Усовершенствование методов выделения, идентификации индикации бактерий Pseudomonas Aeruginosa

Шестаков, Андрей Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Усовершенствование методов выделения, идентификации индикации бактерий Pseudomonas Aeruginosa
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование методов выделения, идентификации индикации бактерий Pseudomonas Aeruginosa"

На правах рукописи 00461313?

Шестаков Андрей Геннадьевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 НОЯ 2010

Саратов-2010

004613159

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич кандидат ветеринарных наук, доцент Богданов Ильгизар Исмаиловпч

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Тихомирова Елена Ивановна доктор биологических наук Селяиинов Юрий Олегович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение

Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, г. Москва

Защита диссертации состоится « 25 » ноября 2010 года в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан октября 2010 г. и размещен на сайте: www.sgau.rn

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa вызывают заболевание «псевдомоноз» к которому восприимчивы: крупный рогатый скот, свиньи, овцы, птица, пушные звери, пчёлы, рыбы, из лабораторных животных чувствительны белые мыши, морские свинки и кролики (Lipej et al., 1993; Прунтова и др., 1995; Покровский 2002). Диагноз ставят на основании лабораторных исследований на Р. aeruginosa. Источник возбудителя, больные животные, выделяющие его с различными выделениями, калом, мочой, молоком, со спермой. Факторы передачи возбудителя - инфицированные корма, пищевое сырьё, вода, почва, окружающая среда (Сидоров, 1995; Красильников, 1999). По существующим данным в окружающей среде Р. aeruginosa паразитирует в простейших (Ряпис, 1994; Бухарин, Розенберг, 2007). На особом месте стоит водный ареал распространения Р. aeruginosa (Смирнов, Киприанова, 1990; Афонин, 1999).

Отмечена высокая резистентность бактерии к антибиотикам и антимикробным веществам (Nikaido, 1978; Илюхин, 1985). Р. aeruginosa вызывает порчу белковых пищевых продуктов (в первую очередь мясомолочных) (Стефанов, 1997). Сообщается, что Р. aeruginosa вызывает деструкцию нефтепродуктов и углеродсодержащих веществ (Al-Hadhrami, Lapin-Scott, Ficher, 1995). Несмотря на то, что потребность в диагностике синегнойной инфекции очевидна, существующие бактериологические параметры схем, методов выделения, идентификации и индикации Р. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах не совершенны. Трудности диагностики Р. aeruginosa связаны с беспигментными штаммами и ассоциативной микрофлорой (Шуляк, 2003). В связи с этим исследования, посвященные методам быстрого и точного обнаружения Р. aeruginosa в объектах окружающей среды, пищевом сырье и пищевых продуктах являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение.

Цель работы - совершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий вида P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Задачи работы:

1. Изучить основные биологические свойства штаммов P. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

2.Усовершенствовать среды для выделения и идентификации атипичных и беспигментных штаммов P. aeruginosa.

3. Усовершенствовать схему бактериологической идентификации и дифференциации P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на основе разработанных сред и тестов.

4. Выделить из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов специфические бактериофаги бактерий P. aeruginosa и изучить их основные биологические свойства; отобрать наиболее оптимальный специфический бактериофаг для конструирования биопрепарата.

5. На основе отобранного бактериофага создать биопрепарат и технологию его изготовления для индикации и идентификации бактерий вида P. aeruginosa.

6. Усовершенствовать схему индикации бактерий P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4, методом реакции нарастания титра фага.

Научная новизна. Проведены комплексные исследования по выделению и из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов штаммов P. aeruginosa. Получены новые данные о биологических свойствах атипичных и беспигментных штаммах, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструирована новая специфическая среда накопления. Усовершенствована селективная среда с цетримидом для выделения атипичных и беспигментных штаммов P. aeruginosa. Отобран ряд наиболее информативных тестов и разработаны

дополнительные тесты, позволяющие проводить видовую дифференциацию бактерий рода Pseudomonas с учётом существующих беспигментных штаммов.

Усовершенствована схема выделения и бактериологической идентификации бактерий вида P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

Выделены и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги Р. aeruginosa, и отобран наиболее оптимальный специфический бактериофаг УГСХА-Р.а.№4 для создания диагностического биопрепарата.

Разработаны биотехнологические параметры изготовления диагностического биопрепарата и усовершенствована схема индикации Р. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с применением специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4.

Практическая значимость работы. Предложенная в диссертационной работе схема бактериологической идентификации и дифференциации позволяет выделять и типировать атипичные, беспигментные штаммы Р. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Использование сконструированной нами среды накопления, усовершенствованной селективной среды и подобранных тестов бактериологической идентификации, позволяет выделять и типировать бактерии Р. aeruginosa до вида в течение 75 часов. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе специфичного бактериофага и усовершенствована схема индикации бактерий Р. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 19-20 часов.

Результаты усовершенствования бактериологической схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, а также возможность использования диагностического биопрепарата специфичного бактериофага УГСХА-Р.а.4 в схеме реакции нарастания титра фага, подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА от 22 января 2010г.

По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены ректором УГСХА (от 10 феврвля 2010г) «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий P. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора», «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофага УГСХА-Р.а.№4», а так же «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида P. aeruginosa в объектах санитарного надзора». Методические рекомендации разработаны для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среда накопления (УГСХА-P.a.l) способствует избирательному росту и размножению P. aeruginosa, при первичном посеве исследуемого материала. Плотная селективная среда (УГСХА-Р.а.2) является специфичной и обеспечивает преимущественный рост P. aeruginosa, угнетая рост возможных ассоциантов.

2. Использованные среды УГСХА-P.a.l и УГСХА-Р.а.2, а также подобранные тесты в усовершенствованной схеме бактериологической дифференциации дают возможность за 75 ч идентифицировать P. aeruginosa.

3. Отобран штамм специфического бактериофага для целей идентификации и индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

4. Разработаны биотехнологические параметры по созданию диагностического биопрепарата специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4.

5. Усовершенствованная схема идентификации бактерий вида P.aeruginosa с применением диагностического биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4 ускоряет определение видовой принадлежности P. aeruginosa.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2005; 2008; 2009), Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них I статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения и двух глав: обзора литературы; собственных исследований, состоящих из объектов, материалов и методов исследований; результатов исследований и их обсуждения; заключения; выводов; списка использованных литературных источников; приложений. Материалы диссертации изложены на 155 страницах, включают 33 таблицы и 21 рисунок. Список использованных литературных источников включает 203 наименования, в том числе 111 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследований

Штаммы: в работе было использовано 4 референс-штамма бактерий Р. aeruginosa 128, 1677, 381, 453, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ при ФГОУ ВПО Ульяновской ГСХА, а также 35 штаммов, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Кроме того, для определения специфичности сконструированных сред, а также изучения специфичности

бактериофагов использовали 16 штаммов бактерий: Proteus mirabilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Stenotrophomonas maltophila из музея вышеназванной кафедры. Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами. Объектами исследования так же являлись семь штаммов бактериофагов P. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды.

Питательные среды и реактивы: МПА (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), МПБ (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Левина (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Плоскирева (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда висмут-сульфит агар (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург), среда АГВ для определения антибиотикочувствительности, диски с антибиотиками (НИЦФ Санкт-Петербург), хлорид бария, хлорид натрия, ацетамид, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, магния сульфат, нитрат калия, пептон сухой ферментативный, глюкоза, сукцинат натрия, L-аргинин, N-N-диметилпарафенилендиамин, перекись водорода, индикатор феноловый красный, индикатор бромтимоловый синий, фурадонин, цетримид, агар-агар, желатин, трихлорметан, ТТХ, набор для окраски по Граму.

Методы: В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения, идентификации и индикации бактерий (Васильев и др., 2004; Лабинская, 2004). Основные биохимические свойства штаммов Р. aeruginosa исследовали экспресс методом с использованием тест системы для ускоренной идентификации микроорганизмов, разработанной в НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург. Оксидазный тест проводили с применением 1% р-ра N-N-диметилпарафенилендиамина. Тест на каталазную активность

проводили с применением 3% р-ра перекиси водорода. Исследования с использованием бактериальных штаммов проводили согласно ГОСТ Р 5144699, ГОСТ Р 51426-99, ГОСТ Р 26670-91.

Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным Д.М. Гольдфарбом (1961), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловичем (1973), С.Н. Золотухиным (2007). Литическую активность фагов определяли по Аппельману и Грациа (Гольдфарб, 1961). Реакцию нарастания титра фага для индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом (1962), В.Я. Гашошкиным (1984).

Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартным методикам (Ашмарин, Воробьев, 1962; Бейли, 1970). Обработку результатов осуществляли с помощью программы SPSS statistics 17.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Рост референс-штаммов Pseudomonas aeruginosa на стандартных средах н образование пигментов

Нами исследованы тинкториальные и культуральные свойства 4-х; референс-штаммов P. aeruginosa для определения стабильности свойств и их обоснованного использования при составлении бактериологической схемы выделения и идентификации Р. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

Все референс-штаммы Р. aeruginosa, окрашенные по методу Грама, были представлены мелкими грамотрицательными палочками. Подвижность клеток Р. aeruginosa, отмечали у всех референс-штаммов. Мы изучили характер роста колоний референс-штаммов Р. aeruginosa на стандартных средах. Эти бактерии образовывали, в основном, плоские колонии, или мелкие выпуклые в центре, края ровные или бахромчатые, поверхность гладкая, а так же складчатая. Поскольку однотипных колоний не было, то использовать морфологию колоний как дифференциально-диагностический признак, по нашему мнению, не целесообразно. Далее мы провели изучение

сравнительной характеристики пигментов у референс-штаммов бактерий P. aeruginosa. Образование пигментов бактериями P. aeruginosa рассматривается рядом авторов, как ключевой и видообразующий признак при внутриродовой дифференциации. В связи с этим мы попытались охарактеризовать пигменты, продуцируемые референс-штаммами P. aeruginosa, и установили вариабельность этого признака при росте P. aeruginosa на МПА. Основными пигментами референс-штаммов были пиоцианин и флюоресцеин (от бледно-желтого до зеленого), классического сине-зеленого оттенка не образовывалось. Наиболее интенсивная пигментация у штаммов P. aeruginosa проявлялась в течение 3-х суток после культивирования, и особенно сильно при аэрировании среды. В результате исследований мы пришли к выводу, что пигментообразование у P. aeruginosa можно рассматривать как дифференциально-диагностический признак, но только как дополнительный, не определяющий. Морфология клеток при окраске по методу Грама и подвижность клеток P. aeruginosa были использованы нами в схеме выделения и идентификации псевдомонад в дальнейших исследованиях. Показана возможность усовершенствования или замены существующих стандартных сред в схемах выделения и идентификации бактерий P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

Биохимические свойства и антибиотикочувствнтельность референс-штаммов Pseudomonas aeruginosa

Характеристика биохимических свойств референс-штаммов Р. aeruginosa и определение их антибиотикочувствительности, позволили нам использовать полученные данные в подборе тестов бактериологической идентификации Р. aeruginosa из внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

Из полученных данных мы сделали вывод, что окисление глюкозы является характерным признаком для всех штаммов. Следовательно, этот признак можно использовать дня дифференциации Р. aeruginosa от бактерий, защелачивающих глюкозу. Оксидазный и каталазный тесты были также положительны у всех референс-штаммов Р. aeruginosa. Установлено, что эти

штаммы имеют ферменты аргининдегидролазу, нитратредуктазу, способны утилизировать цитрат натрия и ацетат натрия.

Определили антибиотикочувствительность штаммов Р. aeruginosa к гентамнцину, амикацину, ампициллину, цефазолину, эритромицину, доксициклину, левомицитину, тетрациклину, фурадонину и фурагину. Отмечена устойчивость P. aeruginosa к нитрофурановым препаратам, что согласуется с данными литературы.

Конструирование накопительной среды для Pseudomonas aeruginosa На основании анализа данных литературы для клеток Р. aeruginosa в среде накопления в качестве источника углерода и энергии был выбран сукцинат натрия, а предпочтительным источником азота - L-аргинин (Weyant, 1996; Покровский, 2002).

Соли КН2РО4, К2НРО4, MgS04, NaCl обеспечивают биохимические процессы и стабилизируют осмотическое давление в клетках Р. aeruginosa. В качестве ингибитора посторонней микрофлоры в среде накопления, на основании антибиотикочувствительности был выбран фурадонин, в концентрации 150 мг/л. Все компоненты среды, кроме аргинина и фурадонина смешивали в 1л. дистиллированной воды, автоклавировали при 1,1 атм 120 "С в течение 15 мин. Затем в остывшую до 45 °С вносили навески аргинина и фурадонина. Концентрации компонентов среды накопления подбирали экспериментально. Состав среды накопления: вода дистиллированная -1000мл, сукцинат натрия - 20,Ог, КН2Р04- 0,5г, К2НР04 - 1,5г, MgS04 - 0,5г, NaCI - 5,Or, L-аргинин - 2,Or, фурадонин - 150мг. ph готовой среды накопления - 7,0. Для определения чувствительности среды накопления мы засевали штамм P. aeruginosa в концентрации 10м.к./мл. Через 24ч термостатирования при температуре 37 °С мы определяли количество живых клеток P. aeruginosa в среде накопления. Количество КОЕ на МПА составило 4196. Результаты свидетельствуют о высокой чувствительности среды. Фурадонин ингибирует широкий спектр ассоциантов. Рост P. aeruginosa происходит по всей высоте среды и характеризуется помутнением поверхностной пленкой, придонным ростом. Выраженность придонного роста

зависит от концентрации клеток Р. aeruginosa. Таким образом, была сконструирована и зарегистрирована среда накопления УГСХА-P.a.l, для выделения Р. aeruginosa в концентрации 10м.к./мл.

Усовершенствование плотной селективной среды с цетримидом По результатам анализа роста Р. aeruginosa на плотных средах, из нескольких селективных агентов (ТТХ, ЦПХ, цетримид) наиболее оптимальным компонентом в составе плотной селективной среды, включенной в схему идентификации Р. aeruginosa, был выбран цетримид. Концентрацию цетримида подбирали экспериментально. Состав плотной селективной среды: вода дистиллированная - 1000 мл, МПБ - 20 г, агар микробиологический -15г, цетримид - 0,3 г. Способ приготовления: Все компоненты смешивали в холодной воде, доводили до кипения и автоклавировапи при 121 °С 20 минут. Цвет среды серо-желтый. Колонии штамма №128 Р. aeruginosa средние, круглые с волнистым краем, гладкие, слабо пигментированы. Пигмент бледно-зеленый. Специфичность селективной среды определялась сравнительным высевом чистых суточных культур бактерий Р. aeruginosa, Proteus mirabilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas putida, Pseudomonas ßuorescens, Stenotrophomonas maltophila на селективную среду. Культивировали при 37 °С в течение 96 часов. Контролем жизнеспособности являлся посев указанных бактериальных культур на МПА и культивирование при 37 °С в течение 96 часов. Отмечено, что на селективной среде растут Р. aeruginosa, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis. По результатам наших опытов, более высокие концентрации цетримида в среде угнетают рост Р. aeruginosa. Эта модифицированная селективная среда использована как среда второго порядка в схеме выделения и идентификации Р. aeruginosa и зарегистрирована как селективная среда УГСХА-Р.а.2.

Конструирование и подбор тестов бактериологической дифференциации Pseudomonas aeruginosa

Для целей бактериологической дифференциации псевдомонад были сконстркированы следующие тесты: тест «А», тест «В», тест «С», тест «D». Тест «А» - основан на использовании ацетамида в качестве источника углерода в анаэробных условиях. Тест «А» содержит неорганические соли и ацетамид в качестве единственного источника углерода. Ацетамид (амид уксусной кислоты) дезаминируется бактериями, проявляющими ациламидазную активность. P. aeruginosa способна к восстановлению нитратов (денитрификация) до свободного азота, что можно использовать как полезный диагностический признак. Мы поставили перед собой задачу установить возможность использования ацетамида баггериями в Р. aeruginosa в анаэробных условиях в присутствии нитрата калия. Для исследования способности к денитрификации и утилизации ацетамида в анаэробных условиях использовали тест А по прописи: вода дистиллированная - 1000мл, ацетамид 10г., КН2Р04 - 0,5г, К2НР04 - 1,5г, MgS04 - 0,5г, NaCl - 5,Or, KN03 -2г., феноловый красный 0,012г., агар-агар — 15г. Все компоненты среды смешивали в 1000 мл дистиллированной воды и нагревали до полного растворения компонентов. После стерилизации в автоклаве при 1,1 атм. пробирки подвергали резкому охлаждению под струей холодной воды, с целью уменьшения в среде парциального давления кислорода. Часть исследуемой колонии с селективной среды захватывали бактериологической петлей и уколом вносили в нитратно-ацетамидную среду. Культивирование проводили в термостате при 37 °С 24ч. Положительной реакцией считали изменение окраски среды с желтой на красную или малиновую, а также образование пузырьков N2 в толще среды или разрывов среды.

Тест «В» - основан на отсутствии роста P. aeruginosa на агаре с 2г/л хлорида бария. Мы поставили перед собой задачу изучить возможность применения МПА с добавлением хлорида бария, в схеме идентификации бактерий Р. aeruginosa. Для решения поставленной задачи необходимо было изучить рост штаммов бактерий P. aeruginosa на вышеупомянутой среде

тест «В». В МПА, добавляли хлорид бария из расчета 2 г/л. Среду стерилизовали в автоклаве при 1,1 атм 121 °С. Суточную бульонную культуру P. aeruginosa штрихом засевали на поверхность скоса и помещали в термостат на 24 ч при температуре 37 °С. Через указанное время проводили учет результатов. Рост ингибировался у всех штаммов P. aeruginosa.

Тест «С» основан на окислении глюкозы в аэробных условиях с использованием модифицированной нами среды Хью-Лейфсона. Этот тест использован в бактериологической схеме для дифференциации P. aeruginosa от бактерий не способных к окислению глюкозы, либо защелачивающих ее (например Alcaligenes faecalis). Предложенный нами состав теста «С»: Вода дистиллированная 1000мл, агар-агар 20г., D-глюкоза Юг., пептон 2г., хлорид натрия 5 г., сульфат магния 0,5 г., гидрофосфат калия 1,39г., дигидрофосфат калия 0,73г., бромтимоловый голубой 0,03г. Все компоненты среды смешивали и нагревали до полного растворения, кроме глюкозы. Глюкозу добавляли в последний момент, среда разливалась по пробиркам и автоклавировалась при 0,5 атм. 20 мин. Пробирки остужали для формирования скоса. Посев производят бактериологической петлей на поверхность косяка. Положительной реакцией считается изменение цвета индикатора с зеленого на желтый на поверхности скоса.

Для целей идентификации P. aeruginosa мы включили тест «D», основанный на разжижении желатина. В рамках исследований, связанных с разработкой тестов идентификации бактерий P. aeruginosa, мы изучили протеолитическую активность выделенных штаммов бактерий P. aeruginosa. Тест «D» содержал МПБ, с добавлением 150 г/л сухого желатина. Расплавленную среду автоклавировали при 0,5 атм., в течение 15 мин и разливали в пробирки по 5 мл. Штаммы бактерий P. aeruginosa уколом засевали в столбик желатина и помещали в термостат при 37 °С на 24ч. Параллельно ставили контрольные не засеянные пробирки. После извлечения засеянных пробирок с желатином и контроля из термостата, все пробирки помещали в холодильник с температурой +6 °С на 15 мин. Спустя указанное время проводили учет результатов. Среда с желатином в засеянных пробирках

оставалась жидкой, в то время как контрольная не засеянная среда застывала столбиком. Протеолиз желатина наблюдался у всех штаммов бактерий Р. aeruginosa.

Усовершенствование бактериологической схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов

При усовершенствовании бактериологической схемы нами были выбраны следующие свойства P. aeruginosa', отношение Р. aeruginosa к окраске по Граму, наличие у Р. aeruginosa ферментов цитохромоксидазы, каталазы, аргининдегидролазы, желатиназы, способность к окислению глюкозы в аэробных условиях, способность к утилизации ацетамида, денитрификация, чувствительность к хлориду бария, чувствительность к специфическому бактериофагу. Усовершенствованная схема выделения и идентификации бактерий Р. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья

и пищевых продуктов представлена на рисунке 1.

Исследуемый материал -1 ► Среда УГСХА-Р.а. 1- -► УГСХА-Р.а.2

24 ч + 37 "С 24ч^ + 37 "С

пк-рягк-я по Гряму ^ irnnOHHIl t мпк

гп- ^ ^ Зч 37 "С

каталаэл пигментация оксндаза

+ +/- +

гест А тест В тест С тест D

Доршкка mronta 24 ч "С 14 ч У! "С 14ч37"С 24 ч37 "С

*а сплошном газоне суспензии + + +

24ч + 37 "С

Рис. 1. Схема выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов

Таким образом, предложенная схема выделения и идентификации Р. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах позволяет выделять и идентифицировать бактерии до вида, исключая возможных ассоциантов.

С использованием разработанной схемы из сточных вод города Ульяновска, проб молочных продуктов, проб мяса с рынков города Ульяновска, без органолептических признаков порчи, нами было выделено 35 штаммов из которых 4 штамма не образовывали пигменты. Беспигментные «полевые» штаммы Р. aeruginosa №Д888, №17, №91, №5 лизировались диагностическим биопрепаратом специфического бактериофага и давали характерные реакции на разработанных нами тестах.

Характеристика выделенных фагов Pseudomonas aeruginosa

Следующим этапом наших исследований стало выделение бактериофагов Р. aeruginosa из объектов внешней среды. Материалом для выделения являлись сточные воды и реки Ульяновской области. Всего исследовано 129 проб. Морфологию негативных колоний бактериофагов изучали с помощью метода агаровых слоев по Грациа. Бактериофаг УГСХА - Р.а.№1 и бактериофаг УГСХА - Р.а.№4, имели диаметр 3-4мм с четким прозрачным центром и мутным ореолом по периферии. Бактериофаги УГСХА - Р.а.№18, УГСХА - Р.а.№35, УГСХА - Р.а.№44 имели диаметр негативных колоний 2мм и были прозрачны. Бактериофаги УГСХА - Р.а.№9 и УГСХА- Р.а.№52 имели диаметр колоний 4мм и характеризовались наличием прозрачного центра с мутной периферией. Дальнейшим этапом изучения биологических свойств выделенных бактериофагов было определение их литической активности. Изучили литическую активность 7 выделенных бактериофагов Р. aeruginosa методами предложенными Аппельманом и Грациа (Гольдфарб, 1961). Определили количество фаговых корпускул в 1 мл, для каждого выделенного бактериофага. По результатам полученных данных, нами было решено в дальнейших исследованиях использовать наиболее активные бактериофаги УГСХА - Р.а.№1 и УГСХА - Р.а.№4, характеризовавшиеся максимальным количеством активных корпускул фага в 1мл. Титр селекционированных бактериофагов УГСХА- Р.а.№1 и УГСХА- Р.а.№4 по Грация: 2х1010, 4хЮ10 соответственно, фаговых корпускул в 1 мл. Титр бактериофагов УГСХА -Р.а.№1 и УГСХА- Р.а.№4 по Аппельману: 10"8,10"10 соответственно.

Определение спектра литической активности проводили методом нанесения фага на газон бактериальных культур. Установлено, что наиболее широким спектром литической активности по отношению к исследуемым культурам обладал штамм фага УГСХА- Р.а.№4, который лизировал 37 из 39 штаммов P. aeruginosa (94.8%). Фаг УГСХА - Р.а.№1 лизировал 30 из имеющихся у нас 39 штаммов P. aeruginosa (76.9%). Поэтому фаг УГСХА-Р.а.№4 был выбран для конструирования диагностического препарата. Результаты определения специфичности бактериофага УГСХА-Р.а.№4, показали, что он строго специфичен по отношению к P. aeruginosa и не лизировал другие виды и роды бактерий. Определение чувствительности бактериофага УГСХА-Р.а.№4 проводили путем обработки фаговой суспензии хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Бактериофаг УГСХА - Р.а.№4 проявил выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 60 минут.

В рамках диссертационного исследования также изучили устойчивость бактериофага УГСХА - Р.а.№4 к температуре. Выяснено, что бактериофаг УГСХА - Р.а.№4 инактивировался при температуре 75 °С в течение 30 минут.

Разработка технологических параметров изготовления и контроля биопрепарата для диагностики Pseudomonas aeruginosa

Результаты определения оптимальных температурных показателей культивирования свидетельствуют о том, что оптимальной является температура культивирования специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4 30 °С - 37 °С. Нами решено инкубировать систему специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4 с клетками Р. aeruginosa при температуре 37 °С. Установлено оптимальное соотношение специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4 и культуры 1:5, т.е. 0,2 мл фага х 1 мл индикаторной культуры, оптимальное время пассажа при температуре 37 °С для специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4 составляет 6 часов. За это время происходил лизис индикаторной культуры (просветление среды по

сравнению с контролем), литическая активность специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4 составляла 10"'°по Аппельману и 7 х 1010 по Грациа.

Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага с применением диагностического биопрепарата

При исследовании оптимальных условий постановки РНФ с применением диагностического биопрепарата специфического бактериофага мы установили количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение и оптимальное время РНФ. По результатам проведенных опытов было установлено, что количество фаговых частиц в опытных пробирках более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах, при контаминации МПБ клетками P. aeruginosa в концентрации 102 м.к/мл. Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что наиболее оптимальным является временной режим РНФ при 7 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом без подращивания. Такой режим позволяет провести индикацию бактерий P. aeruginosa в количестве 102 м.к./мл, в течение 19-20 часов. Однако увеличение времени инкубирования до 16 часов повышает чувствительность метода на порядок и позволяет выявлять бактерии вида P. aeruginosa при наличии их в исходном исследуемом материале 10 м.к./мл. Схема постановки РНФ с применением диагностического препарата представлена на рисунке 2.

Таким образом, проведенные нами исследования позволили выявить особенности атипичных и беспигментных штаммов P. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов; усовершенствована схема выделения и идентификации P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов; создан диагностический биопрепарат, на основе специфичного бактериофага, позволяющий в короткие сроки проводить индикацию P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

пробирка №2 7 ч 37 °С 0,25мл

исследуемый материал диагностический биопрепарат МПБ

9,0мл 9,0мл 1,0мл 1,0мл 1,0мл 9,0мл

пробирка № 7 ч 37 °С 0,25мл

пробирка №3 7 ч 37 °С 0,25мл

Пробирка с 4,5 мл МПБ Пробирка с 4,5 мл МПБ Пробирка с 4,5 мл МПБ хлороформ 1:10; 30 мин хлороформ 1:10; 30 мин хлороформ 1:10; 30 мин

1,0мл

Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры

чашка Петри №1 1,5% МПА 12ч 37°С

1,0мл

Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры

чашка Петри №2 1,5% МПА 12ч 37°С

,0мл

Пробирка с 2,5 мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры

чашка Петри №3 1,5% МПА 12ч 37°С

Реакция считается положительной, если количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №1 превышает количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №3 в 5 и более раз

Рис. 2. Схема постановки реакции нарастания титра фага с диагностическим биопрепаратом

Выводы

1. Показано, что сконструированная накопительная среда с сукцинатом натрия, аргинином и фурадонином и усовершенствованная селективная среда с цетримидом, в комплексе обладают высокой специфичностью, позволяют выделять атипичные и беспигментные штаммы Р. aeruginosa, из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

2. Усовершенствованая бактериологическая схема выделения и дифференциации Р. aeruginosa, включающая специфичные среды и подобранные бактериологические тесты, основанные на утилизации ацетамида в анаэробных условиях, ингибировании солями бария, окислении глюкозы, разжижении желатина, позволила из внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов выделить и идентифицировать 35 штаммов Р. aeruginosa, в течение 75 часов.

3. Выделено 7 бактериофагов бактерий вида Р. aeruginosa и изучены их изоляты, которые имели два типа колоний: с прозрачным центром и мутной переферией и мелкие прозрачные; литическая активность варьировала от 10"7 до 10"1с по методу Аппельмана и от 2 х 107 до 2 х Ю10 по методу Грациа. Изоляты бактериофагов проявляли устойчивость к хлороформу в течение 60 минут и инактивировались при температуре 75 °С в течение 30 минут.

4. В результате изучения биологических свойств бактериофагов, выбран один бактериофаг УГСХА - Р.а.№4 имеющий оптимальные для конструирования диагностического биопрепарата свойства: титр бактериофага составляет Ю"10 по методу Аппельмана и 2 х Ю10 по методу Грациа; спектр литической активности 94.8 %.

5. Разработаны параметры постановки реакции нарастания титра фага для ускоренной индикации бактерий вида Р. aeruginosa с использованием биопрепарата из бактериофага УГСХА-Р.а.№4, позволяющие обнаружить в исследуемом материале указанные бактерии в концентрации от 102 м.к. в 1г (1мл) в течение 19-20 часов.

6. Оптимальными технологическими показателями для изготовления специфического биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4 с высокой

литической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма бактерий вида P. aeruginosa 1:5, оптимальное время инкубирования при температуре 37 °С - б часов, обработка фаголизата хлороформом в соотношении 1:10 в течение 30 минут.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шестаков, А.Г. Токсины как основа патогенности Pseudomonas aeruginosa / Э.А. Афонин, А.Г. Шестаков, Т.А, Елантьева, И.Р. Насибуллин, Д.А. Васильев // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Ульяновск, 26-28 апреля 2005. - 4.5. - С. 236-239.

2. Шестаков, А.Г. Тесты по идентификации Pseudomonas aeruginosa и Aeromonas hydrophilia / Д.А. Васильев, Э.А. Афонин, Т.А. Елантьева, А.Г. Шестаков, И.Р. Насибуллин // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Ульяновск, 26-28 апреля, 2005. - 4.5. - С. 230-233.

3. Шестаков, А.Г. Фаги Pseudomonas aeruginosa I А.Г. Шестаков, Э.А. Афонин, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Ульяновск, 26-28 апреля 2005. - 4.5. -С. 227-229.

4. Шестаков, А.Г. Анализ роста Pseudomonas aeruginosa на ацетамидном агаре с добавлением нитрата калия в анаэробных условиях / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, Ульяновск, 20-22 мая 2008.-С. 114-116.

5. Шестаков, А.Г. Культивирование Pseudomonas aeruginosa в анаэробных условиях / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: Материалы Международной научно-практической конференции, Москва, 9-10 октября 2008. - С. 289-290.

6. Шестаков, А.Г. Результаты разработки схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев //Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: Материалы Международной научно-практической конференции, Ульяновск, 26-28 мая 2009. - С. 120-123.

7. Шестаков, А.Г. Особенность роста бактерий Pseudomonas aeruginosa на среде с сукцинатом натрия, аргинином, фурадонином и минеральными солями / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения, 3-4 декабря 2009. - Покров 2009. - С. 46-49.

8. Шестаков, А.Г. Формирование струвитов на среде с сукцинатом, аргинином и мнеральными солями, как диагностический признак при идентификации бактерий Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения, 3-4 декабря 2009г. - Покров 2009. - С. 133-135.

9. Шестаков, А.Г. Схема выделения и идентификации бактерий Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Естественные и технические наукн. - 2009. - №6(44). - С. 118-120.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шестаков, Андрей Геннадьевич

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация бактерий рода Pseudomonas.

1.2. Биологические свойства Pseudomonas aeruginosa.

1.3. Устойчивость Pseudomonas aeruginosa к некоторым веществам.

1.3.1. Антибиотикочувствительность Pseudomonas aeruginosa.

1.4. Резервуар распространения Pseudomonas aeruginosa и вызываемые бактериальные инфекции.

1.5. Способность Pseudomonas aeruginosa к биодеструкции.

1.6. Идентификация Pseudomonas aeruginosa.

1.6.1. Бактериологические методы идентификации

Pseudomonas aeruginosa.

1.6.2. Генетические методы идентификации

Pseudomonas aeruginosa.

1.7. Фагодиагностика Pseudomonas aeruginosa.

1.7.1. Чувствительность бактериофагов Pseudomonas aeruginosa к инактивирующим факторам.

1.7.2. Развитие фаговых корпускул в клетке хозяина.

1.7.3. Реакция нарастания титра фага.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект материалы и методы исследований.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1. Тинкториальные свойства клеток Pseudomonas aeruginosa.

2.2.2. Рост референс-штаммов Pseudomonas aeruginosa на стандартных средах и образование пигментов.

2.2.3. Характеристики отечественных селективных сред, применяющихся для выделения Pseudomonas aeruginosa.

2.2.4. Биохимические свойства референс-штаммов

Pseudomonas aeruginosa.

2.2.5. Антибиотикочувствительность референс-штаммов

Pseudomonas aeruginosa.

2.2.6. Конструирование среды накопления УГСХА-Р.а.1.

2.2.7. Усовершенствование плотной селективной среды с цетримидом УГСХА-Р.а.2.

2.2.8. Конструирование тестов бактериологической дифференциации.

2.2.8.1. Конструирование теста «А».

2.2.8.2. Разработка теста «В».

2.2.8.3. Усовершенствование теста «С».

2.2.8.4. Усовершенствование теста «D».

2.2.9. Усовершенствование бактериологической схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa.

2.2.10. Образование пигментов штаммами Pseudomonas aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

2.2.11. Основные биохимические свойства выделенных штаммов Pseudomonas aeruginosa.

2.2.12. Выделение бактериофагов Pseudomonas aeruginosa.

2.2.13. Характеристика выделенных фагов Pseudomonas aeruginosa.

2.2.14. Разработка технологических параметров изготовления и контроля биопрепарата для диагностики Pseudomonas aeruginosa.

2.2.15. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага с применением диагностического биопрепарата.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование методов выделения, идентификации индикации бактерий Pseudomonas Aeruginosa"

Актуальность темы*

Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa вызывают заболевание «псевдо-моноз» к которому восприимчивы: крупный рогатый скот, свиньи, овцы, птица, пушные звери, пчёлы, рыбы, из лабораторных животных чувствительны белые мыши, морские свинки и кролики (Lipej et al., 1993; Прунтова и др., 1995; Покровский 2002). Диагноз ставят на основании лабораторных исследований на Р. aeruginosa. Источник возбудителя, больные животные, выделяющие его с различными выделениями, калом, мочой, молоком, со спермой. Факторы передачи возбудителя - инфицированные корма, пищевое сырьё, вода, почва, окружающая среда (Сидоров, 1995; Красильников, 1999). По существующим данным в окружающей среде Р. aeruginosa паразитирует в простейших (Ряпис, 1994; Бухарин, Розенберг, 2007). На особом месте стоит водный ареал распространения Р. aeruginosa (Смирнов, Киприанова, 1990; Афонин, 1999).

Цель работы

Совершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий вида Р. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

Задачи работы

1. Изучить основные биологические свойства штаммов Р. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

2. Усовершенствовать среды для выделения и идентификации атипичных и беспигментных штаммов Р. aeruginosa.

3. Усовершенствовать схему бактериологической идентификации и дифференциации Р. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на основе разработанных сред и тестов.

4. Выделить из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов специфические бактериофаги бактерий Р. aeruginosa и изучить их основные биологические свойства; отобрать наиболее оптимальный специфический бактериофаг для конструирования биопрепарата.

5. На основе отобранного бактериофага создать биопрепарат и технологию его изготовления для индикации и идентификации бактерий вида Р. aeruginosa.

6. Усовершенствовать схему индикации бактерий Р. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью- биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4, методом реакции нарастания титра фага.

Научная новизна

Проведены комплексные исследования по выделению и из объектов внешней среды, пищевого сырья- и пищевых продуктов, штаммов Р. aeruginosa. Получены новые данные о биологических свойствах атипичных и беспигментных штаммах, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструирована новая специфическая среда накопления. Усовершенствована селективная среда с цетримидом для выделения атипичных и беспигментных штаммов Р. aeruginosa. Отобран« ряд наиболее информативных тестов и разработаны дополнительные тесты, позволяющие проводить видовую дифференциацию бактерий рода Pseudomonas с учётом существующих беспигментных штаммов.

Усовершенствована схема выделения и бактериологической идентификации бактерий вида Р. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

Практическая значимость работы

Предложенная в диссертационной работе схема бактериологической идентификации и дифференциации позволяет выделять и типировать атипичные, беспигментные штаммы Р. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Использование сконструированной нами среды накопления, усовершенствованной селективной среды и подобранных тестов бактериологической идентификации, позволяет выделять и типировать бактерии Р. aeruginosa до вида в течение 75 часов. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе специфичного бактериофага и усовершенствована схема индикации бактерий Р. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 19-20 часов.

Результаты усовершенствования бактериологической схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья, и пищевых продуктов, а также возможность использования диагностического биопрепарата специфичного бактериофага-УГСХА-Р:а.4 в схеме реакции нарастания титра фага, подтверждены актами комиссионных испытаний; в Ульяновской ГСХА от 22 января;20 Юг.

По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены ректором УГСХА (от 10 феврвля 2010г) «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий P. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора», «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофага УГСХА-Р.а.№4», а так же «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Р. aeruginosa в объектах санитарного надзора». Методические рекомендации разработаны для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения, выносимые на защиту

3:. Отобран штамм специфического бактериофага для целей идентификации и индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

5. Усовершенствованная схема индикации Р.aeruginosa методом РНФ с применением диагностического биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4 ускоряет определение видовой принадлежности Р. aeruginosa.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2005, 2008, 2009), Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, состоящих из материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованных литературных источников, приложений. Материалы диссертации изложены на 155 страницах, включают 33 таблицы и 21 рисунок. Список использованных литературных источников включает 203 наименования, в том числе 111 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шестаков, Андрей Геннадьевич

127 ВЫВОДЫ

1. Показано, что сконструированная накопительная среда с сукцинатом* натрия, аргинином и фурадонином и усовершенствованная селективная среда с цетримидом, в комплексе обладают высокой специфичностью, позволяют выделять атипичные и беспигментные штаммы

P. aeruginosa, из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

2. Усовершенствованая бактериологическая схема выделения и диффе ренциации P. aeruginosa, включающая специфичные среды и подоб ранные бактериологические тесты, основанные на утилизации ацета мида в анаэробных условиях, ингибировании солями бария, окислении глюкозы, разжижении желатина, позволила из внешней среды, пище вого сырья и пищевых продуктов выделить и идентифицировать 35 штаммов P. aeruginosa, в течение 75 часов.

3. Выделено 7 бактериофагов бактерий вида P. aeruginosa и изучены их изоляты, которые имели два типа колоний: с прозрачным центром и мутной переферией и мелкие прозрачные; литическая активность варьировала от 10"7 до 10"10 по методу Аппельмана и от 2 х 107 до 2 х Ю10 по методу Грациа. Изоляты бактериофагов проявляли устойчивость к хлороформу в течение 60 минут и инактивировались при температуре 75 °С в течение 30 минут.

4. В результате изучения биологических свойств бактериофагов, выбран один бактериофаг УГСХА — Р.а.№4 имеющий оптимальные для конструирования диагностического биопрепарата свойства: титр бактериофага составляет Ю"10 по методу Аппельмана и 2 х 10ю по методу Грациа; спектр литической активности 94.8 %.

5. Разработаны параметры постановки реакции нарастания титра фага для ускоренной индикации бактерий вида P. aeruginosa с использованием биопрепарата из бактериофага УГСХА-Р.а.№4, позволяющие обнаружить в исследуемом материале указанные бактерии в концентрации от

10 м.к. в 1г (1мл) в течение 19-20 часов. 6. Оптимальными технологическими показателями для изготовления специфического биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4 с высокой литической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма Р. aeruginosa 1:5, оптимальное время инкубирования при температуре 37 °С — 6 часов, обработка фаголизата хлороформом в соотношении 1:10 в течение 30 минут.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема диагностики так.называемых неферментирующих бактерий,и в. частности Р. aeruginosa, во внешней среде, пищевом сырье и пищевых продуктах, наиболее актуальна (Афонин, 1999; Покровский, 2002; Шуляю 2003); Бактерии Р. aeruginosa вызывают заболевания у животных, что приводит к снижению экономического эффекта в животноводстве (Бовкун, Борисенкова, 1995).

Р. aeruginosa вызывает порчу пищевого сырья животного происхождения, а продукты питания, кроме того, являются одними из факторов передачи инфекций вызванных бактериями этого вида (Стефанов, 1997; Красильников, 1999).

Определенные проблемы, связанные с биодеградацией и ухудшением качества нефтяного сырья и нефтяных продуктов Р. aeruginosa представляет для нефтегазовой отрасли (Al-Hadhrami, Lapin-Scott, Ficher, 1995).

Инфекции, вызванные Р. aeruginosa в условиях госпитальных стационаров, представляют серьезную проблему для больных ожоговых отделений, родильных отделений, урологических и хирургических стационаров (Яковлев, 2001; Kirschke, 2003).

Устойчивость Р. aeruginosa во внешней среде, а так же способность длительное время сохранять свою жизнеспособность в субстратах бедных питательными веществами, способствуют циркуляции указанных бактерий в городах и в животноводческих комплексах (Bergen, 1981).

Проведение нерациональной антибиотикотерапии, а также безконтроль-ное применение антибиотиков в животноводстве, способствуют появлению штаммов Р. aeruginosa обладающих полирезистентностью к широкому спектру антибиотиков. Этому способствует наличие у Р. aeruginosa плазмид резистентности, отвечающих за устойчивость к определенным группам антибиотиков (Trevors, 1991).

При разработке накопительной УГСХА-Р.а.1 и усовершенствовании селективной среды УГСХА-Р.а.2, нами были использованы антимикробный препарат фурадонин и поверхностно-активное вещество цетримид, существенно не влияющие на рост клеток P. aeruginosa, но в комплексе обеспечивающие хороший селективный эффект. Чувствительность разработанной нами среды накопления УГСХА-Р.а.1, составляет 10 м.к./мл. Через 24 часа культивирования при температуре 37 °С количество бактериальных клеток P. aeruginosa увеличивается в 400 раз. Чувствительность селективной среды

-J

УГСХА-Р.а.2 составляет 10 м.к./мл. При дифференцированной чувствительности среды накопления УГСХА-Р.а.1 и селективной среды УГСХА-Р.а.2, появляется возможность визуализировать бактериальные колоний на плотной селективной среде и, кроме того, снижается риск лабораторных ошибок и случайного заражения среды второго этапа.

Типичные штаммы P. aeruginosa синтезируют различные пигменты, и идентификация пигментообразующих штаммов для бактериологов при проведении рутинных исследований не представляет серьезных трудностей. Однако 8% - 18% штаммов P. aeruginosa лишены пигментов (Мороз, 1988). Лабораторные ошибки при идентификации P. aeruginosa от неферментирую-щих бактерий других близких видов и родов создают трудности в своевременной диагностике этого возбудителя во внешней среде, пищевом сырье и пищевых продуктах (Meschede, 1986; Neu, 1985; Zierdt, 1985).

Нами предложено 4 теста бактериологической идентификации Р. aeruginosa, учитывающие их основные биохимические свойства. Тест «А» основан на способности Р. aeruginosa утилизировать ацетамид в анаэробных условиях, тест «В» основан на ингибировании роста Р. aeruginosa солями бария, тест «С» учитывает способность вышеуказанных бактерий окислять глюкозу с образованием кислоты и тест «D» выявляет протеолитические ферменты. Так же в бактериологическую схему добавлен биопрепарат бактериофага УГСХА-Р.а.№4, обладающий высокой специфичностью и широким спектром литической активности.

Таким образом, используя разработанные среды, тесты и специфичный бактериофаг УГСХА-Р.а.№4 в строгой последовательности, мы усовершенствовали схему выделения и идентификации P. aeruginosa с чувствительностью 10м.к./мл в исследуемом субстрате, высокой специфичностью и учетом непигментированных штаммов. Специфичность сконструированной схемы выделения и идентификации P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов проверена на 16 штаммах бактерий других видов и родов. С использованием усовершенствованной нами схемы, из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов выделено 35 штаммов P. aeruginosa, четыре из которых лишены пигментов, что согласуется с данными литературы. Общее время, затрачивающееся на бактериологическую схему выделения и идентификацию бактерий до вида Pseudomonas aeruginosa, составляет 75 часов.

Для быстрого и точного обнаружения Р. aeruginosa, ускоренная индикация в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах приобретает важное значение. Однако, применение современных генетических и иммунологических методов для решения этих задач зачастую притерпевает трудности связанные с высокой стоимостью, либо сложностью выполнения данных исследований.

О возможности применения бактериофагов бактерий Р. aeruginosa с целью идентификации указанных бактерий сообщают некоторые исследователи (Postic, Finland, 1961; Graber, Latta,Vogel, Brame, 1962; Sjoberg, Lindberg, 1968).

Для достижения поставленной цели, из объектов внешней среды выделено 7 бактериофагов активных в отношении штаммов Р. aeruginosa. Для конструирования биопрепарата и разработки реакции нарастания титра фага нами были изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов, это морфология негативных колоний и литическая активность и на основании полученных данных отобран наиболее подходящий для- этих целей штамм бактериофага.

По морфологии негативных колоний выделенные бактериофаги разделены на две группы. К первой группе относятся бактериофаги, образующие негативные колонии диаметром 2мм и полностью прозрачные, ко второй группе относятся бактериофаги, имеющие диаметр 3-4мм с четким прозрачным центром и мутным ореолом по периферии.

Литическая активность выделенных бактериофагов P. aeruginosa варьи

7 1Л 7 1П ровала от 10" до 10" по методу Аппельмана и от 2x10 до 4x10 по методу Грациа.

Далее изучили спектр литической активности и специфичность действия выделенных и отобранных бактериофагов УГСХА- Р.а.№1 и УГСХА-Р.а.№4. Проведенные эксперименты показали, что оба фага являются высокоспецифичными по отношению к штаммам P. aeruginosa. Спектр литической активности составил у бактериофага УГСХА- Р.а.№1 - 76.9 %, а спектр литической активности бактериофага УГСХА- Р.а.№4 - 94.8 %. В настоящее время в России препараты бактериофагов выпускаются на производственных объединениях концерна «Микроген». Спектр литической активности комер-ческих бактериофагов составляет 48,4%. Препарат разработанный коллективом авторов Санкт-Петербурга, состоящий из нескольких бактериофагов, имеет совокупный спектр литической активности 81,7% (Асланов, Яфаев, Зуева, 2003).

Изучена температурная чувствительность и устойчивость к хлороформу бактериофага УГСХА- Р.а.№4. Оказалось что бактериофаг УГСХА- Р.а.№4 оказался устойчив к температуре 55 °С. При температуре выше 55 °С фаг УГСХА-Р.а.№4 терял свою физиологическую активность и погибал при температуре выше 75 °С. Литературные данные показывают, что фаги P. aeruginosa устойчивы к температуре 60 °С — 65 °С в течение 30 минут (Maillard, Hann, Perrin, 1998; Жиленков, 1998).

Результаты исследований устойчивости бактериофага УГСХА-Р.а.№4 к инактивирующему действию хлороформа (обработка 1:10 в течение 60 минут) определили их 100% устойчивость, а штаммы P. aeruginosa инактивиро-вались уже при экспозиции 30 минут. В результате анализа полученных данных было установлено, что при конструировании биопрепарата и постановки реакции; нарастания® титра фага, инактивировать фаголизаты целесообразно? хлороформом.

Таким образом по результатам изучения биологических свойств был отобран бактериофаг УГСХА-Р.а.№4, для изготовления биопрепарата с целью идентификации и индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

Определены оптимальные технологические параметры для изготовления биопрепарата с высокой литической активностью: соотношение количества фаговых корпускул к к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма P. aeruginosa 1:5, время инкубирования при температуре 37 °С — 6 часов. Для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий необходимо применение хлороформа в соотношении 1:10 в течение 30 минут.

Для ускоренной индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах, разработали биотехнологические параметры постановки реакции нарастания титра фага, включающие количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение и оптимальное время, обеспечивающее полноценное взаимодействие: фага с бактериями.

По результатам проведенных исследований установлено, что количественный показатель реакции нарастания титра фага для УГСХА-Р.а.№4 (увел личение количества корпускул фага более чем в 5 раз) составил 10 м.к./мл. Оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров:

- предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5, „ 16, 24 часов, с последующим инкубированием в течение 5 ч при температуре 37 °С.

- Увеличение времени контакта исследуемого материала с фагом до 7, 16, 24 часов при температуре 37 °G.

В результате проведенных исследований было установлено; что после предварительного подращивания исследуемого материала: в течение 5 часов удалось обнаружить P. aeruginosa гомологичные фагу УГСХА-Р.а.№4 в fy концентрации 10 м.к./мл.

Увеличение времени предварительной инкубации до 16 часов повысило чувствительность РНФ на один порядок. Подращивание материала при 24-часовой экспозиции существенно не повлияло на результаты РНФ.

Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что наиболее оптимальным является режим РНФ при 7 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом без подращивания. Такой режим позволяет провести индикацию P. aeruginosa в количестве 10 м.к./мл, в течение 24 часов. Однако увеличение времени инкубирования до 16 часов повышает чувствительность метода и биопрепарата на порядок и позволяет выявлять P. aeruginosa при наличии их в исходном исследуемом материале 10 м.к./мл.

РНФ как указывают В.Д. Тимаков и Д.М. Гольдфарб (1956), является чувствительным и специфическим методом диагностики, позволяющим за относительно короткий срок обнаружить искомые бактерии в субстрате, при наличии посторонней микрофлоры без выделения чистых культур.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шестаков, Андрей Геннадьевич, Саратов

1. Абдусаматов, М.А. Сравнительное изучение реакции нарастания титра фага и бактериологического метода при диагностике брюшного тифа у больных и реконвалесцентов / М.А Абдусаматов. // ЖМЭИ. — 1960. -№1. С. 23-27.

2. Аврех, В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмонелле-зов / В.В. Аврех // ЖМЭИ. 1954. - №7. - С. 93-96.

3. Азизбекян, P.P. Изменение наследственности бактерий путем фаговой конверсии / P.P. Азизбекян // В кн. Микробиология. Т.З. (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М. - 1974. - С. 191-233.

4. Алешня, Е.П. Способ идентификации Pseudomonas aeruginosa / Е.П. Алешня, В.В. Алешня // Открытия. 1977. - №36. - С. 70-72.

5. Ароне, P.M. Применение синтетических минеральных сред для выделения синегнойной палочки / P.M. Ароне, Т.В. Чурсина // Лаб. дело. -1976. -№3.- С. 179-180.

6. Арский, В.Г. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии / В.Г. Арский, 3.3. Ахметов, А.В. Ясен-ский // Здравоохранение Таджикистана. — 1961. — №2. — С. 5-11.

7. Архангельский, И.И. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров / Б.А. Степанов, И.И. Архангельский // Ветеринария. 1966. - №3. - С. 27-29.

8. Асланов, Б.И. Пути рационального использования синегнойных бактериофагов в лечебной И'противоэпидемической практике / Б.И. Асланов, Р.Х. Яфаев, Л.П. Зуева // Микробиол. 2003. - №5. - С. 72-76.

9. Афонин, Э.А. Разработка бактериологического метода выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa / Э.А. Афонин // Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Ульяновск, 1999 — 18 с.

10. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. — Л., 1962. — 261 с.

11. Байрак В*.А. Тесты патогенности и фаготипы стафилококков, выделенных при мастите коров / В.А. Байрак // Автореф. дис. .канд. биол. наук. — М., 1970;- 19 с.

12. Бейли, Н. Математика-в биологии и медицине / Н. Бейли. — М.: Мир, 1970.-326 с.

13. Бовкун Г.Ф. Биологические свойства синегнойной,палочки и ее роль в патологии птицы / Г.Ф. Бовкун, А.Н. Борисенкова // Ветеринария. — 1995.- №2.- С. 30-33.

14. Белов, Д. В. Физико-химические явления на поверхности алюминия и его сплавов при воздействии микроорганизмов / Д.В. Белов // Автореф. дис. канд. химич. Наук. Нижний-Новгород, 2007. — 23 с.

15. Бульканова, Е.А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров их применения // Автореферат, дис. . канд. биол. наук. — Саратов. — 2006. — 20 с.

16. Бухарин, О.В. Биоиндикация экологического состояния равнинных рек / О.В. Бухарин, Г.С. Розенберг. М.: Наука, 2007. - 403 с.

17. Висконти, Р. Генетика бактериофага / Р. Висконти // Онтогенез вирусов. М. - 1956. - С. 141-142.

18. Владимиров, Добрецов Флюорисцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов // Наука. — М. — 1980.- С. 268-270.

19. Габрилович, И.М. Общая,характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. Минск. - 1973. — С. 5 - 24.

20. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение / В.Я. Ганюшкин // Автореф. дис. .докт. вет. наук. — М. — 1984. — 34 с.

21. Гольдфарб, Д.М. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии / Д.М. Гольдфарб, В.Н. Кузнецова // ЖМЭИ. — 1957.-№8.-С. 90-94.

22. Гольдфарб, Д.Mi Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // Mi: Медгиз. -1961.-299 с.

23. Гордина, Р.В. Фаготипирование паратифозных В бактерий: и действие на них бактериофагов / Р1В. Гордина // Автореф. дис. . докт. вет. наук. -М., 1954.-С. 24-27.

24. ГОСТ Р 26670-91. Продукты пищевые. Методы культивирования, микроорганизмов. Взамен ГОСТ 26670-85. - М.: Изд-во стандартов, 2008. -8 с.

25. ГОСТ Р 51426-99. Микробиология. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Общее руководство по приготовлению разведений для микробиологических исследований. — М.: Изд-во стандартов, 2002. — 7 с.

26. ГОСТ Р 51446-99. Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований. — введен 01.01.2001 до 01.01.2010.-М.: Изд-во стандартов, 2005 .-31 с.

27. Давиденко, Т.А. Фаготипирование S.typhimurium, выделенных в Киеве в 1966-1970 / Т.А. Давиденко, А.М. Зарицкий // В кн.: Кишечные инфекции. Киев. - 1972. - С. 41-43.

28. Домарадский, И.В. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага / И.В. Домарадский, О.Н. Мосолова, JI.K. Денисенко // Иркутск. 1957. - С. 44-51.

29. Жарикова, М.С. Оценка эффективности питательных сред для обнаружения синегнойной палочки / М.С. Жарикова, А.Т. Козлова, Л.Г. Зимина//Лаб. дело. 1983. - №10. - С. 48-51.

30. Жиленков, Е.Л. Изучение начальных стадий взаимодействия умеренного фага phi04 с клеткой Pseudomonas aeruginosa / Е.Л. Жиленков // Микробиол. 1997. - Т.66. - №4. - С. 532-538;.

31. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических» биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий /■ С.Н. Золотухин // Автореф. дис. . д-ра биол. наук. -Ульяновск, 2007. 39 с.

32. Инфекция, вызванная Pseudomonas aeruginosa у шиншилл / Lipej Z. et al.. Hrv. Vet. Vjesn. - 1993. - V.21. - №3. - P. 73-77.

33. Применение РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов / А.Ю. Иллютович и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958. - № 6. - С. 78-83.

34. Илюхин, В.И. Псевдомонадные инфекции в патологии человека / Илюхин, В.И. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1985. - №2. - С. 110-114.

35. Калина, Г.П. Применение жидких сред накопления при поисках Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды и патологическом материале / Г.П. Калина, Н.Б. Комзолова // ЖМЭИ. — 1988. — №5. -С. 98-105.

36. Кандемия у пациентов в стационарах Санкт-Петербурга / Н.Н. Климко и др. // журнал клин, микробиол. и антимикр. химиотерап. — 2002. -Т. 4.- № 1. С. 15-21.

37. Капырина, Н.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага / И.А. Бакулов, Н.А. Капырина // Симпозиум "Профилактика и меры борьбы с лептоспирозом и листериозом с/х животных". -Новочеркасск. — 1972. С. 76-78.

38. Усвоение додецилсульфата натрия бактериями рода Pseudomonas / Е.А. Киприанова и др. // Микробиол. 1978. - Т.40. - №4. - С. 503-505.

39. Кандемия у пациентов в стационарах Санкт-Петербурга / Н.Н. Климко и др. // Клин, микробиол. и антимикр. химиотерап. — 2002. — Т.4. — № 1.- С. 15-21.

40. Клюянова, М. Ä. Разработка основы.биопрепарата для диградации нефти при загрязнении природных сред / М.А. Клюянова // Автореф. дис. .канд. биол. наук. — Уфа, 2009. — 24 с.

41. Ковалева, E.H. Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enteroccocus faecalis // Автореф. дис. .канд. биол. наук. Ульяновск, 2009. - 20 с.

42. Козелько, O.A. Применение метода РНФ для контроля качества дезинфекции в очагах кишечных инфекций / O.A. Козелько // ЖМЭИ. — 1961.-№2.-С. 36-40.

43. Кольпикова, Т.И. Фаготипирование листерий / Т.И. Кольпикова // Ветеринария. 1990. - №6. - С. 31-32.

44. Коритняк, Б.М. . Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Yersinia enterocolitica и их применение в диагностике // Автореф. дис. . .канд. биол. наук. Саратов, 2005. - 20 с.

45. Красильников, А.П. Микробиологический словарь — справочник / А.П. Красильников, Т.Р. Романовская // Минск: Асар. 1999. - С. 310-311.

46. Кременчук, Г.А. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды / Г.А. Кременчук, М.А. Гицевич, К.П. Бояршинова // ЖМЭИ. 1961. - № 7. - С. 124-126.

47. Кульба, A.M. Биологические свойства и нуклеотидный состав ДНК бактериофагов Pseudomonas / A.M. Кульба, A.C. Горелышев // Ж., Микробиология. 1981. - Т.50. - В.З. - С. 536-542.

48. Мац, Л.И. Вопросы санитарной бактериологии и вирусологии. — М.: Медицина. 1965. - С. 44-59.

49. Методические рекомендации: по выделению и диагностике псевдомо-ноза сельскохозяйственных животных. — ГУВ МСХ СССР, М., 1982.

50. Методы частной бактериологии / Д.А. Васильев и-др.. Ульяновск : Ульяновская ГСХ, 2004. - 233 с.

51. Молофеева, Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Escherichia coli 0157 и их применение в диагностике: Автореф. дис. .канд. биол. наук. — Саратов, 2004. 20 с.

52. Мороз, А.Ф. Синегнойная инфекция / Мороз, А.Ф. Анциферова, Н.Г. Баскакова, Н.В. М. - Медицина, 1988. — 256 с.

53. Мороз, А.Ф. Питательная среда для выделения Pseudomunas aeruginosa / А.Ф. Мороз, Г.Е. Афиногенов, Б.М. Бекбергенов // Лаб. дело. — 1976. №5.- С. 302-303.

54. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / под редакцией А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. -М.: Медицина, 2004. — 576 с.

55. Островская, Н.Н. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фага / Н.Н. Островская, Б.Н. Папкова // ЖМЭИ. 1951. - № 2. - С. 37-40.

56. Определитель бактерий Берджи / под редакцией Дж. Хоулта и др., 9-е издание. Т.1. М.: Мир, 1997. - 432 с.

57. Островская, Н:Н. К использованию метода нарастания* титра фага для выявления бруцелл во внешней среде / Н.Н". Островская, Д.М. Гольд-фарб // ЖМЭИ. 1961. - № 5. - С. 145-147.

58. Павлова, И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов Вас. anthracis и Вас. Cereus / И.П. Павлова // ЖМЭИ. 1971«. - № 7. —1. С. 147-149.

59. Плетенева, Е.А. Изучение разнообразия в группе фагов вида РВ1 (Mio-viridae) Pseudomonas aeruginosa и их поведения на адсорбционно-устойчивых мутантах бактерий / Е.А. Плетенева, О.В. Шабурова // Генетика. 2008. - Т. 44. - №2. - С. 185-194.

60. Покровский, В.И. Медицинская микробиология / В.И. Покровский, O.K. Поздеев // М.: Гоэтар Медицина. 2002. - С. 343-348.

61. Покровский, В.И. Медицинская микробиология / В.И. Покровский, O.K. Поздеев // М.: Гоэтар Медицина. 1998. - С. 183-192.

62. Пожарникова, E.H. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Enterobacter, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения: Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Саратов, 2006. — С. 4-19.

63. Поляк, М.С. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии / М.С. Поляк СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 179-180.

64. Пульчеровская, Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. — 21 с.

65. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней / И.П. Ревенко // Ветеринария. 1970. - № 6. - С. 13-23.

66. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев: Урожай. - 1978. - С. 41-88.

67. Рожавин М.А. Меланинообразующие культуры Pseudomonas aeruginosa / М.А. Рожавин, П.Л. Тыдельская // Журн. микробиологии.-1979.- N2.-С. 21-23.

68. Результаты бактериологического обследования поросят различного возраста в свиноводческом комплексе / О. В. Прунтова и др. // Вирусные болезни с.-х. животных : тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. Владимир. — 1995. 175 с.

69. Рубашкина Б.К., Казакова С.Ф. Применение метода нарастания титрафага для исследования объектов внешней среды / Б.К. Рубашкина, С.Ф. Казакова // ЖМЭИ. 1959; - №6. - С. 110-112.

70. Ряпис, Л.А. Биологическая активность, музейных и свежевыделенных культур Pseudomunas aeruginosa и возможные* фазовые преобразования популяций возбудителя / Л.А. Ряпис и др.. — микробиол:, эпидемиол. и иммунобиол. — 1994. № 6. — С. 31-32.

71. Сергиенко Ф.Е. Новый метод бактерюлопчно д!агностики за допомо-гою бактерюфага / Ф.Е. Сергиенко // Мжробюл. журн. АН УССР. — 1936. -№1. -С. 85-112.

72. Сиволодский, Е.П. Тест идентификации бактерий рода Pseudomonas / Е.П. Сиволодский // Лаб. дело. 1988. - № 11. - С. 64-66.

73. Смирнов, В.В. Бактерии рода Pseudomonas / B.B. Смирнов, Е.А. Ки-прианова // Киев: Наук. Думка. — 1990. С. 65-69.

74. Стефанов, И. Распространение Pseudomonas aeruginosa в мякоти мясных продуктов / И. Стефанов // Вет. мед. — 1997. — №4. С. 256-257.

75. Стронговская, Н.В. Сравнительное изучение РНФ для выявления носи-тельства дизентерийных бактерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. — Симферополь. 1964. - С. 6-20.

76. Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов, справочник / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Ф. Федотов. М.: Медицина, 1995.-319 с.

77. Тимаков, В.Д. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3-7.

78. Тимаков, В:Д: Об условиях взаимодействия фага и бактериальной клетки / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // Вестник АМН СССР. 1958. - № 2. — С. 37-43.

79. Тимаков, В.Д. Реакция нарастания титра фага (РНФ) / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб. М., 1962. - 32 с.

80. Тихоненко, A.C. Ультраструктура вирусов бактерий. — М.: Наука.1968.-89 с.

81. Тыдельская, И.JI.Селективная среда для выделения Pseudomonas aeruginosa / И.Л. Тыдельская, М.А. Рожавин, В.В. Солозуб // Лаб. дело. 1980. - № 9. - С. 549-550.

82. Усвоение додецилсульфата натрия бактериями рода Pseudomonas / Е.А. Киприанова и др. // Микробиол. 1978. - Т. 40. - №4. - С. 503-505.

83. Феоктистова, Н.А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Proteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения // Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Саратов. — 2006. 22 с.

84. Цветков, К.И. Применение специфического фактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл / К.И. Цветков // Ветеринария. -1941.-№6.-С. 4-6.

85. Шуляк, Б.Ф. Руководство по бактериальным инфекциям собак. Том 2. Грамотрицательные бактерии / Б.Ф. Шуляк. — М.: «Олита», 2003. -283 с.

86. Щеглова, М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага / М.К. Щеглова // ЖМЭИ. 1962. - № 1. - С. 99-102.

87. Яковлев С.В. Современные подходы к антибактериальной терапии инфекций мочевыводящих путей / С.В. Яковлев // Consilium-medicum. — 2001.- №3.-С. 300-306.

88. Яковлев, С.В. Бактериальные инфекции в амбулаторной практике: выбор оптимального антибактериального препарата / С.В. Яковлев, Л.И.

89. Дворецкий, М.П. Суворова // Consilium medicum. 2002. — №4. - С. 10-21.

90. A second N-acylhomoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa / J.P. Pearson et al. // Proc Natl Acad Sci U. S. A. — 1995. V. 92.-P. 1490-1492.

91. Aalam, S. High efficiency styrene biodégradation in a biphasic organic/water continuous reactor / S. Aalam, A. Pauss, J. Lebeault //Applied Microbiology Biotechnology. 1993. - №39. - P. 696-699.

92. Al-Hadhrami, M.N. Bacterial survival and n-alkane degradation within omani crude oil and a mousse / M.N. Al-Hadhrami, H.M. Lappin-Scott, P J. Fisher // Mar. Pollut. Bull. 1995. V. 30. - №6. - P. 403-408.

93. Barnes, H.J. Miscellaneous and sporadic bacterial infections / H.J. Barnes // In Y.M. Saif : Diseases of poultry, 11th edition. 2003. - P. 845-862.

94. Bonde, G. Bacterial Indicator of Water Pollution. / G. Bonde // Teknisk For-lag. Copenhagen. - 1963. - P. 164-167.

95. Boucadida, J. Molecular epidemiology of chronic pulmonary colonization by Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis / J. Boucadida, M. de Montalembert, J. Lenoir // J. Med. Microbiol. 1993. - V. 38. - P. 29-33.

96. Bouza, E. A European perspective on nosocomial urinary tract infections. I. Report on the microbiology, work-load, etiology and antimicrobial susceptibility / E. Bouza, A. Voss, et al. // Clin Microbiol Infect. 2001. - V. 7. -P. 523-531.

97. Boyd, J. S. K. Bacteriophage and heredity / J. S. K. Boyd // Nature. 1954. -V. 173.-P. 50-51.

98. Burnet, F. M. Induced lysogenicity and mutation of bacteriophage within ly-sogenic bacteria / F. M. Burnet, D. Lush. // Australian J. Exptl. Biol. Med. Sei. 1936. - V. 14. - P. 27-38.

99. Byng, G. Variable enzymological pattering in tyrosine biosynthesis as a means of determining natural relatedness among the Pseudomonadaceae / G. Byng, R. Whitarer, Cherna et al. // J. Bacteriol. 1980. - V. 144. - №1. -P. 247-257.

100. Comparative Genomic Analysis of 18 Pseudomonas aeruginosa Bacteriophages / T. Kwan et al. // Journal of Bacteriology. 2006. - V. 188. - № 3. -P. 184-187.

101. Darreil, J.H. Pyocine-typing of hospital strains of Pseudomonas pyocyanea / J. H. Darrell, A.H. Wahba. // J. Clin. Pathol. 1964. - V. 17. - P. 236-242.

102. De Vos, P. Intrageneric and intergeneric similarities of ribosomal RNA cis-trons of the Genus Pseudomonas and the implications for taxonomy / P. De Vos // Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol, and Serol. 1980. — V. 46. — № l.-P. 96-99.

103. Ednie, L.M. Comparative activities of clinafloxacin against gram-positive and -negative bacteria / L.M. Ednie, M.R. Jacobs, P.C. Appelbaum // An-timicrob Agents Chemother. 1998. - V. 42. - P. 269-273.

104. Euzeby, J.P. List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature -Genus Pseudomonas. http://www.bacterio.cict.fr/index.html.

105. Expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes requires cell-to-cell communication / L. Passador et al. // Science. 1993. - V.260. - P. 127130.

106. Feldman, M. Role of flagella inj pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection / M.' Feldman; R. Bryan, S. Rajan, L. Scheffler, S. Brunnert, H. Tang, et al. // Infect Immun. 1998. - V. 66. - P. 43-51.

107. Festl, H. DNA hybridization probe for the Pseudomonas fluorescens group/ H. Festl, W. Ludwig, K. H. Schleifer // Appl. And Environ. Microbiol. -1986.-V.52.- №5.- P. 190-194

108. Finegold, Bailey and Scott's Diagnostic Microbiology / Finegold // 7th ed., The C. V. Mosby Co., St. Louis. 1986.

109. Frank, D.W. Cloning and sequence analysis of a transregulatory locus required for exoenzyme S synthesis in Pseudomonas aeruginosa / D.W. Frank, B.H. Iglewski 11J Bacteriol. 1991. - V. 17. - №3. - P. - 460-468.

110. Freeman, V. J. Studies on the virulence of bacteriophage infected strains of Corynebacterium diphtheriae / V. J. Freeman // J. Bacteriol. 1951. - V. 61.-P. 675-688.

111. Frei, W. Uber Cytochrom and das Atmungssystem der Bakterien / W. Frei, L. Riedmuller, F. Almasy // Biochem. Z. 1934. - V.27. - №4. - P. 253267.

112. Fuerst, J.A. Surfase appendages similar to fimbriae (pili) von Pseudomonas cpecies / J.A. Fuerst, A. Hayward // J. Gen. Microbiology. 1969. - V. 58. -№ 2. - P. 227-237.

113. Fuqua, W.C. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators / W.C. Fuqua, S.C. Winans, E. P. Greenberg // J Bacteriol. 1994. -V. 17. - №6. - P. 269-275.

114. Gaby, W.L. Differential diagnosis of pseudomonas-like microorganisms in the clinical laboratory / W. L. Gaby, E. Free // J. Bact. 1958. - V.76. -№4. p. 442-444.

115. Gaby, W. L. Practical laboratory test for the identification of Pseudmnas aeruginosa / W. L. Gaby, C. Hadley // J. Bact. 1957. - V. 74. - P. 356-363.

116. Galloway, D.K: Pseudomonas aeruginosa elastase and elastolysis revisited: recent developments / D.R. Galloway I I Mol Microbiol: — 1991. — V.5. — №2.-P. 315-321.

117. Gambello, M:J. Cloning and characterization of the Pseudomonas aeruginosa lasR gene, a transcriptional activator of elastase expression / M.J. Gambello, B.H: Iglewski //J Bacteriol. 1991. - V. - 17. - №3. - P. - 3039.

118. Greta, B. Elaboraría Si Evaluaría Metodelor Rapide Pentru Diagnosticul La-borator AI Infectiilor Tractusulii Urinar / G. Balan, // Teza de doctor on medicina. Chisunai. - 2008.

119. Gould, W. New selective media for enumeration and recovery of Pseudomo-nads from various habitats / W. Gould, C. Hagertorn, T. Bardinelli, R. Zabrotoviwicz // Appl. and Envirion.Microbiol. — 1985. V. 45. - №1. - P. 28-32.

120. Garg, P.K. Incidence, spectrum and antibiotic sensitivity pattern of bacterial infections among patients with acute pancreatitis / P.K. Garg, S. Khanna, N.P. Bohidar, et al. // J. Gastroenterol Hepatol. 2001. - V.16. - P. 55-59.

121. Gilardi, G. L. Nonfermentative gram-negative bacteria encouatered in clinical specimens. J. Microbiol. Serol. - 1974. - V. 39. - №2. -P. 29-42.

122. Graber, C. D. Bacteriophage grouping of Pseudomonas aeruginosa / C. D. Graber, R. Latta, E. H. Vogel, R. Brame. // Amer. J. Clin. Pathol. 1962. -V.37.-P. 54-62.

123. Hancock, R. Antibiotic uptake in.Gram-negative bacteria / R.Hancock, A. Bell // Eur. J. Clin Microbiol Infect. Dis. 1988. - V.7. - P. 713-720.

124. Holloway, B. W. Genom organization in Pseudomonas / B. W. Holloway, A. F. Morgan // Ann. Rev. Microbiol: 1986. - V. 40. - P. 79-105.

125. Holloway, B.W. Lysogeny in Pseudomonas, aeruginosa / B.W. Holloway, J. B. Egan, M. Monk. // Aust. J: Exp. Biol. 1960. - V. 38. - P. 321-330.

126. Holloway, B. W. Lysogenic conversion in Pseudomonas aeruginosa / B. W. Holloway, G. N Cooper. II J. Bacteriol. 1962. -V. 84. - P. 321-324.

127. Hugh, R. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various Gram-negative bacteria / R. Hugh, E. Leifson // J. Bact. 1953. - V. 66. - №1. - P. 24-26.

128. Husson, M.O. Pseudomonas and Burkholderia / M.O. Husson, Mr. Hamze, S. Verhille, D. Izard //Clinical precis of bacteriology, Paris. 2000. - P. 259-285.

129. Iglewski, B.H. Pseudomonas. In: Baron's Medical Microbiology (Barron S et al, eds.) / B.H. Iglewski // 4th ed., Univ of Texas Medical Branch. 1996. -P. - 543-548.

130. Iglewski, B.H. Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S: an adenosine diphosphate ribosyltransferase distinct from toxin A / B.H. Iglewski, J. Sadoff, M.J. Björn, E.S. Maxwell // Proc Natl Acad Sei USA.- 1978. V.75. -№3.-P. 211-215.

131. Jain, D.K. Effect of addition of Pseudomonas aeruginosa Ug2 inocula or biosurfactants on biodégradation of selected hydrocarbons in soil / D.K. Jain, H. Lee, J.T. Trevors // Journal of Industrial Microbiology. 1992. -V.lOi — №2. — P. 87-93.

132. Jessen, O. Pseudomonas aerugenosa and other green fluorescent pseudomo-nads / Jessen. O. // Munksgaad, Copenhagen. 1965 - P. 244-246.

133. Keeven, J. A new selective medium for isolation / J. Keeven, B. De Cicco // Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1987, 87tm Annu. Meet., AtlantaWashington, D.C. 1987.-P. 382-385.

134. Kirschke, D.L. Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens contamination associated with amanufacturing defect in bronchoscopes / D.L. Kirschke, et. al. // The New England Journal of Medicine. — 2003. V. 348. -№3.- P. 214-220.

135. Klinge, K. Differential tehniques anB methods of isolation of Pseudomonas / K. Klinge // Journal of Applied Microbiology. 1960. - V. 23. - №3. - P. 442-462.

136. Kramer, G. Beitrage1 zum- sofortigen Nachweis von Oxydations-und Reduktionswirkungen der Bakterien auf Grund der neuen Methode von W. H. Schultze / G. Kramer // Zbl. Bakt. (Abt. 1 Orig.). 1912. - V.62.1. P. 394-399.

137. Krylov, V. Myoviridae bacteriophages of Pseudomonas aeruginosa: a long and complex evolutionary pathway / V. Krylov // Res Microbiol. — 2003. — V. 154.-P. 69-75.

138. Lazdunski, A. Factors of virulence of Pseudomonas aeruginosa and their regulation / A. Lazdunski // Med. Badly. Repugnant. 1998. - V. 28. - P. 109-118.

139. Levin, M.A. Membrane filter technique for enumeration of Pseudomonas aeruginosa / M.A. Levin, V.J. Cabelli // Appl. Microbiol. 1972. - V. 24. -P. 864-870.

140. Loele, W. Uber die Verwendbarkeit von Oxydationswirkungen mit Para-phenylendiamin in der Bakteriologie / Loele, W. // Zbl. Bakt. (Abt. 1 Orig.). — 1929. — V. 111.-P. 325-328.

141. MacFaddin, J.F. Media for Isolation Cultivation -Identification-Maintenance of Medical Bacteria / J.F. MacFaddin // Williams and Wilkins, Baltimore. - 1985. -V. 1. - P. 25-28.

142. Maillard, J.Y. Perrin R Resistance of Pseudomonas aeruginosa PAOl phage Fl 16 to sodium hypochlorite / J.Y. Maillard, A.C. Hann // J: Appl Microbiol. 1998. - V.85. - №5. - P. 799-806.

143. Mann, S. Ober melaninbildende Stamme von Pseudomonas aeruginosa / S. Mann // Arch. Microbiol. 1969. - V. 65. - №4. - P. 359-379.

144. Meschede, W. Pseudomonas aerugenosa / W. Meschede // Med. Welt. — 1986. -V. 37, №41. -P. 269-272.

145. Multiple antibiotics, resistance in Pseudomonas aeruginosa: evidence, for involvement of an efflux operone / K. Poole et al. // J: Bacteriol. 1993. -V. 175.-P. 363-372.

146. Neu, H.C. Ecology, clinical significance and antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aerugenosa / H.C. Neu // Nonfermentative gram-negative rods.- 1985.-V. 16.-P. 117-159.

147. Nicas, T.I. The role of exoenzyme S in infections with Pseudomonas aeruginosa / T.I. Nicas, J. Bradley, J.E. Lochner, B.H. Iglewski // J Infect Dis. -1985.-№152.-P. 16-21.

148. Nikaido, H. Outer membranes of gram-negative bacteria. XIX. Isolation from Pseudomonas aeruginosa PAOl and use in reconstitution and definition of the permeability barrier / H. Nikaido, R.E. Hancock // J. Bacteriol. -1978.-V. 136.-№1.-P. 381-390.

149. Nikaido, H. Penetration of lipophilic agents with multiple protonation sites into bacteria cells; tetracyclines and fluoroquinolones as examples / H. Nikaido, D.G. Thanassi // Antimicrob Agents Chemother. — 1993. V. 37. -P. 393-399.

150. O'Calaghan, R.J. Physical stability and biological and physicochemical properties of twelve Pseudomonas aeruginosa bacteriophages / R.J. O'Calaghan, W. O'Mara, J. B. Grogan // Virology. 1969. - V.37. -P. 642-653.

151. Ojeniyi, B. Comparison of genome fingerprinting with conventional typing methods used on Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients / B. Ojeniyi, U. Steen-Petersen, N. Hoiby // APMIS. 1993". - V. 101. -P. 168-175.

152. Ogle, J.W. Characterization and use of a DNA probe as an epidemiological marker for Pseudomonas aeruginosa / J.W. Ogle, J.M. Janda, D.E. Woods, M.L. Vasil // J. Infect. Dis. 1987. -V. 155. - P. 119-126.

153. Olive, P.r B. Di Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms / PI B. D. Olive // J. Olin Microbiol 1999. V. 37.-P. 661-669.

154. Osman, M.A.Pyocine typing of P. Aeruginosa / M.A. Osman // J. Clin. Pathol. 1965. - V. 18. - P. 200-202.

155. Palleroni, N.J. Doudoroff M. Nucleic acid homologies in the genus Pseudomonas / N.J. Palleroni, M. Doudoroff // Int. J. Syst. Bacteriol. 1973. - V. 23.-№4.-P. 333-339.

156. Palleroni, N.J. Genus Pseudomonas Migula 1984 / N.J. Palleroni // Bergey's manual of systematic bacteriology Ed. R. Noel, Krieg J. G. Holf.-Baltimore: London: Williams Wilkins. 1984. - V.l. - P. - 141-198.

157. Palleroni, N.J. The Pseudomonas group / N.J. Palleroni // Bushey: Meadow-field press Ltd. 1978. - 80 p.

158. Pesci, E.C. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing / E.C. Pesci, B.H. Inglewski // Trends Microbiol. 1997. - V. 24. - P. 132-134.

159. Pickett, M.J. Manual of Clinical Microbiology / M.J. Pickett, D.G. Hollis, E. Bottone // 5th ed., ed. in chief A.Ballows. Washington: Am Soc Mirobiol. -1991.-P. 410-428.

160. Postic, B. Observations on bacteriophage typing of Pseudomonas aeruginosa / B. Postic, M. Finland // J. Clin. Invest.-1961. V.40. - №20. - P. 6475.

161. Premalatha, A. Pentachlorophenol degradation by Pseudomonas aeruginosa / A. Premalatha, G. S. Rajakumar // World Journal of Microbiology« and Biotechnology. 1994. -№10. - P. 334-337.

162. Roncero, C. Pseudomonas aeruginosa Transposable Bacteriophages D3112 and B3 Require Pili and Surface Growth for Adsorption / C. Roncero, A. Darzins, J. Malcolm // J. of Bact., Apr. 1990. P. 899-904.

163. Ryan, K.J. Sherris Medical Microbiology / K.J. Ryan, C.G. Ray // 4th ed., McGraw. 2004. - P. 236-239.

164. Shibata, N., Doi Y., Yamane K., Yagi T., Kurokawa H., Kato K.S.H.,.Kai. K., Arakawa Y. // Journal of Clinical Microbiology. 2003. - V. 41. - P. 407-411.

165. Schubert R., The use of arginine brilliant' green glucose peptone broth (ABGP medium) as a primary culture medium for Pseudomonas'aeruginosa / R. Schubert // Zbl.Bakt. B. 1989. - V.187. - №3. - P. 266-268.

166. Schultze, W.H. Uber eine neue Methode zum Nachweis von Reduktions-u. Oxydations-wirkungen der Bakterien / W.H. Schultze // Zbl. Bakt. (Abt. 1 Orig.). 1910. - V. 56. - P. 544-548.

167. Schwartz, D.C. and Cantor C.R. // Cell. 1984. -V. 37. -P. 67-75.

168. Sellers, W. Medium for differentiating the gram-negative, nonfermenting bacilli of medical interest / W. Sellers //J. Bact. 1964. - V.8. - P. 46-48.

169. Sjoberg, L. Phage typing of Pseudomonas aeruginosa / L. Sjoberg, A. A. Lindberg. // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1968. - V.74. - P. 61-68.

170. Srinivasan, A. An outbreak of Pseudomonas aeruginosa infection associated with flexible bronchoscopes / A. Srinivasan, et.al. // The New England Journal of Medicine. 2003. - V.348. -№3. - P. 221-227.

171. Stackrerbrandt, E. The evolution of prokaryotes / E. Stackrerbrandt, C.R. Woese // Molecular and cellular aspects of microbial evolution: Soc. Gen. microbiol. symp.- Cambridge: Univ. Press. — 1981. — P. 21-31.

172. Stanier, R. Y. The aerobic pseudomonads: a taxonomic study / R. Y. Stanier, N. J. Palleroni, M. Doudoroff. // J. Gen. Microbiol. 1966. -V. 43. P. 159271.

173. Steed, C.J. Common infections acquired in the hospital: the nurse's role in prevention / C.J. Steed. // Nurs Clin North Am. 1999. - V.34. - №2. - P. 43-61.

174. Stock, J.B. Protein phosphorylation and regulation of adaptive response in bacteria / J.B. Stock, A.J. Ninfa, A.M. Stock // Microbiol Rev 1989. V. 53. -P. 450-490.

175. Uetake, H. Conversion of somatic antigens in Salmonella by phage infection leading to lysis or lysogeny / H. Uetake // Virology. 1958. — V. 5. - P. 6891.

176. Van Dyke, M.I. Evaluation of microbial surfactants for recovery of hydrophobic pollutants from soil / M.I. Van Dyke, S.L. Gulley, H. Lee, J.T. Trevors // Journal of Industrial Microbiology. 1993. - №11. - P. 163-170.

177. Vidal, D.R. Immunosuppressive effects of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A on human B-lymphocytes / D.R. Vidal, P. Garrone, J. Banchereau // Toxicon. 1993. - V.31. - P. 27-34.

178. Weber, D.J. Nosocomial infections in the ICU: the growing importance of antibiotic-resistant pathogens / D.J. Weber, R. Raasch, W.A. Rutala // Chest 1999.-V.115.-P. 34-41.

179. Welsh, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. - №72. - P. 13-18.

180. Wick, M.J. Analysis of the structure-function relationship of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A / M.J. Wick, A.N. Hamood, B.H. Iglewski //Mol Microbiol 1990. V.4. -№5. - P. 27-35.

181. Williams, J.G.K. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafal-ski, S.V. Tingey // Nucleic Acids Res. 1989. - V.18. -№6. -P. 531-535.

182. Woese, C.R. Phylogenetic definition of the major eubacterial taxa / C.R. Woese, E. Stackrerbrandt, T. Macre, J.E. Fox // Syst. Appl. Microbiol. -1985. V.6. -№1. — P. 143-151.

183. Woods, D.E. Toxins of Pseudomonas aeruginosa: new perspectives / D.E. Woods, B.H. Iglewski // Rev Infect Dis. 1983. - V.4. - №7. - P. 15-22.

184. Yahr, T.L. Identification of type III secreted products of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S regulon / T.L. Yahr, L.M. Mende-Mueller, M.B. Friese, D.W. Frank // J. Bacteriol. 1997. - V.179. - №7. - P. - 165-168.

185. Zabransky, R.J. Day Pyocine typing of clinical strains of Pseudomonas aeruginosa / R.J. Zabransky, F.E. Day // Appl. Microbiol. 1969. — V. 17. -P. 293-296.

186. Zierdt, C.H. Pseudomonas aerugenosa: Serology, phase, pyocin / C.H. Zierdt // Nonfermentative gram-negative rods. New York; Basel. - 1985. - V. 15. -P. 283-241.

Информация о работе

Шестаков, Андрей Геннадьевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Усовершенствование методов выделения, идентификации индикации бактерий Pseudomonas Aeruginosa - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы