Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Строение печени, селезенки и лимфатических узлов при введении специфического бактериофага для коррекции пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Строение печени, селезенки и лимфатических узлов при введении специфического бактериофага для коррекции пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa"

На правах рукописи

Козлова Юлия Николаевна

СТРОЕНИЕ ПЕЧЕНИ, СЕЛЕЗЕНКИ И ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ ПРИ ВВЕДЕНИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО БАКТЕРИОФАГА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗВАННОЙ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

А В Т О Р Е Ф Е PAT диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2014 005550469

005550469

Работа выполнена в ФГБУН Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и в ФГБУ Научно-исследовательском институте региональной патологии и патомор-фологии СО РАМН.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Манбородин Игорь Валентинович

доктор биологических наук,

доцент Постникова Ольга Алексеевна

Официальные оппоненты:

Бгатова Наталья Петровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией ультраструктурных исследований ФГБУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО

Архипов Сергей Алексеевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией цитологии и клеточных структур ФГЪУ Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН.

Ведущая организация:

ФГБУ Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН.

Защита состоится: « » 2014 г. в час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН http://pathomorphology.soramn.ru/

Автореферат разослан «

2014 г.

РАМН.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На протяжении многих лет антибиотики являются стандартным методом лечения бактериальных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, такими как Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. и другие. Появление все возрастающего количества резистентных к антибиотикам патогенных микроорганизмов представляет существенную проблему как с клинических, так и с эпидемиологических позиций (Трапезов Е. В. и др., 1990; Кушнарева Н. В., 2000; Shasha S. М. et al., 2004; Borysowski J. et al., 2006).

Одним из перспективных средств воздействия для успешной профилактики гнойно-септических инфекций, вызванных патогенными бактериями, являются бактериофаги (Навашин С. М., 1997; Clarke Т., 2003; Abedon S. Т., 2012).

Терапевтическая эффективность бактериофагов к клеткам-хозяевам была показана на моделях in vitro и in vivo (Chibani-Chennoufi S. et al., 2004; Dixon В., 2004; Oliveira A. et al., 2009; Carmody L. A. et al., 2010). Исследования, проведенные во Франции, Польше, России, продемонстрировали успешное применение бактериофагов в 81,5 - 95,6% случаев при гнойно-септических заболеваниях, вызванных бактериальными возбудителями. Проведение фаготерапии пациентов с поддиафрагмальным абсцессом тощей кишки, инфекцией после имплантации протеза бедра, артритом коленного сустава, остеомиелитом большеберцовой кости, при несрастании бедренной кости также дало положительные результаты (Lang G. et al., 1979; Slopek S. et al., 1983-1985,1987; KochetkovaV.A. etal., 1989; Kwarcinski W. et al., 1994; Weber-Dabrowska B. et al., 2000; Sulakvelidze A., Morris JG. Jr., 2001; Soothill J. et al., 2004; Abedon S. T. et al., 2011).

В последнее время ведутся исследования иммуномодулирующих свойств как очищенных фагов, так и коммерческих препаратов, которые кроме фаговых частиц содержат лизаты бактерий и, часто, компоненты культуральной среды (Филиппова Т. О., 2010). Не исключено, что и сам бактериофаг, как организм, содержащий белковый капсид и чужеродную ДНК, может обладать определенной антигенностью и вызвать иммунные реакция на фаготерапию.

Известно, что фаги при пероралыгом введении могут проникать через слизистую желудочно-кишечного тракта и длительное время персистиро-вать в организме (Smith H.W., Huggins М. В., 1982; Reynaud А. et а!., 1992). При этом они проникают везде, от лимфатических узлов до селезенки, и могут оказывать прямое влияние на иммунокомпетентные клетки (Weber-Dabrowska В. et al.,1987).

Степень разработанности темы исследования. Всесторонние исследования по изучению бактериофагов позволяют использовать их для решения многих задач в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии,

биотехнологии, ветеринарии и медицине: косметологии, иммунологии, урологии, гинекологии, офтальмологии, эндопротезировании, гнойной хирургии, борьбе с нозокомиальными инфекциями и др., то есть фаготерапия является одним из перспективных направлений для практического здравоохранения (Щелкунов С.Н., 2004; Акимкин В. Г. и др., 2010; Красильников И. В. и др., 2010,2011). Однако, вместе с этим, в литературе нет результатов морфологических исследований структуры органов иммунитета (в частности, лимфоидных органов, таких как селезенка и лимфатические узлы) и печени в процессе использования бактериофагов in vivo.

Цель исследования. Определить результаты применения специфического бактериофага при пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка), у крыс, и основные реакции печени, селезенки и лимфатических узлов после введения фага здоровым животным.

Задачи исследования:

1. Методами световой микроскопии исследовать состояние печени крыс после внутривенного и перорального введения бактериофага Р57.

2. Изучить основные изменения структурной организации селезенки после применения бактериофага Р57.

3. Выявить отличия реакций брыжеечных лимфатических узлов при различных способах доставки бактериофага Р57 в организм.

4. Оценить результаты использования бактериофага Р57 на фоне экспериментальной пневмонии, вызванной синегнойной палочкой.

Научная повизпа. Впервые определена эффективность использования бактериофага Р57 на фоне экспериментальной пневмонии, вызванной синегнойной палочкой. Показано, что пероральное применение специфического бактериофага для лечения острой пневмонии и сепсиса, вызванных Pseudomonas aeruginosa, в эксперименте на крысах приводит к купированию признаков дыхательной недостаточности, общей интоксикации, явлений пневмонии и сепсиса, увеличению выживаемости животных.

Впервые продемонстрировано, что введение фаголизата бактериофага 57 непосредственно в пищеварительный тракт крыс сопровождается обширными некрозами паренхимы, выраженной диффузной и очаговой лейкоцитарной инфильтрацией печени, что связано с прямым поступлением в данный орган большой концентрации частиц бактериофага в сочетании с токсинами и антигенами синегнойной палочки. При внутривенном введении фаголизата изменения печени, по сравнению с интакгным контролем, практически отсутствуют.

Впервые показано, что применение фага не вызывает значительных изменений в структуре селезенки, пероральный способ введения фаголизата активирует меньше реакций со стороны данного органа по сравнению с внутривенными инъекциями.

Впервые изучены реакции лимфатических узлов после перорального и внутривенного введения бактериофага. Обнаружено, что расширение

герминативных це!ггров лимфоидных узелков брыжеечных лимфатических узлов в сочетании с высоким содержанием деструктивно измененных клеток, наличие эозинофилов, а также большое содержание макрофагов в синусах мозгового вещества имеют место при введении фаголизата непосредственно в пищеварительный тракт, что обусловлено прямым поступлением в данные органы частиц фага в сочетании с токсинами и антигенами разрушенных бактерий синегнойной палочки. Внутривенное введение фаголизата способствует практически полной сохранности структуры указанных лимфатических узлов.

Теоретическое и практическое значепие работы. Получены новые знания об особенностях изменений печени, селезенки и лимфатических узлов при различных способах доставки бактериофага в организм. В связи с тем, что пероральное применение специфического бактериофага для лечения острой пневмонии и сепсиса, вызванных Pseudomonas aeruginosa, в эксперименте на крысах приводит к купированию признаков дыхательной недостаточности, общей интоксикации, явлений пневмонии и сепсиса, увеличению выживаемости животных, показано применение этого фага для лечения всех инфекционных процессов, главным этиологическим фактором в которых является синегнойная палочка.

Так как в легких крыс после фаготерапии пневмонии на фоне введения синегнойной палочки были обнаружены признаки абсцедирования, в печени -дистрофические изменения гепатоцитов, а в селезенке - гипертрофия и гиперплазия лимфоидных узелков, требуется разработка и применение специфических мер профилактики и лечения указанных осложнений.

Для лечения каких-либо инфекций посредством применения бактериофага более целесообразно его внутривенное введение. Пероральное использование позволяет создать высокую концентрацию в органах желудочно-кишечного тракта, но, вместе с этим, в печени происходят выраженные дистрофические и даже некротические изменения. Перед применением бактериофага in vivo требуется тщательная очистка препарата не только от остатков микроорганизмов - хозяев фага, но и от компонентов питательной среды для культивирования этих бактерий.

Методология и методы исследования. В работе использованы современные методы сбора и обработки исходной информации. Диссертация основана на результатах применения специфического бактериофага для лечения пневмонии, вызванной синегнойной палочкой, и сравнительного морфологического исследования изменений печени, селезенки и брыжеечных лимфатических узлов 108 крыс-самцов инбредной линии Wag.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Пероральное применение специфического бактериофага для лечения острой пневмонии и сепсиса, вызванных Pseudomonas aeruginosa, в эксперименте на крысах приводит к купированию признаков дыхательной недостаточности, общей интоксикации, явлений пневмонии и сепсиса, увеличению выживаемости животных.

2. Введение фаголизата бактериофага 57 Pseudomonas aeruginosa непосредственно в пищеварительный тракт крыс сопровождается обширными некрозами паренхимы, выраженной диффузной и очаговой лейкоцитарной инфильтрации печени. При внутривенном введении фаголизата изменения печени, по сравнению с интактным контролем, практически отсутствуют,

3. Применение фага не вызывает значительных изменений в структуре селезенки.

4. Пероральное введение фаголизата сопровождается расширением герминативных центров лимфоидных узелков брыжеечных лимфатических узлов, высоким содержанием деструктивно измененных клеток, наличием эозинофилов, большим количеством макрофагов в синусах мозгового вещества. Внутривенное введение фаголизата способствует практически полной сохранности структуры указанных лимфатических узлов.

Степень достоверности и апробация результатов диссертации. Все использованные методические приемы и способы статистической обработки соответствуют поставленным цели и задачам и позволяют получить достоверные и доступные анализу результаты. Диссертация выполнена на достаточном экспериментальном материале с использованием сертифицированного оборудования, современных высокоинформативных методов исследования и анализа результатов. Сформулированные научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.

Основные положения диссертации доложены на научной конференции «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, 2009), ежегодных международных научных конференциях «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2010, 2013), X региональной научно-практической конференции урологов Западной Сибири «Актуальные вопросы диагностики и лечения урологических заболеваний» (Барнаул, 2011), научно-практической конференции с международным участием «Технологии единого лапароскопического доступа в абдоминальной» (Москва, 2011), IV Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2011» (Санкт-Петербург, 2011), 4 ежегодной Русско-Корейской конференции «Current issues of natural products chemistry and biotechnology» (Новосибирск, 2012), межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти профессора А.Н. Горячева «Риски в современной травматологии и ортопедии» (Омск, 2013) и на заседании научного персонала лабораторий стволовой клетки, восстановительной медицины и персонализованной медицины Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, 2013).

Впедрспис результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в научно-исследовательскую работу «Центра новых медицинских технологий» Института химической био-

логии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск, Россия).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 2 - в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований, и 2 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав собственных результатов с их обсуждением, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников и 6 приложений. Работа изложена на 185 страницах компьютерного текста, содержит 10 таблиц, иллюстрирована 50 многокомпонентными комбинированными рисунками. Список литературы включает 273 источника (177 отечественных и 96 иностранных). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа основана на результатах морфологического исследования печени, селезенки и брыжеечных лимфатических узлов после перорального и внутривенного введения раствора фаголизата крысам-самцам инбредной линии Wag возрастом 6 месяцев и весом 290±27 г на начало наблюдения. В эксперименте всего было использовано 108 крыс. В качестве контроля использовали питательную среду Luria-Bertani (LB), на которой были выращены бактерии - хозяева фага, и лизат этих бактерий. Также была предпринята попытка фаготерапии экспериментальной пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa.

Все манипуляции с животными осуществляли под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

При проведении данного эксперимента, основывались на рекомендациях, описанных в Постановление Госкомсанэпиднадзора РФ от 3 июня 1994 г. № 5 «О введении системы государственной регистрации и сертификации медицинских иммунобиологических препаратов» для определения хронической токсичности с некоторыми модификациями.

Определение хронической токсичности предполагает ежедневное внутривенное и пероральное введение фага в течение 20 дней в дозе, максимально эквивалентной разовой дозе для человека (при пересчете на 1 кг массы). Препарат вводили не менее чем 6 животным один раз в сутки. Если препарат предполагается применять человеку более 3-х раз, то количество однократных ежедневных инъекций должно быть не менее 20.

При внутривенном введении животным инсулиновым шприцом вводили 0,3 мл раствора в хвостовую вену, при пероральном введении использовали автоматическую пипетку на 1 мл, животным выпаивали по 0,3 мл раствора. Все применяемые растворы были стерильными. Препараты

вводили один раз в день в утренние часы. Общее количество введения препаратов составило 20 раз, после отмены препарата за животными наблюдали еще 7 дней. Животных выводили из эксперимента на седьмые сутки после отмены препарата передозировкой общего ингаляционного эфирного наркоза.

Для моделирования пневмонии после обработки кожи спиртом в правую плевральную полость (в межреберный промежуток) крысам инъекци-онно было введено 500 мкл культуры Pseudomonas aeruginosa (штамм 666 № ЭМТК) с титром 109 КОЕ/мл. Далее крыс содержали при 4°С в течение 3 часов и переводили на обычный режим.

Для лечения инфицированным Pseudomonas aeruginosa крысам в указанной дозе с последующим охлаждением через 1 сутки перорально было введено 500 мкл бактериофага ph 57 с титром 8x107 БОЕ/мл, через трое суток повторно ввели такое же количество бактериофага.

Спустя 1 сутки нелеченных крыс (согласно предварительным исследованиям, до истечения 3 суток доживало не более 5% животных) и через 8 суток леченных и интактных крыс выводили из эксперимента передозировкой эфирного наркоза.

Печень, селезенку, брыжеечные лимфатические узлы и легкие фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (pH 7,4) не менее 24 часов, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин, из каждого органа готовили не менее 3 срезов. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Кроме этого, для изучения сохранности структуры лимфатических узлов готовили криостатные срезы толщиной 4-5 мкм, которые фиксировали в метаноле 10 минут при -20°С и далее окрашивали анти-С038 антителами непрямым иммунопероксидазным методом. Использовали набор реагентов и стандартный протокол окарски «Dako reagents kit» (Dako, Дания). Препараты докрашивали гемалауном Майера и после дегидратации заключали в Entellan.

Для исключения жировой дистрофии печени ее фиксированные формалином фрагменты обезвоживали и заключали в полиэтиленгликоль-1500. Срезы толщиной до 10 мкм окрашивали Суданом III, ядра клеток докрашивали гематоксилином.

Срезы изучали на световом микроскопе Axioimager Ml (Zeiss, Германия) при увеличении до 1200 раз.

Для исследования структурной организации лимфатических узлов и селезенки проводили измерения изображений на экране компьютера, полученных при помощи цифровой видеокамеры микроскопа, с использованием программного обеспечения морфологического модуля Axioivision (Zeiss, Германия). С каждого среза проводили 3-5 измерений в связи с рекомендациями, что для рандомизированного исследования достаточно 3 срезов (Head J.R., Seeling L.L., 1984).

В процессе морфометрических исследований на срезах лимфатических узлов и селезенки определяли площадь лимфоидных фолликулов без центров и с центрами размножения, а также отдельно герминативных центров и мантийной зоны этих узелков.

Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической программе MS Excel 7.0 (Microsoft, USA), определяли среднее арифметическое и ошибку среднего арифметического (стандартное отклонение). Достоверность различий сравниваемых средних величин определяли на основании критерия Стьюдента для заданного порога (р) вероятности безошибочных прогнозов (Плохинский Н.А., 1970). Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем доверительной вероятности 95% и выше. Если р<0,05, то это означало, что ряды совпадают на 95% на уровне доверительной вероятности. При расчетах учитывали, что распределение исследуемых признаков было близким к нормальному.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменения строения печени после введения бактериофага 57

В группах при внутривенном и перорапъном применении питательной среды состояние ткани печени на микроскопическом уровне было лучше, чем в интактном контроле, что можно объяснить благоприятным воздействием на пищеварительный тракт и весь организм животных питательных веществ, входящих в состав среды. Признаков жировой дистрофии ни у одного животного найдено не было.

В группе при внутривенном введении фаголизата, кроме лимфо-цитарной инфильтрации в синусоидах, часто встречается увеличенное количество ядер эндотелиальных и купферовских клеток, что может свидетельствовать о поступлении антигена.

В группе животных при внутривенной инъекции клеточного лиза-та произошли более выраженные изменения, чем в группе интактного контроля. Чаще встречалось полнокровие, а также были обнаружены периваскулярные лимфоцитарные инфильтраты в виде двух- или трехрядных муфт вокруг периферических сосудов в ткани печени, которые свидетельствуют о длительном, хроническом антигенном воздействии, способствующем нарушению проницаемости сосудов и даже развитию аутоиммунных процессов у данных особей.

Изменения печени при пероральном применении фаголизата. На фоне перорального применения фаголизата, помимо лимфоцитарной инфильтрации, в синусоидах у 6 животных из 12 (50%) наблюдали увеличение числа купферовских и эндотелиальных клеток в паренхиме органа. Иногда в ткани печени присутствовали мелкие лейкоцитарные инфильтраты с преобладанием в цитограмме лимфоцитов и макрофагов. На больших

участках печени отмечена потеря балочной структуры с гомогенизацией паренхимы. Часто (у 4 животных, 33,3% от всей численности в группе) встречаются очаги некрозов с распадом и пропитыванием тканей эритроцитами и фибрином. У всех крыс были признаки венозного полнокровия.

Не исключено, что сам по себе бактериофаг при пероральном применении, в отличие от внутривенного, за счет того, что достигает печени в значительно большей концентрации, оказывает определенное антигенное воздействие на нее. Это приводит как к полнокровию органа, так и к миграции в печень предшественников макрофагов и дифференцировке их в клетки Купфера.

В таких случаях, по-видимому, нельзя исключить, что большая часть частиц бактериофага при проведении фаготерапии через пищеварительную систему инактивируется и элиминируется из организма посредством печени. То есть фаготерапия инфекционных процессов не в системе желудочно-кишечного тракта с пероральным использованием бактериофага окажется значительно менее эффективной по сравнению с внутривенным применением.

Кроме вирионов бактериофага фаголизат содержит продукты разрушения хозяина фага — синегнойной палочки. Этот микроорганизм характеризуется большим количеством эндо- и экзотоксинов (Алешукина А.В., 2003; Павлова О.Н., 2004; Sio С. F. et al„ 2006, Мирошников К.А. и др., 2006; Hong K.-W., 2012). При разрушении бактерий все токсины вместе с ее другими белками, углеводами и нуклеиновыми кислотами, несомненно, обладающими антигенными свойствами, оказываются в растворе (лизате).

При инфекции фагом бактериальных клеток выключается синтез большей части хозяйских белков, в том числе некоторых токсинов и информационной РНК, и начинает синтезироваться целый ряд ферментов, необходимых для синтеза фаговой ДНК (Jayaraman R., Goldberg Е., 1969; Ильяшенко Б.Н., 1975; Мекшенков М.И., Серегина Т.М., 1977; Феннер Ф. и др., 1977; Назарова А.Ф.,1980; Алешукина А.В., 2003).

По-видимому, не все токсины и антигены разрушаются при наработке бактериофага и лизисе бактерий после этого. Попавшие в пищеварительный тракт токсины и антигены Pseudomonas aeruginosa в большей (относительно внутривенного пути введения) концентрации попадают в печень, где служат наиболее вероятной и главной причиной некроза как отдельных гепатоцитов, так и целых участков печеночной паренхимы.

Влияние продуктов бактериального лизиса также может служить одной из основных причин макрофагальной инфильтрации печени (Michalopoulos G. К., DeFrances М.С., 1997; LeCouter J. et. al., 2003; FaustoN. et. al„ 2006; VanBuren G., 2008; Zaret K. S., Grompe M., 2008) и полнокровия органа (блокада кровотока при воспалении для предотвращения генерализации инфекции) (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990; Воспаление: ненаркотические анальгетики, 1997).

Изменения печенн при пероральном введении лизата Pseudomonas aeruginosa. В группе животных после перорального введения клеточного лизата бактерий, являющихся хозяином бактериофага 57, также наблюдали лимфоцитарную инфильтрацию, в ряде случаев выраженную. У 4 особей (33,3%) в печеночной паренхиме и возе периферических сосудов присутствовали лейкоцитарные (лимфогистиоцитарные или с преобладанием макрофагов) инфильтраты. Венозное полнокровие от умеренного до средней выраженности было отмечено у 50% крыс. Крупно-вакуольная дистрофия клеток паренхимы печени была обнаружена у 2 животных (16,7%) в группе.

Наиболее вероятно, что дистрофические изменения клеток печени, нарушения микроциркуляции (полнокровие), а также диффузная и очаговая лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация связаны с наличием в лизате токсинов и антигенов синегнойной палочки. Эти вещества при пропадании в желудочно-кишечный тракт в большой концентрации поступают в печень, где и происходит их обезвреживание.

В этой группе крыс, по сравнению с введением фаголизата (этот же лизат микроорганизмов вместе с частицами бактериофага), изменения выражены в меньшей степени, а именно - отсутствуют некротические изменения значительных участков печеночной паренхимы.

Можно сделать предположение, что описанные в предыдущем разделе изменения печени связаны или с прямым повреждающим воздействием бактериофага 57 на этот орган, или таким влиянием обладают какие-то структуры вириона (капсида или ДНК) в сочетании с веществами из клеточного лизата. Не исключено, что в данном случае может иметь место не простое суммирование эффекта, а даже его потенцирование.

Селезенка на фоне применения бактериофага 57

Селезенка при внутривенном введении питательной среды. В

селезенке группы животных после внутривенного введения питательной среды Luria-Bertani (LB) присутствуют разнонаправленные изменения белой пульпы: отечность, увеличенное или уменьшенное количество фолликулов. В самих фолликулах большое количество светлых центров с высокой митотической активностью и повышенным содержанием макрофагов и клеток с признаками деструктивных изменений.

Средняя площадь фолликулов составляет 368,69±259,86 мкм2. То есть, хотя размер фолликулов и больше, чем у интактных животных, такая гипертрофия не является статистически достоверной как из-за значительного разброса значений вариационного ряда в интактном контроле, так и вследствие гипертрофии узелков только у отдельных крыс данной группы.

В фолликулах селезенки одного животного много эритроцитов, а также имеются участки некрозов с кровоизлияниями и инфильтрацией

макрофагами. У 8 из 12 (66,7%) животных в группе красная пульпа отечна. Полнокровие паренхимы органа наблюдали у 2 (16,7%) крыс.

Наиболее вероятно, что такие изменения селезенки связаны с какой-то антигенной стимуляцией, которая вызывает гипертрофию лимфоидных фолликулов, стимуляцию митотической активности их клеток, отек и полнокровие красной пульпы. При сильном воздействии полнокровие может сопровождаться кровоизлияниями с пропитыванием тканей эритроцитами. Такие геморрагии затем приводят к некрозам паренхимы на этих участках и замещению соединительной тканью, склерозу.

Антигенная стимуляция иммунокомпетентных клеток селезенки активирует их пролиферацию и дифференцировку. Вследствие этого в лимфоидных фолликулах возрастает число фигур митозов. В процессе клеточного деления образуются клетки с различными дефектами, в таких клетках сразу же включаются процессы апоптоза, и такие клеточные элементы приобретают признаки деструкции (уплотнение и распад ядра). Наличие большого числа клеток с явлениями деструктивных изменений, возможно, служит дополнительным фактором привлечения макрофагов в герминативные центры лимфоидных фолликулов.

В качестве клеток с признаками деструкции мы рассматривали клетки с необратимыми некробиотическими изменениями ядра и цитоплазмы (кариопикноз, кариорексис, кариолизис, выраженная вакуолизация ядра или цитоплазмы и т.п.), когда происхождение (тип) этих клеток определить было невозможно.

В данном случае мы связываем увеличение численности клеток с признаками деструкции с активацией собственных лизосом в результате возрастания митотической активности и стимуляции дифференцировки лимфоцитов, иммуно- и плазмобластов. При увеличении количества делящихся клеток возрастает численность и объектов, в которых при митозе произошли какие-то ошибки (нарушения расхождения хромосом и др.). В этих клетках, ввиду их неполноценности, запускаются процессы апоптоза или, ввиду антигенности дефектных клеток, они лизируются ферментами фагоцитов. В том и другом случае в таких клетках можно наблюдать кариопикноз (уплотнение ядра), кариорексис (распад ядра), вакуолизацию ядра и цитоплазмы и другие признаки деструкции.

Это способствует как миграции во все структуры этих органов, в том числе и лимфоидные узелки, макрофагов для фагоцитоза и лизиса, так и дифференцировке их на месте из моноцитов.

Питательная среда содержит различные питательные вещества для микроорганизмов: пептон, дрожжевой экстракт, ИаС1, то есть свободные аминокислоты, ферменты, нуклеиновые кислоты (Егоров Н.С., 1976; Перт С.Дж., 1978). Некоторые из компонентов, в частности, пептон, дрожжевой экстракт, ферменты, нуклеиновые кислоты, по-видимому, могут вызвать иммунные процессы при внутривенном введении млекопитающим и служить причиной выраженных реакций селезенки. Можно

предположить, что питательная среда Ьипа-ВеЛаш (ЬВ) или ее отдельные компоненты активируют гуморальный иммунитет, при котором образуются антитела.

Селезенка при внутривенном введении фаголизата. В белой пульпе селезенки животных группы после внутривенного введения фаголизата обнаружены гипертрофия и гиперплазия лимфоидных фолликулов. В фолликулах расширены герминативные центры с увеличенным количеством митозов, клеток с явлениями деструкции и макрофагов. В красной пульпе селезенки одного животного много лимфоцитов, имеются участки некрозов с эритроцитами внутри и инфильтрацией макрофагами; у одного животного в красной пульпе селезенки присутствуют старые некрозы. В красной пульпе селезенки у 6 из 12 (50%) животных наблюдали явления отека, у 2 (16,7%) крыс - признаки полнокровия.

Средняя площадь фолликулов составляет 362,38±311,09 мкм2. Относительно интактного контроля изменения недостоверны.

Обнаруженные изменения практически идентичны наблюдаемым при внутривенном введении питательной среды. Так как фаголизат содержит такую же среду (частицы фага и питательная среда с бактериями, разрушенными при наработке фага), все изменения, по-видимому, также обусловлены этой средой или какими-то ее компонентами.

Таким образом, или внутривенное введение фага не приводит к изменениям селезенки, или эти изменения, вызванные фагом, маскируются действием питательной среды Ьипа-Вейат (ЬВ).

Селезенка при пероральном введении питательной среды. После перорального применения питательной среды в селезенке отмечены разнонаправленные изменения: явления отека, увеличенное или уменьшенное количество фолликулов, сопровождающееся возрастанием или сокращением их размеров. Встречаются обширные поля зрения (с использованием объектива X 10) только красной пульпы, без фолликулов. В лимфоидных узелках снижена численная плотность клеток. У 8 из 12 (66,7%) крыс в белой пульпе селезенки наблюдали выраженные явления отека.

Средняя площадь фолликулов составляет 397,32±296,86 мкм2. Относительно интактного контроля изменения недостоверны.

У половины животных этой группы встречаются свежие и старые некрозы (с сидерофагами) с полным или частичным замещением нежизнеспособных тканей соединительной тканью. У одного животного в красной пульпе был найден рубец со старым кровоизлиянием в центре, практически полностью организованным.

При внутривенном введении питательной среды в селезенке были отмечены достаточно выраженные изменения. После перорального применения этой же среды изменения стали еще более значительными. Обнаруженные гипертрофия или даже атрофия лимфоидных фолликулов, отек, полнокровие, многочисленные мелкие геморрагии, некрозы и соединительнотканные прослойки (скорее всего, формирующиеся на

месте геморрагий и некрозов), вероятно, свидетельствуют о длительном, хроническом воздействии антигенов на этот орган иммунной системы (Долин A.B., 2008; Хавинцов В.Х. и др., 2010).

Детерминированные B-лимфоциты активируются антигеном, далее они пролиферируют и дифференцируются в антителообразующие клетки, накапливающиеся в красной пульпе селезенки (Хэм А., Кормак Д., 1983). Можно предположить, что антигенное вещество вызывает пролиферацию и дифференцировку клеток лимфоидных фолликулов, что приводит к их гипертрофии и гиперплазии. Одновременно в этих структурах возрастает число митозов, клеток с явлениями деструкции и макрофагов. Микроциркуляторные изменения при антигенном воздействии приводят к полнокровию и расширению сосудов. Затем вследствие нарушений проницаемости сосудистой стенки начинается диапедез эритроцитов, формируются кровоизлияния.

Микроциркуляторные расстройства и прямое воздействие токсинов и антигенов сопровождаются некрозами тканей. Постепенно геморрагии и некрозы замещаются соединительной тканью, склерозируются. Одновременное наличие свежих и старых кровоизлияний (с сидерофагами и соединительной тканью вокруг), некрозов и прослоек соединительной ткани, по всей вероятности, указывает на длительное и значительное воздействие на селезенку.

Согласно литературным данным, после попадания каких-либо антигенных веществ в кровь, они сразу же оказывают влияние на селезенку, которая является одним из главных органов, фильтрующих чужеродные вещества из крови (Комахидзе М.Э., 1971; Хэм А., Кормак Д., 1983; Долин A.B., 2008). При введении антигенных веществ через желудочно-кишечный тракт сначала происходит фильтрация и обезвреживание их в печени и в целом комплексе лимфатических узлов. И только потом антигены в сильно сократившемся объеме попадают в кровеносное русло и далее - в селезенку (Байматов В.Н., 2000; Мирошников К.А. и др., 2006; Костина Л.Ю. и др., 2012).

Однако в этой группе крыс пероральное введение питательной среды оказало более выраженное влияние на структуру селезенки, чем внутривенное. Не исключено, что это связано с длительностью поступления антигена. При внутривенном введении в крови сразу оказывается высокая концентрация чужеродного вещества, которое быстро инактивируется и исчезает. Поступление вещества в пищеварительный тракт связано со значительно более длительным присутствием антигена в крови, пусть и меньшей концентрации. Видимо, такое хроническое воздействие малых доз и приводит к обнаруженным выраженным изменениям селезенки.

Селезенка при пероральном применении фаголизата. На гистологических срезах селезенки животных после перорального применения фаголизата встречаются увеличенные в размерах фолликулы, а также

большое количество маленьких узелков. В фолликулах расширены светлые центры с увеличенным количеством фигур митозов и клеток с признаками деструктивных изменений. У одного животного были найдены старые некрозы. Полнокровие наблюдали у 2 (16,7%) крыс.

Средняя площадь фолликулов составляет 361,25±276,46 мкм2. Относительно интактного контроля изменения недостоверны.

Таким образом, пероральное применение бактериофага вызывает значительно меньшие изменения селезенки по сравнению с внутривенными инъекциями. Это может быть обусловлено как более медленным поступлением вируса в кровь, так и обезвреживанием токсинов и антигенов из питательной среды и лизированных микроорганизмов синегнойной палочки в печени и лимфатических узлах. Вместе с этим нельзя исключить и инактивацию и элиминацию фага этими же детоксикационными системами организма, что также должно способствовать сохранности структур и клеток селезенки.

При пероралъном и внутривенном введении лизата Pseudomonas aeruginosa селезенка соответствует уровню интактного контроля. Средняя площадь фолликулов не является статистически достоверной из-за значительного разброса значений вариационного ряда в интактном контроле.

Реакции брыжеечных лимфатических узлов после введения бактериофага 57

Реакции брыжеечных лимфатических узлов при внутривенном применении фаголизата и лизата Pseudomonas aeruginosa соответствуют уровню интактного контроля.

Изменения брыжеечных лимфатических узлов при внутривенном введении питательной среды. У животных при внутривенном введении питательной среды Luria-Bertani (LB) в корковом веществе брыжеечных лимфатических узлов в основном наблюдали гипоплазию и гипотрофию лимфоидных фолликулов. Такую картину или даже отсутствие узелков обнаружили у 10 из 12 (83,3%) особей, в остальных наблюдениях размеры и количество фолликулов были резко увеличены, причем у 1 животного лимфоидные узелки в корковом веществе расположены в несколько рядов.

У одного животного (8,3%) имелись небольшие прослойки молодой соединительной ткани (с большим числом фибробластов) в корковом веществе. У 16,7% животных в светлых центрах лимфатических узлов наблюдали значительное число клеток с признаками деструктивных изменений: явлениями кареорексиса и кариопикноза. В 33,3% случаях было найдено расширение мозгового вещества, что может указывать на усиление транспорта лимфы через данные органы. В паракортикальной зоне и мозговых синусах узлов 6 животных (50%) содержится большое число макрофагов.

Средняя площадь фолликулов без центра размножения составила 654,13±465,3 мкм2, площадь узелков с центром размножения - 732,33±341,7 мкм2, площадь герминативных центров-210,41±122,3 мкм2, мантийной зоны — 521,91 ±252,15 мкм2, отличия от группы интактного контроля были недостоверны.

В целом состояние брыжеечных лимфатических узлов этой группы животных даже лучше, чем в интактном контроле, что может быть связано с составом среды (Егоров Н.С., 1976; Перт С.Дж., 1978). Попадая в кровеносное русло, вещества из среды, видимо, инактивируют антигены и токсины, поступающие из кишечника, не исключено, что за счет полипептидных цепей, связывающихся с некоторыми антигенными веществами. Таким образом, уменьшается антигенная нагрузка на все лимфатические узлы, в том числе и брыжеечные, что выражается в уменьшении числа животных с гипертрофией и гиперплазией лимфоидных узелков, в которых, в свою очередь, уменьшается численность клеток с явлениями деструкции. Также не исключено, что среда для развития бактерий содержит какие-то необходимые для жизнедеятельности крыс микроэлементы или другие вещества, которых нет в стандартном корме. Здесь также должно быть улучшение состояния лимфатических узлов за счет нормализации условий деятельности иммунной системы.

В качестве отличий от группы интактного контроля можно отметить большое число макрофагов в паракортексе, что, по-видимому, свидетельствует об активном фагоцитозе из лимфы, находящейся в промежуточных синусах. У 1 крысы во всех структурах брыжеечных лимфатических узлов, но преимущественно в просвете мозговых синусов, было обнаружено значительное число эозинофилов, что может быть связано с аллергическими реакциями на какие-то компоненты питательной среды, например полипептиды или дрожжевой экстракт, или с индивидуальными отличиями данной особи от других животных.

Изменения брыжеечных лимфатических узлов при пероралыюм введении питательной среды. При пероралыюм введении питательной среды Ьипа-Вег1ат (ЬВ), по сравнению со всеми вышеописанными группами, увеличивается количество животных (до 66,7%) с лимфатическими узлами, в которых возрастают размер и количество лимфоидных фолликулов. В гипертрофированных узелках со светлыми центрами возрастает размер самих герминативных центров, где резко увеличивается содержание макрофагов и клеток с признаками деструктивных изменений. Очень высокий уровень митотической активности в центрах размножения был отмечен у 2 особей.

Средняя площадь фолликулов без центра размножения составила 410,3±158,04мкм2, площадь узелков с центром размножения - 617,8±315,8 мкм2, площадь герминативных центров 196,94±171,6 мкм2, мантийной зоны — 432,54±223,9 мкм2. Отличия от интактного контроля недостоверны.

У двух животных из 12 в паракортексе лимфатических узлов присутствуют макрофаги. В 16,7% случаев в корковом веществе встречаются мелкие участки склероза. В мозговых синусах у 50% крыс много макрофагов. Среди структур мозгового вещества в 16,7% случаев встречаются фолликулы.

Следует отметить, что в норме лимфоидные фолликулы в мозговом веществе не встречаются (Бородин Ю. И., Григорьев В. Н., 1986). Подобная дистопия узелков была обнаружена в процессе восстановления лимфоидных органов после химиотерапии и облучения в эксперименте и клинических условиях (Майбородин И.В. и др., 2004а, 20046).

Наличие фолликулов в мозговом веществе встречается только в данной группе, наиболее вероятно, это связано с присутствием некоторых компонентов в питательной среде Ьипа-Вейаш (ЬВ). Входящий в состав питательной среды пептон представляет собой смесь полипептидов (продуктов неполного разложения белка) с содержанием свободных аминокислот, ферментов, нуклеиновых кислот и некоторых витаминов. Дрожжевой экстракт, также входящий в состав питательной среды, представляет собой источник витаминов, аминокислот, в том числе триптофана, и других факторов роста, в частности пуринов и пиримидинов (Егоров Н. С., 1976; Перт С.Дж., 1978).

По-видимому, полипептидные цепи являются антигенными для иммунной системы крыс, эти вещества значительно активируют пролиферацию и дифференцировку В-клеток, и, в результате этого, узелки формируются не только в корковом веществе лимфатических узлов, но и в мозговом. Пероральное введение питательной среды приводит к более выраженному воздействию на брыжеечные лимфатические узлы, чем внутривенное, и, соответственно, активация иммунокомпетентрных клеток более сильная в данной группе животных.

Изменения брыжеечных лимфатических узлов при пероралыюм применении фаголизата. В группе после перорального применения фаголизата в паракортексе (Т-зона) в 25% наблюдений много макрофагов, что может быть связано с присутствием компонентов питательной среды ЬВ, бактериальных токсинов, а также с присутствием самих бактериофагов.

Размеры и количество лимфоидных фолликулов увеличены у 66,7% крыс. Узелки в корковом плато расположены в несколько рядов у 2 (16,7%) животных. В 58,3% случаев присутствуют расширенные центры размножения. Содержание деструктивно измененных клеток в центрах размножения лимфоидных узелков довольно высокое в 10 из 12 случаев. В фолликулах лимфатических узелков много митозов. В 1 случае встречаются деформированные узелки.

Средняя площадь фолликулов без центра размножения составляет 468,1±295,41 мкм2, площадь фолликулов с центром размножения -829,3±277,3 мкм2, площадь герминативных центров 237,3±173,61 мкм2,

мантийной зоны - 592±164 мкм2. Эти величины находятся на уровне интактного контроля.

В синусах мозгового вещества содержится большое количество макрофагов (83,3% наблюдений), эозинофипов (16,7%) и тучных клеток (8,3%). Эозинофилия и тучноклеточная инфильтрация, по-видимому, обусловлены выраженными иммунными процессами у данных особей, что, в свою очередь, может быть связано с присутствием компонентов питательной среды LB (дрожжевой экстракт и полипептиды), бактериальных токсинов (белковой и липосахаридной природы, а также с присутствием самих бактериофагов (белки капсида).

Увеличение содержания макрофагов в паракортексе и мозговых синусах параллельно с увеличением содержания деструктивно измененных клеток в лимфоидных узелках отражает усиление макрофагальной активности в органе в ответ на антигенную стимуляцию (Сапин М.Р., Этинген Л.Е., 1996).

Изменения брыжеечных лимфатических узлов при пероральном введении лизата Pseudomonas aeruginosa. В группе животных после пе-рорального введения клеточного лизата бактерий Pseudomonas aeruginosa в паракортексе 16,7% животных увеличено количество макрофагов. Лимфоидные узелки в корковом веществе встречаются разного размера и в разном количестве, но, в основном, их количество снижено (вплоть до полного отсутствия), и они имеют небольшие размеры (66,7% крыс). Гипертрофия и гиперплазия фолликулов встречаются у 16,7% животных. В 33% случаев в герминативных центрах узелков много митозов. В некоторых наблюдениях в центрах размножения много макрофагов и клеточных элементов с признаками деструктивных изменений.

Средняя площадь фолликулов без центра размножения составляет 273,3± 104,9 мкм2, что в 1,9 раз меньше площади узелков интактных крыс, но это различие недостоверно. Площадь фолликулов с центром размножения равна 590,2±305,1 мкм2, средняя площадь герминативных центров - 134,03±93,04 мкм2, мантийной зоны - 456,2±253,7 мкм2.

После перорального применения лизата бактерий у всех крыс фолликулы лимфатических узлов оттеснены на периферию и сжаты (деформированы), что, наиболее вероятно, обусловлено расширением мозгового вещества (обнаружено также у всех животных): мозговое вещество расширено, синусы широкие, поэтому корковое вещество деформировано и оттеснено на периферию.

Такая картина связана с тем, что клеточный лизат приводит к депонированию лимфы: задержка лимфы с большой концентрацией токсинов и антигенов из разрушенных бактерий в лимфатических узлах для ее более качественной обработки и предотвращения диссеминации по всему организму посредством лимфатического и кровеносного русел (Поликар А., 1965; Sterns Е., Doris Р., 1967; Бородин Ю.И., 1981; Бородин Ю.И., Григорьев В.Н., 1986).

В мозговых синусах у всех крыс преобладают лимфоциты, но в 66,7% наблюдений много и макрофагов, это может свидетельствовать о неспецифической иммунной реакции на белковый антиген, вышедший в среду из разрушенных клеток синегнойной палочки.

Морфологические результаты применения бактериофага 57

для лечения пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa

Пневмония, вызванная Pseudomonas aeruginosa, без лечения. При

морфологическом исследовании в легких нелеченных крыс были найдены явления гиперемии и бронхопневмонии на стадии красного опеченения (пропитывание всех структур кровью). Имелись признаки отека легких: прозрачный слабоэозинофильный выпот в просвете альвеол и бронхиол. Кроме того, просвет некоторых бронхов был полностью обтурирован слизью, спущенным эпителием и лейкоцитами. Необходимо отметить лейкоцитарную инфильтрацию с образованием мелких очагов во всех тканях легких, в цитограмме инфильтрирующих лейкоцитов преобладали лимфоциты и макрофаги.

Результаты фаготерапии пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa. Все леченные животные в течение 8 дней оставались живыми. Гиподинамия и внешние признаки дыхательной недостаточности исчезли к 4 суткам. Из образцов тканей органов крыс на 8 сутки методом отпечатков на среду РПА не было высеяно инфекционного штамма.

На 8 сутки в легких можно было найти свидетельства перенесенной пневмонии. Большей частью альвеолы свободные, но имелась лейкоцитарная инфильтрация стенок альвеол. Вместе с этим присутствовали ограниченные пейтрофильные инфильтраты (абсцессы) от небольших до очень крупных. В одном случае был обнаружен большой абсцесс с нейтрофилыюй инфильтрацией в центре и большим числом макрофагов снаружи (макрофагальный вал), клеточный и тканевой детрит в этой структуре отсутствовал.

После перорального применения бактериофага, специфического в отношении синегнойной палочки, все крысы оставались живы. Явления дыхательной недостаточности и интоксикации (гиподинамия и хрипы) купировались к 4 дню, признаки сепсиса и присутствия инфекционного агента даже в легких найдены не были (отсутствие роста Pseudomonas aeruginosa в отпечатках легких).

Вместе с этим в наших экспериментах в легких крыс после фаготерапии имелись признаки абсцедирования: формирование мелких нейтро-фильных абсцессов у всех крыс, у 1 особи был найден крупный абсцесс с распадом в центре и макрофагальным валом на периферии.

Не исключено, что в результате использования фага большинство бактерий гибнет, но остаются микроорганизмы, находящиеся в лейкоцитарных инфильтратах и недоступные для фага даже при повторном его

введении. Для восстановления подавленной иммунной защиты необходимо определенное время, за этот срок уцелевшие бактерии размножаются в инфильтратах или даже в самих фагоцитах (незавершенный фагоцитоз) и только постепенно лизируются нейтрофилами и макрофагами. Эти клетки образуют инфильтраты вокруг участков ткани с антигенами, такие инфильтраты и были обнаружены спустя 8 дней после начала эксперимента.

Также возможно, что лейкоцитарные инфильтраты были сформированы вокруг поврежденных в результате размножения Pseudomonas aeruginosa тканей легких. Применение фага не сопровождается ускорением репарации поврежденных тканей. И в таком случае наличие лейкоцитарных инфильтратов свидетельствуют только о том, что в легких к 8 суткам еще не полностью лизированы нежизнеспособные ткани. Присутствие большого абсцесса также свидетельствует в пользу этого предположения. Такой абсцесс был образован вокруг значительного массива погибшей паренхимы легкого, в центре его продолжается активный лизис детрита, о чем свидетельствует нейтрофильная инфильтрация. Трудно судить о дальнейшей судьбе такой структуры, но, скорее всего, будет сформирован типичный абсцесс с соединительнотканной капсулой, который будет существовать в течение всей жизни животного или опорожнится через какой-то бронх в случае расплавления его стенки.

В любом случае, сохранение жизни животных при острой септической пневмонии, вызванной Pseudomonas aeruginosa, в результате только фаготерапии, без применения антибактериальных препаратов, даже при наличии участков абсцедирования в легких, дистрофических изменений печени и реактивных изменений селезенки является, безусловно, положительным результатом.

ВЫВОДЫ

1. Пероральное применение специфического бактериофага для лечения острой пневмонии и сепсиса, вызванных Pseudomonas aeruginosa, в эксперименте на крысах приводит к купированию признаков дыхательной недостаточности, общей интоксикации, явлений пневмонии и сепсиса, увеличению выживаемости животных. Вместе с этим, в легких крыс после фаготерапии пневмонии на фоне введения синегнойной палочки имелись признаки абсцедирования, в печени-дистрофические изменения гепато-цитов, а в селезенке - гипертрофия и гиперплазия лимфоидных узелков.

2. Введение фаголизата бактериофага 57 Pseudomonas aeruginosa непосредственно в пищеварительный тракт крыс сопровождается обширными некрозами паренхимы, выраженной диффузной и очаговой лейкоцитарной инфильтрации печени. Такие изменения связаны с прямым поступлением в данный орган большой концентрации частиц бактериофага в сочетании с токсинами и антигенами синегнойной палочки. Введение лизата этого микроорганизма без частиц фага или чистой питательной среды не сопро-

вождается некробиотическими изменениями. При внутривенном введении фаголизата изменения печени, по сравнению с интактным контролем, практически отсутствуют.

3. В селезенке наиболее выраженные изменения происходят при введении питательной среды Luria-Bertani (LB), применяемой для культивирования микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, являющихся хозяевами бактериофага 57. Возможно, что сама среда или какие-либо ее компоненты являются иммуногенными и вызывают гипертрофию лимфоидных фолликулов селезенки, увеличение митотической активности их клеток, повышение численности макрофагов и клеточных элементов с явлениями деструкции, формирование геморрагий и участков некрозов в паренхиме органа, которые впоследствии замещаются соединительной тканью. Применение фага не вызывает значительных изменений в структуре селезенки, пероральный способ введения фаголизата активирует меньше реакций со стороны данного органа по сравнению с внутривенными инъекциями.

4. Изменения брыжеечных лимфатических узлов происходят как после введения фаголизата, так и в группах контроля — после использования питательной среды или клеточного лизата Pseudomonas aeruginosa:

а) После внутривенного введения питательной среды Luria-Bertani (LB) усиливаются процессы деструкции клеточных элементов в герминативных центрах лимфоидных фолликулов брыжеечных лимфатических узлов. Пероральное применение питательной среды, кроме того, приводит к дистопии лимфоидных узелков, которые формируются среди структур мозгового вещества.

б) Расширение герминативных центров лимфоидных узелков брыжеечных лимфатических узлов в сочетании с высоким содержанием деструктивно измененных клеток, наличие эозинофилов, а также большое содержание макрофагов в синусах мозгового вещества имели место при введении фаголизата непосредственно в пищеварительный тракт, что обусловлено прямым поступлением в данные органы частиц фага в сочетании с токсинами и антигенами разрушенных бактерий синегнойной палочки. Внутривенное введение фаголизата способствует практически полной сохранности структуры указанных лимфатических узлов, так как в них поступает значительно меньший объем антигенных и токсических веществ.

в) Введение лизата Pseudomonas aeruginosa без частиц фага сопровождается депонированием лимфы в брыжеечных лимфатических узлах для более качественной обработки и предупреждения диссеминации токсинов по всему организму посредством лимфатической и кровеносной систем, так как лизат содержит множество экзо- и эндотоксинов из разрушенных бактерий, которые попадают в лимфоток и далее - в лимфатические узлы. Депонирование лимфы приводит к расширению мозгового вещества данных органов, за счет чего все корковое вещество, в том числе и лим-фоидные фолликулы с центрами и без центров размножения, оттеснены и сжаты на периферии органа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В связи с тем, что пероральное применение специфического бактериофага для лечения острой пневмонии и сепсиса, вызванных Pseudomonas aeruginos, в эксперименте на крысах приводит к купированию признаков дыхательной недостаточности, общей интоксикации, явлений пневмонии и сепсиса, увеличению выживаемости животных, показано применение этого фага для лечения инфекционных процессов, главным этиологическим фактором в которых является синегнойная палочка.

2. Так как в легких крыс после фаготерапии пневмонии на фоне введения синегнойной палочки найдены признаки абсцедирования, в печени

— дистрофические изменения гепатоцитов, а в селезенке - гипертрофия и гиперплазия лимфоидных узелков, которые могут являться последствиями использованием фага, требуется разработка и применение специфических мер профилактики и лечения указанных осложнений.

3. Для лечения каких-либо инфекций посредством применения бактериофага более целесообразно его внутривенное введение. Пероральное использование позволяет создать высокую концентрацию в органах желудочно-кишечного тракта, но, вместе с этим, в печени происходят выраженные дистрофические и даже некротические изменения.

4. Перед применением бактриофага in vivo требуется тщательная очистка препарата не только от остатков микроорганизмов - хозяев фага, но и от компонентов питательной среды для культивирования этих бактерий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анищенко В.В. , Семенов С. А., Хальзов А. В., Шмакова Е. А., Саранина И. В., Антонова Т. А. , Козлова Ю.Н., Репин В. Е. Микробиологические подходы к проблеме дисбактериоза кишечника после билио-панкреатического шунтирования // Медицинская геномика и протеомика: Мат. науч. конф. - Новосибирск, 2009. - С. 134.

2. Козлова Ю.Н., Репин В.Е., Яковец Е.А., Шевела А.И., Власов В.В. Фаготерапия болезней мочевыводящих путей // Фундаментальные науки

- медицине: Сб. тез. ежегод. науч. конф. - Новосибирск, 2010. — С. 95.

3. Яковец Е.А., Шевела А.И., Репин В.Е., Козлова Ю.Н. Применение бактериофагов при лечении урологических заболеваний // Актуальные вопросы диагностики и лечения урологических заболеваний: Сб. науч. тр. X регион. науч.-практ. конф. урологов Западной Сибири. - Барнаул, 2011.-С. 184-185.

4. Анищенко В. В., Ганичев Д. А., Басс А. А., Семёнов С. А., Дуй-шобаев А. Р., Козлова Ю. Н. Опыт комплексного подхода в лечении ос-

ложнённых форм синдрома // Технологии единого лапароскопического доступа в абдоминальной хирургии: Мат. науч.-прак. конф. с между-народн. участием. - М., 2011. http://laparoscopy.ru/doktoru/view_thesis. php?id=2114&event_id=l О

5. Афонюшкин В.Н., Сподырева Т.В., Юшков Ю.Г., В.Ю. Коптев, Филипенко M.JL, Козлова Ю.Н., Дударева Е.В., Дудников А., Аркова О.В., Шмаков H.A., наук Вольф В.Т. Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов: Метод, рекоменд. - Новосибирск, 2011. -63 с.

6. Козлова Ю.Н., Яковец Е. А. Возможность фаготерапии при инфекциях мочевыводящих путей // Санкт-Петербургские научные чтения -2011: Тез. IV Международ, молодежного мед. конгр. - С-Пб, 2011. - С. 342.

7. Козлова Ю.Н., Репин В.Е., Анищенко В.В., Власов В.В., Ганичев Д.А., Семёнов С.А., Пугачев В.Г., Таранов О.С. Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa, используемый в качестве основы для приготовления асептического средства против синегнойной палочки. Патепт на изобретение RU 2 455 355 С1. Опубликовано 10.07.2012, Бюл. № 19.

8. Fomenko V., Vasiliev V., Bogatyrev A., Kozlova J., and Afonjushkin V . Test Panel Development of Pseudomonas Aeruginosa sStrains for Quorum-sensing and Quorumquenching Study by LC-ESI-Q-TOF-MS // Current issues of natural products chemistry and biotechnology: 4th Annual Russian-Korean conference. - Novosibirsk, 2012. - P. 32.

9. Козлова Ю.Н., Самохин А.Г., Павлов B.B., Тикунова Н.В., Власов B.B. Перспективы фаготерапии инфекций области хирургического вмешательства // Риски в современной травматологии и ортопедии: Мат. межрегион, науч.-практ. конф. с международ участ., посвященной памяти профессора А.Н. Горячева. - Омск: Изд-во «Омскбланкиздат», 2013. - С. 72-73.

10. Козлова Ю.Н., Самохин А.Г., Павлов В.В., Репин В.Е. Способ получения полимерного цемента медицинского назначения. Патент на изобретение RU 2 475 273 С1. Опубликовано 20.02.2013, Бюл. № 5.

11. Козлова Ю. Н., Самохин А. Г., Павлов В. В., Тикунова Н. В., Власов В. В. Исследования возможности применения фаготерапии инфекций области хирургического вмешательства // Фундаментальные науки - медицине: Мат. международ, конф. - Новосибирск, 2013. - С.36

12. Морозова В. В., Козлова Ю. Н., Шедько Е. Д., Бабкин И. В., Ту-пикин А. Е., Кабилов М. Р., Тикунова Н. В. Поиск новых бактериофагов для использования в терапии микробных инфекций // Фундаментальные науки - медицине: Мат. международ, конф. - Новосибирск, 2013.-С. 135.

13. Козлова Ю.Н., Репин В.Е., Майбородин И.В. Применение бактериофага для лечения пневмонии, вызванной Pseudomonas Aeruginosa, в эксперименте. // Вести. Новосибирского гос. ун-та: Сер. биол., клин, мед. - 2013. - Т. 11. - № 4. - С. 114-121.

14. Козлова Ю.Н., Репин В.Е., Майбородин И.В. Специфический бактериофаг для лечения хирургической инфекции, вызванной Pseudomonas Aeruginosa, в эксперименте // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2013. — Т. 6, № 4. - С. 425 — 431.

Соискатель

Ю.Н.Козлова

Подписано в печать 12.03.2014. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 09. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39