Экология бактерий рода Rhodococcus из глубоководных битумных построек озера Байкал

Лихошвай, Александр Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экология бактерий рода Rhodococcus из глубоководных битумных построек озера Байкал
ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Экология бактерий рода Rhodococcus из глубоководных битумных построек озера Байкал"

и 005005212

ЛИХОШВАЙ Александр Викторович

Экология бактерий рода ДАоЛососсиь из глубоководных битумных построек

озера Байкал

03.02.08 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 ДЕК 2011

Иркутск-2011

005005212

Работа выполнена в Отделе микробиологии Учреждения Российской академии наук Лимнологический институт Сибирского отделения РАН, Иркутск.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Т.И. Земская

Научный консультант:

доктор химических наук, академик М.А. Грачев Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Намсараев Баир Бадмабазарович доктор биологических наук, профессор Саловарова Валентина Петровна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН

Защита состоится 27 декабря 2011 г. в 12:00 на заседании совета Д 212.074.07 при при ГОУ ВПО Иркутский государственный университет по адресу: 664003 г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им. проф. М.М. Кожова (ауд. 219).

Факс (3952) 241855 Email: dekanat@bio.isu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Иркутского государственного университета.

Автореферат разослан 25 ноября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, к.б.н

А.А. Приставка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Бактерии рода Rhodococcus, относящиеся к фи-луму Actinobacteria, семейству Nocardiaceae, обитают в почве, соляных шахтах, антарктических льдах, морских осадках, сточных водах и многих других экосистемах (Gorlach et al., 1994; Anan'ina et al„ 2011; Lo Giudice et al., 2007; Helmke and Weyland, 1984; Yoon et al., 2000a; Alvarez, 2010). Отдельные представители данного рода способны использовать в качестве единственного источника углерода широкий спектр органических веществ, в том числе углеводороды, опасные с точки зрения экологии, в связи с этим их изучение имеет не только научное, но и прикладное значение (Larkin et al., 2006). Родококки способны окислять высокомолекулярные п-алканы и сложные хлорорганические соединения, которые трудно поддаются биодеградации (De Carvalho, 2004; Luis et al., 2006). Представители рода Rhodococcus утилизируют бензол, толуол, нафталин (Liu, 2009), гербициды (De Schrijver and De Mot, 1999) и полихлорбифенилы (Vaillancourt et al., 2003). Отдельные штаммы в настоящее время используются при производстве биопрепаратов, применяемых для биоремедиации при нефтяных загрязнениях (Ovchinnikova, 2009; Kuyukina et al.,

В озере Байкал при исследовании поверхностных вод в районе естественных нефтепроявлений у м. Горевой Утёс и близ устья р. Большая Зеленовская культивированием было выявлено микробное сообщество с доминированием бактерий-деструкторов нефти из родов Pseudomonas, Micrococcus и Rhodococcus. В отличие от других бактерий, родококки были найдены не только в нефти на водной поверхности, но и в донных осадках того же района (Павлова и др., 2008а).

Открытие на дне Байкала в районе м. Горевой Утёс битумных построек при погружениях глубоководных обитаемых аппаратов (ГОА) «Мир» в 2008 г., в которых участвовал автор настоящей работы, инициировало исследования по изучению механизмов их образования и деструкции. В частности, представляло интерес исследовать населяющую их микрофлору и оценить наличие микроорганизмов, активно деградирующих нефть.

Цель исследования - изучить микроорганизмы в битумных постройках, расположенных на дне Байкала, и выделить штаммы бактерий, активных деструкторов углеводородов. Были поставлены следующие задачи:

1. Оценить разнообразие микроорганизмов в двух битумных постройках с различной активностью разгрузки нефти.

2. Выделить в культуры из образцов битума активные штаммы микроорганизмов-деструкторов нефти, в лабораторных условиях изучить их способность к использованию я-алканов в качестве единственного источника углерода.

3. Установить филогенетическую принадлежность выделенных штаммов, иссле- • довать физиолого-биохимические свойства и морфологию полученных штаммов бактерий рода Rhodococcus.

2010).

—•у /

4. Установить наличие алкан-1-монооксигеназ - ферментов, инициирующих биодеструкцию и-алканов, и расшифровать структуру alk-генов у одного из штаммов Rhodococcus.

5. Исследовать способность штаммов рода Rhodococcus к синтезу биосурфактан-тов класса гликолипидов.

6. Провести сравнение структур алкан-1-монооксигеназ одного из штаммов рода Rhodococcus, выделенных из битумной постройки, между собой и со структурами этих генов других представителей.

Научная новизна. Впервые исследована филогенетическая структура микробных сообществ в двух битумных постройках на дне Байкала, различающихся по химическому составу и интенсивности разгружающихся через них углеводородов. Установлено, что в битумных постройках обитают представители двух доменов: Archaea и Bacteriae, включающие микроорганизмы различных таксонов. Установлено, что колонии из неактивной битумной постройки, способные расти на агаре в • присутствии нефти в качестве единственного источника углерода, по морфо-физиологическим признакам могут быть отнесены к роду Rhodococcus. Пять штаммов микроорганизмов в лабораторных экспериментах деградировали широкий спектр n-алканов (Сц-Сгэ)- Впервые в геноме одного из байкальских штаммов полностью расшифрованы гены, кодирующие ферменты, осуществляющие окисление и-алканов. Показано, что структуры этих генов гомологичны структурам генов бактерий рода Rhodococcus, обнаруженных в морской воде и почве, загрязнённой нефтью.

Практическая значимость работы. Получены и охарактеризованы 5 штаммов рода Rhodococcus, изолированных из неактивной битумной постройки на дне (глубина 900 м) озера Байкал. Установлена их способность деградировать нефть и я-алканы, что позволяет рекомендовать их как возможные компоненты биопрепаратов, применяемых для биоремедиации холодноводных водоёмов. Показано, что штамм Rhodococcus erythropolis №4 выделяет биосурфактакгы гликоли-пидной природы. Полученные данные по структуре ой-генов могут быть использованы при разработке структур праймеров необходимых для детекции этих генов у других микроорганизмов.

Работа выполнена в группе по изучению углеводородокисляющих микроорганизмов, отделе микробиологии Учреждения Российской академии наук Лимнологический институт Сибирского отделения РАН.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Битумные постройки, обнаруженные на дне озера Байкал в районе естественного нефтепроявления на глубине 900 м, различаются населяющими их микроорганизмами. Видовой состав микроорганизмов, населяющих активную постройку, из которой выделялась нефть, и неактивную (нефть не выделялась), различный.

2. Из неактивной битумной постройки при культивировании на среде, в которой в качестве единственного источника углерода использовалась нефть, выделены только представители рода Rhodococcus. Комплексный анализ 5 выделенных штаммов микробиологическими, молекулярно-биологическими, электронно-микроскопическими и хроматографическим методами показал, что все штаммы относятся к виду Rhodococcus erythropolis. Они способны участвовать в деструкции природных углеводородов и обладают высокой экологической пластичностью - способностью к росту в широком диапазоне (от +4 до +37 °С) температур и при концентрациях NaCl от 3 и 5%.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Х-ом Съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009), V-ой Верещагинской байкальской международной конференции (Иркутск, 2010), 10* International Conference on Gas in Marune Sediments (Листвянка, 2010), 32nd Annual Lome Genome Conference (Лорн, Автстралия, 2011), 3-ем Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах» (Иркутск, 2011).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 95 страницах и включает введение, обзор литературы (Глава 1), экологическую и микробиологическую характеристику района мыса Горевой Утёс (Глава 2), объекты и методы исследования (Глава 3), химическое и микробиологическое исследование битума неактивной постройки (Глава 4), идентификацию генов у выделенных штаммов Rhodococcus erythropolis, участвующих в деструкции «-алкапов (Глава 5), исследование выделенных штаммов Rhodococcus erythropolis в лабораторных условиях (Глава 6), заключение, выводы и список литературы из 142 источников, из них 109 -зарубежных. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 20 рисунками.

Работа поддержана грантами: РФФИ 09-04-12231-офи_м, 10-05-00681-а, РФ МК-1901.2010.5. Автор выражает благодарность научному руководителю работы д.б.н. Т.И. Земской, научному консультанту д.х.н. академику М.А. Грачёву, к.б.н. О.Н. Павловой, К.Х.Н. А.Г. Горшкову, д.б.н. Е.В. Лихошвай, Т.А. Ханаевой, к.б.н. Н.Л. Бельковой, Е.В. Сухановой, к.б.н. И.Б. Клименкову, к.б.н. Т.А. Щербаковой, Ю.П. Галачьянцу, (Лимнологический институт СО РАН), к.б.н. И.В. Морозову (центр коллективного пользования «Секвенирование ДНК»), д.б.н. Н.В. Равину (центр коллективного пользования «Биоинженерия» РАН) за консультативную и практическую помощь, Т.В. Кашик (Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

Проведен анализ литературы по распространению естественных выходов нефти в водных экосистемах, описано, какие источники углеводородов могут служить для представителей рода Rhodococcus в качестве единственного источника углерода, описаны механизмы окисления углеводородов, рассмотрена ферментативная система, обеспечивающая их деградацию микроорганизмами. Описаны история изучения нефтепроявлений на оз. Байкал и приведены данные по биодеструкции углеводородов, дана геохимическая характеристика недавно открытого района естественных нефтепроявлений у м. Горевой Утёс.

Глава 2. Экологическая и микробиологическая характеристика района мыса Горевой Утёс

В ходе совместной экспедиции Лимнологического института СО РАН и Института океанологии им. П.П. Ширшова РАН с помощью ГОА «Мир» в 2008-09 гг. при обследовании дна в районе нефтепроявления (Средний Байкал) обнаружены битумные образования (постройки). По данным Горшкова с соавторами (2010), в одной из активных построек (№3) содержание л-алканов составляет 770 мг/г (77 %), а гомологический ряд представлен Си-С32 с максимумом при ССм, при этом характерным является сужение гомологического ряда по сравнению с нефтью, собранной с водной поверхности. Содержание я-алканов в неактивной постройке (№8) ниже - 148 мг/г (15 %), а состав я-алканов с длиной цепи С22-С34 и максимумом при С25. См, отмечено наличие «нафтенового горба» - смеси высших углеводородов, неразделяемых газовой хроматографией. В байкальской нефти, собранной с водной поверхности, обнаружены уникальные биомаркеры - сесквитерпаны и гомологический ряд гопанов (Конторович и др., 2007), их наличие указывает на то, что нефть на своём пути из недр осадков (3 км) к их поверхности не претерпевала гидротермального воздействия свыше 200 °С.

С использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) установлено, что микроорганизмы представлены метанокисляющими и разрушающими высшие углеводороды бактериями. Выявлены представители альфа-, бета- и гаммапротеобак-терий, актинобактерии и Firmicutes, включающие представителей родов Micromonospora, Mycobacterium, Rhodococcus (Ломакина и др., 2009). В водной толще были обнаружены псевдомонады и спорообразующие микроорганизмы, родственные представителям широкого класса бактерий, выделенных из донных осадков Охотского моря, Антарктиды, почв, загрязнённых углеводородами и др. (Ломакина и др., 2009). Район нефтепроявлений у м. Горевой Утёс отличается не только уникальными экологическими условиями, но и особыми свойствами нефти и битума, а также разнообразием местной биоты. Исследователи, которые погружались в данном районе на ГОА «Мир», отмечали особенности биотопа: обилие на битумных постройках амфипод, олигохет, моллюсков, плоских червей турбеллярий и даже

губок (Хлыстов и др. 2009). В неактивной постройке внутри битума обнаружены белые сгустки, напоминающие вату, внутри которых обитали олигохеты рода Pseudorhynchelmis, нематоды и единичные особи остракод (Хлыстов и др., 2009). Очевидно, что нефтеокисляющие бактерии могут играть важную роль как первое звено пищевой цепи этих животных.

Глава 3. Объекты и методы исследования

В упомянутой выше экспедиции на ГОА «Мир» были отобраны и доставлены в лабораторию для исследований несколько образцов битумных построек. Они представляли собой вязкую бурую битуминоидную массу зернистой структуры, из которой при поднятии на поверхность проступила вода. При комнатной температуре через некоторое время материал превращался в пластичную гомогенную массу.

Элементный анализ (С, Н, N, S, С1) битума постройки №8 проведен на анализаторе Flash ЕА 1112 (Германия) в Иркутском институте химии имени А.Е. Фаворского.

Хроматографический анализ битума построек проводили на масс-спектрометре Agilent GC 6890 MSD 5973 (Германия) с капиллярной колонкой (DB-17ms, 1 = 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм). Сквалан и дейтерированные ПАУ (полиароматических углеводородов - нафталин-dg, аценафтен-dio, фенантрен-dio, хризен-du, псриленч112) использовали в качестве внутренних стандартов при определении «-алкапов и ПАУ. Навеску битума растворяли в хлористом метилене (2 мг/мл) с добавлением 0,5 мл раствора сквалана в хлороформе (0,3 мг/мл). В колонку вводили 2 мкл экстракта с разделением потока в инжекторе с соотношением 1:10. В качестве газа-носителя использовали гелий, подаваемый в хроматограф со скоростью истечения 1 мл/мин. Температура инжектора составляла 280 °С. Условия хроматографии: первоначально температура колонки составляла 50 "С в течение 5.мин, затем следовал градиент температур (15 °С/мин) от 50 до 310 °С и далее изотермический режим при 310 °С в течение 15 мин. Хроматограммы регистрировали в режиме селективного ионного детектирования по ионам с т/г. 57 и 71. Измерения проводили в трёх повторностях. Концентрации я-алканов рассчитывали как средние значения для трёх параллельных измерений (погрешность не превышала 10%).

Выделение штаммов микроорганизмов. Образцы (1 г) битумной постройки смешали с нефтью (100 мкл) из месторождения Югринское (Западная Сибирь), стерилизованной через поликарбонатные GTTP фильтры с диаметром пор 0,2 мкм (Millipore), и равномерно распределили по поверхности агаризованной среды Раймонда в чашках Петри (Raymond, 1961) (г/л): КН2Р04 - 2,0; СаС12-2Н20 - 0,01; MgS04-7H20 - 0,2; FeS04 - 0,01; NH4N03 - 2,0; MnS04-5H20 - 0,02; Na2HP04 - 3,0; Na2C03 - 0,1; агар - 1,5; pH = 7,2. После инкубирования чашек при комнатной температуре в течение 168 ч на поверхности среды появилось множество одинаковых

мелких колоний, пять из которых было отобрано случайным образом. Они были перенесены в пробирки с питательной агаризованной средой РПА (рыбо-пептонный агар) для дальнейшего культивирования при комнатной температуре, чистые культуры были получены путём многократного пересева на этой же среде. Колоний на стерильной нефти без добавления битума выявлено не было. Полученные штаммы пронумеровали от 1 до 5 и законсервировали в 1,5 мл пробирках типа «Eppendorf», их хранили при 4 °С до последующих манипуляций. Штаммы также законсервированы в 50 % растворе глицерина и хранятся при -70 °С.

Физиолого-биохимические свойства выделенных цггаммов микроорганизмов исследовали на основании морфологических и физиолого-биохимических признаков по определителю бактерий Берджи (Bergey's Manual of determinative bacteriology, 1994).

Чистоту штаммов проверяли под световым микроскопом «Axiostar Plus» при увеличении 100x10, окраску по Граму проводили по общепринятой методике (Романенко, 1974).

Морфологические свойства одного из штаммов (№2) изучали с использованием сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) Philips SEM 525-М. Ультратонкие срезы (5 нм) были получены на микротоме Leica Ultracut R (Германия) и исследованы с использованием трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ) LEO 906Е. Для СЭМ клетки бактерий фиксировали в 2,5 %-м растворе глутараль-дегида, нанесли на столик, высушили и покрыли золотом. Для ТЭМ клетки фиксировали в 2,5 %-м растворе глутарапьдегида и контрастировали 0s04, после чего заливали в эпоксидную смолу (Araldite М 502 Kit SPI, USA). Далее были сделаны ультратонкие срезы образцов, которые закрепляли на специальные сеточки.

Выделение ДНК штаммов микроорганизмов проводили по модифицированной методике ферментативного лизиса с последующей фенол-хлороформной экстракцией (Sambrook, Fritsch, 1989). ПЦР ДНК штаммов проводили в режиме (30 циклов): активация полимеразы - 94 °С, 2 мин; денатурация - 92 °С, 45 сек; отжиг - 52 °С, 45 сек; амплификация - 72 °С, 60 сек; элонгация - 72 °С, 60 сек; финальная элонгация - 72 °С, 2 мин (1 цикл). Использовали праймеры 27f, 1350г, комплементарные наиболее консервативным участкам гена 16S рРНК (Brosius et al., 1981; Денисова и др., 1999). Размер и чистоту продуктов ПЦР всех штаммов проверяли электрофорезом в 1,5 %-м агарозном геле. Секвенирование проводили с теми же праймерами, длина нуклеотидных последовательностей - 895-1118 п.о. Сравнительный анализ проводили с использованием международной базы данных NCBI в программе BLASTN и ClustalW v. 1.4, построение филогенетических деревьев осуществляли с помощью пакета программ MEGA v.4.0 с использованием алгоритма группирования «neighbor-joining». Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью «bootstrap-анализа» с использованием соответствующей функции той же программы. Наличие химерных структур определяли анализом после-

довательностей с помощью программы PINTAIL

(http://www.cardiff.ac.uk/biosi/research/biosoft).

Идентификация alk-генов штаммов проводили с использованием ПЦР-программы, описанной выше, и с тремя наборами праймеров alkB-1, alkB-2 и alkB-3 (Sei et al„ 2003).

Последовательности зарегистрированы в международной системе NCBI под следующими номерами: 16S рРНК - HQ702468, HQ702469, HQ702470, HQ702471, HQ702472; я/*-гены - HQ702473, HQ702474, HQ702475, HQ702477.

Метагеномный анализ микробного сообщества битумных построек. Для одного из образцов постройки №8 была выделена суммарная ДНК, как описано выше. Анализ проведён под руководством д.б.н. Н.В. Равина в «Центре Биоинженерия» РАН. ПЦР гена 16S рРНК проводили с праймерами U341F 5'-CCTACGGGRSGCAGCAG-3', U515R 5'- TTACCGCGGCKGCTGVCAC-3', по программе (30 циклов): активация полимеразы - 96 °С, 3 мин; денатурация - 96 °С, 30 сек; отжиг - 55 °С, 30 сек; амплификация - 72 °С, 40 сек; элонгация - 72 °С, 10 мин. Секвенировали на GS FLX (Roche) на основе технологии пиросеквенирования «454 Life Science».

Влияние температуры на культивирование штаммов изучали в 50 мл пробирках с 10 мл среды Раймонда и 10 мкл стерильной нефти при 4, 22, 37 и 46 °С в течение 168 ч.

Исследование деструкции п-алканов выделенными штаммами проводили в трёх повторностях в стеклянных флаконах (200 мл) со средой Раймонда (100 мл), куда помещали культуру и 100 мкл нефти в качестве единственного источника углерода. Флаконы инкубировали в течение 92 ч при 22 °С на орбитальном шейкере BIOSAN OS-IO с постоянным перемешиванием (120 об./мин). Через каждые 24 ч отбирали один флакон (3 повторности, 4 дня - 12 флаконов) для исследования. Весь объём среды экстрагировали хлористым метиленом (3 х 50 мл). Экстракт анализировали хроматографически, как описано ранее (Uchida et al., 1989b).

Выявление гликолипидов проводили у штамма №4, который засевали в 50 мл среды СП А (сухой питательный агар) в колбу (100 мл) с ватно-марлевой пробкой для предварительного накопления биомассы. Посевной материал получали при комнатной температуре и постоянном перемешивании (100 об./мин) в течение 24 часов. Далее 5 мл полученной биомассы переносили в колбу (5 л) с ватно-марлевой пробкой с ферментативной средой состава (Куюкина, 2007) (г/л): KN03 -0,1; КН2Р04 - 2,0; К2НР04 - 2,0; (NH4)2S04 - 2,0; NaCl - 1,0; MgS04-7H20 - 0,2; СаС1-2Н20 - 0,02; FeCl37H20 - 0,01; раствор микроэлементов (Drews, 1974) - 1,0 мл, содержащей в качестве единственного источника углерода 3 объёмных % п-гексадекана. Для повышения выхода биосурфактантов в минеральную среду вносили дрожжевой экстракт (0,1 г/л), а концентрация KNO3 была снижена в 10 раз (до 0,1 г/л). Культивирование проводили при комнатной температуре и постоянном пе-

ремешивании (80 об./мин) в течение 456 ч. По истечении времени в культуральной среле выделилось три слоя, каждый из которых отбирали в отдельную пробирку.

Клетки отделяли центрифугированием (3600g, 20 мин), отбрасывали слой гексадекана и собирали клетки, находящиеся в интерфазе и осаждённые. Проводили двукратную экстракцию реактивом Фолча (хлороформ : метанол = 2 : 1, 50 % к объему экстрагируемой смеси) в течение 3 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании (160 об./мин). Объединенный нижний слой, содержащий гликолипиды, упаривали на роторном испарителе до постоянного объема при температуре 40 "С. Для удаления остаточного гексадекана пробу наносили на концентрирующий патрон для твердофазной экстракции Discovery® DSC-Si SPE Tube (500 мг, объем 6 мл, Supelco) и гексадекан элюировали 100 мл гексана, контролируя его наличие в элюате методом ГХ-МС. Фракцию гликолипидов элюировали 10 мл смеси хлороформ : метанол = 5 : 1,5, упаривали досуха на роторном испарителе при 40 °С и перерастворяли в 200 мкл хлороформа (Uchida et al., 1989b). Растворившуюся часть (экстракт) наносили на хроматографическую пластинку и проводили двумерную хроматографию. В первом направлении проводили в системе хлороформ : метанол : вода = 6,5 : 1,5 : 0,2 мл. При хроматографировании во втором направлении вместо воды был взят 0,1% раствор тетрабората натрия. Пластинку высушивали и опрыскивали водой. О наличии гликолипидов судили по проявлявшимся пятнам, расположенным ниже горизонтальной линии.

Полногеномное секвенирование alk-генов. У штамма №4 полностью расшифрованы alk-тены (lllumina GAIIx, Индия). Число чтений - 10 млн п.о. Сборкой фрагментов отдельных нуклеотидных последовательностей с использованием программы Velvet_1.1.02 получено 3897 контигов среднего размера 1,8 тыс. п.о. и суммарной длинной 6,9 мегабаз. Далее их транслировали в аминокислотные последовательности в программе Expasy Translate tool (http://web.expasy.org/translate/). Поиск последовательностей алкангидроксилаз проводили с использованием микроорганизма R. erythropolis PR4 из международной базы данных NCBI. По аминокислотным последовательностям найдены ближайшие гомологи при помощи программы BLASTX. Структуры проанализировали в программе ClustalW v. 1.4. Филогенетический анализ осуществляли с помощью пакета программ MEGA v.4.0 и алгоритма группирования «neighbor-joining».

Глава 4. Химическое и микробиологическое исследование битума неактивной постройки

В момент отбора образцов постройка не была активна. Элементный состав постройки следующий: С - 77,06 %; Н - 12,12 %; N - 6,38 %; S - 0,75 %; С1 - 0,69 %; зольность - 2,86 %. По данным хроматографического анализа в неактивной постройке содержится 148 мг/г С22-С34 л-алканов, с максимум при С25; 0,03 % составляют полиароматические углеводороды (ПАУ), 1 % - изопреноиды, каротиноиды и

гопаны; остальные 48 % приходятся на «нафтено-ароматический горб» - смесь высших углеводородов, неразделяемых газовой хроматографией. Примерно 33 % органического материала не вышло из колонки. Полученные данные были сопоставлены с данными по составу другой, активной, битумной постройки №3 и нефти с водной поверхности, отобранных в том же районе нефтепроявлений у м. Горевой Утёс (Горшков, 2010; Конторович, 2007) (рис. 1). Нефть, собранная с водной поверхности, содержит 900 мг/г (90 %) «-алканов, а в битуме постройки №3 - 770 мг/г. Содержание я-алканов в исследуемой постройке №8 оказалось в 5 раз меньше (148 мг/г), а гомологи легче С22 отсутствуют. В составе неактивной постройки не обнаружены я-алканы короче С2г- Более того, общее содержание этих углеводородов гораздо меньше, чем в активной постройке. Разность концентраций я-алканов в нефти активной битумной постройки №3 и неактивной №>8 связана с процессом де-парафинизации (Горшков и др., 2010). На своём пути из глубинных слоёв осадка к поверхности дна нефть претерпевает первичное фракционирование с накоплением высших парафинов. При достижении границы «дно-вода» происходит окончательное разделение нефти - «тяжёлые» углеводороды кристаллизуются с образованием битумных построек, а «лёгкие» всплывают к поверхности (Горшков и др., 2010).

Метагеномный анализ ампликонов гена 165 рРНК суммарной ДНК, выделенной из битумных построек №3 и №8, выявил наличие широкого спектра микроорганизмов, принадлежащих к разным таксонам (рис. 2). Представители класса АсИпоЬаМепа (куда входит род ЮюсИососсиз) присутствуют в обеих постройках (4,3 % и 3,6 %, соответственно).

Bacteria

___□ !_

100 —

120 -

Н*фть на водно, пгасркности

___

Битум ная постройка No.3 (активная)

МШШа

=_______

битумная постройка No.8 (неактивная)

II I 1 : 1 I I I I I I ¡ I II I I II

10111213 14 1616 17 18 19 2021 2123242626 2? 2823 3031 32 33 34 36 36 39 Г ом олоическии ряд л-а/каноа

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

№3

я» Y

№8

■ Unclussified

■ Caldiserica

■ Firmicutes

В Spirochaetes LJ Acidobacteria

□ Chlorobi

■ Verrucomicrobia OTM7

■ Bacteroidetes

□ Actinobacteria

■ Epsilonproteobacteria U Gammaproteobacteria

□ Deltaproteo bacteria Ш Betaproteobacteria OAlphaproteobacteria

Рис. 1. Содержание я-алканов в нефти, собран- Рис. 2. Состав бактериального сообщества в ной с водной поверхности и в активной и неак- битумных постройках №3 (активная) и №8 (не-тивной битумных постройках. активная) по данным метагеномного анализа

(ген 168 рРНК).

При посеве битума на среду, где единственным источникам углерода была стерильная нефть, из множества визуально одинаковых выпуклых, круглых, блестящих слизистых колоний бледно-розового цвета с ровным краем диаметром 1-3 мм (рис. ЗА) было выделено 5 штаммов. В суточной культуре клетки были неподвижны, грам-положительны, имели палочковидную форму: длина 1,5 мкм, диаметр 0,52 мкм (рис. ЗБ). На шестые сутки в культуре преобладали кокки (диаметром 0,7 мкм), в меньших количествах встречались короткие палочки длиной 0.8 мкм и диаметром 0,6 мкм (рис. ЗВ). Выделенные штаммы обладали морфологическими свойствами типичных представителей рода Rhodococcus (Alvarez, 2010). Клетки имели сложную клеточную стенку и внутриклеточную перегородку, характерную для представителей семейства Nocardiaceae (Scott and Finnery, 1976) (рис. ЗГ).

В Г

Рис. 3. Микроскопический анализ штаммов. А - колонии на чашке Петри, высеянные из битума постройки №8; Б - гомогенная культура под световым микроскопом; В - шестидневная культура под СЭМ; Г - ультратонкий срез клетки бактерии под ТЭМ. На фотографии ультратонкого среза стрелками обозначено: 1 - перегородка; 2 - плазмалемма; 3 - слой, состоящий из пептидогликана; 4 - слой, состоящий из арабиногалактана. Масштаб: А - 1 см; Б - 10 мкм; В - 1 мкм; Г - 250 нм.

Все выделенные штаммы являются аэробами и растут в диапазоне от +4 до +37 °С, при оптимуме 22 °С. Штаммы не давали роста при +46 °С. При добавлении в среду NaCl в концентрации 3 и 5 % отмечен рост бактерий, который прекращался при 8 %. Отмечена чувствительность к лизоциму (5 мкг/мл). Все штаммы образовывали продукты, сдвигающие рН среды в щелочную область, утилизировали цит-

раты, рамнозу, рафинозу, мальтозу, арабинозу, аммонийный и нитратный азот, не дезаминировали фенилаланин, тирозин, дульцит, инозит, сорбит, манниг, адонит. У всех штаммов обнаружено наличие орнитиндекарбоксилазы, лизиндекарбоксилазы, аргининдегидролазы и уреазы. Отрицательный результат дали тесты на образование индола и сероводорода, газообразование, наличие ß-галактозидазы. Штаммы №1, 2 и 4 не утилизировали глюкозу, лактозу, фруктозу, ксилозу, сахарозу, галактозу. Для штамма №5 через 48 ч отмечено слабое окисление фруктозы, сахарозы, лактозы, глюкозы, а штамм №3 деградировал эти субстраты существенно. Это роднило их с типовым штаммом R. erythropolis DSM 43066. В отличие от последнего (Alvarez, 2010), ни один штамм не деградировал сорбит.

По структуре гена 16S рРНК выделенные штаммы с гомологией 99-100 % отнесены к роду Rhodococcus. Штаммы №1-4 гомологичны штамму R. erythropolus TT07R-57 (АВ546303), №5 - R. erythropolis DLC-terla (EU043316). Среди гомологов штаммов №1-4 представлены углеводородокисляющие бактерии рот Rhodococcus, выделенные из почв, загрязнённых нефтью. Одним из гомологов, помимо выше упомянутого, штамма №5 является микроорганизм R. globerulus AZI-15, выделенный из сильвинитных шахт. Физиологический анализ 5 штаммов из постройки №8 с 12 штаммами из постройки №3, 18 из водной толщи и 5 из осадка у м. Горевой Утес показывает их филогенетическое родство (отмечено пунктиром) (рис. 4).

Глава 5. Идентификация генов у выделенных штаммов Rhodococcus erythropolis, участвующих в деструкции л-алкаиов

По данным ПЦР-анализа у штамма №2 обнаружены alkBl-1 и аШЗ-reны, у остальных - только а!кВЗ-гены. Структура нуклеотидных последовательностей фрагментов attS-генов всех штаммов имеет сходство со структурой аналогичных генов представителей рода Rhodococcus. Последовательности а!к-генов выделенных 5 штаммов сравнили с аналогичными последовательностями штаммов из битумной постройки №3, из осадка и водной толщи исследуемого района (рис. 5).

AlkB-гены штаммов №4 и №5 располагаются на отдельных ветвях и кластеризуются с последовательностями, полученными из активной постройки и из водной толщи, что может свидетельствовать о специфичности данных alk-генов. Последовательности 1, 2 и 3 имеют структуры, схожие с фрагментами генов одного из видов рода Rhodococcus (рис. 5).

Проведен первый раунд секвенирования полного генома штамма №4. Из полученных чтений удалось собрать контиги, из которых затем были собраны полные последовательности пяти alk-генов этого штамма. Они были сопоставлены с соответствующими генами из полного генома R. erythropolis PR4 (Seike et al., 2006) морского происхождения и с последовательностями фрагментов alkB-генов, описанных в предыдущем разделе. Оказалось, что четыре alk-тена. штамма №4 значительно отличаются друг от друга по последовательностям нуклеотидов, но каждый

Rhodococcus sp. AF235011 j\

*' ~ ревой Утес, водная )»олиш EU496547 \ * sp. bwiwn •

74915 ойка

25-6 битумная nocrpoi

Rhodocobcus sp. DQW0386 36 битумная постройка Л

Rhodococcus sp. АР 181690

RhodococcusJascians AB180236 36-16 битумная постройка JS¥3 RJtodococdus sp. AY188941

2 битумная постройка MS Rhodococcus sp. b

1 битумная постройка M8

3 битумная постройка ggg

. 121'oveeou Утес, воднаяТйолща EU496546 Г кпоабсоссих erythropohs aUU43.11Ь ' ^ битумная постройка MS Rftoaococeus erymropoiis АВ546303

I г к..............-X____„Л. .„ и»

я Горевой Утес, водн<м толща EU49654S A4icromww.spom Sp.

ой УН

гтес, водная тот ra sp. HU7142M не, водная momia EU496S44

Лй

5 о

> Micro mono spora sp. 14 Горееой Утес, ее-..—.•---■--■■ Micromonospora sp. а УЗШЛ54

99i Jg Горевои Утес, донные осадки FJ53453 1 Microt>act ftydrocarbonoxydcais EU373354 — 35-12 битумная постройка ЛЬЗ Micrococcus sp. AM990S48

Micrococcus sp. D0448770 ,

61 Горееой Утес, донмш осадки FJ534533 } ^ Kocuria sp. DQ223666 J

Н 38 Горееой Утес, донные осадки FJ534529 PaenibaciUus poiymyxa а™ло° — 33-7 битумная построй 9 битумная постройка Л&З

AJ223988 ойка У*3

нтумная построй-----

33-8 битумная постройка ЖЗ

1 Горевои Утес, водная толща EU496552

т^—Г:!___;п..„-.J А-пр""'^"

PaenibacUlus sp. АБ09447ТГ PaenibaciUus amyblyticus AB 115960 ,,,

3 Горееой Утес: водная толща EU496S53

4 Горевои Утес, водная толиш EU4V6S54

________1cuius sp.--------

PaenibaciUus pabuli AM087615 33 битумная постройка ЛМ Acinetobacter ф. EU073080 7-15 битумная постройка ХвЗ 00 Acinetdbbcter sp. AMI84270

59 Горееой Утес, донные осадки OU911424 ^ Acinelobacter sp. AY177359 Ч

34-10 битумная постройка JVtt ^ J П

-¿jAzorhizobium sp. DQ664248 S - -осгройка Л*3 ff

----пойка №3 >

... ____hmi АВ074717

J 7 Гбреёои Утес, водная толща EU496542 „ w 1 деда sp. UU664253 Sphingotnonas sp. AF177917 Д

>hingomonas sp. EU195325 3 Горееой Утес, водная томца EU44 9122 yseudomonas sp. а изъээ i« 5 Горееой Утес, воднмтолиш EU496551 Pseudomonas aeruginosa ЕЬ'59УЬЧ9 9 Горееой Утес, водная толща EU449119

I pseudomonas sp. EUо73 lib rtPsewA>manas sp. AB284047

180 Горееой Утес, донные осадки GU911426 --------------

t |

22 Горееой Утес, водная толща EU449120 Pseudomonas sp"UQ406817 i/ Горееой Утес водная пю.тщд EU449118 Pseudomonas sp. am4iuozd Pseudomonas sp. FJ424487

2 Горееой Утес, водная толща EU449117 Pseudomonas iiuorescens АМ410631 2i Горееой Утес, водная тояща EU49654 и

я >

Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 165 рРНК чистых культур аэробных микроорганизмов, изолированных из водной толщи и битумных построек и осадка района естественного нефтепроявления м. Горевой Утес на озере Байкал. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов.

Nocardia sp.Hi 7-1 (DQ250039) R. erythropolis st.3S-0

2 битумная построй» Nse 7 new alk 3F

R. eryttircpolis (АВ377Э07) R. erythropoljs Isolate 3C-9(ABE72965) Rhodxoccus sp. Q15(AF3881B1) Rhocbcoixus sp. SH22 (AJ833926) Rhotococctissp. R121 (DQ983831) R- erythropolis St. 23-D(AJ301870) R erythropolis PR4(BAH31454) Shewanella sp. NJ49(AD021492) 1 битумная постройка №8

3 битумная постройка N£8 12 alk GUW

[ R. ruber (a&B) AJ833921 П— R. erythropolis PR4(BAH32870) -48 alk DOT 1R. tasdans(AJ301873) ■ 18 alk GUW

R. opacus AJ833973 ~~L Rhodococcus sp. NTU1(DQ173199)

R. еГуШюроШ РК4(ВАК 33111)

Я. егутгоро/в РЯ4(ВАН36166)

25-6 постройка N23

-36 построжа N83

-4 постройка №28

-1 е водная толща

-5 построжа N28

Microbacterium 5р. ITRH47(FJ014910) Dietzia sp. ITRH66(FJ014913) Arthmbactersp. ITRH48(FJ014812) Strep iomyces sp. 1TRH51(FJ014911)

Рнс. 5. Филогенетическое положение 5 штаммов из битумной постройки №8 относительно гомологов и штаммов из битумной постройки №3 и осадка, отобранного в районе естественного неф-тепроявления у м. Горевой Утёс, определённое исходя из анализа нуклеотидных последовательностей ЫкВ-генов Масштаб: 10 нуклеотидных замен на каждые 100 нуклеотидов.

из них имеет весьма близкого аналога среди 4 расшифрованных а1к-генов Я. егу1-ИгороПэ РЯ4. Это позволяет предположить, что а№>гены, присутствующие в геноме штамма №4, выполняют несколько различающихся функций, например, кодируют ферменты, обладающие способностью окислять алканы различной длины.

Глава 6. Исследование выделенных штаммов Шюйососсиь егуГкгороЧь в лабораторных условиях

В эксперименте установлено, что все штаммы утилизировали с разной интенсивностью «-алканы с длиной цепи С23-С29, концентрация других гомологов уменьшалась равномерно (рис. 6). В состав постройки №8 входят «-алканы с длиной цепи С22-С34 (рис. 1), а выделенные нами штаммы микроорганизмов утилизируют «-алканы С12-С29. Таким образом, отсутствие и-алканов С12-С21 в постройке частично может быть обусловлено их потреблением бактериями, в том числе и представителями рода ШоЛососсиз.

У штамма Я. егуЛгороИя №4 была исследована способность продуцировать биосурфактанты. Для этого при 22 °С проводили культивирование в течение 456 ч в присутствии и-гексадекана в качестве единственного источника углерода. Через 240 ч в культуральной жидкости под слоем гексадекана образовались флоккулы, которые в покое слипались друг с другом, увеличиваясь в размере. При возобновлении перемешивания, они разрушались и оставались лишь мелкие. Флоккулы проэкстрагировали реактивом Фолча, а экстракт проанализировали методом двумерной тонкослойной хроматографии. При

Рис. 6. Деградация и-апканов выделенными штам-опрыскивании водой наряду с пят- мами д егуЛгороШ в среде Раймонда в присутст-нами, расположившимися на диаго- вии нефти. Серые столбцы - начальные концентра- _ ции л-алканов, белые - конечные, через 92 ч при 22 нали, были обнаружены пятна, сме- ос

ставшиеся от диагонали вниз. Известно, что в число биосурфактантов продуцируемых родококками входят глико-липиды, в частности, трегалозодимиколат. Остатки глюкозы в последнем образуют отрицательно заряженный боратный комплекс. Очевидно, что упомянутые выше пятна могут принадлежать такому гликолипиду.

ВЫВОДЫ

1. В битумных постройках, обнаруженных в районе естественного выхода нефти в Байкале на глубине 900 м, обитают микроорганизмы, относящиеся к доменам Агскаеа и Вас1егше. С помощью метагеномного анализа гена 168 рРНК в активной постройке выявлено 4520 и 5197 различных последовательностей архей и бактерий, соответственно, в которые входят представители семейства МеЛапо-загстакя (46%), классов бета- (25%) и гаммапротеобактерий (12%). В неактивной постройке выявлено 1401 и 2200 последовательностей архей и бактерий, соответственно, включающих представителей семейства МейхапоткгоЫаШ (38%), классов альфа- (15%) и бетапротеобактерий (16%). Их соотношение зависело от экологических условий.

2. Из всего разнообразия микроорганизмов, из неактивной постройки культивированием на среде, где в качестве единственного источника углерода была нефть, удалось выделить в чистые культуры 5 активных штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти рода Rhodococcus. На основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, морфологических и физиолого-биохимических свойств они отнесены к виду R. erythropolis. Выделенные штаммы обладают способностью расти в широком диапазоне температур (от +4 до +37 °С) и при различной концентрации NaCl (3 и 5 %).

3. С помощью ПЦР-анализа у всех 5 штаммов удалось выявить aWr-гены, у одного штамма эти гены полностью расшифрованы.

4. В лабораторных экспериментах показано, что все выделенные штаммы R. erythropolis за 92 ч на 60-100 % утилизируют Ci2-C29 л-ачканы, входящие в состав битума построек и разгружающейся нефти. Отсутствие в постройке «-алкапов С12-С21 обусловлено их биодеградацией микроорганизмами. Из культуры штамма №4 выделены гликолипиды.

5. Сумма полученных данных вносит существенный вклад в понимание процессов биодеградации углеводородов в оз. Байкал и описывает новые возможности для практических применений родококков - деструкторов нефти.

Содержание диссертации опубликовано в следующих работах

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Лихошвай A.B. Донные битумные постройки и населяющая их биота по данным обследования озера Байкал с глубоководных обитаемых аппаратов «Мир» / О.М. Хлыстов, Т.И. Земская, Т.Я. Ситникова, И.В. Механикова, И.А. Кайгоро-дова, А.Г. Горшков, O.A. Тимошкин, О.В. Шубенкова, С.М. Черницына, A.B. Ломакина, A.B. Лихошвай, A.M. Сагалевич, В.И. Москвин, В.И. Пересыпкин, H.A. Беляев, М.В. Слипенчук, А.К. Тулохонов, М.А. Грачев / Доклады Академии Наук. 2009. Т. 428. №5. С. 1-4.

2. Лихошвай A.B. Микробные сообщества в районах естественных выходов нефти на озере Байкал / О.Н. Павлова, A.B. Ломакина, A.B. Лихошвай, Г.А. Фёдорова, Т.А. Шишляннкова, Е.С. Корнева, C.B. Букин, Т.И. Земская / Успехи наук о жизни. 2010. №2. С. 169-172.

3. Likhoshvay A. The chemical composition and oil-degrading rhodococci of a deep-water bitumen mound on the bottom of Lake Baikal / A. Likhoshvay, T. Khanaeva, A. Gorshkov, T. Zemskaya, M. Grachev // Geomicrobiology Journal. 2011 (принята в печать).

4. Лихошвай A.B. Микробные сообщества и их способность окислять N-AJIKAHbl в районе разгрузки газо-нефтесодержащих флюидов в Среднем Байкале (м. Го-ревой Утес) / О. Н. Павлова, А. В. Ломакина, А. Г. Горшков, М. Ю. Суслова, А. В. Лихошвай, Т. И. Земская // Известия РАН. 2011 (на рецензии в журнале).

Тезисы и материалы конференций:

1. Лихошвай A.B. Микробные сообщества, участвующие в деградации углеродо-ров в озере Байкал. / Т.И. Земская, О.В. Шубенкова, С.М. Черницына, A.B. Ломакина, A.B. Лихошвай, О.Н. Павлова // Материалы «IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов». - Новосибирск, 2008, С. 136.

2. Лихошвай A.B. Микробные сообщества и фауна холодных сипов и грязевых вулканов в осадках озера Байкал / Т.И. Земская, Т.Я. Ситникова, О.В. Шубенкова, С.М. Черницына, A.B. Ломакина, О.Н. Павлова, И.В. Механикова, A.B. Лихошвай, О.М. Хлыстов // X Съезд Гидробиологического общества при РАН. -Владивосток, 2009. С. 155.

3. Лихошвай A.B. Биологическое сообщество битумных построек из района не-втепроявления у м. Горевой Утёс, Средний Байкал // С.М. Черницына, A.B. Лихошвай, A.B. Ломакина, О.Н. Павлова Т.И., Земская, Т.Я. Ситникова // Пятая Верещагинская Байкальская конференция, Международная научная школа для молодежи «Экология крупных водоемов и их бассейнов», 16 объединенный семинар по проблемам изучения региональных осаждений из атмосферы: тезисы докладов и стендовых сообщений. - Иркутск, 2010. С. 126-127.

4. Лихошвай Ал.В. Бактерии из битумных построек на дне озера Байкал, деградирующие нефть / Ал.В. Лихошвай, Т.А. Ханаева, A.B. Ломакина, А.Г. Горшков, О.Н. Павлова, Т.И. Земская, М.А. Грачёв, М.В. Слепенчук // Там же. С. 139-141.

5. Лихошвай A.B. Первые результаты поиска углеводородокисляющих бактерий, изолированных из оз. Байкал - продуцентов поверхностно-активных веществ / О.Н. Павлова, Г.А. Федорова, Т.А. Шишлянникова, Е.С. Корнева, A.B. Лихошвай, C.B. Букин, A.B. Ломакина, Т.И. Земская //Там же. С. 149-150.

6. Likhoshway A.V. Comparative description of communities from bottom sediments at two sites of natural oil seeps in Lake Baikal: analysis of nucleotide sequences of 16S r RNA gene / A.V. Lomakina, O.N. Pavlova, A.V. Likhoshway, A.G. Gorshkov, V.l. Moskvin, I.V. Morozov, V. Nisheta, T.I. Zemskaya // 10th International Conference on Gas in Marine Sediments. - Listvyanka (Lake Baikal), 2010. P. 122.

7. Likhoshvay Al.V. The Chemical composition and oil-degrading bacteria of a deep water bitumen mound in Lake Baikal / Al.V. Likhoshvay, T.A. Khanaeva, T.I. Zemskaya // 32nd Annual Lome Genome Conference, 2011. P. 385.

8. Лихошвай A.B. Сравнительная характеристика микроорганизмов p. Rhodococcus и p. Pseudomonas, образующих биосурфактанты / О.Н. Павлова, A.B. Лихошвай, Г.А. Федорова, Т.А. Шишлянникова, C.B. Букин, A.B. Ломакина, Т.И. Земская // Материалы 3-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с международным участием. - Иркутск, 2011. С. 94.

Подписано к печати 24.11.2011 г. Формат60*84/16. Объем 1,2 п.л. Тираж 100экз. Заказ№ 537. Издательство Института географин им. В. Б. Сочавы СО РАН. 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лихошвай, Александр Викторович

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Распространение районов естественных выходов нефти в водных экосистемах.

1.2. Бактерии рода Ккоёососст, осуществляющие деструкцию углеводородов.

1.3. Биосурфактанты, синтезируемые бактериями рода Ююйососсш.

1.4. Ферментативное и генетическое обоснование деградации углеводородов представителями рода Шгойососсив.

1.5. История изучения нефтепроявлений на озере Байкал.

1.6. Исследование биодеструкции углеводородов.

Глава 2. Экологическая и микробиологическая характеристика района мыса Горевой Утёс.

2.1. Состав байкальской нефти и битумных построек.

2.2. Состав микробного сообщества в районе мыса Горевой Утёс.

Глава 3. Объекты и методы исследования.

Глава 4. Химическое и микробиологическое исследование битума неактивной постройки.

4.1. Химический состав постройки №8.

4.2. Анализ суммарного микробного сообщества битумных построек на основе пиросеквенирования.

4.3. Исследование экологических, физиолого-биохимических и морфологических характеристик штаммов, выделенных из битумной постройки №8.

4.4. Филогенетическая принадлежность выделенных штаммов на основании анализа структуры гена 16Б рРНК.

Глава 5. Идентификация генов у выделенных штаммов Шюйососст егуЖгороШ, участвующих в деструкции я-алканов.

5.1. Исследование а1к-генов у выделенных штаммов Якойососст егуШгороШ.

5.2. Полногеномное секвенирование а1кВ-теяов штамма №4.

Глава 6. Исследование выделенных штаммов Шойососсш егуЛгороШ в лабораторных условиях.

6.1. Биодеградация и-алканов выделенными штаммами в лабораторных условиях.

6.2. Анализ гликолипидов, продуцируемых штаммом Югойососсш егуЖгороШ №4.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экология бактерий рода Rhodococcus из глубоководных битумных построек озера Байкал"

Актуальность проблемы. Бактерии рода Rhodococcus, относящиеся к филуму Actinobacteria, семейству Nocardiaceae, обитают в почве, соляных шахтах, антарктических льдах, морских осадках, сточных водах и многих других экосистемах (Construction of eco-collection., 1994; Naphthalene-degrading bacteria, 2011; Lo Giudice et al., 2007; Helmke, 1984; Rhodococcus koreensis., 2000; Ленгелер, 2005; Alvarez, 2010). Отдельные представители данного рода способны использовать в качестве единственного источника углерода широкий спектр органических веществ, в том числе углеводороды, опасные с точки зрения экологии, в связи с этим их изучение имеет не только научное, но и прикладное значение (Larkin et al., 2006). Родококки способны окислять высокомолекулярные я-алканы и сложные хлорорганические соединения, которые трудно поддаются биодеградации (Alkane utilization., 2006). Представители рода Rhodococcus утилизируют бензол, толуол, нафталин (Liu et al., 2009), гербициды (De Schrijver, 1999) и полихлорбифенилы (Characterization of extradiol., 2003). Отдельные штаммы в настоящее время используются при производстве биопрепаратов, применяемых для биоремедиации при нефтяных загрязнениях (Ovchinnikova, 2009; Bioremediation of crude., 2010).

1. Оценить разнообразие микроорганизмов в двух битумных постройках с различной активностью разгрузки нефти.

3. Установить филогенетическую принадлежность выделенных штаммов, исследовать физиолого-биохимические свойства и морфологию полученных штаммов бактерий рода Ккойососст.

4. Установить наличие алкан-1-монооксигеназ - ферментов, инициирующих биодеструкцию я-алканов, и расшифровать структуру а1к-генов у одного из штаммов КНойососсш.

5. Исследовать способность штаммов рода Ккойососст к синтезу биосурфактантов класса гликолипидов.

6. Провести сравнение структур алкан-1-монооксигеназ одного из штаммов рода Якойососст, выделенных из битумной постройки, между собой и со структурами этих генов других представителей.

Научная новизна. Впервые исследована филогенетическая структура микробных сообществ в двух битумных постройках на дне Байкала, различающихся по химическому составу и интенсивности разгружающихся через них углеводородов. Установлено, что в битумных постройках обитают представители двух доменов: Агскаеа и ВаМеггае, включающие микроорганизмы различных таксонов. Установлено, что колонии из неактивной битумной постройки, способные расти на агаре в присутствии нефти в качестве единственного источника углерода, по морфофизиологическим признакам могут быть отнесены к роду Rhodococcus. Пять штаммов микроорганизмов в лабораторных экспериментах деградировали широкий спектр я-алканов (С12-С29). Впервые в геноме одного из байкальских штаммов полностью расшифрованы гены, кодирующие ферменты, осуществляющие окисление я-алканов. Показано, что структуры этих генов гомологичны структурам генов бактерий рода Rhodococcus, обнаруженных в морской воде и почве, загрязнённой нефтью.

Практическая значимость работы. Получены и охарактеризованы 5 штаммов рода Rhodococcus, изолированных из неактивной битумной постройки на дне (глубина 900 м) озера Байкал. Установлена их способность деградировать нефть и я-алканы, что позволяет рекомендовать их как возможные компоненты биопрепаратов, применяемых для биоремедиации холодноводных водоёмов. Показано, что штамм Rhodococcus erythropolis №4 выделяет биосурфактанты гликолипидной природы. Полученные данные по структуре я/&-генов могут быть использованы при разработке структур праймеров, необходимых для детекции этих генов у других микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Битумные постройки, обнаруженные на дне озера Байкал в районе естественного нефтепроявления на глубине 900 м, различаются населяющими их микроорганизмами. Видовой состав микроорганизмов, населяющих активную постройку, из которой выделялась нефть, и неактивную (нефть не выделялась), различный.

2. Из неактивной битумной постройки при культивировании на среде, в которой в качестве единственного источника углерода использовалась нефть, выделены только представители рода Rhodococcus. Комплексный анализ 5 выделенных штаммов микробиологическими, молекулярнобиологическими, электронно-микроскопическими и хроматографическим методами показал, что все штаммы относятся к виду Rhodococcus erythropolis. Они способны участвовать в деструкции природных углеводородов и обладают высокой экологической пластичностью -способностью к росту в широком диапазоне (от +4 до +37 °С) температур и при концентрациях NaCl от 3 и 5%.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Х-ом Съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009), V-ой Верещагинской байкальской международной конференции (Иркутск, 2010), 10 International Conference on Gas in Marune Sediments (Листвянка, 2010), 32nd Annual Lome Genome Conference (Лорн, Автстралия, 2011), 3-ем Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах» (Иркутск, 2011).

Заключение Диссертация по теме "Экология (по отраслям)", Лихошвай, Александр Викторович

выводы

1. В битумных постройках, обнаруженных в районе естественного выхода нефти в Байкале на глубине 900 м, обитают микроорганизмы, относящиеся к доменам Агскаеа и Вас1епае. С помощью метагеномного анализа гена 168 рРНК в активной постройке выявлено 4520 и 5197 различных последовательностей архей и бактерий, соответственно, в которые входят представители семейства МеШапоБагста1е$ (46%), классов бета- (25%) и гаммапротеобактерий (12%). В неактивной постройке выявлено 1401 и 2200 последовательностей архей и бактерий, соответственно, включающих представителей семейства МеЛапотгсгоЫа1ез (38%), классов альфа- (15%) и бетапротеобактерий (16%). Их соотношение зависело от экологических условий.

2. Из всего разнообразия микроорганизмов, из неактивной постройки культивированием на среде, где в качестве единственного источника углерода была нефть, удалось выделить в чистые культуры 5 активных штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти рода Яко(1ососст. На основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК, морфологических и физиолого-биохимических свойств они отнесены к виду Я. егуЖгороШ. Выделенные штаммы обладают способностью расти в широком диапазоне температур (от +4 до +37 °С) и при различной концентрации №С1 (3 и 5 %).

3. С помощью ПЦР-анализа у всех 5 штаммов удалось выявить а1к-гены, у одного штамма эти гены полностью расшифрованы.

4. В лабораторных экспериментах показано, что все выделенные штаммы Я. егуЖгороШ за 92 ч на 60-100 % утилизируют С12-С29 «-алканы, входящие в состав битума построек и разгружающейся нефти. Отсутствие в постройке я-алканов С12-С21 обусловлено их биодеградацией микроорганизмами. Из культуры штамма №4 выделены гликолипиды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведены комплексные исследования битумных построек №3 (активная) и №8 (неактивная), обнаруженных при погружениях ГОА «Мир» в августе 2008 г. Хроматографический анализ выявил наличие 77% я-алканов в активной постройке и 15% в неактивной. Тем не менее, при культивировании образцов на синтетической среде с добавлением нефти, из постройки №8, были выделены только представители рода Rhodococcus.

С использованием системы массового параллельного секвенирования Roche исследована филогенетическая структура (по гену 16S рРНК) в активной и неактивной битумных построек, выявлен различный состав микробных сообществ. Впервые в специфичном экотопе, практически состоящем только из тяжелых углеводородов - битумов - были обнаружены, выделены и доведены до состояния чистых культур 5 штаммов рода Rhodococcus. По данным морфологического, физиолого-биохимического анализа, а также на основании структуры нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК выделенные из неактивной постройки штаммы микроорганизмов были отнесены к виду Rhodococcus erythropolis.

Выделенные штаммы были способны расти в широком диапазоне температур от +4 до 37 °С, с оптимумом роста при +22 °С. Кроме того, как показали исследования, они обладали способностью выдерживать высокую соленость в среде, что свидетельствует о их пластичности. Это подтверждается натурными исследованиями, бактерии рода Rhodococcus встречаются в активной битумной постройке №3, в неактивной постройке №8, в осадке, а также в нефти, собранной с водной поверхности в районе естественных нефтепроявлений у мыса Горевой Утёс. Более того, эти бактерии также встречаются и в других экотопах, зачастую очень отличающихся друг от друга. Низкое содержание актинобактерий в постройках является следствием микроаэрофильных условий (Comparative 16S rRNA., 2000; Allgaier, 2006; Taipale et al., 2009).

В лабораторных экспериментах по изучению деструкции и-алканов выделенными штаммами Я. егуОггороИБ показано, что они сохранили высокую способность к деструкции углеводородов, выделенные штаммы утилизировали за короткий срок до 100% я-алканов с длиной цепи С12-С29, концентрация более лёгких гомологов при этом не увеличилась. Как описано в Главе 1, конечными продуктами биодеструкции углеводородов являются жирные кислоты (АбЬ^ е1 а1., 1994) (рис. 7). Эти вещества менее инертны по сравнению с п-алканами и нетоксичны. То есть, бактерии рода Якойососст минерализуют углеводороды и снабжают другие организмы субстратом для развития во многих экосистемах, в том числе и в пресноводных. Это подтверждается данными о том, что пятна нефти на водной поверхности в районе естественных нефтепроявлений у мыса Горевой Утёс не распространяются по площади более чем на 1 км (Хлыстов и др., 2007). В этом районе сформировано микробное сообщество, где доминируют углеводородокисляющие микроорганизмы (нефть - 190 кл./мл и п-алканы -300-500 кл./мл) (Исследование микробного., 2008). В состав битумной постройки №8 входят С22-С34 и-алканы. Таким образом, высказано предположение, что выделенные штаммы Я. егуЖгороШ могут со временем разрушать саму постройку. Это подтверждается отсутствием целых битумных построек в районе естественных нефтепроявлений у реки Большая Зеленовская.

Полимеразной цепной реакцией в ДНК 5 штаммов с использованием специфичных праймеров выявлены а1кВ1-тсшл, кодирующие алкангидроксилазу - фермент, инициирующий биодеструкцию посредством окисления короткоцепочечных я-алканов. Установлено, что, несмотря на очень близкое сходство штаммов по данным структуры гена 168 рРНК, по <я/^-генам они существенно различаются, а один штамм - №2 - имеет в своём наборе а1кВ1- и аШ?3-гены, то есть способен окислять как короткоцепочечные, так и длинноцепочечные и-алканы. Эта способность была подтверждена в лабораторных условиях по изучению биодеструкции п-алканов.

В геноме штамма Я. егу^гороШ №4 полностью расшифрованы и транслированы в аминокислотные последовательности структуры четырёх аШ?-генов, кодирующих алкан-1-монооксигеназу. Показано, что, как и у других представителей рода ЯНойососст, у данного штамма имеются строго консервативные фрагменты, в одном из которых (ЕНКТОНН) обнаружена несинонемичная замена. Аналогичная структура найдена у Я. егуЖгороШ БК121 (04385381), выделенного из почвы, загрязнённой нефтью и Я. егуМгороШ РЯ4 (002768905) - из морской воды Тихого океана с глубины 1 км. Такая модификация структуры аМ>гена, вероятно, отвечает за синтез специфичной алкан-1-монооксигеназы, способной окислять тяжёлые п-алканы, из которых состоит битумная постройка, в условиях низкой температуры (3,5°С) и высокого давления (90 атм.). Гомология аминокислотных последовательностей алкан-1-гидроксилаз штамма Я. егуЖгороШ №4 с аналогичными последовательностями этих микроорганизмов составляет 94-97%.

Также установлено, что в отличие от вышеупомянутого гомолога Я. егуЖгороНя РЯ4, штамм Я. егуМгороШ №4 способен деградировать п-алканы более широкого гомологического ряда (Сз-Сго против С12-С29, соответственно). У штамма Я. егуГкгороИз №4 идентифицированы клеточносвязанные гликолипиды, увеличивающие адгезию клеток к гидрофобной фазе органического субстрата, позволяя им тем самым эффективно осуществлять деструкцию её компонентов. Косвенно на гликолипиды указывает и образование штаммами флоккул (рис. 22) при культивации штаммов с нефтью и я-гексадеканом.

Таким образом, обладая способностью окислять нефть, поступающую из глубины озера, бактерии рода Яко^соссиэ участвуют в деструкции нефтяных пятен на водной поверхности, а также могут утилизировать неактивные битумные постройки на дне Байкала, нефти при её миграции сквозь осадок и водную толщу. Следовательно, бактерии рода Якос1ососсиз играют существенную роль в экосистеме озера Байкал, поддерживая чистоту его вод.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лихошвай, Александр Викторович, Иркутск

1. Биотрансформация (3-ситостерола и его сложных эфиров актинобактериями рода Шойососсиз / И. Б. Ившина, В. В. Гришко, Е. М. Ноговицина и др. // Прикл. биох. и микробиол. 2005. Т. 41. - № 6. - С. 626-633.

2. Глубоководное бурение на Байкале основные результаты / М. И. Кузьмин и др. // Геология и геофизика. - 2001. - Т.42. - № 1-2. - С. 834.

3. Гомологи гена А1кВ термофильных бактерий рода СеоЬсШт / Т.П. Турова и др. // Мол. биол. 2008, Т. 42, № 2. С. 247-257.

4. Готтшлак Г. Метаболизм бактерий / Г. Готтшлак // Москва : Мир, 1982. -310 с.

5. Грачев М. А. О современном состоянии экологической системы озера Байкал / М. А. Грачев // Новосибирск : СО РАН, 2002. 156 с.

6. Донные битумные постройки и населяющая их биота по данным обследования озера Байкал с глубоководных обитаемых аппаратов «Мир» / О. М. Хлыстов и др. // Докл. АН. сер. геогр. 2009. Т. 428. № 5. -С. 1-4.

7. Жданова Н. В. Биотехнологии на основе сухого активного ила для увеличения нефтеотдачи пластов / Н В. Жданова, У. Н. Садыков, В. Р. Баязитова // Интервал. 2000. - Т. 4-5, № 15-16. - С. 4.

8. Жуков Д. В. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами / Д. В. Жуков, В. П. Мурыгина, В. Калюжный // Усп. совр. биол. 2006. - Т. 126. - № 3. - С. 285-296.

9. Ившина И. Б. Адаптационные механизмы выживания алконотрофных родококков, реализованные в неблагоприятных условиях среды / И. Б. Ившина, Т. Н. Каменских, Б. А. Анохин // Вестн. ПГУ. 2007. № 5. - С. 107-112.

10. Исследование микробного сообщества озера Байкал в районе естественных нефтепроявлений / О. Н. Павлова, Т. И. Земская, А. Г.

11. Горшков и др. // Прикл. биох. и микробиол. 2008. Т.44. - № 3. - С. 319-323.

12. Князева Л. М. Современные осадки Южной части озера Байкал / Л. М. Князева // Тр. БЛС АН СССР. 1957. - Т. 15. - С. 159-198.

13. Кожов М. М. Биология озера Байкал / М. М. Кожов. Москва : АН СССР, 1962.-Т. 315.-№28,- С. 295-313.

14. Кожов М. М. Очерки по байкаловедению / М. М. Кожов. Вост.-Сиб. книж. изд-во. - Иркутск. - 1972. 254 с. (27). С. 239 - 252.

15. Куюкина М. С. Биосурфактанты актинобактерий рода Ккойвсоссиз'. индуцированный биосинтез, свойства, применение : Дис. . док. биол. Наук : 03.00.07 / М. С. Куюкина ; ИЭГМ УрО РАН. Пермь, 2007. - 298 с.

16. Ленгелер И. Современная микробиология. Прокариоты. В 2 т. / И. Ленгелер, Г. Древе, Г. Шлегель. Иркутск : Мир, 2005. - 656 с.

17. Микробные сообщества в районах естественных выходов нефти на озере Байкал / О. Н. Павлова, А. В. Ломакина, А. В. Лихошвай и др. // УНЖ. 2010,-№2. С. 169-172.

18. Намсараев Б. Б. Микробиологические процессы круговорота углерода в донных осадках озера Байкал / Б. Б. Намсараев, Т. И. Земская. -Новосибирск: Изд-во СО РАН, Филиал «ГЕО», 2000. 160 с. : ил -Библиогр.: с. 134-152.

19. Нефтегазоностность отложений озера Байкал / А. Э. Конторович, В. А. Каширцев, В. И. Москвин и др. // Геология и геофизика. 2007. - Т.48. - № 12.-С. 1346-1356.

20. Петрова В. И. Изменение численности бактерий в экспериментах с добавками нефти / В. И. Петрова, Л. М. Мамонтова // Структура и функционировании сообществ водных микроорганизмов. Изд-во Наука, 1986.-С. 144-149.

21. Разнообразие культивируемых аэробных микроорганизмов в районах естественных выходов нефти на озере Байкал / А. В. Ломакина и др. // Изв. РАН, сер. биол. 2009. №.5. С. 515-522.

22. Розанова Е. П. Микрофлора нефтяных месторождений / Е. П. Розанова, И. Кузнецов. Москва : Наука, 1974. 197 с.

23. Романенко В. М. Экология микроорганизмов пресных водоёмов / В. М. Романенко, С. И. Кузнецов. Москва : Наука, 1974, 194 с.

24. Рябухин Г. Е. К изучению Байкальского месторождения нефти / Г. Е. Рябухин. Новосибирск : Тр. нефт. геол. развед. инст. серия биол. 1934. -№ 33.-27 с.

25. Рязанов В. Д. Месторождения озокерита и нефти в Прибайкалье.

26. Материалы совещания по геологии и полезным ископаемым Дальнего

27. Востока / В. Д. Рязанов. Владивосток : Изд-во Дальневост. ун-та, 1928. -мм п р 94 а?

28. Самсонов В. В. Перспективы нефтегазоносности Селенгинской депрессии в свете гидрогеологических исследований / В. В. Самсонов. Геология нефти, 1959.-№ 6.-С. 14-18.

29. Современный уровень нефтепродуктов в воде озера Байкал и его притоков / А. Г. Горшков, И. И. Маринайте, Т. И. Земская и др. // Химия в интересах устойчивого развития. 2010. № 18. - С. 711-718.

30. Сравнительная характеристика микробных сообществ двух районов естественных нефтепроявлений озера Байкал / О. Н. Павлова, Т. И. Земская, А. Г. Горшков и др. // Изв. РАН. сер. биол. 2008. - № 3. - С. 333-340.

31. Углеводородокисляющие микроорганизмы в биоценозах некоторых районах Байкала / С. Д. Талиев, О. М. Кожова, О. А. Моложавая и др. //

32. Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. 1985. -Новосибирск. Изд-во Наука С. 64-74 .

33. Филогенетическое разнообразие бактерий на различных глубинах Южного Байкала, выявленное по последовательностям 16S рРНК / Денисова JI. Я., Н. Л. Белькова, И. И. Тулохонов и др. // Сибирский экологический журнал. 1999. № 6. - С. 619-624.

34. Хлыстов О. М. Нефть в озере мирового наследия / О. М. Хлыстов, А. Г. Горшков, А. В. Егоров // Докл. АН. 2007. - Т. 414, № 5. - С. 656-659.

35. Шимараев М. Н. К вопросу о стратификации и механизме конвекции в Байкале / М. Н. Шимараев, Н. Г. Гранин // Докл. АН СССР. 1991. - Т. 321, №2.-С. 381-385.

36. Юлбарисов Э. М. Микробиологические методы повышения охвата пласта заводнением на различных стадиях разработки / Э. М. Юлбарисов // Нефтепромысловое дело. 1982. - № 12. - С. 9-10.

37. Abdel-Mawgoud А. М. Rhamnolipids: diversity of structures, microbial origins, and roles / A. M. Abdel-Mawgoud, F. Lepine, E. Deziel // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. - No. 86. - P. 1323-1336.

38. Algicidal activity7 of rhamnolipid biosurfactants produced by Pseudomonas aeruginosa / X. L. Wang et al. // Harmful Algae. 2005. No. 4 - P. 433-443.

39. Alkane hydroxylases in gram-positive strains / J. B. Van Beilen et al. // Environ. Microbiol. 2002. No. 4. - P. 676-682.

40. Alkane utilization by Rhodococcus strain NTU-1 alone and in its natural association with Bacillus fusiformis L-l and Ochrobactrum sp. / A. Luis et al. //Biotechnol. Prog. 2006. No. 22. - P. 1368-1373.

41. Allgaier M. Diversity and seasonal dynamics of actinobacteria populations in four lakes in northeastern Germany / M. Allgaier, H. P. Grossart // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - No. 72. - P. 3489-3497.

42. Alvarez H. M. Biology of Rhodococcus / H. M. Alvarez // Microbiology Monographs : London, New York, Heidelberg, Dordrecht: Springer, 2010. -P. 1-361.

43. Analysis of Pseudomonas putida alkane degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk-genes / J. B. Van Beilen et al.//Microbiology. 2001.-No. 147.-P. 1621-1630.

44. Ashraf W. Bacterial oxidation of propane // W. Ashraf, A. Mihdhir, J.C. Murrell // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - No. 122. - P. 1-6.

45. Asselineau C. Trehalose-containing glycolipids / C. Asselineau, J. Asselineau // Prog. Chem. Fats other Lipids. 1978. - No. 16. - P. 59-99.

46. A yeast glycolipid biosurfactant, mannosylerythritol lipid, shows high binding affinity towards lectins on a self-assembled monolayer system / M. Konishi et al. // Biotechnol. Lett. 2007. No. 29. - P. 473-480.

47. Bacterioplankton community composition along a salinity gradient of sixteen high-mountain lakes located on the Tibetan Plateau, China / Q. L. Wu et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2006. No. 72. - P. 5478-5485.

48. Banat I. M. Potential commercial applications of microbial surfactants /1. M. Banat, R. S. Makkar, S. S. Cameotra // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. -No. 53.-P. 495-508.

49. Baptist J. N. Hydrocarbon oxidation by a bacterial enzyme system: I products of octane oxidation /' J. N. Baptist, R. K. Gholson, M. J. Coon // Biochim. Biophys. Acta. 1963. No. 69. - P. 40-47.

50. Bergey's manual of determinative bacteriology / G. J. Holt et al.; ed. G. J. Holt. Baltimore, Philadelphia, Hong Kong, London, Munich, Sydney, Tokyo : A Waverly Company, 1994. - 9th ed. - 800 p.

51. Bergstrom S. On a metabolic product of Ps. pyocyanea. Pyolipic acid, active against M. tuberculosis / S. Bergstrom, H. Theorell, H. Davide // Arkiv. Chem. Mineral. Geol. 1946a. - V. 23A, No. 13. - P. 1-12.

52. Bergström S. Pyolipic acid. A metabolic product of Pseudomonas pyocyanea active against Mycobacterium tuberculosis / S. Bergström, H. Theorell, H. Davide // Arch. Biochem. Biophys. 1946b. - No. 10. - P. 165-166.

53. Biers E. J. Prokaryotic genomes and diversity in surface ocean waters: interrogating the global ocean sampling metagenome / E. J. Biers, S. L. Sun,

54. E. C. Howard // Appl. Environ. Microbiol. 2009. - No. 75. - P. 2221-2229.

55. Biogeography and ecological setting of Indian ocean hydrothermal vents / C. L. Van Dover et al. // Science. 2001. No. 294. - P. 818-823.

56. Bioremidiation of coastal areas 5 years after Nakhodka oil spill in the Sea of Japan: isolation and characterization of hydrocarbon-degrading bacteria / S. K. Chaerun et al. // Environ. Int. 2004. V. 30. P. 911-922.

57. Bioremediation of crude oil-contaminated soil using slurry-phase biological treatment and land farming techniques soil and sediment contamination / M. S. Kuyukina et al. // Int. J. 2010.-V. 12, No. l.-P. 85-99.

58. Britton L. N. Microbial degradation of aliphatic hydrocarbons / L. N. Britton // New York : Marcel Dekker, 1984. Microbial degradation of organic compounds. - P. 89-129.

59. Chakrabarty A. M. Plasmids in Pseudomonas /' A. Chakrabarty // Ann. Rev. Genet. 1976. - V. 10. - P. 7-30.

60. Characterization and micellization of rhamnolipidic fractions and crude extracts produced by Pseudomonas aeruginosa mutant MIG-N146 / Y. P. Guo et al. // J. Colloid Interface Sei. 2009. No. 331. - P. 356-363.

61. Characterization of extradiol dioxygenases from a polychlorinated biphenyl-degrading strain that possess higher specificities for chlorinated metabolites /

62. F. H. Vaillancourt et al. // J. Bacteriol. 2003. No. 185. - P. 1253-1260.

63. Chemical structure of lipid bioflocculant produced by Rhodococcus erythropolis / R. Kurane et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. No. 59.-P. 1652-1656.

64. Clifron C. G. Hydrothermal petroleums from Yellowstone National Park, Wyoming, U.S.A. / C. G. Clifron // Appl. Geochem. 1990. - V. 5. - P. 169191.

65. Comparative 16S rRNA analysis of lake bacterioplankton reveals globally distributed phylogenetic clusters including an abundant group of actinobacteria / F. O. Glöckner et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. -No. 66.-P. 5053-5065.

66. Construction and fine mapping for recombinant plasmids containing the rmB ribosomal RNA operon of E. coli / J. Brosius et al. // Plasmid. 1981. V. 6. P. 112-118.

67. Construction of bacterial consortia that degrade arabian light crude oil / S. Komukai-Nakamura et al. // J. Ferm. Eng. 1996. V. 82, No. 6. - P. 570574.

68. Construction of eco-collection of Paddy Field soil bacteria for population analysis / K. Gorlach et al. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1994. No. 40. P. -509-517.

69. Crystal structure of 4-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from the chlorophenol-utilizing Grampositive Rhodococcus opacus 1CP / M. Ferraroni // J. Biol. Chem. 2004. No. 279. - P. 27646-27655.

70. Davila A. M. Sophorose lipid fermentation with differentiated substrate supply for growth and production phases / A. M. Davila, R. Marchel, J. P. Vandecasteele // Appl. Microbiol. Biotechnol . 1997. - No. 47. - P. 496501.

71. De Schrijver A. Degradation of pesticides by actinomycetes / A. De Schrijver, R. De Mot // Crit. Rev. Microbiol. 1999. - No. 25. - P. 85-119.

72. Development and application of PCR primers for monitoring alkane-degrading bacteria in seawater microcosm during crude oil degradation process / K. Sei et al. // J. Chem. Eng. Jap. 2003. V. 36, No. 10. - P. 11851193.

73. Diversity of alkane hydroxylase systems in the environment / J. B. Van Beilen et al. // OGST. 2003. V. 58, No. 4. - P. 427-440.

74. Diversity of bacterial strains degrading hexadecane in relation to the mode of substrate uptake / M. Bouchez-NaTtali et al. // J. Appl. Microbiol. 1999. -No. 86.-P. 421-428.

75. Drews G. Mikrobiologisches Praktikum / G. Drews. Berlin, Heidelberg, New York : Springer Verlag. 1974. 2nd ed.

76. Effects of crude oil, oil components, and bioremediation on plant growth / K. H. Baek et al. // J. Environ. Sei. Health Tox. Hazard Subst. Environ. Eng. 2004. No. 39. P. 2465-2472.

77. Expression of Rhodococcus opacus alkB Genes in Anhydrous Organic Solvents / Y. Sameshima et al. // J. Biosc. Bioeng. 2008. V. 106, No. 2. -P. 199-203.

78. Extracellular accumulation of mono- and di-Succinoyl trehalose lipids by a strain of rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes / Y. Uchida et al. // Agric. Bioi Chern. 1989. V. 53, No. 3. - P. 757-763.

79. Factors affecting the production of succinoyl trehalose lipids by Rhodococcus erythropolis SD-74 grown on «-alkanes / Y. Uchida et al. // Agric. Biol. Chem. 1989. No. 53. - P. 765-769.

80. Formation, isolation and characterisation of trehalose dimycolates from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes / P. Rapp et al. // J. Gen. Microbiol. 1979. No. 115. - P. 491-503.

81. Functional analysis of alkane hydroxylases from gram-negative and grampositive bacteria / T. H. M. Smits et al. // J. Bacteriol. 2002. No. 184. P. 1733-1742.

82. Gagarin V. G. Three new species of free-living nematodes from Lake Baikal, Russia / V. G. Gagarin, T. V. Naumova // Int. J. Nematology. 2010. - V. 20.-No. 2.-P. 185-193.

83. Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems in Rhodococcus spp. strains Q15 and 16531 / L. G. Whyte et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. No. 68 - P. 5933-5942.

84. Gibson D. T. Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology / D. T. Gibson, R. E. Parales // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. -No. 11.-P. 236-243.

85. Helmke E. Rhodococcus marinonascens sp. nov. An actinomycete from the sea / E. Helmke, H. Weyland // Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. - No. 34. - P. 127-138.

86. Hydrothermal activity at Hook Ridge in the central Bransfield Basin, Antarctica / G. Bohrmann et al. // Geo-Marine Letters. 1999. No. 18. - P. 277-284.

87. Identification of an amino acid position that determines the substrate range of integral membrane alkane hydroxylases / J. B. Van Beilen et al. // J. Bacteriol. 2005. No. 187. - P. 85-91.

88. Isolation and characterization of dibenzofuran-degrading actinomycetes: analysis of multiple extradiol dioxygenase genes in dibenzofuran-degrading Rhodococcus species / T. Iida et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. -No. 66.-P. 1462-1472.

89. Isolation and characterization of indene bioconversion genes from Rhodococcus strain 124 / S. L. Treadway et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999.-V. 51,No. 6.-P. 786-793.

90. Isolation of gram-positive n-alkane degraders from a hydrocarbon-contaminated Mediterranean shoreline / P. Quatrini et al. // J. Appl. Microbiol. 2008.-No. 104.-P. 251-259.

91. Jones A. Genus II. Rhodococcus (Zopf 1891) / A. Jones, M. Goodfellow. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Berlin : Springer, 2010. - V. 4.-P. 1-65.

92. Klatte S. Rhodococcus opacus sp. nov., an unusual nutritionally versatile Rhodococcus species / S. Klatte, R. M. Kroppenstedt, F. A. Rainey // Syst. Appl. Microbiol. 1994. - No. 17. - P. 355-360.

93. Lang S. Surface-active lipids in rhodococci / S. Lang, J. C. Philp // Antonie van Leeuwenhoek Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 1998. - No. 74. - P. 59-70.

94. Lang S. Rhamnose lipids biosynthesis, microbial production and application potential / S. Lang, D. Wullbrandt // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1999. -No. 51.-P. 22-32.

95. Larkin M. J. Biodégradation and Rhodococcus masters of catabolic versatility / M. J. Larkin, L. A. Kulakov, C. C. R. Allen // Biotechnology. -2005,- V. 16.-P. 282-290.

96. Larkin M. J. Biodégradation by members of the genus Rhodococcus: biochemistry, physiology and genetic adaptation / M. J. Larkin, L. A. Kulakov, C. C. R. Allen // Adv. Appl. Microbiol. 2006. - No. 59. - P. 1-29.

97. Liu C. W. Bioremediation of n-alkanes and the formation of biofloccules by Rhodococcus erythropolis NTU-1 under various saline conditions and sea water / C. W. Liu, W. N. Chang, H. S. Liu // Biochem. Eng. J. 2009. - No. 45.-P. 69-75.

98. Lo Giudice A. Characterization of antarctic psychrotrophic bacteria with antibacterial activities against terrestrial microorganisms / A. Lo Giudice, V. Bruni, L. Michaud // J. Basic Microbiol. 2007. - V. 47, No. 6. - P. 496-505.

99. MacDonald I. R. The BP oil spill in the Gulf of Mexico: critical assumptions concerning flow rate / I. R. MacDonald // 10th International Conference on Gas in Marine Sediments. Listvyanka, 2010. - P. 53-54.

100. Maier R. M. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications / R. M. Maier, G. Soberôn-Châvez // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - No. 54. - P. 625-633.

101. Marin M. M. Differential expression of the components of the two alkane hydroxylases from Pseudomonas aeruginosa / M. M. Marin, L. Yuste, F. Rojo //J. Bacteriol.-2003.-No. 185.-P. 3232-3237.

102. Microbial community dynamics during assays of harbor oil spill bioremediation: microscale simulation study / S. Cappello et al. // J. Appl. Microbiol. 2006. V. 102. - P. 184-194.

103. Microbial production and application of sophorolipids /1. N. A. Van Bogaert et al. / Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. No. 76. P. 23-34.

104. Minnikin D. E. Actinomycete envelope lipid and peptidoglycan composition / D. E. Minnikin, A. G. O'Donnell // The biology of the Actinomycetes. -London: 1984.- P. 335-388.

105. Molecular characterization of Rhodococcus equi from horse-breeding farms by means of multiplex PCR for the vap gene family / F. Monego et al. // Curr. Microbiol. 2009. No. 58. - P. 399-403.

106. Molecular Screening for Alkane Hydroxylase Genes in Gram-Negative and Gram-Positive Strains / T. H. M. Smits et al. // Environ. Microbiol. 1999. -No. l.-P. 307-318.

107. Muyzer G. Bacteria from hydrocarbon seep areas growing on short-chainalkanes Text. / G. Muyzer, G. M. van der Kraan // Trends in microbiology.-2008.-No. 16.-P. 138-141.

108. Naphthalene-degrading bacteria of the genus Rhodococcus from the Verkhnekamsk salt mining region of Russia / L. N. Anan'ina et al. // Antonie van Leeuwenhoek Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 2011. V. 100, No. 2. -P. 309-316.

109. New Alkane-Responsive Expression Vectors for E. coli and Pseudomonas / T. H. M. Smits et al. // Plasmid. 2001. V. 46, No. 1. - P. 16-24.

110. Nishiuchi Y. Mycolic acids from Rhodococcus, Gordonia, and Dietzia / Y. Nishiuchi, T. Baba, I. Yano // J. Microbiol. Methods. 2000. - No. 40. - P. 19.

111. Nitschke M. Structure and applications of a rhamnolipid surfactant produced in soybean oil waste / M. Nitschke, S. Costa, J. Contiero // Appl Biochem Biotechnol.-2010.-No. 160.-P. 2066-2074.

112. Nutritional requirements of a biosurfactant producing strain Rhodococcus sp. 51T7 / M. Espuny et al. // Biotechnol. Lett. 1996. No. 18. - P. 521-526.

113. Origin, distribution and alteration of asphalta at Chapopote Knoll, Souther Gulf of Mexico / M. Brüning et al. // Mar. Pet. Geol. 2010. No. 27. - P. 1093-1106.

114. Ovchinnikova A. A. Phenanthrene biodégradation and the interaction of Pseudomonas putida BS3701 and Burkholderia sp. BS3702 in plant rhizosphere / A. A. Ovchinnikova // Microbiology. 2009. V. 78, No. 4. - P. 433-439.

115. Oxygen transfer rate and sophorose lipid production by Candida bombicola / V. Guilmanov et al. II Biotech. Bioeng. 2002. Vol. 77, No.5. - P. 489-494.

116. Phenazines and biosurfactants interact in the biological control of soil-borne diseases caused by Pythium spp. / M. Perneel et al. // Environ. Microbiol. 2008.-No. 10.-P. 778-788.

117. Prince R. C. Substrate preferences in biodesulfurization of diesel range fuels by Rhodococcus sp. strain ECRD-1 / R. C. Prince, M. J. Grossman // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - No. 69. - P. 5833-5838.

118. Physiological adaptations involved in alkane assimilation at a low temperature by Rhodococcus sp. strain Q15 / L. G. Whyte et al. II App. Environ. Microbiol. 1999. V. 65, No. 7. - P. 2961-2968.

119. Physicochemical and antimicrobial properties of new rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa AT 10 from soybean oil refinery wastes / A. Abalos et al. //Langmuir. 2001. No. 17. - P. 1367-1371.

120. Physiological and morphological responses of the soil bacterium Rhodococcus opacus strain PD630 to water stress / H. M. Alvarez et al. II FEMS Microbiol. Ecol. 2004. No. 50. - P. 75-86.

121. Physicochemical characterization and antimicrobial properties of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCBIM 40044 / E. Haba et al. // Biotechnol. Bioeng. 2003. No. 81. - P. 316-322.

122. Purification and characterization of a novel naphthalene dioxygenase from Rhodococcus sp. strain NCIMB12038 / M. J. Larkin et al. // J. Bacteriol. 1999. No. 181. - P. 6200-6204.

123. Pseudomonas aeruginosa virulence analyzed in a Dictyostelium discoideum host system / P. Cosson et al. // J. Bacteriol. 2002. No. 184. - P. 30273033.

124. Raymond R. L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons / R. L. Raymond // Develop. Industry. Microbiol. 1961. - V. 2, No. 1. - P. 23-32.

125. Rhamnolipids from the rhizosphere bacterium Pseudomonas sp. GRP(3) that reduces damping-off disease in Chilli and tomato nurseries / A. Sharma et al. // J Nat Prod. 2007. No. 70. - P. 941-947.

126. Rhodococcus koreensis sp. nov., a 2,4-dinitrophenol-degrading bacterium / J. H. Yoon et al. // Int J Syst Evol Microbiol. 2000. No. 50. - P. 1193-1201.

127. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. Cold Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1989. - 1659 p.

128. Scott C. C. L. A comparative analysis of the ultrastructure of hydrocarbon-oxidizing microorganisms / C.C.L. Scott, W.R. Finnery // J. General Microbiol. 1976. - No. 94. - P. 342-350.

129. Screening three strains of Pseudomonas aeruginosa: prediction of biosurfactant-producer strain / G. Dehghan-Noudeh et al. // Am. J. Appl. Sei. 2009. V. 6, No. 8. - P. 1453-1457.

130. Sequence analysis of three plasmids harboured in Rhodococcus erythropolis strain PR4 / M. Sekine et al. // Environ. Microbiol. 2006. V. 8, No. 2. - P. 334-346.

131. Simoneit B. R. T. Hydrothermal petroleum from lacustrine sedimentary organic matter in the East African Rift / B. R. T. Simoneit, T. A. T. Aboul-Kassim, J. J. Tiercelin // App. geochem. 2000. - No. 15. - P. 355-368.

132. Singh P. Potential applications of microbial surfactants in biomedical sciences / P. Singh, S. S. Cameotra // Trends in Biotechnology. 2004. - V. 22, No. 3. -P. 142-146.

133. Taipale S. Vertical diversity of bacteria in an oxygen-stratified humic lake, evaluated using DNA and phospholipid analyses / S. Taipale, R. I. Jones, M. Tiirola //Aquat. Microb. No Ecol. 2009. 55:1-16.

134. The alkane hydroxylase gene of Burkholderia Cepacia RR10 is under catabolite repression control / M. M. Marin et al. // J. Bacteriol. 2001. No. 183.-P. 4202-4209.

135. The complete genome of Rhodococcus sp. RHA1 provides insights into a catabolic powerhouse / M. P. McLeod et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. 2006. -V. 103, No. 42.-P. 15582-15587.

136. The Sorcerer II global ocean sampling expedition: Northwest Atlantic through Eastern Tropical Pacific / D. B. Rusch et al. // PLoS Biol. 2007. No. 5. - P. 398-431.

137. The world's most spectacular marine hydrocarbon seeps (Coal Oil Point, Santa Barbara Channel, California): quantification of emission / J. S. Hornafius, D. Quigley, B. P. Luyendyk // J. Geophy, Res. 1999. - No. 104. -P. 20703- 20711.

138. Trehalose lipid and branched-hydroxy fatty acids formed by bacteria grown on n-alkanes / T. Suzuki et al. // Agric. Biol. Chem. 1969. No. 33. - P. 1619-1625.

139. Van Beilen J.B. Alkane hydroxylase systems in Pseudomonas aeruginosa strains able to grow on «-octane / J.B. Van Beilen, L. Veenhoff, B. Witholt //

140. New Frontiers in Screening for Microbial Biocatalysts. Elsevier Science,1998.-V. 53.-P. 211-215.

141. Van Beilen J. B. Molecular screening for alkane hydroxylase genes in gramnegative and gram-positive strains / J. B. Van Beilen // Environ. Microbiol.1999.-No. l.-P. 307-318.

142. Van Beilen J.B. Topology of the membrane-bound alkane hydroxylase of Pseudomonas oleovorans / J. B. Van Beilen, D. Penninga, B. Witholt // J. Biol. Chem. 1992. - No. 267.-P. 9194-9201.

143. Widespread fluid expulsion along the seafloor of the Costa Rica convergent margin / G. Bohrmann et al. // Terra Nova. 2002. No. 14. - P. 69-79.

144. Zarate-del Valle PF. Hydrothermal bitumen generated from sedimentary organic matter of rift lakes Lake Chapala, Citala Rift, Western Mexico / P.

145. F. Zarate-del Valle, B. R. T. Simoneit // Appl. geochem. 2005. - No. 20. -P. 2343-2350.

146. Zavarzin G. A. A correlation of phylogenetic diversity in the Proteobacteria with the influences of ecological forces / G. A. Zavarzin, E. Stackebrandt, R.

147. G. E. Murray. Can. J. Microbiol. 1991. - No. 37.-P. 1-6.

Информация о работе

Лихошвай, Александр Викторович
кандидата биологических наук
Иркутск, 2011
ВАК 03.02.08

Диссертация

Экология бактерий рода Rhodococcus из глубоководных битумных построек озера Байкал - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы