Бактерии рода Pseudomonas в микробном сообществе озера Байкал

Павлова, Ольга Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактерии рода Pseudomonas в микробном сообществе озера Байкал
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Бактерии рода Pseudomonas в микробном сообществе озера Байкал"

На правах рукописи

ПАВЛОВА Ольга Николаевна

"^JJcd&jucduа.

БАКТЕРИИ РОДА PSEUDOMONAS В МИКРОБНОМ СООБЩЕСТВЕ

ОЗЕРА БАЙКАЛ

03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2004

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Дрюккер Валентин Валерьянович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Мамонтова Лилия Михайловна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Напрасникова Елизавета Викторовна

Ведущая организация: Институт биофизики СО РАН, г. Красноярск

Защита состоится « 3 » 'Ц-ЬОн^Л. 2004 г. в /£ час. на заседании диссертационного совета Д. 212.074.07 при Иркутском государственном университете по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им. профессора М. М. Кожова (ауд. 219).

Почтовый адрес: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, биолого-почвенный факультет ИГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского государственного университета.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Купчинская Е. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бактерии рода Pseudomonas - большая гетерогенная группа микроорганизмов. Данная группа широко населяет биосферу и принимает активное участие в процессах минерализации органических соединений, очищения окружающей среды от загрязнения. Псевдомонады являют собой пример истинного космополитизма, в основе которого лежит их высокая биохимическая лабильность, обеспечивающая им приспособляемость к разнообразным экологическим условиям.

В озере Байкал бактерии рода Pseudomonas изучены авторами в составе так называемых «физиологических групп» [Кузнецов С. И., 1957; Романова А. П., 1958; Младова Т. А., 1971; Максимова Э. А., Максимов В. Н., 1972; Лаптева Н. А., 1990; Белькова Н. Л., Денисова Л. Я., 1999]. В данных работах показано, что большую часть микробного сообщества воды и донных осадков озера Байкал составляют, главным образом, неспрообразующие палочки. Проведенные авторами исследования лишь косвенно затрагивают вопросы видового разнообразия Pseudomonas в озере Байкал. Многие виды, первоначально описанные ими как относящиеся к роду Pseudomonas, в настоящее время, согласно современной систематике, перенесены в другие рода и группы. Анализ работ показал, что в целом данная группа микроорганизмов в озере изучена недостаточно.

Определение видового состава, в соответствии с современной систематикой бактерий рода Pseudomonas, с применением как микробиологических, так и молекулярно-биологических методов, актуально при исследовании состава и структуры микробного сообщества. Изучение особенностей распределения представителей рода Pseudomonas в озере Байкал связано не только с определением их места в микробном сообществе, но и роли в экосистеме озера. Изучение физиолого-биохимических свойств культивируемых бактерий рода Pseudomonas позволяет получить новые данные об их природных возможностях. Кроме этого, сохранение природных экосистем и микробного разнообразия в настоящее время является одной из актуальных задач микробной экологии [Lemke M. J., Leff L. G., 2000]. В последние десятилетия возрос интерес к микроорганизмам-деструкторам различных высокомолекулярных соединений. Загрязнение окружающей среды нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) является проблемой мирового масштаба. Поэтому в настоящее время разрабатываются микробиологические методы, основанные на использовании ферментативной активности микроорганизмов-деструкторов. Изучение и выделение микроорганизмов рода Pseudomonas, обладающих углеводородокисляющей активностью, из озера Байкал позволит оценить роль данных бактерий в процессах очищения и поддержания чистоты байкальских вод.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить роль бактерий рода Pseudomonas в микробном сообществе оз. Байкал и определить степень участия их в процессах биодеградации углеводородов.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Изучить биоразнообразие бактерий рода Pseudomonas в озере Байкал.

2. Исследовать сезонную, межгодовую динамику и пространственное распределение доминирующих видов Pseudomonas.

3. Определить ферментативную активность бактерий Pseudomonas.

4. В условиях лабораторного моделирования определить углеводородокисляющую активность исследуемых бактерий и оценить биологический потенциал природных штаммов в процессах деградации углеводородов.

Научная новизна: в настоящей работе впервые проведено комплексное изучение большой группы микроорганизмов - бактерий рода Pseudomonas в микробном сообществе оз. Байкал. Из озера Байкал было выделено и идентифицировано 200 чистых культур, отнесенных к роду Pseudomonas. Согласно современной систематике в Байкале определены представители пяти основных филогенетических групп изучаемого рода из семи. Изучены особенности сезонной, межгодовой динамики бактерий рода Pseudomonas, a также их физиолого-биохимическая и углеводородокисляющая активность.

Практическая значимость работы: Полученные данные об экологических особенностях, видовом составе культивируемых видов рода Pseudomonas, являются частью работ по изучению состава и функционирования микробного сообщества оз. Байкал в целом и могут быть использованы при организации экологического мониторинга. Исследуемые бактерии, являются активными биодеструкторами как простых, так и сложных высокомолекулярных соединений и могут найти применение в биологической очистке сточных и природных вод.

Защищаемые положения:

1. Бактерии рода Pseudomonas доминируют в гетеротрофном микробном сообществе озера Байкал, сезонная динамика изучаемых бактерий характеризуется закономерностями, отличными от динамики развития гетеротрофов.

2. В культивируемом сообществе микроорганизмов озера Байкал обнаружены представители 5 из 7 филогенетических групп рода Pseudomonas, установленных современной систематикой: P. aeruginosa, P. alcaligenes, P. mendocina; P.putida; P. fluorescens; P. stutzeri; P.fragi.

3. Природные штаммы Pseudomonas, изолированные из воды и донных осадков оз. Байкал, являются активными продуцентами экзоферментов, благодаря которым происходит процесс биодеструкции как простых, так и сложных высокомолекулярных соединений, способствующий сохранению чистоты байкальских вод.

Апробация работы и публикации. Материалы исследований были доложены и обсуждены на: международной конференции «Экология Сибири, Дальнего Востока и Арктики», Томск, 2001; совещании «Интеграция фундаментальной науки и высшей школы в устойчивом развитии Сибири», Иркутск, 2001; международном конгрессе по экологии «Proceeding of the VIII INTECOL International Congress of Ecology», Korea, 2002; третьем

международном симпозиуме «Ancient Lakes: speciation, development in time and space, natural history», Irkutsk, 2002; научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе», Иркутск, 2002; первом европейском микробиологическом конгрессе «1st FEMS congress of European microbiologist», Ljubljana, 2003; научно-практическом совещании «Перспективы нефтегазоносности Байкала и Западного Забайкалья», Улан-Удэ, 2003; международном Байкальском микробиологическом симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ», Иркутск, 2003; Иркутском региональном отделении Микробиологического общества, 2004. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения, списка литературы из 160 источников. Материал диссертации изложен на 146 страницах, содержит 27 рисунков и 8 таблиц.

ГЛАВА 1. Обзор литературы

Приведены литературные данные по истории изучения, характеристике бактерий рода Pseudomonas. Обсуждена современная систематика бактерий исследуемого рода и его место в системе микробного мира. Рассмотрены вопросы о степени изученности бактерий рода Pseudomonas в озере, а также экологические факторы, определяющие развитие микроорганизмов в озере Байкал.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

Пробы воды и донных осадков отбирали и обрабатывали в 1999 - 2004 гг. по общепринятым методикам [Романенко В. И., Кузнецов С. И., 1974; Кузнецов С. И., Дубинина Г. А., 1989]. Водные образцы отбирали в стерильные флаконы батометром, донные отложения - дночерпателем. За весь период исследования было отобрано и проанализировано около 1500 проб воды и донных осадков. Отбор проб для изучения сезонной динамики бактерий рода Pseudomonas проводили у мыса «Березовый», в мелководной зоне Южного Байкала. Распределение, численность гетеротрофов и бактерий рода Pseudomonas, видовой состав данного рода были изучены в донных осадках оз. Байкал из придельтового района р. Селенги, в районе влияния БЦБК, а также в пробах воды, отобранных на стандартных гидрологических разрезах по всей вертикали от поверхностного до придонных слоев Южного, Среднего и Северного Байкала (рис. 1).

Для выделения бактерий рода Pseudomonas из природных образцов использовали рыбо - пептонный агар, разбавленный в 10 раз [Горбенко А. Ю., 1961]. На данной среде изучали две группы микроорганизмов: байкальские гетеротрофы и представители рода Pseudomonas. На использованной в работе

питательной среде проводили отбор колоний, типичных для Pseudomonas. Для идентификации выделенных штаммов микроорганизмов до вида, применяли методику, предложенную Стейниером с соавторами [Stainer R. V. et. al, 1966]. Для этого определяли 16 физиолого-биохимических признаков, которые включают: посев на «косяки» для получения суточной культуры, окраска по Граму, изучение морфологии, подвижности, окраска на определение спорообразования, посев на среду Хью - Лейфсона [Hugh R., Leifson E., 1953]. Дополнительные признаки для идентификации псевдомонад включают: наличие оксидазы, аргининдигидролазы, лецитиназы, выявление пигментообразования, способность роста при +42°С, при +5°С, способность к денитрификации, гидролиз желатины, гидролиз крахмала, использование углеводов [Определитель бактерий Берджи, 1997].

Рис. 1. Карта - схема отбора проб воды и донных осадков в озере Байкал

В главе приведены методы определения ферментативной активности бактерий рода Pseudomonas; таксономического изучения бактерий, на основе анализа последовательностей 16S рРНК. Описаны методы выделения углеводородокисляющих микроорганизмов, проведения эксперимента по деградации 3-х полициклических ароматических углеводородов: пирена, фенантрена и флуорантена, бис-(2этилгексил)фталата.

Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам [Рождественский А. В., Чеботарев А. И., 1974], с использованием программного пакета Microsoft Excel 7.0 для Windows 98. Эксперименты проводили в трех повторностях. Для полученных данных рассчитывали среднее значение, среднее квадратичное отклонение. При оценке погрешности определения ПАУ, обрабатывали и анализировали эксперименты с 5 штаммами микроорганизмов по три параллельных опыта для каждой культуры. Расчет дисперсии

сходимости определения ПАУ проводили по относительным отклонениям результата анализа от среднего значения для каждого штамма. Выводы сделаны с учетом уровня значимости а = 0,05.

ГЛАВА 3. Пространственное распределение и сезонная динамика бактерий рода Pseudomonas в воде и донных осадках озера Байкал

3.1. Пространственное распределение представителей рода Pseudomonas

в озере Байкал

Изучение динамики развития и пространственного распределения доминирующей группы микроорганизмов - бактерий рода Pseudomonas в воде озера Байкал, связано с необходимостью определения их доли в культивируемом микробном сообществе, а также роли в экосистеме озера. Исследования проводили в середине июня 2002 года, сентябре 2003 г. (рис. 2).

0- 10 10 - 50 50 - 200 2СЮ - 500 > >00 КЛ/МЛ

Рис. 2. Пространственное распределение бактерий p. Pseudomonas в озере Байкал в июне 2002 г.(а) и сентябре 2003 г. (б)

В результате проведенных исследований установлено, что в Северном Байкале бактерии рода Pseudomonas, так же как и гетеротрофные микроорганизмы, преобладают либо в поверхностном слое до глубины 50 м, либо в придонных слоях. Количество микроорганизмов рода Pseudomonas в воде Северного Байкала, в среднем, составляет 21% от числа гетеротрофов. В Среднем Байкале бактерии исследуемого рода занимают доминирующее

положение в пробах воды, отобранных на разрезе с. Болдаково - Ольхонские ворота, где установлено 48% и 30% данных микроорганизмов в июне 2002 г. и сентябре 2003 г., соответственно. На разрезе отмечено явное преобладание флуоресцирующих бактерий рода Pseudomonas, с сине-зеленым диффундирующим в питательную среду пигментом. На стандартных гидрологических разрезах м. Ухан - м. Тонкий, Анга - Сухая выявлено 20% и 22% бактерий рода Pseudomonas от числа гетеротрофов. В Южном Байкале бактерии рода Pseudomonas доминируют в пробах воды, отобранных на разрезах п. Маритуй - р. Солзан, м. Кадильный - р. Мишиха - 35% и 38%, соответственно. Бактерии рода Pseudomonas выявлены в поверхностном слое, на глубине 50 м, 800 м.

Таким образом, установлено, что динамика развития бактерий рода Pseudomonas отличается в сезонном аспекте в различных котловинах Южного, Среднего и Северного Байкала. Максимальное их количество обнаружено в Южном и Среднем Байкале. Представители рода Pseudomonas в Северном Байкале выделяются, в основном, из эпилимниона, в Южном и Среднем - из эпилимниона, зоны температурного скачка и гиполимниона.

Для изучения распределения псевдомонад в донных осадках были отобраны пробы в придельтовом районе р. Селенги и в районе влияния БЦБК. Изучение распределения, количества и видового состава бактерий рода Pseudomonas в этих осадках представляет интерес в связи с влиянием антропогенного фактора на данные участки акватории озера. Результаты исследования показали, что количество гетеротрофов, как показателей интенсивности распада органического вещества, в донных отложениях придельтовых районов Селенги колеблется в широких пределах: от 100 тыс. до 600 тыс. клеток в 1 г песчаного грунта; от 400 тыс. до 2,7 млн. кл/г в алевритовых илах. При сравнении численности гетеротрофных бактерий и числа микроорганизмов, которые были отнесены к роду Pseudomonas, было установлено, что доля псевдомонад среди гетеротрофных бактерий в придельтовом районе р. Селенги значительна и составляет от 18 до 88%. Распределение Pseudomonas в этом районе неравномерное. Необходимо отметить, что микроорганизмы исследуемого рода доминируют в основном в осадках, отобранных в районах, граничащих с областью мелководья, т.е. там, где ослабляется влияние вод р. Селенги.

Также наибольшим количеством гетеротрофов характеризуется окисленный слой донных осадков, отобранных в районе влияния Байкальского ЦБК, где численность культивируемых гетеротрофов колеблется в широких пределах -от 20 тыс. до 3 млн. кл/мл. Высокие значения количества микроорганизмов выявлены в восточном направлении от места сброса сточных вод БЦБК. Это связано с влиянием постоянного узконаправленного течения, которое уносит эти сточные воды (постепенно разбавляемые водами озера) на восток-северо-восток. Мозаичность распределения микроорганизмов в донных осадках связана с неоднородностью рельефа и влиянием подводных течений. Количество бактерий рода Pseudomonas в них не превышает 20%, от числа гетеротрофных бактерий. По-видимому, это связано с поступлением в донные осадки таких веществ, как лигнин и целлюлоза, что способствует развитию

представителей других групп микроорганизмов. Таким образом, бактерии рода Pseudomonas доминируют, в основном, в чистых районах акватории озера, не подверженных влиянию антропогенных факторов, что согласуется с данными литературы. Влияние антропогенного фактора выражается в развитии других групп микроорганизмов и снижении процентного содержания псевдомонад, относительно количества культивируемых гетеротрофов. Преобладающим видом в данном районе является Pseudomonas aeruginosa. Данная микрофлора не свойственна производственным сточным водам БЦБК, а является результатом поступления на его очистные сооружения хозяйственно-бытовых сточных вод г. Байкальска.

3.2. Сезонная динамика бактерий рода Pseudomonas в мелководной

зоне

Исследования сезонной динамики проводили в течение 2001 - 2002 годов, в мелководной зоне Южного Байкала, на станции у мыса «Березовый», с максимальной глубиной 14 м, от поверхности до придонного слоя. Сезонное распределение бактерий рода Pseudomonas, также как и гетеротрофных микроорганизмов, зависит не только от температуры воды, но и от распределения биогенных элементов, таких как азот, фосфор и др. В развитии Pseudomonas в поверхностном слое наблюдается два подъема: в июне (летний) и в ноябре (осенний). Изученная динамика несколько отличается от динамики развития численности гетеротрофов, которая, как отмечено раннее во многих работах, в поверхностных слоях воды озера имеет три подъема: весенний, летний, осенний. Результаты проведенных исследований в мелководной зоне показали, что первый подъем гетеротрофов приходится на апрель месяц, связанный с увеличением количества растворенного органического вещества, поступающего в водоем после подледного развития и отмирания водорослей (рис. 3, а). Затем, после снижения численности гетеротрофов в мае, происходит второй пик максимального развития гетеротрофов, который приходится на июнь-июль, и третий более низкий - в ноябре. Следует отметить, что число псевдомонад в мае, когда развитие гетеротрофов снижается, составляет 84% от их количества, в это же время содержание NO3- в поверхностном слое составляет 0,66 мг/л. В развитии бактерий рода Pseudomonas наблюдается плавное нарастание ее численности от марта до июля, нежели для гетеротрофов. И только в ноябре наблюдается максимум в развитии псевдомонад, который достигает 2800 кл/мл, что составляет 96% от количества гетеротрофов (рис. 3, б).

На средней глубине -7м выявлена другая картина распределения псевдомонад. На данной глубине зафиксировано незначительное количество культивируемых гетеротрофов, по сравнению с поверхностными и придонными слоями, но, несмотря на это, почти во все сезоны года наблюдается преобладание бактерий рода Pseudomonas. Максимум развития Pseudomonas в данном слое приходится на июнь - 95% и на ноябрь - 93%, соответственно, от числа гетеротрофов. Отмечено, что в ноябре месяце, псевдомонады

распределены по всей водной толще равномерно, так же как и содержание нитратов (0,5 мг/л). В придонных слоях, бактерии рода Pseudomonas активно развиваются только в ноябре. В основном же, количество псевдомонад в придонных слоях незначительно - минимум их количества отмечен в августе, сентябре, а также в феврале, когда их численность падает до 0. В летние месяцы количество гетеротрофов составляет 2000 кл/мл, тогда как Pseudomonas 100 кл /мл (5%).

кл/мл кл/мл

Ом .Ум — -а--14м |

Рис. 3. Сезонная динамика гетеротрофов (а) и бактерий рода Pseudomonas (б) в мелководной зоне Южного Байкала, в 2001 - 2002 гг.

Таким образом, установлено, что сезонная динамика развития Pseudomonas в мелководной зоне озера Байкал отличается от таковой гетеротрофных микроорганизмов, которая в поверхностных слоях воды имеет три подъема: весенний, летний, осенний. В развитии Pseudomonas в поверхностном слое наблюдается два подъема: в июне (летний) и в ноябре (осенний). Динамика развития Pseudomonas в мелководной зоне озера Байкал тесно связана как с температурным, так и с другими экологическими факторами. В сезонном аспекте доминирование псевдомонад в поверхностном слое воды наблюдается в мае (84% от количества гетеротрофов), а также ноябре, когда численность бактерий рода Pseudomonas составляет 93% - на глубине 7 и 14 м, 96% - в поверхностном слое. Температура воды +4°С благоприятствует развитию микроорганизмов рода Pseudomonas, доминирующих в психрофильном микробном сообществе. В летние месяцы в поверхностном горизонте и подледных сообществах преобладают пигментные формы микроорганизмов, в придонных слоях - бактерии рода Bacillus. В летние месяцы псевдомонады доминируют в среднем горизонте; в поверхностном слое их количество

составляет 32 - 53%, в придонных 5-15 %, соответственно от количества гетеротрофов.

ГЛАВА 4. Биоразнообразие, физиолого-биохимическая характеристика бактерий рода Pseudomonas, изолированных из оз. Байкал

4.1. Биоразнообразие бактерий рода Pseudomonas

Проведенные исследования пространственного распределения, динамики развития в мелководной зоне показали, что бактерии рода Pseudomonas преобладают в гетеротрофном микробном сообществе озера Байкал. Определение видового состава, в соответствии с современной систематикой бактерий рода Pseudomonas, с применением как микробиологических, так и молекулярно-биологических методов, необходимая часть при исследовании состава и структуры микробного сообщества. За время проведения исследований было выделено и идентифицировано 200 чистых культур, отнесенных к исследуемому роду. Доминирующие виды, изолированные из различных участков озера, представлены в таблице 1.

Таблица 1

Видовое разнообразие культивируемых бактерий рода Pseudomonas, изолированных из воды и донных осадков озера Байкал

Место отбора проб Количество выделенных культур Преобладающие виды, отнесенные к роду Pseudomonas Процент встречаемости видов от общего количества выделенных штаммов

мыс «Березовый» 60 Р. flúorescens 20

P. aeruginosa 19

P. putida 18

P. mendocina 14

P. alcaligenes 12

P. cepacia (Burkholderia cepacia) 9

P.fragi 8

разрез Елохин -Давша 17 P. fluorescens 46

P. putida 40

P. aeruginosa 14

разрез с. Болдаково -Ольхонские ворота 13 P. aeruginosa 38

P. fluorescens 26

P. putida 22

P. cepacia (Burkholderia cepacia) 14

окончание табл.

донные 57 P. aeruginosa 31

осадки P. fluorescens 8

района р. P. putida 9

Селенги P. diminuta (Brevundimonas diminuta) 19

P. cepacia (Burkholderia cepacia) 17

P. caiyophylli (Burkholderia caryophylli) 16

донные 53 P. aeruginosa 52

осадки P. alcaligenes 21

района БЦБК P. cepacia (Burkholderia cepacia) 27

Типичным представителем рода Pseudomonas является Pseudomonas aemginosa (Schoeter 1872) Migula 1900, вид, распространенный повсеместно (рис. 4.1., увеличение 7,05 х 104). Средние размеры 2 х 0,6 мкм; в нативных препаратах подвижны, имеют один жгутик. В мазках клетки расположены одиночно, парно либо в виде коротких цепочек. Данный вид растет в широком диапазоне температур (+4 - +42°С), что указывает на способность длительно сохраняться в окружающей среде. К числу характерных для P. aeruginosa культуральных особенностей относятся специфических запах и металлический блеск колоний. Большинство штаммов выделяет в среду пиоцианин, а также другие пигменты феназинового ряда (гемипиоцианин, оксихлорорафин, аэругинозины).

Рис. 4. Морфология бактерий рода Pseudomonas, изолированных из озера Байкал (4.1. - P. aeruginosa; 4.2. - P. fluorescens; 4.3. - P. putida; сканирующая электронная микроскопия)

Другим распространенным видом данного рода в озере является Pseudomonas fluorescens Migula 1895 [Migula W., 1894]. Средние размеры 1,5 x 0,6 мкм (рис. 4.2., увеличение 7,4 х 104). Ранее, сложная внутренняя структура P. fluorescens - этого крупнейшего вида флюоресцирующей группы, была отражена в 9 - м издании определителя Берджи, согласно которому многочисленные разжижающие желатин флуоресцирующие сапрофиты входили в состав P. fluorescens - группы, в качестве пяти его биоваров. Эти отдельные биовары характеризуются, в свою очередь, значительной

иенетической и фенотипической неоднородностью. Многообразие выделяемых из природы и описанных в литературе флюоресцирующих микроорганизмов рода Pseudomonas не исчерпывается приведенными в определителе Берджи характеристиками биоваров, что порождает трудности в их идентификации. В современной систематике P. fluorescens - группа содержит 48 видов, а сам вид Р. fluorescens содержит 7 биотипов.

Pseudomonas putida (Trevisan, 1889) Migula, 1895 - вид, который также как и P. aeruginosa, P. fluorescens - наиболее часто выделяется из воды и донных осадков оз. Байкал, по сравнению с другими видами рода Pseudomonas (рис. 4.3; увеличение 1,04 х 104). Средние размеры 2,5 х 0,5 мкм. Fie разжижающие желатин сапрофитные флюоресцирующие бактерии рода Pseudomonas описаны под видовыми названиями "P. striata", "P. ovalis", "P. incognita", "P. nigosa", "P. convexa", "P. eisenbergii", "P. mildenbergii", "P. nonliquefaciens", "P. syncyanea" и др. Их объединение было существенным шагом вперед, однако гетерогенность «укрупненного» вида P. putida была очевидна уже в момент его создания. Эта гетерогенность нашла отражение в структуре вида, в его состав входят биовары Л и В. В современной систематике вид P. putida содержит три биоварианта.

Таким образом, проведенные исследования биоразнообразия бактерий рода Pseudomonas показали, что согласно современной систематике, в озере Байкал преобладают представители пяти филогенетических групп рода Pseudomonas, из семи, отраженных в «Списке бактериальных названий с положением в номенклатуре» (List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), что позволяет говорить о доминировании бактерий рода Pseudomonas в культивируемом микробном сообществе озера Байкал, а с учетом данных литературы в озере Байкал установлены представители всех семи филогенетических групп.

4.2. Ферментативная активность природных штаммов Pseudomonas

Изучение ферментативной активности косвенно позволяет судить о продукционно-деструкционных процессах, происходящих в озере Байкал, а также о степени участия Pseudomonas в них. Биохимическая активность была изучена для 200 байкальских штаммов, отнесенных к роду Pseudomonas. В проведенных исследованиях изучали потенциальную способность микроорганизмов продуцировать следующие ферменты: протеиназы, липазы, фосфатазы, лецитиназы, как основных, относящихся к классу гидролаз. В результате проведенных исследований установлено, что из 200 исследованных штаммов 20% культур активны по всем исследуемым ферментам, 53% штаммов проявляют липазную активность, 65% штаммов - фосфатазную, 65% и 68% штаммов - протеазную и лецитиназную активности, соответственно. Пять процентов исследуемых штаммов не проявили никакой активности, 15% проявили только фосфатазную активность. Проявление только фосфатазной активности обусловлено физиолого-биохимическими особенностями самих бактерий, отнесенных к роду Pseudomonas, т.к. многие виды, например, Р.

putida не обладает способностью гидролизовать желатину и образовывать лецитиназу (дифференциально-диагностический признак). Необходимо отметить, что ферментативная активность исследуемых штаммов зависит от района выделения бактерий. Наиболее активные бактерии рода Pseudomonas выделены из воды мелководной зоны Южного Байкала и донных осадков, менее активны бактерии, изолированные из воды Северной котловины.

В результате проведенных исследований установлено, что бактерии, отнесенные к роду Pseudomonas, выделенные из озера Байкал принимают активное участие в деструкционных процессах, протекающих в озере. Меньшую активность культур, выделенных из северной части Байкала, можно объяснить малым содержанием органического вещества, преобладанием низких температур, что в свою очередь сказывается на видовом составе микроорганизмов. Большая активность бактерий, выделенных из донных осадков, объясняется тем, что содержание лабильного органического вещества в них составляет 20 - 25% от общего количества Сорг [Намсараев Б. Б., Земская Т. И., 2000]. Для мелководной зоны озера Байкал характерна более высокая температура, чем в пелагиали Северного Байкала. Возможно, этот фактор косвенно определяет биохимическую активность тестируемых штаммов, выделенных из этой зоны. В целом, культивируемые бактерии, отнесенные к роду Pseudomonas, показали высокую биохимическую активность таких экзоферментов как: протеаза, липаза, фосфатаза, фосфолипаза.

4.3. Молекулярно-биологический анализ культивируемых бактерий рода Pseudomonas

Молекулярно-биологический метод, основанный на анализе последовательностей гена 16S рРНК, в настоящее время является основным для выявления некультивируемых бактерий в различных экосистемах, а также для определения и уточнения таксономического положения культивируемых микроорганизмов [Белькова Н. Л., Парфенова В. В., 2003; Белькова Н. Л., Дрюккер В. В., 2003].

Для подтверждения таксономического положения изолированных из оз. Байкал культивируемых бактерий, отнесенных к Pseudomonas, были проведены исследования с использованием молекулярно-биологического подхода, основанного на определении нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Для исследования были отобраны 8 культивируемых штаммов, изолированных из воды мелководной зоны оз. Байкал. Выделенные штаммы были отнесены к роду Pseudomonas на основе морфологических, тинкториальных, физиолого-биохимических признаков. Результаты поиска гомологичных последовательностей в EMBL-банке показали, что процент гомологии культивируемых Pseudomonas и последовательностей из банка данных составляет от 93 до 100% (табл.2).

Таблица 2

Сравнительные данные результатов морфо-биохимических тестов и секвенирования гена 16S рРНК культивируемых Pseudomonas

№ Результат Номер в Результаты секвенирования Процент

штамма морфо- банке гена 16SpPHK гомологии

биохимических данных

тестов

10 Pseudomonas sp. AF251335 Pseudomonas sp. 100

AF251337 Pseudomonas sp. 100

AFI 00322 Pseudomonas brassicacearum 100

12 Pseudomonas sp. AF123092 Xanthomonas campestri 98,63

AFI 23091 Xantomonas axonopodi 98,63

AF123088 Xantomonas vesicator 98,63

15 Pseudomonas AB041885 Pseudomonas psychrophila 100

putida D84027 Pseudomonas taerolens 98,62

AF251335 Pseudomonas sp. SV 5 98,62

16 Pseudomonas AF251335 Pseudomonas sp. 100

aeruginosa AF251337 Pseudomonas sp. 100

AFI00322 Pseudomonas brassicacearum 100

17 Pseudomonas sp. AF251335 Pseudomonas sp. 99,31

AF251337 Pseudomonas sp. 99,31

AFI00322 Pseudomonas brassicacearum 99,31

22 Pseudomonas D49422 Brevundimonas diminuta 93,15

diminuta

34 Pseudomonas AF134704 Pseudomonas fluorescens 97,24

fluorescens AF134705 Pseudomonas fluorescens 97,24

AY035996 Pseudomonas lini 97,24

39 Pseudomonas sp. AF251337 Pseudomonas sp. 96

AFI00322 Pseudomonas brassicacearum 96

Родовая принадлежность исследуемых штаммов бактерий, изолированных из воды оз. Байкал, определенная классическими микробиологическими методами, совпадает с таковой при определении ее молекулярно-биологическими методами. Из восьми штаммов, определенных как Pseudomonas sp, только штаммы № 12 и 22 имеют последовательности гомологичные бактериям, относящимся к родам Xanthomonas и Brevundimonas. Проанализированная последовательность штамма № 12 имеет гомологию 98,63% с последовательностью, зарегистрированной в банке данных как Xanthomonas. Род Xanthomonas, вместе с родом Pseudomonas входит в класс Gammaproteobacteria, уровень гомологии между видами этих родов составляет 97,3 - 97,6% [Anzai Y. et al., 2000]. Все они обладают полярными жгутиками, являются хемоорганотрофами, строгими аэробами, в подавляющем

большинстве оксидазоположительны. Фенотипические отличия представителей рода Xanthomonas немногочисленны.

Штамм № 22 микробиологическими методами был определен как Pseudomonas diminuta. Последовательность данного штамма имеет 93,15% уровень гомологии с последовательностью из банка данных, зарегистрированной как Brevundimonas diminuta. Как уже упоминалось, раннее вид P. diminuta в определителе Берджи соответствовал роду Pseudomonas, т.е. применение микробиологических методов для определения таксономической принадлежности исследуемого штамма коррелирует с определением молекулярными методами.

Таким образом, проведенные исследования показали, что применение, как классических микробиологических методов, так и методов молекулярно-биологических совпадает при определении родового положения культивируемых микроорганизмов. Определение микроорганизмов на основе проанализированного участка длиной 250 п.н. позволяет говорить о принадлежности культивируемых микроорганизмов к той или иной филогенетической группе. Для определения до вида необходимо анализировать более длинный участок. Использование классических микробиологических методов позволяет определить не только таксономическую характеристику, но и физиолого-биохимические свойства изучаемых бактерий.

ГЛАВА 5. Роль микроорганизмов рода Pseudomonas в биодеградации сложных органических соединений

В последние десятилетия возрос интерес к микроорганизмам-деструкторам различных высокомолекулярных соединений. Загрязнение окружающей среды нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) является проблемой мирового масштаба. Озеро Байкал, как известно, является крупнейшим на планете резервуаром пресной воды, внесенном в список ЮНЕСКО, как участок мирового наследия. Поэтому, изучение происходящих в нем процессов, отслеживание возможных изменений и поиски их причин были и остаются в числе важнейших задач. В настоящее время разрабатываются микробиологические методы, основанные на использовании ферментативной активности микроорганизмов-деструкторов, использующих высокомолекулярные соединения в качестве единственного источника углерода и энергии.

Изучение и выделение микроорганизмов рода Pseudomonas, обладающих углеводородокисляющей активностью, позволит оценить роль данных бактерий в процессах очищения и поддержания чистоты байкальских вод. Экспериментальная работа по деградации полициклических ароматических углеводородов (пирена, фенантрена и флуорантена), природных компонентов нефти, была проведена для культур Pseudomonas, выделенных из воды и донных осадков озера Байкал. Эти полициклические углеводороды преобладают в твердой фазе аэрозоля, собранного в зимний период, весной, в период таяния снега, возможен залповый вынос аккумулированных в снежном

покрове ПАУ в прибрежные воды с потоками снеговой воды. В то же время, в водах озера и его донных осадках обнаружен низкий уровень концентрации ПАУ (не более 0,1 нг/л и 10 нг/л соответственно) [Горшков А. Г. и др., 1998]. Это, возможно, связано с активной деградацией данных веществ микроорганизмами.

В результате проведенных исследований установлено, что в присутствии бактерий рода Pseudomonas, в условиях модельного эксперимента, биодеградация ПАУ составляет 20 - 30%, за исключением штамма № 43, отнесенного к Pseudomonasputida, где конверсия не превышает 3,1%, причем пирен в данных условиях сохранился полностью. Способность селективного действия микроорганизмов на ПАУ наиболее четко прослеживается для штамма № 22, отнесенного к Pseudomonas aeruginosa, в опытах с которым флуорантен разрушается в 2-3 раза быстрее, чем фенантрен и пирен. Следует отметить, что уровень биодеградации фенантрена сопоставим с таковым для флуорантена и пирена только в присутствии культуры № 33 (Pseudomonas sp.), а под влиянием штамма № 20 (Pseudomonas fluorescens) сопоставима только с уровнем разрушения флуорантена и превышает уровень пирена (рис. 5).

На основании результатов модельного эксперимента следует вывод о максимальной биоустойчивости в присутствии байкальских микроорганизмов фенантрена из исследованных ПАУ: фенантрен - флуорантен - пирен. Обнаруженная селективная биодеградация ПАУ может быть причиной более высоких концентраций фенантрена в байкальских водах - 2,5-20 нг/л, по сравнению с концентрациями флуорантена и пирена - < 2,5 нг/л.

*3 S

30 -

25 • —

19 ••> 1

10 *

5 Fl ^

№14 №20 №22 №33 № 43 контроль

штшимы

Рис. 5. Деградация ПАУ бактериями рода Pseudomonas в модельном эксперименте (процент деградации ПАУ, суммарные количества фенантрена, флуорантена и пирена)

С учетом результатов исследования процесса биодеградации ПАУ, исследованные штаммы байкальских микроорганизмов могут быть расположены в следующий ряд активности: 22 = 20 ~ 33 ~ 14. Наиболее

активным штаммом, по отношению к указанным полициклическим ароматическим углеводородам, является штамм № 22, отнесенный к Pseudomonas aeruginosa, менее активным оказался штамм Pseudomonas putida (рис. 6).

№14 №20 №22 №43 контроль

штяммы

[□ фсиантрси ■флуорвнтсн Опирен !

Рис. 6. Процент деградации индивидуальных соединений бактериями рода Pseudomonas, в условиях эксперимента

Выводы:

1. Впервые проведена систематизированная работа по изучению биоразнообразия и идентификации бактерий рода Pseudomonas в озере Байкал

2. Бактерии рода Pseudomonas доминируют в гетеротрофном сообществе микроорганизмов озера Байкал. В воде и донных осадках обнаруживаются представители 5 из 7 филогенетических групп рода Pseudomonas, установленных современной систематикой: P. aeruginosa, P. alcaligenes, P. mendocina; P. putida; P. fluorescens; P. stutzeri; P.fragi.

3. Исследованиями установлено, что пространственное распределение бактерий рода Pseudomonas различно в Южном, Среднем и Северном Байкале. Количество этих микроорганизмов в воде Северного Байкала составляет 21% от количества культивируемых гетеротрофов, в Среднем - 22% - 48%, в Южном -35%-38%.

4. Сезонная динамика бактерий исследуемого рода отличается от динамики развития гетеротрофов В поверхностном слое воды максимум развития микроорганизмов рода Pseudomonas отмечен в июне и в ноябре. Доминирование псевдомонад в психрофильном сообществе гетеротрофов наблюдается в апреле - мае, а также в октябре - ноябре.

5. В донных осадках придельтового района р. Селенги установлено от 18% до 47% бактерий рода Pseudomonas от количества гетеротрофов В осадках, отобранных в районах, граничащих с районом дельты, отмечено от 62 до 88%

Pseudomonas, в районе влияния БЦБК количество Pseudomonas не превышает 20% от числа гетеротрофов, т. е. бактерии рода Pseudomonas доминируют, в основном, в чистых районах акватории озера, не подверженных влиянию антропогенных факторов.

6. Природные штаммы Pseudomonas, изолированные из воды и донных осадков озера Байкал, проявляют высокую биохимическую активность таких ферментов как: протеаза - 65%, липаза — 53%, фосфатаза — 65%, фосфолипаза «С» — 68% штаммов, соответственно.

7. Культивируемые бактерии рода Pseudomonas способны использовать полициклические ароматические углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии; в присутствии бактерий рода Pseudomonas, в условиях модельного эксперимента, биодеградация ПАУ составляет 20 - 30%. Данные микроорганизмы, обладая значительным потенциалом в процессах биодеградации органополлютантов, участвуют в процессах сохранения чистоты байкальских вод.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Павлова О. Н., Дрюккер В. В., Парфенова В. В., Косторнова Т. Я. Характеристика бактерий рода Pseudomonas, выделенных из грунтов дельты р. Селенги // Интеграция фундаментальной науки и высшей школы в устойчивом развитии Сибири: Материалы докладов. - Иркутск, 2001. - С. 89 - 90.

2. Павлова О. Н., Дрюккер В. В., Парфенова В. В., Косторнова Т. Я. К вопросу о распространении бактерий p. Pseudomonas в грунтах дельты р. Селенги // Экология Сибири, Дальнего Востока и Арктики: Материалы междун. конф. - Томск, 2001. С. 116.

3. Павлова О. Н., Дрюккер В. В. Систематика бактерий рода Pseudomonas, выделенных из озера Байкал //Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно - Сибирском регионе: Материалы научно - практ. конф. - Иркутск, 2002. С. 48 - 50.

4. Drucker V. V., Parfenova V. V., Kostomova Т. Y., Pavlova О. N.. Tyorkina I. A., Bel'kova N. L. Biodiversity of microbial community in Lake Baikal // Proceedings of the VIII INTECOL International Congress of ecology. - Korea, 2002. -P. 57.

5. Pavlova O. N., Parfenova V. V., Timoshkin O. A., Drucker V. V. Temperature as an ecological factor affecting seasonal dynamics of bacteria genus Pseudomonas in the shallow zone of Southern Lake Baikal // Ancient Lakes: speciation, development in time and space, natural history: Third International Symposium. - Irkutsk, 2002. -P. 133.

6. Pavlova O. N., Drucker V. V. Bacteria of genus Pseudomonas in microbial community of Lake Baikal // lst FEMS congress of European microbiologist. -Ljubljana,2003.-P. 229.

7. Павлова О. Н. Бактерии рода Pseudomonas в озере Байкал // Микроорганизмы в системах озер, рек и водохранилищ: Материалы

международного симпозиума по микробиологии. - Иркутск, 2003. - С. 119 -120.

8. Павлова О. Н.. Парфенова В. В., Земская Т. И., Хлыстов О. М, Суслова М Ю. Изучение бактерий-деструкторов нефти, выделенных из воды и донных осадков озера Байкал // Перспективы нефтегазоносности Байкала и Западного Забайкалья: Материалы научно-практ. конф. - Улан-Удэ, 2003. - С. 96.

9. Павлова О. Н.. Дрюккер В. В., Косторнова Т. Я., Никулина И. Г. Особенности распространения бактерий рода Pseudomonas в озере Байкал // Сибирский экологический журнал. - 2003, № 3. -С. 267 - 272.

10. Азарова И.Н., Парфенова В. В., Барам Г. И., Теркина И. А., Павлова О. Н., Суслова М. Ю. Деградация бис-(2-этилгексил) фталата микроорганизмами воды и осадков реки Селенги и озера Байкал в условиях модельного эксперимента. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т.39, № 6. -С.665-669.

Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н., профессору, чл.-корр. РЭА В. В. Дрюккеру, зав. лабораторией водной микробиологии, к.б.н. В. В. Парфеновой за поддержку, внимание и помощь в проводимых исследованиях, к.б.н. Т. И. Земской, к.б.н. О. М. Тимошкину, к.х.н. А. Г. Горшкову, ст.н.с. А. Л. Верещагину, м.н.с. Н. Л. Бельковой, рук. группы О. М. Хлыстову и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии за оказанную поддержку и сотрудничество при выполнении работ.

Подписано к печати 26.04.2004 г. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 272. Издательство Института географии СО РАН 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1

1-974 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлова, Ольга Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. История изучения бактерий рода Pseudomonas.

1.2. Характеристика представителей рода Pseudomonas.

1.3. Современная систематика бактерий рода Pseudomonas.

1.4. Микробиологические исследования на Байкале.

1.5.Экологические факторы, определяющие развитие микроорганизмов в оз. Байкал.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

ГЛАВА 3. Пространственное распределение и сезонная динамика бактерий рода Pseudomonas в воде и осадках озера Байкал.

3.1. Пространственное распределение представителей рода Pseudomonas в глубоководной зоне.

3.2. Сезонная динамика бактерий рода Pseudomonas в мелководной зоне.

ГЛАВА 4. Биоразнообразие, физиолого-биохимическая характеристика бактерий рода Pseudomonas, изолированных из озера

Байкал.

4.1. Биоразнообразие бактерий рода Pseudomonas.

4.2. Ферментативная активность природных штаммов Pseudomonas.

4.3. Молекулярно-биологический анализ культивируемых бактерий рода Pseudomonas.

ГЛАВА 5. Роль микроорганизмов рода Pseudomonas в биодеградации сложных органических соединений.

5.1. Деградация углеводородов бактериями рода Pseudomonas.

5.2. Деградация бис-(2-этилгексил)фталата бактериями рода Pseudomonas.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бактерии рода Pseudomonas в микробном сообществе озера Байкал"

Аэробные бактерии рода Pseudomonas - большая гетерогенная группа микроорганизмов, впервые описанная Migula в 1894 году [Migula W., 1895] для неспорообразующих грамотрицательных бактерий с полярными жгутиками.

Данные микроорганизмы широко населяют биосферу и принимают активное участие в процессах минерализации органических соединений, очищения окружающей среды от загрязнения. Они являют собой пример истинного космополитизма, в основе которого лежит их высокая биохимическая лабильность, обеспечивающая им приспособляемость к разнообразным экологическим условиям.

Паллерони Н. в 1984 году разделил род Pseudomonas на 5 филогенетических групп, основываясь на изучении рРНК - ДНК гибридизации [Palleroni N.J., 1984]. Всестороннее изучение, особенно с применением молекулярно-биологического метода на основе анализа последовательностей 16S рРНК, сыграло решающую роль в определении таксономической структуры рода Pseudomonas и его места в системе микробного мира. Многие виды, первоначально описанные как относящиеся к роду Pseudomonas, были реклассифицированны в другие рода и группы.

В современной систематике, отраженной в «Списке бактериальных названий с положением в номенклатуре» [List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST] род Pseudomonas занимает следующее положение: «Cellular organisms; Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Pseudomonas и делится на 7 основных филогенетических групп: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas pertucinogena, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas syringae группы.

Изучение физиолого-биохимических свойств культивируемых бактерий рода Pseudomonas позволяет получить новые данные об их природных возможностях. Кроме этого, сохранение природных экосистем и микробного разнообразия в настоящее время является одной из актуальных задач микробной экологии [Lemke M.J., Leff L.G., 2000].

Озеро Байкал - как объект исследования уникальное, олиготрофное озеро, возраст которого 20-30 млн. лет.

Водная толща озера Байкал заселена большим количеством микроорганизмов, которые играют важную роль в процессах круговорота веществ и энергии. Микроорганизмы занимают ведущее место в процессах самоочищения озера, минерализуя органические вещества, участвуя в круговороте биогенных элементов. Активность бактерий определяется экологическими условиями их существования: составом и концентрацией органических и минеральных веществ, температурой, рН и др.

Своеобразие температурного режима оз. Байкал, необычайная глубина озера и резкое преобладание глубинной зоны над мелководьями, олиготрофность озера, высокое содержание кислорода во всей толще воды — создают особенные экологические условия для жизнедеятельности микроорганизмов.

В озере Байкал бактерии рода Pseudomonas изучены рядом авторов в составе так называемых «физиологических групп» [Кузнецов С.И., 1957; Романова А.П., 1958; Младова Т.А., 1971; Максимова Э.А., 1972; Лаптева Н.А., 1990]. В данных работах показано, что большую часть микробного сообщества воды и донных осадков озера Байкал составляют, главным образом, неспрообразующие палочки. Проведенные авторами исследования лишь косвенно затрагивают вопросы видового разнообразия Pseudomonas в озере Байкал. Многие виды, первоначально описанные ими как относящиеся к роду Pseudomonas, в настоящее время, согласно современной систематике перенесены в другие рода и группы. Анализ работ показал, что в целом доминирующая группа микроорганизмов изучена недостаточно.

В последние десятилетия возрос интерес к микроорганизмам-деструкторам различных высокомолекулярных соединений. Загрязнение окружающей среды нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) является проблемой мирового масштаба. Поэтому, в настоящее время разрабатываются микробиологические методы, основанные на использовании ферментативной активности микроорганизмов-деструкторов, использующих высокомолекулярные соединения в качестве единственного источника углерода и энергии. Микробиологическая деградация ПАУ является основным процессом, приводящим к очистке от этих соединений водоемов и почв. Большим катаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Pseudomonas. Псевдомонады способны полностью утилизировать или частично трансформировать такие соединения как фенантрен, флуорантен, пирен и др. [Cerniglia С.Е., 1992; Кошелева И.А., 2000; Звягинцева И.С., 2001].

Изучение и выделение микроорганизмов рода Pseudomonas, обладающих углеводородокисляющей активностью, из озера Байкал позволит оценить роль данных бактерий в процессах очищения и поддержания чистоты байкальских вод.

Цель настоящей работы - изучить роль бактерий рода Pseudomonas в микробном сообществе оз. Байкал и определить степень участия их в процессах биодеградации углеводородов.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Изучить биоразнообразие бактерий рода Pseudomonas в озере Байкал.

2. Исследовать сезонную, межгодовую динамику и пространственное распределение доминирующих видов Pseudomonas.

3. Определить ферментативную активность бактерий Pseudomonas.

Основные положения, выносимые на защиту:

Научная новизна: в настоящей работе впервые проведено комплексное изучение доминирующей в микробном сообществе оз. Байкал группы микроорганизмов - бактерий рода Pseudomonas. Из озера Байкал было выделено и идентифицировано 200 чистых культур, отнесенных к роду

Pseudomonas, с учетом экологических особенностей водоема. Согласно современной систематике видовой состав рода представлен пятью основными филогенетическим группами из семи. Изучена сезонная, межгодовая динамика бактерий исследуемого рода, а также их физиолого-биохимическая и углеводородокисляющая активность.

Практическая значимость работы: Полученные данные об экологических особенностях, видовом составе культивируемых видов рода Pseudomonas, являются частью работ по изучению состава и функционирования микробного сообщества оз. Байкал в целом и могут быть использованы при организации экологического мониторинга. Исследуемые бактерии, являются активными биодеструкторами как простых, так и сложных высокомолекулярных соединений и могут быть использованы в биологической очистке сточных и природных вод.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Павлова, Ольга Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведена систематизированная работа по изучению биоразнообразия и идентификации бактерий рода Pseudomonas в озере Байкал.

2. Бактерии рода Pseudomonas доминируют в гетеротрофном сообществе микроорганизмов озера Байкал. В воде и донных осадках обнаруживаются представители 5 из 7 филогенетических групп рода Pseudomonas, установленных современной систематикой: P. aeruginosa, P. alcaligenes, Р. mendocina; P. putida', P. fluorescens', P. stutzeri', P.fragi.

4. Сезонная динамика бактерий исследуемого рода отличается от динамики развития гетеротрофов. В поверхностном слое воды максимум развития микроорганизмов рода Pseudomonas отмечен в июне и в ноябре. Доминирование псевдомонад в психрофильном сообществе гетеротрофов наблюдается в апреле - мае, а также в октябре — ноябре.

5. В донных осадках придельтового района р. Селенги установлено от 18% до 47%) бактерий рода Pseudomonas от количества гетеротрофов. В осадках, отобранных в районах, граничащих с районом дельты, отмечено от 62 до 88% Pseudomonas, в районе влияния БЦБК количество Pseudomonas не превышает 20%) от числа гетеротрофов, т. е. бактерии рода Pseudomonas доминируют, в основном, в чистых районах акватории озера, не подверженных влиянию антропогенных факторов.

6. Природные штаммы Pseudomonas, изолированные из воды и донных осадков озера Байкал, проявляют высокую биохимическую активность таких ферментов как: протеаза - 65%, липаза - 53%, фосфатаза - 65%, фосфолипаза «С» - 68% штаммов, соответственно.

7. Культивируемые бактерии рода Pseudomonas способны использовать полициклические ароматические углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии; в присутствии бактерий рода Pseudomonas, в условиях модельного эксперимента, биодеградация ПАУ составляет 20 — 30%. Данные микроорганизмы, обладая значительным потенциалом в процессах биодеградации органополлютантов, участвуют в процессах сохранения чистоты байкальских вод.

Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н., профессору, чл.-корр. РЭА В. В. Дрюккеру. Выражаю искреннюю признательность зав. лабораторией водной микробиологии, к.б.н. В. В. Парфеновой за поддержку, внимание и помощь в проводимых исследованиях, к.б.н. Т. И. Земской, к.б.н. О. М. Тимошкину, к.х.н. А. Г. Горшкову, ст.н.с. А. Л. Верещагину, м.н.с. Н. Л. Бельковой, рук. группы О. М. Хлыстову и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии за оказанную поддержку и сотрудничество при выполнении работ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной систематизированной работы по изучению бактерий рода Pseudomonas установлено, что бактерии исследуемого рода доминируют в гетеротрофном микробном сообществе озера Байкал. В воде и донных осадках озера обнаруживаются представители 5 из 7 филогенетических групп рода Pseudomonas, установленных современной систематикой: Р. aeruginosa, P. alcaligenes, P. mendocina', P. putida', P. fluorescens', Pseudomonas stutzeri; Pseudomonas fragi, а с учетом данных литературы в озере Байкал установлены представители всех семи филогенетических групп.

Пространственное распределение бактерий рода Pseudomonas находится в зависимости от экологических факторов: места отбора проб, сезонных закономерностей, глубины водной толщи. Установлено, что в Северном Байкале бактерии рода Pseudomonas, так же как и гетеротрофные микроорганизмы, преобладают либо в поверхностном слое до глубины 50 м, либо в придонных слоях. Развитие гетеротрофов именно на этой глубине, по-видимому, связано с концентрацией органического вещества, которое образуется в результате массового отмирания холодолюбивого комплекса фитопланктона. Количество микроорганизмов рода Pseudomonas в воде Северного Байкала, в среднем, составляет 21% от количества культивируемых гетеротрофов. В Среднем Байкале бактерии исследуемого рода занимают доминирующее положение в пробах воды, отобранных на разрезе с. Болдаково - Ольхонские ворота, где установлено 48% и 30% данных микроорганизмов в июне 2002 г. и сентябре 2003 г., соответственно. На разрезе отмечено явное преобладание флуоресцирующих бактерий рода Pseudomonas, с сине-зеленым диффундирующим в питательную среду пигментом. На стандартных гидрологических разрезах м. Ухан - м. Тонкий, Анга — Сухая выявлено 20% и 22% бактерий рода Pseudomonas от числа культивируемых гетеротрофов. В Южном Байкале бактерии рода Pseudomonas доминируют в пробах воды, отобранных на разрезах п. Маритуй - р. Солзан, м. Кадильный - р. Мишиха

35 и 38%, соответственно. Бактерии рода Pseudomonas выявлены в поверхностном слое, на глубине 50 м, 800 м. Таким образом, установлено, что бактерии исследуемого рода распределены в Байкале неравномерно. Максимальное их количество выделяется в Южном и Среднем Байкале. Представители рода Pseudomonas в Северном Байкале выделяются, в основном, из эпилимниона, в Южном и Среднем - из эпилимниона, зоны температурного скачка и гиполимниона.

В донных осадках придельтового района р. Селенги отмечено от 18% до 47% бактерий рода Pseudomonas от количества гетеротрофов. В осадках, отобранных в районах граничащих с районом дельты, зафиксировано от 62,4 до 88% Pseudomonas, в районе влияния БЦБК количество Pseudomonas не превышает 20% от числа гетеротрофов, т. е. бактерии рода Pseudomonas доминируют, в основном, в чистых районах акватории озера, не подверженных влиянию антропогенных факторов.

Изучение сезонной динамики бактерий рода Pseudomonas в мелководной зоне Южного Байкала позволило установить их численность в различные сезоны года, которая косвенно освещает роль микроорганизмов в круговороте органического вещества. Сезонная динамика развития Pseudomonas в мелководной зоне озера Байкал отличается от таковой гетеротрофных микроорганизмов, которая в поверхностных слоях воды имеет три подъема: весенний, летний, осенний. В развитии Pseudomonas в поверхностном слое наблюдается два подъема: в июне (летний) и в ноябре (осенний). Динамика развития Pseudomonas в мелководной зоне озера Байкал тесно связана как с температурным, так и с другими экологическими факторами. В сезонном аспекте доминирование псевдомонад в поверхностном слое воды наблюдается в мае - 84% от количества гетеротрофов, а также ноябре, когда численность бактерий рода Pseudomonas составляет 93% - на глубине 7 и 14 м, 96 % - в поверхностном слое. Температура воды + 4°С благоприятствует развитию микроорганизмов рода Pseudomonas, доминирующих в психрофильном микробном сообществе. В летние месяцы в поверхностном горизонте и в зимний период в подледных сообществах преобладают пигментные формы микроорганизмов, в придонных слоях - бактерии рода Bacillus. В летние месяцы псевдомонады доминируют в среднем горизонте; в поверхностном слое их количество составляет 32 - 53%, в придонных — 5 - 15 %, соответственно от количества гетеротрофов.

Установлено, что бактерии рода Pseudomonas, изолированные из воды и донных осадков озера Байкал, показали высокую биохимическую активность таких экзоферментов как: протеаза, липаза, фосфатаза, фосфолипаза. Липазной активностью обладают 53% штаммов, протеазной - 65% культур. Фосфолипазу «С» и фосфатазу образуют 68 и 65% штаммов, соответственно, что позволяет говорить об активном участии данных микроорганизмов в деструкционных процессах, протекающих в озере.

Также, проведенные исследования показали, что культивируемые бактерии рода Pseudomonas, выделенные из донных осадков озера Байкал, способны использовать полициклические ароматические углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии. Степень конверсии в условиях модельного эксперимента составляет 20 - 30%, за исключением штамма, отнесенного к Pseudomonas putida, где конверсия не превышает 3,1%, причем, пирен в данных условиях сохранился полностью. Способность селективного действия микроорганизмов на ПАУ наиболее четко прослеживается для штамма, отнесенного к Pseudomonas aeruginosa, в опытах с которым флуорантен разрушается в 2-3 раза быстрее, чем фенантрен и пирен. Следует отметить, что уровень биодеградации фенантрена сопоставим с таковым для флуорантена и пирена только в присутствии культуры Pseudomonas sp., а под влиянием штамма, идентифицированного как Pseudomonas fluorescens, сопоставим только с уровнем разрушения флуорантена и превышает уровень пирена. Наиболее активным штаммом, по отношению к указанным полициклическим ароматическим углеводородам, является штамм, отнесенный к Pseudomonas aeruginosa, менее активным оказался штамм, идентифицированный как Pseudomonas putida

Исследуемые микроорганизмы, несомненно, обладают высоким катаболическим потенциалом в биодеградации органополлютантов, обеспечивая чистоту байкальских вод, а само озеро Байкал может стать источником для получения высокоэффективных, лабильных штаммов биодеструкторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Ольга Николаевна, Иркутск

1. Андрусенко М. Я. Об окислении углеводородов различными физиологическими группами углеводородокисляющих микроорганизмов. // Биология и физиология микроорганизмов. АН УССР.: Изд - во «Фан», 1967.

2. Барам Г. И., Азарова И. Н., Горшков А. Г., Верещагин А. Л., Ланг Б., Кирюхина Е. Д. //Журнал аналитической химии. 2000. Т. 55, № 8. - С. 834 -839.

3. Барышникова Л. М., Грищенков В. Г., Аринбасаров М. У., Шкидченко А. И., Воронин А. И. Биодеградация нефтепродуктов штаммами -деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37, № 5. - С. 542 - 550.

4. Башкатова Н. А., Северина Л. О. Экзолипазы некоторых видов Pseudomonas II Микробиология. 1978. Т. 47, № 2. - С. 234 - 240.

5. Белькова Н. Л., Денисова Л. Я., Манакова Е. Н., Зайчиков Е. В., Грачев М. А. Видовое разнообразие глубоководных микроорганизмов озера Байкал, выявленное по последовательностям 16S рРНК //Доклады академии наук. -1996. Т. 38, № 5. С. 692 - 695.

6. Белькова Н. JL, Парфенова В. В., Косторнова Т. Я., Денисова JI. Я., Зайчиков Е. Ф. Характеристика биоразнообразия микробного сообщества водной толщи озера Байкал //Микробиология. 2003. Т. 72, № 2. - С. 239 -249.

7. Белькова Н. JL, Дрюккер В. В., Хонг С. X., Ан Т. С. Изучение состава водного бактериального сообщества озера Байкал методом гибридизации IN SITU //Микробиология. 2003. Т. 72, № 2. - С. 282 - 283.

8. Вотинцев К. К. Гидрохимия озера Байкал //Тр. Байк. лимнол. ст. АН СССР.-1961. Т. 20.-302 с.

9. Вотинцев К.К., Мещерякова А. И., Поповская Г. И. Круговорот органического вещества в озере Байкал // Н.: Наука, 1975. — 189 с.

10. Верхозина В. А. Микробиальные процессы круговорота азота в Байкале //Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. Н.: Наука, 1985. С. 33-42.

11. Голдырев Г. С., Выхристюк Л. А., Лазо Ф. И. Донные отложения авандельты р. Селенги // Лимнология придельтовых пространств Байкала. Л.: Наука, 1971.-С. 43 -64.

12. Горбенко А. Ю., Дзюбан А. Н. О возможности количественного учета олигокарбофильного (олиготрофного) бактериопланктона на богатой питательной среде // Микробиология. 1992. Т. 61, № 3. - С. 531 - 532.

13. Горленко В. М, Дубинина Г. А., Кузнецов С. И. Экология водных микроорганизмов. М.: Наука, 1977.

14. Горшков А.Г., Маринайте И.И., Оболкин В.А., Барам Г.И., Ходжер Т.В. Полициклические ароматические углеводороды в снежном покрове южногопобережья оз. Байкал // Оптика атмосферы и океана. 1998. Т. 11, № 8. - С. 913-918.

15. Горшков А.Г., Маринайте И.И. Мониторинг экотоксикантов в объектах окружающей среды Прибайкалья // Оптика атмосферы и океана. 2003. Т. 13,№ 10.-С. 967-970.

16. Гранина Л.З., Каллендер Е., Ломоносов И.С., Мац В.Д., Голобокова Л.П. Аномалии состава поровых вод донных осадков Байкала // Геология и геофизика. 2001. Т. 42 (1-2). - С. 362-372.

17. Грищенков В. Г. и др. Деградация 3 хлорбензойной кислоты штаммом Pseudomonas putida II Микробиология. - 1983. Т. 52, № 5. - С. 771 - 775.

18. Громов Б. В., Павленко Т. В. Экология бактерий. Л.: Изд- во Ленингр. унта, 1989.

19. Денисова Л. Я., Белькова Н. Л., Тулухонов И. И., Зайчиков Е. В. Биоразнообразие бактерий на различных глубинах Южной котловины озера Байкал, выявленное по последовательностям 16S рРНК //Микробиология. — 1999. Т. 68, № 4. С. 475 - 483.

20. Заварзин Г. А. К понятию микрофлоры рассеяния в круговороте углерода //Журнал общей биологии. 1970. Т. 31, № 4. - С. 386 - 393.

21. Звягинцева И. С., Суровцева Э. Г., Поглазова М. Н., Ивойлов В. С., Беляев С. С. Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями //Микробиология. 2001. Т. 70, № 3. - С. 321 - 328.

22. Исаев В. П., Преснова Р. Н. Байкальская нефть. //Нефть и газ в современном мире: Геолого-экономические и социально-культурные аспекты: Материалы молодежной школы. Иркутск. - 2003. С. 45 -51.

23. Киприанова Е. А., Айзенман Б. Е., Бойко О.И. Ключ для определения сапрофитных флюоресцирующих бактерий рода Pseudomonas // Микробиологический журнал. 1973, № 3. - С. 367 - 369.

24. Киприанова Е. А., Бойко О. И. О возможности обнаружения пиоцианина в клетках Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 1980. Т. XLIX, № 4. -С. 555-559.

25. Киприанова Е. А., Бойко О. И. Чувствительность к ионам бария и ЭДТА как таксономический маркер рода Pseudomonas II Микробиология. 1992. Т. 61,№3.-С. 508-513.

26. Киприанова Е. А., Гарагуля А. Д., Леванова Г. Ф., Барышева Н. Н. Таксономическое изучение Pseudomonas fragi И Микробиология. 1988. Т. 57, №1.-С. 119- 125.

27. Кожов М. М. Очерки по Байкаловедению // Изд — во ИГУ. 1972.

28. Козлова Е. В. Влияние арсенита на физиологические и цитологические свойства штаммов Pseudomonas putida, деструкторов полициклических ароматических углеводородов. // Микробиология. 1999. Т. 68, № 2. - С. 179 -186.

29. Коронелли Т.В. Экофизиологические основы и практический опыт интродукции углеводородокисляющих бактерий в природные экосистемы // Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. Тез. докл. Москва, 1994. -С. 53.

30. Коронелли Т. В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. 1994. Т. 63, № 5. - С. 917 - 922.

31. Корте Ф. М. Экологическая химия. Основы и концепции. М.: Химия. — 1997.-395 с.

32. Кошелева И.А., Балашова Н.В., Измалкова Т.Ю., Филонов А.Е., Соколов С.Л., Слепенькин А.В., Воронин A.M. Деградация фенантрена мутантными штаммами-деструкторами нафталина //Микробиология. 2000. Т. 69, № 6. -С. 783-789.

33. Кузнецов С. И. Основные итоги и очередные задачи микробиологических исследований распада органического вещества в озерных иловых отложениях // Тр. Русск. гидробиол. об-ва. M.-JL - 1949. Вып. 1. - с. 73 -90.

34. Кузнецов С. И. Роль микроорганизмов в круговороте веществ // М.: Изд — во академии наук СССР. 1952.

35. Кузнецов С. И. Микробиологическая характеристика вод и грунтов Байкала. // Тр. Байкальск. лимнолог, ст. 1957. Т. XV. - С. 45 - 50.

36. Кузнецов С. И., Дубинина Г. А. Методы изучения водных микроорганизмов. М.: Наука. 1989. - 288 с.

37. Кузнецов С. И., Романенко В. И. Микробиологическое изучение внутренних водоемов. Лабораторное руководство. М.- Л.: Изд-во АН СССР. 1963.-129 с.

38. Кузнецов С. И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность. Л. -1970.-400 с.

39. Лаптева Н. А. Видовая характеристика олиготрофных бактерий в озере Байкал // Микробиология. 1990. - Т. 59, № 3 - с. 499 - 506.

40. Лаптева Н. А., Шестаков В. В., Косолапова Н. Г. К характеристике бактериопланктона Телецкого озера //Сибирский экологический журнал. -1998, №2.-С. 201 -210.

41. Лут Б. Ф. Геоморфология Прибайкалья и впадины озера Байкал. Н.: Наука.- 1978.-С. 54-76.

42. Лях С. П. Адаптация микроорганизмов к низким температурам. М.: Наука.- 1976.- 106 с.

43. Максимова Э. А., Максимов В. Н. Вертикальное распределение микробиального планктона в течение 1969 года в Южном Байкале // Микробиология. 1972. - Т. 41. - С. 896 - 902.

44. Медицинская микробиология. // Под ред. Покровского В. И., Поздеева О. К.- 1999.- 1200 с.

45. Мизандронцев И. Б. Химический состав грунтовых растворов и вод придонного слоя // Лимнология придельтовых пространств Байкала. Л.: Наука.-1971.-С. 64-81.

46. Милько Е. С., Мартынкина Л. П. Морфрлогические и физиолого — биохимические особенности диссоциантов Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 1996. Т. 65, № 3. - С. 352 - 356.

47. Младова Т. А. О качественном составе бактериоплактона //Тр. Лимнолог, ин-та СО АН СССР. 1971. Т. 12 (32).-С. 196-201.

48. Младова Т. А. Численность и биомасса бактериопланктона //Тр. Лимнолог, ин-та. 1971. Т. 12 (32).-С. 185- 196.

49. Намсараев Б. Б., Земская Т. И. Микробиологические процессы круговорота углерода в донных осадках озера Байкал //Новосибирск. 2000. -160 с.

50. Никитин Д. И., Циренина М. Л., Чумаков К. М. // Изв. АН. СССР. Сер. биол.- 1986.-№ 1.-С. 125.

51. Никитин Д. И., Вишневецкая О. Ю., Златкин И. В. Кластеризация олиготрофных микроорганизмов на основании устойчивости к антибиотикам и динамических характеристик мембран // Микробиология. -1988. Т. 57, № 2. - С. 262 - 267.

52. Николаев О. А., Проссер Дж. И., Паников Н. С. Внеклеточные факторы адаптации к неблагоприятным условиям среды в периодической культуре Pseudomonas fluorescens 11 Микробиология. 2000. - Т. 69, № 5. - С. 629 — 635.

53. Оборин А. А., Калачникова И. Г., Масливец Т. А., Базенкова И. Н., Плещеева О. В., Оглоблина А. И. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М.: Наука. - 1988. - С. 140 - 159.

54. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. /Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир, 1997. - 432 с.

55. Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий возбудителей внутрибольничных инфекций. // М.: 1987. - Мин - во здравоохранения РСФСР.

56. Павлова О. Н., Дрюккер В. В. Систематика бактерий рода Pseudomonas, выделенных из озера Байкал. //Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно Сибирском регионе. -Иркутск, 2002, с. 48 - 50.

57. Панасюк Е. Ю., Дрюккер В. В., Парфенова В. В., Косторнова Т. Я. Биоразнообразие и распределение бактерий семейства Enterobacteriacea и неферментирующей группы в озере Байкал // Сибирский экологический журнал. 2002. - Т. 9, № 4. - С. 485 - 490.

58. Парфенова В.В., Илялетдинов А. Н. Видовой состав фосформобилизующих микроорганизмов, выделенных из воды и грунтов Байкала //Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. -Новосибирск: Наука. 1985. - С. 55 - 63.

59. Парфенова В. В., Павлова О. Н., Теркина И. А., Суслова М.Ю., Косторнова Т. Я., Никулина И.Г., Синюкович В.Н., Сороковикова Л.М.1. С. 96.

60. Изучение микробного сообщества окисленного слоя донных осадков оз. Байкал в придельтовом районе реки Селенга // Водные ресурсы. 2004, № 5 (в печати)

61. Практикум по микробиологии. // Под ред. Егорова Н. С. М., 1976. - 307 с.

62. Разумов А. С. Микробиологический планктон воды. // Тр. Всесоюзн. гидробиол. об ва. - 1962, № 12. - С. 60 - 190.

63. Родина А. Г. Методы водной микробиологии. JL: Наука, 1965. 363 с.

64. Рождественский А., В., Чеботарев А. И. Статистические методы в гидрологии // JI.: «Гидрометеоиздат». 1974. - 424 с.

65. Романенко В. И. Микробиологические процессы продукции и деструкции органического вещества во внутренних водоемах. JL: Наука. 1985. - 295 с.

66. Романенко В. И., Кузнецов С. И. Экология микроорганизмов пресных водоемов //М.: изд-во «Наука». 1974. - 194 с.

67. Романова А. П. Сезонная динамика бактериопланктона, его горизонтальное и вертикальное распределение в Южной части Байкала // Изв. СО АН СССР. 1958, № 7. - С. 114 - 124.

68. Рубан Е. JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М.: Наука, 1986.

69. Смирнов В. В., Киприанова Е. А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук. Думка. 1990. - 264 с.

70. Сороковикова Я. М., Авдеев В. В. Первичная продукция и деструкция органического вещества р. Селенги //Водные ресурсы. 1992. - Т. 5. - С. 163 -165.

71. Таусон В. О. Основные положения растительной биоэнергетики // Изд -во АН СССР. 1950.

72. Телегина 3. П. Влияние отрицательных температур на жизнеспособность углеводородокисляющих бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. 1979. - Т.15, №2. - С. 254 - 257.

73. Трещанина Н. А. и др. Связь щелочной фосфатазы Pseudomonas maltophilia с мембранами // Микробиология. 1981. - Т. 1, № 4. - С. 613 -618.

74. Тыдельская И. JL, Рожавин М. А., Сологуб В. В. Селективная среда с этонием и пенициллином для выращивания Pseudomonas aeruginosa II Лаб. дело. 1980, № 9. - С. 549 - 550.

75. Хлыстов О.М., Клерке Ж., Де Батист М. Донные осадки, содержащие приповерхностные ГТ в оз. Байкал. // Третья Верещагинская Байкальская конференция: Тез. докл. Иркутск. - 2000. - С. 258.

76. Шевцова И. И., Украинский В. В. Состояние покоя, вызванное длительным водным дефицитом // Микробиология. 1980. - Т. 49, № 6. - С.88.892.

77. Шимарае^МГ^Г, Гранин Н. Г. К вопросу о стратификации и механизме конвекции в Байкале // Докл. АН. СССР. 1991. - Т. 321, №2. - С. 381-385.

78. Andersson R. Е., Bodin Н. G. Thermal inb ;tivation of a heat-resistant lipase- I Aproduces by the psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescent// J 'dairy Sci. 1979. - Vol.62, № 3. - P. 361 - 367.

79. Anzai Y. Phylogenetic affiliation о f the Pseudomonads based on 16S rRNA sequence // Int. J. of Syst and Evol. Microbiol. 2000. - Vol. 50. - P. 1563 -1589.

80. Ballard R., Doudoroff M., Stainer R. et al. Taxonomy of aerobic pseudomonads: P. diminuta and P. veziculare II J.Gen. Microbiol. -1968. Vol. 53, №3.-P. 349-361.

81. Bowman J. P. Diversity and association of psichrophillic bacteria in Antarctic sea ice //Applied microbiology and biotechnology. 1997. - P. 3067 - 3078.

82. Bradley D. A. Function of Pseudomonas aeruginosa polar pili: twitching motility // Can. J. microbiol. 1980. - Vol. 26, № 1. - P. 146 - 154.

83. Buchanan Т., Pearce W. Pathogenic aspects of membrane components of Gram negative bacteria // Bacterial outher membranes, biogenesis and function. - New York: Wiley and Sons. - 1979. - P. 475 - 514.

84. Bugg Т. Uptake and active efflux of polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens II Applied microbiology and biotechnology. 2000. -Vol 66,№ 12.-P. 5387-5392.

85. Burbage D., Sasser M. A medium selective for Pseudomonas cepacia II Phytopatology. 1982. - Vol. 72, № 6. - P. 706 - 710.

86. Cerniglia С. E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Biodegradation. 1992, № 3. - P. 351 - 368.

87. Cho J. C., Tiedje J. M. Biogeography and degree of endemicity of fluorescent Pseudomonas strains in soil // Applied and environmental microbiology. - 2000. -Vol. 66, № 12. - P. 5448 - 5456.

88. Dooren de Jong L.E. Bijdrage tot de Kennis van het mineralisatieproces. -Rotterdam: Nijgt, van Ditmar. 1926.

89. De Vos N. Genotypic relationships and taxonomic localization of unclassified Pseudomonas and Pseudomonas lake strains by deoxyribonucleic acid: ribosomal ribonucleic acid hybridizations // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1989. - Vol. 39.-P. 35-49.

90. Enkiri F. Hydrophobic adsorption of aromatic compounds on polyurethane as carbon source for Pseudomonas growth // Applied microbiology and biotechnology. 1995. - Vol. 44. - P. 539 - 545.

91. Fonchy E. et. al. Effect of growth temperature on hydrolytic and esterifying activities from Pseudomonas fragi grown on whey // Applied and environmental microbiology. 1999. - Vol. 65. - P. 3114 - 3120.

92. Foster J. W. Hydrocarbons as substrates for microorganisms. Journ. Antonie van Leeuwenhock. 1986. - Vol. 28. - P. 241 - 274.

93. Fuerst J. A., Hayward A. Surface appendages similar to fimbrial (pili) von Pseudomonas species // J. Gen. Microbiol. 1989. - Vol. 58, № 2. - P. 227 - 237.

94. Furtmann К. Phthalate in der aqatischen Umwelt. Dusseldorf: Landesamt fur Wasser und Abfall Nordrhein-Wesfalen, LWA-Materialen. 1993, № 6. - 177 p.

95. Giam C. S., Atlas E., Powers M. A., Leonard J. E. // The Handbook of environmental Chemistry. Berlin: Springer-Verlag. 1984. - Vol. 3, part C. - P. 67- 142.

96. Gheysen A. B. Production and comparison of peptide siderophores from strains of distantly related pathovars of Pseudomonas syringae and Pseudomonas viridiflava LMG 2352 // Applied and environmental microbiology. 2000. - Vol. 66, № l.-P. 325-331.

97. Goldberg J.B. Pseudomonas: global bacteria // Trends in microbiology. 2000. -Vol. 8, №2.-P. 456-460.

98. Grimberg S. J., Strigfellow W. Т., Aitken M. D. Quantifying the biodegradation of phenanthrene by Pseudomonas stutzeri in the presence of a nonionic surfactant // Applied and environmental microbiology. 1996. - Vol. 62,-"№7. -P. 2387-2392.

99. Guillou C., Guespin Michel J. F. Evidence for two domains of growth temperature for the psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens H Applied and environmental microbiology. - 1996. Vol. 62, № 9. - P. 3319 - 3324.

100. Gurman Sherman D. Differential effects of growth temperature on ice nuclei active at different temperatures that are produced by cells of Pseudomonas syringe II Criobiology. - 1995. Vol. 32, № 2. - P. 34 - 38.

101. Haigler В. E., Pettigrew C. A., Spain J. C. Biodegradation of mixtures of substituted benzenes by Pseudomonas sp. strain // Applied and environmental microbiology. 1992. - Vol. 58, № 7. - P. 2237 - 2244.

102. Halden R. U. Degradation of 3 phenoxybenzoic acid in soil by Pseudomonas pseudoalcaligenes and two modified Pseudomonas strains // Applied and environmental microbiology. - 1999. - Vol. 65, № 8. - P. 3354 - 3359.

103. Hersman L. E. et. al. Growth of Pseudomonas mendocina on Fe (III) (hydr) oxides // Applied and environmental microbiology. 2001. - Vol. 67, № 10. - P. 4448-4453.

104. Hoffman H. P., Geftic S. C., Heumann H., Adair F. W. Mesosomes in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1973. - Vol. 114, № 2. - P. 434 - 438.

105. Hugh R., Leifson E. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative m etabolism о f с arbohydrates b у v arious gram n egative b acteria / /J. Bacteriology. - 1953. - Vol. 66, №1. - P. 24 - 25.

106. Iizuka H., Komagata K. An attempt at grouping of the genus Pseudomonas II J. Gen. and Appl. Microbiol. 1963. - Vol. 9, № 1. - P. 73 - 82.

107. Jessen O. Pseudomonas aeruginosa and other green fluorescent pseudomonads. Munksgaad, Copenhgen. - 1965. - 240 p.

108. Johnsen K., Andersen S., Jacobsen C. S. Phenotypic and genotypic characterization of phenantrene degrading fluorecent Pseudomonas biovars // Applied and environmental microbiology/ - 1996. - Vol. 62, № 10. - P. 3818 -3825.

109. Kahng H-Y. Cellular Responses of Pseudomonas sp. KK1 to Two-Ring Polycyclic Aromatic Hydrocarbom, Naphthalene // Journal of Microbiology. -2002. Vol. 40, No. 1. - P. 38 - 42.

110. Kanner D. Pattern of Phenazine pigments production by strain of Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1978. - Vol. 137, № 2. - P. 690 - 692.

111. Kanaly R., Haarayma S. Biodegradation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria // J. of bacteriology. - 2000. - Vol. 182, № 8. -P. 2059-2067.

112. Kersters K. Recent chage in the classification of the Pseudomonads: an overveiw // Syst. Appl. Microbiol. 1996. - Vol. 19. - P. 465 - 477.

113. King E. O., Ward M. K., Raney D. E. Two simple media for demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab. Clin/ Med. 1954. - Vol. 44. - P. 301 - 307.

114. Kiyohara H., Nagao K., Yana K. Rapid screen for bacterial degrading water -insoluble, solid hydrocarbons on agar plates // Applied and environmental microbiology. 1982. - Vol. 43, № 2. - P. 454 - 457.

115. Kovacs N. Identification of Pseudomonas pyoceanea by the oxidase reaction I I Nature. 1956. - Vol. 178, № 39.

116. Lemke M. J., Leff L. G. Bacterial populations in an anthropogenically disturbed stream: comparison of different seasons //Microb. Ecol. 1999. - Vol. 38.-P. 234-243.

117. Lysenko O. Pseudomonas- an attempt at a general classification //J. Gen. Microbiol. 1961. - Vol. 25, № 3. p. 379 408.

118. Malkki Y., Mattson R., Rouhiainen L. Properties and use a new Pseudomonas peptidase. In: fifth Intern. Ferment. Symp. - 1976, sess. 19. - P. 307.

119. Marisol F. Highly active microbial communities in the ice and snow cover of high mountain lakes // Applied and environmental microbiology. 1995. - P. 2394-2401.

120. Master E. R., Mohn W. W. Psychrotolerant bacteria isolated from arctic soil that degrade polychlorinated biphenyls at low temperatures // Applied and environmental microbiology. 1998. - Vol. 64, № 12. - P. 4823 - 4829.

121. Membre J. M., Burlot P. M. Effects of temperature, pH, and NaCl on growth and pectinolytic activity of Pseudomonas marginalis II Applied and environmental microbiology. 1994. - Vol. 60, № 6. - P. 2017 - 2022.

122. Meyer J. M. Pyoverdines: pigments, siderophores and potential taxonomic markers of fluorescent Pseudomonas species // University of Louis - Pasteur. -2000.

123. Migula W. Shizomycetes // Engler and Prante. Naturlichen pflanzenfamilien. -1985.-P. 29.

124. Moeller V. Simplified tests for some amino acid decarboxylases and for the arginine dehydrolase system // Acta pathol. et microbiol. scand. 1955. - Vol. 36, №1. - P. 158- 172.

125. Nogales В. Combined use of 16S ribosomal DNA and 16S pPNA to study the bacterial community of polychlorinated biphenyl polluted soil //Applied and environmental microbiology. - 2001. - Vol. 67, № 4. - P. 1874 - 1884.

126. Oyama J., Foster J. W. Bacterial oxidation of cycloparafmic hydrocarbons. Journ. Antonie van Leeuwenhock. 1978. - Vol. 31, № 1. - P. 45 - 65.

127. O'Connor K. The effect of nutrient limitation on styrene metabolism in Pseudomonas putida CA 3 //Applied and environmental microbiology. - 1996. -Vol. 62, № 10. - P. 3594 - 3599.

128. Palleroni N. J. Pseudomonadacea // Bergeys manual of systematic bacteriology. 1984. - P. 140 - 218.

129. Palleroni N. J. Genus Pseudomonas Migula 1894 //Bergeys manual of systematic bacteriology. Ed. R. Noel, Krieg J. G., Holf Baltimor; London; Williams Wilkins. - 1984. - Vol. 1. - P. 141 - 198.

130. Palleroni N.J. Human and animalpathogenic Pseudomonads // The Prokaryotes: a handbook of the biology: Springier. - 1992. - Vol. 3. - P. 3086 -3103.

131. Palleroni N. J., Doudoroff M., Stanier R. Y. et al. Taxonomy of the aerobic Pseudomonads: the properties of the Pseudomonas stutzeri group //J. Gen. Mirobiol. 1970. - Vol. 60, № 2. - P. 215 - 231.

132. Rashid N. Low temperature lipase from psychrotrophic Pseudomonas sp. strain // Applied and environmental microbiology. - 2001. - Vol. 67, № 9. - P. 4064-4069.

133. Raymond R. L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Develop. Industry. Microbiology. 1961. - Vol 2, № 1. - P. 23 - 32.

134. Saijo Y., Mitamura O., Ogiyama K. Chemical composition of surface film in the coastal sea area and in fresh water lakes //Japan. J. Limnol. - 1974. - Vol. 35.-P. 110-116.

135. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory manual //Cold Spring Harbor Laboratory Press . 1989. - Vol. 2.

136. Sands D. С., Schroth M. N., Hildebrand D. C. Taxonomy of the phytopathogenic Pseudomonads // J. Bacterid. 1970. - Vol. 101. - P. 9 - 19.

137. Schulte G., Bonne L., Winder U. Glycogen and various polysaccharides stimulate a the formation of exolipase by Pseudomonas aeruginosa //Canad. J. microbiol. 1982. - Vol. 28, № 3. p. 636 - 642.

138. Snell J. J., Lapage S. P. Carbon source utilization test as an acid to the classification of none fermenting gram - negative bacteria // J. Gen. Microbiol. - 1973. - Vol. 74, № 1. p. 9 20.

139. Staley J. Т., Gosink J.J. Poles apart: biodeversity and biogeography of sea ice bacteria // Annual Rev. Microbiol. 1999. - Vol. 53. - P. 189 - 215.

140. Staples C. A., Peterson D. R., Parkerton T. F., Adams W. J. // Chemosphere. -1997. Vol. 35, № 4. - P. 667 - 749.

141. Stanier R. V., Palleroni N. J., Doudoroff M. The aerobic pseudomonads: a taxonomic study // J. Gen. microbial. 1966. - Vol. 43, № 2. - P. 159 - 271.

142. Stover С. K. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAOl, an opportunistic pathogen // Nature. 2000. - Vol. 406. - P. 959 - 964.

143. Wiedmann M. Molecular and phenotypic characterization of Pseudomonas spp. Isolated from milk // Applied and environmental microbiology. 2000. -Vol. 66, № 5.

144. Willocx F. Modelling the influence of temperature and carbon dioxide upon the growth of Pseudomonas fluoresces II Food microbiology. 1993. - Vol.10, № 2. -P. 456-461.

145. Young H. O. Ultrastructure of Pseudomonas sacchorophila at early and late lag phase of growth. // J. Bacteriol. 1972. - Vol. 109, № 2. - P. 862 - 868.

146. Yen К. M., Serdar С. M. Genetics of naphtalene catabolism in Pseudomonas II Crit. Rev. Microbiol. 1988. - Vol. 15. - P. 247 - 668.

Информация о работе

Павлова, Ольга Николаевна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2004
ВАК 03.00.16

Диссертация

Бактерии рода Pseudomonas в микробном сообществе озера Байкал - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы