Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Pseudomonas putida

Викторов, Денис Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Pseudomonas putida
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Pseudomonas putida"

На правах рукописи

48оВ1эи

Викторов Денис Александрович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РЗЕ1ЮОМОЫА8 РШ'ЮА

03.02.03 - микробиология 03.01.06- биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-з КОЯ 2011

Саратов-2011

4858450

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич

кандидат ветеринарных наук, доцент Богданов Ильгизар Исмаплович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна доктор биологических наук, профессор Грязнева Татьяна Николаевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, г. Москва

Защита диссертации состоится «17» ноября 2011 года в 14в0 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколова*, 335, диссертационный зал. п

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан « '/» октября 2011 г. и размещен на сайте Минобрнауки РФ и www.sgau.ni

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность 1емы. Pseudomonas pulida - часто встречающаяся бактерия, выделяемая как из внешней среды (вода, почва, растения), так и из патологического материала (Красидьников, 1974; Смирнов, 1990; Weyaiit el al., 1996).

В отечественной и зарубежной литературе имеются многочисленные сообщения, в которых освещаются отдельные биологические свойства P. putida (Сиво-лодскиий, 1990; Волкова, 2006; Blazevic, Koepke, Matsen, 1973; Harwood, Fosnaugh, Dispensa, 1989; Boopathi, Rao, 1999; Ribera, Monteoliva-Sanchez, Ramos-Cormenzana, 2001; Ward, de Roo, O'Connor, 2005; Bcrtani ct al., 2007).

Данный микроорганизм является возбудителем псевдомоноза у прудовых рыб, сопровождающегося массовой гибелью рыбы (Лобунцов и др., 1971; Муссе-лиус, 19S3; Грищенко, 1984; Вялова, Шкурина, 1995; Юнчис, 2005; Altinok, Kayis, Capfcin, 2006). В единичных случаях бактерии P. putida способны вызывать заболевания у теплокровных животных и человека: абсцессы, бактериемии, раневые инфекции, инфекции мочевыводящих путей, кольпит, приводящий к самопроизвольным выкидышам, абортам (Литвин, 1997; Blazevic, Koepke, Matsen, 1973; Anaissie et al., 1987; Perz et al., 2005).

Имеются сведения, что Р. putida вызывает порчу пищевых продуктов (Clive de W. Blackburn, 2008), Кроме того, ряд штаммов данной бактерии проявляет фи-топатогенные свойства (Пастушенко, Симонович, 1979; Burkholder, 1950). Другие штаммы, напротив, входят в состав биопрепаратов для стимуляции роста растений (Воронин, Кочетков, 2000; Lopez, Henkels, 1999).

Бактерии Р. pulida широко известны и лмеют важное научно-практическое значение благодаря своей способности окислять необычайно большое число различных органических соединений, являются объектом биотехнологических исследований при конструировании препаратов-деструкторов, в том числе со множественной деструктивной активностью (Волкова, 2006; Müller, 1992). Разработаны методы использования Р. pulida для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (Клюянсва, 2006; Kowalski, 2002).

Вышеперечисленное обуславливает научный и практический интерес к бактериям Р. putida. В значительной степени это связано с недостаточно разработан-

ными методами индикации и идентификации данного микроорганизма при выделении из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов (Сиво-лодский, 1988; Васильев, Золотухин, Никишина, 1998).

С середины прошлого столетия бактериофаги широко используются для диагностики различных бактериальных инфекций (Гольдфарб, 1961). Вместе с тем, использование реакции нарастания титра фага, как быстрого и точного метода индикации бактерий, для Р. putída ранее не изучалось.

Цель работы - усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Р. putída из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

Задачи работы:

1. Разработать среду накопления и селективную среду для выделения штаммов Р. pulida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, подобрать бактериологические тесты для идентификации этих бактерий.

2. Разработать схему бактериологической идентификации и дифференциации Р. putída из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на основе разработанных сред и подобранных тестов

3. Изучить основные биологические свойства штаммов Р. pulida, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

4. Выделить бактериофаги бактерий Р. pulida к изучить их основные биологические свойства: морфологию негативных колоний, литическую активность, установить спектр литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость и устойчивость к хлороформу.

5. По критериям литической активности, спектру лизируемых культур и специфичности, отобрать наиболее оптимальный бактериофаг для конструирования биопрепарата.

6. На основе отобранного бактериофага создать биопрепарат для индикации и идентификации Р. pulida и разработать технологию его изготовления.

7. Оптимизировать схему индикации бактерий Р. pulida в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА методом реакции нарастания титра фаг а.

Научная иовшна. Впервые для выделения, идентификации и оценки распространения бактерий Р. pulida была предложена и использована бактериологическая схема, основанная на применении оригинальных специфических сред: среды накопления Psp-А-УГСХА с сукцинатом натрия и минеральными солями, селективной среды Psp-S-УГСХА с глюкозой, бромтимоловым синим и фурадони-ном, а так же подобранной системы тестов, позволяющая за 96 часов провести дифференциацию бактерий Р. putida от сопутствующей микрофлоры. Применение данной схемы позволило выделить и изучить 33 штамма Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, что внесло существенный вклад в понимание биологических особенностей этих псевдомонад.

Выделены и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги Р. putida. Впервые для целей идентификации бактерий указанного вида разработан биопрепарат на основе отобранного наиболее оптимального для данных целей бактериофага PsplO-УГСХА.

Впервые разработана и апробирована на объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов схема реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Р. pulida с использованием биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА, позволяющая проводить индикацию бактерий Р. pulida за 24 часа. Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА для индикации и идентификации бактерий Р. pulida.

Практическая значимость работы. Предложена схема по выделению, бактериологической идентификации и дифференциации, позволяющая выделять и идентифицировать штаммы Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструированная среда накопления Psp-А-УГСХА, селективная среда Psp-S-УГСХА и подобранная система биохимических тестов позволяют выделять и типировать бактерии Р. putida до вида за 96 часов. Сконструирован биопрепарат на основе бактериофага PsplO-УГСХА и разработана схема индикации бактерий Р. putida методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 24 часов.

Результаты усовершенствования бактериологической схемы выделения и идентификации Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых

продуктов, изучения биологических свойств бактериофага PsplO-УГСХА, а также возможность использования биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА в схеме реакции нарастания титра фага, подтверждены актам« комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА от 11 апреля 2011 г.

По материалам диссертационной работы предложены и утверждены ректором УГСХА (29 апреля 2011 г.) «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий Pseudomonas pntida методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора», «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофага PsplO-УГСХА», а также «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Pseudomonas pntida в объектах санитарного надзора». Методические рекомендации предназначены для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная' среда накопления Psp-А-УГСХА обеспечивает преимущественный рост и размножение бактерий Р. pntida. Сконструированная плотная селективная среда Psp-S-УГСХА является специфичной по отношению к бактериям Р. pntida и угнетает рост возможных ассоциантов.

2. Разработанная схема бактериологической дифференциации, включающая сконструированные среды: среду накопления Psp-А-УГСХА и плотную селективную среду Psp-S-УГСХА, а также систему бактериологических тестов, позволяет идентифицировать Р. putida за 96 часов.

3. Из 14 выделенных и изученных по биологическим свойствам штаммов бактериофагов бактерий Р. pntida отобрал один бактериофаг PsplO-УГСХА, который может быть использован для целей идентификация и индикации Р. pntida в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

4. Разработан биопрепарат на основе бактериофага PsplO-УГСХА для индикации бактерий Р. pulida и биотехнологические параметры по его изготовлению.

5. Усовершенствованная схема индикации P. putida методом РНФ с применением биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА позволяет ткпировать Р. ¡nítida за 24 часа.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».

Апробация работы:

Материалы диссертационной работы были представлены на: Международной научно-практической конференции Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008, 2009, 2011), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), Ш-й Международной научно-практической конференции молодых учёных «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), Между народной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Покров, 20) i).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, состоящих из объекта, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников, приложений. Материалы диссертации изложены на 155 страницах, включают 42 таблицы и 21 рисунок. Список использованных литературных источников включает 239 наименований, в том числе 127 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследовании Штаммы: Объектом исследования явились 2 реферепс-штамма бактерии P. putida №901IV-89; АТСС 12633 IV-87, полученные из музея ГИСК им. JI.А. Та-расевича, а также 33 «полевых» штамма, выделенные из объектов окружающей среды. Для определения специфичности сконструированных сред, а также изучения специфичности бактериофагов использовали 3 референс-штамма бактерии P. aeruginosa №128, №381, №1677, референс-штамм бактерии P. fluorescein 13525 IV-96,14 штаммов бактерий других родов: Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcic spp., Bacillus cereus, E. coli, Enterobacter cloacae, Cilrobacler freundii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Stenotrophomonas maliophila, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ при ФГБОУ ВПО Ульяновской ГСХА. Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами.

Питательные среды и реактивы: МПА (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), МШ (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда АГВ для определения антибиоти-кочуЕствительности, диски с антибиотиками (НИЦФ Санкт-Петербург), среда Симмонса (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), хлорид бария, хлорид натрия, ацетамид, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, магния сульфат, нитрат калия, пептон сухой ферментативный, глюкоза, сукцинат натрия, M-N-диметил-пара-фенилендиамин, перекись водорода, индикатор феноловый красный, индикатор бромтимоловый синий, фура-донин, цетримид, агар-агар, желатин, трихлорметан, набор для окраски по Граму.

Методы: Выделение, идентификацию и индикацию бактерий проводили по общепринятым микробиологическим методам (Васильев, Золотухин, Никишина, 1998; Лабинская, 2004). Морфологические, культуральные, биохимические свойства бактерий P. putida определяли по методам Д. А. Васильева (1998). Оксидазный тест проводили с применением 1% р-ра N-N-диметил-пара-фенилендиамкна. Ка-талазную активность проводили с применением 3% р-ра перекиси водорода (Ско-

роду мои и др., 2005). Приготовление и стерилизацию питательных сред, окраску мазков проводили согласно ГОСТ Р 51446-99. Приготовление суспензий и разведений проводили по ГОСТ Р 51426-99. Посевы на питательные среды осуществляли согласно ГОСТ Р 26670-91. Отбор и подготовку лабораторных проб проводили по ГОСТ 26668-85, ГОСТ 26669-85, ГОСТ Р 51419-99. Контроль разработанных питательных сред проводили согласно МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».

Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили гю методам Д.М. Гольдфарба (1961), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловича (1973), С.Н. Золотухина (2007). Литическую активность фагов определяли по Аппельману и Гра-циа (Гольдфарб, 1961). Реакцию нарастания титра фага для индикации P. putida в объектах внешней среды проводили по методам В.Д. Тимакова и ДМ. Гольдфарба (1962), а также В.Я. Ганюшкина (1984). Конструирование биопрепарата проводили по методу С.Н. Золотухина (2007).

Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартным методикам (Бейли, 1970; Ашмарнн, Воробьев, 1987). Обработку результатов осуществляли с помощью программы SPSS statistics 17.0,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биологические свойства и антибиотикочувствителыюсть референс-штаммов P. putida

Исследованы тинкториаяьные и культуральные свойства 2-х референс-штаммов P. putida для определения стабильности свойств и их обоснованного использования при составлении бактериологической схемы выделения и идентификации P. putida в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах. Оба референс-штамма P. putida были представлены .мелкими грамотрицательными палочками, подвижными благодаря наличию полярного лучка жгутиков. На стандартных средах референс-штаммы P. putida образовывали колонии мелкие (1-2 мм) и средние (2-4 мм), правильной округлой формы, с ровным краем, рельеф куполообразный, поверхность гладкая, влажная, блестящая, цвет молочно-мутный или желтоватый, прозрачны в проходящем свете, структура однородная, консистенция пастообразная.

Исследование биохимических свойств референс-штаммов Р. pulida позволило сделать заключение, что окисление глюкозы является характерным признаком, который можно использовать для дифференциации Р. putida от бактерий, защела-чиваюших глюкозу. Оксидазный и каталазный тесты были также положительны у обоих референс-штаммов Р. putida. Установлено, что эти штаммы имеют ферменты аргининдегидролазу и способны утилизировать цитрат натрия и ацетат натрия. Отсутствие желатиназной активности оказалось также характерным видовым признаком изученных референс-штаммов Р. putida. Все полученные нами результаты исследования биохимических свойств реферсис-штаммов Р. putida согласуются с литературными данными (Weyant et al., 1996).

Определили антибкотикочувствительность этих штаммов Р. pulida к гента-мицину, амикацину, ампициллину, цефазолину, эритромицину, доксициклину, де-вомицитину, тетрациклину, фурадонину и фурагину. Отмечена устойчивость Р. putida к нитрофурановым препаратам, что согласуется с данными литературы (Смирнов, Киприанова, 1990).

Было установлено, что температурный оптимум культивирования изученных референс-штаммов Р. putida составляет 28 °С, Также было установлено, что у исследуемых штаммов отсутствует способность к росту при 41 °С за 120 часов, но наблюдается рост при 4 °С после 96 часов культивирования.

Исследование биохимических свойств референс-штаммов Р. putida и определение их антибиотикочувствительности позволили нам использовать полученные данные при подборе тестов бактериологической идентификации Р. putida в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

Конструирование накопительной среды для Р. putida

Известно, что псевдомонады достаточно неприхотливы и способны расти на простых питательных средах. Однако, при выделении Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов возникают сложности, связанные с ростом сопутствующей микрофлоры, оказывающей антагонистическое воздействие на Р. putida. Поэтому представлялось актуальным конструирование на-

копительной среды, позволяющей обеспечить преимущественный рост бактерий Р. pulida, подавляя развитие сопутствующих микроорганизмов.

Подбор компонентов среды накопления осуществлялся на основании анализа данных литературы. В качестве источника углерода был выбран сукцинат натрия (Покровский, 2002: Weyant, 1996). Источником азота являлся нитрат калия. Калий фосфорнокислый одно- и двузамещёиный создают буферную систему в среде, магний сернокислый и кальций хлористый обеспечивают нормальное осмотическое давление среды и необходимы для обеспечения биохимических процессов в клетках Р. pulida. Концентрации компонентов подбирали экспериментально. В результате проведенных исследований остановились на следующей прописи: сукцинат натрия - 4,0 г, нитрат калия - 0,5 г, фосфат калия двузамещёиный - 0,5 г, фосфат калия одноззмещённый - 0,1 г, сульфат магния - 0,2 г, хлорид кальция -0,1 г, вода дистиллированная - 1000 мл. рН готовой среды накопления Psp-A-УГСХА-7,1.

Все компоненты среды накопления Psp-А-УГСХА смешивали и кипятили 12 минуты до полного растворения компонентов, фильтровали через бумажный фильтр и автоклавировали при 1,1 атм. в течение 15 минут.

Для контроля качества среды накопления мы засевали 0,1 мл со 100 м.к. индикаторного штамма Р. pulida АТСС 12633 в колбы со 100 мл среды Psp-А-УГСХА и в контрольные колбы с таким же объёмом МПБ. Для контроля посевной дозы делали высев на чашки Петри с МПА. Через 6 ч термостатирозания при температуре 28 "С проводили посев бактериологической петлёй из опытных и контрольных колб на чашки Петри с МПА. После культивирования в течение 18 ч при 28 °С наблюдали рост типичных по морфологии колоний Р. putida в количестве от 15 до 25. Аналогичные результаты были получены в контрольных вариантах с МПБ, что свидетельствовало о высокой чувствительности среды Psp-А-УГСХА.

При росте Р. putida на среде Psp-А-УГСХА было замечено слабое помутнение молочного или желтоватого цвета в верхнем слое среды толщиной 2-3 см. Желтоватый цвет планктонная биомасса бактерий приобретала вследствие образования пигмента пиовердина клетками Р. pulida. Данный пигмент проявляет флуо-

ресцентные свойства. Таким образом, была сконструирована и зарегистрирована среда накопления Psp-А-УГСХА для выделения Р. pulida.

Конструирование плотной селективной среды для Р. pulida

При конструировании селективной среды было решено использовать специфичное свойство бактерий рода Pseudomonas окислять глюкозу до глюконовой кислоты в аэробных условиях. Для индикации снижения pH среды вследствие образования кислоты было решено применить индикатор бромтимоловый синий в концентрации 0,03 г/л. Концентрацию остальных компонентов среды подбирали экспериментально. В качестве ингибитора посторонней микрофлоры в селективной среде, на основании антибиотикочувстаительности, был выбран фурадошш в концентрации 200 мг/л.

Состав плотной селективной среды: D-глюкоза - 10,0 г, пептон - 2,0 г, фу-радонин - 200,0 мг, калий фосфорнокислый двузамешённый - 0,05 г, магний сернокислый - 0,1 г, бромтимоловый синий - 0,03 г, агар-агар - 15,0 г, вода дистиллированная- 1000 мл. Способ приготовления: все компоненты кроме D-глюкозы и фурадонина смешивали и автоклавировали при 1,1 атм. в течение 15 минут. Затем в остывшую до 50 °С основу среды вносили D-глюкозу и фурадоннн в указанных выше концентрациях, pH среды доводили до 7,1-7,2. Готовая среда была травянисто-зеленого цвета. Бактерии штамма Р. pulida АТСС 12633 образовывали на этой среде круглые, гладкие, ярко-оранжевого цвета колонии. Цвет среды вокруг колоний менялся с травянисто-зеленого на жёлтый за счёт снижения pH при окислении глюкозы.

Специфичность селективной среды определяли сравнительным высевом чистых суточных культур бактерий Р. pulida, Р. aeruginosa. P. fluorescens, A. hydrophila, Р. mirahilis, М. niorganii, К. pneumoniae, Salmonella spp., S aureus, Streptococcus spp., B. cereus, E. coli, E. cloacae, С. freimdfí, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, S. maltophila ка поверхность среды в чашках Петри. Культивировали посевы при 37 °С в течение 96 часов; посевы Р. pulida и Р. fluorescens - при 28 °С в течение 96 часов. Контролем жизнеспособности являлся посев указанных бактериальных культур на МПА и культивирование при аналогичных условиях.

Отмечено, что на сконструированной селективной среде росли Р. pulida, Р. i/eruginosa, Р. Jlnorescens.

Данная среда была использована как среда второго порядка в схеме выделения и идентификации Р. pulida, а так же в качестве теста на способность бактерий к окислению глюкозы в аэробных условиях, и зарегистрирована как селективная среда Psp-S-УГСХА.

Подбор тестов бактериологической дифференциации Р. pulida

Для целей бактериологической дифференциации Р. pulida были предложены следующие тесты, необходимость которых была обоснована результатами наших исследований: тест на оксидазу, каталазу, желатиназу, окисление глюкозы в аэробных условиях, чувствительность к хлориду бария, окраска бактериальных клеток по Граму, подвижность бактериальных клеток, утилизация ацетамида, реакция «стекающая капля» с бактериофагом PsplO-УГСХА. В качестве дополнительных исследований предложены тесты на способность к росту при 4 °С и при 41 °С.

Тест на способность к окислению глюкозы проводили на разработанной нами селективной среде Psp-S-УГСХА. Результат данного теста считали положительным при изменении цвета среды с травянисто-зеленого на жёлтый.

Для теста на способность бактерий к росту в присутствии хлорида бария, в МПА добавляли указанную соль из расчета 2 г/л. Среду стерилизовали в автоклаве при 1,1 атм. в течение 15 минут. Суточную бульонную культуру Р. pulida штрихом засевали на поверхность скошенного агара и помещали в термостат на 24 ч при температуре 28 °С. Через указанное время проводили учет результатов. Рост инги-бнровался у всех исследуемых штаммов Р. pulida.

Поскольку температура культивирования может являться критерием дифференциации различных видоз псевдомонад (Weyant, 1996), при получении сомнительных результатов вышеперечисленных тестов нами рекомендовано исследовать способность бактерий к росту при температурах 4 "С и 41 "С.

Разработка бактериологической схемы выделения и идентификации Р. pulida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов

При разработке бактериологической схемы выделения и идентификации бактерий Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов нами были учтены следующие свойства Р. pulida-, наличие оксидззы, ката-лазы, отсутствие желатиназной активности, способность к окислению глюкозы в аэробных условиях, ингибирование роста Р. pulida хлоридом бария, наличие мелких грамотрицательных палочек в мазках при окраске по Граму, наличие подвижности, отсутствие способности к утилизации ацетамида, наличие дорожки лизиса в реакции «стекающая капля» с бактериофагом PsplO-УГСХА, способность к росту при 4 °С и отсутствие роста при 41 °С.

Разработанная схема выделения и идентификации бактерий Р. pulida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов представлена на рисунке 1.

Предложенная схема выделения и идентификации Р. pulida позволяет выделять и идентифицировать бактерии до вида, исключая возможных ассоциантов. за 96 часов.

С использованием усовершенствованной схемы выделения и идентификации Р. putida из сточных вод города Ульяновска, образцов воды и почвы Ульяновской области, мяса с рынков города Ульяновска без органолентических признаков порчи, мяса рыбы нами было выделено 33 штамма, биологические особенности которых представлены в таблице.

Характеристика выделенных фагов Р. pulida

Следующим этапом наших исследований стало выделение бактериофагов Р. putida из объектов внешней среды. Материалом для выделения являлись сточные воды. Всего исследовано 76 проб, из которых выделено 14 культур бактериофагов.

Морфологию негативных колоний бактериофагов изучали методом агаровых слоев по Грациа. Выделенные бактериофаги имели различные типы негатив-

ных колоний: диаметр от 0,5 до 5,0 мм, с мутным и прозрачным центром, с зоной вторичного лизиса и без неё.

Дальнейшим этапом изучения биологических свойств выделенных бактериофагов было определение их литической активности. Изучили литическую активность 14 выделенных бактериофагов Р. ргШс/а методами, предложенными Ап-пельманом и Грациа (Гольдфарб, 1961). Определили количество фаговых корпускул в 1 мл, для каждого выделенного бактериофага. По результатам полученных данных нами было решено в дальнейших исследованиях использовать наиболее активные из всех выделенных нами бактериофагов РэрЬУГСХА, Рзр4Ь-УГСХА, РэрЮ-УГСХА и Рзр17-УГСХА характеризующиеся максимальным количеством активных корпускул фага в 1 мл.

исспеауемый иа'ериап

Среда накопиений с суицинатои иагрий Psp-ft-YfCXA

:«"с. и ч

Олёктианай среда й МЯКОЗОЙ. брснтииопсеы» ИНИН II фурадОНИИОИ Psp-S-VTCXA Ч 2Й'С, 24 Ч Ч Ч

/ , \ ч

окраска по Греку н ынкро-

с*епкя твст ка гест на

способность*росту утилизации

в приоутстаии 0.2% аце;амида

хпорида барик !il¡ 2S'C У.е ч

теот ка жспапшззу 28*С.46 «

м т гв-с з ч

'рост при 4*С "рост пвх 4ГС

Реакция "сгег.ва<цз« капая" при нанесения биопрепарата бактериофаге PspiO-УГСХА 28'С. 12N

Рис. 1. Схема выделения и идентификации Р. риМа Примечание: * - дополнительные гесты, проводятся в случае сомнительных результатов.

Таблица - Биологические свойства референс-штаммов и выделенных нами

полевых штаммов Р. риМа

№ п!ч штаммы Р. ршШа Ферментативная активность Окисление углеводов

8 § я о га 8 I 1 Я сз Я Н; и .4 5 а. 0 С Л, о О, Л го и О- сероводород 1 цитрат натрия К р- «я X ь 1 и 1 31 с. (га о. н я У. § о л Г7 О 5 1 1 ы I! сахароза

1 АТСС 12633 + ■г - - - 4 - - - + + - 4 - - - -

2 №901 4 4 - - + - - + + - + - - - •

3 003 + + - - - + - - - 4 + - + - - - -

4 ОПЫп + + - - + - - + + - 4 + - -

5 013Ьт + + - - + - + - + + т • 4 - •

6 013Ы + - - - + - - - + + - + - - 4 -

7 014аП + + - - - 4 - - - + -г - 4 - - - -

8 014зП 4 + - - + - - 4 + - 4 - - - -

9 014аП + + - - + - - - 4- + - 4 - - - -

10 014аП 4 ~г 4 - - - + 4 - + 4 - -

И 015аП + ч- + - + - 4 4- - + - - - -

12 015аП + + - - - + - - - + + - 4 - + - -

13 015ап + - - + - - - 4 4 - т + - - -

14 015аП + + - - + - - + + - 4 - - 4 -

15 017а« + + - + - - + 4 - 4 - - + -

16 017ай + + - + - - - + + - 4 - + • -

17 017аП + + - - - + - + - + + - 4 4 4 -

18 017аП + + - - - + - - - + + - 4 - - - -

19 017аП + + - - - + - - - + + - 4 - 4 - -

20 017аП 4 + - + - - - 4 + - г 4 - - -

21 017ап + + - - + - - - + -Ь 4 + - -

22 017аП 4 4 - 4 - - 4 + - 4 - - - -

23 017а» + -г - - + - - - + 4 - + - - - -

24 017аП 4 4 - 4- - - - 4 4 - + - - -

25 017аЛ + + - - + - - - + 4 - + - 4 + -

26 ОПаП 4 + - - + - - - ■г + - 4 - - - -

27 026Ыр + + - - - -г - - - + + - + + -

28 026Ьгр + + - - + - + - 4 4 - 4 - - - -

29 026Ьгр + + - - - 4 - - - + + - 4 - 4 - -

30 026Ьгр + + - + - - 4 4 - 4 - - - -

31 02бЬгр + + - - - + - - - 4 - 4 -г + 4 -

32 026Ъгр + + + + - 4 - - - -

33 026Ьгр + + - - + + - + + - + - + + -

34 026Ьгр + + - - + - - 4 + - + - - - -

35 02бЬгр т + - - - + - - - + + - + - - - -

Титр селекционированных бактериофагов Pspi-УГСХА, Р5р4Ь-УГСХА, PsplO-УГСХА и Pspl7-yrCXA по Грацка: 2x10'°, 2хЮ10, 4xlOw, 6x109 соответственно, фаговых корпускул в 1 мл. Титр бактериофагов Pspl-УГСХА, Psp4b-УГСХА, PsplO-УГСХА и Р;р17-УГСХА по Аппельману: Ю-9, 10"ш, Ю-9, 10"', соответственно.

Установили, что наиболее широким спектром литической активности по отношению к исследуемым культурам обладал штамм фага PsplO-УГСХА, который лизировал 30 из 35 штаммов Р. putida (85,7%). Фаги Pspl-УГСХА и Pspl7-yrCXA визировали 28 из имеющихся у нас 35 штаммов Р. pulida (80%). Фаг Psp4b-УГСХА лизировал 25 из 35 штаммов Р. pulida (71,4%) Поэтому фаг Pspi 0-УГСХА был выбран для конструирования биопрепарата для индикации и идентификации бактерий Р. putida.

Результаты определения специфичности всех выделенных бактериофагов, в том числе PsplO-УГСХА, показали, что они строго специфичны по отношению к Р. putida и не лизировали бактерии других видов и родов.

Бактериофаг PsplO-УГСХА проявил выраженную устойчивость к воздействию обработки хлороформом в соотношении 1:10 в течение 40 минут.

Также изучили устойчивость бактериофага PsplO-УГСХА к температуре. Выяснено, что бактериофаг PsplO-УГСХА инактивировался при температуре выше 66 "С в течение 30 минуг.

Разработка технологических параметров изготовления и контроля биопрепарата для идентификации Р. putida

Нами была проведена серия исследований по определению оптимальных технологических параметров изготовления и контроля биопрепарата для идентификации Р. pulida.

Технологические параметры изготовления биопрепарата- оптимальная температура культивирования фага PsplO-УГСХА - 28 "С, - оптимальное соотношение бактериофага PsplO-УГСХА и бактериальной культуры - 1:2, т.е. 0,2 мл фага х 0,4 мл индикаторной культуры,

- оптимальное время взаимодействия бактериофага PsplO-УГСХА с бактериальной суспензией индикаторной культуры Р. pulida при температуре 28 °С составляет 8 часов,

- обработка фаголизата хлороформом в соотношении 1:10 в течение 20 минут,

- хранение биопрепарата в условиях холодильника при температуре 4-6 °С в герметичных флаконах до 1 года без снижения активности (сроки наблюдения).

При контроле биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА на литическую активность учитывали следующие параметры: титр бактериофага Psp 10-УТ СХА составляет не менее Ю"10по Аппельмапу и не менее 4хЮ10 по Грациа.

Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания

титра фага с применением биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА

При исследовании оптимальных условий постановки РНФ с применением биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА для индикации бактерий Р. pulida, мы установили количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение и оптимальное время РНФ. По результатам проведенных опытов было установлено, что количество фаговых частиц в опытных пробирках более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах, при контаминации МГ1Б клетками Р. putida в концентрации 103 м.к/мл.

Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что наиболее оптимальным является временной режим РНФ при 7 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом с предварительным подращиванием исследуемого материала в течение 5 часов при температуре 28 °С. Такой режим позволяет провести индикацию бактерий Р. putida в количестве 10? м.к./мл, в течение 24 часов. Схема постановки РНФ с применением биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА для индикации бактерий Р. putida представлена на рисунке 2.

Таким образом, на основе детального изучения биологических свойств различных штаммов Р. putida, была разработана, обоснована и апробирована схема выделения и идентификации Р. pulida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов; создан биопрепарат на основе отобранного бактериофага PsplO-УГСХА, позволяющий в короткие сроки проводить индикацию Р. putida в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

Исследуемый . материал после предварительного подращивания 5 ч. г.ри 2В'С

1 Г

9,0 мл 9,0 мл

п^парат бактериофага

1,0 мл 1,0 ип

¡ЩЦиЯ-МЛ-РЛА АЛ1М~ 7 ч при нем р Ч 0,25 мл | 0,25 мл} 0,25 мп 1

1,0 мл

]

] (

|~1 4,5 »л М мпв

Обработка хлороформ о» 1:10. 2 0 иин упг

} 1 Л ип' 1 П «г

4,5 МЛ МП5

2,5 ип 0.7% МПА +0.2 ЦП индикаторной культуры

№1

2.5 ил 0.7% МПА -0.2 ил ицдим-орной культуры

4,5 ил МПБ

2,5 ип 0,7*4 МПА -0,2 мл индикаторной купь,туры

1,5% МПА 1,5« МПА 1,5% МПА

Игяштриш! 12 ч. пои »»»т у ре !3 'С

Рис. 2. Схема постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Р. ршШ

Примечание: реакция считается положительной, если количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №! превышает количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №3 в 5 и более раз.

20 Вывозы

1. Сконструированы среды - накопительная среда Psp-А-УГСХА с сукцинатом натрия и минеральными солями и селективная среда Psp-S-УГСХА с глюкозой, бромтимоловым синим и фурадонином, обладающие высокой специфичностью и позволяющие выделять штаммы Р. pu/kla.

2. Усовершенствована бактериологическая схема выделения и идентификации Р. putida, основанная на сконструированных средах и подобранных тестах, включающих тесты на оксидазу, каталазу, желатиназу, чувствительность к хлориду бария, подвижность, утилизацию ацетамида, окисление глюкозы в аэробных условиях, окраску по Граму, реакцию «стекающая капля» с бактериофагом PsplO-УГСХА, способность к росту при 4 "С и при 41 °С. С использованием разработанной схемы из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов выделено и идентифицировано 33 «полевых» штамма Р. pulida.

3. Выделены и изучены по биологическим свойствам 14 культур бактериофагов бактерий Р. pulida, литическая активность которых варьировала от 10"7 до Ю'10 по методу Аппельмана и от бхЮ7 до 4хЮ10 по .методу Грациа, а спектр литической активности составил от 71,4 до 85,7%. Выделенные бактериофаги строго специфичны по отношению к Р. pulida и не лизирутот бактерии других видов и родов; проявляют устойчивость к хлороформу в течение 40 минут и инактивируются при температуре 66 °С в течение 30 минут.

4. Отобран бактериофаг PsplO-УГСХА, имеющий оптимальные для конструирования биопрепарата свойства: спектр литической активности 85,7%; титр 10"'° по методу Аппельмана и 4x10'" по методу Грациа.

5. Разработаны параметры постановки реакции нарастания титра фага с использованием биопрепарата на основе бактериофага PsplO-УГСХА для ускоренной индикации бактерий Р. pulida, позволяющие обнаружить в исследуемом материале указанные бактерии в концентрации от 10' м.к. в 1 г (1 мл) в течение 24 часов.

6. Установлены оптимальные технологические показатели для изготовления специфического биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА: соотношение

количества фаголщата к количеству взвести бактериальных клеток индикаторного штамма Р. puticki - 1:2, оптимальное время инкубирования при температуре 28 "С - 8 часов, обработка фаголизата хлороформом, в соотношении 1:10 в течение 20 минут, хранение биопрепарата в условиях холодильника при температуре 4-6 "С в герметичных флаконах до 1 года без снижения активности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Викторов Д.А. Использование экологической пластичности бактерий рода Pseudomonas в научно-хозяйственной практике / Д.А. Викторов, И.И. Богданов // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА. 20-22 мая 2008. - Ульяновск, 2008. - Т. 4. - С. 108-110.

2. Викторов Д.А. Обоснование причин изучения бактерий Pseudomonas putida / Д.А. Викторов. И.И. Богданов // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА. 20-22 мая 2008. - Ульяновск, 2008. - Т. 4.-С. 111-114.

3. Викторов Д.А. Разработка системы тестов для выделения и идентификации Pseudomonas putida / Д.А. Викторов, И.И. Богданов, А.Г. Шестаков, Д.А. Васильев // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: Материалы Международной наушо-практической конференции. 26-28 мая 2009. - Ульяновск, 2009. - Т. 4. - С. 21-25.

4. Викторов Д.А. Система тестов для диагностики псевдомоноза рыб, вызываемого бактерией Pseudomonas putida / Д.А. Викторов, И.И. Богданов, А.Г. Шестаков // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых учёных, ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬ-ХОЗАКАДЕМИИ. - Покров, 2009. - С. 136-140.

5. Викторов Д.А. Разработка методов лечения, профилактики и диагностики псевдомоноза аквариумных рыб с использованием биопрепарата на основе бакте-

риофагов / Д.А. Викторов, O.A. Тем // Ветеринарная медицина домашних животных: Сборник статей. - Казань, 2010. - Вып. 7. - С. 87-88.

6. Викторов Д.А. Разработка биопрепарата на основе бактериофагов бактерии Pseudomonas pulida для диагностики псевдомоноза рыб ! Д.А. Викторов, Д.А. Васильев // Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее: Всероссийский симпозиум с международным участием, Москва. МГУ имени М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 27-29 января 2011. -Москва, 2011.-С. 24.

7. Викторов Д.А. Выделение бактериофагов бактерии Pseudomonas pulida -возбудителя псевдомоноза рыб / Д.А, Васильев, Д.А. Викторов, С.Н. Золотухин, И.И. Богданов // Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской федерации: Материалы Международной научно-практической конференции. 16-17 марта 2011. - Покров, 2011. - С. 181 -184.

8. Викторов Д.А. Выделение бактериофагов бактерий Pseudomonas pulida и их селекция в целях создания, биопрепарата для диагностики псевдомоноза рыб / Д.А. Васильев, Д.А. Викторов, И.И. Богданов // Естественные и технические науки. - 2011. -№2(52). - С. 79-82.

9. Викторов Д.А. Выделение бактерий-нефтедеструкторов рода Pseudomonas / Д.А. Викторов, A.M. Артамонов, М.М. Сидорова, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: Материалы Международной научно-практической конференции. - Ульяновск, 2011.-Т. 3,-С. 72-75.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Викторов, Денис Александрович

Список условных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Развитие классификации бактерий рода Pseudomonas.

1.2. Характеристика семейства Pseudomonadaceae.

1.2.1. Род Pseudomonas.

1.2.2. Характеристика отдельных видов и групп бактерий рода Pseudomonas.

1.2.3. Морфологические, культуральные и физиолого-биохимические признаки псевдомонад.

1.3. Биологические свойства бактерии Pseudomonas putida.

1.3.1. Клеточная структура и метаболизм Pseudomonas putida.

1.3.2. Значение бактерии Pseudomonas putida и её применение в биотехнологии.

1.4. Псевдомонозы карповых рыб.

1.5. Микробиологические методы идентификации бактерий рода Pseudomonas.

1.5.1. Ход микробиологического исследования.

1.5.2. Питательные среды, применяемые для'выделения и идентификации псевдомонад.

1.6. Фагодиагностика бактерий.

1.6.1. Биологические свойства и особенности бактериофагов Pseudomonas putida.

1.6.2. Взаимодействие бактериофагов с клетками хозяина.

1.6.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект, материалы и методы.

212. Результаты собственных исследований и их обсуждение.

2.2.1. Тинкториальные свойства клеток Pseudomonas putida.

2.2.2. Рост референс-штаммов Pseudomonas putida на стандартных: средах.

2.2.3. Основные биохимические свойства референс-штаммов Pseudomonas putida.

2.2.4. Антибиотикочувствительность референс-штаммов Pseudomonas putida.

2.2.5. Исследование отношения референс-штаммов Pseudomonas putida к температуре культивирования.

2.2.6. Конструирование среды накопления Psp-А-УГСХА.

2.2.7. Конструирование плотной селективной среды Psp-S-УГСХА.

2.2.8. Подбор тестов бактериологической дифференциации.

2.2.8.1. Разработка теста на способность Pseudomonas putida к росту в присутствии солей двухвалентного бария.

2.2.8.2.ViecTa на способность Pseudomonas putida к разжижению желатина.

2.2.9. Разработка бактериологической схемы выделения и идентификации Pseudomonas putida.

2.2.10. Основные биохимические свойства выделенных штаммов Pseudomonas putida.

2.2.11. Выделение бактериофагов Pseudomonas putida.

2.2.12. Характеристика выделенных фагов Pseudomonas putida.

2.2.13. Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных бактериофагов Pseudomonas putida.

2.2.14. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага.

2.2.15. Использование РНФ для индикации бактерий Pseudomonas putida в объектах внешней среды.

2.2.15.1. Исследование с помощью РНФ прудовой воды, контаминированной бактериями Pseudomonas putida.

2.2.15.2. Исследование с помощью РНФ патологического материала рыб, контаминированного бактериями Pseudomonas putida.

2.2.15.3. Исследование с помощью РНФ овощей, контаминированных бактериями Pseudomonas putida.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Pseudomonas putida"

Актуальность темы

Pseudomonas putida — часто встречающаяся бактерия, выделяемая как из внешней среды (вода, почва, растения), так и из патологического материала (Красильников, 1974; Смирнов, 1990; Identification^:Unusual., 1996). ^

В отечественной и зарубежной литературе имеются многочисленные сообщения, в которых освещаются отдельные биологические свойства P. putida (Сиволодскиий, 1990; Волкова, 2006; Blazevic, Koepke, Matsen, 1973; Harwood, Fosnaugh, Dispensa, 1989; Boopathi, Rao, 1999; Ribera, Monteoliva-Sanchez, Ramos-Cormenzana, 2001; Ward, de Roo, O'Connor, 2005; Th^Pseudomonas С/" putida,., 2007).

Данный микроорганизм является возбудителем псевдомоноза у прудовых рыб, сопровождающегося массовой гибелью рыбы (^Септический псевдомо- V ноз., 1971; Мусселиус, 1983; Грищенко, 1984; Вялова, Шкурина, 1995; Юн-чис, 2005; Altinok, Kayis, Capkin, 2006). В единичных случаях бактерии P. putida способны вызывать заболевания у теплокровных животных и человека: абсцессы, бактериемии, раневые инфекции, инфекции мочевыводящих путей, кольпит, приводящий к самопроизвольным выкидышам, абортам (Литвин, 1997; Blazevic, Koepke, Matsen, 1973; Pseudomonas putida newly., 1987; t^" Pseudomonas putida Septicemia., 2005). V

Имеются сведения, что P. putida вызывает порчу пищевых продуктов (Clive de W. Blackburn, 2008). Кроме того, ряд штаммов данной бактерии проявляет фитопатогенные свойства (Пастушенко, Симонович, 1979; Burkholder, 1950). Другие штаммы, напротив, входят в состав биопрепаратов для стимуляции роста растений (Воронин, Кочетков, 2000; Lopez, Henkels, 1999).

Бактерии Р. putida широко известны и имеют важное научно-практическое значение благодаря своей способности окислять необычайно большое число различных органических соединений, являются объектом биотехнологических исследований при конструировании препаратов-деструкторов, в том числе со множественной деструктивной активностью (Волкова, 2006; Muller, 1992). Разработаны методы использования Р. putida для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (Клюянова, 2006; Kowalski, 2002).

Вышеперечисленное обуславливает научный и практический интерес к бактериям Р. putida. В значительной степени это связано с недостаточно разработанными методами индикации и идентификации данного микроорганизма при выделении из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов (Сиволодский, 1988; Васильев, Золотухин, Никишина, 1998).

Цель исследования

Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

Задачи исследования

1. Разработать среду накопления и селективную среду для выделения 'штаммов Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, подобрать бактериологические тесты для идентификации этих бактерий.

2. Разработать схему бактериологической идентификации и дифференциации Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на основе разработанных сред и подобранных тестов.

3. Изучить основные биологические свойства штаммов Р. putida, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

4. Выделить бактериофаги бактерий Р. putida и изучить их основные биологические свойства: морфологию негативных колоний, литическую активность, установить спектр литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость и устойчивость к хлороформу.

6. На основе отобранного бактериофага создать биопрепарат для индикации и идентификации Р. ри^а и разработать технологию его изготовления.

7. Оптимизировать схему индикации бактерий Р. риНс1а в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью биопрепарата бактериофага РэрЮ-УГСХА методом реакции нарастания титра фага.

Научная новизна

Впервые для выделения, идентификации и оценки распространения бактерий Р. риМа была предложена и использована бактериологическая схема, основанная на применении оригинальных специфических сред: среды накопления Рэр-А-УГСХА с сукцинатом натрия и минеральными солями, селективной среды Рэр-З-УГСХА с глюкозой, бромтимоловым синим и фурадонином, а так же подобранной системы тестов, позволяющая за 96 часов провести дифференциацию бактерий Р. риМа от сопутствующей микрофлоры. Применение данной схемы позволило выделить и изучить 33 штамма Р. риШа из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, что внесло существенный вклад в понимание биологических особенностей этих псевдомонад.

Выделены и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги Р. риййа. Впервые для целей идентификации бактерий указанного вида разработан биопрепарат на основе отобранного наиболее оптимального для данных целей бактериофага РзрЮ-УГСХА.

Впервые разработана и апробирована на объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов схема реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Р. риМа с использованием биопрепарата бактериофага РБрЮ-УГСХА, позволяющая проводить индикацию бактерий Р. риИйа за 24 часа. Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА для индикации и идентификации бактерий Р. putida.

Практическая значимость

Предложена схема по выделению, бактериологической идентификации и дифференциации, позволяющая выделять и идентифицировать штаммы Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструированная среда накопления Psp-А-УГСХА, селективная среда Psp-S-УГСХА и подобранная система биохимических тестов позволяют выделять и типировать бактерии Р. putida до вида за 96 часов. Сконструирован биопрепарат на основе бактериофага PsplO-УГСХА и разработана схема индикации бактерий Р. putida методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 24 часов.

Результаты усовершенствования бактериологической схемы выделения и идентификации Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, изучения биологических свойств бактериофага PsplO-УГСХА, а также возможность использования биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА в схеме реакции нарастания титра фага, подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА от 11 апреля 2011 г.

По материалам диссертационной работы предложены и утверждены ректором УГСХА (29 апреля 2011 г.) «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий Pseudomonas putida методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора», «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофага PsplO-УГСХА», а также «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Pseudomonas putida в объектах санитарного надзора». Методические рекомендации предназначены для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитариой экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения выносимые на защиту

1. Разработанная среда накопления Рзр-А-УГСХА обеспечивает преимущественный рост и размножение бактерий Р. ргиШа. Сконструированная плотная селективная среда: Рзр-8-УГСХА является специфичной по отношению к бактериям Р. рМгс1а и угнетает рост возможных ассоциантов. 2'. Разработанная схема бактериологической дифференциации, включающая; сконструированные среды: среду накопления Рзр-А-УГСХА и плотную, селективную среду Рзр-8-УГСХЛ, а также систему бактериологических тестов, позволяет идентифицировать Р. риМс!а за 96 часов.

3. Из 14 выделенных и изученных по биологическим свойствам штаммов бактериофагов бактерий Р. ры(Ша отобран один бактериофаг РярЮ-УГСХА, который может быть использован для целей идентификации и индикации Р:рий<1а в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.

4. Разработан биопрепарат на основе бактериофага Рэр 10-УГСХА для индикации бактерий Р. рМгс1а и биотехнологические[ параметры по его изготовлению; ' V- ' ' " '' Л ■ -'' '

5. Усовершенствованная схема индикации Р- ри^а методом РНФ с применением биопрепарата бактериофага РврЮ-УГСХА позволяет типировать Р. ргШфа за 24 часа. :•■.':.'

Апробация работы :

• ; Материалы диссертационной работы были представлены на: Международной научно-практической конференции Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008, 2009, 2011), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), Ш-й Международной научно-практической конференции молодых учёных «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск 2010), Всероссийском симпозиуме с. международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Покров, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Викторов, Денис Александрович

124 Выводы

2. Усовершенствована бактериологическая схема выделения и идентификации P. putida, основанная на сконструированных средах и подобранных тестах, включающих тесты на оксидазу, каталазу, желатиназу, чувствительность к хлориду бария, подвижность, утилизацию ацетамида, окисление глюкозы в аэробных условиях, окраску по Граму, реакцию «стекающая капля» с бактериофагом PsplO-УГСХА, способность к росту при 4 °С и при 41 °С. С использованием разработанной схемы из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов выделено и идентифицировано 33 «полевых» штамма P. putida.

3. Выделены и изучены по биологическим свойствам 14 культур бактериофау гов бактерий P. putida, литическая активность которых варьировала от 10 до Ю"10 по методу Аппельмана и от 6x107 до 4x1010 по методу Грациа, а спектр литической активности составил от 71,4 до 85,7%. Выделенные бактериофаги строго специфичны по отношению к P. putida и не лизируют бактерии других видов и родов; проявляют устойчивость к хлороформу в течение 40 минут и инактивируются при температуре 66 °С в течение 30 минут.

4. Отобран бактериофаг PsplO-УГСХА, имеющий оптимальные для конструирования биопрепарата свойства: спектр литической активности 85,7%; титр Ю"10 по методу Аппельмана и 4x1010 по методу Грациа.

5. Разработаны параметры постановки реакции нарастания титра фага с использованием биопрепарата на основе бактериофага PsplO-УГСХА для ускоренной индикации бактерий P. putida, позволяющие обнаружить в исследуемом материале указанные бактерии в концентрации от 103 м.к. в 1 г (1 мл) в течение 24 часов.

6. Установлены оптимальные технологические показатели для изготовления специфического биопрепарата бактериофага PsplO-УГСХА: соотношение количества фаголизата к количеству взвести бактериальных клеток индикаторного штамма Р. putida — 1:2, оптимальное время инкубирования при температуре 28 °С - 8 часов, обработка фаголизата хлороформом в соотношении 1:10 в течение 20 минут, хранение биопрепарата в условиях холодильника при температуре 4-6 °С в герметичных флаконах до 1 года без снижения активности.

Заключение

Бактерии P. putida вызывают заболевания у животных, что приводит к снижению экономического эффекта в животноводстве. В частности, псевдомо-нозы рыб наносят значительный ущерб рыбоводческим хозяйствам (Септический псевдомоноз., 1971; Мусселиус, 1983; Грищенко, 1984; Вялова, Шкури-на, 1995; Юнчис, 2005; Altinok, Kayis, Capkin, 2006). Имеются данные о способности P. putida вызывать заболевания у теплокровных животных, такие как абсцессы, бактериемии, раневые инфекции, инфекции мочевыводящих путей, кольпит, приводящий к самопроизвольным выкидышам, абортам (Литвин, 1997; Blazevic, Koepke, Matsen, 1973; Pseudomonas putida newly., 1987; Pseudomonas putida Septicemia., 2005). Ряд штаммов данной бактерии проявляет фитопатогенные свойства (Пастушенко, Симонович, 1979; Burkholder, 1950). Р. putida вызывает порчу пищевых продуктов (Clive de W. Blackburn, 2008).

Бактерии P. putida широко используются при конструировании препаратов-деструкторов, в том числе со множественной деструктивной активностью (Волкова, 2006; Muller, 1992). Существуют методы использования Р. putida для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (Клюянова, 2006; Kowalski, 2002).

Нерациональное применение антибиотиков в рыбоводческих хозяйствах при борьбе с псевдомонозами способствуют появлению штаммов Р. putida, обладающих резистентностью к широкому спектру антибиотиков (Trevors, 1991).

Таким образом, проблема идентификации P. putida во внешней среде, пищевом сырье и пищевых продуктах остаётся актуальной (Сиволодский, 1988; Васильев, Золотухин, Никишина, 1998).

При разработке накопительной среды Psp-А-УГСХА и селективной среды Psp-S-УГСХА, нами исследовалась возможность применения сукцината натрия как источника углеродного питания для P. putida, особенность данного вида бактерий окислять глюкозу в аэробных условиях и резистентность к антимикробному препарату фурадонину. Использование среды накопления Psp-A

УГСХА и селективной среды Psp-А-УГСХА даёт возможность визуализировать бактериальные колоний на плотной селективной среде, а так же повышает эффективность выделения и идентификации Р. putida.

Нами подобрана система тестов бактериологической идентификации Р. putida, учитывающая основные биохимические свойства данного вида бактерий, включая наличие у Р. putida оксидазы и каталазы, подвижность бактериальных клеток, ингибирование роста Р. putida солями бария и отсутствие фермента желатиназы.

Используя сконструированные среды и подобранные тесты, мы разработали схему с высокими показателями чувствительности и специфичности и позволяющую проводить выделение и идентификацию Р. putida до вида за 96 часов. Специфичность сконструированной схемы выделения и идентификации Р. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов проверена на 16 штаммах бактерий других видов и родов. С использованием разработанной нами схемы, из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов было выделено 33 штамма Р. putida.

Важное значение приобретает ускоренная индикация Р. putida для быстрого и точного обнаружения данных бактерий в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах. Вместе с тем, применение современных генетических и иммунологических методов для решения этих задач зачастую претерпевает трудности связанные с высокой стоимостью, либо сложностью выполнения исследований.

С середины прошлого столетия бактериофаги широко используются для диагностики различных бактериальных инфекций (Гольдфарб, 1961). О возможности применения бактериофагов с целью идентификации бактерий Р. putida сообщают некоторые исследователи (Выделение и анализ., 1981, 1989; Lee, Boezi, 1966; Chakrabarty, Niblack, Guansalus, 1967).

Для достижения поставленной цели из объектов внешней среды было выделено 14 культур бактериофагов бактерий Р. putida и изучены их основные биологические свойства: морфология негативных колоний, литическая активность, установлен спектр литической активности, специфичность действия, температурная устойчивость и устойчивость к хлороформу.

У выделенных бактериофагов наблюдалось пять типов негативных колоний:

1. Диаметр 1-2 мм, полностью прозрачны, без зоны вторичного лизиса,

2. Диаметр 0,5-1 мм с мутным центром, без зоны вторичного лизиса,

3. Диаметр 4-5 мм с наличием прозрачного центра и мутной зоной вторичного лизиса на периферии,

4. Диаметр 3-4 мм, полностью прозрачны, без зоны вторичного лизиса,

5. Диаметр 1-2 мм, с прозрачным центром и мутной периферией.

Литическая активность выделенных бактериофагов Р. риШа варьировала от 10"7 до 10"'° по методу Аппельмана и от 6x107 до 4x10ю по методу Грациа.

Далее отобрали бактериофаги РБр1-УГСХА, Рзр4Ь-УГСХА, Рэр 10-' УГСХА и рБр 17-У1 'СХА, обладающие наиболее высокой литической активностью и изучили спектр литической активности и специфичность действия. Пр°-веденные эксперименты показали, что все четыре отобранных фага являлись высокоспецифичными по отношению к штаммам Р. ршШа. Спектр литической : активности составил у бактериофага РБр4Ь-УГСХА - 71,4%, Рзр1-УГСХА и РврП-УГСХА - 80%, спектр литической активности бактериофага РБр 10" УГСХА - 85,7%. В настоящее время в России препараты бактериофагов выггус~ каются на производственных объединениях концерна «Микроген». Спектр литической активности коммерческих бактериофагов составляет 48,4%.

Таким образом в целях конструирования биопрепарата для индикации и идентификации Р. риШа, по критериям литической активности, спектру руемых культур и специфичности был отобран бактериофаг РБрЮ-УГСЗ^СА» имеющий оптимальные свойства.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Викторов, Денис Александрович, Саратов

1. Абдусаматов М.А. Сравнительное изучение реакции нарастания титра фага и бактериологического метода при диагностике брюшного тифа у больных и реконвалесцентов / М.А Абдусаматов // ЖМЭИ. 1960. - №1. -С. 23-27.

2. Аврех В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмонеллезов /

3. B.В. Аврех // ЖЭМИ. 1954. - №7. - С. 93-96.

4. Аврех В.В. О понятии "Серологический тип бактериофагов" / В.В. Аврех // В кн.: XIII Всесоюзный съезд гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов. Ленинград, 1959. - Т.2. - С. 537-540.

5. Адельсон Л.И. Современное состояние проблемы теории бактериофага и его практическое применение / Л.И. Адельсон, В.Д Гуторова, Г.Г. Ключа-рева // Тезисы докладов юбилейной научной сессии Ленинградского сан.-гиг. мед. ун-та. Ленинград, 1958. — С.34.

6. Азизбекян P.P. Изменение наследственности бактерий путем фаговой конверсии / P.P. Азизбекян // В кн. Микробиология. Генетика микроорганизмов. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. М., 1974. - Т.З.1. C. 191-233.

7. Арский В.Г. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии / В.Г. Арский, 3.3. Ахметов, А.В. Ясенский // Здравоохранение Таджикистана. — 1961. — №2. — С. 5-11.

8. Архангельский И.И. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров / Б.А. Степанов, И.И. Архангельский // Ветеринария. 1966. -№3. - С. 27.

9. Асланов Б.И. Пути рационального использования синегнойных бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике / Б.И. Асланов, Р.Х. Яфаев, Л.П. Зуева // Микробиология. 2003. - №5. - С. 72-76.

10. Афонин Э.А. Разработка бактериологического метода выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa / Э.А. Афонин // Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ульяновск, 1999 - 18 с.

11. Байрак В.А. Тесты патогенности и фаготипы стафилококков, выделенных при мастите коров / В.А. Байрак // Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 1970.-19 с.

12. Воронин A.M. Биологические препараты на основе псевдомонад / A.M. Воронин, В.В. Кочетков // Arpo XXI. 2000. - №3. - С. 3-5.

13. Бульканова Е.А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров их применения // Автореферат, дис. . канд. биол. наук. Саратов. - 2006. - 20 с.

14. Быкова З.И. Некоторые свойства чумных фагов / З.И. Быкова // Тр. Армянской противочумной станции. М., 1964. - №3. - С. 171-175.

15. Васильев Д.А. Учебно-методическое пособие по методам общей бактериологии / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.М. Никишина Ульяновск, 1998.-151 с.

16. Висконти Р. Генетика бактериофага / Р. Висконти // В кн.: Онтогенез вирусов. М., 1956. - 141 с.

17. Волкова К.В. Деструкция диметилфталата Pseudomonas putida МК55 / K.B. Волкова II Биотехнология состояние и перспективы развития: материалы 1-го Междунар. конгресса. 14-18 октября 2002. - Москва, 2002. — С. 281-282.

18. Волкова К.В. Разрушение ДМФ в воде штаммом Pseudomonas putida МК55 / К.В. Волкова II Ломоносов: сб. тезисов XIII Межд. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых, Москва, МГУ им. М.В, Ломоносова. 12-15 апреля 2006. М., 2006. - Т. IV. - С.29.

19. Воронцова A.A. Применение метода реакции нарастания титра фага при эпидемиологическом и санитарном обследовании / A.A. Воронцова // Кишечные инфекции: Тез.докл. на межинстит.конф. М., 1961. — С. 127128.

20. Выделение и анализ фагоустойчивых мутантов Pseudomonas putida с помощью новых бактериофагов / В.Н. Крылов и др. // Генетика. 1981.1. Т.17, №2. С.239-245.

21. Выделение и общая характеристика группы умеренных фагов Pseudomonas aeruginosa / А.С. Яненко и др. // Микробиология. 1979. -Т.48, №1. - С.109-113.

22. Вялова Г.П. Псевдомоноз молоди лососевых на Малкинском рыбо- водном заводе Камчатки / Г.П. Вялова, З.К. Шкурина // Проблемы товар, выращивания лососевых рыб России: Сб. докл. Всерос. совещ. 1-4 августа 1995 - Мурманск: Изд-во ПИНРО, 1995. - С. 79-84.

23. Вялова Г.П. Методы борьбы и профилактики псевдомоноза молоди горбуши / Г.П. Вялова, А.В. Полтева, З.К. Шкурина // Информ. листок СахЦНТИ. 1995. - № 38-95. - С. 4.

24. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. Минск. - 1973. - С. 5-24.

25. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии / В.Я. Ганюшкин Ульяновск. — 1988. - С.45.

26. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение / В.Я. Ганюшкин // Автореф. дис. . докт. вет. наук. — М., 1984. — С. 13-34.

27. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят / В.Я. Ганюшкин // Ветеринария. 1967. - №3. - С. 69-71.

28. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. 1961. -225 с.

29. Гольдфарб Д.М. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии / Д.М. Гольдфарб, В.Н. Кузнецова // ЖМЭИ. -1957.-№8.-С. 90-94.

30. Гольдфарб Д.М. Индикация брюшнотифозной палочки в воде с помощью реакции нарастания титра фага / Д.М. Гольдфарб, З.С. Островская // ЖМЭИ. 1957. - №5. - С. 17.

31. Гордина Р.В. Фаготипирование паратифозных В бактерий и действие на них бактериофагов / Р.В. Гордина // Автореф. дис. . докт. вет. наук. -М., 1954.-С. 24-27.

32. Грищенко Л.И. Патоморфология и вопросы патогенеза при септическом псевдомонозе рыб / Л.И. Грищенко // Восьмое Всесоюзн. совещание по паразитам и болезням рыб. Тезисы докл. М., 1984. - С. 26-27.

33. Грищенко Л.И. Болезни рыб и основы рыбоводства. Учебник. / Л.И. Грищенко, М.Ш. Акбаев, Г.В. Васильков М.: Колос, 1999. - С. 10-69; 139-263; 420-448.

34. Давиденко Т.А. Фаготипирование S.typhimurium, выделенных в Киеве в 1966-1970 / Т.А. Давиденко, А.М. Зарицкий // В кн.: Кишечные инфекции. -Киев.-1972.-С. 41.

35. Домарадский И.В. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага / И.В. Домарадский, О.Н. Мосолова, Л.К. Денисенко // Иркутск. — 1957. — С. 44-51.

36. Ершов Ф.И. Индикация дизентерийных бактерий с помощью РНФ / Ф.И. Ершов // В кн.: Изменчивость микроорганизмов и иммунитет. — М. — 1959.-С. 188.

37. Жиленков Е.Л. Изучение начальных стадий взаимодействия умеренного фага phi04 с клеткой Pseudomonas aeruginosa / Е.Л. Жиленков // Микробиология. 1997. - Т.66, №4. - С. 532-538.

38. Золотухин С.Н. Создание и разработка схем применения диагностическихбиопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов робактерий / С.Н. Золотухин // Автореф. дис. . д-ра биол. наук. -новск, 2007.-39 с.

39. Изучение морфологии частиц и структуры геномов бактериос~^ Ъагов

40. Pseudomonas putida с, целью их классификации / В.Н. Крылов м >

41. Генетика. 1989. — Т.25, №9. — С. 1559-1570. -v,;'' ■

42. Илюхин В.И. Псевдрмонадные инфекции в патологии человека / ЗЗ.И. Илюхин^/УЖМЭШ;-;1985.-№2.-G. 110-114. V \'vV'

43. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации псевдоту^""—грно-за рыб / Министерство сельского хозяйства и продовольствия Росси^^Ег^^ской Федерации от 18 сентября 1998г.

44. Капырина H.A. Идентификация возбудителя листериоза.с помощью»- ■ бактериофага / И.А. Бакулов, H.A. Капырина // Симпозиум > "Профилакт: е: тка и меры борьбы с лептоспирозом и листериозом с/х животных". — Hog<- >чер-касск. 1972. - С. 76-78. ' ■:■•';■

45. Катмакова Н.П. Селекция псевдотуберкулезных бактериофагов дл5эц.;- создания диагностического препарата // H.H. Катмакова, С.Н. Золоту-—-—

46. Катмакова Н.П: Разработка и применение диагностического би<р>~—парата «YP 09 УГСХА» на основе бактериофагов Yersinia ps*^-——cZ^-do-tuberculosis / Н.П. Катмакова// Автореф. дис. . канд. биол. наук. —яновск, 2010 -24 с.

47. Килессо В.А. Идентификация сальмонеллёзных культур с помощью О-бактериофага / В.А. Килессо // Тез. докл. конф. Таллин, научн.- иссл. инта эпидемиол., микробиол. и гигиены. Таллин. - 1960. - С. 5.

48. Клив де В. Блекберн. Микробиологическая порча пищевых продуктов: пер. с англ. / ред. Клива де В. Блекберн. СПб.: Профессия, 2008. - 784 с.

49. Ковалева E.H. Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enteroccocus Faecalis // Автореф. дис. . канд. биол. наук. 2009. - 20 с.

50. Козелько O.A. Применение метода РНФ для контроля качества дезинфекции в очагах кишечных инфекций / O.A. Козелько // ЖМЭИ. — 1961. — №2. С. 36-40.

51. Кольпикова Т.И. Фаготипирование листерий / Т.И. Кольпикова // Ветеринария. 1990. - №6. - С. 31-32.

52. Коритняк Б.М. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Yersinia enterocolitica и их применение в диагностике //

53. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2005. - 20 с.

54. Красильников H.A. Определитель бактерий и актиномицетов / H.A. Кра-сильников М.: Д.: Изд-во АН СССР, 1949. - 830 с.

55. Красильников H.A. Жизнь растений. Том 1. Введение Бактерии и актино-мицеты / Под ред. члена-корреспондента АН СССР, профессора H.A. Красильников, профессора A.A. Уранов М.: Просвещение, 1974. - С. 209-218.

56. Красильников А.П. Микробиологический словарь справочник / А.П. Красильников, Т.Р. Романовская // Минск: Асар. - 1999. - 310 с.

57. Кременчук Г.А. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды / Г.А. Кременчук, М.А. Гицевич, К.П. Бо-яршинова И ЖМЭИ. 1961.-№7.-С. 124.

58. Кульба A.M. Биологические свойства и нуклеотидный состав ДНК бактериофагов Pseudomonas / A.M. Кульба, A.C. Горелышев // Микробиология. — 1981. — Т.50. — С. 536-542

59. Лешкович Н.Л. О диапазоне и специфичности действия чумных фагов 1701, 1710иих мутантов / Н.Л. Лешкович, В.П. Ермилова //В кн.: Проблемы особо опасных инфекций. М. - 1974. - С. 38-41.

60. Лихачев Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага / Н.В. Лихачев // Ветеринария. 1948. - №7. - С. 32.

61. Мац Л.И. Вопросы санитарной бактериологии и вирусологии / Л.И. Мац — М.: Медицина. 1965. - С. 44-59.

62. Методические рекомендации по выделению и диагностике псевдомоноза сельскохозяйственных животных / ГУБ МСХ СССР от 15 декабря 1982г.

63. Методические указания по лабораторной диагностике псевдомонозов рыб / Министерство сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации от 22 сентября 1998г.

64. Методические указания по санитарно-бактереологической оценке рыбо-хозяйственных водоемов от 27.09.99г. №13-4-2/1742.

65. Методы получения, концентрации и очистки бактериофагов, поражающих фитопатогенные бактерии рода Pseudomonas / Ж.И. Оемчук и др. // Пробл.общ.и молекул, биол. Киев ,1988. - №7. - С. 97-100.

66. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных / Д.И. Скородумов и др.. М.: ИзографЪ, 2005. - 656 с.

67. Микробиологические методы идентификации микробов рода Pseudomonas. Приказ № 535 от 22.04.85г. "Об унификации микробиологических методов иследования, применяемых в КДЛ лечебно-профилактических учреждениях".

68. Молофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Escherichia coli 0157 и их применение в диагностике // Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Саратов, 2004. — 20 с.

69. Мусселиус В.А. Лабораторный практикум по болезням рыб / Под ред. В.А. Мусселиус. — М.: Лёгк. и пищ. пром-сть, 1983 — 296 с.

70. Никитюк Н.М. Фаготипирование Styphimurium, выделенных на различных территориях СССР / Н.М. Никитюк // ЖМЭИ. 1970. - №1. - С. 53.

71. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. / Р. Вейант и др. -М.: Мир, 1999. С. 506-553.

72. Островская H.H. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фага

73. H.H. Островская, Б.Н. Папкова // ЖМЭИ. 1951. - №2. - С. 37-40.

74. Островская H.H. К использованию метода нарастания титра фага для выявления бруцелл во внешней среде / H.H. Островская, Д.М. Гольдфарб // ЖМЭИ.-1961.-№5.-С. 145.

75. Павлова И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов Bacillus anthracis и Bacillus cereus / И.П. Павлова // ЖМЭИ. 1971. - №7. -С. 147.

76. Пастушенко А.Т. Серологические группы фитопатогенных бактерий рода Pseudomonas / А.Т. Пастушенко, И.Д. Симонович // Микроб, журн. -1979.-Т.41.-С. 222-228

77. Покровский В.И. Медицинская микробиология / В.И. Покровский, O.K. Поздеев // М.: Гоэтар Медицина. 2002. - С. 343-348.

78. Покровский В.И. Медицинская микробиология / В.И. Покровский, O.K. Поздеев // М.: Гоэтар Медицина. 1998. - С. 183-192.

79. Пожарникова E.H. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Enterobacter, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения: Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Саратов, 2006. С. 4-19.

80. Поляк М.С. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии / М.С. Поляк СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 179-180.

81. Понявин Б .Я. Изучение реакции нарастания титра фага в условиях практической лаборатории / Б.Я. Понявин // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 135.

82. Применение РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов / А.Ю. Иллютович и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958. — №6. — С. 78.

83. Пульчеровская Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. 21с.

84. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней / И.П. Ревенко // Ветеринария. -1970. -№ 6. -С. 13.

85. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практшивсе-- Киев: Урожай. 1978. - С. 41-88.

86. Рубашкина Б.К. Применение метода нарастания титра фага для иссле^хо-вания объектов внешней среды / Б.К. Рубашкина, С.Ф. Казакова^ // ЖМЭИ. 1959. - №6. - С. 110-112.

87. Самойленко В.И. Современное состояние изученности фагов фитопагзсго-генных бактерий / В.И. Самойленко // Бактериальные болезни растениМг — М.: Колос, 1981. С. 27-42.

88. Септический псевдомоноз карпов и толстолобиков / К.А. Лобунцов JQec др. //Ветеринария. 1971. - С. 58-59.

89. Сиволодскиий Е.П. Питательная среда Pseudomonas APS для выделениям ^ идентификации Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida / Е.П. Сив <cz>— лодскиий // ЖМЭИ. 1990. - С. 60-65.

90. Сиволодский Е.П. Тест идентификации бактерий рода Pseudomonas / Е.ЖПХ-Сиволодский // Лаб. дело. 1988. - №11. - С. 64-66.

91. Смирнов В.В. Бактерии рода Pseudomonas / B.B. Смирнов, Е.А. Кипрщ^з^-нова // Киев: Наук. Думка. 1990. - С. 65-69.

92. Стент Г. Молекулярная биология вирусов бактерий / Г. Стент — М.: Мищ=г>=у 1965.-452 с.

93. Стронговская Н.В. Сравнительное изучение РНФ для выявления нос^зп—тельства дизентерийных бактерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. --

94. Симферополь. — 1964. — С. 6-20.

95. Сидоров М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов, справо^зм-— ник / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Ф. Федотов. М.: Медицина-. 1995-С. 162.

96. Таксономическое изучение Pseudomonas fragi / Е.А. Киприанова и др. // Микобиология. 1988. - Т.57, №1. - С. 119-125.

97. Тимаков В.Д. Экспериментальное обоснование нового принципа обнару-— жения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // ЖМЭИ. 1956. - №10. - С. 3-7.

98. Тимаков В.Д. Об условиях взаимодействия фага и бактериальной клетки / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // Вестник АМН СССР. 1958. - №2. - С. 37.

99. Тимаков В.Д. Реакция нарастания титра фага (РНФ) / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб М., 1962. - С. 65-71.

100. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий / А.С. Тихоненко — М.: Наука, 1968. С. 89-168.

101. Усвоение додецилсульфата натрия бактериями рода Pseudomonas / Е.А. Киприанова и др. // Микробиол. Журн. 1978. - Т. 40, №4. - С. 503-505.

102. Фаги Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков и др. // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. 26-28 апреля 2005. — Ульяновск, 2005. 4.5. - С. 227-229.

103. Феоктистова Н.А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Proteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения // Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Саратов. — 2006. — 22 с.

104. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов / У. Хейс М.: «Мир», 1965. -С. 288-294.

105. Цветков К.И. Применение специфического фактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл / К.И. Цветков // Ветеринария. — 1941. — №6.-С. 4-6.

106. Шестаков А.Г. Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков // Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2010 - 22 с.

107. Щеглова М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага / 1VI.K. Щеглова // ЖМЭИ. 1962. - №1. - С. 99-102.

108. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий / В.Ю. Литвин и др.- ~~ М.: Фармарус-Принт, 1997. С. 255-256.

109. Юнчис О.Н. Инфекционные болезни морских аквариумных рыб / О-Н. Юнчис // Проблемы аквакультуры: Межвед. сб. науч. и науч.-метод. тр. Московский зоопарк. 2005. - С. 115-126.

110. Aalam S. High efficiency styrene biodégradation in a biphasic organic/water continuous reactor / S. Aalam, A. Pauss, J. Lebeault //Applied Microbiology Biotechnology. 1993. - N39. - P. 696-699.

111. Adams M. H. Bacteriophages / M.H. Adams Interscience Publishers, Inc., New York, 1959. - 473 p.

112. Altinok I. Pseudomonas putida infection in rainbow trout /1. Altinok, S. Kayis, E. Capkin // Aquaculture. 2006. - V.261. - P. 850-855.

113. Baigent H.L. Bacteriophages of Pseudomonas syringae / H.L. Baigent, J.E. De Va y, M.P. Starr // Z. J. Sei. 1963. - N6. - P. 75-100.

114. Bartell P.F. Distinct slime polysaccharide depolymerases of bacteriophage-infected Pseudomonas aeruginosa: evidence of close assotiation with the structured bacteriophage particle / P.F. Bartell, Т.Е. Orr // J. Virol. 1969. - V.4(5> -P. 580-584.

115. Benzene, Toluene and Xylene Biodegradation by Pseudomonas putida CClS/tI 852 / M.H. Otenio et al. // Brazilian Journal of Microbiology. V.36. -258-261.

116. Bergey's manual of determinative bacteriology / D. Bergey et al. Baltimore : Williams and Wilkins Co., 1923. - 442 p.

117. Blazevic D.J. Incidence and identification of Pseudomonas fluorescens arx<ä Pseudomonas putida in the clinical laboratory / D.J. Blazevic, M.H. Koepki^, J.M. Matsen // Appl. Microbiol. 1973. - P. 107-110.

118. Bonde G. Bacterial Indicator of Water Pollution / G. Bonde // Teknisk Forlag. Copenhagen. 1963. - P. 164.

119. Boopathi E. A sideophore from Pseudomonas putida type Al: structural and biological characterization / E. Boopathi, K.S. Rao // 1999. V.1435. - P. 3040.

120. Boyd J. S. K. Bacteriophage and heredity / J. S. K. Boyd // Nature. 1954. -V.173.-P. 50-51.

121. Bredley D.E. The structure of some Staphylococcus and Pseudomonas phages / D.E. Bredley // J. Ultrastruct. Res. 1963. -N8. - P. 552- 558.

122. Bradley D.E. The fine structure of bacteriophages / D.E. Bradley, D. Kay // J. Gen. Microbiol. 1960. - V.23. - P. 553-563.

123. Bradley D.E. The structure and infective process of a Pseudomonas aeruginosa bacteriophage containing ribonucleic acid / D.E. Bradley // J. Gen. microbiol. -1966.-V.45.-P. 83-96.

124. Bradley D.E. The adsorption of the Pseudomonas aeruginosa bacteriphage pf to its hast / D.E. Bradley // J. Microbiol. 1973. - N5. - P. 623-631.

125. Bradley D.E. Adsorption of bacteriophages specific for Pseudomonas aeruginosa R factors and R1 1822 / D.E. Bradley // Bio-chem. Biophys. Ries. Comm. 1974. -N57. - P. 893-900.

126. Breed K. Bergey's manual of determinative bacteriology / K. Breed, E. Murray, N. Smith Baltimore, 1957. - 1094 p.

127. Buchanan T. Pathogenic aspects of outer membrane components of Grammnegative bacteria / T. Buchanan, W. Pearce // Bacterial outer membranes, biogenesis and function. New York: Wiley and Sons. - 1979. - P. 475-514.

128. Burkholder W. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs / W. Burkholder // Phytopathology. 1950.-Nl.-P. 115-117.

129. Burnet F.M. Induced lysogenicity and mutation of bacteriophage within lysog-enic bacteria / F.M. Burnet, D. Lush. // Australian J. Exptl. Biol. Med. Sei. -1936.-V.14.-P. 27-38.

130. Castillo F.J. Localization and functional role of the Pseudomonas bacteriophage 2 depolimerase / F.J. Castillo, P.F. Bartell // J. Virol. 1976. - V.18(2). -P. 701-708.

131. Chakrabarty A.M. Phage initiated polysaccaride depolimerase in Pseudomonas putida / A.M. Chakrabarty, J.F. Niblack, I.C. Guansalus // Virology. 1967. -V.32.-P. 532-534.

132. Darreil J.H. Pyocine-typing of hospital strains of Pseudomonas pyocyanea / J.H. Darreil, A.H. Wahba. // J. Clin. Pathol. 1964. - V. 17. - P. 236-242.

133. Davison P.F. The physical properties of T7 bacteriophage / P.F. Davison, D. Freifelder // J. Mol. Biol. 1962. - P. 635-642.

134. Decomposition of poly-ß-hydroxybutyrate by Pseudomonads / F.P. Delafield et al. // J. Bacteriol. 1965. - N5. - P. 1455.

135. De Vos P. Intrageneric and intergeneric similarities of ribosomal RNA cistrons of the Genus Pseudomonas and the implications for taxonomy / P. De Vos // Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol, and Serol. 1980. - V.46, N1. - P. 96.

136. Dooren de Jong L.E. Bijdrage tot de Kennis van het mineralisatieproces / L.E. Dooren de Jong Rotterdam: Nijgt, van Ditmar, 1926.

137. Doudoroff M. Genus Pseudomonas Migula 1894 / M. Doudoroff, N.J. Palleroni // Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8th ed. - Baltimore : Williams and Wilkins Co, 1974. - P. 217-243.

138. Ednie L.M. Comparative activities of clinafloxacin against gram-positive and -negative bacteria / L.M. Ednie, M.R. Jacobs, P.C. Appelbaum // Antimicrob Agents Chemother. 1998. - V.42. - P. 269-273.

139. Espinosa-Urgel M. Genetic Analysis of Functions Involved in Adhesion of Pseudomonas putida to Seeds / M. Espinosa-Urgel, A. Salido, J. Ramos // Journal of Bacteriology. 2000. - V.182. - P. 2363-2369.

140. European perspective on nosocomial urinary tract infections. I. Report on the microbiology, work-load, etiology and antimicrobial susceptibility / E. Bouza et al. // Clin Microbiol Infect. 2001. - V.7. - P. 523-531.

141. Euzeby J.P. List of Prokaiyotic Names with Standing in Nomenclature Genus Pseudomonas. - http://www.bacterio.cict.fr/index.html

142. Evaluation of microbial surfactants for recovery of hydrophobic pollutants from soil / M.I. Van Dyke et al. // Journal of Industrial Microbiology. 1993. -Nil.-P. 163-170.

143. Festl H. DNA hybridization probe for the Pseudomonas fluorescens group/ H. Festl, W. Ludwig, K.H. Schleifer // Appl. And Environ. Microbiol. 1986. -V.52, N5. — P. 1190-1194.

144. Finegold, Bailey and Scott's Diagnostic Microbiology / Finegold // 7th ed., The C. V. Mosby Co., St. Louis. 1986.

145. Freeman V. J. Studies on the virulence of bacteriophage infected strains of Corynebacterium diphtheriae / V. J. Freeman // J. Bacteriol. 1951. — V.61. — P. 675-688.

146. Frei W. Uber Cytochrom and das Atmungssystem der Bakterien / W. Frei, L. Riedmuller, F. Almasy // Biochem. Z. 1934. - V.274. - P. 253-267.

147. Fuerst J.A. Surfase appendages similar to fimbriae (pili) von Pseudomonas cpecies / J.A. Fuerst, A. Hayward // J. Gen. Microbiology. 1969. - V.58, N2. -P. 227-237.

148. Gaby W.L. Differential diagnosis of Pseudomonas-iike microorganisms in the clinical laboratory / W.L. Gaby, E. Free // J. Bact. 1958. - V.76, N4. - P. 442-444.

149. Galarneault T. Pseudomonas vesiculare (Busing et al.) comp. nov. / T. Galarneault, E. Leifson // Int. Bull. Bact. Nomencl. Taxon. 1964. - V14, N1. -P. 165.

150. Genomotyping of Pseudomonas putida strains using P. putida KT2440-based high-density DNA microarrays: implications for transcriptomics studies / H. Ballerstedt et al. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2007. - V.75. -P. 1133-1142.

151. Greta B. Elaboraría Si Evaluaría Metodelor Rapide Pentru Diagnosticul Laborator Al Infectiilor Tractusulii Urinar / G. Balan // Teza de doctor on medicina. Chisunai. - 2008.

152. Gilardi G.L. Nonfermentative gram-negative bacteria encouatered in clinical specimens / G.L. Gilardi // J. Microbiol. Serol. 1974. - V.39. - P. 229-242.

153. Hancock R. Antibiotic uptake in Gram-negative bacteria // R. Hancock, A. Bell / Eur. J. Clin Microbiol Infect. Dis. 1988. - V.7. - P. 713-720.

154. Härtig C. Formation of trans Fatty Acids Is Not Involved in Growth-Linked Membrane Adaptation of Pseudomonas putida II C. Härtig, N. Loffhagen, H. Harms / Applied and Enbironmental Microbiology. 2005. - V.71. - P. 19151922.

155. Harwood C.S. Flagellation of Pseudomonas putida and analysis of its motile behavior / C.S. Harwood, K. Fosnaugh, M. Dispensa // Journal of Bacteriology. 1989. - V.171. -P. 4063-4066.

156. Hayward A.C. Characteristics oí Pseudomonas solanacearum / A.C. Hayward I I J. Appl. Bacterid. 1964. - V.27. - P. 265.

157. Hegeman G.D. Synthesis of the enzymes of the mandelate pathway by Pseudomonas putida. I. Synthesis of enzymes by the wild type / G.D. Hegeman // J. Bacteriol. 1966. - V.91. - P. 1140-1154.

158. Holloway B. W. Genom organization in Pseudomonas / B.W. Holloway, A.F. Morgan // Ann. Rev. Microbiol. 1986. - V.40. - P. 79-105.

159. Holloway B. W. Lysogenic conversion in Pseudomonas aeruginosa / B.W. Holloway, G.N Cooper. // J. Bacteriol. 1962. - Y.84. - P. 321-324.

160. Hugh R. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various Gram-negative bacteria / R. Hugh, E. Leifson // J. Bact. 1953. - V.66, N1. - P. 24-26.

161. Hugh R. Ryschenkow, E. Pseudomonas maltophilia, an alcaligenes-like species / R. Hugh // J. Gen. Microbiol. 1961. - V.26, N1. - P. 123-132.

162. Human- and animal-pathogenic members of the genus Pseudomonas / T. Bergen et al. I I The Prokaryotes A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria. Springer-Verlag. - Berlin, 1981.

163. Identification of Unusual Pathogenic Gram-Negativ Aerobic and Facultatively Anaerobic bacteria / R.S. Weyant et al. // 2nd ed. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md. 1996.

164. Iglewski B.H. Pseudomonas. In: Baron's Medical Microbiology (S. Barron et al, eds.) / B.H. Iglewski // 4th ed., Univ of Texas Medical Branch. 1996.

165. Iizuka H. An attempt at grouping of the genus Pseudomonas / H. Iizuka, K. Komagata I I J. Gen. and Appl. Microbiol. 1963. - V.9, N1. - P. 73-82.

166. Ikari P. Pseudomonas alcaligenes monias (1928) a polar monotrichos dextrose non-oxidizer / P. Ikari, R. Hugh // Bacteriol. Proc. 1962. - P. 70.

167. Incidence, spectrum and antibiotic sensitivity pattern of bacterial infections among patients with acute pancreatitis / P.K. Garg et al. // J. Gastroenterol Hepatol. -2001. -V. 16. P. 55-59.

168. Jessen O. Pseudomonas aerugenosa and other green fluorescent pseudomonads / O. Jessen. Munksgaad, Copenhagen, 1965 - P. 240-244.

169. Keeven J. A new selective medium for isolation / J. Keeven, B. De Cicco // Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 87tm Annu. Meet. AtlantaWashington, D.C. - 1987. - P. 382.

170. Kellin E.A. Isolation and properties ofa bacteriophage lytic for a wide rang of Pseudomonas / E.A. Kellin, R.A. Wrren // Canad. J. liacrobiol. 1971. - V.17, N5.-P. 677-682.

171. Klinge K. Differential tehniques and methods of isolation of Pseudomonas / K. Klinge I I Journal of Applied Microbiology. 1960. - V.23, N3. - P. 442-462.

172. Kluyver A.J. Pseudomonas aureofaciens nov. spec, and its pigments / A.J. Kluyver // J. Bacreriol. 1956. - V.72, N3. - P. 406-411.

173. Kowalski H. U.S. German Research Consortium Sequences Genome of Versatile Soil Microbe / H. Kowalski // J.Craig Venter Archive. - 2002.

174. Krylov V. Myoviridae bacteriophages of Pseudomonas aeruginosa: a long and complex evolutionary pathway / V. Krylov // Res Microbiol. 2003. - V.154. -P. 69-75.

175. Lee L. F. Characterization of bacteriophage gh-1 for Pseudomonas putida / L.F. Lee, J.A. Boezi // J. Bacteriol. 1966. - V.92. - P. 1821-1827.

176. Loele W. Uber die Verwendbarkeit von Oxydationswirkungen mit Para-phenylendiamin in der Bakteriologie / W. Loele // Zbl. Bakt. (Abt. 1 Orig.). -1929.-V.111.-P. 325.

177. Lopez J.E. Utilization of Heterologous Siderophores Enhances Levels of Iron Available to Pseudomonas putida in the Rhizosphere / J.E. Lopez, M.D. Henkels // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - V.65. — P. 5357-5363.

178. Lysenko O. Pseudomonas — an attempt at a general classification / O. Lysenko // J. Gen. Microbiol. 1961. - V.25, N3. - P. 379-408.

179. MacFaddin J.F. Media for Isolation Cultivation -Identification-Maintenance of Medical Bacteria / J.F. MacFaddin // Williams and Wilkins, Baltimore. -1985.-V.l.-P. 25-28.

180. Marcus A. Versatile soil-dwelling microbe is mapped / A. Marcus // Genome News Network. 2003.

181. Marcus P. Induction and purification of a- and ß-hydroxysteroid dehydrogenases / P. Marcus, P. Talalay // J. Biol. Chem. 1956. - V.218, N2. - P. 661-674.

182. Migula W. Shizomycetes / W. Migula // Engler and Prante. Naturlichen pflanzenfamilien. 1895. - P. 29.

183. Migula W. System der Bacterien / W. Migula Jena : G. Fisher. - 1900. - V.2. -876 p.

184. Miller C.D. Cloning and mutational analysis of the gene for the stationary-phase inducible catalase (catC) from Pseudomonas putida / C.D. Miller, Y.C. Kim, A.J. Anderson // Journal of Bacteriology. 1997. - V.179. - P. 52415245.

185. Moustafa F.A. A Comparison of some phytopathogenic and nonphytopatho-genic Pseudomonas / F.A. Moustafa, Whittenbury // Phytopatol. Z. 1970. -V.67, Nl.-P. 63.

186. Muller R. Bacterial Degradation of Xenobiotics. / R. Muller // Microbial Control of Pollution. 1992. - V.48. - P. 52.

187. New selective media for enumeration and recovery of Pseudomonads from various habitats / W. Gould et al. // Appl. and Envirion.Microbiol. 1985. -V.45, Nl.-P. 28-32.

188. Nikaido H. Penetration of lipophilic agents with multiple protonation sites into bacteria cells; tetracyclines and fluoroquinolones as examples / H. Nikaido, D.G. Thanassi // Antimicrob Agents Chemother. 1993. - V.37. - P. 13931399.

189. Olive P. B. D. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms / P. B. D. Olive // J. Clin Microbiol. 1999. - V.37. - P. 1661-1669.

190. O'Toole Isolation and Characterization of a Generalized Transducing Phage for Pseudomonas aeruginosa Strains PAOl and PA14 / M. Jonathan et al. // Journal of Bacteriology. 2004. - V.186, N10. - P. 3270-3273.

191. Palleroni N. Phenotypic characterization and deoxyribonucleia acid homologies of Pseudomonas solanacearum / N. Palleroni, M. Doudoroff Ibid. — 1971.-V.107, N3.-690 p.

192. Palleroni N.J. Nucleic acid homologies in the genus Pseudomonas / N.J. Palleroni, M. Doudoroff// Int. J. Syst. Bacterid. 1973. - V.23, N4. - P. 333339.

193. Palleroni N.J. Genus Pseudomonas Migula 1894 / N.J. Palleroni // Bergey'smanual of systematic bacteriology Ed. R. Noel, Krieg J. G. Holf.-Baltimore:1.ndon: Williams Wilkins. 1984. - V.l. -P. 141-198.

194. Palleroni N.J. The Pseudomonas group / N.J. Palleroni // Bushey: Meadowfield press Ltd.-1978.-P. 80.

195. Pesci E.C. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing / E.C. Pe-sci, B.H. Inglewski // Trends Microbiol. 1997. - V.24. - P. 132-134.

196. Phylogenese definition of the major eubacterial taxa / C.R. Woese et al. // Syst. Appl. Microbiol. 1985. - V.6, N1. -P. 143-151.

197. Pickett M.J. Manual of Clinical Microbiology / M.J. Pickett, D.G. Hollis, E. Bottone // 5th ed., ed. in chief A.Ballows. Washington: Am Soc Mirobiol. -1991.-P. 410-28.

198. Postic B. Observations on bacteriophage typing of Pseudomonas aeruginosa / B. Postic, M. Finland // J. Clin. Invest. 1961. - V.40, N20. - P. 64-75.

199. Prevot A.R. Traite de sistematique bacterienne / A.R. Prevot Paris : Dunod, 1961.-V.2.-P. 41-191.

200. Pseudomonas and Burkholderia / M.O. Husson et al. //Clinical precis of bacteriology, Paris. 2000. - P. 1259-1285.

201. Pseudomonas aureofaciens Kluyver and phenazine-a-carboxylic acid, ist characteristic pigment / W.C. Haynes et al. // J. Bacteriol. 1956. - V.72, N3. -P. 412-417.

202. Pseudomonas bacteriophage phiKZ contains an inner body in its capsid / V.N. Krylov et al. // Can. J. Microbiol. 1984. - V.30. - P. 758-762.

203. Pseudomonas putida newly recognized pathogen in patients with cancer / E. Anaissie et al. // Am. J. Med. 1987. - P. 1191-1194.

204. Pseudomonas putida Septicemia in a Special Care Nursery Due to Contaminated Flush Solutions Prepared in a Hospital Pharmacy / J. Perz et al. //Journal of Clinical Microbiology. -2005. -V.43. -P. 5316-5318.

205. Reanney D. Genetic Interactions Among Communities / D. Reanney, P. Gowland, J. Slater // Microbes in Their Natural Environments. 1983. - V.34. -P. 408.

206. Rhodes M.E. The characterization of Pseudomonas fluorescens / M.E. Rhodes // J. Gen. Microbiol. 1959. - V.21, N1. - P. 221-263.

207. Rhodes M.E. The characterization of Pseudomonas fluorescens with the acid of an electronic computer / M.E. Rhodes // Ibid. 1961. - V.25, N2. - P. 331.

208. Ribera R. Production of polyhidroxyalkanoates by Pseudomonas putida KT2442 harboring pSK2665 in wastewater from olive oil mills (alpechin) / R. Ribera, M. Monteoliva-Sanchez, A. Ramos-Cormenzana // Electronic Journal of Biotechnology. V.4. - 2001.

209. Romano J. Pseudomonas-Saccharomyces Interactions: Influence of Fungal Metabolism on Bacterial Physiology and Survival / J. Romano, R. Kolter // Journal of Bacteriology. 2005. - V.187. - P. 940-948.

210. Roncero C. Pseudomonas aeruginosa Transposable Bacteriophages D3112 and B3 Require Pili and Surface Growth for Adsorption / C. Roncero, A. Darzins, J. Malcolm // J. of Bact. 1990. - P. 1899-1904.

211. Ruiz-Manzano A. Levels and Activity of the Pseudomonas putida Global Regulatory Protein Crc Vary According to Growth Conditions / A. Ruiz-Manzano, L. Yuste, F. Rojo // Journal of Bacteriology. 2005. - V.187. - P. 3678-3686.

212. Ryan K.J. Sherris Medical Microbiology / K.J. Ryan, C.G. Ray // 4th ed., McGraw. 2004. - P. 236.

213. Sands D.C. Taxonomy of phytopathogenio Pseudomonads / D.C. Sands, M.N. Schroth, D.C. Hildebrand // J. Bacteriol. 1970. - V. 101, N1. - P. 9.

214. Sellers W. Medium for differentiating the gram-negative, nonfermenting bacilli of medical interest / W. Sellers // J. Bact. 1964. - V.8. - P. 46-48.

215. Sjoberg L. Phage typing of Pseudomonas aeruginosa / L. Sjoberg, A.A. Lindberg. // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1968. - V.74. - P.61-68.

216. Slayter H.S. The structure of Pseudomonas aeruginosa phages B3, E79, and F116. / H.S. Slayter, B.W. Holloway, C.E. Hall // J. Ultrastruct. Res. 1964. — V.ll.-P. 274-281.

217. Stanier R. Y. The aerobic pseudomonads: a taxonomic study / R.Y. Starrier, N.J. Palleroni, M. Doudoroff. // J. Gen. Microbiol. 1966. - V.43. - P. 159271.

218. Stock J.B. Protein phosphorylation and regulation of adaptive response in bacteria / J.B. Stock, A.J. Ninfa, A.M. Stock // Microbiol Rev. 1989. - V.53. -P. 450-490.

219. Taxonomy of aerobic pseudomonads: P. diminuta and P. veziculare / R. Bailard et al. // J. Gen. Microbiol. 1968. - V.53, N2. - P. 349-361.

220. Taxonomy of the aerobic pseudomonads: the properties of the Pseudomonas stitzeri group / N.J. Palleroni et al. // J. Gen. Microbiol. 1970. - V.60, N2. -P. 215-231.

221. The Effect of Nutrient Limitation of Styrene Metabolism in Pseudomonas putida CA-3. / K. O'Connor et al. // Applied and Environmental Microbiology. 1996. - V.62. - P. 3594-3599.

222. The family and genera of the bacteria. Preliminary report of the society of American bacteriologists on characterization and classification of bacterial types / C.E. Winslow et al. // J. Bacteriol. 1917. - V.2, N5. - P. 505-566.

223. The genome of bacteriophage phiKMV, a T7-like virus infecting Pseudomonas aeruginosa / R. Lavigne et al. // Virology. 2003. - V.20, N312(1). - P. 4959.

224. The genome of bacteriophage phiKZ of Pseudomonas aeruginosa / V.V. Me-syanzhinov et al. // J. Mol. Biol. 2002. - V.15, N317(1). - P. 1-19.

225. The Pseudomonas putida Lon protease is involved in N-acyl homoserine lactone quorum sensing regulation / I. Bertani et al. // BMC Microbiology. -2007. — V.7. — P. 71.

226. Trevors J.T. Development of a Microbial Profile on Selected Groups of Microorganisms to assist in evaluations under the Canadian Environmental Protection Act for the Genus: Pseudomonas / J.T. Trevors // Environment Canada contract report. —1991.

227. TSCA Experimental Release Application Approved for Pseudomonas putida Strains. United States Environmental Protection Agency. 2007.

228. Uetake H. Conversion of somatic antigens in Salmonella by phage infection leading to lysis or lysogeny / H. Uetake // Virology. 1958. - V.5. - P. 68-91.

229. Vandenbergh P.A. Plasmid Involvement in Acyclic Isoprenoid Metabolism by Pseudomonas putida / P.A. Vandenbergh, A.M. Wright // Applied and Environmental Microbiology. 1983. - V.45. - P. 1953-1955.

230. Variable enzymological pattering in tyrosine biosynthesis as a means of determining natural relatedness among the Pseudomonadaceae / G. Byng R. et al. // J. Bacteriol. 1980. - V.144, N1. - P. 247-257.

231. Van Niel C. A note on 'Pseudomonas stutzeri / C. Van Niel, M.B. Allen // J. Bacteriol. 1952. - V.64, N 3. - P. 413-421.

232. Vicente M. Glucolysis in Pseudomonas putida\ Physiological Role of Alternative Routes from the Analysis of Defective Mutants / M. Vicente, J.L. Canovas // Journal of Bacteriology. 1973. - V.l 16. - P. 908-914.

233. Ward P.G. Accumulation of Polyhydroxyalkanoate from Styrene and Phylacetic Acid by Pseudomonas putida CA-3 / P.G. Ward, G. de Roo, K.E. O'Connor // Applied Environmental Microbiology. 2005. - V.71. - P. 20462052.

234. Weber D.J. Nosocomial infections in the ICU: the growing importance of antibiotic-resistant pathogens / D.J. Weber, R. Raasch, W.A. Rutala // Chest. -1999.-V.l 15.-P. 34-41.

235. Welsh J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Res. — 1990. — V. 18, N72. — P. 13-18.

236. Whitman P.A. Characterisation of two psychrophylic Pseudomonas bacteriophages isolated from ground beef / P.A. Whitman, R.T. Marshall // Appl.Microbiol. 1971. - V.22, N3. -P. 463-468

Информация о работе

Викторов, Денис Александрович
кандидата биологических наук
Саратов, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Pseudomonas putida - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы