Разнообразие микроорганизмов в различных по экологическим условиям осадках оз. Байкал

Черницына, Светлана Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разнообразие микроорганизмов в различных по экологическим условиям осадках оз. Байкал
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Разнообразие микроорганизмов в различных по экологическим условиям осадках оз. Байкал"

На правах рукописи

Черницына Светлана Михайлов на ^ р

РАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В РАЗЛИЧНЫХ ПО ЭКОЛОГИЧЕСКИМ УСЛОВИЯМ ОСАДКАХ ОЗ. БАЙКАЛ

03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2007

003057355

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН (г. Иркутск)

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Земская Тамара Ивановна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Грабович Маргарита Юрьевна

кандидат медицинских наук Терехова Валерия Евгеньевна

Ведущая организация: Институт общей и экспериментальной

биологии СО РАН

Защита состоится 25 мая 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.056.02 при Дальневосточном государственном университете МОН РФ по адресу: 690600, г. Владивосток, Океанский проспект 37. Научный музей ДВГУ. Факс: (4232)268543.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дальневосточного государственного университета МОН РФ.

Автореферат разослан 18 апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю.А. Галышева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Байкал - это уникальное, олиготрофное озеро, возраст которого оценивается в 20-30 млн. лет (Атлас Байкала, 1993). Его характеризуют большие глубины, низкая температура воды и постоянство химического состава вод в глубинной части. Высокая насыщенность кислородом всей толщи воды, низкая концентрация органических веществ и минерализация воды — обуславливают специфические условия жизнедеятельности организмов. 60% флоры и фауны являются эндемиками (Тимошкин, 2001).

В последние годы на Байкале открыты места приповерхностного залегания газовых гидратов и нефтепроявлений, но признаков губительного влияния газов и загрязнения вод Байкала нефтью не выявлено. Очевидно, в этих районах наблюдаются активные процессы, ключевую роль в которых играют микроорганизмы донных осадков и водной толщи.

Ранее микробиологические исследования донных отложений Байкала проводили по следующим направлениям: определение общей численности микроорганизмов и сезонной динамики (Яснитский и др., 1927 Мессинева, 1957; Младова, 1975; Романова, 1963), изучение различных физиологических групп (Никитин, 1967; Луста, Намсараев, 1988; Лаптева, 1990). В исследованиях использовали методы электронной микроскопии, биохимии и радиоизотопии (Максимов, Черных, 1979; Штевнева, Судакова, 1986; Земская и др., 1997). Однако большая часть микроорганизмов не культивируется (более 90%), поэтому при исследовании природных образцов классическими методами часть сообщества остается неизученной (Атапп с1 а\„ 1995).

Использование методов молекулярной биологии позволяет идентифицировать и выявлять отдельные виды микроорганизмов в различных природных сообществах без культивирования.

Цель данной работы - исследование структуры микробных сообществ в осадках районов, различающихся по экологическим условиям. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать эффективные методы выделения суммарной бактериальной ДНК из донных осадков озера Байкал, чтобы избежать ингибирующего действия гуминовых кислот.

2. Исследовать разнообразие микроорганизмов в донных отложениях, сформированных в голоцене и плейстоцене (на примере станции Посольская банка).

3. Исследовать разнообразие микроорганизмов в районе гидротермального источника б. Фролиха и сопоставить с мировыми базами данных.

4. Подтвердить филогенетическое положение бесцветных серных бактерий родов ТШор1оса и ТИШИг1х.

Научная новизна. Впервые проведено изучение микробных сообществ донных осадков озера Байкал, различающихся по экологическим условиям и времени формирования осадка. На основе сравнительного анализа фрагментов гена 16Б рРНК установлено, что в осадках преобладают некультивируемые формы бактерий, последовательности которых имеют невысокую степень гомологии с известными в мировой базе данных. Филогенетический анализ последовательностей показал, что они в основном группируются с последовательностями альфа-, гамма-, бета- и дельта-протеобактерий, Но1ор}ю^а/Лск1пЬас1су\а, Пстс1отусс1сх, АсНпоЬаМепа, Г1гписи1е.ч, СуапоЬаМегш, Вас1его!с1е1е.ч, Уеггисот кгоЫа, ЬЧ1го$р1гае, СЫого/1ех1. Найдены последовательности гомологичные археям, относящиеся к царствам Сгепагскаеога и ЕигуагсИаео/а. Впервые подтверждено филогенетическое положение бесцветных серных бактерий родов ТЫор1оса, ТЪШИггх обитающих в Байкале, а также исследовано сопутствующее микробное сообщество бактерии рода ТЫор1оса. Впервые обнаружены бесцветные серные бактерии в районах впадения рек и местах естественных нефтепроявлений озера Байкал.

Защищаемые положения.

1. Донные осадки, сформированные в различные временные периоды и отличающиеся по экологическим условиям, характеризуются разнообразными микробными сообществами. Для современных голоценовых осадках описано более 18 филогенетических групп, для плейстоценовых глубинных - 5.

2. Бесцветные серные бактерии широко распространены в озере Байкал и обнаружены в районе гидротермального источника бухты Фролиха, местах впадения рек и естественных нефтепроявлениях. Структура гена 16Б рРНК байкальской бактерии рода ТМор1оса на 99% является идентичной последовательностям пресноводных представителей бактерии из других мест обитания: озер Бива и Констанц.

Практическая значимость. Для исследований оценены различные методы выделения ДНК из донных осадков озера Байкал, что особенно важно при работе с осадками различной литологии. Создан банк данных последовательностей фрагментов гена 16Б рРНК, 92 последовательности зарегистрированы в базе данных N081, им присвоены следующие номера: 00916135, Б(2780007, О0338566, 0(3371461-0(3371460, Б0364475-0(^364473, 0(3359154, 00359155, 0035932-00356934, АУ833517-АУ833519, АУ839107-АУ839135, АУ739914-АУ739938, Б<3178146-О0178162. Эта информация может быть использована для построения филогенетических деревьев, выяснения родственной связи между бактериями из других географических мест. Также полученные последовательности могут быть использованы для конструирования групп- и видо-специфичных праймеров и зондов для быстрого и эффективного анализа микробного сообщества донных осадков и воды.

Полученные данные расширяют представления о таксономическом составе донных осадков озера Байкал, позволяют проводить сопоставление с результатами исследования микробных сообществ других озер и океанов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на научно-практической конференции "Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе", Иркутск, 2002; всероссийской конференции "Биоразнообразие и функционирование микробных систем Центральной Азии", Улан-Уде, 2003; международном Байкальском симпозиуме по микробиологии "Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ", Иркутск, 2003; международном рабочем совещании ""Происхождение и эволюция биосферы", г. Новосибирск, 2005; Четвертой Верещагинской Байкальской конференции, Иркутск, 2005; молодежной конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии", Москва, 2005, 2006; международном симпозиуме "Speciation in Ancient Lakes", SIAL IV, Berlin, 2006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы (164 источника, 65 из них зарубежных) и 3 приложений. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, включает 34 рисунка и 12 таблиц.

Автор выражает сердечную благодарность научному руководителю к.б.н. Т.И. Земской, акад. М.А. Грачеву, зав.лаб., к.б.н. Парфеновой В.В., О.М. Хлыстову, д.б.н. С.И. Беликову, Р.В. Адельшину, к.б.н. О.В. Шубенковой, Погодаевой Т.В., Воробьевой С.С. и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии ЛИН СО РАН за оказанную помощь при выполнении работ и обсуждении результатов.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 03-05-65289-а, РФФИ 05-05-65291а, Программы Президиума РАН 18.10, 2006-НШ-112./001/007.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Приведены литературные данные о физико-химическом состоянии осадков озера Байкал и описание их как среды обитания для микроорганизмов. Обобщены данные о численности и разнообразии микроорганизмов донных осадков. Обсуждено современное состояние вопроса, описаны методы изучения структуры микробных сообществ. Описаны физиологические особенности серных бактерий родов Thioploca и Thiothrix.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Пробы донных осадков были отобраны со станции Посольская банка в ходе летний экспедиции 2002 года на НИС "Верещагин". Пробы донных осадков озера Байкал, содержащие бактерии рода Thioploca, были отобраны в конце августа - начале сентября 2003 г., в июне 2005 и июле 2006 гг. с использованием различных пробоотборников (дночерпатель «Океан», бентосная трубка) во время экспедиции на НИС «Верещагин» (рис. I). Нити бактерии рода Thioploca легко определяли визуально. Образцы фиксировали глутаральдегидом, в лаборатории проводили измерение морфологических параметров с использованием эпифлюоресцентного микроскопа «Olympus» при различных увеличениях. Из отмытых нитей выделяли суммарную бактериальную ДНК (Teske et al., 1999) и проводили молекулярный анализ.

Для опенки содержания бактерий в осадке микроорганизмы окрашивали флуорохроМНым красителем ДАФИ (4,6-диамидино-2-фенилиндол) (Gloeckner et al . 1999). Расчет ОЧМ проводили в соответствии с методикой (Романенко, Кузнецов. 1974).

-IL 81'

^ I'1 ^цу

'S imfsvif'

ИМ». 31'

iu*1 а.ча:

53" 0», 24' ; 107" U4.-4T'

^ in?" it. м-

ИИ>1 »3,25'

Рисунок 1. Карта отбора проб. Места обнаружения бесцветной серной бактерии рода ТИгор1оса: 1 - бухта Фролиха, 2 — устье реки Селенга, 3 -Горевой утес, 4 - Баргузинскйй залив, 5 - М. Толстый, 6 - губа Семисосенная, Малое море. Место обнаружения бесцветной серной бактерии рода ТЬк>}Ъпх\ 7 - бухта Змеиная. Точка отбора осадков различных временных периодов: 8 -станция Посольская банка.

Выделение суммарной ДНК из байкальских осадков осуществляли по адаптированной методике (Черницына и др., 2006), Качество ДНК устанавливали спектрофото метрически {Маниатис и др., 1984). Для

амплификации использовали следующие типы праймеров: 500L и 1350R (Lane et al., 1985), Ar20F и Ar958R (Hallam et al., 2003), CYA 106F и CYA 781 Ra (Денисова и др., 1999), 109L и 706R (Kojima et al., 2003). Для ПЦР-ДГГЭ использовали праймеры (GC-clamp) 27F (Lane, 1985) и 517R (Bano et al., 2004). Трансформацию и клонирование проводили по стандартным методикам (Sambrook et al., 1989). Последовательности генов определяли на автоматическом приборе 373А DNA Sequencer (Backmann, США). Для АТ-клонирования суммарной бактериальной ДНК применяли набор реактивов "pGEM-T-Easy Vector Systems" (Promega, США). Денатурирующий градиентный гель-электрофорез проводили на приборе DCode Universal Mutation Detection System (BioRad). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили путем поиска гомологичных последовательностей в банках данных (GenBank, EMBL, DDBJ) с помощью поисковой программы BLASTN (Altschul et al., 1990), а также в базе данных RDPII. Для выравнивания использовали программу CLUSTAL W (Thompson et al., 1994), полученные файлы обрабатывали с помощью программы BioEdit Sequence Editor (Hall, 1999). Филогенетический анализ выполняли с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer & De Wachter, 1994). Для вычисления эволюционных дистанций использовали модель Джукса и Кантора (Jukes & Canto, 1969). Филогенетические деревья строили по методу объединения ближайших соседей (Saitou & Nei, 1987). Достоверность филогенетических связей определяли с помощью бутстрэп-анализа (Felsenstein, 1985).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Методы выделения суммарной бактериальной ДНК

Существует две стратегии экстракции бактериальной ДНК из почв и осадочных пород. Первая основана на прямом лизисе бактериальных клеток без их отделения от частиц породы (ûgram et al., 1987), вторая предполагает предварительное отделение бактерий от частиц породы и проведение лизиса (Holben et al., 1988). В методе прямого лизиса каждая стадия выделения и очистки ДНК зависит от типа породы и качественного состава. При таком способе, выделенная ДНК более полно отражает состав микробного сообщества (Roose-Amsaleg et al., 2001). При второй стратегии, как правило, не происходит полного отделения бактериальных клеток от породы и поэтому исследуется лишь небольшая часть природного сообщества.

Для выделения суммарной бактериальной ДНК из осадков озера Байкал нами были апробированы четыре подхода к выделению ДНК. Критерии качества полученной ДНК следующие: выход, чистота и представительность.

Процедуры выделения ДНК представлены на рис. 2, за основу взяты методики, описанные (Ogram et al., 1987; Holben et al., 1988; Rochelle et al., 1992).

Водная Осадок

фаза (ДНК-2)

Супернатант

Спирт с ацетатом натрия рН 6,5

Электрофорез -ПЦР не идет

Спирт с ацетатом натрия рН 6,5

Осадок (ДНК-1)

Электорфорез . ПЦР не идет

Осадок (ДНК-3)

Электрофорез • ПЦР +

Рисунок 2. Схема методов выделения ДНК.

Первый способ включал отделение бактериальных клеток от частиц осадка с помощью фосфатного буфера и последующее проведение лизиса. Полученный экстракт не давал на агарозном геле характерных для ДНК полос, и реакция ПЦР была отрицательной. Скорее всего, бактериальные клетки, сорбированные на частицах осадка, не отделялись, а удалялись вместе с осадком. При прямом лизисе ДНК из той же самой пробы осадка (рис. 2, способ 2) был получен окрашенный в коричневый цвет продукт, с которым также не удалось получить продукты ПЦР при самых различных условиях ее проведения. В последующих экспериментах для увеличения эффективности лизиса клеток и разрушения их клеточной стенки были введены процедуры механического воздействия и химические реагенты (Zhou et al., 1996; Steffan et al., 1988; Tsai & Oison, 1992). Полученные препараты ДНК были также окрашены в коричневый цвет и не давали ПЦР продукта. Гуминовые кислоты являются одним из основных ингибиторов полимеразной цепной реакции (Tebbe, 1988), поэтому в последующих экспериментах мы попытались провести очистку ДНК от этих соединений. В качестве осадителя гуминовых кислот в процедуру выделения ДНК был введен поливинилполипирролидон (ПВПП) (рис. 2, способ 3) (Rochelle et al., 1992). Наиболее чистая ДНК была получена из поверхностных слоев

осадков, УФ спектры имели максимум поглощения на 260 нм, соотношение А2бо/2зо равнялось 1,5. Для станций Посольская банка и Маленький содержание ДНК на грамм осадка было примерно одинаковым - 1,6 и 1,17 мкг соответственно.

Наиболее эффективно выделение ДНК из осадков озера Байкал осуществлялось при комплексном сочетании процедур (механическое воздействие, использование лизирующих агентов для разрушения бактериальных клеток и реагентов для связывания гуминовых соединений). Этот подход позволил получить ПЦР продукты из различных по возрасту и физико-химическим характеристикам осадков.

3.2. Анализ таксономического состава поверхностных и глубинных слоев донных осадков Посольской банки

Проанализированы физико-химические условия в осадках на станции Посольская банка. Проведенный анализ диатомовых водорослей показал, что поверхностный слой сформирован в голоцене, самый нижний глубинный (357-359 см) - плейстоцене (табл. 1).

Таблица 1. Физико-химическая характеристика анализируемых осадков Посольской банки.

Характеристика Поверхностный слой, 1 -3 см Глубинный слой, 357-359 см

Датирование Современный осадок, голоцен Плейстоцен, более 20 тыс. лет

Физические характеристики Окислен, электропроводность 90 гиБ/вт, влажность 70%, рН 6,8, аэробные условия Восстановлен, электропроводность 275 тБ/зш, влажность 30%, рН 6,9 анаэробные условия

Концентрации ионов, г/мл гидрокарбонат 65,69 59,3

хлорид 0,82 -

нитрат 0,89 -

сульфат 2,68 13,85

натрий 10,7 7,8

калий 9,1 3,8

кальций 6,2 11,6

сумма всех ионов 99,98 99,35

Бактерии, детектируемые с использованием красителя ОАР1, наблюдались во всех слоях исследуемого керна. Их численность достигала 42,5±2,1 млн. кл/г грунта. Из данных слоев осадка была выделена

бактериальная суммарная ДНК. Чтобы оценить разнообразие микробного сообщества, ДНК была амплифицирована с различными групп-специфичными праймерами.

Продукты ПЦР были получены не для всех типов используемых праймеров. С ДНК из поверхностного слоя донных осадков положительный результат достигнут с универсальными эу-, архе- и цианобактериальными праймерами. Для ДНК из глубинного горизонта ПЦР - продукты получены только с использованием универсальных эубактериальных праймеров. Во всех других случаях результат ПЦР анализа был отрицательным, хотя были использованы различные условия реакции.

3.2.1. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов поверхностного слоя осадков станции Посольская банка

Последовательности, полученные из поверхностного слоя осадков с использованием универсальных эубактериальных праймеров, отнесены к следующим филогенетическим группам: зеленые несерные бактерии (Chloroflexi), дельта-протеобактерии, бета-протеобактерии, альфа-протеобактерии, Planctomycetes, Acidobacteria, Verrncomicrobia, Nitrospirae (рис. 3).

Байкальские последовательности 2 и 5 (AY839120, AY839121) отнесены к группе альфа-протеобактерий, ближайшими гомологичными последовательностями являются последовательности некультивируемых бактерий родов Rhodobacteraceae (AY345425, Гавайский архипелаг), Sphingomonas (DQ655708, пресноводная лагуна) и Hyphomicroaceae (DQ395499, глубоководные морские осадки). Байкальские последовательности 6 и 8 (AY839112, AY839113) ближайшими гомологами имеют последовательности бактерий филума Nitrospira, родов Nitrospirae (AJ534687, DQ811893) и Magnetobacterivm (DQ354748), выявленных в подземных водах. Одна последовательность (AY839109) отнесена к группе Verrucomicrobia, ближайшие гомологи выделены из пресноводного озера Северного Висконсина, США (AY792307) и системы пещер в Италии (DQ499213). Две последовательности 3 и 16 (AY839110, AY839111) отнесены к группе Acidobacteria. Ближайшие гомологи этих последовательностей обнаружены в микробных матах (AMI 80890), гидротермах Среднего Атлантического хребта (AY225640), леднике (DQ228377). Две последовательности AY839122 и AY839107 отнесены к группе зеленых несерных бактерий Chloroflexi, представители которых выделены из глубоководных морских осадков (AJ567543) и шельфовых осадков Антарктики (AF424387, AF424388).

Последовательности 1, 11, 15, 26, образуют отдельный кластер на филогенетическом древе и ближайшими гомологами имеют последовательности гамма-протеобактерий (род Pseudomonas), Firmicutes (род Clostridia), некультивируемых бактерий группы ОР8. Последовательности некультивируемых бактерий группы ОР8 впервые были выявлены в горячем источнике Yellowstone (США) (AF027068, AF027067),

затем в грязевом вулкане Хаакон Мосби (AJ704718). Формирование байкальскими последовательностями отдельного кластера на филогенетическом древе может являться следствием их эндемичности.

Одна последовательность 24 (DQ178149) имеет 99% с Synechococcus sp. (Cyanobacteria). Представители этого рода также широко распространены в озере Байкал (Поповская, Белых, 2003). Учитывая небольшие глубины в районе Посольской банки (около 200 м), появление планктонных видов, в том числе и цианобактерий, в ДНК из поверхностных донных отложений не удивительно. Полученная нами из осадков цианобактериальная последовательность близка последовательностям цианобактерий из водной толщи озер Бива и Нагасаки (Япония), Констанц (центральная Европа).

Праймеры, выбранные для анализа цианобактерий, не являются строго специфичными и позволяют выявить бактерии других филогенетических групп. В частности, несколько последовательностей 2, 20, 26, 27, 28 (DQ171146-DQ171148, DQ171151, DQ171153) отнесены к группе Acidobacteria. Одна последовательность 32 (DQ178155) лежит в группе некультивируемых бактерий OPIO (AY607161), которые обнаруживаются в глубоководных морских осадках.

Выявлена последовательность, имеющая 99% гомологии с последовательностями бактерий группы Actinobacteria и отнесенная к некультивируемым Streptomyces.

Анализ клонов, полученных из голоценовых осадков с помощью архейных праймеров, показал невысокую степень сходства с известными последовательностями. Эти клоны показывают наибольшую гомологию с клонами, полученными для глубоководных осадков и горячих источников. Семь последовательностей отнесено к царству Crenarchaeota, входящих в кластер некультивируемых Crenarchaeota. Шесть последовательностей отнесены к царству Euryarcaeota. Пять из них образуют отдельно лежащий кластер на филогенетическом дереве. Данный кластер занимает промежуточное положение между кластерами ANME-1 и ANMF.-2, представители которых участвуют в анаэробном окислении метана (Hinrichs et al., 1999). При более подробном анализе таксономического положения клон 54 был отнесен к кластеру некультивируемых Methanosaeía, участвующих в синтезе метана (Purdy et al., 2003). Процент гомологии составил 98% (рис. 4).

Таким образом, проведенные исследования показали, что использование нескольких типов праймеров специфичных для различных групп бактерий позволяет выявить более широкое микробное разнообразие по сравнению с использованием только универсальных эубактериальных праймеров. Современные поверхностные осадки благодаря более благоприятным условиям (наличие кислорода и легкоусвояемого органического вещества, пористость, окислительно-восстановительный потенциал) обладают большим видовым разнообразием.

______98J

95 7

100

AY225648 пек. бакт. роля Acidobacteriaceae

------Л .Ml 80890 некЛ cidobacteria

__9JL----------------------------AY839111

AY839110 3

AY225640 пек. бакт. рода Acidobacteriaceae

— DQ228377 нек. бакт. рода Acidobacteriaceae __100 AF465656 iitKAcidobacteria

с.

о с

100J

.98

J73I

-95J

__861

АВ238773 иск. АсЫоЪаМспа ----------------------------АУ839108 23

Х81945 РШШа яр.

____0(2329820 нек. бакт. рода

" ;__Р1апс1отусе1асеае

1)<2070834 нек. бакг. рода ВШ1ор1ге11и1а ЛУ922075 нек. бакт. рода СМогоАЫ '

AJ567543 нек. бакт. рода СЫого/1ех1

---------ДУ839122 С

|------()(2811889 иск. бакт. рода СЫопфсхг

\----------------------АЛ'839107 22

AF424387 нек. бакт. рода Chloroflexi

Л¥962684 rhizogenes

—100 Л.1012461 8рЫп%отопа$ есЫпо1йе$

1)0655708 нек. бакт. рода Зр/итяотопая А\'345425 нек. бакт. рода Rhodobacteraceae

-------1)0395499 нек. бакт. рода

НурНоткгоЫасеае

71---------АУ839Ш 5

------АУ839121 2 ^

Л.1534687 нек. бакт. рода Nitrospirae ~ 0(2354748 нек. бакт. рода МацпеюЬааегичп 0(2811893 нек. бакт. рода НИгоьрЬае АР286037 клон из солончака ЬСР-6

___100] АУ839112 6 >

'- АУ839113 8 |

-----AJ55И66 ШюЛососсиъ вр.Ап28

АЛ551151 АпкгоЪааег 8р.Ап12

--------------------АУ839109 25 "

--------------О0499213 нек. бактерия

ЛУ792307 нек. УеггчсопйсгоЫа

> ■5"

о о-

С ге

-t С

п о

о о-

5Г

о "1 о Э

~ AF424388 нек. бакт. рода Chloroflexi AJ401017 Thermotoga maritima

Рисунок 3. Филогенетическое дерево байкальских последовательностей, полученных для поверхностного осадка Посольской банки. Построено на основе анализа фрагмента гена 16S рРНК с помощью метода объединения ближайших соседей (NJ). Байкальские последовательности подчеркнуты, остальные взяты из банков данных.

М59137 МеЛапояагста асеНуогат - АУ196682 МеИшпояагапа Ьагкеп —1120149 МеЧшпо1ш1оЫшп е\'ехй;>аичп

100

Г"

84!] 100

100

М59127 МеЧшпососс/н/къ теЛуШет Ш0152 МеИшпо1оЬш огедопеми 1— М59135 МеНиию/оЬш НпЛагшъ — 100 г АЕО15991 пек.архся 2МТ7 АГ015977 пек.архея 2С83

ню -— С1опе 54

;— А\'692054 пек. .\fetlimwsaetu ер.

АИ34391 пек.архея 10(у~ АП34387 нек.архея АН34381 нек.архея --А\'196683 МеМнтоэрМНит

— АГ095272 МакапорШ МИопя -М59142 МеЛапопйсгоЫит тоЪИе

- АЛ862839 МеЛапосиИет ЛегторЫШх А\'196684 МеЛапохркаега ¡1аШтапае

100 !

99 Г

100

М59124 МеЛапоЬаШгшт ЬгуаШи

1--АУ196659 МеИтпоЬааепит/огпиасит

М59126 МеИгапосаЫососсиз уаппахсИи - М59128 МеИтпоЛегтососсиз ¡кегтоШИ

-- 1138488 МеЛапососсм уоШе

--ЛУ454746 I[ек.МсОгапососсич ер.

---М35966 ТИегторгМеиз <епах

100

76 I

— 1,07511 РугоЬасиЫт ЫапШсит М36474 Ост1/игососсш тоЬПЬ ----Х90477 АаМапю Ьпег1еу1

■ч о 3 85

сг го о о

И с

»3 О

а-

о о

100 I-Х90480 ЛУ( <'(7)/й/)//.у пгопси*

-Х03235 Лн//о/о/)(М ъо^Мапсю

- Л.Т401017 ТИегтоЮ^а тагШта

Рисунок 4. Филогенетическое положение последовательности байкальской археи, полученной для поверхностного осадка Посольской банки. Построено на основе анализа фрагмента гена 16Б рРНК с помощью метода объединения ближайших соседей (Ш). Байкальская последовательность подчеркнута, остальные взяты из банков данных.

3.2.2. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов глубинного слоя осадков станции Посольская банка

Следует отметить более бедный видовой состав микроорганизмов в осадках сформированных в плейстоцене. Последовательности, полученные из ДНК глубоководного осадка, наиболее часто имели сходство с последовательностями рода Pseudomonas. Процент гомологии варьировал от достаточно высокого (99%) до низкого (88%). Последовательности, имеющие низкий процент гомологии, образуют отдельный кластер на филогенетическом дереве внутри кластера культивируемых Pseudomonas. Нами уже отмечалось наличие последовательностей, близких роду Pseudomonas, в глубоководных осадках озера Байкал, содержащих газовые гидраты (Шубенкова и др., 2005).

Также были выявлены последовательности микроорганизмов следующих филогенетических групп: Desidfuromonales, Sphingomonadales, Planctomycetes, Burkholderiales. Например, последовательность 14 отнесена к группе Desulfuromonales (дельта-протеобактерии), ближайшими гомологами являются последовательности бактерий рода Geobacter (AY013644, AY013609, DQ378240).

Одна последовательность 15 отнесена к группе Planctomycetes, ближайшие гомологи обнаружены в озере Kauhako, Гавайский архипелаг (AY344414), осадках Тихого океана (AJ966588). Две последовательности 22 и 43 отнесены к филогенетической группе Sphingomonadales (альфа-протеобактерии). Ближайшими гомологами являются последовательности бактерий Sphingomonas sp. (АВ265153, АВ265150, подповерхностные почвы пустыни Атакама, Чили), Sphingomonas echinoids (AJO12461), Caulobacter leidyia (AJ007806).

3.3. Филогенетическое положение байкальской бактерии рода Thioploca

Изучение района низкотемпературного подводного источника, открытого в бухте Фролиха на Северном Байкале, с помощью автоматических и обитаемых подводных аппаратов показало, что к нему приурочено богатое биологическое сообщество (Crane et al., 1991). Доминирующим организмом в этом сообществе является бесцветная серобактерия рода Thioploca (Намсараев и др., 1994). В месте обнаружения матов зарегистрированы наиболее высокие значения исследуемых анионов (хлорид - 2,5 мг/л, сульфат -41,3 мг/л, гидрокарбонат -174,4 мг/л, нитрат не обнаружен). Наименьшие значения гидрокарбоната (53,4 мг/л) отмечены в донных осадках открытой части бухты (глубина 690 м), где имеется мощный окисленный слой и не развивается бактерия рода Thioploca (Намсараев, Земская, 2000). В этом районе отмечены максимальные скорости метаногенеза (0,39-543,7 мкл СН4/кг сут) и окисления метана (696 мкл СН4/кг сут) (Намсараев и др., 2006). Получены данные по изотопному составу углерода осадков, микробных матов и донных животных, которые свидетельствуют о чрезвычайно сильном изменении соотношения

стабильных изотопов углерода в сторону облегчения, что указывает на бактериальную природу происхождения этого углерода из биогенного метана (Гебрук и др., 1993).

Источниками углерода в данном биоценозе являются поступающие из донной толщи фитопланктон и растительные остатки, а также образующийся в донных отложениях и поступающий из более глубоких слоев осадков биогенный метан. В результате деятельности метаногенного сообщества в верхнем слое грунта происходит обогащение биогенным метаном, в окислении которого участвуют метанотрофные бактерии (Гебрук и др., 1993; Намсараев и др., 2006). Очевидно, что в этом месте существует богатое микробное сообщество.

Ранее предполагали, что сообщества, сформированные бактерией рода ТЫор1оса в озере Байкал, есть только в районе гидротермального вента бухты Фролиха. В 2003 г. серные бактерии рода ТМор1оса нами были обнаружены в дельте реки Селенги и Баргузинском мелководье, а в 2006 году в районе вента Горевой утес (900 м) и мыса Толстый (200 м), характеризующихся высоким содержанием органического вещества (табл. 2).

Таблица 2. Физико-химические характеристики осадков, в которых

станция год глубина, м Физико-химические характеристики

Eh, mV рН ЕС, mS/m Т, °С NaCl, %

бухта Фролиха 55° 31, 207' 109° 51, 376' 2003, 2005 100-425 -45 - +70 6,9-7,5 23,9-30,2 4,8-6,2 0,03

устье реки Селенга 52° 17, 8136' 106° 13,2497 2004 -2006 16-42 61-80 6,9-7,3 29,7- 123,6 6,3-8,7 0,030,06

Баргузинский залив 53° 26, 3040' 108° 55, 2552 2004, 2006 12,3-18 68 7,28 29,8 9,9 0,01

м. Толстый 52° 38, 4507' 107° 21, 6447' 2006 200 76 7,05 102,1 10,1 0,05

Горевой утес 53° 18,3065' 108° 23,4803' 2006 900 — 6,83 142 4,9 0,07

губа Семисосенная 53° 08, 240' 107° 04, 472' 2006 35-45

Во всех районах они занимают достаточно обширную зону, охватывающую самые придонные слои воды, микроаэробную зону поверхностных слоев осадков и более глубокие анаэробные слои осадков. Глубина проникновения бактерий рода Ткюр1оса в осадок составляла: в бухте Фролиха -19 см, в Селенгинском мелководье - 6 см, в Баргузинском заливе - 5 см.

Морфология бесцветных серобактерий исследовалась в трех районах озера Байкал (рис. 1). Независимо от района обитания бактерия рода ТЫор1оса имела общий чехол, внутри которого располагалось от 1 до несколько десятков трихомов. Терминальные клетки трихомов имели заостренную или округлую форму (рис. 5). Трихомы обладали способностью передвигаться внутри чехла независимо друг от друга. Нити бактерий в донных осадках ориентированы вертикальна, максимальная их плотность наблюдалась в верхних 2 см осадка.

Рисунок 5, Общий вид нитей Тк'юрЬса А- без чехла, видны включения серы; В- вид нитей в общем чехле.

По морфологическим характеристикам наиболее однородно сообщество в Селенгинском мелководье, где отмечены морфотипы, характерные только для вида - Т. т^гка. В других районах озера Байкал очевидно существование разноразмерного сообщества, состоящего, как минимум, из двух морфотипов бесцветных серных бактерий. Поскольку до сих пор никому не удалось получить чистую культуру бактерии рода ТИюр1оса, поэтому для ее исследования использовали молекулярные методы анализа. Филогенетический анализ показал, что байкальские клоны входят в состав кластера гамма-протеобактерий (рис. 6). Бактерия рода ТНшр/оса из озера Байкал попадает в кластер пресноводных видов, найденных в озерах Бива и Констанц (Корта Н. е! а)., 2003) и наиболее близка ТЫор1оса 1щпса. Процент гомологии составляет 99%, что показывает высокий уровень сходства. Эти организмы формируют отдельную от морских представителей (большой морской вакуолированпой нитрат-аккумулирующеЙ Ве^аЮа и ТЫор1оса зрр.) кладу. Процент гомологии с морскими представителями ТЫор1оса менее 90%, что говорит об отдаленности пресноводных видов от морских. Сравнение последовательностей ТЫор1оса из озер Бива и Констанц,

показало, что их структуры отличаются друг от друга на два нуклеотида, а байкальская последовательность отличается от них лишь одну замену в участке, где вышеуказанные последовательности не обнаруживают различий. Все проанализированные байкальские последовательности не имеют различий в структуре исследуемого гена, что позволяет идентифицировать их как один вид ТЫорЪса ¡п^гка.

-M99448 Lucinoma aequizonata gill symhiont

- M99447 Codakia orbicularis gill symhiont

---L25707 Lucina floridana gill symhiont

— M9945I Riftiapachyptiia trophnanme symhiont ---LO1575 Thyaxiraflexuosa gill symhiont

— L25711 Anodontiaphillipiana gill symhiont

---M90415 Solemya velum symhiont

--U 41 fl 4 9 iVi lent) a oca den talis gill symhiont

100

L25709 Solemya reiJi gill symbinnt

----AJ278ÍÍX8 Halorh adospira halophiht

-M59152 Halorhodnspira hahchloris

--M59150 Chromaüum tepulum

- M2ii(i29 AHochromatium vinosum

--AF129557 Achromafium sp. HK13

--AF\29tt6 Achromatium sp. HK9

1П0

100 . AF064544 Thiomicrospira sp.

L AF064545 Thiomicrospira crunngena ----ХЯ7277 Leucorhrix ntucor

АВП42542 Thiothrix eikelhoomii — L79961 Thiothrix unzii

I97 [-----L40993 Thiothrix ¡the

; ,___U32940 Thiothrix

83 H-----AJ 548919 к

1--j AF148516 Thiothrix sp.

к. Thiothrix sp.

DO780007 Thiothrix sn. Lake Baikal

— U 29081 Rimicaris e.

,-— L799(Í3 Thiothrixfructosivorans 8-4 L79962 Thiothrix fructosivorans

----M99445 Bathymodiolus thermophilus gilí symbiont

100----L25713 Venicomya chordate gilí symbiont

--M99446 Cafyptogena magnifica symbiont

-M9ÍKÍ62 HatothiohaciUus hydrothermalis

■ AF452892 Iftioploca sp. Lake Biwa 71 J— DQ33A566 Th i opine a sp. Lake Baíkal

JÜÜJI AY115530 Thioploca sp. LakeConstanc«

; L40998 Thioploca ingrica '

---AY496953White Point filamentous 6aKT.

100 ----AB108786 H(K. Beggiutoa sp.

l----AF5327(i9 neic. Beggiatoa sp.

AF035956 Beggiatoa sp. Bav Concepción

I----AF129012 Thiomargarita namibiensis

r—JM ----L40999 Thioploca chileae

i L41Q43 Thioploca araucae

IQ0 - X75268 Acidithiobacillus ferrooxidans

--j¡--M79401 AcidithiohaciUus thiooxidans

1___Z29975 Acidithiohacillu.t caldu.t

----M34407 Desulfosarcina variabilis

-»culata cctos vmhiont

пресноводные

морские

Рисунок 6. Филогенетическое положение байкальских бактерий родов Thioploca и Thiothrix.

3.4. Сопутствующее микробное сообщество бактерии рода Thioploca

Бактериальное сообщество, сопутствующее Thioploca, ранее не было исследовано. Его разнообразие было изучено с помощью стандартной методики клонирования суммарной бактериальной ДНК, выделенной из отмытых нитей и методом ДГГЕ. Было построено несколько филогенетических деревьев. Результаты исследования показали значительное разнообразие микроорганизмов обитающих совместно с бактерией рода Thioploca в донных осадках.

В результате анализа библиотеки клонов, полученной с использованием универсальных эубактериальных праймеров были получены последовательности, принадлежащие следующим филогенетическим группам: бета-, дельта-протеобактерии, Acidobacteria, Actinobacteria, Nitrospirae, Cytophaga, Chloroflexi и из группы ОР8.

Последовательности 1, 10 и 16 отнесены к группе Acidobacteria, гомологичными последовательностями являются последовательности бактерии Geothrix fermentas (U41563), восстанавливающей трехвалентное железо, некультивируемые бактерии класса Fibrobacteres/Acidobacteria (DQ211449, DQ211418) из речной системы Японии Шиманто. Последовательность 9 отнесена к группе гамма-протеобактерий, поскольку ближайшими гомологами являются последовательности бактерий рода Pseudomonas (AJ889838, DQ208663, AMI 11061). Две последовательности (5 и 6) входят в состав бактерий рода Bacillus, ближайшие гомологи выделены из безкислородной почвы рисовых полей (AY607217, AY360659), почвы в Нидерландах (AJ563501).

Последовательность 44, из бухты Фролиха, отнесена к классу Desulfobacterales (дельта-протеобактерии). Необходимо отметить, что ближайшими гомологами являются последовательности бактерий семейства Desulfobacteraceae (AB 177195, AJ704696), выделенные из газогидратных осадков Перу и метанотрофного сообщества грязевого вулкана Хаакон Мосби (Норвежское море), а также последовательность бактерии рода Desulfofaba (AY592202) из грязевого вулкана Средиземноморья с глубины 1910 м.

Последовательности некультивируемой бактерии рода Holophaga (AMI 80889) найденной в микробных матах и бактерии рода Geothrix (DQ069181, U41563, AF529125), участвующей в восстановлении трехвалентного железа, являются ближайшими гомологами последовательности 25 бухты Фролиха.

Последовательность 61 отнесена к классу Bacteroidetes, ближайшие гомологи выделены из сульфидной биопленки системы пещер Fransassi (Италия) (DQ415759) и мезотрофного озера Кинерет (Израиль) (АМ086105). Последовательность 26 отнесена к филуму Verrucomicrobia. Две байкальских последовательностей отнесены к группе зеленых несерных бактерий, Chloroflexi. Ближайшие гомологи выделены из почв альпийских лугов (DQ450725), осадков древнего горного ручья (AY689508). Последовательность 25 наибольший процент гомологии показала с

последовательностью бактерии из железо-марганцевой конкреции из бухты

Green (озеро Мичиган, США) (AF293009).

Одна из анализируемых последовательностей (номер 18) отнесена к группе

Actinobacteria, ближайшие гомологи найдены в евтрофном озере Японии

(AB 1543 09), ультраолиготрофном Кратерном озере (AF316665), озере

Gossenkoehessee (Австрия, AJ290024).

ВЫВОДЫ

1. Проанализированы различные стратегии выделения суммарной бактериальной ДНК из донных осадков озера Байкал и выбрана наиболее эффективная методика. Она включает в себя процедуры механического воздействия, химического и ферментативного лизиса, а также использование реагентов для связывания гуминовых соединений.

2. Использование праймеров, специфичных для различных групп бактерий позволяет выявить широкий спектр последовательностей в микробном сообществе. Установлено, что современные поверхностные слои осадков озера Байкал отличаются большим микробным разнообразием, чем плейстоценовые слои.

3. В аэробном слое современных осадков получены последовательности зеленых несерных бактерий (Chloroßexi), альфа-протеобактерий, Planctomycetes, Acidobacteria, Verrucomicrobia, Nitrospirae, Firmicntes (род Clostridia), Cyanobacteria (род Synechococcus), Actinobacteria (род Streptomyces); выявлены археи царств Crenarchaeota и Euryarchaeota. Найден кластер, занимающий промежуточное положение между кластерами ANME-1 и ANME-2, представители которых участвуют в анаэробном окислении метана. При более подробном анализе таксономического положения кластер был отнесен к кластеру некультивируемых Methanosaeta, участвующих синтезе метана.

4. Последовательности плейстоценового слоя в большинстве своем гомологичны таковым для рода Pseudomonas. Также выявлены последовательности следующих филогенетических групп: Desulfuromonales, Sphingomonadales, Planctomycetes, Burkholderiales.

5. Определено филогенетическое положение байкальской бесцветной серной бактерии рода Thioploca. Показано, что нуклеотидная последовательность группируется совместно с представителями этого рода из пресноводных озер.

6. Исследовано микробное сообщество, сопутствующее бактерии рода Thioploca. Вместе с серными бесцветными бактериями развиваются микроорганизмы следующих филогенетических групп: Acidobacteria, гамма-протеобактерии (род Pseudomonas), бета-протеобактерии, Firmicutes (род Bacillus), дельта-протеобактерии (класс Desidfobacterales), Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Nitrospirae, Chloroflexi, Actinobacteria и некультивируемой группы OP8.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

1. Шубенкова О.В., Земская Т.И., Черницына С.М., Хлыстов О.М., Трибой Т.И. Первые результаты исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов осадков Южного Байкала в районе приповерхностного залегания гидратов метана. // Микробиология; 2005; Т. 74, № 3, С. 370377.

2. С.М. Черницына, О.В. Шубенкова, Т.И. Земская, М.А. Грачев, A.JI. Верещагин, Т.Я. Косторнова Выделение суммарной бактериальной ДНК для экологической характеристики донных осадков озера Байкал // Сибирский экологический журнал; 2006; 6; С. 717-723.

3. Черницына С.М., Земская Т.И., Воробьева С.С., Шубенкова О.В., Хлыстов О.М., Косторнова Т.Я. Сравнительный молекулярный анализ микробиального сообщества в голоценовых и плейстоценовых осадках из района Посольской банки (озеро Байкал) // Микробиология; 2007; Т. 76, № 1,С. 116-125.

Статьи, опубликованные в других изданиях

4. Khlystov О., Osipov Е„ Grachev М., Zemskaya Т., Shubenkova О., Chernitsina S., Dagurova О. Some preliminary results of geological survey of methane hydrates in freshwater lake Baikal // Proc. Of СОТ 03, International Conferece on Coastal and Ocean Technology. - India. - 2003. - P. 581-587.

Работы, опубликованные в материалах региональных, всероссийских и международных конференций

5. Т.И. Земская, О.В. Шубенкова, С.М. Черницына, О.М. Хлыстов, Б.Б. Намсараев, О.П. Дагурова, А.Б. Имбс, О.Ю. Глызина, Т. Я Косторнова Микробиальное сообщество района приповерхностного залегания газовых гидратов. // Конференция Тазовые гидраты в экосистеме Земли '. Тез. докладов; 2003; С. 37.

6. Земская Т.И., Шубенкова О.В., Черницына С.М., Хлыстов О.М., Намсараев Б.Б., Дагурова О.П., Голобокова Л.П., Погодаева Т.П., Верещагин А.Л. Геохимические и молекулярно-биологические исследования осадков Южного Байкала в районе приповерхностного залегания газовых гидратов (Южный Байкал). // Материалы Всероссийской конференции; 2003; С. 65-67.

7. Шубенкова О.В., Дагурова О.П., Черницына С.М., Хлыстов О.М. Микроорганизмы, участвующие в окислении метана в донных осадках озера Байкал. Тез. докл. // Материалы российской научно-практической конференции' Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе'; 2002; С. 127.

8. Черницына С.М., Шубенкова О.В. Сравнительная характеристика методов выделения бактериальных ДНК из донных осадков оз. Байкал. Тез. докл. // Материалы российской научно-практической конференции' Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе'; 2002; С. 125.

9. Черницына С.М., Земская Т.Н. Выделение бактериальной ДНК из донных осадков оз. Байкал. // Вестник. Иркут. ун-та. Спец. выпуск. Материалы ежегодной научно-теоретической конференции молодых ученых; 2000; С. 232-233.

10.Т.И. Земская, О.В. Шубенкова, С.М. Черницына, О.М. Хлыстов, Б.Б. Намсараев, О.П. Дагурова, Голобокова Л.П., Погодаева Т.П., Верещагин A.JL Геохимические и молекулярно-биологические исследования осадков южного Байкала в районе приповерхностного залегания газовых гидратов. // Конференция "Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем центральной Азии", г. Улан-Удэ. С. 65-67.

1 l.O.V. Shubenkova, T.I. Zemskaya, О.М. Khlystov, S.M. Chernitsina, B.B. Namsaraev, O.P. Dagurova Biodiversity of the microorganisms near an outcrop of gas hydrates of lake Baikal // 1st FEMS congress of European microbiologists. 2003. P. 224.

12.Zemskaya T. L, Namsaraev В. В., Khlystov O, Golobokova L. P., Dagurova O. P., Shubenkova O., Chernitsina S., Proviz V. Bacterial community anomalous territories of Lake Baikal. // Proceedings of the VII Intecol International Congress of Ecology; 2002; P. 302.

13.Shubenkova O.V., Zemskaya T.I., Khlystov O.M., Chernitsina S.M., Dagurova O.P., Namsaraev B.B. Biodiversity of the microorganisms near an outcrop of gas hydrates of lake Baikal. // International Baikal Symposium on microbiology (IBSM-2003) "Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers and reservoirs" Irkutsk, P. 159.

14.Хлыстов О.М.,Шубенкова O.B., Черницына С.М., Земская Т.И., Дагурова О.П., Намсараев Б.Б. Геолого-микробактериальная характеристика гидратоносных осадков озера Байкала. // Матер. IV конф. мол. учен., посвящ. М.А.Лаврентьеву; 2004; Ч. И, С. 202-205.

15.Земская Т.Н., Дульцева Н.М., Черницына С.М., Сергеева В.Н., Погодаева Т.П., Намсараев Б.Б. Структура сообществ бактерий рода Thioploca в различных районах озера Байкал и экологические факторы, способствующие их развитию. // Международное рабочее совещание 'Происхождение и эволюция биосферы' (ВОЕ); 2005; С. 205-206.

16.Черницына С.М., Земская Т.Н., Шубенкова О.В., Дульцева Н.М., Погодаева Т.П., Хлыстов О.М. Бесцветные серные бактерии озера Байкал и сообщества, ассоциированные с ними. // Четвертая Верещагинская Байкальская Конференция. Тезисы докладов и стендовых сообщений. 26 сентября - 1 октября, 2005 г.; 2005; С. 219-220.

17.Шубенкова О.В., Земская Т.П., Черницына С.М., Волгина Т., Хлыстов О.М., Деникина Н.Н. Разнообразие микроорганизмов в осадках, ассоциированных с газовыми гидратами озера Байкал. // Четвертая Верещагинская Байкальская Конференция. Тезисы докладов и стендовых сообщений. 26 сентября - 1 октября, 2005 г.; 2005; С. 227-228.

18.Черннцына С.М., Земская Т.И., Шубенкова О.В., Хлыстов О.М. Таксономический состав микробиального сообщества современных и

древних (плейстоценовых) осадков. // Всероссийская Молодежная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии" 1-3 ноября 2005 г. С. 63-64.

19.Шубенкова О.В., Земская Т.И., Волгина В.В., Черницына С.М. Исследование микробного сообщества в районе выхода газовых гидратов озера Байкал. // Всероссийская Молодежная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии" 1-3 ноября 2005 г. С. 67.

20.Zemskaya T.I., Egorov A.V., Khlystov О.М., Shubenkova O.V., Namsaraev B.B., Chernitsyna S.M., Dagurova O., Kalmychkov G.V., Grachev M.A. Biogeochemical cycles of methane in Lake Baikal // Geophysical Research Abstracts, V. 7, 03994, 2005.

21.Zemskaya T.I., Chernitsyna S.M., Shubenkova O.V., Pogodaeva T.P. Colorless sulfur bacteria of lake Baikal // Fouth International Symposium' Ancient Lakes: Speciation, Development in Time and Space, Natural History'; 2006; P. 68.

22.Zemskaya T.I., Khlystov O.M., Namsaraev B.B., Shubenkova O.V., Pogodaeva T.P., Chernitsyna S.M. Bottom sediments of lake Baikal as a habitat for prokaryotes // Fouth International Symposium' Ancient Lakes: Speciation, Development in Time and Space, Natural Histoiy'; 2006; P. 69.

Подписано в печать 12.04.07. Формат 60x90 1/16 Бумага офсетная. Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1,5. Уч.- изд.л. 1,33. Тираж 100 экз. Заказ 6405.

Изготовлено в ООО «Репроцентр А1» г. Иркутск, ул. Лапина, 1, оф. 101 тел. 203-144, 999-003, 99-26-27

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черницына, Светлана Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика озера Байкал

1.2. Экологические факторы, определяющие развитие И микроорганизмов в определенных районах озера

1.3. Физико-химическая характеристика донных осадков озера 13 Байкал и поровых вод

1.4. Органическое вещество донных осадков озера Байкал

1.5. История микробиологических исследований донных осадков 20 озера Байкал

1.6. Численность микроорганизмов донных осадков озера Байкал

1.7. Разнообразие микроорганизмов донных осадков озера Байкал

1.8. Исследование структуры микробных сообществ методами 26 молекулярной биологии

1.9. Биоразнообразие бесцветных серных бактерий

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследования и методы отбора проб

2.2. Методы выделения суммарной бактериальной ДНК

2.3. Методы молекулярной микробиологии

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнение стратегий методов выделения суммарной 47 бактериальной ДНК из донных осадков озера Байкал

3.2. Анализ таксономического состава поверхностных и 58 глубинных слоев донных осадков Посольской банки

3.2.1. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов 64 поверхностного слоя осадков станции Посольская банка

3.2.2. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов глубинного 76 слоя осадков станции Посольская банка

3.3. Исследование микробного сообщества бесцветных серных бактерий

3.3.1. Распространение и морфология бесцветных серобактерий

3.3.2. Филогенетическое положение байкальской бактерии рода 92 Thioploca

3.3.3. Сопутствующее микробное сообщество бактерии рода 96 Thioploca

3.3.4. Филогенетическое положение серной бактерии рода Thiothrix 103 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 106 ВЫВОДЫ 109 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 111 ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разнообразие микроорганизмов в различных по экологическим условиям осадках оз. Байкал"

Актуальность проблемы. Байкал - это уникальное, олиготрофное озеро, возраст которого оценивается в 20-30 млн. лет (Атлас Байкала, 1993). Его характеризуют большие глубины, низкая температура воды и постоянство химического состава вод в глубинной части. Высокая насыщенность кислородом всей толщи воды, низкая концентрация органических веществ и минерализация воды - обуславливают специфические условия жизнедеятельности организмов. 60% флоры и фауны являются эндемиками (Тимошкин, 2001).

Ранее микробиологические исследования донных отложений Байкала проводили по следующим направлениям: определение общей численности микроорганизмов и сезонной динамики (Яснитский и др., 1927; Мессинева, 1957; Младова, 1975; Романова, 1963), изучение различных физиологических групп (Никитин, 1967; Луста, Намсараев, 1988; Лаптева, 1990). В исследованиях использовали методы электронной микроскопии, биохимии и радиоизотопии (Максимов, Черных, 1979; Штевнева, Судакова, 1986; Земская и др., 1997). Однако большая часть микроорганизмов не культивируется (более 90%), поэтому при исследовании природных образцов классическими методами часть сообщества остается неизученной (Amann et al., 1995).

Цель работы - исследование структуры микробных сообществ в осадках районов, различающихся по экологическим условиям. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

4. Подтвердить филогенетическое положение бесцветных серных бактерий родов Thioploca и Thiothrix.

Научная новизна. Впервые проведено изучение микробных сообществ донных осадков озера Байкал, различающихся по экологическим условиям и времени формирования осадка. На основе сравнительного анализа фрагментов гена 16S рРНК установлено, что в осадках преобладают некультивируемые формы бактерий, последовательности которых имеют невысокую степень гомологии с известными в мировой базе данных. Филогенетический анализ последовательностей показал, что они в основном группируются с последовательностями альфа-, гамма-, бета- и дельта-протеобактерий, Holophaga/Acidobacteria, Planctomycetes, Actinobacteria, Firmicutes, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Nitrospirae, Chloroflexi. Найдены последовательности гомологичные археям, относящиеся к царствам Crenarchaeota и Euryarchaeota. Впервые подтверждено филогенетическое положение бесцветных серных бактерий родов Thioploca, Thiothrix обитающих в Байкале, а также исследовано сопутствующее микробное сообщество бактерии рода Thioploca. Впервые обнаружены бесцветные серные бактерии в районах впадения рек и местах естественных нефтепроявлений озера Байкал.

Защищаемые положения.

2. Бесцветные серные бактерии широко распространены в озере Байкал и обнаружены в районе гидротермального источника бухты Фролиха, местах впадения рек и естественных нефтепроявлениях. Структура гена 16S рРНК байкальской бактерии рода Thioploca на 99% является идентичной последовательностям пресноводных представителей бактерии из других мест обитания: озер Бива и Констанц.

Практическая значимость. Для исследований оценены различные методы выделения ДНК из донных осадков озера Байкал, что особенно важно при работе с осадками различной литологии. Создан банк данных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК, 92 последовательности зарегистрированы в базе данных NCBI, им присвоены следующие номера: DQ916135, DQ780007, DQ338566, DQ371461-DQ371460, DQ364475-DQ364473, DQ359154, DQ359155, DQ35932-DQ356934, AY833517-AY833519, AY839107-AY839135, AY739914-AY739938, DQ178146-DQ178162. Эта информация может быть использована для построения филогенетических деревьев, выяснения родственной связи между бактериями из других географических мест. Также полученные последовательности могут быть использованы для конструирования групп- и видо-специфичных праймеров и зондов для быстрого и эффективного анализа микробного сообщества донных осадков и воды.

Публикации. По материалам опубликовано 22 научных работы, из них 3 в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы (164 источника, 65 из них зарубежных) и приложения. Диссертация содержит 34 рисунка, 12 таблиц, 3 приложения.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Черницына, Светлана Михайловна

ВЫВОДЫ

3. В аэробном слое современных осадков получены последовательности зеленых несерных бактерий (Chloroflexi), альфа-протеобактерий, Planctomycetes, Acidobacteria, Verrucomicrobia, Nitrospirae, Firmicutes (род Clostridia), Cyanobacteria (род Synechococcus), Actinobacteria (род Streptomyces)\ выявлены археи царств Crenarchaeota и Euryarchaeota. Найден кластер, занимающий промежуточное положение между кластерами ANME-1 и ANME-2, представители которых участвуют в анаэробном окислении метана. При более подробном анализе таксономического положения кластер был отнесен к кластеру некультивируемых Methanosaeta, участвующих синтезе метана.

6. Исследовано микробное сообщество, сопутствующее бактерии рода Thioploca. Оно характеризуется большим разнообразием, вместе с серными бесцветными бактериями развиваются микроорганизмы следующих филогенетических групп: Acidobacteria, гамма-протеобактерии (род Pseudomonas), бета-протеобактерии, Firmicutes (род Bacillus), дельта-протеобактерии (класс Desulfobacterales), Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Nitrospirae, Chloroflexi, Actinobacteria и некультивируемой группы OP8.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования показали, что чистота экстрагированной из осадков ДНК зависит от метода ее выделения. Наиболее эффективен метод выделения, который включает процедуры механического воздействия (растирание осадка в ступке с целью разрушения клеточной стенки и отделения бактериальных клеток от частиц осадка), химический и ферментативный лизис, а также использование сорбента для связывания гуминовых соединений. ДНК, выделенная с помощью этого метода, была амплифицирована и клонирована. Использование нескольких наборов праймеров для изучения разнообразия микроорганизмов позволяет более полно охарактеризовать спектр видов бактерий в донных отложениях.

Дополнительное использование методов гибридизации in situ и денатурирующего градиентного гель-электрофореза позволили зафиксировать последовательности, не выявляемые с помощью стандартной методики клонирования. Ранее ДГГЭ не применялся для изучения микробного состава донных осадков озера Байкал.

Изучение биоразнообразия микробного сообщества донных осадков озера Байкал молекулярно-биологическими методами показало, что полученные нуклеотидные последовательности принадлежат бактериям следующих групп: аэробная зона - Holophaga/Acidobacteria, Planctomycetes, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Nitrospirae, Chloroflexi, альфа-протеобактерии, Firmicutes (род Clostridia), Cyanobacteria (вид Synechococcus), Actinobacteria (вид Streptomyces), археи царств Crenarchaeota и Euryarchaeota; анаэробная зона - Desulfuromonales (дельта-протеобактерии), Sphingomonadales (альфа-протеобактерии), Burkholderiales (бета-протеобактерии), род Pseudomonas (гамма-протеобактерии).

Впервые проведено сравнение микробных сообществ осадков, сформированных в различные временные периоды. Анализ показал, что современные поверхностные слои осадков озера Байкал отличаются большим микробным разнообразием, по сравнению с осадками, сформированными в плейстоцене. В первом случае выявлено более 13 филогенетических групп, во втором - только 5, причем среди последних большую часть составили последовательности бактерий рода Pseudomonas. Полученные данные свидетельствуют, что часть байкальских последовательностей при сравнении их с мировой базой данных показали невысокий процент гомологии (87%-96%). Это затруднило их филогенетическую идентификацию и не позволило отнести их к какой-либо группе. Возможно, эти последовательности в микробном сообществе принадлежат к новым, еще не описанным, таксонам и видам, и присущи только Байкалу.

Впервые обнаружены новые районы обитания бесцветных серных бактерий рода Thioploca, которые, как считалось ранее, приурочены только к гидротермальному венту в б. Фролиха (Намсараев и др., 1994). В 2003 г. серные бактерии рода Thioploca нами были обнаружены в дельте реки Селенги и Баргузинском мелководье, а в 2006 году в районе вента Горевой утес (900 м) и мыса Толстый (200 м), характеризующихся высоким содержанием углеводородов. Таким образом, в Байкале, как и в морских экосистемах, нитчатые серобактерии занимают достаточно обширную зону, охватывающую самые придонные слои воды, микроаэробную зону поверхностных слоев осадков и более глубокие анаэробные слои осадков.

Проведенный морфологический анализ бактерии рода Thioploca из озера Байкал свидетельствует, что наиболее однородно сообщество в Селенгинском мелководье, где отмечены морфотипы, характерные только для вида - Т. ingrica. В других районах озера Байкал очевидно существование разноразмерных сообществ, состоящих, как минимум, из двух морфотипов бесцветных серных бактерий.

Филогенетический анализ ДНК этих бактерий из различных районов показал, что байкальская бесцветная серная бактерия рода Thioploca входит в состав группы гамма-протеобактерий, попадает в кластер пресноводных видов, найденных в озерах Бива и Констанц (Kojima et al., 2003). Все проанализированные байкальские последовательности не имеют различий в структуре исследуемого гена, что позволяет идентифицировать их как один вид Thioploca ingrica. Сравнение последовательностей Thioploca из озер Бива и Констанц, показало, что их структуры отличаются друг от друга на два нуклеотида, а байкальская последовательность отличается от них лишь на одну замену в участке, где вышеуказанные последовательности не обнаруживают различий.

Также впервые было исследовано сопутствующее Thioploca микробное сообщество. Оно характеризуется большим разнообразием, вместе с серными бесцветными бактериями развиваются микроорганизмы следующих филогенетических групп: Acidobacteria, гамма-протеобактерии (род Pseudomonas), бета-протеобактерии, Firmicutes (род Bacillus), дельта-протеобактерии (класс Desulfobacterales), Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Nitrospirae, Chloroflexi, Actinobacteria и некультивируемой группы OP8. Найденный спектр последовательностей для байкальской бактерии более широк, чем для сообщества этой бактерии из озер Бива и Констанц (Kojima et al., 2006).

Таким образом, исследованные осадки озера Байкал различаются разнообразием населяющих их микроорганизмов. Каждая экологическая зона (аэробная, микроаэрофильная, анаэробная) характеризуются своей "уникальной" структурой. Наиболее представительно сообщество аэробной зоны осадков, наименее - анаэробных, глубинных осадках, сформированных в плейстоцене. Применение различных методов исследования (клонирование, ДГГЭ, FISH) значительно расширяет список обнаруживаемых микроорганизмов.

109

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черницына, Светлана Михайловна, Иркутск

1. Атлас и определитель пелагионтов озера Байкал // отв. ред. О.А. Тимошкин // Новосибирск: "Наука". 1995. - 694, 11. е., 239 ил. е., 30 см. -Библиогр.: с.582-608, 639-667. - 500 экз. - IBSN 5-02-030815-3.

2. Байкал. Атлас Карты. / сост. и подг. к печ. РАН. Сиб. отд. Межведомств, научн. совет по прогр. «Сибирь» в 1993 г.; преде, ред. кол-гии, гл. ред., чл.-кор. РАН Г. И. Галазий М.: ФСГК, 1993. - 160 е., цв.; 33 см. - 5000 экз., ISBN 5- 85120-009-Х.

3. Будовский, Э. И. Метод выделения транспортной ДНК из пекарских дрожжей Текст. / Э. И. Будовский, М. А. Грачев // Вопросы медицинской химии. 1964. - Т. X. - С. 431-433.

4. Верещагин, Г. Ю. Происхождение и история Байкала, его фауны и флоры Текст. / Г. Ю. Верещагин // Тр. Байкальск. лимнолог, ст. АН СССР. -1940.-Т. Х.-С. 73-239.

5. Вотинцев, К. К. Гидрохимия озера Байкал Текст. / К. К. Вотинцев ; Академ, наук СССР, Сиб. отд, вост.- сиб. филиал, труды Байк. лимн. ст. М.: Изд-во АН СССР, 1961. - Т. 20. - 302, е.; 26 см. - Библиогр.: с. 302 - 309. -1000 экз.

6. Вотинцев, К. К. Круговорот органического вещества в озере Байкал Текст. / К. К. Вотинцев, А. И. Мещерякова, Г. И. Поповская. -Новосибирск: Наука, 1975. 189 е.; 21 см. - 500 экз.

7. Вотинцев, К. К. Гидрохимия рек бассейна озера Байкал Текст. / Вотинцев К. К, И. В. Глазунов, А. П. Толмачева // Труды Лимнологической института СО АН СССР п. Листвянка. 1965. - Т. 8, № 28. - 222 с.

8. Выхристюк, Л. А. Органическое вещество донных осадков Байкала Текст. / Л. А. Выхристюк // АН СССР. Сиб. отд-е. Труды Лимнологического ин-та. Вып. 32. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-е, 1980. - 80 с, 30 ил.с.; 20 см. - Библиогр.: с. 74-79. - 1000 экз.

9. Выхристюк, Л. А. К вопросу о преобразовании органического вещества осадков озера Байкал на стадии раннего диагенеза Текст. / Л. А. Выхристюк, Ф. И. Лазо // Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах. 1975. - С. 242-246.

10. Выхристюк, Л. А. Легкогидролизуемое органическое вещество в донных отложениях озера Байкал Текст. / Л. А. Выхристюк, Ф. И. Лазо // Известия СО АН СССР. Серия биологические науки. 1972. - Т. 2. - С. 59-63.

11. Выхристюк, Л. А. О поступлении и распределении основных химических элементов в донных отложениях Байкала Текст. / Л. А. Выхристюк // Литология и полезные ископаемые. 1977. - Т. 1. - С. 54-65.

12. Голдырев, Г. С. Донные отложения авандельты р. Селенги Текст. / Г. С. Голдырев, Л. А. Выхристюк, Ф. И. Лазо // Лимнология придельтовых пространств Байкала, тр. ЛИН СО АН СССР. 1971. - Т. 12, № 32. - С. 4363.

13. Голубев, В. А. Очаги субаквальной гидротермальной разгрузки и тепловой баланс Северного Байкала Текст. / В. А. Голубев // Доклады РАН. 1993.- Т. 328, №3.-С. 315-318.

14. Гольдберг, Е. Л. Урановый сигнал влажности палеоклиматов в осадках озера Байкал Текст. / Е. Л. Гольдберг, Е. П. Чебыкин, С.С. Воробьева, М.А. Грачев // ДАН. 2005. - Т. 400. - С. 72-77.

15. Гоман, Г. А. Бактериальное восстановление сульфатов и окисление сульфидов в грунтах Байкала Текст. / Г. А. Гоман // Гидробиологический журнал.- 1975.-Т. 11, №5.-С. 18-22.

16. Горленко. М. В. Экология водных микроорганизмов Текст. / М. В. Горленко, Г. А. Дубинина, С. И. Кузнецов. М.: Наука, 1977. - 289, [2] е., 99 с. ил.; 22 см. - Библиогр.: с. 264 - 285. - 1700 экз.

17. Гранина, Jl. 3. Аномалии состава поровых вод донных осадков Байкала Текст. /Л. 3. Гранина, Е. Каллендер, И. С. Ломоносов, В. Д. Матц // Геология и геофизика. 2001. - V. 42. - Р. 362-372.

18. Гранина, Л. 3. Процессы формирования химического состава донныхосадков и поровых вод озера Байкал Текст.: дис. докт. геол. наук /

19. Гранина Либа Заламановна. М, 2007. - 250 с. Библиогр.: С. 235-250.

20. Грачев, М. А. Глубинная вода озера Байкал природный стандарт пресной воды Текст. / М. А. Грачев, В. М. Домышева, Т. В. Ходжер // Химия в интересах устойчивого развития. - 2004. - № 12. - С. 417-429.

21. Грачев, М. А. Метод выделения высокоочищенной ДНК для использования в полимеразной цепной реакции Текст. / М. А. Грачев, С. Ю. Кузнецова, Т. А. Щербакова // Молекулярная биология. 2006. - Т. 40, № 1. -С. 180-183.

22. Грачев, М. А. О современном состоянии экологической системы озера Байкал Текст. / Михаил Грачев. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2002. - 156 [3] с, 57 с. ил.; 22 см.- Библиогр.: с.141-153.- 1000 экз. - ISBN 5-7692-0481-8.

23. Грачев, М. А. Сигналы палеоклиматов верхнего плейстоцена в осадках озера Байкал Текст. / М. А. Грачев, Е. В. Лихошвай, С. С. Воробьева, О. М. Хлыстов, Е. В. Безрукова, Е. В. Вейнберг, Е. Л. Гольдберг, Л. 3. Гранина, Е.Г.

24. Дзюба, А. А. Реликтовые соленые озера дельты Селенги Текст. / А. А. Дзюба, Н. В. Кулагина // Третья Верещагинская Байкальская конференция: Тез. Докл. Иркутск. 2000. - С.76.

25. Ефремова, С. М. Метанотрофные симбиотические бактерии в тканях глубоководных байкальских губок Текст. / С. М. Ефремова, В. А. Фиалков, В. С. Кузин // Вторая Верещагинская байкальская конференция: Тез. докл. и стенд, сообщ. 1995. - С. 62.

26. Заварзин, Г. А. К понятию микрофлоры рассеяния в круговороте углерода Текст. / Г. А. Заварзин // Журнал общей биологии. 1970. - Т. 31, №4.-С. 386-393.

27. Заварзина, Н. Б. Изучение причин, задерживающих развитие микроорганизмов в толще иловых отложений оз. Бисерово Текст. / Н. Б. Заварзина // Микробиология. 1955. - Т. 24, № 5. - С. 31-35.

28. Земская, Т. И. Микроорганизмы донных осадков оз. Байкал и экологические условия среды Текст. / Т. И. Земская, Б. Б. Намсараев, В. В. Парфенова, Т. А. Ханаева, Л. П. Голобокова, Л. 3. Гранина // Экология. -1997.-№ 1.-С. 40-44.

29. Исаев, В. П. Природные газы Байкала Текст. / В. П. Исаев, Н. Г. Коновалова, П. В. Михеев // Геология и Геофизика. 2002. - Т. 43. - С. 638 -643.

30. Кожов, М. М. Биология озера Байкал Текст. / М. М. Кожов. М.: Изд-во АН СССР, 1962. - 316 е.; 22 см. - Библиогр.: с. 310 - 314. - 300 экз.

31. Кожов, М. М. Очерки по байкаловедению Текст. / М. М. Кожов. -Иркутск: Вост.-сиб. книж. изд-во, 1972. 256 е.; 21 см.

32. Козырева, JI. П. Видовое разнообразие микроорганизмов озера Байкал Текст. / JI. П. Козырева, JI. П. Дагурова, Т. И. Земская // Биоразнообразие Байкальской Сибири. Новосибирск: Наука. - 1999. - С. 31-36.

33. Кузнецов, С. И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность Текст. / С. И. Кузнецов. АН СССР. Ин-т биол. внутр. вод. JI.: Наука. Ленингр. отд., 1970. - 440 [6] е., 202 1. с. ил.; 26 см. - Библиогр.: с. 402435.- 1250 экз.

34. Кузнецов, С. И. Микробиологическая характеристика вод и грунтов Байкала Текст. / С. И. Кузнецов // Тр. Байкальск. Лимнолог, ст. АН СССР. -1957.-Т. 15.-С. 388-396.

35. Кузнецов, С. И. Роль микроорганизмов в круговороте веществ в озерах Текст. / С. И. Кузнецов // М.: Изд-во АН СССР. 1952. - 300с.

36. Кузнецов, Ю. А. Магматические породы и магматические формации Сибири и Дальнего Востока Текст. / Ю. А. Кузнецов // Геология и геофизика. 1977.-Т. 11.-С. 98-101.

37. Лазо, Ф. И. Геохимия серы в донных отложениях озера Байкал Текст. / Ф. И. Лазо // Геохимия. 1980. - Т. 1. - С. 109-115.

38. Лаптева, Н. А. Видовая характеристика гетеротрофных бактерий в озере Байкал Текст. / Н. А. Лаптева // Микробиология. 1990. - Т. 59, вып. 3. - С. 499-506.

39. Лейбович, Л. 3. Влияние жидкой фазы донных осадков на состав байкальской воды Текст. / Л.З . Лейбович // Тез. докл. 9 конф. молодых научн. сотр. по геологии и геофизике Вост. Сибири. 1980. - С. 125-126.

40. Лисицын, А. П. Основные понятия биогеохимии океана Текст. / А. П. Лисицын // М.: Наука. 1983. - С. 3-31.

41. Луста, К. С. Целлюлозоразлагающие природные ассоциации донных осадков пресного озера Текст. / К. С. Луста, Б. Б. Намсараев // Микробиология. 1988. - Т. 57, вып. 5. - С. 835-840.

42. Максимова, Э. А. Микробиоценозы доннных отложений Байкала Текст. / Э. А. Максимова, И. А. Сергеева, В. Н. Максимов // Иркутск, 1991. С. 160.

43. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование Текст. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук // Лабораторное руководство. Москва: Мир, 1984. 480, [2] с, 75 с. ил.; 22 см. - Библиогр.: с. 446-463. - 4000 экз.

44. Мессинева, М. А. Биогеохимические исследования глубоководных осадков Байкала Текст. / М. А. Мессинева // Тр. Байкальск. Лимнол. Ст. АН СССР. 1957. - Т.15. - С. 199-211.

45. Мизандронцев, И. Б. Об относительной интенсивности раннего диагенеза донных отложений озера Байкал Текст. / И.Б. Мизандронцев, Т.А. Младова // Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах. Изд-во Наука.- 1975.-С. 107-115.

46. Мизандронцев, И. Б. Химический состав грунтовых растворов Байкала Текст. / И.Б. Мизандронцев // Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах. Изд-во Наука, 1975. - С. 250-253.

47. Мизандронцев, И. Б. Гидродинамическая концепция Н. М. Страхова и осадкообразование в Байкале Текст. / И. Б. Мизандронцев // Позднекайнозойская история озер в СССР. 1982. - С. 11-18.

48. Мизандронцев, И. Б. Осадкообразование Текст. / И. Б. Мизандронцев // Труды ЛИН СО АН СССР. 1978. - Т. 16, № 36. - Проблемы Байкала. - С. 33-46.

49. Младова, Т. А. Микробиологическая характеристика донных отложений Байкала Текст. / Т. А. Младова // Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах. 1975. - С. 246-250.

50. Младова, Т. А. Микроорганизмы донных отложений (авандельты р. Селенги) Текст. / Т. А. Младова // Лимнология придельтовых пространств Байкала. Селенгинский район: сб. Труды АН СССР СО Лимнологический институт. Т. 12, вып. 32. - 1971. - С. 90-95.

51. Намсараев, Б. Б. Бактериальное окисление метана в озере Байкал Текст. / Б. Б. Намсараев, Т. И. Земская, О.П. Дагурова, Е.А. Гайнутдинова, О.В. Шубенкова, А.В. Егорова // Труды института микробиологии им.С.Н. Виноградова. 2006 - вып. XIII. - С. 113-146.

52. Намсараев, Б. Б. Геохимическая деятельность сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках озера Байкал Текст. / Б. Б. Намсараев, Л. Е. Дулов, Т. И. Земская, Е. Б. Карабанов // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 3. -С. 405-410.

53. Нечаева, Н. Б. Микробиологический анализ донных отложений Байкала Текст. / Н. Б. Нечаева, А. Г. Салимовская-Родина // Тр. Байкал, лимнол. ст. -1935.-Т. 6.-С. 5-14.

54. Никитин, Д. И. Применение электронной микроскопии для изучения водной микрофлоры Текст. / Д. И. Никитин, С. И. Кузнецов // Микробиология. 1967. - Т. 36, вып. 5. - С. 108-117.

55. Погодаева, Т. В. Химический состав поровых вод осадков оз. Байкал (ст. 'Маленький'), вмещающих газовые гидраты Текст. / Т. В. Погодаева, Т. И. Земская, О. М. Хлыстов // Материалы научной конференции

56. Фундаментальные проблемы изучения и использования воды и водных ресурсов'. 2005. - С. 428-431.

57. Поповская, Г. И. Этапы изучения автотрофного пикопланктона озера Байкал Текст. / Г. И. Поповская, О. И. Белых // Гидробиологический журнал. 2003. Т.39, № 6. - С. 12-24.

58. Прангвишвили, Д. А. Молекулярная биология архебактерий Текст. / Д. А. Прангвишвили // Тбилиси: Мецниереба, 1989. 170 с.

59. Родина, А. Г. Бактерии в продуктивности каменистой литорали оз. Байкал Текст. / А. Г. Родина // Проблемы гидробиологии внутренних вод. -1954.-С. 172-201.

60. Романенко, В. И. Экология микроорганизмов пресных водоемов. Лабораторное руководство. Текст. / В. И. Романенко, С. И. Кузнецов. АН СССР. Ин-т биологии внутр. вод. Л.: Наука, Ленингр. отд., 1974. - 194 е.; 21,5 см. - Библиогр.: с. 181-188. - 1850 экз.

61. Романова, А. П. Сезонная динамика процессов круговорота азота в водной толще и грунтах литорали оз. Байкал Текст. / А. П. Романова // В кн.: Труды VI совещания по проблемам биологии внутренних вод. - Борок, 1959.-С. 159-167.

62. Романова, А. П. сезонная динамика бактериопланктона, его горизонтальное и вертикальное распределение в южной части Байкала Текст. / А. П. Романова // Изв. СО АН СССР. 1958. - № 7. - С. 28-35.

63. Романова, А. П. Микробиологическая характеристика глубоководных грунтов южной части озера Байкал Текст. / А. П. Романова // Исследованияпо микрофлоре и зоопланктону Байкала. М.: Изд-во АН СССР. - 1963. - С. 1-11.

64. Страхов, Н. М. Диагенез современных морских и озерных отложений и превращение их в осадочные породы Текст. / Н. М. Страхов // В сб. "Образование осадков в современных водоемах". Изд-во АН СССР. 1954. -С. 374-787.

65. Страхов, Н. М. Основы теории литогенеза Текст. / Н. М. Страхов // -М.: Изд-во АН СССР. 1962. - Т. 2. - 574 с.

66. Тимошкин, О. А. Аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна Текст. / О. А. Тимошкин, Т. Я. Ситникова, О. Т. Русинек // Том I. Озеро Байкал, кн.1. 2001. - 832 с.

67. Шишмарев, М. И. Особенности аэромии глубинных вод Байкала в период весеннего перемещения Текст. / М. И. Шишмарев, В. М. Домышева, Л. А. Горбунова // География и природные ресурсы. 1996. - № 1. - С. 64-72.

68. Штевнева, А. И. Активность бактериальных процессов в донных отложениях южной части Байкала Текст. / А. И. Штевнева, Н. Д. Судакова // Микробиология. 1986. - Т. 55, № 5. - С. 839-845.

69. Штурм, Л. Д. Микробиологические исследования иловых отложений озера Боровского Текст. / Л. Д. Штурм, М. А. Мессинева, Н. П. Федоровская // Тр. Лаборатории генезиса сапропелей. 1941. - вып. 2. - С. 115-129.

70. Экзерцев, В. А. Определение мощности микробиологически активного слоя иловых отложений Текст. / В. А. Экзерцев // Микробиология. 1948. -Т. 17, вып. 5. - С. 476-483.

71. Яснитский, В. А. Отчет о работе Байкальской лимнологической станции Текст. / В. А. Яснитский, Б. Н. Бланков, В. И. Гортиков // Известия Биол.-геогр. Института при ИГУ. Иркутск. - 1927. - Т. 3, вып.З. - С. 47-54.

72. Amann, R. J. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation Text. / R. J. Amann, W. Ludwig, K.-H. Schleifer // Microbial Rewiev. 1995. - V. 59, № 1. - P. 3496-3500.

73. Bano, N. Phylogenetic composistion of Artie Ocean archaeal assemblages and comparison with Antartic assemblages Text. / N. Bano, S. Ruffin, B. Ranson, J. T. Hollibaugh // Applied and Environmental Microbiology. 2004. - V. 70, № 2. -P. 781-789.

74. Bergey's Manual of systematic Bacteriology. Editor Garrity, G. M. -Springer, 2nd edition. 2004. 2816 P.; 28 см. - экз. - ISBN 978-0387950402.

75. Bradbury, J. P. A synthtesis of post-glacial diatom records from Lake Baikal Text. / J. P. Bradburry, Y. V.Bezrukova, G. P. Chernyaeva // Paleolimnology. -1994.-V.10.-P. 213-252.

76. Callender, E. Geochemical mass balances of major elements in Lake Baikal Text. / E. Callender, L. Granina // Limnology and Oceanography. 1997. - V. 42, № 1,-P. 148-155.

77. Chapelle, F.H. Rates of microbial metabolism in deep coastal-plain aquifers Text. / F.H. Chapelle, D.R. Lovley // Applied and Environmental Microbiology. -1990. -V. 56.-P. 1856-1874.

78. Crane, K. Hydrothermal vents in Lake Baikal Text. / K. Crane, В. Hecker, V. Golubev // Nature. 1991. - V. 350, № 6316. - P. 281.

79. Eilkelboom, D. H. Filamentous organisms observed in activated sludge Text. / D. H. Eilkelboom // Water Research. 1975. - V. 9. - P. 365-388.

80. Ekendahl, S. Carbon transformations by attached bacterial populations in granitic groundwater from deep crystalline bed-rock of the Stripa research mine Text. / S. Ekendahl, K. Pedersen // Microbiology. 1994. - V. 140. - P. 1565-73.

81. Falkner, К. K., The major and minor element geochemistry of Lake Baikal Text. / К. K. Falkner, С. I. Measures, S. E. Herbelin, J. M. Edmond, R. F. Weiss // Limnology and Oceanography. 1991. - V. 36, №3. - P. 413-423.

82. Fodde, R. Mutation detection by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Text. / R. Fodde, M. Losekoot // Human Mutation. 1994. - V. 3. - P. 83-94.

83. Gallardo, V. A. Large benthic microbial communities in sulphide biota under Peru-Chile subsurface counter current Text. / V. A. Gallardo // Nature. 1977. -V. 286.-P. 331-332.

84. Glockner, F.-O. Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridisation Text. / F.-O. Glockner, B. M. Fuchs, R. Amann // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - V. 65, №8.-P. 3721-3726.

85. Granina, L. Oxygen, iron, and manganese at the sediment-water interface in Lake Baikal Text. / L. Granina, B. Mueller, B. Wehrli, P. Martin // Terra Nostra. -2000.-V. 9.-P. 87-94.

86. Grote, A. Der Sauerstoffhausshalt der Seen Text. / A. Grote // Die Biennengewasser. 1934. - Bd. 14. - Stuttgart.

87. Hinrichs, K. U. Methane-consuming archaebacteria in marine sediments Text. / K. U. Hinrichs, J. M. Hayes, S. P. Sylva, P. G. Brewer, E. F. DeLong // Nature. 1999. - V. 398. - P. 802-805.

88. Holben, W. E. DNA probe method for the detection of specific microorganisms in the soil bacterial community Text. / W. E. Holben, J. K. Jansson, В. K. Chelm, J. M. Tiedje // Applied Environmental Microbiology. -1988.-V. 54. P.703-711.

89. Huettel, M. Vertical Migration in the Sediment-Dwelling Sulfur Bacteria Thioploca spp. In Overcoming Diffusion Limitations Text. / M. Huettel, S. Forsret, S. Kloser, H. Fossing // Applied Environmental Microbiology. 1996. -P. 1863-1872.

90. Killworth, P. D. Modelling deep water renewal in Lake Baikal Text. / P. D. Killworth, E. C. Carmack, R. F. Weiss, R. Matear // Limnology and Oceanography. 1996.-V. 41.-P. 1521-1538.

91. Kojima, H. Community structure of bacteria associated with sheaths of freshwater and brackish Thioploca species Text. / H. Kojima, Y. Koizumi, M. Fukui // Microbial Ecology. 2006. - V. 52, № 4. - P. 765-773.

92. Maier, S. Description of Thioploca ingrica sp.nov. nom.rev. Text. / S. Maier // International Journal Systematic Bacteriology. 1984. - V. 34. - P. 344-345.

93. Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms Text. / J. Marmur // Journal Molecular Biology. 1961. - V. 3. -P. 208-218.

94. Martin, P. Oxygen concentration profiles in sediments of two ancient lakes: Lake Baikal (Siberia, Russia) and Lake Malawi (East Africa) Text. / P. Martin, L.Z. Granina, K. Martens, B. Goddeeris // Hydrobiologia. 1998. - V. 367. - P. 163-174.

95. Martin, P. Oxygen concentration profiles in soft sediment of Lake Baikal (Russia) near the Selenga delta Text. / P. Martin, B. Goddeeris, K. Martens // Freshwater Biology. 1993. - V. 29, № 3. - P. 343-349.

96. McHatton, S. C. High nitrate concentrations in vacuolate, autotrophic marine Beggiatoa spp. Text. / S. C. McHatton, J. P. Barry, H. W. Jannasch, D. C. Nelson // Applied Environmental Microbiology. 1996. - V. 62. - P. 954-958.

97. Miskin, I. Bacteria in post-glacial freshwater sediments / I. Miskin, G. Rhodes, K. Lawlor, J. R. Saunders, R. W. Pickup // Microbiology. 1998. - V. 144.-P. 2427-2439.

98. Mortimer, С. H. The exchange of dissolved substances between mud and water in lake Text. / С. H. Mortimer // The Journal of Ecology. 1941. - V. 29, № 2.-P. 280-329.

99. Odintsova, E. V. Chemolithoautotrophic growth of Thiothrix ramosa Text. / A. P. Wood, D. P. Kelly//Arch. Microbiology. 1993. -V. 160. - P. 152-157.

100. Ogram, A. The extraction and purification of microbial DNA from sediments. / A. Ogram, G. S. Sayler, T. Barkay // Journal Microbiology Methods.- 1987.-V. 7.-P. 57-66.

101. Purdy, K. J. Analysis of the sulfate-reducing bacterial and methanogenic archaeal populations in contrasting Antarctic sediments Text. / K. J. Purdy, D. B. Nedwell, Т. M. Embley II Applied Environmental Microbiology. 2003. - V. 69. -P. 3181-3191.

102. Rochelle, P. A. DNA extraction for 16S rRNA gene analysis to determine genetic diversity in deep sediment communities Text. / P. A. Rochelle, J. C. Fry, R. J. Parkes, A. J. Weightman // FEMS Microbiology Letters. 1992. - V.100. -P.59-66.

103. Roose-Amsaleg C. L., Garnier-Sillam E., Harry M. Extraction and purification of microbial DNA from soil and sediment samples Text. / C. L. Roose-Amsaleg, E. Garnier-Sillam, M. Harry // Applied Soil Ecology. 2001. - V. 18.-P. 47-60.

104. Rothfuss, F. Survival and activity of bacteria in a deep, aged lake sediment (Lake Constance) Text. / F. Rothfuss, M. Bender, R. Conrad II Microbial ecology.- 1997. -V. 33, №1.-P. 69-77.

105. Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual Text. / J. Sambrook, E. F. Frisch, Maniatis T. // New York, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor1.boratory Press. 1989. - 350, 2. с ил. 27,5 см. - Библиогр.: с. 342-348. - экз. -ISBN 0-87969-309-6.

106. Schippers, A. Prokaiyotic cells of the deep sub-seafloor biosphere identified as living bacteria Text. / A. Schippers, Lev N. Neretin, J. Kallmeyer, T.G. Ferdelman, B. A. Cragg, R. J. Parkers, Bo B. Jorgensen // Nature. 2005. - V. 433. -P. 861-864.

107. Schulz, H. N. Big bacteria Text. / H. N. Schulz, В. B. Jorgensen // Annual Review Microbiology. -2001. V. 55. - P. 105-137.

108. Schulz, H. N. Dense populations of a giant sulfur bacterium in Namibian shelf sediments Text. / Schulz H. N., Brinkhoff T. G., Ferdelman T. G., Marine M. H., Teske A. // Science. 1999. - V. 284. - P.493-495.

109. Skerman, V. B. D. Approved lists of bacterial names Text. /V. B. D. Skermann, V. Mc Gowan, P. H. A. Sneath // International Journal Systematic Bacteriology. 1980. - V. 30. - P. 225-420.

110. Steffan, R. J. Recovery of DNA from soil and sediments Text. / R. J. Steffan, J. Goksoyr, A. K. Bej, R. M. Atlas // Applied and Environmental Microbiology. -1988.-V. 54. P.2908-2915.

111. Tebbe, С. C. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and yeast Text. / С. C. Tebbe, W. Vahjen // Applied and Environmental Microbiology. -1988.-V. 59. P.2657-2665.

112. Teske, A. Phylogeny of Thioploca and related filamentous sulfide-oxidizing bacteria Text. / A. Teske, N. B. Ramsing, J. Kuver, H. Fossing // Systematic Applied Microbiology. -1995. V. 18. - P. 517-526.

113. Tsai, Y.-L. Rapid method for separation of bacterial DNA from humic substances in sediments for polymerase chain reaction Text. / Y.-L. Tsai, В. H. Olson [Text] // Applied Environmental Microbiology. 1992. - V. 58. - P. 22922295.

114. Urbach, E. Unusual bacterioplankton community structure in ultra-oligotrophic Crater Lake Text. / E. Urbach, K. L. Vergin, L.Young, A. Morse, G.

115. Larson, S.J. Giovannoni 11 Limnological Oceanography. -2001. V. 46,3.-P. 557-572.

116. Vologina, E. G. New results of high resolution studies of surface sediments of Lake Baikal Text. / E. G. Vologina, M. Sturm, S. S. Vorobyova, L. Z. Granina // Terra Nostra. 2000. - V. 9. - P. 115-131.

117. Williams, D. F. Lake Baikal record of continental climate response to orbital insolation during the past 5 million years Text. / D. F. Williams // Science. 1997. -V. 278.-P. 1114-1117.

118. Williams, Т. M. Filamentous sulfur bacteria of activated sludge: characterization of Thiothrix, Beggiatoa, and Eikelboom type 02IN strains Text. / Т. M. Williams, R. F. Unz // Applied and Environmental Microbiology. 1985. -V. 49, № 4. - P. 887-98.

119. Woese, C. R. Bacterial evolution Text. / C. R. Woese // Microbial Reviews. -1987.-V. 51, №2.-P. 221-271.

120. Zhou, J. DNA recovery from soils of diverse composition Text. / J. Zhou, M. A. Bruns, J. M. Tiedje // Applied and Environmental Microbiology. 1996. - V. 62.- P. 316-322.

Информация о работе

Черницына, Светлана Михайловна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2007
ВАК 03.00.16

Диссертация

Разнообразие микроорганизмов в различных по экологическим условиям осадках оз. Байкал - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы