Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный анализ микробных сообществ мест залегания углеводородов на дне озера Байкал

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный анализ микробных сообществ мест залегания углеводородов на дне озера Байкал"

сЛу/*

На правах рукописи

КАДНИКОВ ВИТАЛИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Молекулярпый анализ микробных сообществ мест залегания углеводородов на дне озера Байкал

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о 4 СЕН 2014

Москва-2014

005552215

Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук.

Научпый руководитель:

Официальные оппоненты: Яненко Александр Степанович, доктор биологических наук, профессор. Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов", заведующий лабораторией генетики процессов биодеградации, заместитель директора по научной работе.

Петрова Майя Александровна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, лаборатория молекулярной генетики микроорганизмов, заведующая сектором анализа и хранения микроорганизмов.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится <61» октября 2014 г. в 11 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени МВЛомоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр.12, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте www.hio.msu.ru

Автореферат разослан «М » 2014 г.

доктор биологических наук

Марданов Андрей Владимирович

Ученый секретарь дисссртационногг кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Изучение биоразнообразия микроорганизмов и структур микробных сообществ занимает центральное место среди задач экологии микроорганизмов. Озеро Байкал, возраст которого оценивается в 20-30 млн. лет, является уникальной экологической нишей. Его характеризуют большие глубины, низкая температура и постоянство химического состава воды. Высокая насыщенность кислородом всей толщи воды, низкая концентрация органических веществ и низкая минерализация воды обуславливают специфические условия жизнедеятельности микроорганизмов.

В последние годы на дне Байкала открыты районы приповерхностного залегания гидратов метана, - кристаллических структур, в которых газ находится в окружении молекулы воды. Гидраты метана распространены в морских осадках и рассматриваются в качестве перспективного топливно-энергетического ресурса. Байкал является единственным пресным водоемом, в котором обнаружены гидраты, их стабильность в нем обеспечивается благодаря большой глубине и низкой температуре воды. На дне Байкала обнаружены также естественные выходы нефти, в районах которых образуются битумные холмы, представляющие собой специфические экосистемы, зависимые от углеводородов, а не от притока органических веществ с поверхности.

Микроорганизмы играют важную роль как в процессах биодеградации углеводородов, так и их образования. Так, превращение органического вещества в метан микроорганизмами - важнейший биологический процесс в глобальном цикле углерода. Образованный метан может выходить в атмосферу в газовой форме, окисляться, или быть изолированным в твердой форме в виде газовых гидратов. Микробные процессы могут способствовать не только образованию гидратов метана, но также и их разрушению через анаэробное окисление метана, осуществляемое некоторыми линиями архей. Исследование микробных сообществ экологических ниш, ассоциированных с естественными выходами углеводородов, расширят наши знания о роли микроорганизмов в процессах их образования и биодеградации.

Ранее в рамках микробиологических исследований воды и донных отложений Байкала проводили определение численности микроорганизмов и сезонной динамики, изучение различных физиологических групп микробиологическими и биохимическими методами, с помощью электронной микроскопии и радиоизотопного анализа. Однако, как правило, не более 0.1-1% микроорганизмов из природного сообщества удается культивировать в лабораторных условиях, поэтому при исследовании природных

экосистем классическими методами большая часть сообщества остается не охарактеризованной (Ашапп е1 а!.. 1995).

Дм характеристик состава микробных сообществ используются как традиционные микробиологические методы, предполагающие получение чистых культур микроорганизмов и их характеристику, так и молекулярные методы идентификации микроорганизмов по последовательностям генов 168 рРНК, без их культивирования. Разработка метода параллельного пиросеквенирования дала возможность проведение анализа нескольких тысяч-десятков тысяч независимых нуклеотидных последовательностей 168 рРНК, что дает возможность количественного определения долей отдельных групп микроорганизмов даже для сложных сообществ, насчитывающих сотни-тысячи видов. Применение методов пиросеквенирования к анализу 168 РНК микробных сообществ сразу же выявило неожиданно большое разнообразие многих из них (почв, океана и др.) и позволило идентифицировать новые филогенетически линии микроорганизмов, неизвестные классической микробиологии.

Феномен байкальской нефти и газовых гидратов являлся предметом всестороннего геолого-геофизического изучения. Имеется ряд работ, посвященных выделению и культивированию бактерий - биодеструкгоров нефти, однако исследования микробных сообществ, ассоциированных с районами нефтепроявлений и газовых гидратов в Байкале, методами высокопроизводительной геномики ранее не проводились. Таким образом, задача характеристики этих микробных сообществ молекулярными методами является актуальной и представляет интерес для исследований в области микробиологии и молекулярной биологии.

Предметом настоящей работы является молекулярный анализ микробных сообществ мест залегания гидратов метана и выходов нефти на дне Байкала

Цель и задачи исследования

Целью работы является определение структур сообществ микроорганизмов в местах залегания гидратов метана и естественных выходов нефти на дне Байкала и реконструкция их метаболизма.

Для этого в работе решались следующие основные задачи:

1. Идентификация микроорганизмов на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16Э рибосомной РНК, определенных методом пиросеквенирования.

2. Идентификация и анализ генов, определяющих ключевые процессы, протекающие в исследуемых экологических нишах.

3. Реконструкция путей метаболизма сообществ на основе данных об их составе.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые методами высокопроизводительной геномики определен состав микробных сообществ, ассоциированных с гидратами метана в пресноводной экосистеме. Ранее такие исследования проводились только для морских гидрат-содержащих осадков. Идентифицированы новые филогенетические линии микроорганизмов, эндемичных для Байкала. Установлено, что состав исследованных микробных сообществ существенно отличается от состава сообществ морских гидрат-содержащих осадков. Полученные данные подтверждают гипотезу о биогенном происхождении гидратов метана в Байкале, предложена схема экологической взаимосвязи микроорганизмов, приводящая к их образованию.

Определен состав микробных сообществ битумных построек на дне Байкала. Обнаружены протеобакгерии и акгинобактерии, способные осуществлять аэробное окисление алканов. Полученные данные указывают на то, что в анаэробной зоне битумных построек процессы биодеградации углеводородов с образованием метана могут осуществляться синтрофным сообществом, включающем дельта-протеобактерии и метаногенные археи. Практическая значимость работы обусловлена перспективами поиска и использования гидратов метана в энергетике, а также применения психрофильных микроорганизмов для биоремедиации нефтяных загрязнений.

Апробация работы

Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: 14-я и 15-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010 и 2011), The 10 International conference on gas in marine sediments (Листвянка, 2010), The 11 International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology (Греция, 2011), The 8 International Symposium of Subsurface Microbiology (Германия, 2011), The 14 International Symposium on Microbial Ecology - ISMEI4 (Дания, 2012), «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, 2013).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований, анализе результатов. Основные результаты получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК и 7 материалов отечественных и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и включают 23 рисунков и 13 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 30 отечественных и 250 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Микробное сообщество микроорганизмов ассоциированных с газовыми гидратами на дне озера Байкал.

Для анализа разнообразия микроорганизмов, ассоциируемых с местами залегания гидратов метана, в ходе экспедиции летом 2009 г. сотрудниками Лимнологического института СО РАН (Погодаева Т.В., Шубенкова О.В., Земская Т.И.) с глубины около 1400 м. из района «Санкт-Петербург» в центральном Байкале (52°52.8'N и 107°09.4'Е) были отобраны образцы придонной воды, верхнего слоя осадков (0-2 см) и глубинных осадков (85-95 см). Слой гидрата находился на глубине 85-89 см от поверхности осадка Результаты химического анализа, проведенного в ЛИН СО РАН, показали, что поровые воды осадка являются гидрокарбонатно-кальциевыми, содержание сульфата не превышало 15 мг/л и снижалось при увеличении глубины (Рис. 1). Содержание метана было минимально у поверхности и быстро увеличивается на глубине. Выделявшийся из гидратов газ представлял собой метан с небольшой примесью этана.

SO.'-crmM На1. К', С,". Mg!'mM

Рисунок 1. Химический состав поровых вод (данные Т.И. Земской, ЛИН СО РАН).

Сотрудниками ЛИН СО РАН были выделены препараты метагеномной ДНК из отобранных образцов и предоставлены нам для проведения молекулярного анализа микробных сообществ.

Относительное содержание и разнообразие бактерий и архей Для проведения количественного анализа состава микробных сообществ мы использовали метод, основанный на пиросеквенировании вариабельных V3 районов генов 16S рРНК. Для ПЦР амплификации V3 регионов были использованы «универсальные» праймеры U341F и U515R. Пиросеквенирование полученного ПЦР фрагмента осуществляли на геномном анализаторе GS FLX (Roche). Анализ полученных последовательностей проводили с использованием пакета программ RDP Classifier (Cole et al., 2009). На первом этапе последовательности 16S рРНК разделяли на бактериальные и архейные с помощью классификатора RDP Naive Bayesian rRNA Classifier Version 2.0, в дальнейшем «бактериальные» и «архейные» последовательности анализировали отдельно.

В результате пиросеквенирования V3 района гена 16S рРНК метагенома придонной воды (В1), было определено 28902 бактериальных и 336 архейных последовательностей 16S рРНК. Таким образом, бактерии представляют абсолютное большинство микроорганизмов в придонной воде, небольшая примесь архей может быть обусловлена захватом верхнего слоя осадка при отборе пробы воды. Для оценки сложности исследуемых сообществ и полноты полученных данных мы провели кластерный анализ и определили зависимость числа детектируемых филотипов (OTU, Operational Taxonomic Units) от количества анализируемых последовательностей (Rarefaction анализ). Построенные кривые выходят на плато, подтверждая, что полученной в данной работе выборки достаточно для полного описания микробного сообщества (Рис. 2). Разнообразие бактериального сообщества придонной воды (Табл. 1) может быть оценено примерно в 450 видов (кластерное расстояние 0,03).

Рисунок 2. Rarefaction анализ микробного сообщества придонной воды. Показана зависимость числа детектируемых филотипов от числа анализируемых последовательностей 16S рРНК

Таблица 1. Разнообразие микробных сообществ.

Образец Количество прочтенных последовател ьносгей Количество ОТ11

0 0.03 (вид) 0.05 (род)

Придонная вода (В1) Бактерии 28902 849 448 349

Археи 336 29 20 19

Верхний слой осадка (В2) Бактерии 5576 332 193 144

Археи 11811 340 171 134

Глубинный слой осадка (ВЗ) Бактерии 18177 952 490 359

Археи 6800 460 183 132

Из последовательностей 165 рРНК метагенома верхнего слоя осадка (В2) к бактериям было отнесено 5576 последовательностей, а к археям - 11811. Таким образом, археи составляют около 2/3 всех обнаруженных микроорганизмов. Разнообразие бактериального сообщества в верхнем слое осадков было меньше чем в придонной воде и сопоставимо с архейным компонентом (Табл. 1). Набор данных для глубинного слоя осадков (ВЗ) содержал 18177 чтений, соответствовавших бактериальным генам 16Б рРНК и 6800 - архейным. В глубинном слое осадка доля бактерий составила более 70% микроорганизмов. Это бактериальное сообщество было более сложным по составу, тогда как разнообразие архей было приблизительно таким же, как в поверхностном осадке (Табл. 1).

Структура бактериального сообщества придонной воды Большую часть бактерий в придонной воде составляли представители класса Оаттарго1еоЬас1епа (50.5% всех бактериальных последовательностей) и большинство из них принадлежали к семейству Ме1Ьу1ососсасеа (43% всех бактерий, в основном род Ме1Иу1оЬас1ег), известные представители которого осуществляют аэробное окисление метана (Рис. 3). Приблизительно 5,6% всех последовательностей 16Э рРНК были близки к семейству С/гготаНасеае того же класса. Вторая по численности группа микроорганизмов - Ве1арго1еоЬас1епа (27%), главным образом, представленные типичными «водными» микроорганизмами из семейств Сотатопа<1асеае (19,6%) и Мго<1осус1асеае, а также метилотрофами семейства МеЛу1орМ1асеае. Около 5,7% бактерий относились к классу Ое11арго1еоЬас1епа, хотя большинство из них были филогенетически удалены от известных видов. Около 7% бактерий относятся к филуму йас/егои/е/ея, они представлены родами Г1сп>оЬас1егшт, Ра1исИЬас1ег, и различными 5р1г^оЬас1егшсеае, которых неоднократно обнаруживали в Байкальской воде.

6

Бактерии филума Firmicutes, в основном Clostridia, составляли около 2,1% микроорганизмов. Также в минорных количествах были обнаружены представители Epsilonproteobacteria, филумов Actinobacteria, SRI, Cyanobacteria, Acidobacteria, Verrucomicrobia и Spirochaetes.

Bacteria Archaea

□ Alpha-proteobactena

□ Beta-proteobactena

□ Gamma-proteobactena

■ Detla-proteobaelena

■ Epsilon-proteobactena

□ Firmicules

■ Bacteroidetes

□ Aclinobacteriiii

□ Chloroflexi BOD1-OP11-SR1 group ■Cyanobacteria

■ Acidobacteria

■ Spirochaotas

■ Caldisenca QJS1

□ VerrucomicrobH

■ Separate lineages QOthers'unassigned

О Met ha nomic robiales

□ Methanosarcinales DTMEG

■ MGIII

□ Tbeimoptasnialoles ■SAGMEG DVALIII

QMCG

■ Baikal-1

□ Baikal-2 D Baikal-3

■ Baikal-4

□ Baikal-5

■ Baikal-6 BBaikat-7

■ Baikal-8

□ MBGA

□ M8GB

■ Marine group 1

□ Ol her/unassigned

Рисунок 3. Структура микробных сообществ, определенная в результате анализа последовательностей 168 рРНК. В1, - придонная вода; В2, - верхний слой осадка. ВЗ. -глубинный осадок (ВЗ)

Структура микробного сообщества поверхностного слоя осадка.

В отличие от придонной воды, большая часть бактерий из донных осадков (как поверхностного, так и глубинного слоя), оказалась филогенетически удаленной от известных видов. Более половины последовательностей не удалось классифицировать путем сравнения с базой данных генов 168 рРНК. Поэтому для анализа состава микробных сообществ осадков был использован кластерный анализ. Для каждого кластера была выбрана репрезентативная нуклеотидная последовательность. Для их таксономической классификации строили филогенетические деревья, включающее эти последовательности и последовательности 16Э рРНК представителей основных групп архей или бактерий.

Полученные результаты (Рис. 3) показывают, что бактерии включают как линии, обнаруженные в придонной воде, так и группы, специфичные для осадков. Среди первых обнаружены СаттаргоГеоЬааеп'а (24.9%, в основном метаноторофы МеЛуЬЬас/ег зрр.), ВеШрго1еоЬас1ег1а (7.4%. в основном метилотрофные бактерии МеЛу1орЫ1асеае), ОеНарго/еоЬааег^а (3.4%), А1рИарго1еоЬас1ег1а (2.0%) и Bacteroidetes (8.1%). Неожиданным результатом оказалось то, что второй по численности (20.1%)

группой бактерий в верхнем слое осадка оказались цианобактерии, близкие к Synechococcus spp. - фотосинтезирующим микроорганизмам, обычно размножающимся в поверхностных слоях воды. Напротив, доля цианобактерий в придонной воде составляла менее 0,5% бактериального сообщества. Возможно, цианобактерии развиваются в отсутствии света, осуществляя гетеротрофный метаболизм, хотя и не исключена вероятность поступления их с фекальными пеллетами зоопланктона.

Представители трех других бактериальнььх филумов были найдены только в осадках, но не в придонной воде - Caldiserica (8.3%), представители которого первоначально были обнаружены в геотермальных местообитаниях, а позднее в различных озерах и почвах, кандидатного филума JSI (2.7%) и Chloroflexi (2.0%). В небольших количествах были обнаружены представители Actinobacteria (2%), SRI (1%), Acidobacteria (0,6%) и Verrucomicrobia (0,4%). Около 10% бактерий были филогенетически удалены от известных микроорганизмов (идентичность последовательностей 16S рРНК менее 90%), что не позволило провести их классификацию даже на уровне филума. Вероятно, эти бактерии представляют собой глубокие филогенетические ветви, специфичные для Байкала. Известные сульфат-редуцирующие бактерии ни в придонной воде, ни в осадках не обнаружены.

Доминирующей группой архей в верхнем слое осадка были метаногены, которые были представлены эуриархеями порядка Methanomicrobiales (17.4%), являющихся гидрогенотрофными метаногенами. и порядка Methanosarcinales (16.8%), включающего также ацетокластических метаногенов. Организмы, относящиеся к другим известным группам метаногенных архей, порядкам Methanococcales, Methanobacteriales и Methanopyrales, обнаружены не были. Представители группы I метаногенов (Methanomicrobiales) были близки к роду Methanosphaerula (95% идентичности на уровне последовательности 16S рРНК), тогда как группа 2 метаногенов (Methanosarcinales) была представлена линией, которая имеет отдаленное родство с Methanosaeta (Рис. 4). Архей, близкие второй группе (97-98% идентичности 16S рРНК), были найдены в различных осадках рек и пресноводных озер, а также в осадках моря Лаптевых в Арктике. Подчеркнем, что байкальские архей на филогенетическом дереве кластеризовались именно с метаногенами, а не с группами архей, осуществляющих обратную реакцию анаэробного окисления метана (ANME-1, 2, 3).

Около 6.9% последовательностей I6S рРНК архей кластеризовались с группой кренархей Marine group 1, близкой к Nitrosopumilus spp. Эти аэробные автотрофные микроорганизмы широко распространены в морях и почвах, где они играют важную экологическую роль, осуществляя окисление аммония до нитрита.

PMMV-ATC317 PMMV.Arc301

PMMV-Arc1 PMMV-Arc303 87L PMMV-Arc12

55L ANME2aPC

62*-SB-24a1Bl1

- BS-K-410 HydBegl34 00 ANME2bPC — Eel-36a2B9

Eel-36a2A5 ANME2cPC Cl_R048

GoM GC234 634R_ Methanohalobium evestigatum Methanosarcina mazsi Methanosarcina ecetivcrans,

Methanomicrococcus

Methanomethylovorans holiendica Mathanohalophilus portucalensis Msthanolobus uulcani Methanococcoides burtonii HMMVBeg-34 "| HydBeg92 HMMVBeg-32 J

Methanothrix soehnganii SI3143

Methanosaeta Iharmophila B2U-AJKVW (group 2)

SMPUFLSS70m_1 LCDARCH63

_I LCDARCH117

67 i-PASLSS0.5m_2

Methanosphaemla palustris B2U-C39DZ (group 1)

Mat'nanocalculus pumilus

Methanocorpusculum labreanum MethanospiriUum hungalei Methsnogeniurr, frigidum Mothanorricrobium mobile Methanoganium thermoohilum Mathanocullous marisnigri GBa2r045 ANME1PC HR-MM-004 PM MV-Arc 186 -SR-G1

Methanosphaera stadtmanaa 1 Melhanobacterialcs MertiQnothennobacler thermautotrophicusj Methanococcus vannialii "1

Mfithanococcales

ANME-3

Malhamceldococcus jannaschii

- Aempymm pemix

Рисунок 4. Филогенетическое дерево архей, построенное по последовательностям генов 16Б рРНК. на котором представлены основные группы метаногеных и метан-окисляющих архей. Обнаруженные в нашей работе группы 1 и 2 метаногенов представлены последовательностями B2U-A.IK.VW и В21)-С3907, соответственно.

Остальные архей представляют некультивируемые линии. Около 14% последовательностей относятся к Terrestrial miscellaneous euryarchaeotal group (TMEG), первоначально обнаруженной в шахтах Южной Африки, а затем в почвах, морских и озерных осадках. Близкие к этой группе последовательности 16S рРНК были обнаружены в почвах, загрязненных нефтью, и осадках. Около 1 1,4% архей относятся к кренархеям линии MCG1, имеющей широкий ареал распространения, который включает почвенные и морские, горячие и холодные, поверхностные и подземные

местообитания. В частности, близкие клоны были обнаружены в осадках пресных водоемов в разных районах мира.

Около 28% архей относятся к восьми группам кренархей, названным Baikal-1 -Baikal-8, филогенетически удаленным от ранее описанных групп. Наиболее многочисленной из этих групп является Baikal-1, на которую приходится 19,2% всех архейных последовательностей. Архей, близкие этой группе, широко распространены в пресноводных осадках. Последовательности 16S рРНК двух линий (Baikal-5 и Baikal-б), на которые приходится суммарно около 2% архейных последовательностей, не имели близких гомологов в базах данных; возможно эти группы эндемичны для Байкала.

Структура микробного сообщества глубинного слоя осадков.

В глубинном слое осадков (85-95 см.) бактерии составляли около 70% всех микроорганизмов. Лишь менее 5% бактериальных и архейных последовательностей имели более 95% гомологии с генами 16S рРНК культивируемых микроорганизмов, что подчеркивает новизну и необычность этого микробного сообщества.

Состав бактерий глубинного слоя осадков существенно отличается от состава бактерий верхнего слоя и придонной воды (Рис. 3). Большинство составляли представители филумов Chloroflexi (38% бактериальных последовательностей), JS1 и Caldiserica, тогда как Gammaproteobacteria и Cyanobacteria были представлены в минорных количествах. Более 10% 16S рРНК бактерий представляли глубокие филогенетические ветви и не были классифицированы даже на уровне филума.

Среди Chloroflexi большую часть составляли представители класса Dehalococcoidetes, внутри которого байкальские образцы образовывали отдельный филогенетический кластер. Культивируемые представители Dehalococcoidetes являются анаэробными гетеротрофами, осуществляющими восстановительное дехлорирование. Клоны, близкие к обнаруженной в данной работе линии Chloroflexi, были обнаружены в различных анаэробных пресноводных и морских осадках.

Около 19% бактериальных последовательностей относились к кандидатному филуму JS1. Представители этой линии обнаруживались в глубинных и поверхностных морских осадках, в частности, члены бактерии филума JS1 составляли более 50% клонов в морских осадках, содержащих гидраты метана (Inagaki et а!., 2006).

В архейном сообществе глубинного слоя осадков помимо метаногенов были

обнаружены некультивируемые линии архей (Рис. 3). Среди метаногенов были

детектированы две группы, найденные и в верхнем слое осадков, однако их суммарная

Ю

доля была ниже (10,3% против 34,2% всех архей, соответственно). В отличие от верхнего слоя осадка здесь среди метаногенов преобладали Afelhanomicrobiales (8,4%). Euryarchaeota бьии также представлены некультивируемыми группами TMEG (8,8%) и SAGMEG (3,4%). Вторая группа была первоначально обнаружена в глубокой золотодобывающей шахте Южной Африки (Takai et al., 2001), но позднее эти археи были найдены и в морских осадках с гидратами метана.

Кренархеи нескольких групп, близких к линии MCG1, составляли 24,2% архейного сообщества. Они близки к археям линии MCG1, обнаруженным в верхнем слое осадка (В2). Из восьми «некультивируемых» линий кренархей, найденных в верхнем слое осадка, три линии (Baikal 1, 2 и 3) были также найдены в глубинном слое. На долю этих «Байкальских» линий приходилась почти половина всех архей (41,5%), причем группа Baikal-1 являлась доминирующей в архейном сообществе (33,2%).

Филогенетический анализ последовательностей МсгА

Принципиально важным для анализа путей биотрансформации метана является ответ на вопрос о том, являются ли археи «метаногенных» групп именно метаногенами или они родственны организмам, осуществляющими обратную реакцию, т.е. анаэробное окисление метана. Среди представителей порядка Methanomicrobiales окисляющие метан организмы ранее не были обнаружены, но две из трех групп ANME архей (ANME-2 и ANME-3), образуют отдельные ветви в порядке Methanosarcinales. Построенные нами филогенетические деревья последовательностей 16S рРНК показывают (Рис. 3), что байкальские метаногены не кластеризуются с ANME-2 или ANME-3, однако, мы провели дополнительное исследование этого вопроса.

Ключевым ферментом метаногенеза является метил-коэнзим М редукгаза (Мег), субъединица А которой (МсгА) используется как общий маркер метаногенных архей. Этот фермент присутствует как у метаногенов, так и у AMNE - архей и используется в обоих процессах. Однако, различия в механизмах метаногенеза и окисления метана определяют и различия в аминокислотных последовательностях МсгА у метаногенов и AMNE — архей. Для анализа последовательностей МсгА мы амплифицировали фрагменты гена тсгА из метагеномной ДНК верхнего слоя осадков, полученный фрагмент клонировали в плазмидном векторе pGEM-T и определяли нуклеотидные последовательности независимых клонов. Аминокислотные последовательности МсгА анализировали, строя филогенетические деревья, включающие последовательности МсгА из различных метаногенных и ANME-архей (Рис. 5).

B2U4fc«№82a ftfOt* tj

MRE-ME1

Utiftancfftnium су$ггк&Шт ~~ -тоШ

MbtteroCdihut tfrnmofiMit WHbtPGV&fkt*i Aufljvt»/ Sktiuxoc crpv Kuivr» parvw*

MattwvYTfcrcfctato*

RS-MCR01

|Wr— Metf*»oc«<le pttodkofe RS-ME26

RS-MCR24 RS-MCR42 lkMt>anc&2*t3(МпьорШ щ .CIfos_35_2S12

1—BR_42bB08 I-OOPS-ME1

Дптцоню

f?C4.1_30e06

ЯГС/А {уоф* e-d

(AMME-7)

_f4j- W3m-10? (ZC-1 e*et«) — RS-MCR04 n ADT43 16

fij- W3m-1 ( —

—— LLmjU ГГ1 I

4

- RS-MCR« ~IRS4HCR06

ptf—=-1 -Kb

•J I-Km

j— (XP&-ME2 "IF17.1_30B02 Kuro-mciA-З.И Kuo-tncrA-4.C2

К(Ж>як«М".01

Metb4K>hal<&»m evwijwt m

/¡MbenteMons Mt« MHJWKGktxx zirxtoti IMbanosdsun ГЛЛ'аж ilfettooocqccoAJrt

(ANME-2)

МвМмпомгскмсые

н I-(&X6491

H I-OUos

Ml_

«п— T201

f&t&siKje&cteriii» bryar&i *Mtetx>tt»rmct>*X#ittm ИнтзиКЛърЬк HM*if>abrevb*citr tniM

trtrtcrtfod M-ghaxfrartaiatet _

ИнЬюжк-М 1жЬ**КО€М

ttettenoc&fixiicciKjmMacM _J

Btock sea tfosml (8X64919?) GZios1?a3 .30Д02 ТЙП.ЗОСО«

mtrA дпч>

(ME-U

MEttMnGtoactefides

Рисунок 5. Филогенетическое дерево аминокислотных последовательностей фрагмента McrA. Group I и group 2, - две группы последовательностей МсгА архей, выделенных из верхнего слоя осадка.

Первая группа кластеризовалась с МсгА метаногенов порядка Methanomicrobiales. Вторая группа образовывала филогенетическую ветвь, аффилированную с МсгА метаногенов порядка Methanosarcinales и включающую также последовательности МсгА метаногенных архей с рисовых полей Италии (RC-MCR46, RC-MCR06 и RC-MCR04) и высокогорных болот Тибета (ZCl_w3m-10). В частности, мегганогены ZC1, составляющие около 30% архей в болотах региона Zoige Тибета, являются линией Methanosarcinales, адаптированной к холодным местообитаниям и использующим для метаногенеза различные субстраты, включая водород и ацетат. Последовательности МсгА из ANME архей образовывали отдельные филогенетические ветви. Таким образом, проведенный анализ подтвердил наличие ключевого фермента

12

метаногенеза, МсгА, у архей, обитающих в донных осадках, и показал, что последовательность этого фермента сходна с последовательностями МсгА метаногенных, но не анаэробно окисляющих метан архей.

Процессы образования гидратов метана в Байкале

Ключевыми биогеохимическими процессами, отражающими структуру микробных сообществ мест залегания гидратов, являются метаногенез и аэробное окисление метана. Микробное сообщество придонной воды Байкала в районе залегания гидратов метана примерно на половину состоит из аэробных метанотрофных гамма-протеобактерий рода \iethylobacter, а вторую половину составляют типичные «водные» бактерии. Такая структура бактериальной популяции согласуется с процессами аэробного окисления метана, выходящего из осадка в воду.

Структура микробного сообщества верхнего слоя донного осадка отражает совокупность различных метаболических процессов на границе содержащей кислород озерной воды и осадка, находящегося в бескислородных условиях. Бактериальное сообщество включает как анаэробных метанотрофов, так и «водные» бактерии филума Ва^егоШез, которые могут содержаться в воде, циркулирующей между водной толщей озера и порами в верхнем слое осадка, а также группы бактерий, характерные для осадков (СЫого/!ех!, .131, СаШепса). Архей составили около двух третей микроорганизмов в приповерхностном слое донных осадков. Эуриархеи порядков МеЛапотюгоЫа^ и Ме1капо^агапа!е^ составляли около трети архей. При анализе генов 16Э рРНК и тег А было показано, что эти линии микроорганизмов относятся к метаногенным, а не к анаэробно окисляющим метан линиям. Эти данные согласуются с пресноводной природой местообитания, характеризующегося низкой концентрацией сульфатов т.е. отсутствием сульфатредукции," которая могла бы конкурировать с метаногенезом, и анаэробного окисления метана, связанного с сульфатредукцией. Таким образом, в отличие от морских и других богатым сульфатом экологических ниш, в Байкале метаногенез может происходить даже в верхних слоях донных осадков. Большинство архей было представлено различными некультивируемыми линиями кренархей. Пути их метаболизма в основном неизвестны, за исключением группы МС01, представители которой являются гетеротрофными анаэробами, которые утилизируют сложные органические субстраты (Тезке & Зогепэеп, 2008).

В глубинном слое осадка, непосредственно прилегающем к гидратам, большинство сообщества составляли бактерии, хотя доля архей была существенна. Бактерии филумов С1ого/1ех 1, 151 и СаШкепса были доминирующими группами в этом

13

сообществе. В морских осадках, содержащих газовые гидраты, больше половины последовательностей приходилось на JS1, тогда как представители филума Chloroflexi доминировали в осадках с высоким содержанием органических веществ в отсутствии гидратов (Inagaki et al., 2006).

Микробное сообщество гидрат-содержащих осадков Байкала отличается от сообществ в районах залегания гидратов в морских осадках. Как и в Байкале, в морских гидрат-содержащих осадках доминировали бактерии филумов JS1 и Chloroflexi (Inagaki et al., 2006). Археи в морских и байкальских сообществ сильно отличались. Так, в морских осадках археи составляли менее 0.01% прокариот в большинстве образцов, в которых были обнаружены гидраты метана (Inagaki et al., 2006) и были в основном представлены «неметаногенной» группой deep-sea archaeal group (DSAG), что оставляет открытым вопрос о микробном источнике метана

В целом, полученные данные о составе микробных сообществ согласуются с гипотезой о биогенном происхождении гидратов метана в Байкале. Изотопный состав газа из гидрат содержащих осадков района «Санкт-Петербурге, также указывает на микробиологическое происхождение метана (Egorov et al., 2010). Результаты молекулярного анализа состава микробных сообществ позволяют предложить следующую схему экологических взаимосвязей микроорганизмов, приводящую к образованию метана (Рис. 6). Первичная продукция органических веществ осуществляется в верхних слоях воды фотосинтезирующими организмами, -цианобактериями и водорослями. Отмершие фотосинтетики, а также зооплантктон, осаждаются на дно водоема В придонной воде одна часть органики окисляется аэробными гетеротрофными бактериями, а часть образует осадок, который в дальнейшем анаэробно сбраживается с образованием органических кислот, водорода и углекислого газа Эти процессы могут осуществляться различными группами бактерий и архей, обнаруженными в верхнем слое осадка, в том числе бета-протеобактериями, представителями Bacteroidetes, Caldiserica, археями групп MCG1, TMEG и «Байкальских» групп Baikal 1-8. Образовавшиеся в результате сбраживания органики ацетат и водород являются субстратами для роста метаногенных архей, представляющих порядки Methanomicrobiales и Methanosarcinales. Затем метан может либо подниматься вверх и потребляться в придонных слоях воды аэробными метанотрофными гамма-протеобакгериями, либо сохраняется в виде гидратов.

Гидраты являются одним из конечных продуктов переработки биомассы в Байкале, что позволяет классифицировать их как возобновляемый источник энергии. В отличие от обычных газовых месторождений, образование гидратов метана происходит

14

в настоящее время и является одним из механизмов как образования месторождений энергоносителей, так и ограничения поступления парниковых газов в атмосферу.

Рисунок 6. Схема трофических взаимосвязей между микроорганизмами различных групп и процессов образования гидратов метана в Байкале.

2. Микробное сообщество микроорганизмов битумных холмов в естественных выходах нефти на дне озера Байкал.

Район выходов нефти на дне Байкала у мыса Горевой Утес был исследован во время погружений глубоководных аппаратов «Мир» в ходе экспедиций 2008-2009 гг. В ходе обследования дна озера на глубине 800-900 метров были обнаружены битумные холмы, образовавшиеся в местах выхода нефти. Эти объекты плотно заселены глубоководными беспозвоночными животными, плотность которых на порядок превышала плотность поселения контрольных участков дна (Хлыстов и др., 2009). Вероятно, это сообщество не зависит от поступления органических веществ из поверхностных слоев воды, а основано на деятельности микроорганизмов, осуществляющих биодеградацию углеводородов. Эта часть работы была посвящена анализу разнообразия микробных сообществ двух битумных построек.

Объектами исследования были две битумные постройки, 8 и 3. Постройка 8

достигала высоты 10 м и имела диаметр около 50 м. На периферии постройки имелись

«факелы», свидетельствующие о выходе газа. Верхние 1-2 см вещества постройки

представлены твердым и хрупким материалом, более глубокие слои - темно-

коричневым пластическим веществом, имеющим свойства битума. Постройка 3 (Рис. 7)

15

имела конусовидную форму и меньшие размеры: ее высота составляла 1 м, диаметр -1.5 м. В отличие от постройки 8. она была представлена вязким материалом темно-коричневого цвета, на ее вершине имелась вертикально стоящая трубка — «капельница», из которой периодически высачивались капли нефти.

В 2008-2009 гг. в ходе экспедиций ЛИН СО РАН и Института океанологии им. П. Г1. Ширшова РАН с помощью глубоководного аппарата «Мир» были отобраны образцы битумных построек. Сотрудниками ЛИН СО РАН (Ломакина A.B., Лихошвай A.B., Горшков А.Г., Погодаева Т.В.. Земская Т.И.) определено содержание углерода в данных постройках, а также состав поровых вод. Содержание углерода в материале построек варьировало от 80 до 87%, водорода - от 12.3 до 13.3% и минерального вещества - до 1.1%. Органическое вещество построек идентифицировано как парафиновый нефтяной битум. Однако, состав двух построек существенно различался. По данным ЛИН СО РАН в материале постройки 3 н-алканы составляли около 77%, в постройке 8 их доля составляла лишь 15%, а на хроматограммах прис\тствует пик нафтено-ароматических соединений, образующихся в результате биодеградации нефти. Вероятно, в постройке 8 сохранились лишь длинноцепочечные н-алканы, более устойчивые к биодеградации.

Для битумной постройки 8 и прилегающих к ней донных осадков в ЛИН СО РАН был определен состав поровых вод. По химическому составу эти воды являются гидрокарбонатно-кальциевыми и характеризуются низкой минерализацией. Содержание кислорода в придонной воде в районе битумных построек составляет около 7 мг/л, что создает условия для аэробного окисления углеводородов построек.

Сотрудниками ЛИН СО РАН были выделены препараты метагеномной ДНК из данных битумных построек и предоставлены нам для проведения молекулярного анализа состава микробных сообществ.

Рисунок 7. Битумная постройка в районе мыса Горевой Утес. Фотография сделана с глубоководного аппарата «Мир» и предоставлена д.б.н. Т.И. Земской (ЛИН СО РАН). Белые объекты - плоские черви и амфиподы.

Бактерии микробных сообществ битумных построек

Для анализа состава микробных сообществ мы проводили пиросеквенирование фрагментов генов 16S рРНК, включающих вариабельные районы V3-V6, полученных в результате ПЦР с «универсальными» праймерами PRK.341F и PRK.806R. Пиросеквенирование полученного ПЦР фрагмента осуществляли на GS FLX (Roche).

В результате секвенирования фрагментов генов I6S рРНК для постройки 3 было определено 5370 последовательностей 16S рРНК бактерий и 4520 - архей. Для постройки 8 количество последовательностей 16S рРНК бактерий и архей составляло 2240 и 1405 соответственно.

Среди идентифицированных по последовательностям генов 16S рРНК бактерий микробного сообщества постройки 8 (рис. 8) абсолютное большинство составляют протеобактерии классов Betaproteobacteria (39.7% бактериальных последовательностей), Gammaproteobacteria (19.5%), Alphaproteobacteria (11.2%), Deltaproteobacterta (5.6%) и Epsilonproteobacteria (4.1%). Минорными компонентами сообщества являются Actinobacteria (5.8%), Acidobacteria (6.2%), Ccildiserica (1.8%), Bacteroidetes (1.7%), TM7 (1.2%) и Firmiertes (1.1%).

Бактерии

Архей

□ Other/unclassified HTM7

О Acidobacteria ■ Bacteroidetes

□ Actinobacteria M Epsilonproteobacteria El Deltaproteobacteria

□ Gammaproteobacteria 40oA

□ Betaproteobacteria Ш Alphaproteobacteria

20%

Рисунок 8. Состав микробных сообществ битумных построек, определенный в результате анализа последовательностей генов 165 рРНК.

■ TMEG

□ Methanobacteriales

□ Methanomicrobiales

□ Methanosarcinales

Среди бета-протеобактерий были обнаружены представители родов ВигккоШепа и ЯаШота, для которых показана способность к деградации алканов в аэробных условиях. Почти половина выявленных генов 168 рРНК бета-протеобактерий принадлежат некультивируемым представителям семейства Rhodocyclaceae. Близкие

последовательности 16S рРНК (98-99% идентичности) были обнаружены при анализе микробных сообществ почв, активного ила, подземных вод и осадков, загрязненных углеводородами Известно, что некоторые бета-протеобактерии, а именно, относящиеся к группе Azoarcus-Thauera (Rabus et al., 1999), могут осуществлять анаэробную деградацию ароматических соединений и алканов используя в качестве акцептора электронов нитрат, однако, они обнаружены не были.

Второй по численности группой бактерий являются гамма-протеобактерии, абсолютное большинство которых относится к роду Pseudomonas (17%). Многие бактерии этого рода способны осуществлять аэробную деградацию углеводородов. Например, Pseudomonas fluorescens CHAO может использовать даже длинноцепочечные (С|8—Сзв) н-алканы. Среди альфа-протеобактерий обнаружены в основном аэробные гетеротрофы, некоторые из которых, а именно представители родов Sphingomonas (1.1%). Sphingobium (0.6%), Caulobacter (2.8%), способные деградировать ароматические углеводороды. Еще одна группа, для которой показана способность деградировать н-алканы и некоторые ароматические соединения, это умеренно термофильные аэробные фирмикуты рода Geobacillus (около 1% последовательностей 16S рРНК), часто выделяемые из нефтяных резервуаров (Nazina et al., 2001).

Дельта-протеобактерии составляли около 5.6% бактерий постройки 8. Сульфатредуцирутощие бактерии этого класса широко распространены в нефтяных резервуарах, среди них описаны и штаммы, способные осуществлять анаэробную деградацию ароматических соединений и н-алканов. Однако, среди дельта-протеобактерий не были найдены известные сульфатредукторы; большинство относились к родам Syntrophus (4.6%), Syntrophobacter (0.5%) и Geobacter (0.5%). Представители первых двух родов являются анаэробами, характеризующимися синтрофным метаболизмом, при котором деградация органических соединений (жирные кислоты, сахара, углеводороды и др.) оказывается термодинамически выгодной, только если концентрация образующегося при брожении молекулярного водорода поддерживается на очень низком уровне в результате его потребления микроорганизмом-партнером, например, метаногенной археей. В частности, описана конверсия гексадекана в метан консорциумом, включающим бактерии Syntrophus и метаногенные археи (Zengler et al., 1999).

Микробное сообщество постройки 3, через которую высачивается нефть, включает те же основные группы бактерий, как и в постройке 8, но их соотношение и видовой состав существенно отличались. Как и в постройке 8, бета-протеобактерии являются наиболее многочисленной группой (30.5% последовательностей 16S рРНК

18

бактерий), причем почти половину также составляют представители «некультивируемой» линии, присутствующие и в постройке 8. Альфа-протеобактерии составляли значительную долю бактериального сообщества постройки 3 (26.9% всех бактерий), причем около половины альфа-протеобактерий относилась к нескольким «некультивируемым» линиям, отсутствовавшим в постройке 8. В отличие от постройки 8, в постройке 3 обнаружено значительно меньше гамма-протеобактерий (6.3%), причем бактерии рода Pseudomonas не были выявлены. Actinobacteria составляли около 8% сообщества и были представлены в основном родом Nocardia, способным аэробно окислять алканы. Наиболее заметным отличием сообществ двух битумных построек является большая доля (13.2%) выявленных по генам 16S рРНК бактерий филума Bacteroidetes в сообществе постройки 3. Почти все они принадлежали микроорганизмам нескольких некультивируемых линий. Близкие к ним последовательности 16S рРНК были выделены при изучении микробных сообществ почв и озерных осадков.

Археи микробных сообществ битумных построек В библиотеках генов 16S рРНК обоих сообществ были обнаружены последовательности архей, принадлежащих метаногенам порядков Methanosarcinales, Methanimicrobiales и Methanobacteriales (Рис. 8). Обнаруженные Methanosarcinales были представлены одной группой, близкой к ацетокласшческим метаногенам рода Methanosaeta (98-99% идентичности по 16S РНК), использующим ацетат для образования метана. Две другие группы принадлежали метаногенам, использующим водород, - Methanimicrobiales и Methanobacteriales. Помимо метаногенов, в сообществе постройки 3 в небольших количествах были обнаружены эуриархеи линии TMEG, которые были найдены и в гидрат-содержащих осадках.

Для анализа путей биотрансформации метана мы провели филогенетический анализ альфа субъединицы метил-коэнзим М редуюазы (МсгА). В составе библиотеки клонов фрагментов генов МсгА, полученной для битумной постройки 3, выявлены три группы последовательностей (Рис. 9). Первая принадлежала представителям порядка Methanomicrobiales, вторая - Methanobacteriales, и третья - Methanosaetaceae. Таким образом, филогенетический анализ последовательностей как 16S рРНК, так и МсгА подтверждает принадлежность обнаруженных архей именно к метаногенным, а не метан-окисляющим группам.

Methanosaranacaa*

100 , RS-MCR15 (AAK166S1) ' BS-МСЯОв (AAK16842) RS-MCR4fi (CAN90061J i AOT43_16

RS-MCR04 (AAK16840) w>n-107 (A8X7S071) b«E-ME1 (ЛЛК16916) •MCR01 (AAK16837) RS-ME26 (ЛАХ16892) j

ШОшкхяварЫиЛсоЬрР 0033S5571) j

[ Ric<

ANME-2

(mcrA groups c-d)

Metfranosaart OmrnopM* (Y*,_M3000) UetfwKUMle «юс* (АЛК16833) RS44CA24 (ААК1вв5в) RS-MCR42 (ЛАК18875)

Methanosaetaceaa

«WfteoosprSum Гипумм (AAK16835) j

CIom* Melhanomkxobialas

ШОтософияяЛлп рл/wm (AAP20899) МмгммярАмпМ patotrn (ABY2eM6) MsffianOCuCte* ЛвяпорЛй* (AAK16S34)

ШтмхзпктЫт лмЫ» (AAL29293) ЫЛГмлодоигп огрморП*«» (BAF745W) J

-ММГмлососал *wM*ff CAAA72596) -1 _

MeffMnoeaMbcoccus jarmttctoS (NP J247S4Q) j ММПв/ЮСОССв»«

I ANME-1 3 (moA group« e-b)

(ААК168Э6)

Maffunoewmotecferiun ttXHmautotrceHc (AAA 73445)

unidentfted ЬШЬлпоЬлсШШе* (ВААЮ900) (YP_001273588)

Methanobacteriales

- Metfunopyrut teKton (AA&Q20031

Рисунок 9. Филогенетическое дерево аминокислотных последовательностей фрагментов гена МсгА полученных в данной работе (Clone), и представителей известных метано генных и ANME линий архей.

Идентификация генов алкан-гидроксилаз

Алкан-гидроксилазы являются ключевыми ферментами в процессах аэробного окисления углеводородов. Поэтому мы провели эксперимент по детекции alkB генов с помощью ПЦР, чтобы затем идентифицировать соответствующие им микроорганизмы. В отличие от тсгА, гены alkB более разнообразны, что делает практически невозможным создание «универсальных» праймеров для их детекции. Однако, обнаружение последовательности, близкой к alkB известного микроорганизма, будет свидетельствовать о возможности деградации н-алканов присутствующими в сообществе бактериями. Обнаруженные нами последовательности alkB имели

гомологию с генами alkB актинобактерий рода Nocardia и бета-протеобактерий рода Burkholderia, что может свидетельствовать об участии этих групп в аэробной деградации алканов в битумных постройках. Остальные последовательности были гомологичны генам alkB некультивируемых бактерий или не имели близких гомологов в базах данных, представляя «новые» группы алкан-деградирующих микроорганизмов.

Механизмы биодеградации углеводородов битумных построек

Материал битумных построек служит источником углерода и энергии для обитающих в них микроорганизмов, однако, лимитирующим фактором в использовании углеводородов является доступность акцепторов электронов, в качестве которых могут использоваться кислород, нитрат, сульфат, оксиды железа и марганца. В анаэробных условиях деградация углеводородов может также осуществляться синтрофными ассоциациями с образованием метана.

По-видимому, отобранные для анализа образцы построек наряду с анаэробной зоной содержали и участки, контактирующие с содержащей кислород озерной водой (вблизи трещин и т.п.). В обоих постройках выявлены различные группы бактерий, для которых показана способность к аэробной деградации ароматических углеводородов и н-алканов. Состав этих групп в библиотеках построек существенно отличался, что вероятно связано с различиями состава их материала. Так, в постройке 8 преобладали бактерий родов Pseudomonas и Burkholderia, которые практически отсутствовали в постройке 3, в которой, напротив, были обнаружены актинобакгерии рода Nocardia. Возможно, в процессе аэробной деградации углеводородов участвуют также некультивируемые представители альфа-, бета-протеобактерий и Bacteroidetes., на которые приходится около 40% и 16% последовательностей 16S рРНК бактерий в библиотеках постройки 3 и постройки 8 соответственно. В пользу этого свидетельствует обнаружение близких этим группам последовательностей 16S рРНК некультивируемых бактерий в различных загрязненных углеводородами экосистемах, а также обнаружение генов alkB, не принадлежащих известным группам бактерий.

Лишь небольшая часть идентифицированных бактерий относится к группам, для которых показана способность к анаэробной деградации углеводородов, что, видимо, является следствием низкой доступности альтернативных кислороду акцепторов электронов - нитрата и сульфата. Известные сульфатредуцирующие бактерии и бета-протеобактерии группы Azoarcus-Thauera (Rabus et al., 1999), способные деградировать углеводороды, обнаружены не были. В небольших количествах были обнаружены бактерии, способные осуществлять анаэробную деградацию ароматических

21

углеводородов, сопряженную с восстановлением оксида железа Fe(III) — бета протеобактерии Georgfuchsia и дельта-протеобактерии Geobacter. В отсутствие альтернативных акцепторов электронов в анаэробной зоне битумных построек процессы биодеградации углеводородов могут осуществляться синтрофным сообществом, включающим дельта-протеобактерии рода Syntrophus и метаногенные археи. Предполагается, что синтрофия может являться основным механизмом биодеградации углеводородов с образованием метана в подземных нефтяных резервуарах (Jones et al., 2008). Наши данные показывают, что аналогичные процессы могут протекать и в битумных постройках на дне озера Байкал.

ВЫВОДЫ

1) В придонной воде озера Байкал в районе залегания гидратов метана преобладают гамма-протеобактерии, из которых большинство составляют метанотрофные бактерии семейства Methylococcaceae. Археи составляют менее 1% прокариот.

2) В поверхностном слое осадка (0-1 см) в районе залегания гидратов метана среди бактерий преобладают гамма-протеобактерии, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Caldiserica и бета-протеобакгерии. Археи в основном представлены метаногенами, относящимися к порядкам Methanomicrobiales и Methanosarcinales, а также группами, не имеющими культивируемых представителей.

3) В глубинном слое осадков (85-95 см) в районе залегания гидратов метана преобладающими группами бактерий являются Chloroßexi, JS1 и Caldiserica. Более 90% архей представляют глубокие филогенетические ветви, не имеющие культивируемых представителей, часть из найдены только в Байкале.

4) В микробных сообществах битумных построек в районах природных выходов нефти на дне Байкала обнаружены группы протеобактерий и актинобактерий, способных осуществлять аэробное окисление алканов.

5) В анаэробной зоне битумных построек процессы биодеградации углеводородов могут осуществляться синтрофным сообществом, включающем дельта-протеобактерии и метаногенные археи. Сульфатредукторы и бета-протеобактерии группы Azoarcus-Thauera, способные анаэробно деградировать углеводороды, в микробных сообществах битумных построек не обнаружены.

6) Анализ последовательностей 16S рРНК и гена А-субъединицы метил-коэнзим М редуктазы показал, что обнаруженные в гидрат-содержащих осадках и битумных

постройках археи относятся к группам, представители которых осуществляют метаногенез, а не анаэробное окисление метана.

7) Данные о структуре исследованных микробных сообществ подтверждают гипотезу о биогенном происхождении гидратов метана в озере Байкал.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК

1. Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Shubenkova O.V., Pogodaeva T.V., Zemskaya T.I., Ravin N.V., Skryabin K.G. Microbial community structure in methane hydrate-bearing sediments of freshwater Lake Baikal. // FEMS Microbiol Ecol. 2012. V.79. P. 348-358.

2. Kadnikov V.V., Lomakina A.V., Likhoshvai A.V., Gorshkov A.G., Pogodaeva T.V., Beletsky A.V., Mardanov A.V., Zemskaya T.I., Ravin N.V. Composition of the microbial communities of bituminous constructions at natural oil seeps at the bottom of lake Baikal. // Microbiology. 2013. V. 82. No.3. P. 373-382.

Тезисы

3. Mardanov A.V., Kadnikov V.V., Shubenkova O.V., Zemskaya T.I., Ravin N.V. Molecular analysis of microbial communities associated with gas hydrates of Lake Baikal. // Abstracts of The 10л International conference on gas in marine sediments. Listvyanka (Russia). 2010. P. 56-57.

4. Кадников B.B., Марданов A.B. Анализ состава микробного сообщества, ассоциированного с газовыми гидратами озера Байкал методами высокопроизводительной геномики. // Тезизы 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино. 2010. Т.2. С. 229.

5. Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Shubenkova O.V., Zemskaya T.I., Ravin N.V. Analysis of microbial community structure suggests the biological origin of gas hydrates in the sediments of freshwater Lake Baikal. // Abstracts of the 11th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology BAGECO-11. Corfu (Greece). 2011. P. 123.

6. Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Shubenkova O.V., Pogodaeva T.V., Zemskaya T.I., Ravin N.V. Microbial communities of methane hydrate-bearing sediments of freshwater Lake Baikal. // Abstracts of the 8th International Symposium of Subsurface Microbiology. Garmisch-Partenkirchen (Germany). 2011. P. 46.

7. Кадников В.В., Марданов А.В. Экология микроорганизмов мест залегания углеводородов в озере Байкал. // Тезизы 15-й международной Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино. 2011. С. 345-346.

8. Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Zemskaya T.I., Ravin N.V. (2012) Molecular analysis of microbial communities of hydrocarbon-bearing sediments of freshwater Lake Baikal. Abstracts of the 14th International Symposium on Microbial Ecology - ISME14, Copenhagen (Denmark). 2012. P. 494-495.

9. Кадников B.B., Марданов A.B., Равин H.B. Пиросеквенирование фрагментов генов 16S рибосомной РНК как метод высокочувствительной детекции микроорганизмов-индикаторов загрязнений окружающей среды. // Тезисы международной конференции "Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред". Москва. 2013. С. 86.

Работа была поддержана грантами РФФИ 12-04-31951 и Минобрнауки 14.Z50.31.0011.

Подписано в печать: 08.08.2014

Заказ № 10150 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \vww.autoreferalru