бактериофагов Р.aeruginosa fk, и /ran с бактериями хозяина. В соответствии с даной целью были определены следующие задачи:

1. Изучение динамики взаимодействия нелизогешзирующих бактериофагов P.aeruginosa /¡с, «п и/лп с бактериями, хозяина в условиях непрерывного культивирования.

2. Исследование ограничения бактериофагов P.aeruginosa /к, /га и /щи на различных, плазмидсодержащих штаммах, а также на штаммах, содержащих системы рестрикции-модификации p.aeruginosa.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые исследовалось взаимодействие нелизогешзирующих бактериофагов P.aeruginosa с клетками бактериального хозяина в условиях непрерывного культивирования. Выявлены два тша поддержания бактериофагов в ПОПУЛЯЦИЯХ P.aeruginosa.

При сравнительном изучении влияния R-плазмид на развитие нелизогенизирующих и умеренных бактериофагов p. aeruginosa" обнаружено ограничение их одними и теми же плазмидами.

Впервые для бактериофагов P.aeruginosa показано, что фаги /к имеют собственную систему защиты от рестрикции-модификации, детерминируемой штаммами хозяина. Данная система защиты не связана с модификацией ДНК, локализована в 3'-концевой области ДНК фага, в районе ника 6. Получены данные, позволяющие предполагать существование у фага ^№77 двух различных систем защиты от эндонуклеаз рестрикции.

Особый интерес представляет наблюдение, что часть мутаций по рестрикционной защите влияет на распределение однонитевых канонических разрывов в фаговой ДНК, то есть, по-видимому, они являются мутациями по гену (генам) никазы.

Научно-практическая значимость полученных результатов. В настоящей работе представлены данные по динамике изменений численности вирусов бактерий и бактериальных клеток в условиях непрерывного культивщрования. Выявлены различные механизмы поддержания бактерий и специфичных к ним бактериофагов в популяциях, что позволяет судить о различных путях коэволюции бактерий и специфичных к ним нелизогенизирующих бактериофагов- P.aeruginosa. Показана возможность получения мутантов фага v>mF8i по кругу хозяев в больших популяциях с использованием методов непрерывного культивирования.

Анализ влияния Е-плазмид на развитие нелизогенизирующих бактериофагов показал подавление фагов группы ут на ряде плазмидосо-

держащих штаммов р.aeruginosa. Полученные результаты окажутся полезными при использовании бактериофагов в качестве лечебных и сельскохозяйственных препаратов.

Показано наличие у фагов/к p.aeruginosa системы зашиты (do) от рестрикции-модификации, детерминируемой штаммами хозяина. Создана коллекция мутантов фага >*cF77 по системе защиты, которая использована для генетического анализа 4с локуса. Разработана система рекомбинационного анализа ■ do области ДНК фага /№77.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (з главы), описания материалов и методов исследований, изложения экспериментальных результатов (3 главы), обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 128 страниц машинописного текста, включая ю рисунков и 13 таблиц. Библиография включает 201 литературный источник, в том числе -140 зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конферении "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации; растениеводства и кормопроизводства".секция: Вирусы растений, животных и микроорганизмов (Алма-Ата, 199о).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плазшды и бактериофаги. Штамм P.aeruginosa РА0242 получен от Б.Холловея (Австралия), штаммы P.aeruginosa ML4262, ML4600 - от С.Митсухаши (Япония), рестрици-рующие штаммы P.aeruginosa: РАОЗОЗ (pMG7). РАОЗОЗ (pMG70), РАОЗОЗ (pMG71), РА0038 (pMG73) - от Дж.Джакоби (США). Фагоустойчивые штаммы Б.aeruginosa РА0242: РА0242 •fiP-fztnP-fn?, РА0242 -f l^yWVn3, РА0242 №SiminsyraR, а также штамм P.putida BS394 получены из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАЯ.' Были использованы R-плазмида, принадлежащие к группам несовместимости Р-2 и Р-5, они получены из коллекции лаборатории биологии плазмид. В работе использованы нелизогенизирущие бактериофаги P.aeruginosa: ?kJ77, ^kPi79, VriiPsi, rmF77, -лтРвг, f,mnP78 - из коллекции лаборатории биологии плазмид, Е79, получен от Б.Холловея (Австралия).

Среды. В качестве полноценных сред использовали мясо-пептон-ный агар, Ь-бульон (Charhart, Hegeman, 1975), среду гхУТ (Миллер, 1976). В качестве минимальной использовалась среда М9 с добавлением 0,5% глюкозы в качестве иточшжа углерода (Клаус, Хейс,

1970). В экспериментах по непрерывному культивированию использовали жидкую минерально-солевую среду (Балакшина и др., 1987).

Условия непрерывного культивирования P.aeruginosa РА0242 со специфичными бактериофагами описаны в работе (Балакшиной и др., 1987).

Основные методы, использованные в работе с бактериофагами: определение титра фага, получение фага в высоком титре, измерение уровня адсорбции описаны в книге М. Адамса (1961).

Мутагенез фага гидрокс&йамином проводили согласно (Девис и др., 1984), нитрозогуанидином - как описано в книге Дж.Миллера (1976).

Комплементация измерялась по методам (Benser, 1955), (Battreall et al., 1979).

Чувствительность бактериофагов к действию повышенной температуры в присутствии хелатирующих агентов проводили по модифицированному методу, предложенному ранее для бактериофага Т5 и его производных (Чернов и др.,' 1979).

Скрещивание бактериофагов проводили согласно (Девис и др., 1934).

Выделение фаговой ДНК проводили согласно (landy et "al.,1974).

Гидролиз препаратов ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили в условиях, рекомендуемых фирмой Boehringer.

Быстрое тестирование наличия одконитевых разрывов у фагов проводили, используя модифицированный метод Роджерса с соавторами (Rogers et al., 1979).

Выделение и клонирование фрагментов ДНК бактериофагов проводили согласно методическим рекомендациям, приведенным (Маниатис и др., 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Динамика взаимодействия нелизогенизирующих бактериофагов Eseudomonas aeruginosa с бактериями хозяина

В связи с широким распространением в природе бактериофагов P.aeruginosa, а также с перспективами промышленного использования псевдомонад и клиническим их значением, большой интерес представляет изучение популяционннх взаимодействий между бактериофагами и клетками бактериального хозяина. Удобным методом для изучения таких взаимоотношений может быть метод непрерывного культивирования.

Изучалось взаимодействие нелизогенизирующих бактериофагов

- 5 -

>/№77, .vteiFS2 и/тР81 с бактериями хозяина.

1.1. Динамнка взаимодействия фага >°jcF77 с Pseudomonas

aeruginosa PAQ242 При совместном культивировании клеток P.aeruginosa РА0242 с бактериофагом у°!№77 по прошествии 1.2 генерации титр исходных клеток значительно снизился (в 1(Яраз), а бактериофага - возрос более чем в Ю4 раз (Рис.1). Наблюдался лизис бактериальной

30 60 90 120 150 180 210

Время (ч)

/

Рис.1. Динамика популяционных изменений Р.aeruginosa РА0242 и бактериофага VkF77 в условиях непрерывного культивирования.

1 - изменение титра бактериальной культуры

2 - изменение тигра бактериофага

культуры. С этого момента преобладающим типом бактериальной популяции стали фагоустойчивые клетки РА0242 уйг^. Однако, по истечении десяти генераций, в пробах наряду с РА0242 /к11 клетками, стали обнаруживаться клетки типа РА0242 которые через 120 часов культивирования составили 65Я» а к концу эксперимента - 7бй бактериальной понулящш. При исследовании стабильности взятых из ферментера РА0242 уъ^ клеток было обнаружено, что от 20$ до 40&

проанализированных фагоустойчивых клеток дают расщепление на РАОг^/к1* и РАОгАгу'к3 клоны. Фагочувствительные клоны в этих случаях вылеплялись с частотам! 10-30&. Они были стабильны в ряду клеточных поколений, тогда как фагоустойчивые клоны обнаруживали дальнейшее расщепление на РАОгдг/к11 и PA0242yfcs субклоны.

Присутствие высокой концентрации фагочувствительных клеток, очевидно, и является причиной поддержания фага в достаточно высоком титре до конца эксперимента.

Анализ фаговых клонов из каждой пробы на газонах исходного штамма p.aeruginosa РА0242 и стандартных фагоустойчивых мутантов показал, что круг хозяев фага у №77 не изменился на протяжении всего эксперимента.

1.2. Динамика взаимодействия фага ^,iaiFB2 с Pseudomonas 'aeruginosa PAQ242

При изучении взаимодействия фага ytani82 с клетками бактерии-хозяина была получена иная картина, чем для </kF77 (Рис.2). Через

30 60 90 120 150 180 210 240

Время (ч)

Рис.г. Динамика популяционных изменений P.aeruginosa РА0242 и бактериофага v*nwF82 в условиях непрерывного культивирования.

1 - изменение титра бактериальной культуры

2 - изменение титра бактериофага

7 часов культивирования наблюдался лизис бактериальных клеток. С этого момента преобладающим типом бактерий стаж фэгоустойчивые клетки. Анализ таких клонов, выделенных из ферментера, показал стабильность признака VTmR в ряду поколений .На основании этого мы обозначили РА0242 у!шпЕ-клетки как фэгоустойчивые мутанты первого порядка. Фаговая популяция к этому времени была представлена исходным фагом дикого типа /пшР82. По прошествии тридцати генераций в популяции появился бактериофаг, способный расти как на исходном штамма РА0242, так и на фагоустойчивом мутанте РА0242 /mnR первого порядка. Этот мутант фага по кругу хозяев был обозначен как /лпР82Ь. Через 120 -часов культивирования в бактериальной популяции явно преобладающими (более 99%) являлись фэгоустойчивые клетки, нелизироваввшеся фагом дикого типа ятпР82 и его мутантом по кругу хозяев (/тпР82Ю. Мы обозначили их как фэгоустойчивые мутанты второго порядка РАО242 /.nn^iW1 • Несмотря на то, что фаг .^гааР82 дикого типа и его h-мутанты не способны расти на РАО242 mE ymnhR клетках, эти фаги поддерживались в относительно высокой концентрации (2x1 о частиц/мл) до конца эксперимента.

1.3. Динамика взаимодействия фага /rriF8l с Pseudomonas

aeruginosa РА0242 При изучении взаимодействия фага ^тР81 с ■ клетками р.aeruginosa РА0242 обнаружен тип взаимодействия, аналогичный рассмотренному выше РА0242 - фаг /toiF82. Было выявлено три последовательных состояния бактериальной популяции:

1. Популяция состоит из клеток исходного штамма РА0242.

2. В популяции преобладают фэгоустойчивые мутанты первого порядка.

3. В популяции преобладают фэгоустойчивые мутанты второго порядка.

■ Было обнаружено также два состояния фаговой популяции:

1. Популяция состоит из исходного фага ^mF8i.

2. В популяции присутствует исходный фэг и его мутант по кругу хозяев y*mF8lh.

Следует отметить,- что ранее (Блохина и др., 1985) в условиях периодического культивирования бактерий P.aeruginosa РА0242 и бактериофага /гаР81 не удалось получить мутанты фага по кругу хозяев. По-видимому, частота образования мутантов этого фага по кругу хозяев низкая, в связи с чем появление и накопление h-мутантов /№81 удалось обнаружить лишь при анализе больших популяций бактерий и фагов.

До конца эксперимента фаги поддерживались в достаточно высокой концентрации, хотя дикий тип yrrmiB2 и VmF8i и их мутанты по кругу хозяев не способны расти на фагоустойчивых бактериальных мутантах второго порядка. Аналогичный состав бактериальной и фаговой популяции наблюдали ранее для-бактерий E.coli и фага Т7 (Chao et al., 1977).

Поскольку не было обнаружено вариантов фага, способных расти на фагоустойчивых мутантах второго порядка, мы предположили, что сохранение фаговой популяции обусловлено присутствием "минорных" популяций фагочувствительных клеток.

Таким образом, изучение взаимодействия бактерий P.aeruginosa с вирулентными бактериофагами выявило два типа изменений (коэволюции) бактериальной и фаговой популяций. Причем, поддержание фаговых и бактериальных популяций может осуществляться в одном случае за счет мутационных событий - возникновение бактериальных фагоустойчивых мутантов и мутантов фага, преодолевающих эту устойчивость, в другом случае - за счет способности бактерий P.aeruginosa РАО к образованию- нестабильных фагоустойчивых вариантов.

II. Влияние плазмид на развитие нелизогенизирукщих бактериофагов P.aeruginosa

Широкое распространение плазмидсодержапщх штаммов в популяциях р.aeruginosa вызвало интерес к изучению влияния плазмид на развитие бактериофагов. Ваш.Оыло исследовано влияние R-плазмид на развитие четырех групп неродственных нелизогенизирукщих бактериофагов: /к, у»и, /тпТ82, утпР78. Обнаружено, что бактериофаги /к и <Дпп не ограничиваются использованными в работе R-плазмидами (табл.1).

На рост бактериофагов плазмида влияли в разной степени. Практически полностью подавляли развитие фага VmF8i (ЗП<ю~9) штаммы, несущие плазмида pBSio, pBSH, pBSi2, pBS13, PBS31, PBS32, pBS33, PBS35, pBS37, pBS38, pBS39, pBS51, pBS66. В TO же время плазмида pBS48 не влияла на рост фага y»mF8i, но ' снижала эффективность посева родственного ему фага y>mF77 в юоо раз. Плазмида pBSio и pBSi3 снижали эффективность посева *пй?77 в юо и юоо раз соответственно (таол.1). Морфология негативных колоний не изменялась при выращивании фага y?inF77 на плазмидсодержащих штаммах РАО242.

Другие плазмида, ограничивающие развитие бактериофага /№81,

не снижали эффективность посева /niF77. Между тем, ранее было показано, что эти бактериофаги обладают рядом общих свойств: сходной морфологией частиц, сходными адсорбционными свойствами, обнаруживают серологическое родство (Кулаков и др.,1985; Мазепа и др, 1987). Кроме того, бактериофаги у№77 и /№81 обнаруживают высокую степень гомологии ДНК, негсмологичные области не превышают 2% длины-гетеродуплексной молекулы (Kulakov et al., 1975К В то же время эти фаги видимо отличаются по большому числу непротяженных областей негомологии. Вероятно, их эволюция шла путем накопления точечных мутаций.

Таблица 1. Взаимодействие нелизогенизирующих бактериофагов Г.aeruginosa о плазмидсодержащимн штаммами

Бактериальные Эффективность посева бактериофагов

штаммы ■ __

/kF77 /№179 ^mF8 i PmF77 №iF82 tfmnP78 E79

PA0242 1 1 1 1 1 1 1

PA0242 pBSIO 1 1 <10-9 1СГ2 1 1 10'6

PA0242 pBS11 1 1 <1CT9 1 1 1 НП

FA0242 pBS12 1 1 <10-9 1 1 1 НП

PA0242 pBS13 1 1 С1СГ9 1СГ3 1 1 1Q-5

FA0242 pBS31 1 1 <10-9 1 1 1 <1СГ9

PA0242 pBS32 1 1 <1СГ9 1 1 1 <10-9

PA0242 PBS33 1 1 <10-9 1 1 1 Ш1

PA0242 PBS35 1 1 <1CT9 1 1 1 НП

PA0242 pBS37 1 1 <10-9 1 1 1 НП

P A02 42 pBS38 1 1 <1CT9 1 <1СГ9

PA0242 pBS39 1 1 <1CT9 1 1 1 НП

PA0242 pBS43 1 1 1 1 1 1 1

PA0242 pBS45 1 1 ' 1 1 ' 1 1 1

PA0242 pBS48 1 1 1 10-3 1 1 1.СГ6

PA0242 PBS51 1 1 <1СГ9 1 1 1 <10~9

PA0242 PBS59 1 1 1 1 1 1 1

PA0242 PBS63 1 1 1 1 1 1 1

PA0242 pBS66 1 1 <10-9 1 1 1 кг6

нп - не проверялось

Таким образом, можно полагать, что возникшие в ходе эволюции различия затрагивают гены, определяющие взаимодействие с различными плазмидами. Возможно также, что фаги ут занимают различные экониши в природных популяциях. При выяснении механизмов защиты плазмидсодержащих клеток от действия бактериофагов мы обнаружили, что плазмида ограничивают внутриклеточное развитие бактериофагов от, не влияя на адсорбцию.

III. Ограничение фагов p.aeruginosa рестрицирующими штатами хозяина

К настоящему времени описано несколько систем рестрикции-модификации у Р.aeruginosa. Среди них одна определяется штаммом РАО (Holioway, 1965), другая - штаммом BS176 (Рае253) (Воронин и др., 1989). Есть системы рестрикции-модификации P.aeruginosa определяемые плазмидами: pMG7 (PaeR7), "pMG70 (PaeFPlIO), pMG73 (PaeR73) (Jaooby, Sutton, 1982). При изучении взаимодействия вирулентных бактериофагов с рестрицирующими штаммами p.aeruginosa РАОЗОЗ (pMG7), РАОЗОЗ (pMG70), РА0038 (pMG73) И BS176 бЫЛО обнаружено, что штамм BS176 полностью ограничивает развитие бактериофагов №81 и Угап. Кроме того, рост фага j»mF8i полностью ограничен штаммом РА0038 (pMG73) и в значительной степени -штаммом РАОЗОЗ (pMG70). Эффективность посева фагов Утп на штамме PA0038(pMG73) была снижена в 10 - юо раз.

Ш.1. Устойчивость фага /КГ77 к системам рестрикций Р.aeruginosa

Фаг tfkF77 не ограничивался ни одним из рестрицирующих • штаммов P.aeruginosa. Лишь на BS176 титр фага был снижен в 2-5 раз, по сравнению с титром йа РА0242 и изменена морфология колоний (мелкие нк). При обработке фага различными мутагенами удалось выделить мутанты фага 4?kF77(dc-), утратившие способность к росту на рестрицирующих штаммах Р.aeruginosa. Фенотипически эти мутанты подразделяются на три типа, но все они относятся к одной груше комплементации (табл.2). Видимо, все выделенные do- мутанты могут быть отнесены к одной функциональной единице.

Таким образом, очевидно, у фага VKP77 существует собственная система защиты (do) от ряда рестриктаз, кодируемых штаммами бактерии хозяина. В то же время мы показали, что фаги VKF77 de- не модифицируются при выращивании на рестрицирующих штаммах, то есть фаговая защита, детерминируемая do геном, очевидно, обусловлена

Таблица 2. Эффективность посева мутантов фага /КР77 на штаммах P.aeruginosa, содержащих различные системы ре сгрикции-модафикации.

Фенотипическая Мутант Эффективность посева на штаммах:

группа мутантов фага

РАО(pMG7) РАО (pMG70) РАО(pMG73) BS176

I de 9 1 1 1 ю-9

dc28 1 0,5 0,5 <Ю"10

do30 1 1 10"1 <10~9

II do 2 1 1 10~5 <10~9

ts11 del4 1 ю'г <10~9 <10~9

do 62 1 1 10"8 <Ю"10

dc33 10"1 1 10~б <Ю"10

do 42 1 1 ю-7 <Ю"10

III H'9 1СГ5 10~5 10~б <10"10

do 6 1СГ6 10"6 10_б <10~9

del 3 1СГ6 2 10~7 10~9 <10"9

do 8 1СГ6 10"6 10_б <10~9

механизмами, отличными от модификации ДНК. Ранее описана интересная особенность фага ^кР77: его ДНК устойчива к действию ряда рестриктаз (BamHI, Pstl, Xhol, Bglll) (Кулаков и др., 1986). В результате рестрикционного анализа препаратов ДНК de"мутантов мы обнаружили их устойчивость, как и устойчивость исходного фага, к действию данных рестриктаз. В то же время было показано, что по крайней мере один фрагмент ДНК фага СКР77 (smai-фрагмент), клонированный в клетках Е.coli, имеет сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции BamHi, к которой устойчива ДНК фага VKF77.

Таким образом, можно предполагать наличие у бактериофага 4(>kF77 двух различных генетических систем, которые определяют защиту от действия эндонуклеаз рестрикции: одной, обеспечивающей модификацию ДНК и другой (de ген), не связанной с модификацией.

Iii.2. Мутации, изменяющие количество пиков в ДНК ykF77

Ранее было отмечено, что ДНК фага <ЛД77 имеет четыре канонических однонитевых разрыва (Рис.3) (Kulakov et al., 1987).

При исследовании злектрофэретической подвижности однонитевых фрагментов ДНК некоторых с1о-мутантов неожиданно было обнаружено, что у одного из них (п9) изменена электрофореграмма однонитевых фрагментов ДНК (Рис.4).

Для изучения природа мутанта ^№77 п9 были исследованы продукты денатурации ряда рестршодионных фрагментов ДНК этого фага (Рис.5).

На основании представленных результатов можно заключить, что мутация п9: 1) не приводит к появлению новых ников в фаговой ДНК; 2) уменьшает частоту встречаемости ников а и 6 в популяции молекул фаговой ДНК; 3) не изменяет частоты встречаемости ников р и у. Проверка роста мутанта у№77 п9 на различных рестрицирующих штаммах р.аегивиюэа показала, что /"кГ77 п9 является йс- мутантом третьего типа (табл.2).Оказалось, что электрофоретическая подвиж-

Sall Si-ial Snal'

Hindlll Snal

Sali Hindlll

Sali Hbal Snal Hindl'll feall'

Snal

Sa

HindiII EcoRI I EcoFfl

Snal EcoR1! EcoRI Hindi II

Xbal

-ЧГ^ М Ч ' — ¿0 — 4о

5' I & 3

--S-Г-S-------1-^- п--1—5-1 л '

J>

Рис.3. Физическая карта ДНК бактериофага УкР77 Р.аегтдёйюза.

Цифрами I - IV обозначены однонитевые фрагменты, образующиеся при денатурации ДНК фага.

а, р, 7 и б - канонические однонитевые разрывы ("ники") в одной из цепей молекулы ДНК ¡/>№11. Размеры ДНК фага даны в тысячах пар нуклеотидов (т.п.н.).

ность однонитевых фрагментов ДНК у всех dc-мутантов третьего типа идентична таковой у У№77п9. Все de-мутанты третьего типа являются в то же время и мутантами, изменяющими частоту встречаемости ников а и {>. Возможно, что ген, кодирующий никазу /№77 одновременно определяет и антирестрикционные свойства фага, либо эти гены имеют общую регуляцию. У dc-мутантов первого и второго типов (кроме v?kF77tsii de4) каких-либо отличий в структуре ДНК от фага дикого типа не обнаружено.

При анализе dc-мутантов был также найден фаг, имеющий деле-цию - /№77 &е14 (Рис.з). Рестрикционннй анализ ДНК этого бактериофага выявил наличие делеции размером около 1400 п.я., которая, была локализована в правом конце генома. Делеция приводит к потере фагом i*kP77 одного ника - 5. Наличие делеции у этого фага, по-видимому, обусловливает DC-фенотип, поскольку это единственный мутант второго типа, у которого не удается получить реверсий к дикому фенотипу - DC+.

III.3. Чувствительность у*№77 и его производных к повышенной температуре.

Ранее была показана устойчивость к повышенной температуре в присутствии хелатируюцих агентов делециошшх производных бактериофага Т5 (Чернов и др., 1979). В нашем исследовании было обнару-

12 3

Рис.4. Электрофэреграмма однонитевых фрагментов ДНК мутантов фага >?№77 с измененным расположением канонических одонитевых разрывов.

1 - /№77п9; 2 - /№771:811 ае14;

3 - да77 исходный тип.

жено, что наряду с делеционным мутантом ts11 с1е14 повышен-

ной термостабильностью отличается мутант п9. Эти результаты

свидетельствуют, что однонитевые разрывы могут играть определенную роль в упаковке ДНК фага ^кТ77, причем уменьшение количества ников в геноме может приводить к такому же эффекту повышения термоустойчивости, как и наличие делеции.

II I2_р 14

!<Т>

I

* t > -г* -г. ä w - ■*г '

!%' t«

v-

v 1 ^ 1

>• % XJ, ^

J ^V Ч >B ii

•г

'И

ч

4 Ч к

Рис.5. Электрофоретический анализ продуктов денатурации EcoRl- и SalI-фрагментов ДНК фагов /№77 и y»kF77n9.

1- Sall-фрагмент "2" /Ы77п9; 2- Sall-фрагмент "1" v^F77n9; 3- ДНК l/kF77n9 гидролизованная Sali; 4- Sall-фрэгмент "2" •/KF77; 5- Sall-фрагмент "1" №77; б- ДНК уы"77 гидролизованная Sali; 7- EcoRI-фрагменг "2" ¡"Ы77п9; 8- EcoRl-фраг-мент "1" /кГ77п9; 9- ДНК 4»kF77n9 гидролизованная EcoRl; 10- Eoori-фрагмент "2"/№77; 11- EcoRl-фрагмент "l"VkF77; 12- ДНК fkF77 гидролизованная EcoRl; 13- ДНК AJ77n9; 14 -ДНК /KF77.

III.4. Генетический анализ de локуса

Для изучения de локуса был проведен его рекомбинационшй анализ. При скрещивании ряда dc-мутантов и отборе dc+ реком-

бинантов на рестрицирующем штамме раоозз (pMG73) удается тестировать рекомбинанты, возникающие с частотой 10_5-10"7. В результате проведенцого анализа было выяснено, что мутации в пределах do ло-куса обнаруживают различную степень генетического сцепления. На основании данных рекомбинациошюго анализа do локуса (табл.з) можно выделить группу тесно сцепленных dc-мутаций (n.9, do9, do28, do30, dc6, do8, dol3, dc18, do33, dc58). Эта группа сцепления, условно Названная нами п9, объединяет около 40% всех проанализированных мутаций. В то время как частота рекомбинации в do локусе колеблется в пределах от O.OOOW до 8.7%, частота рекомбинации между мутациями группы п9 составляет от 0.0001% до 0.008%. При этом следует отметить, что частота рекомбинации о.0001% фактически соответствует частоте обратных мутаций (от do- к dc+), то

Таблица 3. Рекомбинационный анализ do локуса фага ^№77

do" мутанты Частота рекомбинации в % с do~ мутантами

фага /№77 фага t"№77

do2 n9 ts11del4 dc62

dc2 . - 3,0 0,005 0,002

ts11del4 0,005 1 ,7 - 0,0001

do 62 0,002 1,1 0,0001 -

de 6 1,6 0,002 . 1,0 -

de 8 1 ,7 0,008 1,6 0,96

dc13 1,1 0,0004 0,96 -

de 18 1,7 0,0001 - -

do33 - 0,002 - -

do 5 - - 2,5 4,0

dc10 - 1 ,4 - -

do 42 3,3 1 ,5 3,0 2,5

dc14 - 6,2 - -

dcl6 - - 8,7 4,34

do 58 - 0,00015 - 1 ,96

dc21- - — — 7,7

Скрещивания do-мyтaнтoв фага >*№77 проводились в двух, а в ряде случаев - в трех повторах. В таблице приведены средние величины частот рекомбинации.

есть значительная часть мутаций в группе п9 не может быть разделена с помощью рекомбинационного анализа в данной системе.

Таким образом, налицо концентрация мутаций в одном из районов локуса de. Возможно, что район п9 представляет собой "горячую точку" в данном локусе.' Очевидно, что дальнейший анализ этой области представляет существенный интерес.

Важно отметить, что тесно сцепленные мутации пэ района принадлежат к различным фенотипическим классам (табл.2, 3). Б то же время ряд мутаций, принадлежащих к одному и тому же фенотипи-ческому классу, может находиться на значительном расстоянии в пределах do гена. Полученные данные подтверждают предположение о том, что все do-мутации являются мутациями по одному и тому же гену или, по крайней мере, по функционально связанным генам.

Было обнаружено, что наибольшая частота рекомбинации в пределах do локуса составляет 8,7%, очевидно, она и определяет рекомбинационный размер данного локуса.

Анализ рекомбинантов, возникающих при скрещивании делецион-ного мутанта /kF77tsiidei4 с различными do-мутантами, обнаружил, что все они имеют структуру ДНК дикого типа (ykF77), не выявлено расщепления по признаку наличия (отсутствия) делеции del4. Результаты анализа свидетельствуют о том, что деления у фага ><"kF77tslldel4 захватывает часть do локуса (гена).

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено два различных типа взаимодействия бактерий P.aeruginosa и специфичных к ним нелизогенизирукщих бактериофагов в условиях непрерывного культивирования. При культивировании P.aeruginosa РАО с фагом №F77 показана способность P.aerginosa РАО образовывать нестабильные фагоустойчивые варианты.выщепляхщие фагочувствительные клетки. В случае бактериофагов у№81 и mF82 поддержание бактериальной и фаговой популяции осуществляется за счет последовательного возникновения бактериальных фагоустойчивых мутантов и мутантов фага, преодолевающих эту устойчивость.

2. Выявлено, что развитие бактериофагов группы у>т ограничивается целым рядом плазмид inoP-2 группы, причем фаги в пределах этой группы различаются по способности развиваться на плазмидсо-держащих штаммах хозяина.

3. Показано наличие у фага </№77 системы защиты (do-система) от рестриктаз, кодируемых штаммом хозяина. Данная система защиты

- 17 -

не связана с модификацией ДНК.

4. de локус локализован на правом конце фагового генома

(З'-конец). Разработана система для проведения генетического

анализа данного локуса.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Балакшна В.В., Кулаков Л.А., Воронин А.М. Динамика взаимодействия вирулентных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa с бактериями хозяина . - Микробиология,1987, Т.56, No2, С.249-253.

2. Валакшина В.В., Кулаков Л.А. Бактериофаг Pseudomonas aeruginosa, устойчивый к действию систем рестрикции хозяина. -В сб. тезисов Всесоюзной конференции "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства." Алма-Ата, 1990, с.6.

3. Кулаков Л.А., Балакшна В.В., Моренкова М.А., Жуланова Е.Ю., Воронин А.М. Выделение и характеристика мутационных производных бактериофага VkP77 Pseudomonas aeruginosa. - Генетика, 1991, т. 27, No 11, с.1904 - 1911.

31.03.92 г. Зак. 3973Р Тир. 125 экз. Уч.-изд.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН